DE69131942T2

DE69131942T2 - Auswahl von effizient ziel-rns spaltenden ribozymen

Info

Publication number: DE69131942T2
Application number: DE69131942T
Authority: DE
Inventors: A. Drlica; David Dubnau; Russell Kramer; Abraham Pinter
Original assignee: Public Health Research Institute of City of New York Inc
Current assignee: Medicine And Dentistry Of Ne Us, University of
Priority date: 1990-07-16
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 2000-06-29
Anticipated expiration: 2011-07-17
Also published as: WO1992001806A1; AU651380B2; ATE189263T1; EP0600877A4; CA2087519C; EP0600877A1; DE69131942D1; US5616459A; AU8517591A; EP0600877B1; CA2087519A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Screenen von Ribozymen, um zu bestimmen, welche beim Spalten einer Ziel-Ribonucleinsäure am wirksamsten sind. Die Erfindung betrifft auch die Erzeugung verschiedener Ribozymmutanten zum Screenen.

Hintergrund der Erfindung

Bestimmte natürlich auftretende RNA-Moleküle sind selbstkatalysierter Spaltung unterworfen (Kruger et al., 1982). Die am besten untersuchten Beispiele treten in Pflanzen auf, die mit Viroiden (Hutchins et al., 1986), Virusoiden (Forster & Symons, 1987a) oder Satellitenviren (Prody et al., 1986) infiziert werden. Die genomischen RNAs dieser infektiösen Mittel werden durch einen rolling circle- Mechanismus reproduziert, bei dem multimere Replikationsintermediate erhalten werden, die unter Bildung monomerer Genome einer Selbstspaltung unterworfen sind. Die Fähigkeit zur Selbstspaltung wird durch distale Konsensusseguenzen verliehen, die wechselwirken, wobei eine hochstrukturierte RNA-Konfiguration (in der Form eines "Hammerkopfes") vor der Spaltung gebildet wird (Forster & Symons, 1987a, Forster & Symons, 1987b). Obwohl die Selbstspaltung ausschließlich intramolekular verläuft, führte eine sorgfältige Analyse der beteiligten Sequenzen und Strukturen Uhlenbeck zu der Erkenntnis, daß synthetische RNA konstruiert werden könnte, die mit einer zweiten RNA (dem "Substrat"-Strang) unter Bildung einer Hammerkopf-Konfiguration wechselwirkt, was zu der Spaltung des Substrats an einer spezifischen Stelle führt (Uhlenbeck, 1987). Er zeigte, daß diese synthetischen RNAs enzymatisch wirken.
Uhlenbecks Experimente haben die Aussicht eröffnet, daß RNA-Enzyme ("Ribozyme") konstruiert werden könnten, die eine vorher ausgewählte Sequenz in einer beliebigen RNA spalten. In seinem Schema wurden jedoch einige der Konsensussequenzen, die zur Bildung der aktiven Hammerkopf-Konfiguration erforderlich waren, durch den Substrat-Strang bereitgestellt, was die Anzahl der natürlichen RNAs, die als Substrate wirken könne, stark einschränkt. Haseloff und Gerlach verbesserten Uhlenbecks Entwurf durch Einbeziehung aller erforderlichen Konsensussequenzen in das Ribozym deutlich (Haseloff & Gerlach 1988). Ihr Ribozym arbeitet dadurch, daß es zuerst an eine bestimmte Stelle in der Substrat-RNA hybridisiert und dann die Spaltung des Substrats an dieser Stelle katalysiert. Sie berichten, daß Stellen, die das Trinucleotid GUC und vielleicht GUU oder GUA enthalten, gespalten werden, mit der Maßgabe, daß die Strukturen, die in der Substrat-RNA vorhanden sind, die Bindung des Ribozyms an diese Stelle nicht verhindern. Fig. 1A zeigt ein typisches Haseloff- Gerlach-Ribozym, das an einen Substrat-Strang hybridisiert ist. Der Pfeil gibt die Stelle in dem Substrat an, an der die Spaltung auftritt. Diese Stelle ist der GUC-Sequenz unmittelbar benachbart.
Haseloff-Gerlach-Ribozyme besitzen zwei unterschiedliche funktionelle Regionen. Die erste funktionelle Region ist eine "katalytische Domäne" in der Mitte des Ribozyms (Fig. 1B), welche die Konsensussequenzen enthält, die die Fähigkeit zur Substratspaltung verleihen. Die katalytische Domäne in dem gezeigten Beispiel ist 22 Nucleotide lang. Diese Region ist den Haseloff-Gerlach-Ribozymen gemein. Die zweite funktionelle Region besteht aus Sequenzen auf beiden Seiten der katalytischen Domäne. Diese Sequenzen sind so ausgewählt, daß sie zu den Sequenzen, welche die Spaltungsstelle in dem Substrat umgeben, komplementär sind (Fig. 1C). Sie verleihen dem Ribozym die Fähigkeit, spezifisch mit einer vorher ausgewählten Spaltungsstelle zu wechselwirken. Weil die kombinierte Länge dieser komplementären Sequenzen typischerweise zwischen 12 und 16 Nucleotiden ist, sind die Haseloff-Gerlach-Ribozyme hochspezifisch.
Experimente, welche die Aktivität der Haseloff-Gerlach- Ribozyme in vivo untersuchten, waren enttäuschend. Die Expression von Ziel-Genprodukten wurde nicht ausgeschaltet, sondern nur vermindert (Cameron & Jennings, 1989), und extrem hohe Ribozymkonzentrationen waren erforderlich, um die betreffende Substrat-RNA zu zerstören (Cotten et al., 1989). Des weiteren zeigten unsere eigenen in vitro-Studien, daß die optimalen Bedingungen für die Ribozymaktivität (60ºC in Anwesenheit von 40 mM Magnesiumchlorid) sich von den Bedingungen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden sind, deutlich unterscheiden. Natürlich vorkommende Hammerkopf-Konfigurationen sind nur optimal für die Spaltung innerhalb derselben RNA (Spaltung in cis). Überdies könnte in Pflanzenzellen (in denen die Hammerköpfe üblicherweise wirken) die Spaltung durch Helferproteine unterstützt werden. Die Haseloff-Gerlach-Ribozyme werden andererseits konstruiert, um eine andere RNA (Spaltung in trans) ohne die Unterstützung zellulärer Proteine zu spalten. Des weiteren könnten die Haseloff-Gerlach-Ribozyme gegen zelluläre Nucleasen besonders empfindlich sein. Es überrascht deshalb nicht, daß künstliche Ribozyme in vivo nicht optimal wirken. Die Verwendung therapeutischer Ribozyme hängt von ihrer Fähigkeit ab, in einem komplexen zellulären Milieu effizient zu funktionieren (Sarver et al., 1990). Aus unserer Arbeit und der Arbeit anderer Laboratorien geht deshalb hervor, daß die Effizienz der Ribozyme, die derzeit konstruiert werden, seien es Haseloff-Gerlach-Ribozyme oder andere, zu gering ist, als daß diese Ribozyme als kommerziell wirksame therapeutische Mittel dienen könnten. Ein Zweck der hierin beschriebenen Erfindung ist es, Ribozyme zu entwerfen und zu screenen, die Ziel-RNA effizient spalten.
