DE69636863T2

DE69636863T2 - Benutzung von immunmodulatoren zur herstellung von medikamenten zur inhibierung einer immunantwort gegen gleichzeitig verabreichte rekombinante viren

Info

Publication number: DE69636863T2
Application number: DE69636863T
Authority: DE
Inventors: M. James Gladwyne WILSON; Yiping Philadelphia YANG; Giorgio Wynnewood TRINCHIERI
Original assignee: University of Pennsylvania Penn; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: University of Pennsylvania Penn; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2016-02-24
Also published as: JPH11500736A; MX9706483A; AU5302996A; DE69636863D1; ATE352634T1; EP0811073A2; ES2281081T3; WO1996026285A3; AU697022B2; CA2213439A1; PT811073E; EP0811073B1; DK0811073T3; WO1996026285A2

Description

Die vorliegende Erfindung wurde durch Geldmittel (Nr. DK 47757-02 und AI 34412-02) der National Institutes of Health unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gentherapie und insbesondere die Verwendung von Immunmodulatoren sowie gleichzeitig verabreichten rekombinanten Viren zur Herstellung von Arzneimitteln, bei denen der Immunmodulator die Immunantwort gegen das rekombinante Virus hemmt.
Stand der Technik
Rekombinante Adenoviren haben sich als attraktive Vehikel für den in-vivo-Gentransfer in viele verschiedene Zelltypen erwiesen. Dabei sind Vektoren der ersten Generation, die durch eine Abreicherung der sehr frühen Gene E1a und E1b einen Replikationsdefekt aufweisen, zu einem hocheffizienten in-vivo-Gentransfer in sich nicht teilende Zielzellen fähig [M. Kay et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2353–2357 (1994); S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92:883–893 (1993); B. Quantin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581–2584 (1992); M. Rosenfeld et al, Cell, 68:143 (1992); R. Simon et al, Hum. Gene Thera., 4:771 (1993); Rosenfeld et al, Science, 252:431–434 (1991); Stratford-Perricaudet et al, Hum. Gene Ther., 1:241–256 (1990)].
Immunantworten des Empfängers auf den Virusvektor, das von dem Vektor getragene Transgen sowie die virusinfizierten Zellen haben sich als wiederkehrende Probleme bei der ersten Anwendung dieser Technologie auf Tiere und Menschen herausgestellt [Yang et al, J. Virol., 69:2004–2015 (1995) (Yang I)]. Bei fast allen Modellen, einschließlich der auf die Lunge und die Leber gerichteten Gentherapie, ist die Expression des Transgens transient und mit der pathologischen Entwicklung an der Stelle des Gentransfers assoziiert.
Die transiente Art der Transgenexpression von rekombinanten Adenoviren liegt zum Teil an der Entwicklung antigenspezifischer zellulärer Immunantworten gegen die virusinfizierten Zellen und deren anschließende Eliminierung durch den Wirt. Insbesondere exprimieren Vektoren der ersten Generation trotz einer Deletion im E1a-Bereich des Vektors Virusproteine zusätzlich zu dem Transgen. Diese Virusproteine aktivieren zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) [Y. Dai et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1401–1405 (1995); Y. Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4407–4411 (1994) (Yang II); und Y. Yang et al, Immunity, 1:443–442 (1994) (Yang III)]. Die Zusammenarbeit von gegen neu synthetisierte Virusproteine gerichteten CTLs und virusspezifischen T-Helferzellen [Zabner et al, Cell, 75:207–216 (1993); Crystal et al, Nat. Genet., 8:42–51 (1994)] führt zur Zerstörung der virusinfizierten Zellen.
Ein weiteres antigenes Ziel für die immunvermittelte Clearance virusinfizierter Zellen kann das Produkt des Transgens darstellen, wenn dieses Transgen ein Protein exprimiert, das dem behandelten Wirt fremd ist. CTLs stellen somit einen wichtigen Effektor bei der Zerstörung von Zielzellen dar, wobei die Aktivierung in einigen Fällen im Zusammenhang mit dem Transgenprodukt oder mit dem virussynthetisierten Proteinen stattfindet, die jeweils durch MHC-Moleküle der Klasse I präsentiert werden [Yang I; und Zsengeller et al, Hum. Gene Thera., 6:457–467 (1995)]. Ebenso wurde festgestellt, daß diese Immunantworten das Auftreten einer assoziierten Hepatitis verursachen, die sich in Empfängern einer auf die Leber gerichteten in-vivo- Gentherapie innerhalb von 2–3 Wochen nach der ersten Behandlung entwickelt.
Eine weitere Einschränkung für rekombinante Adenoviren für die Gentherapie lag in der Schwierigkeit, nach einer zweiten Verabreichung des Virus einen nachweisbaren Gentransfer zu erhalten. Diese Einschränkung ist besonders problematisch bei der Behandlung von durch ein einzelnes Gen vererbten Erkrankungen oder von chronischen Krankheiten, wie beispielsweise zystischer Fibrose (CF), bei denen wiederholte Therapien erforderlich sind, um eine lebenslange genetische Rekonstitution zu erzielen. Ein verminderter Gentransfer nach einer zweiten Therapie konnte in vielen verschiedenen Tiermodellen nach intravenöser oder intratrachialer Viruszuführung gezeigt werden [T. Smith et al, Gene Thera., 5:397 (1993); S. Yei et al, Gene Thera., 1:192–200 (1994); K. Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269:13695 (1994]]. Dabei wurde jeweils die Resistenz gegenüber einer wiederholten Gentherapie mit der Entwicklung eines neutralisierenden Anti-Adenovirus-Antikörpers assoziiert, der den erfolgreichen Gentransfer nach einer zweiten Verabreichung des Virus vereitelte.
Mögliche Lösungen für diese Probleme richteten sich auf die Entwicklung rekombinanter Viren der zweiten Generation [Y. Yang et al, Nat. Genet., 7:362–369 (1994) (Yang IV); und J. Engelhardt et al, Hum. Gene Thera., 5:1217 (1994)], die zur Verminderung der Expression neu synthetisierter Virusproteine konstruiert wurden, sowie die Verwendung nichtimmunogener Transgene zur Verhinderung der CTL-Aktivierung. In der WO 92/19266 (US Gov't/Schlom) wird ein rekombinantes karzinoembryonales Antigen (CEA)/Vacciniavirus bzw. ein anderer Virusvektor beschrieben, bei dessen Verwendung in vivo eine humorale Immunantwort und/oder zellvermittelte Antwort gegen CEA ausgelöst wird. Ebenso wird die Verabreichung des Virusvektors mit Cyclophosphamid beschrieben. Die WO 96/12030 (Rhone-Poulenc Rorer, Lee und Perricaudet) sieht den Einschluß eines spezifischen adenoviralen Gens, gp19k, in einem Adenoviruskonstrukt vor, um so einer mit dem Viruskonstrukt infizierten Zelle einen Schutzeffekt zu verleihen. In der WO 96/12406 (Genetic Therapy, Inc., Trapnell) wird ein Behandlungsverfahren bereitgestellt, bei dem ein Adenovirus und ein unter Anti-CD4-Antikörpern, CTLA4-Immunglobulin sowie einigen nichtspezifischen Immunsuppressiva ausgewähltes Immunsuppressivum verabreicht werden, das Verabreichungsschema gestoppt und die Verabreichung des Immunsuppressivums und des Adenovirusvektors dann wiederholt wird. Ferner ist die erneute Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus in Gegenwart eines Immunmodulators vorgesehen.
Somit besteht nach wie vor ein Bedarf im Fachgebiet an der Verbesserung der Effizienz des Gentransfers während wiederholter Verabreichungen von viraler Gentherapie.
Kurze Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung eines Arzneimittels ein Immunmodulator sowie ein rekombinanter Virusvektor benutzt, wodurch sich eine verminderte Immunantwort gegenüber dem zur Durchführung der Therapie verwendeten rekombinanten Virusvektor ergibt. Bei der Erfindung wird gleichzeitig mit dem gentherapeutischen Virusvektor ein ausgewählter Immunmodulator verabreicht, der das Auftreten neutralisierender Antikörperantworten, die gegen die vektorcodierten Antigene gerichtet sind, und/oder der Eliminierung der virusproteinhaltigen Zellen durch zytolytische T-Zellen weitgehend reduziert. Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Fälle, bei denen die erneute Verabreichung des rekombinanten Virus gewünscht ist. Erfindungsgemäß kann der Immunmodulator entweder vor oder gleichzeitig mit dem das zuzuführende Transgen tragenden rekombinanten Virusvektor verabreicht werden.
Handelt es sich allerdings bei dem rekombinanten Virus um ein Adenovirus, so wird im Hinblick auf die Offenbarung in der oben erwähnten WO 96/12406, die nach dem Anmeldedatum des vorliegenden Falls veröffentlicht wurde, auf die erneute Verabreichung des Adenovirus in Gegenwart eines Immunmodulators verzichtet.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Bei 1A handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung des in bronchoalveolärer Lavage-(BAL)-Proben aus an Tag 0 mit Adenovirus infizierten und an Tag 28 einer Autopsie unterzogenen C57BL-6-Mäusen, wie in Beispiel 2 beschrieben, vorhandenen Titers von neutralisierendem Antikörper. Die Kontrolle repräsentiert normale Mäuse („Kontrolle"); CD4 mAb repräsentiert Mäuse mit einem Mangel an CD4⁺-Zellen; IL-12 repräsentiert mit IL-12 an Tag 0 und +1 behandelte Mäuse und IFN-γ repräsentiert mit IFN-γ an Tag 0 und +1 behandelte Mäuse. Die Daten sind als Mittelwert ±1 Standardabweichung für drei unabhängige Experimente dargestellt.
Bei 1B handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung der relativen Mengen (OD₄₀₅) an in BAL-Proben vorhandenem IgG. Die Symbole sind wie in 1A beschrieben.
Bei 1C handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung der relativen Mengen (OD₄₀₅) an in BAL-Proben vorhandenem IgA. Die Symbole sind wie in 1A beschrieben.
Bei 2 handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung des Titers von neutralisierendem Antikörper, ausgedrückt als reziproke Verdünnung von Serumproben für die Tiere in Beispiel 4. Die die Mäuse repräsentierenden Symbole werden wie folgt beschrieben: mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und mit H5.010BALP an Tag 28 infizierte C57BL-6-Mäuse („B6-Mäuse"); mit UV-inaktiviertem H5.010CMVlacZ an Tag 0 und mit H5.010BALP an Tag 28 infizierte C57BL-6-Mäuse („B6-UV-Mäuse); mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und mit H5.010CBALP an Tag 28 infizierte Mäuse mit MHC-Klasse-II-Mangel („Klasse II^–-Mäuse"); mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und mit H5.010BALP an Tag 28 infizierte Mäuse mit β2-Mikroglobulin-Mangel („β2m^–-Mäuse"); sowie mit GK1.5 (anti-CD4) mAB behandelte und mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und mit H5.010CBALP an Tag 28 infizierte C57BL/6-Mäuse („CD4Ab-Mäuse").
Bei 3A handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung des Titers von neutralisierendem Antikörper, ausgedrückt als reziproke Verdünnung von Serumproben für durch Infusion in die Schwanzvene mit H5.010CMVLDLR an Tag 0 und mit H5.010CMVlacZ an Tag 21 und mit H5.010CBALP an Tag 42 versehene C57BL/6-Mäuse, denen an Tag –3, 0 und 3 jeweils Kochsalzlösung verabreicht wurde. Der Titer ist in Abhängigkeit von den Tagen nach der Infektion angegeben.
Bei 3B handelt es sich um eine ähnliche graphische Darstellung wie die in 3A für durch Infusion in die Schwanzvene mit H5.010CMVLDLR an Tag 0 und mit H5.010CMVlacZ an Tag 21 und mit H5.010CBALP an Tag 42 versehene C57BLj6-Mäuse, denen an Tag –3, 0 und 3 jeweils anti-CD40L mAb GK1.5 verabreicht wurde.
Bei 3C handelt es sich um eine ähnliche graphische Darstellung wie die in 3A für durch Infusion in die Schwanzvene mit H5.010CMVlacZ an Tag 21 und mit H5.010CBALP an Tag 42 versehene C57BL/6-Mäuse, denen an Tag –3, 0 und 3 jeweils anti-CD4 mAb GK1.5 verabreicht wurde.
Bei 4A handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung der relativen Mengen (OD₄₀₅) von in Serumproben vorhandenem IgG1 in Abhängigkeit von Probenverdünnungen, wie in Beispiel 6 beschrieben.
Bei 4B handelt es sich um eine graphisch dargestellte Zusammenfassung der relativen Mengen (OD₄₀₅) von in Serumproben vorhandenem IgG2a in Abhängigkeit von Probenverdünnungen, wie in Beispiel 6 beschrieben.
Bei 5 handelt es sich um eine graphische Darstellung des Prozentanteils der spezifischen Lyse von scheininfizierten („mock") und mit H5.010CBALP („ALP") infizierten C57SV-Zellen in Abhängigkeit des Verhältnisses Effektor:Ziel für einen ⁵¹Cr-Freisetzungstest in Beispiel 6B. Dabei wurden Milzzellen aus C57BL/6-Mäusen („B6") und mit IL-12 behandelten C57BL/6-(„B6+IL12")-Mäusen 10 Tage nach Verabreichung von H5.010CBALP in vitro 5 Tage mit H5.010CMVlacZ nochmals stimuliert.
Bei 6A handelt es sich um ein Balkendiagramm der neutralisierenden Antikörper gegen Ad5, erhalten in der BAL (Lungenexperiment) in Beispiel 7. Die Ergebnisse in Spalte 1 stammen von C57BL/6-Mäusen (Kontrolle), Ergebnisse in Spalte 2 stammen von knockout-Mäusen mit CD40L-Mangel (CD40L-KO) und Ergebnisse in Spalte 3 stammen von mit CD40L-Antikörper (CD40L Ab) behandelten C57BL/6-Mäusen. Die Daten sind als Mittelwert des Titers von neutralisierendem Antikörper von drei Proben +/– 1 S.D. (Standardabweichung) dargestellt.
Bei 6B handelt es sich um ein Balkendiagramm wie in 6A beschrieben, wobei die Daten aus Serum für das Leberexperiment in Beispiel 7 erhalten wurden.
Bei 7A handelt es sich um eine lineare Auftragung des Vergleichs des Prozentanteils an spezifischer Lyse bei aus C57BL16-Kontrollmäusen (offene Kreise) und mit Antikörper gegen CD40L behandelten C57BL/6-Mäusen geernteten Lymphozyten (gefüllte Kreise). Sieben Tage nach der Virusverabreichung wurden die Lymphozyten nochmals 5 Tage in vitro stimuliert und auf spezifische Lyse auf scheininfizierten C57SV-Zellen in einem 6stündigem ⁵¹Cr-Freisetzungstest getestet. Der Prozentanteil an spezifischer Lyse ist in Abhängigkeit von unterschiedlichen Effektor:Ziel-Verhältnissen (6:1, 12:1, 25:1 und 50:1) ausgedrückt. Für dieses Lungenexperiment wurden Milzzellen verwendet.
Bei 7B handelt es sich um eine wie in 7A beschriebene lineare Auftragung unter Verwendung von virusinfizierten C57SV-Zellen.
Bei 7C handelt es sich um eine wie in 7A beschriebene lineare Auftragung unter Verwendung scheininfizierter Zellen. Für diese Leberexperimente wurden MLN-(Mediastinal lymph node)-Zellen verwendet.
Bei 7D handelt es sich um eine wie in 7A beschriebene lineare Auftragung unter Verwendung virusinfizierter Zellen. Für diese Leberexperimente wurden MLN-Zellen verwendet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird ein Immunmodulator für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung der Fähigkeit eines Tiers oder eines Menschen, die Verabreichung gentherapeutischer Virusvektoren zu tolerieren, verwendet. Mit der Erfindung wird ein Arzneimittel zur transienten Verhinderung der Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen, die sowohl an zellulären als auch humoralen Immunschranken gegenüber der Gentherapie beteiligt sind, bereitgestellt. Bei der Erfindung wird einem einen gentherapeutischen Vektor erhaltendem Individuum eine geeignete Menge eines vorzugsweise kurzzeitig wirkenden Immunmodulators verabreicht. Dabei wird der Immunmodulator vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des gentherapeutischen Vektors, d.h. eines rekombinanten Virus, der bzw. das zur Zuführung eines für die Gentherapie erwünschten therapeutischen Transgens verwendet wird, verabreicht. Der Immunmodulator kann auch vor oder nach Verabreichung des Vektors verabreicht werden, vorrausgesetzt, daß, wenn es sich bei dem rekombinanten Virus um ein Adenovirus handelt, die Verwendung ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß das Adenovirus in Abwesenheit eines Immunmodulators erneut verabreicht wird. Im Hinblick auf die Offenbarung in der WO 96/2406 wird auf die erneute Verabreichung des Adenovirus in Gegenwart eines Immunmodulators verzichtet, wie oben erwähnt.
Die Erfindung, durch die die Entwicklung negativer zellulärer und humoraler Immunantworten gegenüber gentherapeutischen Virusvektoren verhindert wird, beruht auf der Immunsuppression zur Blockierung der Aktivierung von T-Helferzellen, insbesondere der CD4-Funktion, sowie B-Zellen. Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem eine chronische Immunsuppression durch kontinuierliche Verabreichung nichtspezifischer Immunsuppressiva erfolgt, wird in der vorliegenden Erfindung ein transienter Ansatz zur Immunsuppression verwendet. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird von den Erfindern die Theorie aufgestellt, daß es sich bei dem primären Stimulus für die Immunaktivierung um virale Kapsidproteine aus dem rekombinanten Vektor handelt. Bei einem solchen Szenario ist eine chronische Immunsuppression nicht notwendig. Insbesondere wird durch die transiente Ablation der CD4-Funktion zum Zeitpunkt oder nahe dem Zeitpunkt der Verabreichung von rekombinantem Virus gemäß der vorliegenden Erfindung die Bildung von neutralisierendem Antikörper verhindert, wodurch ein effizienter Gentransfer nach wenigstens zwei nachfolgenden Verabreichungen gentherapeutischer Virusvektoren gestattet wird.
Wie nachfolgend veranschaulicht, wird die Verabreichung von Immunmodulatoren gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise nur zum Zeitpunkt der Virusverabreichung ausgeführt. Allerdings kann eine längere Immunmodulation als in den folgenden Beispielen eines Gentransfers in Mausleber und/oder -lunge notwendig erforderlich sein, je nach der Art und Weise, in der die Antigene in unterschiedlichen Gentherapievorschriften präsentiert werden. Somit kann die erfindungsgemäße transiente Immunmodulation unter gewissen Umständen mit Langzeit-Immunsuppression oder anderen immunmodulatorischen Therapien kombiniert werden.
I. Immunmodulatoren
Der ausgewählte Immunmodulator ist hier als ein Mittel definiert, das zur Hemmung der Bildung von gegen den rekombinanten Virusvektor gerichteten neutralisierenden Antikörpern durch aktivierte B-Zellen und/oder zur Hemmung der CTL-(Cytolytic T Lymphozyte)-Eliminierung des Vektors fähig ist. Der Immunmodulator kann so ausgewählt sein, daß er die Wechselwirkungen zwischen den T-Helfer-Untergruppen (T_H1 bzw. T_H2) und B-Zellen stört, so daß die Bildung von neutralisierendem Antikörper gehemmt wird. Als Alternative kann der Immunmodulator so ausgewählt sein, daß er die Wechselwirkung zwischen T_H1-Zellen und CTLs hemmt, so daß das Auftreten einer CTL-Eliminierung des Vektors reduziert wird. Insbesondere stört oder blockiert der Immunmodulator wünschenswerterweise die Funktion der CD4-T-Zellen.
Immunmodulatoren zur Verwendung bei der Hemmung der Bildung von neutralisierendem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können aufgrund der Bestimmung des Immunglobulin-Subtyps eines beliebigen, als Antwort gegenüber dem Virusvektor produzierten neutralisierenden Antikörpers ausgewählt werden. Der neutralisierende Antikörper, der als Antwort auf die Verabreichung eines gentherapeutischen Virusvektors entwickelt wird, beruht häufig auf der Identität des Virus, der Identität des Transgens, welches Vehikel zur Zuführung des Vektors verwendet wird und/oder dem Zielort bzw. Gewebetyp für die Zuführung des Virusvektors.
So sind beispielsweise T_H2-Zellen allgemein für die Störung des effizienten Transfers von während einer Gentherapie verabreichten Genen verantwortlich. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der Virusvektor auf einem Adenovirus beruht. Insbesondere konnte von den Erfindern bestimmt werden, daß neutralisierende Antikörper der Subtypen IgG₁ und IgA, die von der Wechselwirkung zwischen T_H2-Zellen und B-Zellen abhängig sind, die Hauptursache für die hauptsächlichen neutralisierenden Antikörper gegen Adenovirusvektoren zu sein scheinen.
Die Identität des durch Verabreichung eines spezifischen gentherapeutischen rekombinanten Virusvektors induzierten neutralisierenden Antikörpers läßt sich leicht in Tierversuchen bestimmen. Siehe z.B. Beispiel 6. So wird beispielsweise durch Verabreichung adenoviraler Vektoren über die Lungen im allgemeinen die Produktion eines neutralisierenden IgA-Antikörpers induziert, während die Verabreichung adenoviraler Vektoren über das Blut im allgemeinen einen neutralisierenden IgG₁-Antikörper induziert. In diesen Fällen stört eine T_H2-abhängige Immunantwort den Transfer des ein therapeutisches Transgen tragenden, auf Adenovirus beruhenden Virusvektors.
Handelt es sich bei dem durch Verabreichung von Virusvektor induzierten neutralisierenden Antikörper um einen T_H2-vermittelten Antikörper, wie beispielsweise IgA oder IgG₁, so unterdrückt oder verhindert der ausgewählte Immunmodulator wünschenswerterweise die Wechselwirkung von T_H2-Zellen mit B-Zellen. Falls sich andererseits herausstellt, daß es sich bei dem induzierten neutralisierenden Antikörper um einen T_H1-vermittelten Antikörper, wie z.B. IgG_2A, handelt, so unterdrückt bzw. verhindert der Immunmodulator wünschenswerterweise die Wechselwirkung von T_H1-Zellen mit B-Zellen. Ist die Reduktion der CTL-Eliminierung der Virusvektoren ebenso wie die Blockierung der Bildung von neutralisierendem Antikörper erwünscht, so wird der Immunmodulator aufgrund seiner Fähigkeit zur Unterdrückung oder Blockierung von CD4⁺-T_H1-Zellen ausgewählt, um so eine längere Anwesenheit des Virusvektors in vitro zu gestatten.
