DE69213401T2

DE69213401T2 - Polymerharz für Peptidsynthese

Info

Publication number: DE69213401T2
Application number: DE69213401T
Authority: DE
Inventors: Mohandas Pai; Robert Webber
Original assignee: Research and Diagnostic Antibodies
Current assignee: Research and Diagnostic Antibodies
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-09
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2012-06-10
Also published as: JP2722392B2; AU2238992A; EP0543986A4; EP0543986A1; US5563220A; EP0543986B1; US5198531A; JPH06502679A; DE69213401D1; WO1992022591A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Polymerharz und ein Verfahren, das sich zur Erzeugung von Polypeptiden eignet.
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) hat sich als das einzig praktikable Verfahren zur Herstellung synthetischer Peptide mit mehr als 8-10 Aminosäuren erwiesen. Ein Verfahren zur Herstellung synthetischer Peptide wird als Boc-(tert-Butyloxycarbonyl-) SPPS bezeichnet. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung synthetischer Peptide ist als Fmoc-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-)SPPS bekannt. Sowohl Boc- als auch Fmoc-SPPS verwenden winzige Kügelchen aus speziell hergestelltem Harz, die in einer chemischen Lösung suspendiert sind. jedes dieser Kügelchen dient als Anker zum Zusammenlagern von Aminosäureketten zur Bildung von Polypeptiden.
Die Boc-SPPS ist zwar das derzeit am häufigsten angewandte Verfahren zur Synthese von Peptiden, sie weist jedoch folgende Nachteile auf: geringe Produktausbeute (besonders bei Peptiden von mittlerer bis großer Länge), niedrige Reinheit und das Unvermögen, bestimmte Kombinationen der Aminosäuren ohne große Schwierigkeliten und Kostenaufwand zu bilden. Konkret spaltet Trifluoressigsäure (TFA), die normalerweise gemäß der "Schutz durch BOC"-Strategie dazu verwendet wird, bei jedem Synthesezyklus den Aminoterminus von der Schutzgruppe zu befreien, duch etwa 1% der Harz-Ankerpeptide von den Harzkügelchen ab. Somit nehmen die Ausbeute und die Reinheit während der Syntheseverfahren rasch ab. Dies ist das Ergebnis von abgespaltenen und verlorengegangenen Ketten, die freie Initiationsstellen auf dem Harz hinterlassen, an denen der Aufbau neuer Ketten beginnen kann. Außerdem ist Flußsäure (HF), ein integraler Bestandteil der Boc-SPPS, für viele destruktive Nebenwirkungen verantwortlich, wenn sie für synthetische Peptide angewandt wird. Fmoc-SPPS stellt eine Verbesserung gegenüber Boc-SPPS dar, da ein orthogonales Synthesesystem zum Einsatz kommt. Anders ausgedrückt sind die Seitenketten- Schutzgruppen und die Peptid-Harz-Bindungen gegenüber den in jedem Schritt der Peptidsynthese verwendeten Mitteln vollkommen stabil. Der in jedem Zyklus erfolgende Schritt der Schutzgruppen-Entfernung sieht eine sekundäre Aminbase vor, welche die Bindung zwischen der wachsenden Peptidkette und dem Harzträger nicht angreift, da diese Bindung säurelabil ist. Außerdem wird bei Fmoc nur TFA verwendet, wodurch die destruktiven Nebenwirkungen von HF ausgeschaltet werden. Einige Fmoc- SPPS sehen jedoch Polyamidharz vor, das im allgemeinen eine geringe Beladungskapazität aufweist. Derzeit verwendete Polyamidharze neigen auch zum Zusammenklumpen, weshalb sie für eine Produktion in großem Maßstab ungeeignet sind.
Es wird auf US-A-4.831.083 und 4.914.151 (Mergler et al.) verwiesen, die Polystyrolharz-Linker-Formulierungen beschreiben, die bei Fmoc-SPPS einsetzbar sind. Leider läßt sich das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Harz nur schwer herstellen, da das Ausgangsmaterial in einer Mehrstufen-Reaktion gebildet werden muß. Außerdem wird das fertige synthetische Peptid vom Harz unter Verwendung von 1%- iger TFA in Dichlormethan (DCM) abgespalten. Es stellte sich heraus, daß 1%-ige TFA stark genug ist, um einen beträchtlichen Teil der Seitenketten-Schutzgruppen, entweder Boc oder Triphenylmethyl (Trt), zu entfernen. Boc dient dazu, die funktionelle Gruppe auf den Seitenketten des Lys zu blockieren, während Trt Cys und His blockiert. Die Eliminierung dieser Aminosäuren aus jeder Peptidkonstruktion schränkt die Anwendbarkeit derselben stark ein. Das Mergler-Harz operiert weiters bei einem geringen Substitutionsgrad, was das industrielle Arbeiten in großem Maßstab ausschließt. Die Herstellung eines solchen Harzes mit hohen Beladungseigenschaften wäre enorm kostspielig, da das Ausgangsmaterial für dieses Harz teuer ist.