Durch die Verwendung von Zellen, deren Überleben in Anwesenheit eines Mittels von der Aktivität eines exprimierten Ribozyms abhängt, haben wir ein Verfahren zum Selektieren von Ribozymmutanten erfunden, daß unter physiologischen Bedingungen effizient funktioniert. Unser Verfahren zum Screenen von Ribozymen umfaßt das Kultivieren von Zellen, deren Überleben von der Spaltung von RNA durch ein Ribozym aus RNA abhängt, wobei die Spaltung bewirkt, daß die Zellen überleben, und das Selektieren derjenigen Zellen, die überleben.
Ribozyme, die durch das hierin beschriebene Screening- Verfahren erhalten werden, können eingesetzt werden, um in vivo selektiv RNA zu zerstören, wie solche, die für menschliche-Immuninsuffizienz-Virus-(HIV)-Proteine kodieren.
Hierin wird auch ein Verfahren zur Erzeugung verschiedener Oligonucleotide zum Screenen beschrieben, bei denen Gemische von Nucleotidvorläufern in einem DNA- Synthetisiergerät eingesetzt werden.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen von Ribozymen auf ihre Wirksamkeit zum Spalten von RNA bereitgestellt, welches umfaßt:
(a) Herstellen mehrerer Vektoren, die für Ribozyme mit unterschiedlichen Sequenzen kodieren, wobei die Ribozyme auf ihre Wirksamkeit zum Spalten von RNA, die eine Ziel-RNA- Sequenz enthält, gescreent werden solen;
(b) Bereitstellen von Zellen, welche die Ziel-RNA-Sequenz enthaltende RNA enthalten und die, wenn die RNA durch eines der Ribozyme in ausreichender Menge gespalten wird, in einem vorher ausgewählten Kulturmedium überleben;
(c) Ausstatten der Zellen mit den Vektoren;
(d) Kultivieren der Zellen in dem vorher ausgewählten Kulturmedium unter Bedingungen, bei denen die Ribozyme exprimiert werden; und
(e) Selektieren der überlebenden Zellen.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung nur durch ein Beispiel unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen eingehender beschrieben.

Fig. 1: Ribozymstruktur

(A) Haseloff-Gerlach-Ribozym, das an sein Substrat gebunden ist. Die 36 Nucleotide lange RNA, die oben gezeigt ist, ist das Ribozym. Die untere RNA ist der Substrat-Strang. Wenn das Ribozym an das Substrat hyridisiert ist und mit Magnesiumionen inkubiert wird, katalysiert es die Spaltung des Substrats an der durch den Pfeil angegebenen Stelle.
(B) Katalytische Domäne eines Haseloff-Gerlach-Ribozyms. Unveränderliche Sequenzen (die in dem umrahmten Bereich enthalten sind) sind für die Spaltung des Substrat-Stranges erforderlich.
(C) Komplementäre Sequenzen eines Haseloff-Gerlach-Ribozyms. Diese variablen Sequenzen (als umrahmte Bereiche gezeigt) werden dahingehend ausgewählt, daß sie zu einer vorher ausgewählten Sequenz in dem Substrat-Strang komplementär sind.
Fig. 2: Vorhergesagte Sekundärstruktur der ermC-Leader- Sequenz. Zwei potentielle Ribosomen-Bindungsstellen sind vorhanden (als umrahmte Sequenzen gezeigt). Jede besitzt ein AUG-Initiationscodon. Das UAA-Codon, das den ersten offenen Leserahmen terminiert, ist in fetten Buchstaben gezeigt. Der zweite offene Leserahmen, der für die Methylase kodiert, die für die Resistenz gegen MLS-Antibiotika verantwortlich ist, kann nicht translatiert werden, weil ihr AUG-Initiationscodon in einem doppelsträngigen Bereich vorliegt, wo es für Ribosomen nicht zugänglich ist.
Fig. 3: Strukturelle Umorganisation der ermC-Leader- Sequenz.
(A) Umorganisation durch Erythromycin-Induktion. Die linke Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung der Sekundärstruktur, die durch den ermC-Leader gebildet wird. Die zwei Ribosomen-Bindungsstellen sind durch fette Linien angegeben. Das Methylasegen kann nicht translatiert werden, weil seine Ribosomen-Bindungsstelle innerhalb der durch die Bereiche c und d gebildeten Struktur abgesondert wird. Die rechte Zeichnung zeigt ein Ribosom (an das Erythromycin gebunden ist), das im Bereich a festhängt, was zur Freilegung des Bereichs b führt. Da die alternative Struktur, die durch die Regionen b und c gebildet werden könnte, stabiler ist als die Struktur, die durch die Regionen c und d gebildet wird, kommt es zu einer strukturellen Umorganisation, welche die Region d freilegt, wodurch die Ribosomen-Bindungsstelle für die Synthese von Methylase freigelegt wird.
(B) Umorganisation durch die Ribozymspaltung.
Die linke Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung des ermc-Leaders, an den ein Ribozym über die Haarnadelschleife der Struktur gebunden ist, die durch die Regionen a und b gebildet wird. Die Spaltung dieser Haarnadelschleife durch das Ribozym verkürzt die Leader-Sequenz und führt zur Freilegung des Bereichs b. Da die alternative Struktur, die durch die Bereiche b und c gebildet werden könnte, stabiler ist als die Struktur, die durch die Bereiche c und d gebildet wird, kommt es zu einer strukturellen Umorganisation, welche den Bereich d freilegt, wodurch die Robosomen-Bindungsstelle für die Synthese von Methylase freigelegt wird.
Fig. 4: Vorhergesagte Sekundärstruktur der verkürzten ermC-Leader-Sequenz. Die Ribosomen-Bindungsstelle für die Synthese von Methylase (als umrahmte Sequenz gezeigt) ist in einer einzelsträngigen Konformation, die für Ribosomen zugänglich ist.
Fig. 5: Spezifische Spaltung einer RNA durch ein Ribozym. Ein äquimolares Gemisch von MDV-1 RNA und rekombinanter RNA wurde mit einem 10fachen molaren Überschuß eines Ribozyms gemischt, das konstruiert worden ist, um die MDV-1-RNA zu spalten. Die rekombinante RNA war eine modfizierte MDV-1-RNA, in der in die Ribosomen-Bindungsstelle eine zusätzliche Sequenz eingebaut worden war. Dieses Gemisch wurde bei 50ºC in Anwesenheit von 20 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Tris-HCl (pH 8) inkubiert. In 10-minütigen Abständen wurden Proben genommen und durch Elektrophorese durch ein 8 %iges Polyacrylamidgel analysiert, das 7 M Harnstoff enthielt. Die Ribozymmenge und die Menge der rekombinanten RNA blieben im gesamten Verlauf der Reaktion gleich. Das Verschwinden der MDV-1-RNA wurde durch das Auftreten von MDV- 1-RNA-Fragmenten von erwarteter Größe begleitet.
Fig. 6: Spaltung von HIV-1-RNA in vitro.