Die Immunmodulatoren können lösliche oder natürlich vorkommende Proteine, einschließlich Cytokine und monoklonale Antikörper, umfassen. Die Immunmodulatoren können weitere Pharmazeutika umfassen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Immunmodulatoren allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. So können beispielsweise Cyclophosphamid sowie der spezifischere Immunmodulator monoklonaler Anti-CD4-Antikörper gleichzeitig verabreicht werden. In solch einem Fall dient Cyclophosphamid als Mittel zur Blockierung der T_H1-Aktivierung und zur Stabilisierung der Transgenexpression über den Zeitraum der durch die Anti-CD4-MAb-Behandlung induzierten transienten Immunblockade hinaus.
Eine geeignete Menge bzw. Dosierung des ausgewählten Immunmodulators hängt hauptsächlich von der Identität des Modulators, der Menge an das Transgen tragendem rekombinanten Vektor, die dem Patienten zunächst verabreicht wird, sowie dem Verfahren und/oder der Stelle der Zuführung des Vektors ab. Diese Faktoren lassen sich empirisch vom Fachmann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahrensweisen beurteilen. Weitere Sekundärfaktoren, wie beispielsweise das behandelte Leiden, das Alter, Gewicht, der allgemeine Gesundheitszustand sowie Immunstatus des Patienten, können ebenso von einem Arzt bei der Bestimmung der Dosierung von dem Patienten zuzuführenden Immunmodulator in Verbindung mit einem gentherapeutischen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden.
Im allgemeinen wird beispielsweise eine für den Menschen therapeutisch wirksame Dosierung eines Proteinimmunmodulators, z.B. IL-12 oder IFN-γ, im Bereich von etwa 0,5 μg bis etwa 5 mg pro etwa 1 × 10⁷ pfu/ml Virusvektor verabreicht. Zur Abwägung des therapeutischen Nutzens gegen eventuelle negative Nebenwirkungen können vom Fachmann verschiedene Dosierungen bestimmt werden.
A. Monoklonaler Antikörper und lösliche Proteine
Vorzugsweise beinhaltet die Hemmung einer negativen Immunantwort gegenüber dem gentherapeutischen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung eine nichtspezifische Inaktivierung von CD4⁺-Zellen, beispielsweise durch Verabreichung eines entsprechenden monoklonalen Antikörpers. Dabei sind derartige blockierende Antikörper vorzugsweise „humanisiert", um beim Empfänger die Entwicklung einer Immunantwort gegenüber dem blockierenden Antikörper zu verhindern. Ein „humanisierter Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, dessen komplimentaritätsbestimmende Bereiche (complementarily determining regions, CDRs) und/oder andere Teile seiner leichten und/oder schweren variablen Domänen-Gerüstbereiche aus einem nichtmenschlichen Donor-Immunglobulin stammen, wobei die restlichen, von Immunglobulin abgeleiteten Teile des Moleküls aus einem oder mehreren menschlichen Immunglobulinen stammen. Zu solchen Antikörpern können auch Antikörper gezählt werden, die durch eine mit einer nichtmodifizierten Donor- oder Akzeptor-leichten Kette oder einer chimärischen leichten Kette assoziierte humanisierte schwere Kette oder umgekehrt gekennzeichnet sind. Eine derartige „Humanisierung" kann mit im Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt werden. Siehe beispielsweise G.E. Mark und E.A. Padlan, „Chap. 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, Bd. 113, Springer-Verlag, New York (1994), S. 105–133, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Zu weiteren geeigneten Antikörpern zählen solche, die spezifisch CD4⁺-Zellen hemmen oder abreichern, wie beispielsweise ein gegen das Zelloberflächen-CD4 gerichteter Antikörper. Es konnte von den Erfindern gezeigt werden, daß die Abreicherung an CD4⁺-Zellen die CTL-Eliminierung des Virusvektors hemmt. Zu derartigen modulatorischen Agentien gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Anti-T-Zellen-Antikörper, wie z.B. anti-OKT3+ [siehe z.B. US-Patent Nr. 4,658,019; Europäische Patentanmeldung Nr. 501,233, veröffentlicht am 2. September 1992]. Siehe Beispiel 2 unten, bei dem zur Abreicherung von CD4⁺-Zellen der im Handel erhältliche Antikörper GK1.5 (ATCC Accession No. TIB207) eingesetzt wird.
Als Alternative eignen sich als Immunmodulator gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung alle Agentien, die die für die Aktivierung von B-Zellen durch T_H-Zellen notwendigen Wechselwirkungen und somit die Produktion neutralisierender Antikörper stören oder blockieren. So erfordert beispielsweise die Aktivierung von B-Zellen durch T-Zellen, daß bestimmte Wechselwirkungen stattfinden [F.H. Durie et al, Immunol. Today, 15(9):406–410 (1994)], wie z.B. die Bindung von CD40-Ligand auf der T-Helferzelle an das CD40-Antigen auf der B-Zelle sowie die Bindung der CD28- und/oder CTLA4-Liganden auf der T-Zelle an das B7-Antigen auf der B-Zelle. Ohne die beiden Wechselwirkungen kann die B-Zelle nicht zur Induktion der Produktion des neutralisierenden Antikörpers aktiviert werden.
Die Wechselwirkung zwischen CD40-Ligand (CD40L) und CD40 stellt einen wünschenswerten Punkt zur Blockierung der Immunantwort gegenüber gentherapeutischen Vektoren dar, und zwar aufgrund ihrer breiten Aktivität sowohl bei der Aktivierung als auch Funktion der T-Helferzellen ebenso wie der Abwesenheit von Redundanz in ihrem Signalweg. Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet somit die transiente Blockierung der Wechselwirkung von CD40L mit CD40 zum Zeitpunkt der Verabreichung von Adenovirusvektor. Dies läßt sich durch Behandlung mit einem Agens erreichen, das den CD40-Liganden auf der T_H-Zelle blockiert und die normale Bindung von CD40-Ligand auf der T-Helferzelle mit dem CD40-Antigen auf der B-Zelle stört. Durch die Blockierung der CD40L-CD40-Wechselwirkung wird die Aktivierung der T-Helferzellen verhindert, die zu Problemen mit der transgenen Stabilität und Wiederverabreichung beiträgt.
Somit läßt sich ein Antikörper gegen CD40-Ligand (Anti-CD40L) [erhältlich von der Firma Bristol-Myers Squibb Co; siehe z.B. Europäische Patentanmeldung 555,880, veröffentlicht am 18. August 1993] oder ein lösliches CD40-Molekül als erfindungsgemäßer Immunmodulator auswählen.
Als Alternative wird durch ein Agens, das die auf T-Helferzellen vorhandenen CD28- und/oder CTLR4-Liganden blockiert, die normale Bindung dieser Liganden mit dem Antigen B7 auf der B-Zelle gestört. Somit läßt sich eine lösliche Form von B7 oder ein Antikörper gegen CD28 oder CTLA4, z.B. CTLA4-Ig [erhältlich von der Firma Bristol-Myers Squibb Co; siehe z.B. Europäische Patentanmeldung 606,217, veröffentlicht am 20. Juli 1994] als erfindungsgemäßer Immunmodulator auswählen. Die Erfindung besitzt größere Vorteile als die unten beschriebene Cytokinverabreichung zur Verhinderung der T_H2-Aktivierung, da sie sowohl zelluläre als auch humorale Immunantworten gegenüber Fremdantigenen betrifft.
B. Cytokine
Bei der Erfindung können noch weitere Immunmodulatoren, die die T_H-Zellfunktion hemmen, eingesetzt werden.
Somit kann zum Zeitpunkt der primären Verabreichung des Virusvektors ein Immunmodulator zur Verwendung bei der Erfindung verabreicht werden, durch den selektiv die Funktion der T_H1-Untergruppe von CD4⁺-T-Helferzellen gehemmt wird. Ein derartiger Immunmodulator ist Interleukin-4 (IL-4). IL-4 verstärkt die antigenspezifische Aktivität von T_H2-Zellen auf Kosten der T_H1-Zellfunktion [siehe z.B. Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:5894-5898 (1986); US-Patent Nr. 5,017,691]. Dabei ist vorstellbar, daß andere Immunmodulatoren, die in der Lage sind, die T_H1-Zellfunktion zu hemmen, ebenso bei der Erfindung geeignet sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei dem Immunmodulator um ein Cytokin handeln, das die Aktivierung der T_H2-Untergruppe von T-Helferzellen verhindert. Der Erfolg dieser Ausführungsformen hängt von dem relativen Beitrag ab, den T_H2-abhängige Ig-Isotypen bei der Virusneutralisierung liefern, deren Profil durch den Stamm, die Tierspezies ebenso wie durch die Art der Viruszuführung und das Zielorgan beeinflußt werden kann.
Ein wünschenswerter Immunmodulator zur Verwendung bei der Erfindung, der selektiv die Funktion der CD4⁺-T-Zellen-Untergruppe T_H2 zum Zeitpunkt der primären Verabreichung des Virusvektors hemmt, umfaßt Interleukin-12 (IL-12). IL-12 verstärkt die antigene spezifische Aktivität von T_H1-Zellen auf Kosten der T_H2-Zellfunktion [siehe z.B. Europäische Patentanmeldung Nr. 441,900; P. Scott, Science, 260:496–497 (1993); R. Manetti et al, J. Exp. Med., 177:1199 (1993); A. D'Andrea et al, J. Exp. Med., 176:1387 (1992)]. Zur Verwendung bei der Erfindung liegt IL-12 vorzugsweise in Proteinform vor. Menschliches IL-12 kann mit bekannten Techniken rekombinant produziert oder im Handel erworben werden. Als Alternative kann es gentechnisch in einem Virusvektor (bei dem es sich gegebenenfalls um den gleichen Vektor, der zur Expression des Transgens verwendet wurde, handeln kann) eingeführt und in einer Zielzelle in vivo oder ex vivo exprimiert werden.
Eine T_H2-spezifische Ablation mit IL-12 ist besonders wirksam bei lungengerichteten Gentherapien, bei denen IgA die primäre Quelle für den neutralisierenden Antikörper darstellt. Bei der lebergerichteten Gentherapie tragen sowohl T_H1- als auch T_H2-Zellen zur Produktion virusspezifischer Antikörper bei. Allerdings läßt sich die Gesamtmenge an neutralisierendem Antikörper mit IL-12 vermindern.
Ein weiterer ausgewählter Immunmodulator, der eine ähnliche Funktion ausübt, ist γ-Interferon (IFN-γ) [S.C. Morris et al, J. Immunol., 152:1047–1056 (1994); F.P. Heinzel et al, J. Exp. Med., 177:1505 (1993)]. Es wird angenommen, daß IFN-γ viele der biologischen Wirkungen von IL-12 über die Sekretion aktivierter Makrophagen und T-Helferzellen vermittelt. IFN-γ hemmt ebenso teilweise die IL-4-stimulierte Aktivierung von T_H2. IFN-γ ist ebenfalls von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich.
Als Alternative kann es mit bekannten gentechnischen Verfahren in einen Virusvektor eingeführt und in einer Zielzelle in vivo oder ex vivo exprimiert werden.
Vorzugsweise liegen derartige Cytokin-Immunmodulatoren in Form menschlicher rekombinanter Proteine vor. Diese Proteine können mit im Fachgebiet vorhandenen Verfahren produziert werden. Aktive Peptide, Fragmente, Untereinheiten oder Analoge der bekannten hier beschriebenen Immunmodulatoren, wie z.B. IL-12 oder γ-Interferon, die jeweils die T_H2 hemmende Funktion dieser Proteine teilen, sind ebenso bei diesem Verfahren geeignet, wenn es sich bei den neutralisierenden Antikörpern um T_H2-vermittelte Antikörper handelt.
Wie in den Beispielen unten veranschaulicht, sieht man, daß die Cytokine IL-12 (das T_H1-Zellen aktiviert, so daß diese IFN-γ sezernieren) und IFN-γ lediglich die humorale Immunität ablatieren (d.h. sie hemmen die T_H1-Differenzierung). Die gleichzeitige Verabreichung eines der beiden Cytokine zum Zeitpunkt der Virusinstallation verhinderte die Bildung von IgA und gestattete eine effiziente erneute Verabreichung des Virus.
Um eine wirksame zweite Virusverabreichung bei der lebergerichteten Gentherapie zu gestatten, kann das Verfahren vorzugsweise die Verabreichung von mehr als einen Cytokin, spezifische Dosierungspläne und/oder die gleichzeitige Verabreichung eines zusätzlichen Immunmodulators, wie z.B. eines oder mehrerer der oben erörterten Antikörper, umfassen. Die Verwendung von Cytokinen ist dabei vorteilhaft, da es sich bei Cytokinen um Naturprodukte handelt, die somit wahrscheinlich keine ungünstigen Immunantworten in dem Patienten, dem sie verabreicht werden, erzeugen.
C. Weitere Pharmazeutika
Ebenso können bei den erfindungsgemäßen Verfahren andere Immunmodulatoren oder Agentien, die die Immunfunktion nichtspezifisch hemmen, d.h. Cyclosporin A oder Cyclophosphamid, verwendet werden. So konnte beispielsweise gezeigt werden, daß eine kurze Behandlung mit Cyclophosphamid die Aktivierung sowohl von CD4- als auch CD8-T-Helferzellen gegen das Adenovirus-Kapsidprotein zum Zeitpunkt der Viruszuführung an die Leber erfolgreich unterbricht. Als Ergebnis fand eine verlängerte Transgenexpression statt, und bei höheren Dosen wurde die Bildung von neutralisierendem Antikörper verhindert, was eine erfolgreiche Wiederverabreichung des Vektors gestattete. In der Lunge wurde durch Cyclophosphamid die Bildung von neutralisierenden Antikörpern bei allen Dosen verhindert und die Transgenexpression bei hoher Dosis stabilisiert.
II. Virusvektoren
Geeignete Virusvektoren, die bei der Gentherapie von Nutzen sind, sind allgemein bekannt, wobei dazu unter anderem Retroviren, Vacciniaviren, Poxviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren gehören. Es wird erwartet, daß sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei allen Viren, die die Grundlage für einen gentherapeutischen Vektor bilden, eignet. Beispielhafte Virusvektoren für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch Adenovirusvektoren (siehe z.B., M. S. Horwitz et al, "Adenoviridae and Their Replication", Virology, second edition, pp. 1712, ed. B. N. Fields et al, Raven Press Ltd., New York (1990); M. Rosenfeld et al, Cell, 68:143–155 (1992); J. F. Engelhardt et al, Human Genet. Ther., 4:759–769 (1993); Yang IV; J. Wilson, Nature, 365:691–692 (Oct. 1993); B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", Hrsg. P. Tijsser, CRC Press, S. 155–168 (1990).
Besonders wünschenswert sind menschliche Typ-C-Adenoviren (Ad), einschließlich der Serotypen Ad2 und Ad5, die durch Deletion des frühen Genlocus, der für E1a und E1b codiert, für die Gentherapie replikationsdefekt gemacht wurden. Es liegen zahlreiche Veröffentlichungen über die Verwendung E1-deletierter Adenoviren in der Gentherapie vor. Siehe, K.F. Kozarsky und J. M. Wilson, Curr. Opin. Genet. Dev., 3:499–503 (1993). Die DNA-Sequenzen einer Reihe von Adenovirustypen sind über Genebank zugänglich, einschließlich des Typs Ad5 [Genbank Accession No. M73260]. Die Adenovirussequenzen können einem beliebigen bekannten Adenovirustyp entnommen werden, einschließlich den gegenwärtig identifizierten 41 menschlichen Typen [Horwitz et al, Virology, 2. Aufl., B. N. Fields, Raven Press, Ltd., New York (1990)]. Verschiedene Adenovirusstämme stehen bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, oder sind auf Anfrage von verschiedenen kommerziellen und institutionellen Quellen erhältlich. In der vorliegenden Ausführungsform wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit ein Adenovirustyp 5 (Ad5) verwendet.
Es wird nicht erwartet, daß die vorliegende Erfindung durch die Auswahl des für die Konstruktion der rekombinanten Vektoren geeigneten Virus, einschließlich des Virustyps, z.B. Adenovirus, und des Stamms beschränkt wird.
In ähnlicher Weise stellt die Auswahl des im Virusvektor enthaltenen Transgens keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Es wird erwartet, daß sich dieses Verfahren mit allen Transgenen eignet. Vom Fachmann können geeignete Transgene für die Zuführung an einen Patienten in einem Virusvektor für die Gentherapie ausgewählt werden. Diese therapeutischen Nukleinsäuresequenzen codieren typischerweise für Produkte zur Verabreichung und Expression in einem Patienten in vivo oder ex vivo, um einen vererbten oder nichtvererbten genetischen Defekt zu ersetzen oder zu korrigieren oder eine epigenetische Störung bzw. Krankheit zu behandeln. Zu den therapeutischen Genen, die für die Durchführung einer Gentherapie wünschenswert sind, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Gen für einen VLDL (very low density lipoprotein)-Rezeptor zur Behandlung von familiärer Hypercholesterinämie oder familiärer kombinierter Hyperlipidämie, das CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator)-Gen zur Behandlung von cystischer Fibrose, das DMD Becker-Allel zur Behandlung von Duchenne-Muskeldystrophy sowie eine Reihe anderer Gene, die vom Fachmann für die Behandlung einer bestimmten Störung oder Krankheit leicht ausgewählt werden können. Somit wird nicht angenommen, daß die Auswahl des Transgens eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung darstellt da eine solche Auswahl im Bereich des fachmännischen Wissens liegt.
Der ein therapeutisches Gen tragende Virusvektor kann vorzugsweise als Suspension in einer biologisch verträglichen Lösung oder einem pharmazeutisch unbedenklichen Zuführungsvehikel einem Patienten verabreicht werden. Als geeignetes Vehikel zählt sterile Kochsalzlösung. Weitere wäßrige und nichtwäßrige isotonische sterile Injektionslösungen sowie wäßrige und nichtwäßrige sterile Suspensionen, die als pharmazeutisch unbedenkliche Träger sowie dem Fachmann allgemein bekannt sind, können für diesen Zweck eingesetzt werden.
Der Virusvektor wird in ausreichenden Mengen zur Transfektion der gewünschten Zellen und zur Bereitstellung ausreichender Transduktions- und Expressionsniveaus des ausgewählten Transgens verabreicht, so daß ein therapeutischer Nutzen ohne übermäßige negative physiologische Auswirkungen bzw. mit medizinisch unbedenklichen physiologischen Auswirkungen, die sich vom Fachmann auf den Gebieten der Medizin bestimmen lassen, bereitgestellt wird. Zu herkömmlichen und pharmazeutisch unbedenklichen Verabreichungswegen zählen die direkte Zuführung an das Zielorgan, -gewebe bzw. den Zielort, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale, orale sowie andere parenterale Verabreichungswege. Die Verabreichungswege können dabei, falls gewünscht, kombiniert werden.
Die Dosierungen des Virusvektors hängen hauptsächlich von Faktoren, wie z.B. dem behandelten Leiden, dem ausgewählten Gen, dem Alter, Gewicht und Gesundheitszustand des Patienten ab und können daher unter Patienten variieren. So liegt beispielsweise eine therapeutisch wirksame Dosierung der Virusvektoren beim Menschen im allgemeinen im Bereich von etwa 20 bis etwa 50 ml Kochsalzlösung mit Konzentrationen von etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ pfu/ml Viren. Eine bevorzugte Dosierung bei einem Erwachsenen beträgt etwa 20 ml Kochsalzlösung mit den obigen Konzentrationen. Die Dosierung wird zur Abwägung des therapeutischen Nutzens gegen eventuelle Nebenwirkungen eingestellt. Die Expressionsniveaus des ausgewählten Gens lassen sich zur Bestimmung der Auswahl, Einstellung oder Häufigkeit der verabreichten Dosierung verfolgen.
III. Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels
Die Erfindung beinhaltet die gleichzeitige Verabreichung des ausgewählten Immunmodulators mit dem ausgewählten rekombinanten Virusvektor. Dabei findet die gleichzeitige Verabreichung so statt, daß der Immunmodulator und der Vektor zeitnah zueinander verabreicht werden. Dabei ist es vorliegend bevorzugt, den Modulator gleichzeitig mit oder nicht mehr als ein bis drei Tage vor der Verabreichung des Vektors zu verabreichen.
Wie durch die Beispiele unten veranschaulicht, wird der Immunmodulator, gleichgültig, ob es sich dabei um einen Anti-CD40L-Antikörper, Anti-CD4-Antikörper oder ein Cytokin handelt, wünschenswerterweise zeitnah mit der Verabreichung des für die Gentherapie verwendeten Virusvektors verabreicht. Insbesondere wird durch die Verabreichung von IL-12 oder IFN-γ eine Verringerung der T_H2-Zellspiegel über einen Zeitraum von 2–3 Tagen hervorgerufen. Daher werden IL-12 und/oder IFN-γ wünschenswerterweise innerhalb eines Tages der Verabreichung des das zuzuführende Gen tragenden Virusvektors verabreicht. Vorzugsweise wird das IL-12 und/oder IFN-γ allerdings im wesentlichen gleichzeitig mit dem Virusvektors verabreicht.
Der Immunmodulator kann in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Kochsalzlösung, verabreicht werden. So wird beispielsweise der Immunmodulator bei einer vom Virusvektor getrennten Formulierung wünschenswerterweise in Kochsalzlösung suspendiert. Dabei kann eine solche Lösung herkömmliche Bestandteile, z.B. Mittel zum Einstellen des pH-Werts, Konservierungsmittel und dergleichen, enthalten. Derartige Bestandteile sind bekannt und können vom Fachmann leicht ausgewählt werden.
Als Alternative kann der Immunmodulator selbst in Form von DNA verabreicht werden, und zwar entweder getrennt vom Vektor oder im Gemisch mit dem das Transgen tragenden rekombinanten Vektor. Im Fachgebiet gibt es Verfahren zur pharmazeutischen Präparation des Modulators als Protein oder als DNA [siehe z.B. J. Cohen, Science, 259:1691–1692 (1993) bezüglich DNA-Impfstoffen]. Wünschenswerterweise wird der Immunmodulator über den gleichen Weg wie der rekombinante Vektor verabreicht.
Der Immunmodulator kann direkt in die den dem Patienten verabreichten Virusvektor enthaltende Zusammensetzung formuliert werden. Als Alternative kann der Immunmodulator getrennt, vorzugsweise kurz vor oder nach Verabreichung des Virusvektors, verabreicht werden. Bei einer weiteren Alternative kann eine einen ersten Immunmodulator, wie z.B. IL-12, enthaltende Zusammensetzung getrennt von einer einen zweiten Immunmodulator, wie z.B. Anti-CD40L-Antikörper, enthaltenden Zusammensetzung, und so weiter, je nach Anzahl der verabreichten Immunmodulatoren, verabreicht werden. Diese Verabreichungen können jeweils unabhängig vor, gleichzeitig mit oder nach Verabreichung des Virusvektors erfolgen.
