DE69133200T2

DE69133200T2 - Spezifisch bindende Agentien

Info

Publication number: DE69133200T2
Application number: DE69133200T
Authority: DE
Inventors: Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2011-09-06
Also published as: AU653167B2; FI114611B; JP3514456B2; NO930825D0; KR930702526A; US6204366B1; DE69133200D1; DK0483961T3; ES2193129T3; FI113873B; JPH06500468A; GB9019553D0; WO1992004380A1; NO315239B1; FI930984L; NO930825L; RO113432B1; CA2090961A1; HU9300609D0; ATE233279T1

Description

Diese Erfindung betrifft umgestaltete humane Antikörper und umgestaltete humane Antikörperfragmente und insbesondere Polypeptide, die Aminosäuresequenzen enthalten, die spezifisch an andere proteinische oder nicht-proteinische Materialien binden. Die Erfindung betrifft vor allem die Erzeugung derartiger umgestalteter humaner Antikörper und umgestalteter humaner Antikörperfragmente mittels gentechnologischer Verfahren.

Struktur von Antikörpern

Natürliche Antikörpermoleküle bestehen aus zwei identischen Polypeptiden, den schweren Ketten, und zwei weiteren identischen Polypeptiden, den leichten Ketten, die kovalent über Disulfrd-Bindungen miteinander verbunden sind. Die Fig. 14 der begleitenden Zeichnungen stellt diagrammartig die typische Struktur eines Antikörpers der IgG-Klasse dar. Jede der Ketten ist zu verschiedenen eigenständigen Domänen gefaltet. Die N-terminalen Domänen aller Ketten sind bezüglich ihrer Sequenz variabel und werden deshalb als die variablen Bereiche (V- Bereiche) bezeichnet. Die V-Bereiche einer schweren Kette (VH) und einer leichten Kette (VL) assoziieren unter Bildung der Antigen-bindenden Stelle. Das Modul, das durch die vereinigten VH- und VL-Domänen gebildet wird, wird als das Fv (variable Fragment) des Antikörpers bezeichnet. Die C-terminalen Enden sowohl der schweren als auch der leichten Ketten sind bezüglich ihrer Sequenz am stärksten konserviert und werden deshalb als die konstanten Bereiche bezeichnet. Die konstanten Bereiche der schweren Kette bestehen aus verschiedenen Domänen, z. B. besteht der konstante Bereich der schweren Kette des Gamma-Isotyps (lgG) aus drei Domänen (CH1, CH2, CH3) und einem "Hinge"-Bereich, der die CH1- und CH2- Domänen verbindet. Die Hinge-Bereiche der zwei schweren Ketten sind kovalent über Disulfid- Bindungen miteinander verknüpft. Die leichten Ketten haben eine konstante Domäne, die gegenüber der CH1-Domäne angeordnet ist. Die konstanten Bereiche des Antikörpermoleküls sind in Effektorfunktionen involviert, beispielsweise die Lyse und die Komplement-Beseitigung über "Antibody Dependent Cell Cytotoxicity" (ADCC). Der klassische Verdau eine Antikörpers mit der Protease Papain führt zu drei Fragmenten. Ein Fragment enthält die CH2- und CH3- Domänen und wurde, da es leicht kristallisiert, das Fc-Fragment genannt. Die anderen beiden Fragmente wurden als die Fab-Fragmente (Antigen-bindende Fragmente) bezeichnet. Sie sind identisch und enthalten die gesamte leichte Kette zusammen mit der VH- und CH1-Domäne. Bei der Verwendung von Pepsin erfolgt die proteolytische Spaltung so, dass die beiden Fabs über den Hinge-Bereich verbunden bleiben und das (Fab)&sub2;-Fragment bilden. Jede dieser Domänen wird auf der genetischen Ebene durch ein eigenes Exon repräsentiert.
Die variablen Bereiche enthalten selbst jeweils 3 Cluster hypervariabler Reste in einem Gerüst (Framework) stärker konservierter Sequenzen. Diese hypervariablen Bereiche treten mit dem Antigen in Wechselwirkung und werden die "Complementarity Determining Regions" (CDRs) genannt. Die stärker konservierten Sequenzen werden die Gerüstbereiche ("Framework Regions", FRs) genannt (siehe Kabat et al. (1987)). Röntgenuntersuchungen von Antikörpern haben gezeigt, dass die CDRs Schleifen bilden, die aus der Oberseite des Moleküls heraus ragen, während die FRs ein stützendes Gerüst aus einem Beta-Faltblatt bilden.