(A) Die Ziel-RNA wurde mit Ribozymen bei 50ºC inkubiert, dann durch Elektrophorese analysiert und durch Hybridisierung mit einer Sonde für das HIV-1-Integrasegen sichtbar gemacht. Spur 1: Kein Ribozym, 60 Minuten. Spur 2: Ribozym α, 30 Minuten. Spur 3: Ribozym α, 60 Minuten. Spur 4: Ribozym β (in vitro synthetisiert), 30 Minuten. Spur 5: Ribozym β (in vitro synthetisiert), 60 Minuten. Spur 6: Ribozym β (in vivo synthetisiert), 30 Minuten. Spur 7: Ribozym β (in vivo synthetisiert), 60 Minuten. Spur 8: mutiertes Ribozym β, bei dem die katalytische Domäne entfernt wurde (in vivo synthetisiert), 60 Minuten. Spur 9, 10 und 11: Wiederholung der Reaktionen, die in den Spuren 2, 4 bzw. 6 analysiert wurden, außer daß die Inkubation bei 37ºC durchgeführt wurde.
(B) Analyse der Inkubationsprodukte durch Hybridisierung mit einer Sonde für das E. coli-trpE-Gen.
Fig. 7: Spaltung von HIV-1-RNA in vivo.
Vier unterschiedliche E. coli-Stämme wurden induziert, um ein Transkript zu synthetisieren, daß eine HIV-1-Zielsequenz enthielt, und um gleichzeitig ein zweites Transkript zu synthetisieren, um zu untersuchen, ob das zweite Transkript die Spaltung der Zielsequenz katalysieren kann. Zu unterschiedlichen Zeiten nach der Inkubation wurde die RNA in den Zellen isoliert und durch northern-blotting analysiert, um zu untersuchen, ob die HIV-1-Zielsequenz vorhanden war, und wenn ja, zu untersuchen, ob sie intakt war.
Die eingesetzten Stämme und die Zeit der Induktion sind über jeder Spur des Gels angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß wenn ein intaktes Ribozym in dem zweiten Transkript vorhanden ist, die HIV-1-RNA vollständig zerstört wird.
Fig. 8: Transkript, das ein Haseloff-Gerlach-Ribozym enthält, das an einen modifizierten ermC-Leader gebunden ist. Das 5'-Ende des Transkripts enthält eine Sekundärstruktur, die durch die "Palindrom"-Elemente des E. coli-lac-Operators gebildet wird. Das 3'-Ende des Transkripts enthält eine Sekundärstruktur, die für einen rho-unabhängigen Transkriptionsterminator kennzeichnend ist. Das Ribozym ist entworfen, um die Spaltung des ermC-Leaders (in fetten Buchstaben gezeigt) an der durch den Pfeil angegebenen Stelle zu katalysieren.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens werden Ribozyme durch Kultivieren von Zellen gescreent, deren Überleben von der Spaltung von RNA durch ein Ribozym in den Zellen abhängt. Die Spaltung durch das Ribozym ermöglicht den Zellen zu überleben. Die überlebenden Zellen werden selektiert und enthalten die wirksamsten Ribozyme. Die erhaltenen Ribozyme sind wirksamer als diejenigen des Standes der Technik. Sie können beispielsweise eingesetzt werden, um die virale Replikation in Zellen durch die Spaltung der RNA zu verhindern, die für die Bildung der Virus-Strukturproteine erforderlich ist.
Dieses Screening-Verfahren kann eingesetzt werden, wenn das zu screenende Ribozym jeglichen Typ von RNA spaltet, die, wenn sie gespalten ist, der Zelle ermöglicht zu überleben. In einer Ausführungsform ist die RNA eine Messenger-RNA, die für ein Polypeptid kodiert, das, wenn es exprimiert wird, bewirkt, daß die Zellen in den für die Kultivierung der Zellen verwendeten Medien überleben. Die Spaltung durch das Ribozym kann beispielsweise die Translation des Polypeptids durch Veränderung der Sekundärstruktur der Messenger-RNA ermöglichen. Die Veränderung der Sekundärstruktur kann ein Ribosomen-Bindungsstelle freilegen, was die nachfolgende Translation ermöglicht.
In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zum Screenen von Ribozymmutanten des Haseloff- Gerlach-Typs eingesetzt. In dieser Ausführungsform werden Zellen kultiviert, deren Überleben von der Spaltung an einer Sequenz, die in eine Haarnadelschleife des ermc-Leaders in der ermC-Messenger-RNA eingebaut ist, durch die Ribozyme abhängt. Die Spaltung verursacht eine Veränderung in der Struktur der ermC-Messenger-RNA und legt eine Ribosomen- Bindungsstelle frei, welche die Synthese von Methylase ermöglicht, wodurch das Überleben der Zelle in Medien ermöglicht wird, die ein MLS-Antibiotikum enthalten. Die überlebenden Zellen werden selektiert.
Das Screening-Verfahren kann auch die Bildung einer Bibliothek von Ribozymklonen durch Erzeugen einer großen Anzahl von Vektoren, welche für Ribozyme mit unterschiedlichen Sequenzen kodieren, die gescreent werden sollen, und durch Transformieren von Zellen mit den Vektoren umfassen. Eine Strategie zur Konstruktion einer Bibliothek von Ribozymmutanten, die wahrscheinlich wirksam ist, wird hierin beschrieben.
Wie vorstehend beschrieben, kann die katalytische Domäne eines wirksameren Ribozyms, das unter Verwendung des hierin beschriebenen Screening-Verfahrens erhalten werden soll, mit der Sequenz in dem Haseloff-Gerlach-Design verwandt sein. Die Anzahl der möglichen zu testenden Sequenzen wird enorm, wenn multiple Nucleotidsubstitutionen beabsichtigt sind. Eine umfangreiche Ribozymbibliothek kann jedoch synthetisiert werden, wobei jedes Ribozym eine unterschiedliche Sequenz in seiner katalytischen Domäne besitzt, jedoch alle Ribozyme die gleiche komplementäre Sequenz in den flankierenden Segmenten besitzen. Das Verfahren zur Herstellung dieser Bibliothek wird dadurch ermöglicht, daß künstliche Ribozyme vom synthetischen DNA-Matrizen transkribiert werden können. Während der Synthese der Matrix-DNA für die Ribozyme können die Nucleotid-Substitutionen bei einer relativ geringen. Häufigkeit statistisch in diejenigen Positionen in der Sequenz eingebaut werden, welche die katalytische Domäne des Ribozyms spezifizieren. Die von diesen DNA-Matrizen transkribierten RNAs bestehen aus einer vielfältigen Sammlung von Ribozymmutanten.
Um die wirksamsten Ribozyme in diesem Gemisch zu identifizieren, kann eine Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle oder eine eukaryotische Zelle, wie Hefe, transformiert und dazu gebracht werden, das Ribozym zu exprimieren. Das Überleben der Zelle wird von der wirksamen Spaltung der RNA in der Zelle durch das Ribozym abhängig gemacht. Beispielsweise können DNA-Matrizen von Ribozymen, die gescreent werden sollen, in Plasmide kloniert und in einen speziell modifizierten Stamm von Bacillus subtilis eingeführt werden. Diese Bakterien können unter Bedingungen wachsen, bei denen ihr Überleben in Anwesenheit eines Antibiotikums von dem wirksamen Funktionieren des in dem Plasmid kodierten Ribozyms abhängt. Durch Untersuchen der Plasmide aus einigen Zellen, die überleben können, können Ribozymmutanten identifiziert werden, die unter physiologischen Bedingungen effizient funktionieren. Plasmide aus diesen ausgewählten Klonen werden isoliert, und ihre Nucleotidsequenz wird bestimmt, um diejenigen Nucleotidsubstitutionen zu identifizieren, die in den wirksamsten Ribozymen vorhanden sind.