Die Verabreichung des ausgewählten Immunmodulators kann während der Behandlung mit dem das Transgen tragenden rekombinanten Virusvektor wiederholt werden, und zwar entweder während des Zeitraums, in dem das Transgen exprimiert wird (wie über Tests, die die Transgenexpression oder die vorgesehene Wirkung davon nachweisen, beobachtet), oder jeweils mit jeder Auffrischimpfung des rekombinanten Vektors. Als Alternative kann bei jeder erneuten Injektion des gleichen Virusvektors ein unterschiedlicher Immunmodulator eingesetzt werden. Handelt es sich allerdings bei dem rekombinanten Virus um ein Adenovirus, so ist dessen Verwendung ferner dadurch gekennzeichnet, daß im Hinblick auf die Offenbarung in der oben erwähnten WO 96/12406, die nach dem Anmeldedatum des vorliegenden Falls veröffentlicht wurde, auf die erneute Verabreichung des Adenovirus in Gegenwart eines Immunmodulators verzichtet wird.
Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, daß sie eine transiente Manipulation darstellt, die lediglich zum Zeitpunkt der Verabreichung des gentherapeutischen Vektors notwendig ist. Es wird erwartet, daß diese Strategie sicherer ist als auf einer Toleranzinduktion beruhende Strategien, durch die die Fähigkeit des Empfängers, auf Virusinfektionen zu reagieren, permanent beeinträchtigt werden kann.
Weiterhin wird erwartet, daß die bevorzugte Verwendung von Immunmodulatoren, wie beispielsweise den oben erwähnten Cytokinen oder Antikörpern, sicherer ist als die Verwendung von Agentien, wie beispielsweise Cyclosporin oder Cyclophosphamid (die eine generalisierte Immunsuppression hervorrufen), da die transiente Immunmodulation selektiv ist (d.h. die CTL-vermittelten Antworten bleiben ebenso wie von der T_H1-Funktion abhängige humorale Antworten erhalten).
In einem Beispiel für einen wirksamen Gentransfer gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den ausgewählten Immunmodulatoren um IL-12, das die selektive Induktion von T_H1-Zellen verursacht, und/oder IFN-γ, das die Induktion T_H2-Zellen unterdrückt. Ein weiterer bevorzugter Immunmodulator ist der Anti-CD4⁺-Antikörper GK1.5, der die T_H1-Zellen abreichert und die CTL-Eliminierung des Vektors reduziert. Noch ein weiterer bevorzugter Immunomodulator ist der monoklonale Anti-CD40-Ligand-Antikörper MR1, der von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhältlich ist.
Wie nachfolgend beispielhaft dargestellt, gestattete die Verwendung der oben identifizierten Immunmodulatoren einen wirksamen Gentransfer ebenso wie die wiederholte Verwendung des gleichen Virusvektors. In Verbindung mit der Gentherapie, bei der ein entweder ein Transgen für alkalische Phosphatase („ALP"), ein Transgen für beta-Galactosidase („lacZ") oder ein LDLR (low density lipoprotein receptor)-Transgen („LDLR") enthaltender Adenovirusvektor eingesetzt wurde.
Durch die folgenden Beispiele werden die bevorzugten Verfahren zur erfindungsgemäßen Herstellung geeigneter, bei der Gentherapie nützlicher Virusvektoren veranschaulicht. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und stellen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung dar.
Beispiel 1 – Konstruktion und Aufreinigung beispielhafter rekombinanter Adenovirusvektoren
Das rekombinante Adenovirus H5.010CMVlacZ wurde wie folgt konstruiert. Verwendet wurde das Plasmid pAd.CMVlac [beschrieben in Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269:13695–13702 (1994)], das die Adenovirus-Karteneinheiten 0–1 und daran anschließend einen Cytomegalovirus-Enhancer/Promotor [Boshart et al, Cell, 41:521–530 (1985)], ein Gen für E. coli-beta-Galactosidase (lacZ), ein Polyadenylierungssignal (pA), die Adenovirus-5-Karteneinheiten 9.2–16 (Ad 9.2–16) sowie generische Plasmidsequenzen, einschließlich eines Replikationsursprungs und eines Ampicillinresistenz-Gens, enthält. pAd.CMVlacZ wurde mit NheI linearisiert und in 293-Zellen [ATCC CRL1573] zusammen mit sub360-DNA (aus Adenovirus-Typ 5), die mit XbaI und ClaI verdaut worden war, wie zuvor beschrieben [K.F. Kozarsky, Somatic Cell Mol. Genet., 19:449–458 (1993) und Kozarsky (1994), oben zitiert] cotransfiziert. Das erhaltene rekombinante Virus H5.010CMVlacZ enthält die Adenovirus-Karteneinheiten 0–1 und daran anschließend einen CMV-Enhancer/Promotor, ein lacZ-Gen, ein Polyadenylierungssignal (pA), die Adenovirus-Karteneinheiten 9.2–100, mit einer kleinen Deletion im E3-Gen bei 78.5–84.3 mu aus dem Ad 5 sub360-Grundgerüst. Das rekombinante Adenovirus H5.010CBALP enthält die Adenovirus-Karteneinheiten 0–1 und daran anschließend einen CMV-verstärkten zytoplasmatischen β-Actin-Promotor aus Huhn [T.A. Kost et al, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)], ein Gen für ALP aus menschlicher Plazenta, ein Polyadenylierungssignal (pA) sowie die Adenovirus-Typ 5-Karteneinheiten 9–100 mit einer kleinen Deletion im E3-Gen bei 78.5 bis 84.3 mu aus dem Ad 5 sub360-Grundgerüst. Dieses rekombinante Adenovirus wurde im wesentlichen ähnlich wie das oben beschriebene H5.010CMVlacZ-Adenovirus konstruiert. Siehe auch Kozarsky (1994), oben zitiert.
Diese rekombinanten Adenoviren, H5.010CMVlacZ und H5.010CBALP, wurden nach Transfektion [Graham, Virol., 52:456–467 (1974)] isoliert und zwei Runden Plaque-Aufreinigung unterzogen. Lysate wurden auf zwei aufeinanderfolgenden Cäsiumchloriddichtegradienten auf gereinigt, wie zuvor beschrieben [Englehardt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11192–11196 (1991)]. Die Abtrennung des Cäsiumchlorids erfolgte, indem das Virus über BioRad-DG10-Gelfiltrationssäulen unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphatebuffered saline, PBS) gegeben wurde.
Für die Mausexperimente wurde entweder frisches Virus verwendet, oder es wurde nach der Säulenreinigung Glycerin mit einer Endkonzentration von 10% (v/v) zugegeben und das Virus bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
Beispiel 2 Verbesserung des adenovirus-vermittelten Gentransfers nach zweiter Verabreichung durch IL-12 und IFN-γ in Mauslunge
In diesem Beispiel wurden die rekombinanten Adenoviren H5.010CMVlacZ und H5.010CBALP verwendet. Die Viren exprimieren jeweils ein unterschiedliches Reportertransgen, dessen Expression von der des ersten Reportertransgens unterschieden werden kann.
Weibliche C57BL/6-Mäuse (6~8 Wochen alt) wurden mit Suspensionen von H5.010CBALP (1 × 10⁹ pfu in 50 μl PBS) über die Trachea am Tag 0 und in ähnlicher Weise mit H5.010CMVlacZ am Tag 28 infiziert. Dabei wurde eine Gruppe solcher Mäuse als Kontrolle verwendet. Bei einer weiteren Gruppe von Mäusen wurde eine akute Abreicherung an CD4⁺-Zellen durch i.p.-Injektion von Antikörper gegen CD4⁺-Zellen (GK1.5; ATCC Nr. TIB207, 1:10-Verdünnung von Aszites) zum Zeitpunkt der ersten Gentherapie (Tag –3, 0 und +3). durchgeführt. Eine dritte Gruppe von Mäusen wurde mit IL-12 (1 μg intratracheal oder 2 μg, i.p.-Injektionen) zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung von Virus (Tag 0 und +1) injiziert. Eine vierte Gruppe von Mäusen wurde mit Gamma-Interferon (1 μg intratracheal oder 2 μg, i.p.-Injektionen) zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung von Virus (Tag 0 und +1) injiziert.
Die Mäuse wurden nachfolgend an Tag 3, 28 bzw. 31 getötet, wobei bei der Autopsie Lungengewebe für die Gefrierschnitte präpariert wurden, während bronchoalveoläre Lavage (BAL) und MLN (mediastinal lymph nodes) für die immunologischen Tests geerntet wurden.
A. Gefrierschnitte
Die Lungengewebe wurden hinsichtlich ALP-Expression an Tag 3 und Tag 28 mittels histochemischer Färbung nach den Verfahren von Yang I, oben zitiert, beurteilt. Die Die β-Galactosidase-Expression wurde an Tag 31 mittels histochemischer X-gal-Färbung getestet. Die unten beschriebenen Ergebnisse wurden aus den histochemischen Anfärbungen mit alkalischer Phosphatase (100fache Vergrößerung) bzw. X-gal-Anfärbungen mit β-Galactosidase (100fache Vergrößerung) erhalten.
Die Instillation von ALP-Virus (10⁹ pfu) in die Atemwege aller Gruppen der C57BL%6-Mäuse führte zur Transgenexpression auf hohem Niveau in der Mehrzahl der luftführenden Wege, die bis Tag 28 auf nichtnachweisbare Niveaus gefallen waren. Es konnte gezeigt werden, daß der Verlust an Transgenexpression an der CTL-vermittelten Eliminierung der gentechnisch veränderten Hepatozyten lag [Yang I, oben zitiert]. Bei den Kontrollmäusen wurde drei Tage nach der zweiten Verabreichung von Virus, d.h. an Tag 31, keine rekombinante Genexpression nachgewiesen.
Die Verabreichung von Virus an die Tiere mit CD4⁺-Mangel wurde mit einer rekombinanten Transgenexpression auf hohem Niveau assoziiert, die über einen Monat stabil war. Die Expression des zweiten Virus war an Tag 31 nachweisbar. Somit gestattet die Abreicherung der CD4⁺-Zellen auf wirksame Weise die Wiederverabreichung des Vektors ohne sofortige CTL-Eliminierung.
Das ursprüngliche hohe Gentransferniveau verringerte sich nach etwa einem Monat in den mit IL-12 behandelten Mäusen. Allerdings wurde im Gegensatz zur Kontrolle ein hohes Niveaus an Gentransfer zu Luftwegepithelzellen erzielt, wenn Virus mit IL-12 behandelten Tieren an Tag 28 wieder verabreicht wurde, wie die Ergebnisse von Tag 31 zeigen.
Die mit Gamma-Interferon behandelten Tiere waren praktisch von den mit IL-12 behandelten Tieren dahingehend nicht zu unterscheiden, daß nach einer zweiten Verabreichung von Virus ein effizienter Gentransfer erzielt wurde.
Somit ermöglichte die Verwendung dieser Cytokine als Immunmodulatoren die wiederholte Verabreichung des Vektors ohne dessen sofortige Eliminierung durch neutralisierenden Antikörper. In anderen Experimenten wurden T_H2-Zellen auf Kosten einer erhöhten T_H1-Aktivierung nicht gehemmt. Bei Mäusen, die mit dem ALP-Virus parenteral bzw. mit IL-12 i.p. behandelt worden waren, führte das IL-12 zu keinem Anstieg der adenovirus-spezifischen CTL-Aktivität, wie durch Chromfreisetzungstests gezeigt werden konnte. Von besonderer Wichtigkeit ist die Tatsache, daß es durch die Behandlung der Tiere mit IL-12 zum Zeitpunkt der intratrachealen Instillation von Virus zu keiner verstärkten Entzündung bzw. keiner verkürzten Verweildauer des Transgens nach einer zweiten Verabreichung von Virus kam.
B. Immunologische Tests – MLN
Lymphozyten aus MLN der Kontrollgruppe sowie der mit IL-12 behandelten Gruppe von C57BL/6-Mäusen wurden 28 Tage nach Verabreichung von H5.010CBALP geerntet und in vitro mit UV-inaktiviertem H5.010CMVlacZ bei 10 Partikeln/Zelle 24 Stunden erneut stimuliert. Zellfreie Überstände wurde auf das Vorhandensein von IL-2 bzw. IL-4 auf HT-2-Zellen (einer IL-2- bzw. IL-4-abhängigen Zellinie) getestet [Yang I, oben zitiert]. Das Vorhandensein von IFN-γ im gleichen Lymphozytenkulturüberstand wurde an L929-Zellen wie beschrieben gemessen [Yang I, oben zitiert]. Der Stimulationsindex (S.I.) wurde berechnet, indem in in Überständen von mit Virus erneut stimulierten Lymphozyten kultivierte HT-2-Zellen eingebaute ³H-Thymidin-cpm durch in in Überständen von in antigenfreiem Medium inkubierten Lymphozyten kultivierte HT-2-Zellen eingebaute ³H-Thymidin-cpm dividiert wurden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I dargestellt.
Tabelle 1
Die Stimulation von Lymphozyten aus regionalen Lymphknoten mit beiden rekombinanten Adenoviren führte zur Sekretion von für die Aktivierung sowohl der T_H1-Untergruppe (d. h. IL-2 und IFN-γ) als auch die T_H2-Untergruppe (d.h. IL-4) von T-Helferzellen spezifischen Cytokinen (Tabelle I).
Die Analyse von Lymphozyten aus den mit IL-12-behandelten Tieren, die in vitro mit Virus stimuliert worden waren, zeigte eine erhöhte Sekretion von IL-2 und IFN-γ relativ zur Produktion von IL-4 im Vergleich mit Tieren, die kein IL-12 erhalten hatten (d. h. das Verhältnis IL-2/IL-4 erhöhte sich von 3 auf 6 bei Verwendung von IL-12; Tabelle I).
C. Immunologische Tests – BAL
Aus Tieren 28 Tage nach dem primären In-Kontakt-Bringen mit rekombinantem Virus erhaltene BAL-Proben wurden hinsichtlich neutralisierenden Antikörpers gegen Adenovirus und anti-Adenovirus-Antikörperisotypen wie folgt beurteilt. Die gleichen vier Gruppen von C57BL/6-Mäusen, d.h. Kontrolle, CD4⁺-Mangel, IL-12-behandelt und IFN-γ-behandelt, wurden mit H5.010CBALP infiziert. Neutralisierender Antikörper wurden in Verdünnungsreihen von BAL-Proben (100 μl) gemessen, die mit H5.010CBlacZ (1 × 10⁶ pfu in 20 μl) gemischt, eine Stunde bei 37°C inkubiert und in 96-Loch-Platten auf 80% konfluente Hela-Zellen (2 × 10⁴ Zellen pro Loch) aufgetragen wurden. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37°C wurden in jedes Loch jeweils 100 μl DMEM mit 20% FBS gegeben. Die Zellen wurden fixiert und am folgenden Tag hinsichtlich β-Galactosidase-Expression angefärbt.
Alle Zellen waren in Abwesenheit von anti-adenoviralen Antikörpern lacZ-positiv.
Adenovirus-spezifischer Antikörperisotyp wurde in BAL unter Verwendung eines ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt. Dabei wurden kurz gesagt 96-Loch-Platten mit 100 μl PBS mit 5 × 10⁹ H5.010CBlacZ-Partikeln 18 Stunden bei 4°C beschichtet. Die Vertiefungen wurden fünfmal mit PBS gewaschen. Nach dem Blockieren mit 200 μl 2° BSA in PBS wurden die Platten einmal mit PBS gespült und mit 1:10-verdünnten BAL-Proben 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Vertiefungen ausgiebig gewaschen und erneut mit 100 μl 1:1000-verdünntem ALP-konjugierten anti-Maus-IgG oder IgA (Sigma) gefüllt. Die Platten wurden inkubiert, anschließend fünfmal gewaschen, und die Vertiefungen wurden jeweils mit 100 μl der Substratlösung (p-Nitrophenylphosphat, PNPP) versetzt. Die Substratumwandlung wurde durch Zugabe von 50 μl 0,1 M EDTA gestoppt, und die Reaktionen wurden bei 405 nm gelesen.
Die Ergebnisse sind in 1A bis 1C graphisch dargestellt, und zwar als Zusammenfassung des Titers von neutralisierendem Antikörper und der relativen Mengen (OD₄₀₅) an in BAL-Proben vorhandenem IgG und IgA. Dabei wurde der Titer von neutralisierendem Antikörper für jede Probe jeweils als die höchste Verdünnung, bei der weniger als 50% der Zellen blau gefärbt wurden, angegeben.
Wie am ersten Balken von 1A bis 1C demonstriert, wurden die in Tabelle 1 oben identifizierten Cytokine in den Kontrollmäusen mit dem Auftreten von Antikörpern sowohl des IgG- als auch des IgA-Isotyps gegen Adenovirusproteine in BAL assoziiert, die in einem In-vitro-Test bis zu einer Verdünnung von 1:800 zur Neutralisierung des rekombinanten Ad5-Vektors fähig waren.
Wie im zweiten Balken der Graphen in 1A bis 1C gezeigt, wurde die Bildung von neutralisierendem Antikörper (1A) bzw. virusspezifischem IgA-Antikörper (1C) um das 80fache durch die transiente CD4⁺-Zellabreicherung gehemmt, wodurch ein effizienter Gentransfer nach einer zweiten Verabreichung von Virus erfolgen kann. 1B zeigt ebenso eine leichte Hemmung von IgG.
Wie im dritten Balken der drei Graphen dargestellt, wurde die Sekretion von antigenspezifischem IgA durch IL-12 selektiv blockiert (1C), ohne daß sich dies in signifikanter Weise auf die Bildung von IgG auswirkte (1B). Dies erfolgte gleichzeitig mit einer 20fachen Reduzierung von virusspezifischem neutralisierendem Antikörper (1A).
Die mit Gamma-Interferon behandelten Tiere (vierter Balken in 1A und 1B) waren praktisch von den. mit IL-12 behandelten Tieren dahingehend nicht zu unterscheiden, daß im Vergleich mit den nicht mit Cytokin behandelten Kontolltieren virusspezifisches IgA (1C) und neutralisierender Antikörper (1A) reduziert waren, jedoch nicht in dem Ausmaß wie bei den mit IL-12 behandelten Tieren.
Diese Arbeiten zeigen, daß die Verabreichung ausgewählter Immunmodulatoren an Empfänger gentherapeutischer rekombinanter Virusvektoren am genauen oder ungefähren Zeitpunkt des primären In-Kontakt-Kommens mit dem Vektor die Bildung blockierender Antikörper und/oder die CTL-Eliminierung des Vektors sowohl am Anfang als auch zum Zeitpunkt eines wiederholten In-Kontakt-Kommens mit dem Virusvektor verhindern kann. Die entsprechende Reduzierung von neutralisierendem Antikörper und anti-viralem IgA läßt darauf schließen, daß Immunglobulin des IgA-Subtyps die Hauptverantwortung für die Blockade des Gentransfers trägt.
Beispiel 3 – Verbesserung des adenovirus-vermittelten Gentransfers nach zweiter Verabreichung durch IL-12 und IFN-γ in Mausleber
Mit den in Beispiel 2 beschriebenen Experimenten weitgehend identische Experimente wurden durchgeführt, wobei Virusvektoren in das Blut zur Einführung des Transgens in die Leber (statt intratrachealer Zuführung in die Lunge) appliziert wurden.
In diesem Beispiel wurden die rekombinanten Adenoviren H5.010CMVlacZ und H5.010CBALP verwendet.
Weibliche C57BL/6-Mäuse (6–8 Wochen alt) wurden mit Suspensionen von H5.010CBALP (1 × 10⁹ pfu in 50 μl PBS) i.p. am Tag 0 und auf ähnlicher Weise mit H5.010CMVlacZ am Tag 28 injiziert. Eine Gruppe solcher Mäuse wurde als Kontrolle verwendet. Bei einer weiteren Gruppe von Mäusen wurden CD4⁺-Zellen durch i.p.-Injektion von Antikörper gegen CD4⁺-Zellen (GK1.5; ATCC Nr. TIB207, 1:10-Verdünnung von Aszites) zum Zeitpunkt der ersten Gentherapie (Tag –3, 0 und +3) akut abgereichert. Eine dritte Gruppe von Mäusen wurde mit IL-12 (2 μg i.p.-Injektionen) zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung von Virus (Tag 0 und +1) injiziert. Eine vierte Gruppe von Maüsen wurde mit Gamma-Interferon (2 μg i.p.Injektionen) zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung von Virus (Tag 0 und +1) injiziert.
Die Mäuse wurden nachfolgend an Tag 3, 28 bzw. 31 getötet, wobei bei der Autopsie Lebergewebe für Gefrierschnitte gemäß den für Lungengewebe in Beispiel 2 verwendeten Verfahrensweisen präpariert wurden.
Die Gefrierschnittergebnisse waren bei der lebergerichteten Gentherapie gemäß dem vorliegenden Verfahren wie bei der lungengerichteten Therapie in Beispiel 2 oben weitgehend ähnlich. Die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse wurden aus histochemischen Anfärbungen mit alkalischer Phosphatase (100fache Vergrößerung) bzw. X-gal-Anfärbungen mit β-Galactosidase (100fache Vergrößerung) erhalten.
Die Verabreichung von ALP-Virus (10⁹ pfu) in die Venen aller Gruppen der C57BL/6-Mäuse führte zu einer Transgenexpression auf hohem Niveau im Lebergewebe, die bis Tag 28 auf nichtnachweisbare Niveaus gefallen war. Es konnte gezeigt werden, daß der Verlust an Transgenexpression an der CTL-vermittelten Eliminierung der gentechnisch veränderten Hepatozyten lag [siehe auch Yang I, oben zitiert].
Bei den Kontrollmäusen wurde drei Tage nach der zweiten Verabreichung von Virus, d.h. Tag 31, keine rekombinante Genexpression nachgewiesen.
Die Verabreichung von Virus an die Tiere mit CD4⁺-Mangel wurde mit wesentlich weniger neutralisierenden Antikörpern und einem hohem Niveau an rekombinanter Transgen-expression, die über einen Monat stabil war, assoziiert. Die Expression des zweiten Virus war an Tag 31 nachweisbar.
Ein anfangs hohes Gentransferniveau verringerte sich nach etwa einem Monat in den mit IL-12 behandelten Mäusen; allerdings wurde im Gegensatz zur Kontrolle ein gewisser Gentransfer an die Leber über das Blut erzielt, wenn Virus mit IL-12 behandelten Tieren an Tag 28 erneut verabreicht wurde, wobei das Niveau an neutralisierendem Antikörper reduziert war.
Die mit Gamma-Interferon behandelten Tiere waren praktisch von den mit IL-12 behandelten Tieren dahingehend nicht zu unterscheiden, daß ein effizienter Gentransfer nach einer zweiten Verabreichung von Virus erzielt wurde.
Somit ermöglichte die Verwendung dieser Cytokine und der anti-CD4⁺-Antikörper als Immunmodulatoren die wiederholte lebergerichtete Verabreichung des Vektors ohne dessen sofortige Eliminierung durch neutralisierende Antikörper.
Beispiel 4 – adenovirus-vermittelter Gentransfer in Mausleber
Die Immunantworten gegenüber der primären Verabreichung von rekombinantem Virus wurden ferner unter Verwendung unterschiedlicher Mausstämme charakterisiert.
Rekombinantes Virus (H5.010CMVLacZ oder H5.010CBALP) wurde mit ultraviolettem Licht in Gegenwart von 8-Methoxypsoralen inaktiviert. Dabei wurde kurz gesagt gereinigtes Virus in 0,33 mg/ml 8-Methoxypsoralen-Lösung resuspendiert und einer UV-Lichtquelle mit 365 nm auf Eis in einem Abstand von 4 cm vom Lampenfilter 30 Minuten ausgesetzt. Anschließend wurde das Virus über eine mit PBS äquilibrierte SephadexG-50-Säule gegeben. Durch Transduktionstests mit limitierender Verdünnung von inaktivierten Virusstammlösungen konnte gezeigt werden, daß pro 10⁵ Partikeln inaktiviertes Virus weniger als ein funktionelles Virus vorlag. Suspensionen der Viren (2 × 10⁹ pfu in 100 μl PBS) wurden in die Schwanzvene von 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Mäusen, wie in den folgenden Experimenten ausführlich beschrieben, infundiert. Dabei wurde jedes Experiment mit mindestens drei Mäusen durchgeführt, bei denen die Transgenexpression jeweils in Schnitten von fünf Lappen quantifiziert wurde. Als Minimum wurden 15 Schnitte pro Versuchsbedingung analysiert.

