-
Erfindungsgebiet
1. Gegenstand der Erfindung
-
Diese Erfindung betrifft neue pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Prävention und Behandlung von Krankheiten,
bei denen es zu einem anomalen Abbau von Calcium und
Knochenmatrix aus dem Knochen kommt (Knochenresorption). Eine
anomale Knochenresorption tritt nicht nur bei Osteoporose
auf, sondern auch bei rheumatoider Arthritis,
Paget-Krankheit, Knochen-Metastasierung maligner Tumoren,
Hyperthyreose oder nach Ovarektomie. Darüber hinaus wird sie mit
Neurektomie oder längerer Inaktivität oder Fixierung der
Extremitäten in Verbindung gebracht. In der Folge steigt
die Brüchigkeit der Knochen und die Gefahr von Frakturen.
Hinzu kommt, daß mit einer steigenden Zahl der Patienten
mit derartigen Erkrankungen, insbesondere der Osteoporose-
Patienten, zu rechnen ist, da die Zahl der älteren Personen
ab 65 Jahren in Japan angesichts der steigenden
durchschnittlichen Lebenserwartung rasch zunimmt. Der Begriff
"Osteoporose" bezieht sich in dieser Beschreibung sowohl
auf die Alters-Osteoporose als auch die postmenopausale
Osteoporose.
2. Stand der Technik
-
Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Vitamin D&sub3;,
Calcitonin, Östrogenen und Diphosphonat-Derivaten sind in
der klinischen Praxis bereits eingesetzt worden. Ihre
therapeutischen Ergebnisse waren jedoch nicht völlig
zufriedenstellend, es wäre daher höchst wünschenswert, über eine
bessere pharmazeutische Zusammensetzung zu verfügen.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Es ist bekannt, daß Knochenresorption durch
Aktivierung von Osteoklasten ausgelöst wird. Wir haben umfassende
Studien durchgeführt, um eine pharmazeutische
Zusammensetzung
zu finden, die selektiv Osteoklasten mit großer
Sicherheit hemmt. Wir haben entdeckt, daß eine Reihe von
Benzopyran-Derivaten der allgemeinen Formel (I)
-
die Knochenresorption hemmt. Diese Entdeckung veranlaßte
uns, die vorliegende Erfindung auszuarbeiten.
-
Diese Erfindung betrifft pharmazeutische Verbindungen
zur Inhibierung der Knochenresorption, die aus einem
pharmazeutischen Träger und einer therapeutisch wirksamen Menge
eines Benzopyran-Derivats der allgemeinen Formel (I)
-
bestehen, wobei die mit einer unterbrochenen Linie
dargestellte Bindung eine optionale Doppelbindung, R1 ein
Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R&sub2; eine Cyanogruppe,
eine Phenylsulfonyl-Gruppe oder eine Halogen-substituierte
Methoxyl-Gruppe und R&sub3; eine Gruppe mit der Formel
-
ist.
-
Beispiele für das Benzopyran-Derivat sind:
-
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung einer
therapeutisch wirksamen Menge eines Benzopyran-Derivats
gemäß Formel I für die Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Inhibierung der Knochenresorption.
-
Alle diese Benzopyran-Derivate sind bekannte
Verbindungen. So sind z.B. Verbindung I in der japanischen
Offenlegungsschrift Nr. 201182/1988, Verbindung II in Br.J.
Pharmacol., Bd 88, S. 103-111 (1986) und in den japanischen
Offenlegungsschriften Nr. 67683/1983, 188880/1983 und
219183/1983, Verbindung III in Br.J. Pharmacol., Bd 101, S.
605-614 (1990), Verbindung IV in J. Cardiovasc. Pharmacol.,
Bd 15, S. 188-197 (1990), und Verbindung V in J. Pharmacol.
Exp. Ther., Bd 256, S. 639-644 (1991), beschrieben. Akute
Toxizitätsstudien zu Verbindung I haben gezeigt, daß ihre
LD&sub5;&sub0; bei Mäusen 470 mg/kg (p.o.) und 103 mg/kg (i.v.)
beträgt und bei Ratten bei 2.000 mg/kg (p.o.) und 128 mg/kg
(i.v.) liegt. Die Toxizität dieser Verbindung ist somit
relativ gering.