Die Ribozymsequenzen, die aus einer ersten Mutagenisierungsrunde ausgewählt werden, können dann als "Wildtyp" in einer zweiten Mutagenisierungs- und Selektionsrunde eingesetzt werden. Mit anderen Worten kann ein zweiter Satz Ribozyme auf der Grundlage der Sequenz eines Ribozyms oder von Ribozymen, die sich in der ersten Screeningrunde als effektiv zeigten, für das Screenen hergestellt werden. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Verfahrens wird die natürliche Evolution nachgeahmt, und die Ribozymsequenz kann allmählich verbessert werden, bis sie für die Spaltung in trans optimal geeignet ist.
Falls gewünscht, können die durch dieses Screening- Verfahren erhaltenen Ribozyme weiter auf ihre Fähigkeit, Ziel-RNA zu spalten, beispielsweise HIV-1 mRNA, und auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Expression der Ziel-RNA in menschlichen Zellen, wie menschlichen Lymphocyten, zu blockieren.
In einer bevorzugten Ausgestaltung kann die Effizienz der unterschiedlichen Ribozymmutanten dadurch getestet werden, daß untersucht wird, ob eine Zelle, in der das jeweilige Ribozym exprimiert wird, in Anwesenheit eines Antibiotikums der Gruppe der Macrolid-Lincosamid- Streptogramin-B-(MLS)-Antibiotika, vorzugsweise Tylosin, wachsen kann. Das Überleben des jeweiligen Klons hängt von der Fähigkeit seines exprimierten Ribozyms ab, die hochstrukturierte Leader-Sequenz der ermC-Messenger-RNA effizient zu spalten. Das ermc-Gen, das konstitutiv transkribiert wird (Shivakumar et al., 1980) kodiert für eine Methylase (Shivakumar & Dubnau, 1981), deren Aktivität Resistenz gegen MLS-Antibiotika verleiht (Weisblum et al., 1979). Die ermC-Methylase kann jedoch üblicherweise nicht in ausreichender Menge hergestellt werden, um die Resistenz gegen das Antibiotikum zu verleihen, weil das für die Initiation der Methylase-Synthese erforderliche AUG-Codon in einer durch die Leader-Sequenz der ermC-mRNA gebildeten Sekundärstruktur abgesondert wird (Gryczan et al., 1980). Unter natürlichen Bedingungen tritt die Resistenz in Anwesenheit von subinhibitorischen Konzentrationen eines anderen Macrolidantibiotikums, Erythromycin, auf, welches eine Reihe von Vorgängen initiiert, die zu einer strukturellen Umorganisation der ermC-Leader-Ssequenz führt, die das AUG-Initiationscodon freilegt, was zur Synthese der Methylase führt (Gryczan et al., 1980).
Anstatt einer Kultivierung der Bakterien in Anwesenheit von Erythromycin können Bakterien jedoch auch induziert werden, um Ribozyme zu synthetisieren, die konstruiert sind, um den ermC-Leader zu spalten. Die Spaltung führt zu einer strukturellen Umorganisation der mRNA, die der Umorganisation ähnlich ist, die auftritt, wenn Erythromycin in niedrigen Konzentrationen vorhanden ist. Vorzugsweise ist die Ribozymsynthese unter Kontrolle eines Induktors, und die Konzentration des Induktors kann eingestellt werden, so daß nur einige Ribozymmoleküle synthetisiert werden. Nur solche Klone, welche die effizientesten Ribozymmutanten exprimieren, wachsen in Anwesenheit des MLS-Antibiotikums.
Das ermC-Gen kann in verschiedenen Bakterien exprimiert werden. B. subtilis kann als Wirtszelle eingesetzt werden, dem Fachmann sind jedoch geeignete Modifikationen ersichtlich, um die hierin beschriebene Methodik auf andere Bakterien anzupassen.
Auf ähnliche Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren auf Wirtszellen angewandt werden, die Messenger-RNAs enthalten, die nicht ermC sind, wobei die Messenger-RNA durch die Spaltung durch ein Ribozym umgeordnet wird, wobei die Expression eines Polypeptids ermöglicht wird, welche der Zelle ermöglicht zu überleben. Es wurde gezeigt, daß die Spaltung von RNA zu strukturellen Umorganisationen führt (Kramer & Mills, 1981) und die banachbarten intramolekularen Komplementärstränge, über die durch ein Computerprogramm vorhergesagt wird, daß sie stabile Sekundärstrukturen bilden (Zuker und Stiegler, 1981), fast immer diese Strukturen bilden (Jaeger et al., 1989). Somit kann ein Fachmann andere Messenger-RNAs bestimmen, die gespalten werden können, um das Überleben der Zellen zu ermöglichen. Die Messenger-RNA kann beispielsweise für ein Polypeptid kodieren, das der Zelle Resistenz gegen unterschiedliche Antibiotika verleiht, oder das der Zelle ermöglicht, einen speziellen Nährstoff zu verwenden, um zu überleben. Beispielsweise wird die Expression der Messenger-RNA, die für die Chloramphenicolresistenz kodiert, in einer Weise gesteuert, die derjenigen der ermC-Messenger-RNA ähnlich ist. Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens würden Bakterien, die nur die effizientesten Ribozyme exprimieren, in Chloramphenicol enthaltenden Medien wegen ihrer Resistenz aufgrund der wirksamen Spaltung der Ziel-Messenger-RNA überleben.
Eine alternative Ziel-Messenger-RNA ist eine, die ein toxisches Peptid kodiert. Toxische Peptide sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen antibakterielle Peptide, sowie Peptide, die für Hefe oder andere eukaryotische Zellen toxisch sind. Messenger-RNA, die für das toxische Peptid kodiert, kann unter die Kontrolle eines induzierbaren Regulators gestellt werden. Wenn die zu screenenden Ribozyme und die Messenger-RNA, die für das toxische Peptid kodiert, unter geeigneten Induktorkonzentrationen exprimiert werden, überleben nur Zellen, die die wirksamsten Ribozyme enthalten.
Das Screening-Verfahren kann auch eingesetzt werden, wenn das zu screenende Ribozym RNA spaltet, die keine Messenger-RNA ist, die jedoch anderweitig für das Überleben der Zelle verantwortlich ist. Beispielsweise kann die Kopienzahl eines Plasmids, das für eine Antibiotikaresistenz kodiert, durch die in einer Zelle exprimierte RNA kontrolliert werden, die möglicherweise durch ein zweites Plasmid exprimiert wird. Die Spaltung der RNA durch ein Ribozym führt zu einer erhöhten Kopienzahl und deshalb zu erhöhter Antibiotikaresistenz. In einem bekannten System wird die RNA-Spezies I durch ein erstes Plasmid spezifiziert und kontrolliert die Kopienzahl eines zweiten Plasmids, das für die Antibiotikaresistenz kodiert (Tomizawa und Itoh, 1981). Ribozyme können auf die effiziente Spaltung von RNA I gescreent werden, wobei die Spaltung die Kopienzahl des Plasmids erhöht, das für die Antibiotikaresistenz kodiert, und den Zellen ermöglicht, in Antibiotika enthaltenden Medien zu überleben.
Die Struktur und die Funktion des ermC-Translation- Attenuators, der in der bevorzugten Ausführungsform eingesetzt wird, werden im folgenden beschrieben.