a. C57BL/6-Mäuse [H-2^b; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) wurden mit Suspensionen von H5.010CMVlacZ an Tag 0 und auf ähnliche Weise mit H5.010CBALP am Tag 28 injiziert ("B6-Mäuse");
b. C57BL/6-Mäuse wurden mit UV-inaktiviertem H5.010CMVlacZ an Tag 0 und H5.010CBALP am Tag 28 injiziert ("B6-UV-Mäuse");
c. In den C57BL/6-Hintergrund gezüchtete (zwischen 5-10 Generationen) Mäuse mit MHC-Klasse-II-Mangel (II^–) [GenPharm International, Mountain View, CA], die den H-2^b-Haplotyp tragen, sind nicht in der Lage, I-A^b-Determinanten zu exprimieren und können keine CD4⁺-T-Zellen-vermittelte Antworten entwickeln [Grusby et al, Science, 253:1417–1420 (1991)]. Diese Mäuse wurden mit H5.010CBALP an Tag 0 und H5.010CMVlacZ an Tag 28 infiziert ("Klasse-II^–-Mäuse");
d. In den C57BL/6-Hintergrund gezüchtete (zwischen 5–10 Generationen) Mäuse mit β2-Mikroglobulin-Mangel (β2m^–) [GenPharm International, Mountain View, CA), die den H-2^b-Haplotyp tragen, sind nicht in der Lage mit MHC-Klasse I assozierte Antworten zu entwicklen. Diese Mäuse wurden mit H5.010CBALP an Tag 0 und H5.010CMVlacZ an Tag 28 infiziert ("β2m^–-Mäuse");
e. C57/BL/6-Mäusen wurden i.p. mit 0,5-ml-Portionen einer 1:10-Verdünnung von Maus-Aszites-Flüssigkeit mit dem GK1.5 (anti-CD4 MAb, ATCC TIB207) an Tag –3, 0 und +3, wie im Beispiel 2 beschrieben, inokuliert. Dies entsprach 100 μg gereinigtem monoklonalen Antikörper pro Injektion. Diese CD4⁺-Zellen-abgereicherten Mäuse wurden mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und H5.010CBALP an Tag 28 infiziert ("CD4Ab-Mäuse"); und
f. Mit IL-12 (2 μg in 200 μl PBS) i.p. an Tag 0 und Tag +1, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelte C57BL/6-Mäuse wurden mit H5.010CMVlacZ an Tag 0 und H5.010CBALP an Tag 28 infiziert ("IL-12-Mäuse").