Andere Harze, die für die Erzeugung geschützter Peptidsegmente oder -fragmente mittels Fmoc-SPPS entwickelt wurden, wiesen ähnliche Probleme auf. Zu den Unzulänglichkeiten von Harzen nach dem Stand der Technik zählen die irreversible Bindung von Tryptophan an das Trägerharz und die Alkylierung verschiedener Aminosäuren bei der Abspaltung des Produkts von der festen Trägermatrix.
Es besteht weiterhin Bedarf an für die Fmoc-SPPS geeigneten Harzen, die höhere Ausbeuten und Reinheit ergeben und für die Konstruktion jeglicher Sequenzen aus sowohl natürlichen als auch nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuren sowie anderer Moleküle, die Carbonsäuregruppen enthalten, herangezogen werden können.
Demzufolge bietet die vorliegende Erfindung in einem Aspekt zur Verwendung bei der Peptidsynthese geeignete und im beigelegten Anspruch 1 definierte Polymerharze. In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung derivatisierte, zur Verwendung bei der Peptidsynthese geeignete und im beigelegten Anspruch 5 definierte Polymerharze. Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Synthetisieren eines Peptids, das die im beigelegten Anspruch 8 definierten Schritte umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt drei Harze bereit, von denen jedes einen einzelnen funktionellen Angriffspunkt bereitstellt, an dem geschützte Aminosäuren oder andere Moleküle, die eine freie Carbonsäuregruppe besitzen, angebunden werden können.
Das erste Harz (Harz Nr.1) besitzt die Formel eines an ein Polystyrol-DVB-Copolymer gebundenen 4-Hydroxy-3-methoxybenzylalkohols (HMBA) und ist ein Allzweckharz für herkömmliche Fmoc-SPPS. Es ist viel billiger herzustellen als das herkömmliche für Fmoc-SPPS verwendete p-Alkoxybenzylalkohol-Harz, da das Ausgangsmaterial, Vanillylalkohol, problemlos und kostengünstig in großen Mengen zur Verfügung steht. Das fertige synthetische Peptid kann mittels 25%-iger TFA in Dichlormethan (DCM) vom Harz abgespalten werden, was eine deutliche Verbesserung gegenüber der 95 %igen TFA darstellt, die zur Abspaltung von Produkten von p-Alkoxybenzylalkohol-Harz erforderlich ist. Das HMBA-Harz kann mit einer Aminosäure oder einem anderen carbonsäurehältigem Molekül derivatisiert oder beladen werden.
Das zweite Harz (Harz Nr.2) kann als ein an eine Polystyrol-DVB-Matrix gebundener Tritylalkohol bezeichnet werden. Das zweite Harz ist ein gegenüber verdünnten Säuren sehr anfälliges Harz zur Herstellung geschützter Peptidfragmente mittels Fmoc-SPPS. Die fertigen geschützten Peptide werden mit 15% Essigsäure und 85% DCM von der Trägermatrix abgespalten. Die Eliminierung von TFA für diesen erwünschten Abspaltungsschritt ist eine signifikante und unerwartete Eigenschaft von Harz Nr.2. Der Substitutionsgrad des Ausgangsmaterials und die Ausbeute an synthetischen Peptiden unter Verwendung eines derartigen Materials ist ziemlich hoch.
Das dritte Harz (Harz Nr.3) ist speziell zur Herstellung von Peptidamiden mittels Fmoc- SSPS geeignet. Harz Nr.3 ist ein an eine Polystyrol-DVB-Matrix gebundenes Tritylamin. Ein solches Tritylaminharz kann mit einer Aminosäure beladen und zur Peptidsynthese unter Anwendung des Fmoc-SSPS-Verfahrens eingesetzt werden. Das Tritylaminharz kann auch mit anderen carbonsäurehältigen Molekülen beladen werden, um Carbonsäureamide zu ergeben. Das Peptidamid kann mittels 25%-iger TFA in DCM vom Harz abgespalten werden, ohne daß mehrstufige Synthesen von Linker- Zwischenprodukten nötig wären.