Bakterien, die das ermC-Gen enthalten, sind resistent gegen alle Mitglieder der Macrolid-Lincosamid-Streptogramin- B-(MLS)-Antibiotikagruppe (einschließlich Tylosin), wenn sie in Anwesenheit von Erythromycin gezüchtet werden (Weisblum et al., 1971). Die MLS-Antibiotika inhibieren die Proteinsynthese durch Bindung an die 50S- Ribsomenuntereinheit. Die durch das ermC-Gen spezifizierte Methylase modifiziert einen bestimmten Adenosinrest in der 23S-Ribosomen-RNA (Lai et al., 1973), wodurch die Bindung der MLS-Antibiotika an das Ribosom verhindert wird (Shivakumar et al., 1980). Fig. 2 zeigt eine Leader-Sequenz des ermC- Transkripts, das in die Sekundärstrukturen gefaltet ist, von denen ein Computerprogramm vorhersagt, daß sie die stabilsten sind (Zuker und Stiegler, 1981; Zuker, 1989). Es gibt zwei Ribosomenbindungsstellen in der Sequenz (Shine & Dalgarno, 1974). Die erste Ribosomenbindungsstelle ist vor einem offenen Leserahmen, der für ein 19 Aminosäuren langes Leader- Peptid kodiert. Ihr AUG-Initiationscodon ist in einer einzelsträngigen Konformation. Die zweite Ribosomenbindungsstelle ist vor einem offenen Leserahmen, der für die 244 Aminosäuren lange ermC-Methylase kodiert, sein AUG-Initiationscodon wird jedoch in einem doppelsträngigen Bereich des Leaders abgesondert. Nuclease- Verdauungsexperimente und Ribosomenschutzuntersuchungen bestätigen, daß nur die erste Bindungsstelle für Ribosomen zugänglich ist (Narayanan & Dubnau, 1985).
Die Funktion dieses Translationsattenuators wurde von Dubnau und seinen Kollegen umfangreich untersucht (Dubnau 1984) und wird nachstehend zusammengefaßt. In Abwesenheit eines MLS-Antibiotikums binden Ribosomen an die erste Ribosomenbindungsstelle und gleiten über die Leader-Sequenz, wodurch viele Kopien des Leader-Peptids synthetisiert werden. Das Methylasegen wird andererseits nicht translatiert, weil sein Initiationscodon für die Ribosomen nicht zugänglich ist. Der rasche Durchlauf der Ribosomen entlang des ersten offenen Leserahmens hat keine nennenswerte Wirkung auf die Zugänglichkeit des AUG-Codons am Anfang des Methylasegens. In Anwesenheit der meisten MLS-Antibiotika wird die Synthese von Proteinen angehalten, nachdem nur eine oder zwei Aminosäuren eingebaut worden sind (Mao & Robishaw, 1971). Folglich halten Ribosomen, die die Synthese des Leader- Peptids initiieren, fast unmittelbar nach dem Beginn der Synthese. In Anwesenheit von Erythromycin werden andererseits längere Peptide synthetisiert, bevor die Translation angehalten wird (Mao & Robishaw, 1972). Ribosomen, die an Erythromycin gebunden sind und die Synthese des Leaders initiieren, werden nicht angehalten, bis etwa neun Aminosäuren eingebaut worden sind (Mayford & Weisblum, 1989a, Mayford & Weisblum, 1989b).
Fig. 3A veranschaulicht, wie die sich ergebende Anwesenheit eines festhängenden Ribosoms in der Leader-Sequenz die Sekundärstruktur des Leaders stört, was zu einer strukturellen Umorganisation führt, welche das AUG- Initiationscodon für die Methylase in eine einzelsträngige Konformation bringt (Mayford & Weisblum, 1989b). In jedem gegebenen Fall sind einige Ribosomen nicht an das MLS- Antibiotikum gebunden (Dubnau, 1984). Ribosomen, die nicht an das Antibiotikum gebunden sind, sind dann fähig, die Methylase zu synthetisieren, was zur Modifizierung von ribosomaler RNA führt, welche dem Bakterium das Überleben in Anwesenheit eines beliebigen MLS-Antibiotikums ermöglicht.
Ribozyme können die ermC-Leader-Sequenz spalten. Die erhaltene verkürzte ermC-mRNA wird derselben strukturellen Umorganisation unterworfen, die auftritt, wenn ein Ribosom, das an Erythromycin gebunden ist, während der Synthese des Leader-Peptids hängen bleibt. Die Spaltungsfragmente werden dadurch voneinander getrennt, daß Tylosin-freie Ribosomen entlang der Leader-Sequenz gleiten. Nach der Dissoziation der Fragmente kommt es für die ermC-mRNA zu einer strukturellen Umorganisation, die das AUG-Initiationscodon freilegt, wodurch die Synthese der Methylase durch Tylosin-freie Ribosomen ermöglicht wird. Fig. 3B veranschaulicht dies und Fig. 4 zeigt die vorhergesagte Sekundärstruktur (Zuker, 1989; Zuker und Stiegler, 1981) des verkürzten Leaders nach der Umorganisation.
In einer bevorzugten Ausführungsform zum Screenen von Ribozymen werden B.-subtilis-Klone, die das ermC-Gen enthalten, auf Agarplatten in Anwesenheit von Tylosin, jedoch in Abwesenheit von Erythromycin gezüchtet. Üblicherweise kann keiner der Klone Kolonien bilden. Jeder Klon ist jedoch dahingehend transformiert, daß er eine unterschiedliche Ribozymmutante exprimiert, die konstruiert ist, um den ermc- Leader zu spalten. Wenn die Ribozymmutante in einem gegebenen Klon in vivo effizient funktioniert, wird eine ausreichende Anzahl von ermC-Transkripten gespalten (und unterliegen der strukturellen Umorganisation, welche die Synthese der Methylase ermöglicht), was zu einer Resistenz der Zellen gegen Tylosin führt. Die Anzahl der Ribozymmoleküle, die pro Zelle synthetisiert werden, ist unter der Kontrolle eines Induktors und wird vorzugsweise bei einer sehr niedrigen Konzentration gehalten. Deshalb überleben nur diejenigen Klone, die eine extrem effiziente Ribozymmutante enthalten. Eine Untersuchung der Sequenzen, die für die katalytische. Domäne der Ribozyme in den selektierten Klonen kodieren, identifiziert die vorteilhaften Mutationen.
Es gibt eine Anzahl von alternativen experimentellen Wegen, die eingeschlagen werden können, um ein effizientes Ribozym zu selektieren. Beispielsweise kann eine natürliche Ziel-Sequenz ein Teil der ermC-Leader-Sequenz ersetzen. Mit anderen Worten, wenn die interessierende Spaltungsstelle in einem HIV-1-Ziel enthalten ist, kann eine HIV-1-Sequenz, welche die Spaltungsstelle enthält, einen Teil der ermC- Leader-Sequenz ersetzen, der gespalten werden soll. Diese Substitution kann beispielsweise in der Haarnadelschleife des ermc-Leaders in den Positionen der Nukleotide 70 bis 82 durchgeführt werden, was in Fig. 2 gezeigt ist. Es kann deshalb eine Ribozymmutante selektiert werden, welche die katalytische Domäne enthält, die bereits für die Spaltung der natürlichen Zielsequenz "fein abgestimmt" ist.