-
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist als
pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung der
Knochenresorption geeignet. Sie kann parenteral in Form von
subkutanen Injektionen, intravenösen Injektionen oder
intramuskulären Injektionen, oder oral in Form von Tabletten,
Kapseln, Granulaten, Pulvern oder Sirup verabreicht werden.
-
Die Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung schwankt in
Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, Alter, Körpergewicht,
von den Symptomen des Patienten usw. Die Tagesdosis für
Erwachsene beträgt 1-200 mg, vorzugsweise 10-100 mg.
-
Die erfindungsgemäße Verbindung wird unter Verwendung
üblicher Adjuvantien wie z.B. Füllstoffen, Sprengmitteln,
Bindemitteln, Gleitmitteln oder Aromen in die vorgenannten
Formulierungen gebracht. Sie kann auch an eine Verbindung,
ein Protein oder ein Peptid mit hoher Affinität für ein
Knochengewebe gebunden werden, um eine spezifisch in das
Knochengewebe eindringende Dosierungsform zu erhalten.
-
Die Knochenresorptions-inhibierende Wirkung der
erfindungsgemäßen Verbindung zeigt sich in vitro anhand ihrer
direkten Wirkung auf die Osteoklastentätigkeit, und in vivo
anhand ihrer Wirkungen bei Ratten mit experimenteller
Hyperkalzämie und bei Ratten mit experimenteller
Immobilitätsknochenatrophie.
-
Die in vitro-Wirkung auf die Osteoklastentätigkeit
kann beispielsweise im Lakunentest geprüft werden. Hierbei
wird ein kleines Elfenbeinstück (Durchmesser ca. 6 mm) mit
einer mikroskopisch glatten Oberfläche in eine Suspension
von murinen Knochenmarkzellen mit Osteoklasten eingegeben.
Des weiteren wird Parathormon (PTH) zugegeben, um die
Osteoklasten zu aktivieren. Die aktivierten Osteoklasten
lösen die Mineralstoff- und Protein-haltige Matrix des
kleinen Elfenbeinstücks auf und bilden Lakunen. Nach Zugabe
der erfindungsgemäßen Verbindung zu dieser Testflüssigkeit
wird die Zahl der Lakunen auf dem kleinen Elfenbeinstück,
die durch die Osteoklasten-induzierte Knochenauflösung
entstanden sind, ermittelt, um die Wirkung dieser Verbindung
zu bestimmen. Je stärker die Knochenresorptions-hemmende
Wirkung ist, um so geringer ist die Zahl der entstandenen
Lakunen. Calcitonin wird als positive Kontrolle verwendet.
-
In einem in vivo-Test kann die systemische Wirkung der
erfindungsgemäßen Verbindung untersucht werden. Es ist
bekannt, daß PTH die Calciumionenwerte im Serum erhöht. So
kann experimentell durch Verabreichung von PTH
Hyperkalzämie induziert werden. Die Wirkung der erfindungsgemäßen
Verbindung auf die Calciumionenwerte im Blut von Ratten mit
einer auf diese Weise induzierten Hyperkalzämie kann als
Parameter zur Bestimmung ihrer verbessernden Wirkung auf
den Knochenstoffwechsel verwendet werden.
-
Die Knochenresorptions-inhibierende Wirkung der
erfindungsgemäßen Verbindung kann auch in Modellen mit
experimentell durch Inaktivität erzeugter Knochenatrophie
untersucht werden. Es ist bekannt, daß feste Verbände nach
Fraktur sowie Immobilität nach traumatischer Nervenexzision das
Gleichgewicht zwischen Knochenresorption und Knochenbildung
zugunsten der ersteren beeinflussen und zu einer
Verringerung der Knochenmasse führen. Die experimentelle Resektion
des Brachialnervs im Achselbereich führt zu Knochenatrophie
aufgrund einer Abnahme der Knochenmasse von Ulna und Radius
(auf Trockengewichtbasis) in Folge der Ruhigstellung des
Arms. Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung
gegenüber einer derartigen Atrophie kann durch Berechnung
des Verhältnisses der Knochenmasse von Ulna und Radius auf
der resezierten Seite im Vergleich zur nicht resezierten
Seite bestimmt werden.