Modifizierte Antikörper

Die Erfindung betrifft sogenannte "umgestaltete" oder "veränderte" humane Antikörper, wie sie in den Ansprüchen beansprucht werden, d. h. Immunglobuline, die im wesentlichen humane konstante Bereiche und Gerüstbereiche aufweisen, bei denen aber die Complementarity Determining Regions (CDRs) denjenigen entsprechen, die in einem nicht-humanen Immunglobulin vorkommen, und sie betrifft auch entsprechende umgestaltete Antikörperfragmente.
Die allgemeinen Prinzipien, nach denen derartige umgestaltete humane Antikörper und Fragmente erzeugt werden können, sind heutzutage gut bekannt, und es kann auf Jones et al. (1986), Riechmann et al. (1988), Verhoeyen et al. (1988) sowie EP-A-239400 (Winter) verwiesen werden. Eine umfassende Liste relevanter Literaturstellen wird später in dieser Beschreibung gebracht.
Umgestaltete humane Antikörper und Fragmente sind besonders für die In-vivo- Diagnose und die Behandlung menschlicher Leiden nützlich, da die im wesentlichen menschlichen Proteine mit geringerer Wahrscheinlichkeit zu unerwünschten Reaktionen führen, wenn sie einem menschlichen Patienten verabreicht werden, und die gewünschte Spezifität, die durch die CDRs bewirkt wird, kann in einem Wirtstier erzeugt werden, beispielsweise der Maus, über das die Antikörper mit ausgewählter Spezifität leichter gewonnen werden können. Die Gene der variablen Bereiche können über den nicht-humanen Antikörper kloniert werden, und die CDRs können mittels gentechnologischer Verfahren in ein Gerüst aus humanen variablen Bereichen verpflanzt werden, um den umgestalteten humanen Antikörper oder das umgestaltete humane Fragment zu erzeugen. Zur Erzielung dieses gewünschten Ergebnisses ist es erforderlich, wenigstens die CDRs in dem ausgewählten nicht-humanen Antikörper zu identifizieren und zu sequenzieren und vorzugsweise die Sequenz des gesamten humanen nicht-variablen Bereichs, um die Identifizierung potenziell wichtiger Wechselwirkungen zwischen den CDRs und dem Gerüst zu identifizieren,
Antikörper, die gegen das humane Milchfett-Kügelchen (HMFG), im allgemeinen im delipidierten Zustand, erzeugt wurden, können eine breite Reaktivität gegenüber Neoplasien epithelialen Ursprungs zeigen, insbesondere gegenüber Karzinomen der Brust, des Ovars, des Uterus und der Lunge (siehe Taylor-Papadimitriou et al., 1981, und Arklie et al., 1981). Vön einem gut charakterisierten Antikörper (bezeichnet als HMFG1) ist bekannt, dass er an eine Komponente des HMFG bindet, die auch in einigen Körpergeweben, in einigen Krebsgeweben und im Urin gefunden wird und als epitheliales polymorphes Mucin (PEM) bezeichnet wurde (Gendler et al. 1988). Man nimmt an, dass der Peptid-Kern des PEM an der Bindung beteiligt ist. Eine entsprechende nützliche Spezifität kann erhalten werden, indem Antikörper gegen Krebszellen, beispielsweise Brustkrebs-Zelllinien, erzeugt werden.
EP-A2-0369816 (Universität Melbourne, Xing et al.) beschreibt monoklonale Antikörper, die spezifisch für humanes polymorphes epitheliales Mucin sind und an eine definierte Aminosäuresequenz binden. Es wird im EP-A2-0369816 vorgeschlagen, dass die beschriebenen Antikörper mittels des Verfahrens von Riechmann et al. (1988) "humanisiert" werden könnten. Allerdings beschreiben Xing et al. nicht die tatsächliche Herstellung irgendwelcher derartiger umgestalteter Anti-PEM-Antikörper.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen umgestalteten humanen Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment gemäß Anspruch 1 bereit. Der umgestaltete humane Antikörper oder das Fragment eines umgestalteten Antikörpers kann ein intakter herkömmlicher Antikörper sein oder einem Fragment eines derartigen Antikörpers aus mehren Ketten oder aus einer Kette äquivalent sein.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein umgestalteter Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment, der bzw. das eine Proteinsequenz aufweist, wie sie in der Fig. 12 und/oder der Fig. 13 der begleitenden Zeichnungen dargestellt ist. Weitere wichtige Ausführungsformen der Erfindung sind ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, wie sie in der Fig. 12 und/oder der Fig. 13 der begleitenden Zeichnungen dargestellt ist, und ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die für die Proteinsequenzen codiert, die in der Fig. 1 und/oder der Fig. 2 der begleitenden Zeichnungen als CDR gekennzeichnet sind.
Einen wichtigen Aspekt der Erfindung stellt eine stabile Wirtszelllinie dar, die ein fremdes Gen enthält, das dazu führt, dass die Wirtszelllinie einen erfindungsgemäßen umgestalteten humanen Antikörper oder ein erfindungsgemäßes umgestaltetes humanes Antikörperfragment gemäß den Ansprüchen erzeugt. Sie kann eine stabile Wirtszelllinie sein, die ein fremdes Gen enthält, das für die Aminosäuresequenzen codiert, die in der Fig. 1 und/oder der Fig. 2 der begleitenden Zeichnungen als CDR bezeichnet sind, zusammen mit einem Protein-Gerüst, das es der durch sie codierten Aminosäuresequenz, wenn sie exprimiert wird, ermöglicht, als eine CDR mit Spezifität für HMFG zu fungieren.
Die Erfindung stellt auch eine immortalisierte Säugetierzelllinie oder eine Hefe oder eine sonstige eukaryotische Zelle oder eine prokaryotische Zelle, wie ein Bakterium, bereit, die einen umgestalteten Antikörper oder ein umgestaltetes Antikörperfragment gemäß der Erfindung erzeugt.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein umgestalteter humaner Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment mit einer Spezifität, die derjenigen des monoklonalen Gamma-1-kappa-Anti-HMFG-Antikörpers "HMFG1" äquivalent ist.
Die Erfindung stellt auch zwei neuartige Plasmide bereit, pSVgpt-HuVHHMFG1-HulgG1 und pSVneo-HuVkHMFG1-HuCk, und diese Plasmide können zur Herstellung eines umgestalteten humanen Antikörpers oder eines umgestalteten humanen Antikörperfragments eingesetzt werden.
Diese Plasmide sind in den neuen E.-coli-Stämmen NCTC 12411 bzw. NCTC 12412 enthalten.
Weitere Aspekte der Erfindung sind:
a) Eine DNA-Sequenz, die für den variablen Bereich der schweren Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers codiert, der eine Spezifität gegenüber HMFG aufweist, wie sie im E.-coli-Stamm NCTC 12411 enthalten ist.
b) Eine DNA-Sequenz, die für den variablen Bereich der leichten Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers codiert, der eine Spezifität gegenüber HMFG aufweist, wie sie im E.-coli-Stamm NCTC 12412 enthalten ist.
c) Ein variabler Bereich der schweren Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers, der eine Spezifität gegenüber HMFG aufweist, und der mittels des Expressionsvektors, der im E.-coli-Stamm NCTC 12411 enthalten ist, erzeugt werden kann.
d) Ein variabler Bereich der leichten Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers, der eine Spezifität gegenüber HMFG aufweist, und der mittels des Expressionsvektors, der im E.-coli-Stamm NCTC 12412 enthalten ist, erzeugt werden kann.
e) Ein umgestalteter humaner Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment, der bzw. das wenigstens einen variablen Bereich gemäß c) oder d) oben aufweist.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung ist deshalb ein umgestalteter humaner Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment, der bzw. das eine Anti-HMFG- Spezifität aufweist und eine Kombination von CDRs enthält (die beispielsweise aus einem Anti- HMFG-Immunglobulin der Maus kloniert werden können), die die Aminosäuresequenzen aufweisen, die in den Fig. 1 und 2 der begleitenden Zeichnungen als CDR1, CDR2 bzw. CDR3 bezeichnet wurden, die jeweils den variablen Bereich (VH) der schweren Kette und den variablen Bereich (Vk) der leichten Kette eines monoklonalen Anti-HMFG-Antikörpers der Maus repräsentieren, und die wir kloniert und sequenziert haben. Im Falle eines intakten Antikörpers oder eines Fragments, das wenigstens einen variablen Bereich der schweren Kette und wenigstens einen variablen Bereich der leichten Ketten aufweist, enthält der umgestaltete Antikörper oder das umgestaltete Fragment vorzugsweise alle sechs CDRs der nicht-humanen Quelle. Damit die effektivste Bindung erzielt wird, sollten die CDRs vorzugsweise in der gleichen Anordnung zueinander angeordnet sein, wie sie im ursprünglichen, nicht-humanen Antikörper vorliegt; beispielsweise sollten die VH-CDRs in einem humanen VH-Gerüst und in der Reihenfolge vorliegen, in der sie natürlicherweise im nicht-humanen Antikörper vorkommen.
Die Erfindung kann auch für die Erzeugung bi-spezifischer Antikörper eingesetzt werden, die zwei Fab-Abschnitte unterschiedlicher Spezifität aufweisen, wobei eine der Spezifitäten durch einen umgestalteten humanen variablen Kettenbereich bewirkt wird, der die CDRs, die in den Fig. 1 und 2 der begleitenden Zeichnungen dargestellt sind, enthält.
Die Erfindung kann auch bei der Erzeugung sogenannter einzelkettiger Antikörper (beispielsweise wie es in EP-A-281604, Genex, offenbart ist) sowie für Polysaccharidverknüpfte Antikörper (siehe EP-A-315456, Hybritech) und andere modifizierte Antikörper eingesetzt werden.
Es können beliebige humane konstante Bereiche (beispielsweise vom Gamma-1-, -2-, -3- oder -4- Typ) verwendet werden.
Antikörperfragmente, die nützliche spezifische Bindungsaktivitäten behalten, können (Fab)2-, Fab-, Fv-, VH- oder Vk-Fragmente sein. Diese können von einem intakten umgestalteten Antikörper gewonnen werden, beispielsweise durch einen Protease-Verdau, oder sie können als solche mittels gentechnologischer Verfahren erzeugt werden.