Mäuse aus jeder Gruppe wurden anschließend getötet, und Lebergewebe wurden auf die lacZ-Expression mittels X-gal-Histochemie (100fache Vergrößerung) an Tag 3 und Tag 28 sowie auf ALP-Expression mittels histochemischer Färbung an Tag 31 (100fache Vergrößerung) beurteilt. Die Entwicklung von neutralisierendem Antikörper gegen Adenovirus in jeder Gruppe von Mäusen wurde jeweils in an Tag 28 entnommenen Serumproben untersucht.
Die Infusion von lacZ-Virus in C57BL/6-Mäuse wurde mit einer auf hohem Niveau liegenden, jedoch transienten, Expression des Reportergens und der letztendlichen Entwicklung von gegen adenovirales Antigen gerichtetem neutralisierendem Antikörper assoziiert (2). Kein Gentransfer wurde nachgewiesen, wenn das ALP-Virus anschließend durch Infusion in diese Tiere eingeführt wurde. Dagegen wurde von den Klasse II^–-Mäusen kein neutralisierender Antikörper produziert (2), wobei diese Mäuse für einen Gentransfer auf hohem Niveau von einer zweiten Verabreichung von Virus empfänglich waren. In ähnlicher Weise wurde von transient an CD4 abgereicherten Tieren die lacZ-Expression teilweise stabilisiert und kein neutralisierender Antikörper entwickelt, was die effiziente Wiederverabreichung von Virus gestattete.
Bei den B6-UV-Mäusen, die UV-inaktiviertes rekombinantes Virus erhalten hatten, erzeugte das inaktivierte Virus eine volle Antwort mit neutralisierendem Antikörper (2), durch die der anschließende Gentransfer vollständig verhindert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß Kapsidproteine des eingeführten Virus ausreichen, um eine blockierende T-Helferzellen- und B-Zellen-vermittelte humorale Immunantwort zu aktivieren.
Das Experiment mit β2m^–-Mäusen wurde durchgeführt, um die Rolle von CD8-Zellen und der Expression von Klasse-I-MHC bei der primären Antwort gegenüber Virus zu beurteilen [Zijlstra et al, Nature, 344:742–746 (1990)]. Die Transgenexpression war in diesen Tieren stabil, was mit früher veröffentlichten Daten übereinstimmt [Yang III, oben zitiert]. Allerdings erfolgte ein Gentransfer auf einem signifikanten Niveau unter den Bedingungen einer Wiederverabreichung des Virus. Dies war unerwartet, da dieser Mausstamm alle zur Produktion von neutralisierendem Antikörper notwendigen Komponenten der Immunantwort (d.h. CD4-Zellen, MHC-Klasse-II-Expression und B-Zellen) besitzen sollte. Diese Tiere konnten keine signifikante neutralisierende Antikörperantwort gegenüber adenoviralen Antigenen entwickeln. Diese Ergebnisse lassen auf eine Fehlregulierung der Aktivierung von T-Helfer- und/oder B-Zellen schließen (2).
Die Analyse von Lymphozyten aus β2m^–-Tieren demonstrierte eine antigen-aktivierte Sekretion von IFN-γ, die über die in C57BL/6-Mäusen gemessene hinausging, möglicherweise aufgrund der langen Verweildauer virusinfizierter Zellen und der chronischen Aktivierung von T_H1-Zellen. Die amplifizierte T_H1-Antwort in β2m^–-Mäusen könnte zu einer Hemmung von T_H2-Zellen führen, was in einer verminderten Produktion antiviraler Antikörper resultiert.
Es stellte sich heraus, daß die Transgenexpression in Tieren mit Mangel an CD8-Zellen und MHC-Klasse I aufgrund einer β2m^–Unterbrechung in der Keimbahn stabilisiert ist. Die spezifische Ablation von Perforin, dem Molekül auf CTLs und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), das Zytolyse vermittelt, verlängert auf ähnliche Weise die Transgenexpression (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 5 – Wirkung von CD4-Antikörper auf Advermittelten Gentransfer nach wiederholten Verabreichungen
Suspensionen der unterschiedliche Transgene exprimierenden rekombinanten Adenoviren wurden mittels Infusion in die Schwanzvene von C57BL/6-(H-2^b)-Mäusen im Abstand von jeweils 21 Tagen eingeführt. Bei H5.010CMVLDLR handelt es sich um ein Adenovirus, bei dem die Gene E1a und E1b deletiert sind und das eine Deletion im E3-Gen bei 78.5 bis 84.3 mu aus dem Ad 5 sub360-Grundgerüst aufweist, wobei anstelle der E1-Deletion ein LDL-Rezeptor-Gen vorliegt [beschrieben in Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269:1–8 (1994)].
H5.010CMVLDLR wurde an Tag 0, H5.010CMVlacZ an Tag 21 und H5.010CBALP an Tag 42 verabreicht. Einer Kontrollgruppe von Mäusen wurde Kochsalzlösung in Form von i.p.-Injektionen an Tag –3, 0, +3, jeweils mit Bezug auf die Infusion mit Virus, verabreicht. Einer zweiten Gruppe von Mäusen wurden i.p.-Injektionen von CD4-abreicherndem Antikörper zur Blockierung der T-Helferzellaktivierung (GK1.5 mAb) in der gleichen Vorschrift gegeben. Einer dritten Gruppe von Mäusen wurden i.p.-Injektionen von GK1.5 mAb an Tag –3, 0, 3, 18, 21 und 24 gegeben. Eine vierte Gruppe von Mäusen, die keine erste Verabreichung vom H5.010CMVLDLR erhalten hatte, wurde mit GK1.5 mAb an Tag –3, 0 und 3 behandelt.
Die Mäuse wurden anschließend getötet und die Lebergewebe auf LDLR-Expression mittels Immunhistochemie an Tag 3, auf lacZ-Expression mittels X-gal-Histochemie an Tag 24 sowie auf ALP-Expression mittels histochemischer Anfärbung an Tag 45 beurteilt. Dabei wurden die Tests wie folgt ausgeführt:

A. Die Immunfluoreszenzanfärbung auf LDLR-Expression wurde wie folgt durchgeführt: gefrorene Schnitte (6 μm) wurden in Methanol fixiert, wie bei Morris et al, oben zitiert, beschrieben. Nach Blockierung mit 10 Ziegenserum in PBS (GS/PBS) wurden Schnitte mit einem polyklonalem Antikörper gegen LDLR (1:200) 60 Minuten und anschließend mit Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-FITC 30 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden gewaschen und mit Citifluor (Citifluor, UK) aufgebracht.
B. Die X-gal-Histochemie wurde wie folgt durchgeführt: Schnitte von frischem eingefrorenem Gewebe (6 μm) wurden 10 Minuten in 0,5% Glutaraldehyd fixiert, zweimal jeweils 10 Minuten in PBS mit 1 mM MgCl₂ gespült und in 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal), 5 mM K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄Fe(CN)₆ und 1 mM MgCl₂ in PBS 3 Stunden inkubiert.
C. Die ALP-Histochemie wurde wie folgt durchgeführt: gefrorene Schnitte (6 μm) wurden 10 Minuten in 0,5% Glutaraldehyd fixiert, in PBS gespült, 30 Minuten bei 65°C zur Inaktivierung von endogener ALP-Aktivität inkubiert, in 100 mM Tris (pH 9,5), 100 mM NaCl und 50 mM MgCl₂ gewaschen und im gleichen Puffer mit 0,165 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) sowie 0,3 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT) 30 Minuten bei 37°C angefärbt.

Die unten erörterten Ergebnisse wurden aus Analysen der zytochemischen Anfärbungen von Lebergewebe jeweils drei Tage nach der Virusinfusion, einschließlich LDLR-Virus an Tag 0, lacZ-Virus an Tag 21 und ALP-Virus an Tag 42 erhalten (150fache Vergrößerung).
Serumproben wurden auch an Tag 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 aus jeder Gruppe von Tieren gesammelt und auf den Titer von neutralisierendem Antikörper getestet. Dabei wurden Serumproben 30 Minuten bei 56°C inkubiert und anschließend, beginnend mit 1:20, in Zweierschritten in DMEM verdünnt. Jede Serumverdünnung (100 μl) wurde mit H5.010CMVlacZ (2 × 10⁶ pfu in 20 μl) gemischt, 1 Stunde bei 37°C inkubiert und auf 80% konfluente Hela-Zellen in 96-Loch-Platten (2 × 10⁴ Zellen pro Loch) aufgetragen. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen jeweils mit 100 μl DMEM mit 20% FBS versetzt. Die Zellen wurden am nächsten Tag fixiert und auf β-Galactosidase-Expression angefärbt. Dabei färbten sich alle Zellen in Abwesenheit von Serumproben blau. Der Titer von neutralisierendem Antikörper wurde für jede Probe jeweils als die höchste Verdünnung angegeben, bei der sich weniger als 50% der Zellen blau färbten. In 3A–3C ist der Antikörpertiter als eine Funktion der Tage nach der Infektion ausgedrückt.
Diese Experimente zeigten, daß in der Gruppe der Mäuse, die keine CD4-Antikörper erhalten hatten, nach dem ersten Virus ein effizienter Gentransfer erfolgt. Allerdings wurde durch die Entwicklung von neutralisierendem Antikörper der Gentransfer mit den nachfolgenden beiden Viren blockiert. Dabei trat neutralisierender Antikörper schnell in Serum nach dem zweiten Virus auf, wenn CD4-Antikörper nicht gleichzeitig verabreicht wurden (3B). Das dritte Virus war in diesen Tieren nicht wirksam. Im Gegensatz wurde durch Verabreichung von CD4-Antikörpern zum Zeitpunkt der ersten Infusion mit Virus die Bildung neutralisierender Antikörper verhindert (3B) und ein Gentransfer auf hohem Niveau mit dem zweiten Virus gestattet. Das Auftreten von neutralisierendem Antikörper nach dem zweiten Virus erfolgte schneller (3B im Vergleich mit dem zeitlichen Verlauf einer primären Antwort in 3A) was darauf hindeutet, daß die Aktivierung gewisser Ebenen der zellulären Immunität selbst in Gegenwart von CD4-Antikörpern nicht stattfindet.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß für einen effizienten Gentransfer lediglich eine transiente Immunblockade zum Zeitpunkt der Viruszuführung im Gegensatz zu einer chronischen Immunsuppression benötigt wird.
Die dritte Gruppe von Tieren erhielt CD4-Antikörper an Tag –3 ohne H5.010CMVLDLR-Verabreichung, d.h. 21 Tage vor der primären Verabreichung von Virus. Neutralisierender Antikörper, der sich im Anschluß an das primäre Challenge mit Virus entwickelt hatte, blockierte den Gentransfer 21 Tage später (3C) in einer Weise, die von der bei nicht mit CD4-Antikörper vorbehandelten naiven Tieren beobachteten nicht zu unterscheiden war (3A). Dieses Ergebnis bestätigt die transiente Art der CD4-Abreicherung.
Beispiel 6 – Wirkung von IL-12 auf Ad-spezifische Antikörper-Isotypen und CTL-Antworten

A. Aus den C57BL/6-Mäusen („B6") und mit IL-12 behandelten C57BL/6-Mäusen („B6+IL-12") in Beispiel 5 erhaltene Serumproben wurden 28 Tage nach der Infektion auf Adenovirus-spezifische IgG1- und IgG2A-Antikörperisotypen getestet.

Dabei wurde ein Festphasen-ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) unter Verwendung von aufgereinigtem H5.010CMVlacZ-Virus als Antigen durchgeführt. Immunolon-2-U-Mikrotiterplatten (Fisher) wurden mit 200 ng/Loch viralem Antigen in 100 ml PBS 6 Stunden bei 37°C beschichtet, dreimal in PBS gewaschen und über Nacht bei 4°C in PBS/1% BSA blockiert. Am folgenden Tag wurden die mit Antigen beschichteten Platten jeweils mit 4fach in Verdünnungsreihen verdünnten Serumproben versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 3mal in PBS/1% BSA gewaschen und mit Ziege-anti-Maus-IgG1-Biotin oder Ziege-anti-Maus-IgG2A-Biotin (CALTAG Laboratories, San Francisco, CA) in einer Verdünnung von 1:5000 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen, und die Vertiefungen wurden jeweils 1 Stunde bei 37°C mit einer 1:5000-Verdünnung von Avidin-ALP (Sigma) versetzt. Die Vertiefungen wurden wiederum wie oben gewaschen und mit PNPP-Substrat versetzt. Die optischen Dichten wurden an einem Mikroplattenablesegerät Modell 450 der Firma Biorad ausgelesen.
In 4A bzw. 4B sind die in Serumproben vorhandenen relativen Mengen (OD₄₀₅) an IgG1 bzw. IgG2A in Abhängigkeit von den Probenverdünnungen zusammengefaßt. Die ELISA-Tests der Seren zeigten antivirale Antikörper sowohl des IgG1- als auch des IgG2A-Subtyps, was mit der Aktivierung sowohl der T_H1- als auch der T_H2-Untergruppen übereinstimmt. IL-12 erhaltende Tiere produzierten weniger antivirales IgG1 auf Kosten einer erhöhten Produktion an IgG2a.