Es ist offenkundig, daß eine neuartige und nützliche Gruppe von für die Fmoc-SPPS- Synthese geeigneten Harzen beschrieben wurde.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, feste Trägerharze für die Fmoc-SSPS- Synthese bereitzustellen, die sich für alle 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, für die nicht in der Natur vorkommenden D-Aminosäuren sowie für alle anderen eine Carbonsäuregruppe enthaltenden Moleküle eignen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines festen Trägerharzes für die Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese, die zu einer hohen Ausbeute an synthetischen Polypeptiden führt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung fester Trägerharze für die Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese, um unerwünschte Nebenreaktionen während der Anbindung der ersten Aminosäure an die feste Trägermatrix auszuschalten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung fester Trägerharze für die Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese, um im Vergleich zu Harzen nach dem Stand der Technik geringere Mengen an Lösungsmittel in den Waschschritten der peptidbildenden Verfahren zu erfordern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung fester Trägerharze für die Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese, die relativ billig und leicht herzustellen sind.
Die Erfindung umfaßt auch weitere Ziele und Vorteile, insbesondere im Zusammenhang mit bestimmten Eigenschaften und Merkmalen, die sich aus dem weiteren Verlauf der Beschreibung ergeben.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Harz Nr.1 kann durch Zugabe des nach dem Stand der Technik bekannten Merrifield- Harzes zu Vanillylalkohol oder einem Derivat davon durch folgende Reaktion gebildet werden:
Das eingekreiste R ist ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer in einer Gel- oder einer membranartigen Form, die sich zur Durchflußsynthese eignet.
Harz Nr.1 kann durch die nachstehende Formel dargestellt werden:
worin: "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R eine Methyl-, Ethyl- oder Niederalkylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffen ist. R kann auch für eine Methoxy-, Ethoxy- oder Niederalkoxygruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffen stehen.
Die Behandlung des obigen Harzes mit einer Fmoc-Aminosäuregruppe belädt oder derivatisiert das vorliegende Harz. Eine solche Zugabe findet in Gegenwart von Carbonyldiimidazol (CDI) und DCM statt. Das Produkt wird nach einer Inkubationszeit durch Filtration gewonnen. Die folgende Formel stellt das derivatisierte Harz Nr.1 dar:
worin: "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R¹ eine Alkyl- oder Alkoxygruppe ist und R² eine Aminosäuregruppe oder ein anderes carbonsäurehältiges Molekül ist. Es wurde gefunden, daß das derivatisierte HMBA-Harz (Harz Nr.1) mittels 25%-iger TFA in DCM gespalten werden kann, was eine deutliche Verbesserung gegenüber der 95%-igen TFA darstellt, die nach dem Stand der Technik erforderlich ist, da unerwünschte Nebenreaktionen praktisch ausgeschlossen werden.
Harz Nr.2 wird durch Reaktion zwischen Polystyrol-DVB-Copolymer und Benzoylchlorid in Gegenwart von Aluminiumchlorid und Dichlorethan (DCE) gebildet, um ein Ketoharz herzustellen. Ein solches Harz wird dann durch eine Grignard-Reaktion in Gegenwart von Tetrahydrofuran (THF) gemäß folgender Reaktion in einen Alkohol umgewandelt:
Harz Nr.2 ist ein gegenüber verdünnten Säuren sehr anfälliges Harz, das zur Herstellung geschützter Peptidfragmente mittels Fmoc-SPPS verwendet werden kann. 15% Essigsäure in 85% DCM - und nicht TFA - kann dazu dienen, die fertigen, geschützten Peptide von der Trägermatrix abzuspalten. Harz Nr.2 kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
worin: "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und/oder R&sub4; entweder Wasserstoff, Methyl-, Ethyl- oder Niederalkygruppen mit 7 oder weniger Kohlenstoffen, Methoxy-, Ethoxy- oder Niederalkoxygruppen mit 7 oder weniger Kohlenstoffen sind. In seiner derivatisierten oder beladenen Form kann Harz Nr.2 durch folgende Formel dargestellt werden:
worin R&sub5; eine Aminosäuregruppe oder ein anderes carbonsäurehältiges Molekül ist Man beachte, daß die funktionelle Alkoholgruppe von Harz Nr.2 vor dem Beladen in ein Chlorid umgewandelt werden muß, was nachstehend detailliert beschrieben wird.
Harz Nr.3 wird speziell zur Herstellung von Peptidamiden mittels Fmoc-SPPS verwendet und gemäß folgender Reaktion gebildet, worin ein Tritylchloridharz in Gegenwart von wasserfreiem Ammoniak und DCM in das Tritylaminharz (Harz Nr.3 umgewandelt wird:
Man beachte, daß das oben dargestellte Tritylchloridharz aus dem Derivatisierungsverfahren von Harz Nr.2 durch folgende Reaktion gewonnen werden kann, indem Tritylalkoholharz in Gegenwart von DCM mit Acetylchlorid behandelt wird:
Das Tritylchloridharz kann mit der Fmoc-Aminosäuregruppe beladen oder in das oben gezeigte Tritylaminharz umgewandelt werden. Das Tritylaminharz (Harz Nr.3) kann durch folgende Formel dargestellt werden:
worin: "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und/oder R&sub4; Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder eine andere Niederalkylgruppe mit weniger als 7 Kohenstoffen, Methoxy, Ethoxy oder eine andere Niederalkoxygruppe mit weniger als 7 Kohlenstoffen sind.
In seinem derivatisierten oder beladenen Zustand kann Harz Nr.3 durch folgende Formel dargestellt werden: worin R&sub5; eine Aminosäuregruppe oder ein anderes carbonsäurehältiges Molekül ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, soll jedoch nicht darauf beschränkt sein. Die hierin angeführten Abkürzungen sind jene, die normalerweise auf dem Gebiet der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung, Derivatisierung und Spaltung des oben beschriebenen Harzes Nr.1.
6,0 g chlormethyliertes Polystyrol-DVB-Copolymer mit 4,15 mÄq. Chlorid pro Gramm Harz wurden in 50 mi Dimethylacetamid (DMA) oder Dimethylformamid (DMF) gequollen. 11,24 g 4-Hydroxy-3-methoxybenzylalkohol (HMBA oder Vanillylalkohol) wurden in 20 ml DMA gelöst. Diese Lösung wurde dem gequollenen Harz zugegeben und mit diesem vermischt. Anschließend wurden 3,94 g Natriummethoxid der Suspension zugegeben, 8 Stunden lang bei 65ºC inkubiert und dann über Nacht bei Raumtemperatur kontinuierlich durchmischt. Das resultierende HMBA-Harz wurde durch Filtration gewonnen, mit DMF, zweimal mit Dichlormethan (DCM), einmal mit Methanol und wiederum zweimal mit DCM gewaschen. Das gewaschene Harz wurde in einem Ofen bei 45ºC getrocknet. Die resultierende Ausbeute betrug 11,63 g an derivatisiertem HMBA-Harz, was eine berechnete Gewichtszunahme von 5,63 g ergab. Es wurde bestimmt, daß 36,5 mMol des HMBA am Polystyrol-DVB-Copolymer gebunden waren. Somit umfaßte das Endprodukt 2,7 mMol/g funktionelle Einheiten 1,0 g dieses Produkts wurde exemplarisch mit Fmoc-Phenylalanin wie folgt beladen. 2,0 g Carbonyldiimidazol (12,3 mMol) wurden zusammen mit 2,6 g Fmoc-Phenylalanin (6,7 mMol) in 10 ml DCM gelöst, gründlich vermischt und bei Raumtemperatur 10-15 Minuten lang vorinkubiert. Dieses Gemisch wurde dann dem HMBA-Harz zugegeben und die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur (21ºC) inkubiert. Das Produkt wurde dann durch Filtration gewonnen, zweimal mit DCM, einmal mit Methylalkohol und zweimal mit DCM gewaschen und in einem Ofen bei 35ºC getrocknet. Der Substitutionsgrad wurde an einer 10 mg-Probe des Produkts durch Abspalten der Fmoc- Gruppe mit 1,0 ml 20%-igem Pyrrolidin in DCM, Abfiltrieren des Harzes und Verdünnen des Volumens auf 10 ml bestimmt. Anschließend wurde die optische Dichte einer 1:10 verdünnten Probe gemessen. Diese Zahl wurde dann durch den molaren Extinktionskoeffizienten x 10&supmin;³ dividiert. Der erhaltene Wert stellt die mMol/g der am Harz gebundenen Fmoc-Aminosäure dar und entspricht dem erzielten Substitutionsgrad. In diesem veranschaulichenden Teil von Beispiel 1 wurden 1,24 mMol Fmoc- Phenylalanin pro Gramm Harz erhalten. Die folgende Tabelle I zeigt jenen Substitutionsgrad, der mit anderen Fmoc-Aminosäuren mittels ähnlicher Verfahren wie dem obigen unter Verwendung von Fmoc-Phenylalanin erzielt wird. TABELLE I Beladung von HMBA-Harz (Harz Nr.1) mit Fmoc-Aminosäuren
Die oben angeführten beladenen Harze können bei Fmoc-SPPS und der zyklischen Addition von Aminosäuren unter Verwendung vorgebildeter symmetrischer Anhydride, DIPCDI/HOBt, BOP/HOBt oder verschiedener anderer Kopplungsverfahren zum Einsatz kommen. Im Anschluß an den Aufbau der erwünschten Peptidsequenz wird das Peptid (mit freiem Carboxylterminus) durch Behandeln des Peptid-Harzes mit 100 ml 25%-iger TFA in DCM pro mMol Peptid vom Trägerharz abgespalten. Die folgende Tabelle II zeigt den zeitlichen Verlauf der Abspaltung verschiedener Fmoc-Aminosäuren vom Trägerharz. Das freie synthetische Peptid wird isoliert und nach Wunsch verwendet. TABELLE II Abspaltung von Fmoc-Aminosäuren von HMBA-Harz mit 25%-iger TFA