Praktische Anwendungen der Erfindung

Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein humaner Anti-HMFG-Antikörper oder ein entsprechendes Fragment, wie sie oben definiert wurden, die mit einem Mittel verknüpft sind oder ein Mittel enthalten, das imstande ist, das Wachstum von Krebszellen zu verzögern oder zu beenden, oder die mit einem Mittel für eine Bilddarstellung verknüpft sind, das nachgewiesen werden kann, wenn es sich im menschlichen Körper befindet. Die Erfindung schließt auch injizierbare Zusammensetzungen ein, die eine derartige Kombination in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, beispielsweise einer Salzlösung, einem Plasmaexpander oder Liposomen, umfassen. Die Erfindung schließt auch die Verwendung eines umgestalteten menschlichen Anti-HMFG-Antikörpers oder eines entsprechenden Fragments, wie sie oben definiert wurden, in einem Verfahren zur Krebstherapie oder zur Krebsdarstellung beim Menschen ein. Die Erfindung schließt ferner die Verwendung eines derartigen Antikörpers oder Fragments zur Herstellung eines Medikaments für die therapeutische Anwendung zur Linderung von Krebsleiden beim Menschen ein oder die Verwendung eines derartigen Antikörpers oder Fragments zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für diagnostische Anwendungen in vivo beim Menschen.
Der Fc-Bereich des Antikörpers, der selbst Reaktionswege und Mechanismen, die im Körper vorhanden sind, ausnützt, wie eine Komplement-Lyse und eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, kann dazu verwendet werden, das Wachstum von Krebszellen negativ zu beeinflussen. Bei dieser Ausführungsform muss kein weiteres Reagens mit dem umgestalteten Antikörper verknüpft sein.
Zu Beispielen für Agenzien, die imstande sind, das Wachstum von Krebszellen negativ zu beeinflussen, gehören Radioisotope wie Yttrium-90 und Jod-131, Arzneimittel wie Methotrexat, Toxine wie Ricin oder Teile davon sowie Enzyme, die z. B. ein inaktives Arzneimittel an der Stelle, an der der Antikörper bindet, in ein aktives Arzneimittel umwandeln können.
Beispiele für Agenzien für eine Bilddarstellung sind Radioisotope, die Gammastrahlen erzeugen, wie Indium-111 und Technetium-99, Radioisotope, die Positronen erzeugen, wie Kupfer-64, und passive Agenzien wie Barium, die als Kontrastmittel für Röntgenstrahlen wirken, sowie Gadolinium für das NMR/ESR-Scanning.
Wenn ein metallisches Agens, beispielsweise ein Radioisotop, an einem umgestalteten humanen Antikörper oder einem umgestalteten humanen Antikörperfragment der Erfindung befestigt werden soll, kann es erforderlich sein, ein Kopplungsmittel oder einen Chelatbildner zu verwenden. Es wurden viele geeignete Chelatbildner entwickelt, und es kann beispielsweise auf die Patente US 4 824 986, US 4 831 175, US 4 923 985 und US 4 622 420 verwiesen werden. Techniken, die die Verwendung von Chelatbildnern beinhalten, werden beispielsweise in den Patenten US 4 454 106, US 4 722 892, bei Moi et al. (1988), McCall et al. (1990), Deshpande et al. (1990) und Meares et al. (1990) beschrieben.
Die Verwendung radioaktiv markierter Antikörper und Fragmente bei der Darstellung und der Therapie von Krebs beim Menschen wird beispielsweise im EP 35265 beschrieben. Es kann vorteilhaft sein, den radioaktiv markierten, krebsspezifischen Antikörper oder das entsprechende Fragment zusammen mit einem unspezifischen Agens zu verwenden, das mit einem anderen Isotop markiert ist, um einen kontrastierenden Hintergrund für das sogenannte Subtraction-Imaging zu schaffen.
Die Antikörperreagenzien der Erfindung können dazu verwendet werden, PEM-produzierende Krebstypen zu identifizieren, beispielsweise durch eine Serumtestung oder eine Bilddarstellung, und/oder sie zu behandeln. Derartige Krebsformen können beispielsweise als Karzinome der Brust, der Ovarien, des Uterus und der Lunge vorkommen, oder sie können sich als Flüssigkeiten, wie pleurale Effusionen, manifestieren.

Erzeugung modifizierter Antikörper

Die Bereiche der VH- oder VL-Abschnitte, die übereinkunftsgemäß (Kabat, 1987) als die CDRs bezeichnet werden, müssen nicht die alleinigen Merkmale sein, die von dem nicht- humanen monoklonalen Antikörper übernommen werden müssen. Manchmal kann eine verbesserte Funktion eines Antikörpers bezüglich seiner Spezifität und/oder Affinität mit dem umgestalteten humanen Antikörper erhalten werden, wenn bestimmte nicht-humane Gerüst- Sequenzen im umgestalteten humanen Antikörper erhalten bleiben. Das Ziel besteht darin, die wichtige dreidimensionale Proteinstruktur der CDRs, die durch den Kontakt mit den Resten des Gerüsts gestützt wird, zu erhalten.
Der normale Ausgangspunkt, von dem aus ein umgestalteter Antikörper gemäß der Erfindung hergestellt werden kann, ist eine Zelle (vorzugsweise eine immortalisierte Zelllinie), die von einem nicht-humanen Wirtstier (beispielsweise einer Maus) gewonnen wird und die einen Antikörper exprimiert, der spezifisch für HMFG oder PEM ist. Eine derartige Zelllinie kann beispielsweise eine Hybridomzelllinie sein, die gemäß der herkömmlichen Technologie zur Erzeugung monoklonaler Antikörper erhalten wurde. Vorzugsweise hat der exprimierte Antikörper eine hohe Affinität und eine hohe Spezifität für HMFG, da damit gerechnet werden sollte, dass es während der Übertragung dieser Eigenschaften auf einen menschlichen Antikörper oder ein menschliches Antikörperfragment durch die erfindungsgemäßen Verfahren zu einem gewissen Verlust an Affinität und/oder Spezifität kommen kann. Durch das Auswählen eines Antikörpers hoher Spezifität als Ausgangsantikörper wird die Wahrscheinlichkeit, dass der letztendliche umgestaltete Antikörper oder das entsprechende Fragment ebenfalls eine effektive Bindung zeigt, erhöht.
Der nächste Schritt besteht aus dem Klonieren der cDNA der Zelle, die den ausgewählten nicht-humanen Antikörper exprimiert, und dem Sequenzieren und Identifizieren der Gene der variablen Bereiche einschließlich der Sequenzen, die für die CDRs codieren. Die erforderlichen experimentellen Verfahren können heutzutage als Routineverfahren auf diesem Gebiet angesehen werden, auch wenn sie immer noch mühsam sind.
Wenn das Ziel darin besteht, einen umgestalteten vollständigen humanen Antikörper oder wenigstens ein Fragment eines solchen Antikörpers, das die variablen Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Kette enthält, zu erzeugen, ist es erforderlich, die cDNA, die mit diesen beiden Domänen assoziiert ist, zu sequenzieren.
Nachdem die relevante(n) cDNA-Sequenz bzw. Sequenzen analysiert worden ist bzw. sind, ist es erforderlich, einen oder mehrere zur Replikation fähige(n) Expressionsvektor(en) zu präparieren, der bzw. die eine DNA-Sequenz enthält bzw. enthalten, die für wenigstens eine variable Domäne eines Antikörpers codiert, wobei diese variable Domäne humane Gerüstbereiche zusammen mit CDRs, die von dem ausgewählten nicht-humanen Anti-HMFG-Antikörper stammen, enthält. Die DNA-Sequenz in jedem Vektor sollte geeignete regulatorische Sequenzen enthalten, die notwendig sind, um eine wirksame Transkription und Translation des Gens sicher zu stellen, insbesondere einen Promotor und eine Leader-Sequenz, die korrekt mit der Sequenz der variablen Domäne verknüpft sind. Bei einem typischen Verfahren zur Erzeugung eines umgestalteten Antikörpers oder eines entsprechenden Fragments gemäß der Erfindung kann es erforderlich sein, zwei derartige Expressionsvektoren herzustellen, wobei der eine eine DNA-Sequenz für eine umgestaltete humane leichte Kette und der andere eine DNA- Sequenz für eine umgestaltete humane schwere Kette enthält. Die Expressionsvektoren sollten imstande sein, eine ausgewählte Zelllinie zu transformieren, in der die Erzeugung des umgestalteten Antikörpers oder des entsprechenden Fragments erfolgt. Eine derartige Zelllinie könnte beispielsweise eine stabile nicht-produzierende Myelomzelllinie sein, und entsprechende Beispiele (wie NS0 und sp2-0) können leicht im Handel erhalten werden. Eine Alternative besteht darin, ein bakterielles System, wie E. coli, als Expressionsvehikel für den umgestalteten Antikörper oder das entsprechende Fragment zu verwenden. Die abschließenden Schritte des Verfahrens beinhalten deshalb die Transformation der gewählten Zelllinie oder des gewählten Organismus mittels des Expressionsvektors oder der Expressionsvektoren und das anschließende Kultivieren der transformierten Zelllinie oder des transformierten Organismus zur Gewinnung des umgestalteten humanen Antikörpers oder des entsprechenden Fragments.
Detaillierte Schritte, mittels derer geeignete Expressionsvektoren hergestellt werden können, werden später in dieser Beschreibung erläutert. Die Manipulation von DNA-Material in einem geeignet ausgerüsteten Labor ist heutzutage Routine, und die benötigten Verfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Viele geeignete genomische Bibliotheken und cDNA-Bibliotheken, Plasmide, Restriktionsenzyme sowie die verschiedenen Reagenzien und Medien, die benötigt werden, um derartige Manipulationen durchzuführen, können von Lieferanten von Labormaterialien kommerziell bezogen werden. Beispielsweise können genomische Bibliotheken und cDNA-Bibliotheken von Clontech Laboratories Inc. erworben werden. Die Schritte, die im Folgenden beispielhaft beschrieben werden, sind lediglich für die Anleitung des Lesers dieser Beschreibung gedacht, und die Erfindung hängt auf keine Weise kritisch von der Verfügbarkeit des einen oder des anderen speziellen Ausgangsmaterials ab. In der Praxis steht dem Fachmann auf diesem Gebiet eine große Anzahl von Materialien zur Verfügung, aus denen er auswählen kann, und er kann die veröffentlichte Technologie einsetzen und adaptieren durch seine Erfahrung und unter Verwendung von Materialien, die auf dem wissenschaftlichen Feld am leichtesten verfügbar sind. Beispielsweise fallen viele Plasmide in diese Kategorie, die weit verbreitet sind und unter der betreffenden Wissenschaftlern weiter gegeben wurden, so dass sie nun als alltägliche Materialien betrachtet werden können.