Beispiele
-
Die Wirkungen der vorliegenden Erfindung werden
nachstehend anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
In vitro-Inhibierung der Knochenresorption.
-
Aus den Röhrenknochen einer 10 Tage alten ICR-Maus
wurden Knochenmarkzellen entnommen. Bruchstücke von Knochen
wurden durch Zentrifugieren in einem MEM-Medium mit 5%
bovinem Fetalserum entfernt. Die Knochenmarkzellen wurden in
demselben Medium bis zu einer Zelldichte von 10&sup7;/ml wieder
suspendiert. Auf eine Platte mit 96 Vertiefungen wurden
jeweils 100 ul der Suspension in eine Vertiefung
eingegeben. Jede Vertiefung der Platte enthielt ein kleines
Elfenbeinstück mit einem Durchmesser von 6 mm. Ein Testwirkstoff
wurde in einer Konzentration von 1 x 10&supmin;&sup6; bis 1 x 10&supmin;¹&sup0; mol
zu der Zellsuspension zugegeben. Die Platte wurde 3 Tage
lang bei 37º in Gegenwart von 1 x 10&supmin;&sup7; mol PTH bebrütet.
Anschließend wurden die Elfenbeinstücke entfernt, mit
Coomassie Brilliant Blue gefärbt, und die entstandenen Lakunen
wurden unter dem Mikroskop gezählt. Die Zahl der Lakunen in
der Gruppe, die den Testwirkstoff erhielt, wurde mit
derjenigen in der Gruppe ohne Testwirkstoff verglichen. Die
statistische Auswertung der Differenz erfolgte nach dem
t-Test von Student. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
dargestellt.
-
Der Anstieg der Zahl der durch PTH hervorgerufenen
Lakunen wurde durch handelsübliches Aal-Calcitonin
(nachstehend eCT genannt) in einer Konzentration von 1 x 10&supmin;&sup8;
mol, durch Verbindung I in einer Konzentration von 1 x 10&supmin;&sup8;
mol und durch Verbindung II in einer Konzentration von
1 x 10&supmin;&sup6; mol signifikant inhibiert (p< 0,01). eCT diente als
positive Kontrolle.
Tabelle 1
Beispiel 2
Wirksamkeit
bei Modelltieren mit Hyperkalzämie
(1. Versuch)
-
Männliche SD-Ratten im Alter von 5 Wochen erhielten 20
Stunden kein Futter. Danach wurden sie in Gruppen mit 3 bis
5 Tieren aufgeteilt und erhielten intravenös 60 E/kg
humanes PTH (N1-34), um eine Hyperkalzämie herzustellen. Die
Prüfsubstanz wurde in physiologischer Salzlösung gelöst,
und die Lösung wurde 15 Minuten vor Verabreichung des PTH
intravenös appliziert. Die Kontrollgruppen erhielten in
derselben Weise physiologische Salzlösung. 60 Minuten nach
Verabreichung des PTH wurden Blutproben genommen und die
Calciumionenwerte im Serum bestimmt. Die Werte der
Kontrollgruppen und der mit der Prüfsubstanz behandelten
Gruppen wurden verglichen. Die statistische Auswertung der
Differenzen erfolgte nach dem t-Test von Student.
-
Die Ergebnisse sind in Tab. 2 dargestellt. Die
Verabreichung von PTH führte zu einer signifikanten Erhöhung der
Calciumionenwerte im Serum; dies zeigt, daß eine
Hyperkalzämie induziert wurde. Die minimale Wirkdosis für die
Inhibierung dieser Anomalie lag bei 0,1 mg/kg für Verbindung I
und 1,0 mg/kg für Verbindung II.
Tabelle 2Beispiel 4
Wirksamkeit bei Modelltieren mit
immobilitätsbedingter Knochenatrophie
-
Der Brachialnerv wurde bei männlichen SD-Ratten (6
Wochen alt) unter Pentobarbital-Anästhesie aus der linken
Achselregion reseziert, um immobilitätsbedingte
Knochenatrophie-Modelle herzustellen. Sie wurden in 5 Gruppen mit
5 oder 6 Tieren aufgeteilt und erhielten unmittelbar nach
der Resektion intravenös Verbindung I in einer Dosis von
1,0 mg/kg zweimal täglich über 1 oder 2 Wochen bzw.