B. Aus C57BL/6-Mäusen („B6") und mit IL-12 behandelten C57BL/6-Mäusen („B6+IL12") in Beispiel 5 geerntete Milzzellen wurden 10 Tage nach Verabreichung von H5.010CBALP erneut in vitro 5 Tage mit H5.010CMVlacZ in mit 5% FBS und 50 mM 2-Mercaptoethanol supplementiertem DMEM stimuliert. Diese Zellen wurden auf die spezifische Lyse bei scheininfizierten („mock") und mit H5.010CBALP („ALP") infizierten C57SV-Zellen in einem anschließend durchgeführten 6stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Verwendung der folgenden Verhältnisse von Effektor zu Zielzellen (C57SV, H-2^b) in 200 μl DMEM mit 10% FBS in 96-Loch-Platten mit V-Boden getastet (E:T = 50:1, 25:1, 12:1, 6:1, 5:1 und 3:1).

Vor dem Mischen mit den Effektorzellen wurden Zielzellen (1 × 10⁶) mit 100 μCi ⁵¹Cr nach einer 24 Std.-Infektion mit H5.010CMVlacZ bei einem moi-Wert von 50 markiert und bei 5 × 10³ Zellen/Loch verwendet. Nach einer 6stündigen Inkubation wurden Portionen von jeweils 100 μl Überstand zum Zählen in einem gamma-Zählgerät entnommen. Der Prozentanteil an spezifischer ⁵¹Cr-Freisetzung wurde berechnet als: [(cpm Probe – cpm spontane Freisetzung)/(cpm maximale Freisetzung – cpm spontane Freisetzung)] × 100. Die als Prozentanteil der spezifischen Lyse in Abhängigkeit von unterschiedlichen Effektor:Ziel-Verhältnissen angegebenen Ergebnisse (5) zeigen, daß die CTL-Aktivität gegen virusinfizierte Zielzellen von einer Behandlung mit IL-12 nicht beeinflußt wurde.
Das Nettoergebnis bestand in einer 3fachen Reduzierung von neutralisierendem Antikörper, deren Größe nicht ausreichte, um einen effizienten Gentransfer nach erneuter Verabreichung von Virus zu gestatten. Unterschiede in der Effizienz der erneuten Virusverabreichung zwischen den β2m^–-Mäusen und den mit IL-12 behandelten C57BL/6-Mäusen könnte eine unzureichende Cytokin-vermittelte Repression nach i.p.-Injektion von IL-12 oder andere Mechanismen als die Hemmung der T_H2-Aktivierung widerspiegeln.
Beispiel 7 – CD40L-Mangel-Mäuse veranschaulichen die notwendige Rolle der T-Zellaktivierung bei Wirtsreaktionen gegenüber Adenovirusvektoren
Die Rolle der CD40L-vermittelten Signalgebung von T-Zellen bei zellulären und humoralen Immunantworten gegenüber Adenovirusvektoren wurde in Mäusen mit genetischem Mangel an CD40L untersucht. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, daß in diesen Mäusen Abnormalitäten bei den Thymus-abhängigen B-Zellantworten vorliegen [J. Xu et al, Immunity, 1:423–431 (1994) und B. Renshaw et al, J. Exp. Med., 180:1889–1900 (1994)]. CD40L-Mangel-Mäusen (CD40L KO) und deren normalen Wurfgenossen in einem chimärischen C57BL/6-129-Hintergrund [J. Xu et al, oben zitiert] wurde lacZ enthaltendes Adenovirus mit E1-Deletion (H5.010CMVlacZ) an Tag 0 in die Trachea (1 × 10⁹ in 50 μl PBS) zur Durchführung eines Gentransfers an die Lunge sowie in den peripheren Blutkreislauf über die Schwanzvene (1 × 10⁹ in 100 μl in PBS) zur Ausführung eines Gentransfers an die Leber appliziert. Die Tiere wurden erneut mit H5.010CBALP, einem ein anderes Reportergen (alkalische Phosphatase, ALP) enthaltenden Adenovirusvektor, an Tag 28 behandelt. Vor der zweiten Vektorverabreichung wurde Blut auf neutralisierende Antikörper hin analysiert, und 3 Tage später (d.h. Tag 31) wurden Gewebe für die Analyse der Reportergenexpression geerntet. Die Tiere wurden 3 bzw. 28 Tage später getötet, um die Effizienz bzw. Stabilität der Transgenexpression zu beurteilen. In Tabelle II sind die morphometrischen Analysen dieser Gewebe zusammengefaßt. Tabelle II Quantitative Analyse der Effizienz der Transgenexpression in Lunge bzw. Leber der Maus

¹ Daten wurden durch Untersuchen von insgesamt 100 Luftwegen aus 3 Mäusen auf das Vorhandensein transgenhaltiger Atemwegsepithelzellen quantifiziert, wobei als Kriterium eines positiven Luftwegs das Transgen mehr als 25% betrug.

² Die Daten sind als Mittelwert ±1 S.D. (Standardabweichung) angegeben.
Normalen Wurfgenossen, denen Vektoren verabreicht worden waren, zeigten ein hohes Niveau der Transgenexpression an Tag 3 in der Lunge und der Leber, > das sich bis Tag 28 auf nicht nachweisbare Niveaus verringert hatte (ähnlich zu dem, was in naiven C57BL/6-Mäusen beobachtet wurde; Tabelle II). Serum- und bronchoalveoläre Lavagen (BAL) wurden auf neutralisierenden Antikörper gegen menschliches Ad5 analysiert, wie bei Y. Dai et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1404–1405 (1995) beschrieben. Dabei hatten sich beträchtliche Mengen an neutralisierendem Antikörper gegen adenovirale Kapsidproteine bis Tag 28 sowohl in der BAL-Flüssigkeit von Tieren, die Vektor intratrachial erhalten hatten, als auch im Blut von Tieren, die Vektor über den venösen Kreislauf erhalten hatten, entwickelt (6).
Die erneute Verabreichung von Vektor an Tag 28 war nicht erfolgreich, wie sich anhand des Fehlens der Transgenexpression im Zielorgan 3 Tage später zeigte (ähnlich zu dem, was bei C57BL/6-Mäusen beobachtet wurde, Tabelle II). Wesentlich andere Ergebnisse wurden bei den CD40L-Mangel-Mäusen erhalten. Die Transgenexpression war bei nur geringer Abnahme über 28 Tage sowohl in der Lunge als auch der Leber stabil (Tabelle II). Darüber hinaus konnte sich kein neutralisierender Antikörper entwickeln (6), was zu einer hocheffizienten Transgenexpression nach einer zweiten Verabreichung von Virus führte (Tabelle I).
Beispiel 8 – Transiente Blockade von CD40-Ligand mit Antikörper verhindert die primäre T-Zellaktivierung und verlängert die Transgenexpression
Das folgende Beispiel zeigt, daß durch die transiente Hemmung von CD40L mit Antikörper das Priming von CD4⁺-T-Zellen im Lungenmodell der Gentherapie blockiert und CD4-T- und B-Zelleffektor-Antworten wirksam eliminiert wurden. Die langandauernde Transgenexpression und Effizienz der erneuten Vektorverabreichung in die Lunge war im wesentlichen identisch bei Tieren mit genetischem CD40L-Mangel (Beispiel 7 oben) im Vergleich mit solchen, die transient mit CD40L-Antikörper gehemmt wurden (siehe unten).
Durch die bei den CD40L-Mangel-Mäusen erhaltenen vielversprechenden Ergebnisse, wie sie in Beispiel 7 oben dargestellt sind, wird eine Basis zur Entwicklung einer adjunkten Gentherapie mit Adenovirusvektoren auf Grundlage der pharmakologischen Hemmung der CD40L-Signalgebung bereitgestellt. Diese Therapie beruht auf Erkenntnissen, daß die Kapsidproteine des eingeführten Virus die Hauptantigenquelle für die CD4⁺-T-Zellaktivierung darstellen, wodurch der Zeitraum der costimulatorischen Blockade auf ein kurzes Intervall bei der Verabreichung des Vektors eingeschränkt wird.
Experimente in nicht mit Antikörper oder mit Isotyp-Kontrollantikörper behandelten C57BL/6-Mäusen (6 Wochen alt, weiblich) zeigten ein hohes Niveau an Transgenexpression an Tag 3 in der Lunge (Tabelle II) und der Leber (Tabelle II), das sich bis Tag 28 auf nicht nachweisbare Niveaus verringert hatte (Tabelle II). Ebenso wurden Gentransferexperimente in mit 100 μg mAb gegen CD40L (MR1, ATCC Hybridoma HB11048) i.p. an Tag 3, 0, +3 und +6 relativ zur ersten Vektorverabreichung oder mit äquivalenten Mengen eines monoklonalen Kontrollantikörpers aus Hamster injizierten C57BL/6-Tieren durchgeführt. Untersuchungen in Mauslunge zeigten eine Stabilisierung der Transgenexpression in mit CD40L-mAb behandelten Tieren: die Anzahl an Luftwegen, die Transgen in >25% der Epithelzellen zeigen, zeigte eine minimale Abnahme von 72% an Tag 3 auf 42° an Tag 28 (Tabelle II). Die Transgenexpression wurde auch in der Leber von mit CD40L-mAb behandelten Tieren stabilisiert, wobei Transgen exprimierende Hepatozyten leicht von 89% auf 47% über einen Zeitraum von 28 Tagen abnahmen (Tabelle II). Die Transgenexpression ist in mit CD40L-Antikörper behandelten Tieren wenigsten 6 Wochen stabilisiert, wobei es sich hier um den längsten beurteilten Zeitpunkt handelt (Daten nicht gezeigt).
Empfängertiere wurden auf die antigenspezifische Aktivierung von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen unter Verwendung von sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Tests analysiert. Die Auswirkung der CD40L-Blockade auf CD4⁺-T-Zellen wurde in Proliferationstests von mit UV-inaktiviertem Adenovirus stimulierten Lymphozyten im wesentlichen wie unten beschrieben untersucht (Tabelle III). Dabei wurden kurz gesagt Lymphozyten aus mediastinalen Lymphknoten (für das Lungenexperiment) bzw. Milzzellen (für das Leberexperiment) aus Mäusen 10 Tage nach Verabreichung von Viren 24 Stunden mit UV-inaktiviertem Virus erneut stimuliert. Überstände wurden an HT-2-Zellen (ATCC, CRL 1841) auf Cytokinsekretion getestet, und die Proliferation wurde 72 Stunden später durch Messen des Einbaus von ³H-Thymidin beurteilt. Die Aktivierung Adenovirus-spezifischer T-Zellen, wie sie durch den Stimulationsindex quantifiziert wurde, wurde zunächst an Tag 7 in mit keinem Antikörper behandelten Tieren, bei denen eine Applikation über Vektor in die Lunge oder Leber vorgenommen wurde, dokumentiert. Die Aktivierung Adenovirus-spezifischer T-Zellen erhöhte sich zunehmend über die folgenden 14 Tage. Der Stimulationsindex wurde berechnet, indem die ³H-Zellwerte in Gegenwart von Antigen durch diejenigen in Abwesenheit von Antigen geteilt wurden. Die T- Zellaktivierung wurde in beiden Modellen durch gleichzeitige Verabreichung von CD40L-Antikörper weitgehend gehemmt. Dabei wurde die größte Hemmung bei Tieren beobachtet, denen Vektor in die Lunge appliziert wurde. Tabelle III CD4⁺-T-Zellantworten und neutralisierender Antikörper

¹ Daten sind als mittlerer Stimulationsindex aus drei Bestimmungen ±1 S.D. (Standardabweichung) angegeben – N.D. – nicht bestimmt.
² Daten sind als mittlerer Titer von neutralisierendem Antikörper (reziproke Verdünnung) von drei Proben ±1 S.D. angegeben.