Beispiele

Das zur Herstellung umgestalteter humaner Anti-HMFG-Antikörper eingesetzte Verfahren wird, und zwar lediglich beispielhaft, im Folgenden detailliert beschrieben, wobei Bezug auf die begleitenden Zeichnungen genommen wird.
Fig. 1 zeigt die cDNA-Sequenz, die für den variablen Bereich mit Anti-HMFG-Spezifität einer schweren Kette der Maus codiert. Die drei klassischen CDRs sind gekennzeichnet, zusammen mit einer Aminosäuresequenz, die mit dem cDNA-Code übereinstimmt.
Fig. 2 zeigt die cDNA-Sequenz, die für den variablen Bereich mit Anti-HMFG-Spezifität einer leichten Kette der Maus codiert.
Fig. 3a zeigt einen Plan eines synthetischen Gens für einen umgestalteten humanen VH mit Spezifität für HMFG1 (HuVHIconHMFG1-Genkassette), das 3 Fragmente enthält.
Fig. 3b bis 3d zeigen die Sequenzen der entsprechenden Fragmente in der Fig. 3a sowie die Oligonukleotide, die für die Zusammensetzung der einzelnen Fragmente verwendet wurden.
Fig. 4a, 4b und 4c zeigen zusammen einen Weg, über den ein Expressionsvektor, der für eine umgestaltete humane schwere Kette codiert, die die CDRs der Fig. 1 enthält, hergestellt werden kann.
Fig. 5a und 5b zeigen zusammen einen ähnlichen Transformationsweg, über den ein Expressionsvektor, der für eine umgestaltete humane leichte Kette codiert, die die CDRs der Fig. 2 enthält, hergestellt werden kann
Fig. 6 zeigt das Plasmid pUC&sub1;&sub2;-IgEnh, das eine Enhancer-Sequenz enthält, die in den Wegen der Fig. 4a bis 5b verwendet wurde.
Fig. 7 zeigt die Herkunft des Plasmids pBGS18-HuIgG1, das im Weg der Fig. 4c verwendet wurde.
Fig. 8 zeigt die Herkunft des Plasmids pBGS18-HuCk, das im Weg der Fig. 5b verwendet wurde.
Fig. 9 zeigt zwei synthetische Oligonukleotidsequenzen I und II, die für die Klonierung der cDNA-Sequenzen der Fig. 1 und 2 verwendet wurden.
Fig. 10 zeigt zwei synthetische Oligonukleotidsequenzen III und IV, die zur Einführung der KpnI- bzw. SalI-Restriktionsstellen in M13mp9HuVHLYS in dem in der Fig. 4a dargestellten Weg verwendet wurden.
Fig. 11 zeigt drei synthetische Oligonukleotidsequenzen VI, VII und VIII, die zur Verpflanzung der Vk-HMFG1-CDRs auf die humanen VK-REI-Gerüstbereiche in dem in der Fig. 5a dargestellten Weg verwendet wurden.
Fig. 12 und 13 zeigen die cDNA- und Aminosäuresequenzen der resultierenden umgestalteten variablen Bereiche der humanen schweren bzw. leichten Kette.
Fig. 14 stellt in Diagrammform die Struktur eines typischen Antikörpermoleküls (Immunglobulins) dar.
Fig. 15 zeigt in graphischer Form die relative spezifische Anti-HMFG1-Bindungsaktivität des resultierenden umgestalteten humanen Antikörpers.
Die experimentellen Verfahren, die für die Durchführung der Erfindung benötigt werden, verkörpern als solche keine ungewöhnlichen Technologien. Die Klonierungs- und Mutagenesetechniken wurden durchgeführt, wie sie allgemein beschrieben werden, beispielsweise bei Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988) und EP-A-239400 (Winter). Die "De-novo- Synthese" des Gens des variablen Bereichs der schweren Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers (siehe Fig. 3a-3d) erfolgte mittels herkömmlicher Techniken, wobei ein Set langer überlappender Oligonukleotide verwendet wurde (siehe auch Jones et al., 1988). Die Laborausrüstung und die Reagenzien für die Synthese langer Oligonukleotide sind leicht erhältlich, und da sich die Techniken auf diesem Gebiet weiter entwickeln, wird es praktikabel, immer längere Sequenzen zu synthetisieren.
Es sind detaillierte Laborvorschriften, die alle grundlegenden Aspekte gentechnologischer Verfahren abdecken, verfügbar, beispielsweise "Molecular Cloning" von Sambrook et al. (1989).
Mittels der Erfindung wurden die Antigen-bindenden Bereiche eines Anti-HMFG- Antikörpers (HMFG1) der Maus auf menschliche Gerüstbereiche verpflanzt. Der resultierende umgestaltete humane Antikörper (bezeichnet als HuHMFG1) hat eine Bindungscharakteristik, die derjenigen des ursprünglichen Maus-Antikörpers ähnelt.
Derartige umgestaltete Antikörper können für eine In-vivo-Diagnose und die Behandlung menschlicher Krebserkrankungen, z. B. von Eierstockkrebs und Brustkrebs, verwendet werden, und es wird erwartet, dass sie das Problem einer Immunantwort beim Patienten, die man oft bei der Anwendung eines nicht-humanen Antikörpers sieht, zumindest vermindern. Ein ähnlicher Vorteil wurde für den umgestalteten Antikörper CAMPATH-1 bei Hale et al. (1988) gezeigt.