BEISPIEL2

Herstellung, Derivatisierung und Spaltung von Harz Nr.2 (Tritylalkoholharz)

50 g Polystyrol-DVB-Copolymer wurden in 400 ml Dichlorethan (DCE) oder DCM gequollen und die Suspension auf -6ºC abgekühlt. 56 g Benzoylchlorid und 64 g Aluminiumchlorid wurden in 100 ml des gleichen Lösungsmittels suspendiert und unter konstantem Rühren zum suspendierten Harz zugetropft. Nach Beendigung des Zutropfens wurde die Suspension auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und die Ketoharz-Bildung über Nacht unter konstantem Rühren fortgesetzt. Das resultierende Ketoharz wurde durch Filtration gewonnen, zweimal mit DCM, einmal mit Methanol und wiederum zweimal mit DCM gewaschen und in einem Ofen bei 45ºC getrocknet. Die Ausbeute betrug 82 g Ketoharz mit 3,75 mMol/g. 5 g Ketoharz wurden in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert und der Suspension 15 ml von 3 m Phenylmagnesiumbromid in Ether unter konstantem Rühren zugegeben. Die Grignard- Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um Tritylalkoholharz (Harz Nr.2) zu ergeben, das durch Filtration gewonnen, zweimal mit DCM, einmal mit Methanol und wiederum zweimal mit DCM gewaschen und in einem Ofen bei 35ºC getrocknet wurde. Das Tritylalkoholharz wird anschließend vor dem Beladen in das Chlorid übergeführt. Das getrocknete Tritylalkoholharz aus der Grignard-Reaktion wurde in 50 ml Toluol gequollen, 10 ml Acetylchlorid (140 mMol) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um die funktionelle Gruppe von Hydroxyl in Chlorid umzuwandeln. Das Tritylchloridharz wurde wie das obige Tritylalkoholharz durch Filtration gewonnen, gewaschen und getrocknet. Zum Beladen des Tritylchloridharzes wurde 3 g desselben verwendet. 3,87 g Fmoc-Phenylalanin (10 mMol) oder eines anderen carbonsäurehältigen Moleküls und eine äquivalente Menge Diisopropylethylamin (DIEA) wurde in DCM gelöst zugegeben und die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur (21 ºC) inkubiert. Das Produkt wurde wie das obige Tritylalkoholharz durch Filtration gewonnen, gewaschen und getrocknet. Der Substitutionsgrad wurde an einer 10 mg-Probe durch Abspalten der Fmoc-Gruppe mit 1,0 ml 20%-ges Pyrrolidin in DCM, Abfiltrieren des Harzes, Einstellen des Volumens auf 10 ml, Messen der optischen Dichte einer 1:10 verdünnten Probe und Dividieren der optischen Dichte durch den molaren Extinktionskoeffizienten x 10&supmin;³ bestimmt. Die resultierende Menge stellt die mMol pro Gramm der am Harz gebundenen Fmoc- Aminosäure dar und entspricht demnach dem erzielten Substitutionsgrad.
Die nachstehende Tabelle III zeigt den mit verschiedenen Fmoc-Aminosäuren unter Verwendung von Harz Nr.2 erzielten Substitutionsgrad. TABELLE III Beladen von Tritylalkoholharz (Harz Nr.2) mit Fmoc-Aminosäuren
Das derivatisierte oder beladene Harz war dann bereit zur Verwendung bei der Fmoc- SPPS und der zyklischen Addition von Aminosäuren unter Verwendung von vorgebildeten symmetrischen Anhydriden mit einem Äquivalent DIEA oder unter BOP/HOBt/DIEA-Kopplung. Verschiedene Aminosäuren wurden all das Trägerharz gebunden und durch Behandlung des Peptidharzes mit 200 ml 15%-iger Essigsäure in DCM pro Mol Peptid davon abgespalten. Tabelle IV zeigt den zeitlichen Verlauf der Abspaltung verschiedener Fmoc-Aminosäuren vom Trägerharz. TABELLE IV

BEISPIEL 3

Herstellung, Derivatisierung und Spaltung von Harz Nr.3 - Tritylaminharz

Das in Beispiel 2 hergestellte und beschriebene Tritylchloridharz wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Chloridgruppe wurde durch Quellen des Tritylchloridharzes in DCM und Durchleiten von wasserfreiem Ammoniak durch die Suspension über Nacht in eine Amingruppe umgewandelt. Das Tritylaminharz wurde wie in Beispiel 2 durch Filtration gewonnen, gewaschen und getrocknet. 1,0 g des Tritylaminharzes wurde mit Fmoc-Aminosäuren beladen. Als Beispiel wurden 3,1 g Fmoc-Phenylalanin (8,0 mMol), eine äquivalente Menge Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und eine äquivalente Menge Hydroxybenzotriazol (HOBt) gemeinsam zugegeben, in DMF gelöst und die resultierende Suspension bei Raumtemperatur (21ºC) 4-6 Stunden lang inkubiert. Das Produkt wurde nach dem obigen Verfahren durch Filtration gewonnen, gewaschen und getrocknet. Der Substitutionsgrad wurde durch Abspalten der Fmoc-Gruppe mit 1,0 ml 20%-iges Pyrrolidin in DCM, Abfiltrieren des Harzes, Einstellen des Volumens auf 10 mi, Messen der optischen Dichte (OD) einer 1:10 verdünnten Probe und Dividieren der OD durch den molaren Extinktionskoeffizienten x 10&supmin;³ an einer 10 mg-Probe bestimmt. Die resultierende Zahl stellt die mMol/g der am Harz gebundenen Fmoc-Aminosäure dar und entspricht dem erzielten Substitutionsgrad. Tabelle V zeigt jenen Substitutionsgrad, der unter Verwendung von Harz Nr.3 mit verschiedenen hergestellten Fmoc-Aminosäuren erzielt wurde: Tabelle V Beladen von Tritylaminharz (Harz Nr.3) mit Fmoc-Aminosäuren
Wiederum könen derartige beladene Harze unter Anwendung der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren für Fmoc-SPPS und die zyklische Addition von Aminosäuren verwendet werden. Die unter Verwendung des Harzes dieses Beispiels gebildeten Peptidsequenzen wurden durch Behandeln des Peptidharzes mit 100 ml 25%-iger TFA in DCM pro mMol Peptid vom Trägerharz abgespalten. Die abgespaltene Substanz ist ein freies Peptid mit einem Carbonsäureamidterminus. Tabelle VI zeigt den zeitlichen Verlauf der Abspaltung verschiedener Fmoc-Aminosäureamide vom Trägerharz. TABELLE VI Abspaltung von Fmoc-Aminosäureamiden von Tritylaminharz mit 25%-iger TFA in DCM