Verbindung II in einer Dosis von 1,0 mg/kg zweimal täglich über 1
Woche. Die Kontrollgruppen erhielten in derselben Weise
physiologische Salzlösung intravenös zweimal täglich über 1
oder 2 Wochen. Dann wurden Ulna und Radius entfernt,
dehydratisiert und mit Alkohol entfettet. Danach wurden diese
Knochen 6 Stunden lang bei 160ºC getrocknet und
anschliessend gewogen. Das Gewichtsverhältnis von linker zu rechter
Ulna sowie von linkem zu rechtem Radius wurde berechnet.
Die Werte der Kontrollgruppe und der einzelnen
Behandlungsgruppen wurden verglichen. Die statistische Auswertung
erfolgte nach dem t-Test von Student.
-
Die Ergebnisse sind in Tab. 4 dargestellt. Bei
einwöchiger Verabreichung führte Verbindung II zu einer
signifikanten Hemmung der Gewichtsabnahme der Ulna auf der Seite
mit dem resezierten Nerv, während mit Verbindung I eine
Tendenz zur Hemmung der Gewichtsabnahme festzustellen war,
die jedoch nicht signifikant war. Nach Behandlung über 2
Wochen war mit Verbindung I eine signifikante Hemmung der
Gewichtsabnahme von Ulna und Radius auf der Seite mit dem
rezesierten Nerv festzustellen.
Tabelle 4
-
Eine erfindungsgemäße Formulierung ist anhand des
nachstehenden Beispiels beschrieben.
Formulierungsbeispiel
-
0,4 g der Verbindung I und 16 g Natriumchlorid wurden
mit destilliertem Wasser für Injektionslösungen bis zu
einer Gesamtmenge von insgesamt 2.000 ml Flüssigkeit
aufgefüllt. Diese Flüssigkeit wurde über ein 0,22 u Millipore-
Filter steril filtriert und in einer Menge von jeweils 5 ml
in 5 ml-Ampullen eingegeben. Die Ampullen wurden
schmelzversiegelt und im Autoklaven sterilisiert, um
Injektionslösungen herzustellen.
-
Wie deutlich aus der vorstehenden Beschreibung
hervorgeht, zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen in vitro
eine Inhibierung der Knochenresorption, in vivo eine
Korrektur des anomalen Knochenstoffwechsels in Tiermodellen
mit experimenteller Hyperkalzämie und mit Knochenatrophie
infolge experimenteller Immobilität. Daher werden diese
Verbindungen vorgeschlagen, um bei Krankheiten, die mit
Knochenstoffwechsel in Verbindung gebracht werden, wie z.B.
Osteoporose und Hyperkalzämie, eine Besserung zu erzielen.
-
1. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge
eines Benzopyranderivats der allgemeinen Formel (I):
-
wobei die mit der unterbrochenen Linie dargestellte Bindung
eine optionale Doppelbindung, R&sub1; ein Wasserstoffatom oder
eine Hydroxylgruppe, R&sub2; eine Cyano-Gruppe, eine
Phenylsulfonyl-Gruppe oder eine halogensubstituierte Methoxyl-Gruppe
und R&sub3; eine Gruppe mit der Formel
-
ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Inhibierung der Knochenresorption.
-
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei R&sub1; eine
Hydroxyl-Gruppe, R&sub2; eine Cyano-Gruppe, R&sub3; eine
2-Oxo-1-pyrrolidinyl-Gruppe in trans-Position zu R&sub1; und die mit der
unterbrochenen Linie dargestellte Bindung eine einfache Bindung
ist.
-
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei R&sub1; eine
Hydroxyl-Gruppe, R&sub2; eine Phenylsulfonyl-Gruppe, R&sub3; eine
2-Oxo-1-pyrrolidinyl-Gruppe in trans-Position zu R&sub1; und die mit
der unterbrochenen Linie dargestellte Bindung eine einfache
Bindung ist.