Methoden

1. Klonierung und Sequenzbestimmung der Gene des variablen Bereichs der Maus

Messenger-RNA wurde aus einer Maus-Hybridomlinie isoliert, die den Gamma-1-kappa- Anti-HMFG-Antikörper "HMFG1" sekretiert (siehe Taylor-Papadimitriou et al., 1981 und Arklie et al., 1981). Die cDNA des ersten Stranges wurde über ein Priming mit den Oligonukleotiden I und II (siehe Fig. 9), die komplementär zu den 5'-Enden des CH1- bzw. Ck-Exons sind, synthetisiert. Die cDNA des zweiten Stranges wurde erhalten, wie es von Gübler und Hoffmann (1983) beschrieben wurde.
Kinase-behandelte EcoRI-Linker wurden mit der doppelsträngigen cDNA der schweren Kette und Pst1-Linker mit der doppelsträngigen cDNA der leichten Kette ligiert (beide wurden zuerst mit EcoRI- oder Pst1-Methylase behandelt, um mögliche innere Stellen zu schützen), woran sich eine Klonierung in EcoRI- oder PstI-geschnittenen pUC9 (Vieira et al., 1982) und eine Transformation des E.-coli-Stammes TG2 (Gibson, 1984) anschloss.
Kolonien, die Gene enthielten, die für den HMFG1-VH der Maus (MoVHHMFG1) und für den Anti-HMFG-Vk der Maus (MoVkHMFG1) codierten, wurden durch Koloniehybridisierung mit zwei Sonden identifiziert, die aus der 32P-markierten cDNA des ersten Stranges des HMFG1- VH bzw. -Vk bestanden. Positive Klone wurden über eine Plasmidpräparation charakterisiert, an die sich ein Verdau mit EcoRI oder PstI und eine Analyse auf einem 1,5%igen Agarosegel anschloss. Inserts voller Größe (ungefähr 450 bp) wurden in die EcoRI- oder PstI-Stelle von M13mp18 (Norrander et al., 1983) subkloniert. Das führte zu Klonen mit Inserts in beiden Orientierungen, was die Bestimmung der Nukleotidsequenz des gesamten Inserts mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., 1977) erleichterte.
Die Nukleotidsequenzen sowie ihre Übersetzung in Aminosäuresequenzen der Gene der reifen variablen Region MoVHHMFG1 und MoVkHMFG1 sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt. Die Inserts von 450 bp enthielten eine Signalsequenz und eine 5'-untranslatierte Sequenz und Linker, die nicht in den Figuren gezeigt sind.

2. Verpflanzung der HMFG1-CDRs der Maus auf humane Gerüstbereiche

Die allgemeinen Techniken, die notwendig sind, um das zu erzielen, wurden sehr adäquat bei Jones et al. (1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988) und EP-A- 239400 (Winter) beschrieben.

a) Leichte Kette:

Das grundlegende Konstrukt, das für die Umgestaltung einer humanen leichten Kette verwendet wurde, war M13mp9HuVkLYS (Riechmann et al., 1988), das Gerüstbereiche mit Sequenzen enthält, die auf denjenigen der variablen Bereiche der leichten Kette des humanen Bence-Jones-Proteins REI (Epp et al., 1974) basieren.
Die CDRs in diesem Konstrukt (Fig. 5a) wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese durch die Oligonukleotide VI, VII und VIII ersetzt, die für die CDRs der HMFG1-kappa-Kette codieren, flankiert an jedem Ende von 12 Nukleotiden, die für die entsprechenden Reste des humanen Gerüsts codieren. Diese Oligonukleotide sind in der Fig. 11 gezeigt. Die Mutagenese erfolgte wie bei Riechmann et al. (1988) beschrieben. Das resultierende Gen des variablen Bereichs der umgestalteten humanen leichten Kette (HuVkHMFG1) ist in der Fig. 13 gezeigt.

b) Schwere Kette:

Ein Gen eines variablen Bereichs einer humanen schweren Kette wurde mittels "Denovo-Synthese" erhalten. In den oben erwähnten, von Jones et al. etc. veröffentlichten Experimenten wurden CDRs der schweren Kette von Nagetieren auf die Gerüstbereiche des variablen Bereichs der humanen schweren NEW-Kette verpflanzt. Es wurde von Verhoeyen et al. (1988) und von Riechmann et al. (1988) gezeigt, dass es wichtig ist, dass das humane Gerüst die Nagetier-CDRs in einer Konformation halten kann, die derjenigen ähnlich ist, die im ursprünglichen Nagetier-Antikörper vorliegt, und dass bestimmte Wechselwirkungen zwischen CDR und Gerüst kritisch sein können. Es folgt somit, dass, je unähnlicher die Gerüst-Sequenzen des Nagetiers und des Menschen sind, um so geringer auch die Chance sein wird, dass die CDR- Verpflanzung "angenommen" wird.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette des HMFG1 der Maus (Fig. 1) mit derjenigen des humanen NEW (wie er in Verhoeyen et al., 1988 verwendet wurde) zeigte 44% Unterschiede zwischen ihren jeweiligen Gerüstbereichen. Eine viel bessere Homologie wurde beim Vergleich mit den variablen Bereichen der humanen schweren Kette der Untergruppe I (Kabat et al., 1987) gefunden. Das humane VHNEW gehört zur Untergruppe II.
Wir beschlossen deshalb, ein Gen des variablen Bereichs einer humanen schweren Kette der Untergruppe I, das die CDRs der schweren Ketten des HMFG1 enthielt, zu synthetisieren. Wir konstruierten eine Konsensussequenz der variablen Bereiche der humanen schweren Kette der Untergruppe I, basierend auf Sequenzinformationen über diese Untergruppe bei Kabat et al., 1987. Die optimale Codon-Verwendung wurde den Sequenzen der Gene der konstanten Bereiche der Maus entnommen (diese Gene werden in einer Maus- Myelomlinie exprimiert).
Der Unterschied zwischen den Gerüstsequenzen des VH des HMFG1- und der Konsensus-Sequenz (HuVHIcon) dieses humanen VH der Untergruppe I liegt bei nur 14%. Das resultierende umgestaltete Gen wurde als HuVHIconHMFG1 bezeichnet und ist in der Fig. 12 dargestellt. Die Gen-Synthese wird separat im Abschnitt c) unten beschrieben. Das neu synthetisierte Gen HuVHIconHMFG1 wurde verwendet, um HuVHLYS in dem Konstrukt M13mp9HuVHLYS (Verhoeyen et al. 1988) zu ersetzen, wodurch der Vektor M13mp9HuVHIconHMFG1 erhalten wurde (siehe Fig. 4a).