BEISPIEL 4

Unter Verwendung von Harz Nr.1 aus Beispiel 1 (HMBA-Harz) wurde ein 12mer der folgenden Formel konstruiert:
Ac-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala
Es wurden 200 mg Fmoc-Ala-HMBA-Harz aus Beispiel 1 mit einem Substitutionsgrad von 0,5 mMol/g (0,1 mMol substituiertes Harz) verwendet. Die übrigen 11 Aminosäuren des vorliegenden 12mers wurden in Zyklen addiert. Die Addition jeder Fmoc-Aminosäure wurde mit einem vierfachen molaren Überschuß der einzelnen Fmoc-Aminosäuren, HOBt und DIPCDI während des Kopplungszyklus erreicht. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Nachdem das aminoterminale Tyrosin von seiner Schutzgruppe befreit wurde, wurde der Aminoterminus mittels Essigsäureanhydrid und Triethylamin acetyliert. Das synthetische Peptid wurde vom Trägerharz abgespalten und die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren durch Behandeln des Peptidharzes mit 25% TFA, 4% Wasser und DTT in DCM gleichzeitig von ihrer Schutzgruppe befreit. Das Rohpeptid wurde durch Gelfiration in 25%-iger Essigsäure teilweise gereinigt und lieferte 126 mg Peptid. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 1208,6 betrug die Ausbeute des Peptids 104,2%. Das teilweise reine Peptid wurde durch präparative HPLC bis zur Homogenität gereinigt, was 82,5 mg reines Peptid ergab (68,3% Gesamtausbeute). Aminosäureanalyse des Peptids führte zu den in nachstehender Tabelle VII gezeigten Ergebnissen. TABELLE VII

BEISPIEL 5

Unter Verwendung des HMBA-Harzes aus Beispiel 1 (Harz Nr.1) wurde das folgende Peptid konstruiert:
Ser-Tyr-Thr-Asn-Pro-Glu-Phe-Val-Ile-Asn-Val
Es wurden 465 mg Fmoc-Val-HMBA-Harz mit einem Substitutionsgrad von 0,43 mMol/g verwendet (0,2 mMol substituiertes Harz). Die zyklische Addition jeder Fmoc- Aminosäure wurde mittels eines vierfachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc- Aminosäuren, HOBt und DIPCDI in jedem Kopplungszyklus erreicht. Die Fmoc- Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Das Peptid wurde vom Trägerharz abgespalten und die Seitengruppen der trifunktionellen Aminosäuren durch Behandeln des Peptidharzes mit 25% TFA, 4% Wasser und 1 % DTT in DCM gleichzeitig von ihrer Schutzgruppe befreit. Das Rohpeptid wurde durch Gelfiltration in 25%-iger Essigsäure teilweise gereinigt und ergab 256 mg Peptid. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 1282,3 betrug die Ausbeute 99,8%. Das teilweise gereinigte Peptid wurde durch präparative HPLC bis zur Homogenität gereinigt und lieferte 119 mg reines Peptid (46,4% Gesamtausbeute). Die Aminosäureanalyse des Peptids führte zu den in nachstehender Tabelle VIII gezeigten Ergebnissen.