Das hierin offenbarte Selektionsverfahren kann auf Ribozyme angewendet werden, die nicht zum Haseloff-Gerlach- Typ gehören. Kürzlich wurde beispielsweise eine andere kurze Ribozym-Sequenz identifiziert (Hampel & Tritz, 1989), die eine einzigartige katalytische "Haarnadel"-Domäne bildet (Hampel et al., 1990) und unter physiologischen Bedingungen aktiv ist. Da verschiedene Typen von Ribozymen zugänglich werden, können sie unter Verwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung der speziellen Sequenzen, die am stärksten katalytisch wirken, gescreent werden.
Obwohl Haseloff-Gerlach-Ribozyme hierin beschrieben werden, die eine katalytische Sequenz von 22 Nukleotiden aufweisen, können Ribozyme, die Variationen dieses herkömmlichen Haseloff-Gerlach-Designs sind, ebenso gescreent werden. Während Nucleotidsubstitutionen in der 22 Nukleotide langen Domäne gescreent werden können, können auch Insertionen, Additionen und Deletionen, welche die Nucleotidzahl der Ribozyme ändert, auf die Wirksamkeit gescreent werden. Es wird angenommen, daß diese Ribozyme als die zu der in Fig. 1 gezeigten Stuktur unterschiedliche Strukturen haben können. Obwohl 12 bis 16 Nukleotide typischerweise in das Haseloff-Gerlach-Konstrukt eingebaut werden, die zum Zielstrang komplementär sind, können auf ähnliche Weise Ribozyme zum Screenen konstruiert werden, die weniger oder mehr als diese Anzahl der komplementären Nukleotide enthalten. Eine ausreichende Nukleotidanzahl sollte jedoch eingebaut werden, um das Ribozym für das Ziel hochspezifisch zu machen.
Das Screeningverfahren kann eingesetzt werden, um Ribozymsequenzen zu bestimmen, die zum Spalten jeglicher gewünschten Zielsequenz am wirksamsten sind. Bei der Auswahl der komplementären Sequenzen des Ribozyms sollte jedoch darauf geachtet werden, daß nicht alle potentiellen Zielstellen des zu screenenden Ribozyms gleichermaßen einem Angriff zugänglich sind. Bei der Auswahl der Zielsequenz gibt es verschiedene Überlegungen. Bei der Konstruktion eines Ribozyms zur Spaltung viraler RNA ist die Konservierung der ausgewählten Sequenz unter unterschiedlichen Isolaten des Virus von primärer Bedeutung. Beispielsweise tritt in der genomischen HIV-NL43-RNA GUC 46 mal auf. Unter kennzeichnenden Isolaten von HIV-1 (aufgelistet in der Menschlichen-Retroviren- und Aids-Datenbank) ist GUC nur an 35 dieser 46 Positionen konserviert; und flankierende Sequenzen (mit einer Länge von 8 Nukleotiden) sind nur bei 18 dieser Stellen konserviert. Wenn der Vergleich auf afrikanische HIV-1-Isolate ausgeweitet wird, erfüllen nur 7 Stellen dieses Erfordernis. Ein andere wichtige Überlegung beim Auswählen einer Ziel-Virus-RNA ist, daß sie in einem Gen lokalisiert ist, dessen Funktion oder Produkt für die Reproduktion oder Infektiosität des Virus essentiell ist. Beispielsweise wäre das tat-Gen ein gutes Ziel, weil sein Genprodukt ein positiver Regulator der Virus-Expression ist. Das Ziel sollte auch in einem Bereich der RNA sein, der für das Ribozym physikalisch zugänglich ist. In vitro-Studien haben gezeigt, daß die Struktur der Substrat-RNA eine Hauptdeterminante der katalytischen Effizienz von Haseloff- Gerlach-Ribozymen sein kann (Fedor & Uhlenbeck, 1990). Ein Computerprogramm (Zuker, 1989; Zuker und Stiegler, 1981) hilft bei der Vorhersage, welche Sekundärstrukturen am wahrscheinlichsten auftreten.
Während GUC die am besten charakterisierte Bindungsstelle der Haseloff-Gerlach-Ribozyme ist, können jedoch auch GUU und GUA als Spaltungsstellen dienen. Jede beliebige Spaltungsstelle eines zu testenden Ribozyms kann jedoch in der Zielsequenz eingesetzt werden, entweder die, die von Haseloff-Gerlach-Ribozymen gespalten wird, oder Steilen, die von anderen Ribozymen gespalten werden. Die Stelle kann entweder natürlich in der Sequenz auftreten, oder die Zielsequenz kann dahingehend angepaßt sein, daß sie die Zielstelle enthält. Im hierin beschriebenen ermC-Beispiel wird eine GUC-Stelle in die Zielsequenz eingebaut. Wenn eine natürliche Sequenz oder beispielsweise ein Virus in das ermC- Gen oder ein anderes eingesetztes Gen gespleißt wird, enthält die virale Sequenz üblicherweise bereits die Bindungsstelle. Wenn die Isolierung des wirksamen Ribozyms nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, können natürlich anschließende Tests durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob Ribozym enthaltende Sequenzen, die zu einem ausgewählten Ziel komplementär sind, die Ziel-RNA in vitro spalten können. Ein weiterer Folgetest kann durch Konstruieren eines Ribozyms zu deren Spaltung und dann durch Beobachten der biologischen Konsequenzen der Expression des Ribozyms in menschlichen Zellen, die dem behandelten Reagenz ausgesetzt wurden, zur Bestimmung, ob die Zielstelle geeignet ist, durchgeführt werden. Sobald beispielsweise ein wirksames Enzym nach unseren Screeningverfahren gefunden wurde, das HIV-1-RNA spaltet, können menschliche Lymphocyten mit einem Vektor transfiziert werden, von dem das Ribozym exprimiert wird und können dann mit einem HIV-1-Virus behandelt werden. Ein Test für die HIV-1-Infektiosität kann die Wirksamkeit des Ribozyms zur Verhinderung von HIV-Infektionen von menschlichen Zellen messen. Während solche Tests bei der Durchführung der Erfindung nicht beteiligt sind, können sie dennoch nützliche Folgetests sein.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Diese Beispiele sollten nicht dahingehend verstanden werden, daß sie den Umfang der angefügten Ansprüche einschränken.

BEISPIEL 1

In diesem Beispiel zeigen wir die Fähigkeit von Haseloff-Gerlach-Ribozymen, die nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gescreent wurden, zur Spaltung von MDV-1-mRNA und HIV-1-Integrase-RNA.
Wir konstruierten und testeten ein Ribozym, das konstruiert war, um MDV-1-RNA zu spalten, die eine gut charakterisierte Matrize für Q-β-Replicase ist (Kacian et al., 1972, Mills et al., 1973). Der Zeitverlauf der Spaltung von MDV-1-RNA in vitro durch dieses Enzym ist in Fig. 5 gezeigt. Das Inkubationsgemisch enthielt (als innere Kontrolle) eine verwandte rekombinante RNA (Miele et al., 1983), die nicht gespalten werden kann, weil ihre Ribosomen- Bindungsstelle durch die Anwesenheit einer inserierten heterologen Sequenz unterbrochen war. Obwohl das Ribozym seine vorgesehene Zielsequenz spaltete (und die Kontrolle nicht spaltete), zeigten die Ergebnisse die relativ geringe Effizienz der Haseloff-Gerlach-Konstrukte.