Die Aktivierung von CD8⁺-T-Zellen durch virusinfizierte Zellen wurde in Chromfreisetzungstests unter Verwendung von mit Adenovirusvektoren infizierten MHC-H-2-kompatiblen Zielzellen analysiert. Wie bereits gezeigt, wurde bei aus C57BL/6-Empfängern an Tag 7 geernteten Lymphozyten eine spezifische Lyse demonstriert, wobei die Lymphozyten in vitro mit mit Adenovirus infizierten, Antigen präsentierenden Zellen stimuliert und mit Adenovirus-infizierten Zielen inkubiert wurden (7). An scheininfizierten Zielen konnte keine Lyse demonstriert werden.
Aus mit CD40L-Antikörper behandelten Tieren geerntete Lymphozyten zeigten ebenso CTL-Aktivität gegenüber Adenovirus-infizierten Zellen. Allerdings war das Ausmaß der Lyse durchgehend geringer als die bei immunablatierten Tieren erhaltene Lyse. Die Notwendigkeit, CTL durch in-vitro-Stimulation vor dem zytolytischen Test zu amplifizieren, kann signifikantere Unterschiede bei der CTL-Aktivierung, die nach dem primären Inkontaktkommen in vivo auftraten, verschleiern.
Der primäre Effekt der CD40L-Hemmung auf die Aktivierung Adenovirus-spezifischer CD4⁺-T-Zellen wurde ferner in vivo unter Verwendung von Immunzytochemietechniken beurteilt. Dabei waren diese Experimente auf das Modell des lebergerichteten Gentransfers aufgrund technischer Grenzen bei der Immunfluoreszenz in Lungenschnitten beschränkt. Die Lebergewebe wurden an Tag 14 auf die Infiltration von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen mittels Doppelimmunfluoreszenz analysiert. Mit keinem Antikörper behandelte Tiere zeigten ein typisches gemischtes Lymphozyteninfiltrat, das von CD4⁺-T-Zellen dominiert wurde und mit einer beträchtlichen Hochregulierung von MHC-Klasse I auf der basolateralen Oberfläche von Hepatozyten assoziiert war. In früheren Arbeiten wurde vorgeschlagen, daß die Sekretion von IFN-γ aus T_H1-aktivierten CD4⁺-T-Zellen zur Zunahme der MHC-Klasse I beiträgt, wodurch die Hepatozyten gegenüber der CTL-vermittelten Eliminierung empfindlich werden können. Von mit Antikörper gegen CD40L behandelten Tieren wurde immer noch ein gemischtes Lymphozyteninfiltrat mobilisiert. Allerdings ist der Anteil an CD4⁺-T-Zellen beträchtlich niedriger und die Zunahme an MHC-Klasse I weitgehend eingedämmt. Die Spezifität der Immunfluoreszenztests wurde an scheininfizierten Tieren demonstriert.
Beispiel 9 – CD40L-Antikörper verhindert die Bildung von blockierendem Antikörper beim lungengerichteten Gentransfer
In diesem Experiment wurde die Auswirkung einer transienten Blockade der CD40L-Signalgebung zum Zeitpunkt der Vektorverabreichung auf die Produktion von neutralisierendem Antikörper und die Effizienz einer wiederholten Vektorverabreichung beurteilt. Tiere, die Vektor an Tag 0 mit oder ohne mAb erhalten hatten, wurden mit einem ein anderes Reportergen enthaltenden Adenovirusvektor an Tag 28 erneut behandelt. Vor Verabreichung des zweiten Vektors wurde Blut auf neutralisierende Antikörper analysiert, und drei Tage später (d.h. an Tag 31) wurden Gewebe zur Analyse der Reportergenexpression geerntet.
Die beeindruckendsten Ergebnisse wurden im Modell der lungengerichteten Gentherapie erhalten. Die Entwicklung von neutralisierendem Antikörper in BAL nach lungengerichtetem Gentransfer von Vektor wurde bei Tieren, denen CD40L-Antikörper verabreicht worden war, um das 20fache gehemmt (7). Der Gentransfer mit dem zweiten Vektor war bei nicht mit Antikörper behandelten Tieren oder bei Tieren, die mit einem Isotyp-Kontroll-mAb behandelt worden waren (Daten nicht gezeigt) nicht erfolgreich, wie sich am vollständigen Fehlen der Transgenexpression drei Tage nach erneuter Vektorverabreichung zeigte. Dies steht im Gegensatz zu Tieren, die während der ersten Vektorverabreichung mit CD40L-Antikörper behandelt worden waren und bei denen ein Gentransfer nach einer zweiten Verabreichung von Vektor erzielt wurde. Eine Transgenexpression wurde in >25% der Luftwegsepithelzellen von 30° der Luftwege nach dem zweiten Vektor nachgewiesen, wobei dieser Wert nur etwas unterhalb der Anzahl an Luftwegen liegt, die transgen in einem mit Vektor behandelten naiven Tier exprimieren (d.h. 75%; Tabelle II). Antikörper gegen CD40L blockierte teilweise die Produktion von neutralisierendem Antikörper in Serum nach intravenöser Infusion von Virus (7). Dies reichte aus, um einen gewissen Gentransfer an die Leber mit dem zweiten Vektor (8% der Hepatozyten) zu ermöglichen, der in Abwesenheit von Antikörper nicht auftrat, jedoch beträchtlich niedriger liegt, als der, der nach einer primären Verabreichung von Vektor in einem naiven Tier erzielt wurde (89%).
Beispiel 10 – Kurze Behandlung mit Zyclophosphamid verhindert destruktive Immunantworten in Lunge und Leber der Maus
C57BL/6-Mäusen wurde Cyclophosphamid mit verschiedenen Dosierungsschemata zum Zeitpunkt der Verabreichung eines lacZ-Virus mit E1-Deletion in das Blut zur Untersuchung des lebergerichteten Gentransfers sowie in die Trachea zur Untersuchung des lungengerichteten Gentransfers gegeben. Ein zweites Virus mit E1-Deletion, das das Reportergen für alkalische Phosphatase exprimiert, wird nochmals in das gleiche Organ, das den ersten Vektor erhalten hatte, appliziert. Lymphozyten wurden aus regionalen Stellen isoliert und in vitro auf die vektorspezifische T-Zellaktivierung hin beurteilt. Gewebe wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für die Analyse der Entzündung sowie ihrer Folgen ebenso wie der Expression sowohl des lacZ- als auch des ALP-Reportergens geerntet.
A. Tierstudien
Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden mit 1 × 10⁹ pfu H5.010CMVlacZ über die Trachea (Lungenuntersuchungen) oder die Schwanzvene (Leberuntersuchungen) an Tag 0 injiziert. Cyclophosphamidinjektionen wurden iv wie angegeben gegeben (in 200 ml PBS). H5.010CBALP wurde wie oben beschrieben an Tag 28 injiziert. Die Tiere wurden an Tag 3, 28, 31 und 50 für die Analyse der Transgenexpression getötet. Bei der Autopsie wurden Lungen- und Lebergewebe für die Gefrierschnitte präpariert, während die Milz, bronchoalveoläre Lavage (BAL) und mediostinale Lymphknoten (MLN) für immunologische Tests geerntet wurden.
B. Morphologische Analysen
Für die immunzytochemischen Analysen wurden Gefrierschnitte von gefrorenem Lebergewebe hergestellt, während die Lungen mit einem 1:1-Gemisch von PBS/OTC gefüllt, eingefroren und Gefrierschnitte aus Blöcken davon hergestellt wurden. Für die Histochemie mit X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid) wurden gefrorene 6 mm große Gewebeschnitte in 0,5 Glutaraldehyd 10 Min. fixiert, zweimal mit PBS mit 1 mM MgCl₂ gewaschen und in 1 mg X-Gal pro ml, 5 mm K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄FE(CN)₆ und 1 mM MgCl₂ in PBS 4 Stunden inkubiert. Für die Anfärbung mit alkalischer Phosphatase wurden Gefrierschnitte in 0,5°% Glutaraldehyd 10 Minuten fixiert und zweimal in PBS gewaschen. Die Schnitte wurden 30 Minuten zur Inaktivierung endogener alkalischer Phosphataseaktivität bei 65°C inkubiert, einmal in PBS gewaschen und in 100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂ mit 0,165 mg BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) und 0,33 mg Nitroblau-Tetrazolium pro ml 30 Minuten bei 37°C angefärbt.
C. Immunfluoreszenz
Gefrorene Schnitte wurden 10 Minuten in –20°C kaltem Methanol fixiert, an der Luft getrocknet und zweimal in PBS rehydratisiert, und unspezifische Bindung wurde 30 Minuten in 10% Ziegenserum/PBS blockiert. Die Schnitte wurden 1 Stunde entweder mit Ratte-anti-Maus-CD4-Antikörper (anti L3T4, GibcoBRL, 1:100-Verdünnung in 2 Ziegenserum) mit anschließender 30minütiger Inkubation mit 5 mg Ziege-anti-Ratte-Immunglobulin G (igG)-Fluoreszein oder Ratte-anti-Maus-CD8a-Fluoreszeinisothiocyanat (anti-Ly-2, GibcoBRL, 1:100-Verdünnung in 2 Ziegenserum) inkubiert. Für die Anfärbung von MHC-Klasse I wurden Schnitte mit 1:50 verdunntem Maus-Hybridomzellen-Überstand gegen H-2K^bD^b (20-8-4S) 60 Minuten und anschließend 30 Minuten mit 5 mg/ml Ziege-anti-Maus-IgG-konjugierten Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) inkubiert. Die Schnitte wurden zweimal gewaschen und mit dem Antiausbleichmittel Citifluor (Canterbury Chemical Lab., Canterbury, UK) aufgebracht.
D. CTL-Test
Für die CTL-Tests wurden Milzzellen aus drei Mäusen oder Lymphozyten aus 10 Mäusen vereinigt. Die Zellen wurden in vitro 5 Tage mit H5.010CMVlacZ (MOI 0,5) erneut stimuliert und auf MHC-kompatible Zielzellen getestet, die zuvor mit H5.010CMVlacZ infiziert und mit ⁵¹Cr unter Verwendung unterschiedlicher Effektor/Zielzellen-Verhältnisse beladen wurden. Der Prozentanteil an spezifischer ⁵¹Cr-Freisetzung wurde berechnet als [(cpm Probe – cpm spontane Freisetzung)/(cpm maximale Freisetzung – cpm spontane Freisetzung) – cpm of spontaneous realease)] × 100. Die spontane Freisetzung wurde bestimmt, indem Zielzellen ohne Effektorzellen in Medium getestet wurden, während die maximale Freisetzung durch Zugabe von 5% SDS zu den Zielzellen während der 6stündigen Inkubationszeit abgeschätzt wurde.
E. Cytokinfreisetzungstest
6 × 10⁶ Milzzellen wurden mit oder ohne Antigen (d.h. UV-inaktiviertem H5.010CMVlacZ bei einer MOI von 10) 24 h in einer 24-Loch-Platte kultiviert. 100 ml zellfreier Überstand wurden auf 2 × 10³ HT-2-Zellen (IL-2- und IL-4-abhängige Zellinie) in 96-Loch-Platten mit Rundboden überführt. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle wurden Medium bzw. 10% Ratte-Concanavalin-A-Überstand verwendet. Die Proliferation wurde 48 h später mit einem 6 h-Puls von [³H]-Thymidin (0,35 mCi/Loch) bestimmt.
F. Neutralisierender Antikörpertest
Zur Inaktivierung von Komplement wurden Serum und BAL 30 Min. bei 56°C inkubiert. Verdünnungsreihen von Serum und BAL in DMEM ohne FBS (50 ml, beginnend mit 1:20) wurden mit 1 × 10⁶ pfu H5.010CMVlacZ 60 Min. inkubiert und auf 2 × 10⁴ Hela-Zellen (80% konfluent) in 96-Loch-Platten aufgetragen. Nach einer 60minütigen Inkubation wurden 100 ml DMEM mit 20° FBS zugegeben. Die Zellen wurden 16–18 Stunden später fixiert und auf β-Galactosidaseaktivität angefärbt. Dabei wurden alle Zellen blau gefärbt, wenn statt Serum oder BAL Medium zugegeben wurde. Der Titer von neutralisierendem Antikörper wurde mit der höchsten Verdünnung bestimmt, bei der weniger als 50% Zellen blau gefärbt wurden.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der oben angegebenen Beschreibung enthalten, wobei erwartet wird, daß diese für den Fachmann naheliegend sind. Es wird angenommen, daß solche Modifikationen und Änderungen, einschließlich des ausgewählten spezifischen Immunmodulators, der Verabreichungsweise, des ausgewählten rekombinanten Vektors und Transgens, des Verabreichungswegs usw., im Schutzumfang der hier anhängigen Ansprüche liegen.

Claims

Verwendung eines Immunmodulators zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer Immunantwort gegen ein rekombinantes Virus, das zusammen mit dem Arzneimittel verabreicht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus ein therapeutisches Gen umfaßt, und dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel neutralisierende Antikörperantworten gegen das Virus hemmt, und dadurch gekennzeichnet, daß bei einer weiteren Wiederverabreichung des rekombinanten Virus die Wiederverabreichung gegebenenfalls in Abwesenheit des Immunmodulators vorgenommen wird, vorausgesetzt daß, wenn es sich bei dem rekombinanten Virus um ein Adenovirus handelt, die Wiederverabreichung in Abwesenheit eines Immunmodulators durchgeführt werden muß.
Verwendung eines rekombinanten Virus zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei das rekombinante Virus zusammen mit einem Immunmodulator zur Hemmung einer Immunantwort gegen das rekombinante Virus verabreicht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus ein therapeutisches Gen umfaßt, und dadurch gekennzeichnet, daß der Immunmodulator neutralisierende Antikörperantworten gegen das Virus hemmt, und dadurch gekennzeichnet, daß bei einer weiteren Wiederverabreichung des rekombinanten Virus die Wiederverabreichung gegebenenfalls in Abwesenheit des Immunmodulators vorgenommen wird, vorausgesetzt daß, wenn es sich bei dem rekombinanten Virus um ein Adenovirus handelt, die Wiederverabreichung in Abwesenheit eines Immunmodulators durchgeführt werden muß.
Verwendung nach Anspruch 1 und 2, wobei der Immunmodulator ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Agens umfaßt: a) ein Cytokin; b) ein Agens, das selektiv die Aktivierung oder Funktion von CD4⁺-Zellen hemmt, wodurch die CTL-Eliminierung des Virus reduziert wird; c) ein Anti-T-Zellen-Antikörper; d) ein Agens, das den CD40-Liganden auf einer T-Zelle bindet und die Bindung des Liganden mit CD40 auf einer B-Zelle hemmt; und e) ein Agens, das den CD28-Liganden oder CTLA4-Liganden auf einer T-Zelle bindet und die Bindung des Liganden mit dem Antigen B7 auf einer B-Zelle hemmt.
Verwendung nach Anspruch 3a, wobei es sich bei dem Cytokin um Interleukin-4 handelt.
Verwendung nach Anspruch 3a, wobei es sich bei dem Cytokin um Interleukin-12 handelt.
Verwendung nach Anspruch 3a, wobei es sich bei dem Cytokin um gamma-Interferon handelt.
Verwendung nach Anspruch 3b, wobei das Agens einen Anti-CD4-Antikörper umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 3d, wobei das Agens aus der aus löslichem CD40-Molekül und Anti-CD40-Liganden-Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 3e, wobei das Agens aus der aus löslichem CD28, löslichem CTLA4, Anti-CD28-Antikörper und Anti-CTLA4-Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Immunmodulator ein DNA-Molekül umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Immunmodulator ein Protein umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das rekombinante Virus aus der aus Adenoassoziiertem Virus, Retrovirus, Vaccinia und Poxvirus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei es sich bei dem rekombinanten Virus um ein rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel gleichzeitig mit dem rekombinanten Virus verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus in Abwesenheit eines Immunmodulators wiederverabreicht wird.