TABELLE VIII

BEISPIEL 6

Unter Verwendung des HMBA-Harzes aus Beispiel 1 (Harz Nr.1) wurde das folgende Peptid konstruiert:
Ser-Phe-Val-Asn-Ser-Glu-Phe-Leu-Lys-Pro-Glu-Val-Lys-Ser
Es wurden 384 mg Fmoc-Ser(o-t-But)-HMBA-Harz mit einem Substitutionsgrad von 0,39 mMol/g verwendet (0,15 mMol substituiertes Harz). Die zyklische Addition jeder Fmoc- Aminosäure wurde mittels eines vierfachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc- Aminosäuren, HOBt und DIPCDI in jedem Kopplungszyklus erreicht. Die Fmoc- Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Das Peptid wurde vom Trägerharz abgespalten und die Seitengruppen der trifunktionellen Aminosäuren durch Behandeln des Peptidharzes mit 25% TFA, 4% Wasser und 1 % DTT in DCM gleichzeitig von ihrer Schutzgruppe befreit. Das Rohpeptid wurde durch Gelfiltration in 25%-iger Essigsäure teilweise gereinigt und ergab 231 mg Peptid. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 1610,9 betrug die Ausbeute 95,6%. Das teilweise gereinigte Peptid wurde durch präparative HPLC bis zur Homogenität gereinigt und lieferte 172 mg reines Peptid (70,9% Gesamtausbeute). Die Aminosäureanalyse des Peptids führte zu den in nachstehender Tabelle IX gezeigten Ergebnissen. TABELLE IX

BEISPIEL 7

Das folgende geschützte Peptid wurde unter Verwendung des Trityiaikoholharzes aus Beispiel 2 (Harz 2) konstruiert:
Fmoc-Cys(Trt)-Ser(o-t-B ut)-Asn-Leu-Ser(o-t-But)-Thr(o-t-But)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly
Es wurden 100 mg Fmoc-Gly-Tritylharz mit 1,00 mMol/g (0,1 mMol substituiertes Harz) verwendet. Die zyklische Addition jeder Fmoc-Aminosäure wurde unter Verwendung eines Äquivalents HOBt, eines dreifachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc- Aminosäuren und BOP sowie eines sechsfachen molaren Überschusses an DIEA in jedem Kopplungszyklus erzielt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mittels 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Die letzte Fmoc-Schutzgruppe auf dem aminoterminalen Rest wurde jedoch nicht entfernt. Daher waren bei Abschluß der Synthese dieses Peptids der Aminoterminus sowie alle Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren nach wie vor geschützt. Das voll geschützte Peptid wurde mit 1 5%-iger Essigsäure in DCM vom Trägerharz abgespalten Das geschützte Peptid wurde gewonnen, die Essigsäure dreimal in Wasser extrahiert, das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt über P&sub2;O&sub5; im Vakuum getrocknet. Es wurden 165 mg geschütztes Peptid gewonnen. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 1805,0 für das voll geschützte Peptid betrug die Ausbeute 91,4%. Eine Probe des geschützten Peptids wurde mit 20%-igem Pyrrolidin in DCM behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, und die Probe für die Aminosäureanalyse hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse der Probe ergab die folgenden, in Tabelle X gezeigten Ergebnisse. TABELLE X

BEISPIEL 8

Das folgende geschützte Peptid wurde unter Verwendung des Tritylalkoholharzes aus Beispiel 2 (Harz 2) konstruiert:
Fmoc-Glu(o-t-But)-Thr(o-t-But)-Leu-Pro-Gln-Gly
Es wurden 200 mg Fmoc-Gly-Tritylharz mit 1,0 mMol/g (0,2 mMol substituiertes Harz) verwendet. Die zyklische Addition jeder Fmoc-Aminosäure wurde unter Verwendung eines Äquivalents HOBt, eines dreifachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc- Aminosäuren und BOP sowie eines sechsfachen molaren Überschusses an DIEA im jedem Kopplungszyklus erzielt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mittels 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Die letzte Fmoc-Schutzgruppe auf deni aminoterminalen Rest wurde jedoch nicht entfernt. Daher waren wie in Beispiel 7 bei Abschluß der Synthese dieses Peptids der Aminoterminus sowie alle Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren nach wie vor geschützt. Das voll geschützte Peptid wurde mit 15%-iger Essigsäure in DCM vom Trägerharz abgespalten. Das geschützte Peptid wurde gewonnen, die Essigsäure dreimal in Wasser extrahiert, das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt über P&sub2;O&sub5; im Vakuum getrocknet. Es wurden 177 mg geschütztes Peptid gewonnen Bezogen auf ein Molekulargewicht von 960,8 für das voll geschützte Peptid betrug die Ausbeute 92,2%. Eine Probe des geschützten Peptids wurde mit 20%-igem Pyrrolidin in DCM behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, und die Probe für die Aminosäureanalyse hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse der Probe ergab die folgenden in Tabelle XI gezeigten Ergebnisse. TABELLE XI