3. Zusammenbau der Gene des umgestalteten humanen Antikörpers in Expressionsvektoren

Der nächste Schritt beinhaltete die Verwendung eines Enhancers IgEnh der schweren Kette der Maus, der bei Neuberger et al. (1983) beschrieben wurde, wobei der Enhancer in einem XbaI-Fragment von 1 kb des Plasmids pSV-Vpl enthalten ist. Das XbaI/EcoRI- Subfragment von 700 bp dieses XbaI-Fragments von 1 kb reicht aus, um Enhancer-Aktivität zu bewirken.
Eine alternative Quelle für diesen Enhancer stellt das Plasmid pSVneoHuVkPLAP (siehe Fig. 5a) dar, von dem eine Variante in einem E.-coli-Stamm im Rahmen des Budapester Vertrags vorn 19. April 1990 als NCTC 12390 hinterlegt wurde. In der hinterlegten Form enthält das Plasmid auch ein Gen des konstanten Bereichs einer humanen Kappa-Kette (kloniert in die BamH1-Stelle).
Die umgestalteten humanen Gene, wie sie in den Abschnitten 2a) und 2b) oben hergestellt worden waren, wurden aus den M13-Vektoren als HindIII-BamHI-Fragmente herausgeschnitten. Die Gene des variablen Bereichs der schweren Kette wurden in einen auf pSV2gpt (Mulligan et al., 1981) basierenden Vektor kloniert, und die Gene des variablen Bereichs der leichten Kette wurden in einen auf pSV2neo-Expressionsvektoren (Southern et al., 1981) basierenden Vektor kloniert, wobei beide den Enhancer IgEnh der schweren Kette des Immunglobulins enthielten. Bei dem auf pSV2gpt basierenden Antikörper-Expressionsvektor (siehe Fig. 4b - 4c) wurde das Fragment, das den XbaI/EcoRI-Enhancer enthielt, in die nur einmal vorkommende EcoRI-Stelle pSV2gpt-Vektors kloniert (nach der Ligation des EcoRI- Linkers an das aufgefüllte XbaI-Ende des Fragments).
Bei dem auf pSVneo basierenden Antikörper-Expressionsvektor (siehe Fig. 5a-5b) wurde das Fragment, das den XbaI-Enhancer von 1 kb enthielt, zuerst in pUC12 (Vieira et al. 1982) kloniert, wodurch das Plasmid pUC&sub1;&sub2;-lgEnh erhalten wurde, siehe Fig. 6. Der Enhancer kann dann als ein EcoRI/HindIII-Fragment von 700 bp herausgeschnitten werden (beide Orientierungen des Enhancers funktionieren). Dieses EcoRI/HindIII-Fragment von 700 bp kommt im Plasmid pSVneoHuVkPLAP vor, das wir zur Klonierung des HuVkHMFG1-enthaltenden Fragments, das im Abschnitt 2a) beschrieben wurde, siehe Fig. 5a und 5b, verwendeten. Die HindIII-Stelle im ursprünglichen pSV2neo war entfernt worden. Es ist möglich, pSV2gpt als einen alternativen Vektor für die Expression der leichten Kette zu verwenden, da in der Praxis eine Neo-Selektion nicht erforderlich ist.
Das HuVHIconMFG1-Gen wurde mit einem humanen konstanten Gamma-1-Bereich verknüpft (Takahashi et al., 1982), zunächst als ein HindIII-Fragment von 8 kb in die HindIII- Stelle von pBGS18 (Spratt et al., 1986) kloniert und dann als ein BamHI-Fragment in den pSV2gpt-Expressionsvektor (siehe Fig. 4c und 7). Es soll angemerkt werden, dass in der Literaturstelle Takahashi et al. (1982) ein Fehler in der Fig. 1 vorliegt: die letzten beiden Stellen (3') sind BamH1 gefolgt von HindIII, und nicht umgekehrt. Das wurde von Flanagan et al. (1982) bestätigt.
Das HuVkHMFG1-Gen wurde mit dem konstanten humanen C-Kappa-Bereich verknüpft (Hieter et al., 1980), der ebenfalls als ein BamHI-Fragment einkloniert worden war (siehe Fig. 5b und 8). Die Herkunft dieses in der Fig. 8 verwendeten humanen Ck wird bei Hieter et al. (1980) angegeben. Das BamH1-Fragment von 12 kb aus embryonaler DNA (kloniert in ein Gamma-Ch28-Vektorsystem) wurde in die BamH1-Stelle des Plamids pBR322 subkloniert.

4. "De-novo-Synthese" des HuVHIconHMFG1-Gens

Wir beschlossen, ein Gen zu synthetisieren, das für ein Gen eines humanen variablen Bereichs der Subgruppe I (Kabat et al., 1987) codierte, und zwar mit den CDRs von VHHMFG1 (Fig. 1). Zusammengefasst wird das synthetische Gen so konstruiert, dass es das HuVHLYS- Gen im existierenden M13mp9HuVHLYS-Vektor ersetzen kann. M13mp9HuVHLYS wurde so mutiert, dass es eine KpnI- und eine SalI-Stelle an den entsprechenden Orten enthielt (siehe auch Fig. 4a), um das Klonieren des neu synthetisierten Gens als Kpn-SalI-Fragment zu ermöglichen.
Die Gensequenz wurde konstruiert, wie es oben im Abschnitt 2b) beschrieben wurde, und sie ist in der Fig. 12 dargestellt. Um den Ersatz des HuVHLYS-Gens in M13mp9HuVHLYS durch dieses Gen zu erleichtern (Verhoeyen et al., 1988, siehe auch Fig. 4a) wurden 5'- und 3'-Verlängerungen an das Gen angefügt. Die 5'-Verlängerung enthält 37 bp des Leader-Introns und 11 bp der zweiten Hälfte des Leader-Exons (wie bei M13mp9HuVHLYS), und sie weist eine KpnI-Stelle am äußersten 5'-Ende auf. Die 3'-Verlängerung enthält 38 nicht-translatierte Nukleotide (wie bei M13mp9HuVHLYS) und endet mit einer SalI-Stelle.
M13mp9HuVHLYS wurde durch ortsspezifische Mutagenese mit den Oligonukleotiden III und IV so modifiziert, dass es eine KpnI- und eine SalI-Stelle an den geeigneten Orten enthielt (siehe Fig. 4a und Fig. 10). Dieser Vektor wurde als M13mp9HuVHLYS(K,S) bezeichnet. Das ermöglichte das Klonieren des HuVHIconHMFG1-Gens als KpnI-SalI-Fragment in den mit KpnI-SalI geschnittenen M12mp9HuVHLYS(K,S)-Vektor.
Aus praktischen Gründen wurde beschlossen, das Gen aus drei Fragmenten (Kassetten) zu synthetisieren, die dann zu einem kompletten Gen zusammengefügt wurden.
Jedes Fragment enthält eine der drei VHHMFG1-CDRs und kann leicht durch Verwendung der (existierenden oder neu eingeführten) nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen kloniert oder entfernt werden (siehe Fig. 3a). Jedes Fragment wurde am 5'- und am 3'-Ende verlängert, um eine HindIII- bzw. BamHI-Stelle zu erzeugen und das Klonieren in pEMBL9 (Dente et al., 1993) zu ermöglichen. Der codierende Strang jedes Fragments wurde in Oligonukleotide mit einer Durchschnittslänge von 33 Basen aufgeteilt. Das gleiche wurde mit dem nicht-codierenden Strang durchgeführt, und zwar so, dass die Oligonukleotide um ungefähr 50% mit denjenigen des codierenden Stranges überlappten.
Die Sequenzen aller Fragmente und der für den Zusammenbau verwendeten Oligonukleotide sind in den Fig. 3b, 3c und 3d gezeigt.
Vor dem Zusammenbau der Fragmente mussten die 5'-Enden der synthetischen Oligonukleotide phosphoryliert werden, um die Ligation zu ermöglichen. Die Phosphorylierung wurde wie folgt durchgeführt: äquimolare Mengen (50 umol) der Oligonukleotide wurden gepoolt und in 40 ul Reaktionspuffer mit 8 Einheiten Polynukleotidkinase 30-45 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 70ºC für 5 Minuten und Fällen mit Ethanol gestoppt. Das Annealing erfolgte durch Auflösen des Pellets in 30 ul eines Puffers, der 7 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt und dem 5 mM ATP zugesetzt wurde. Anschließend wurde die Mischung 5 Minuten lang in ein Wasserbad von 65ºC gegeben, wonach innerhalb einer Stunde auf 30ºC abgekühlt wurde. Es wurde MgCl&sub2; bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt. Es wurde T4-DNA-Ligase (2,5 Einheiten) zugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang auf 37ºC gebracht (oder über Nacht auf 16ºC). Danach wurde die Reaktionsmischung 10 Minuten lang auf 70ºC erhitzt. Nach der Ethanol-Fällung wurde das Pellet in Verdaupuffer gelöst und mit HindIII und BamHI geschnitten. Diese Mischung wurde auf einem 2%igen Agarose-Gel aufgetrennt, und das Fragment mit einer Länge, die der korrekt zusammengesetzten Kassette entsprach, wurde durch Elektroelution isoliert.
Die Fragmente (1, 2, 3) wurden in pEMBL9 ligiert (geschnitten mit HindIII/BamHI), wodurch die Vektoren pUR4107, pUR4108 bzw. pUR4109 erhalten wurden. Die Sequenz der Inserts wurde durch eine Sequenzanalyse überprüft (in beiden Orientierungen). Das Fragment 1 wurde aus pUR4107 durch einen Verdau mit KpnI/XhoI isoliert, während das Fragment 2 aus pUR4108 durch einen Verdau mit XhoI/SacI isoliert wurde, und anschließend wurden sie mit einer Drei-Fragment-Ligation in das mit KpnI/SacI geschnittene pUR4109 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pUR4110 genannt (siehe Fig. 4a). Die Sequenzanalyse zeigte, dass das Insert das gewünschte HuVHIconHMFG1-Gen enthielt. Dieses Gen wurde in einen von pSV2gpt abstammenden Expressionsvektor kloniert, wie es in den Fig. 4b und 4c dargestellt ist. Der Vektor pSVgptMoVHLYS-MolgG1 (Verhoeyen et al., 1988) wurde als die Quelle des auf pSVgpt basierenden Vektors verwendet, der den IgEnh-Enhancer enthielt.