Wir stellten zwei Haseloff-Gerlach-Ribozyme her, die jeweils konstruiert waren, um das Integrasegen von HIV-1-RNA an einer Position zu spalten, die dem GUC der Nukleotide 4669-4671 des Hybrid-HIV-1-Klons, HIV-NL43 (Adachi et al., 1986), entsprach. Das erste Ribozym ("Ribozym alpha") wurde von einer synthetischen, einzelsträngigen DNA-Matrize durch Inkubation in vitro mit Bakteriophage-T7-RNA-Polymerase transkribiert (Milligan et al., 1987). Seine Sequenz ist unten gezeigt. Großbuchstaben geben die Nukleotide an, die der HIV-1-Zielsequenz komplementär sind:
Das zweite Ribozym ("Ribozym beta") wurde von einem rekombinanten Plasmid sowohl in vitro (Melton et al., 1984) als auch in vivo transkribiert. Dieses Plasmid enthielt die Sequenz, die für das Ribozym kodiert, das sich zwischen dem Promotor für T7-RNA-Polymerase und einem T7- Transkriptionsterminator befand. Das Plasmid wurde in E. coli-Zellen eingeführt, die eine chromosomale Kopie des T7- RNA-Polymerasegens enthielten, von dem die T7-RNA-Polymerase induzierbar exprimiert werden konnte. Die Anwesenheit des Terminators in dem Plasmid stellt sicher, daß die Transkripte homogen sind. Überdies verleiht die Anwesenheit der Terminatorsequenz am 3'-Ende des Transkripts Schutz vor zellulären Exonucleasen. Die Sequenz des zweiten Ribozyms ist nachstehend gezeigt.
Beide Ribozyme wurden in vitro untersucht. Fig. 6 zeigt ein einzelnes Experiment, das die Ergebnisse veranschaulicht. Jedes der 11 Reaktionsröhrchen enthielt "Ziel-RNA", welche die zelluläre Gesamt-RNA war, die aus E. coli-Zellen isoliert wurde, die ein trpE-HIV-1-Integrase-Fusionsprotein exprimieren. Nach der Inkubation mit einem Ribozym wurde die RNA aus jeder Reaktion elektrophoretisch getrennt, auf eine Membran überführt und mit einer radioaktiven Sonde für das HIV-1-Integrasegen hydridisiert. Die Ergebnisse zeigten, daß sowohl Ribozym alpha als auch Ribozym beta die Ziel-RNA in Fragmente der erwarteten Größe spalten. Es spielte keine Rolle, ob Ribozym beta durch Transkription in vitro oder durch Isolation der zellulären Gesamt-RNA von einem Bakterium erhalten wurde, worin seine Synthese induziert wurde. Die Ergebnisse zeigten auch, daß Ribozyme fähig sind, in Anwesenheit von nicht verwandten zellulären RNAs zu funktionieren und daß die Anwesenheit einer Terminatorsequenz am 3'-Ende des Ribozyms nicht dazu führt, daß sein Funktionieren verhindert wird. Keine Spaltung trat auf, wenn Ribozyme weggelassen wurden; und keine Spaltung trat auf, wenn eine Ribozymmutante (ohne katalytische Domäne) anwesend war. Die Ribozyme waren in vitro bei 50ºC aktiv, jedoch inaktiv bei 37ºC. Die nachstehenden Experimente zeigen jedoch die Fähigkeit der Ribozyme, in vivo bei 37ºC zu funktionieren.
Um zu bestätigen, daß im Integraseanteil des Zieltranskripts Spaltung auftrat (und nicht im trpE-Anteil), wurden die Membranen mit einer Sonde für das E. coli-trpE-Gen rehybridisiert. Die Ergebnisse zeigten, daß Spaltung innerhalb des HIV-1-Integrase-Gens auftrat.
Wir haben auch eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Fähigkeit von Ribozymen zu zeigen, HIV-1-RNA in vivo zu spalten. Wir stellten E. coli-Zellen her, die eine chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gens unter lac- Kontrolle und auch ein Plasmid enthielten, in dem die Transkription des HIV-1-Integrase-Gens durch einen Promotor für T7-RNA-Polymerase gesteuert wird (Stamm A). Wir stellten dann drei zusätzlich E. coli-Stämme durch Einführen eines zweiten (kompatiblen) Plasmids in Stamm A her. Die Plasmide, die in Stamm A eingeführt wurden, enthielten ein inseriertes Gen unter der Kotrolle eines Promotors für T7-RNA-Polymerase. In Stamm D kodierte das inserierte Gen für Ribozym beta. In Stamm C kodierte das inserierte Gen für eine Ribozym beta- Mutante, der eine katalytische Domäne fehlte. Und in Stamm B enthielt das Plasmid kein inseriertes Gen. Die Aktivität der Ribozyme, die von der inserierten Sequenz in dem jeweiligen Stamm transkribiert wurden, wurde durch Überführen der Bakterien in Medien beobachtet, die einen Induktor des lac- Operons enthielten. Zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion wurde das Wachstum angehalten, und die RNA in den Zellen wurde isoliert, durch Elektrophorese analysiert und durch Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde für das HTV-1-Integrase-Gen sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse (in Fig. 7 gezeigt) zeigen, daß die Transkripte, welche die HIV-1-Ziel-Sequenz enthielten, nach der Induktion in Zellen vorhanden waren, die kein Ribozym exprimieren (Stämme A und B). Wenn jedoch das Ribozym beta exprimiert wird (Stamm D), führt die Spaltung der Ziel-RNA durch das Ribozym anscheinend zur vollständigen Zerstörung der gespaltenen Transkripte durch zelluläre Endonucleasen. Eine ähnliche Beobachtung wurde während der Spaltung von HIV- 1-RNA durch Ribozyme in kultivierten menschlichen Zellen gemacht (Sarver et al., 1990). Die Ribozymmutante, der eine katalytische Domäne fehlte (in Stamm C), wirkte offensichtlich als eine klassische Gegensinn-RNA, welche die Expression des Ziels moduliert. Interessanterweise war das Ribozym beta in vivo bei 37ºC aktiv, obwohl es bei derselben Temperatur in vitro inaktiv war. Ein Ribozym katalysierte deshalb offensichtlich die Spaltung eines HIV-1-Ziels bei 37ºC in vivo, was zur vollständigen Zerstörung des Transkripts führte.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines B. subtilis- Klons, der eine einzelne Kopie eines modifizierten ermC-Gens enthielt.
ErmC tritt normalerweise in einem Plasmid, pE194, auf, das aus Staphylococcus aureus isoliert wurde (Iordanescu, 1976) und das in B. subtilis durch Transformation überführt werden kann (Weisblum et al., 1979). pE194 ist beim ATCC unter der Hinterlegungsnummer 68359 hinterlegt.