BEISPIEL 9

Unter Verwendung des Tritylharzes aus Beispiel 3 (Harz Nr.3) wurde das folgende Peptid konstruiert:
Lys-Lys-Tyr-Leu-Glu-Ser-Leu-Met-NH&sub2;
Es wurden 170 mg Fmoc-Met-Tritylaminharz mit 0,15 mMol/g verwendet (0,025 mMol substituiertes Harz). Die zyklische Addition jeder Fmoc-Aminosäure wurde mittels eines vierfachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc-Aminosäuren, HOBt und DIPCDI in jedem Kopplungszyklus erreicht. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20%-igem Pyrrolidin in DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Das Peptid wurde vom Trägerharz abgespalten und die Seitengruppen der trifunktionellen Aminosäuren durch Behandeln des Peptidharzes mit 25% TFA, 4% Wasser und 1 % DTT in DCM gleichzeitig von ihrer Schutzgruppe befreit. Das Rohpeptid wurde durch Gelfiltration in 25%-iger Essigsäure teilweise gereinigt und ergab 24 mg Peptid. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 1010,4 betrug die Ausbeute 95%. Das teilweise gereinigte Peptid wurde durch präparative HPLC bis zur Homogenität gereinigt und lieferte 20 mg reines Peptid (79,2% Gesamtausbeute). Die Aminosäureanalyse des Peptids führte zu den in nachstehender Tabelle XII gezeigten Ergebnissen. TABELLE XII

BEISPIEL 10

Unter Verwendung des Tritylaminharzes aus Beispiel 3 (Harz Nr.3) wurde das folgende Peptid konstruiert:
Phe-Met-Arg-Phe-NH&sub2;
Es wurden 260 mg Fmoc-Phe-Tritylaminharz mit 1,30 mMol/g verwendet (0,20 mMol substituiertes Harz). Die zyklische Addition jeder Fmoc-Aminosäure wurde mittels eines vierfachen molaren Überschusses der einzelnen Fmoc-Aminosäuren, HOBt und DIPCDI in jedem Kopplungszyklus erreicht. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20%-igem Pyrrolidin iii DMF im Schutzgruppenentfernungs-Schritt jedes Zyklus entfernt. Das Peptid wurde mit 25% TFA und 1,0% DTT in DCM 60 Minuten lang vom Trägerharz abgespalten. Das Rohpeptid wurde dann mit 50% TFA und 100/0 Thioanisol in DCM über Nacht behandelt, um die Pmc-Schutzgruppe von der Seitenkette von Arginin zu entfernen. Das Peptid wurde durch Gelfiltration in 25%-iger Essigsäure teilweise gereinigt und ergab 122 mg Peptid. Bezogen auf ein Molekulargewicht von 598,8 betrug die Ausbeute 101,8%. Das teilweise gereinigte Peptid wurde durch präparative HPLC bis zur Homogenität gereinigt und lieferte 107 mg reines Peptid (89,3% Gesamtausbeute). Die Aminosäureanalyse des Peptids führte zu den in nachstehender Tabelle XIII gezeigten Ergebnissen. TABELLE XIII

Claims

1. Zur Verwendung bei der Peptidsynthese geeignetes Polymerharz, dessen Aufbau im wesentlichen einer der folgenden Formeln entspricht:

worin "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R eine Niederalkyl- oder Niederakoxygruppe ist, und R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppe sind, worin jede der Niederalkyl- oder -alkoxygruppen 1 bis 7 Kohenstoffatome aufweist.

2. Polymerharz nach Anspruch 1, worin die Polymermatrix ein Polystyrol- Divinylbenzol-Copolymer ist.

3. Polymerharz nach Anspruch 1 oder 2, worin R eine Methylgruppe oder eine Methoxygruppe ist.

4. Polymerharz nach Anspruch 1 oder 2, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils Wasserstoff sind.

5. Zur Verwendung bei der Peptidsynthese geeignetes, derivatisiertes Polymerharz, dessen Aufbau im wesentlichen einer der folgenden Formeln entspricht:

worin "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R¹ eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit jeweils 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; wie in Anspruch 1 definiert sind und R² und R&sub5; ein eine Aminosäuregruppe oder ein anderes Carbonsäure enthaltendes Molekül sind.

6. Derivatisiertes Polymerharz der Formel (v) nach Anspruch 5, worin R ein eine Aminosäuregruppe oder eine Carbonsäure enthaltendes, mit einer Schutzgruppe versehenes Molekül ist.

7. Derivatisiertes Polymerharz nach Anspruch 5, bei dem R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils Wasserstoff sind und R&sub5; ein eine Aminosäuregruppe oder eine Carbonsäure enthaltendes, mit einer Schutzgruppe versehenes Molekül ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, folgende Schritte umfassend:

a) das Bereitstellen eines derivatisierten Polymerharzes mit einer aus den folgenden ausgewählten Formel:

worin "n" die Basiseinheit der Harzmatrix ist, R¹ eine Alkyl- oder Alkoxygruppe ist, R² eine Aminosäuregruppe ist und R³ eine Schutzgruppe ist;

b) das Abspalten der Schutzgruppe von der Aminosäuregruppe; und

c) das Anbinden einer Aminosäure mit einer geschützten aminoterminalen Gruppe an die R²-Gruppe.

9. Verwendung eines Polymerharzes nach Anspruch 1 oder eines derivatisierten Polymerharzes nach Anspruch 5 bei der Peptidsynthese.