5. Expression in Myelomzellen

Die Co-Transfektion der Expressionsplasmide pSVgptHuVHIconHMFG1-HulgG1 und pSVneoHuVkHMFG1-HuCk (Fig. 4c und 5b) in NSO-Myelomzellen erfolgte durch Elektroporation (Potter et al., 1984) nach einer Linearisierung mit Pvul. Transfektome wurden mit Medium, das Mycophenolsäure enthielt, selektiert, um Zellen zu selektieren, die das gpt- Genprodukt exprimierten, und mittels ELISA-Assays bezüglich einer Antikörperproduktion und einer Anti-HMFG-Aktivität gescreent.
Es wurden Klone, die in beiden Tests positiv waren, erhalten und durch limitierende Verdünnung subkloniert, und reine Klone wurden erneut bezüglich einer Anti-HMFG-Aktivität getestet, und die besten produzierenden Klone wurden in serumfreiem Medium für eine Antikörperherstellung gezüchtet.

6. Hinterlegte Plasmide

E.-coli-Stämme, die die Plasmide enthalten, die in den oben genannten Verfahren verwendet wurden, wurden gemäß den Abmachungen des Budapester Vertrags in der National Collection of Type Cultures am 11. Juli 1990 wie folgt hinterlegt:
NCTC 12411: K12, TG1 E. coli mit dem Plasmid pSVgptHuVHIconHMFG1-HulgG1 (für die Hinterlegung einfach bezeichnet als pSVgpt-HuVHHMFG1-HulgG1)
NCTC 12412: K12, TG1 E. coli mit dem Plasmid pSVneo-HuVkHMFG1-HuCk

7. Bindungsfähigkeit der umgestalteten humanen Antiköper

Eine nützliche Art des Nachweises der Bindungsfähigkeit eines umgestalteten Antikörpers besteht darin, zu zeigen, dass er eine ähnliche Antikörper-Verdünnungskurve liefert, wenn er an ein Antigen bindet, das an eine feste Fläche adsorbiert ist. Derartige Kurven wurden wie folgt unter Verwendung des ursprünglichen HMFG-Antikörpers der Maus und eines umgestalteten humanen Antikörpers, der mittels der oben beschriebenen Prozedur hergestellt worden war, erzeugt.
0,5 ml M280-Tosyl-aktivierter magnetischer Kügelchen (10% (G/V)) (Dynal, Wirral, GB) wurden an Milchmucin gekoppelt (106 Einheiten, wie in einem Immunoassay für HMFG1 bestimmt wurde, bei dem normales menschliches Serum ungefähr 100-200 Einheiten pro ml beiträgt). Das Milchmucin wurde aus menschlicher Frauenmilch gemäß dem Verfahren von Burchell et al. (1987) gewonnen. Die Menge des Mucins wurde so gewählt, dass eine geeignete Aktivität für die Tests, in denen die Kügelchen verwendet wurden, bereit gestellt wurde. Die Kopplung erfolgte in 2,5 ml 0,5 M Borat-Puffer, pH 9,5, plus 2,5 ml Mucin in Phosphatgepufferter Saline (PBS), pH 7,2, und zwar 22 Stunden lang bei 37ºC und leichtem Rotieren. Das Blocken der verbleibenden aktiven Stellen erfolgte durch den Zusatz von 1 ml 10%igen Rinderserumalbumins (BSA; Sigma) in PBSA (PBS + 0,02% Natriumazid), gefolgt von einer weiteren 7-stündigen Inkubation bei 37ºC. Das überschüssige Protein wurde nach der Verwendung eines Samarium-Kobalt-Magneten für das Absetzen der Kügelchen durch Waschen entfernt. Weitere Waschungen wurden dreimal in Waschpuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 8,0, 0,1% Tween 20, 0,5% BSA) und viermal in Spülpuffer (PBS + 0,1% BSA, 0,1% Merthiolat) durchgeführt. Die Kügelchen wurden in Spülpuffer in einer Konzentration von 10% (G/V) (bestimmt durch Analyse des Trockengewichts) aufbewahrt.
Die Antikörperbindung wurde aus einer Reihe von sich jeweils verdoppelnden Verdünnungen von Antikörperproben (die in kritischen Fällen durch Einwiegen hergestellt wurden) gemessen. Proben von 50 ul wurden als Mehrfach-Ansätze in Mikrotiter-Wells mit 50 ul einer 0,05%igen (G/V) Suspension der Kügelchen in 1% BSA/PBSM (PBS + 0,01% Merthiloat) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert. Es wurden kleine, in Kunststoff eingebettete Kobalt-Samarium-Magnete verwendet, um die Kügelchen an den Seitenwänden der Wells der Platte niederzuschlagen und so ein Entfernen der Flüssigkeit und eine einmalige Waschung mit 150 ul PBSTM (PBSM + 0,15% Tween 20) zu ermöglichen. Daran schloss sich der Nachweis des gebundenen Antikörpers mit 50 ul alkalischer Phosphatase, die an Ziege-Anti-Mensch-IgG (H + L) (Jackson) gekoppelt war und in einer Verdünnung von 1/1000 in 1% BSA in PBSTM eingesetzt wurde, nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur an. Die Kügelchen wurden dreimal in PBSTM gewaschen. Die Farbentwicklung erfolgte mit 200 ul Nitrophenylphosphat (Substrattabletten für die alkalische Phosphatase, Sigma) in 1 M Diethanolamin-Puffer bei pH 9,8. Die Extinktionen wurden mit einem Plattenlesegerät von Dynatech bei 410 nm bestimmt, nachdem definierte Volumina des Überstands (üblicherweise 150 ul) auf eine Mikrotiterplatte mit Wells mit flachem Boden übertragen worden waren. Bei der Untersuchung von Maus-Antikörpern war das verwendete Konjugat Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Sigma).
Antikörper-Verdünnungskurven für den Maus-Antikörper und den umgestalteten HMFG1-Antikörper sind in der Fig. 15 gezeigt. Die maximale Bindung wurde bei einem großen Überschuss des Antikörpers bestimmt, in den Negativkontrollen war keiner enthalten. Die Antikörperkonzentrationen, in ug/ml, wurden über die Messung der UV-Extinktion bei 280 nm bestimmt. Für beide Antikörper wurde eine Verdünnung von 1 als äquivalent zu 1 ug/ml eingestellt. Die beiden Kurven sind ähnlich, was anzeigt, dass der umgestaltete erfindungsgemäße Antikörper eine signifikante und nützliche Bindungsaktivität zeigt.

Literaturstellen:

Arklie et al. (1981) - Int. J. Cancer, 28, S. 23-29
Burchell et al. (1987) - Cancer Res., 47, S. 5476
Dente et al. (1983) - Nucleic Acids Res. II, S. 1645-1655
Epp et al. (1974) - Eur. J. Biochem., 45, S. 513-524
Flanagan et al. (1982) - Nature, 300, S. 709-713
Gendler et al. (1988) - J. Biol. Chem., 236, S. 12820-12823
Gibson T (1984) - Doktorarbeit, LMB-MRC Cambridge
Gubler et al. (1983) - Gene, 25, S. 263-269
Hale et al. (1988) - Lancet, 2, S. 1394
Hieter et al. (1980) - Cell, 22, S. 197-207
Jones et al. (1986) - Nature, 321, S. 522-525
Kabat et al. (1987) - in Sequences of Proteins of Immunological Interest, S. ix - US Dept. of Health and Human Services
Mulligan et al. (1981)- Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, S. 2072-2076
Neuberger et al. (1983) - EMBO Journal, 2, S. 1373-1378
Norrander et al. (1983) - Gene, 26, S. 101-106
Potter et al. (1984) - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, S. 7161-7163
Riechmann et al. (1988) - Nature, 332, S. 323-327
Sambrook et al. (1989) - Molecular Clonina, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York
Sanger et al. (1977) - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, S. 5463-5467
Saul et al. (1978) - J. Biol. Chem., 253, S. 585-597
Southern et al. (1981)- J. Molec. Appl. Genetics, 1, S. 327-345
Spratt et al. (1986) - Gene, 41, S. 337-342
Takahashi et al. (1982) - Cell, 29, S. 671-679
Taylor-Papadimitriou et al. (1981) - Int. J. Cancer, 28, S. 17-21
Verhoeyen et al. (1988) - Science, 239, S. 1534-1536
Vieira et al. (1982) - Gene, 19, S. 259-268
Winter (1987) - EP-A-239400
Xing et al. (1990) - EP-A2-369816

Claims

1. Umgestalteter humaner Antikörper, oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment mit einer Spezifität für humanes polymorphes Epithelmucin (PEM), wobei der umgestaltete humane Antikörper oder das umgestaltete humane Antikörperfragment wenigstens einen variablen Bereich der schweren Kette aufweist, der die folgenden CDRs beinhaltet:

CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu

CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr

und wenigstens ein variabler Bereich der leichten Kette die folgenden CDRs beinhaltet:

CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Ala

CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

CDR3: Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr.

2. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach Anspruch 1, wobei der genannte umgestaltete Antikörper oder das umgestaltete humane Antikörperfragment ein einzelkettiger Antikörper ist.

3. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach Anspruch 1, die wenigstens einen variablen Bereich der schweren Kette beinhalten, der die gesamte Aminosäuresequenz umfaßt, die in Fig. 12 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

4. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach Anspruch 1, die wenigstens einen variablen Bereich der leichten Kette beinhalten, der die gesamte Aminosäuresequenz umfaßt, die in Fig. 13 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

5. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das PEM das humane Milchfettkügelchen (HMFG) ist.

6. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach Anspruch 1 mit einer Spezifität, die der des monoclonalen gamma- 1, kappa-anti-HMFG-Antikörpers "HMFG1" äquivalent ist.

7. Stabile Wirtszellinie, die einen umgestalteten normalen Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 erzeugt, die das Ergebnis der Aufnahme eines Fremdgens in die Zellinie ist, das für den umgestalteten humanen Antikörper oder das umgestalteten humane Antikörperfragment codiert.

8. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, bei dem das Fremdgen die Nucleotidsequenzen einschließt:

i) GCC TAC TCC ATA GAC

ii) GAG ATT TTA CCT GGA AGT AAT AAT TCT AGA TAC AAT GAG AAG TTG AAG GGC

iii) TCC TAC GAC ITT GCC TGG ITT GCT TAC

iv) AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT AGT AGC AAT cm AAG ATC TAC TTG GCC

v) TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT

vi) CAG CAA TAT TAT AGA TAT CCT CGG ACG

9. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, wobei das Fremdgen die gesamte Nucleotidsequenz enthält, die in Fig. 12 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

10. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, bei der das Fremdgen die gesamte Nucleotidsequenz enthält, die in Fig. 13 der beigefügten Zeichnungen gezeigt ist.

11. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, wobei das Fremdgen codiert für:

a) die Aminosäuresequenz:

i) Ala Tyr Trp Ile Glu

ii) Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

iii) Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr

iv) Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Ala

v) Trp Ala Ser thr Arg Glu Ser

vi) Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr sowie b) eine Proteinumgebung, die es den codierten Aminosäuresequenzen nach ihrer Exression ermöglicht, als CDRs mit einer Spezifität für PEM zu fungieren.

12. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, bei dem das Fremdgen für die gesamte Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 12 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

13. Stabile Wirtszellinie nach Anspruch 7, bei der das Fremdgen für die gesamte Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 13 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

14. Plasmid pSVgpt-HuVHHMFG1-HulgG1, enthalten in E.coli NCTL 12411.

15. Plasmid pSVneo-HuVkHMFG1-HuCk, enthalten in E.coli NCTL 12412.

16. Verwendung eines Plasmids nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 bei der Herstellung eines umgestalteten humanen Antikörpers oder umgestalteten humanen Antikörperfragments.

17. E. coli NCTC 12411.

18. E. coli NCTC 12412.

19. DNA-Sequenz, die für den variablen Bereich der schweren Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers codiert, der eine Spezifität für HMFG aufweist, wie sie in E. coli NCTC 12411 enthalten ist.

20. DNA-Sequenz, die für den variablen Bereich der leichten Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers codiert, der eine Spezifität für HMFG aufweist, wie sie in E. coli NCTC 12412 enthalten ist.

21. Variabler Bereich der schweren Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers, der eine Spezifität für HMFG aufweist, herstellbar mit Hilfe des Expressionsvektors, der in E. coli NCTC 12411 enthalten ist.

22. Variabler Bereich der leichten Kette eines umgestalteten humanen Antikörpers, der eine Spezifität für HMFG aufweist, herstellbar mit Hilfe des Expressionsvektors, der in E. coli NCTC 12412 enthalten ist.

23. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment, die wenigstens einen variablen Bereich nach Anspruch 21 oder 22 aufweisen.

24. Umgestalteter humaner Antikörper oder umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach irgendwelchen der Ansprüche 1 bis 6 oder Anspruch 23, die mit einem Mittel verknüpft sind oder ein Mittel enthalten, das in der Lage ist, das Wachstum von Krebszellen zu verzögern oder zu beenden, oder die mit einem Mittel verknüpft sind, das in der Lage ist, nachgewiesen zu werden, wenn es sich im menschlichen Körper befindet.

25. Injizierbare Zusammensetzung, die einen umgestalteten humanen Antikörper oder ein umgestaltetes humanes Antikörperfragment nach Anspruch 24 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

26. Verwendung eines umgestalteten humanen Antikörpers oder eines umgestalteten humanen Antikörperfragments nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 oder Anspruch 23 oder Anspruch 24 für die Herstellung eines Medikaments für eine therapeutische Anwendung für die Linderung von Krebs bei Menschen, oder für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für diagnostische in-vivo- Verwendungen in Menschen.

27. Verwendung eines umgestalteten humanen Antikörpers oder umgestalteten humanen Antikörperfragments nach Anspruch 24 in einem in-vitro-Verfahren der Bilddarstellung von humanem Krebs.