Ein modifiziertes pE194 kann eingesetzt werden, worin eine einzelne Basenpaarsubstitution in das ermC-Gen eingeführt ist, so daß es eine einzige EcoRI- Restriktionsstelle enthält. Obwohl diese Substitution an der Position 109 des ermc-Leaders zu einem Guanosin führt, hat sie keine Auswirkung auf die ermC-Funktion oder die Induktion durch Erythromycin. In einer weiteren Modifikation kann ein 3 Basenpaare langes Segment, das durch die zu testenden Ribozyme spaltbar ist, in das ermC-Gen inseriert werden. Beispielsweise kann eine GUC-Sequenz zwischen die Nucleotide 75 und 76 des ermC-Leaders eingeführt werden (vergl. Fig. 2). Da diese Insertion in einer Haarnadelschleife auftritt und sie nur ein einzelnes Codon in den bestehenden Leserahmen der Leader-Sequenz einführt, ist es unwahrscheinlich, daß sie die Funktion des ermC-Gens verändert. Die Insertion einer GUC-Sequenz an dieser Stelle ermöglicht der modifizierten Haarnadelschleife, als Substrat für die Spaltung durch ein Haseloff-Gerlach-Ribozym zu dienen. Wir wissen von unserer eigenen Arbeit mit einem Enzym, das konstruiert wurde, um MDV-1-RNA in einer Haarnadelschleife (vergl. Fig. 1) zu spalten, und von der Arbeit anderer (Koizumi et al., 1988), daß Haarnadelschleifen als Ziel-Stellen für Ribozyme dienen können.
Da eine einzige SstI-Restriktionsstelle stromaufwärts der ermC-Transkriptionsinitiationsstelle auftritt (Narayanan & Dubnau, 1985), kann die Insertion des GUC oder einer anderen geeigneten Spaltungsstelle durch Ersetzen des SstI- EcoRI-Segments, das für den Anfang des ermc-Leaders kodiert, durch eine synthetische DNA erreicht werden, die in jeder Hinsicht identisch ist, außer daß sie die gewünschten inserierten Basenpaare enthält.
In B. subtilis wird pE194 bei einer Kopienzahl von etwa 10 bei 37ºC gehalten (Weisblum et al., 1979). Es ist wünschenswert, die Menge der ermC-RNA zu vermindern, die in jeder Zelle anwesend sein wird, um das Überleben der Zellen schwieriger zu machen, solange sie nicht eine extrem effiziente Ribozymmutante exprimieren. Deshalb ist es bevorzugt, eine einzelne Kopie von pE194 oder eines anderen eingesetzten Plasmids, das für die ermC-Messenger-RNA kodiert, in das B. subtilis-Chromosom zu integrieren. Ein weiterer Grund für das Integrieren des speziellen Plasmids pE194 in das Chromosom ist, den spontanen Verlust des Plasmids zu verhindern, da die Replikation von pE194 temperaturempfindlich ist. Der erhaltene Klon kann untersucht werden, um zu bestätigen, daß er gegen Tylosin in Abwesenheit von Erythromycin empfindlich ist, jedoch gegen Tylosin in Anwesenheit von Erythromycin resistent ist. Die Integration einer einzelnen Kopie von pE194, welche das Wildtyp-ermC-Gen enthält, kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erreicht werden (Hofemeister et al., 1983). Insbesondere wird die Replikation von pE194 bei erhöhten Temperaturen inhibiert, welche das Wachstum von B. subtilis nicht stören. Durch die Selektion auf Erythromycin-resistente Organismen bei erhöhten Temperaturen (ca. 500C) werden Klone erhalten, in denen pE194 in das B. subtilis-Chromosom integriert worden sind, und die Determinante für die Erhythromycin-Resistenz wird deshalb als Teil des Chromosoms repliziert. Die Integration tritt im wesentlichen an statistischen Positionen im Chromosom auf. pE194, das eine native ermC-Sequenz enthält, oder pE194, das eine inserierte Spaltungsstelle enthält, kann in einer einzelnen Kopie in das Chromosom auf diese Weise integriert werden.
Diese Stämme, welche pE194-Insertionen tragen, können auch als Empfänger für die Transformation oder Transduktion mit Plasmiden eingesetzt werden, welche ein DNA-Segment von Interesse zusammen mit einem Bereich tragen, der den integrierten pE194-Element homolog ist. Dies erlaubt die Integration in das Chromosom unter Ersetzen der vorhandenen pE194-Sequenz durch die Sequenz auf dem Plasmid, welche eine geänderte Version von pE194 sein kann, welche die Spaltungsstelle von Interesse enthält. Auf diese Weise kann das Segment von Interesse einfach an einer bekannten Stelle auf dem B. subtilis-Chromosom integriert werden.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Plasmids, das induziert werden kann, um ein auf Effektivität zu screenendes Ribozym zu exprimieren. Die Verwendung im B. subtilis-Wirt wird hier beispielhaft genannt, es können jedoch geeignete Plasmide für die Expression von Ribozymen hergestellt werden, für die andere Wirtszellen eingesetzt werden.
Ein rekombinantes Plasmid, pLIQ-1, kann eingesetzt werden, in dem die Transkription von einem speziellen Promotor unter der Kontrolle eines E. coli-lac-Operators ist, selbst wenn das Plasmid in B. subtilis gezüchtet wird (Yansura & Henner, 1984). Die Konstruktion dieses Plasmids wird im US Patent 4,912,046 beschrieben, das durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt wird. Dieses Plasmid enthält einen Hybridpromotor (genannt "Spac"), der aus einem Promotor aus dem B. subtilis-Phagen SPO-1 besteht, der an einen E. coli-lac-Operator fusioniert ist. Das Plasmid enthält auch ein E. coli-lac-Repressorgen unter der Kontrolle eines Promotors und eine Ribosomenbindungsstelle, welche die Expression des Repressors in B. subtilis ermöglicht. Der Spac-Promotor liegt unmittelbar stromaufwärts der Sequenz, welche die einzige Restriktionsstelle für HindIII und XbaI enthält. Folglich kann die Transkription einer Sequenz, die zwischen der HindIII- und XbaI-Stelle inseriert ist, in B. subtilis durch Verändern der Konzentration von Isopropylbeta-D-thiogalactosid (IPTG), welches ein Induktor des E. coli-lac-Operons ist, moduliert werden.
Eine Sequenz, die aus zwei Bereichen besteht, wird stromabwärts vom Spac-Promotor eingeführt. Der erste Bereich kodiert für ein Haseloff-Gerlach-Ribozym, das konstruiert ist, um die modifizierte Leader-Sequenz des ermC-Transkripts an der Stelle der GUC-Insertion zu spalten. Der zweite Bereich enthält die Sequenz eines Transkriptionsterminators. Ein Transkriptionsterminator, der eingesetzt werden kann und hier eingesetzt wird, ist der hauptsächliche rho-unabhängige Transkriptionsterminator des comG-Gens von B. subtilis (Albano et al., 1989), dessen Sequenz in dem zweiten nachstehend gezeigten Oligonucleotid enthalten ist. Jeder Bereich kann in kommerziell erwerbbaren DNA- Synthetisiergeräten hergestellt werden. Die Sequenz des ersten Oligonucleotids (das für das Ribozym kodiert) ist
Großbuchstaben identifizieren die Sequenzen, die für die Bereiche des Ribozyms kodieren, die an den ermC-Leader hybridisieren. Die 22 Nucleotide lange katalytische Domäne des Ribozyms wird durch den Bereich zwischen den Sequenzen aus Großbuchstaben kodiert. Eine HindIII-Erkennungssequenz (AAGCTT) ist in der Nähe des 5'-Endes des Oligonucleotids. Die Sequenz des zweiten Oligonucleotids (das den Terminator enthält) ist
Großbuchstaben identifizieren den Bereich, der zur Sequenz komplementär ist, die am 3'-Ende des terminierten Transkripts auftritt. Eine XbaI-Erkennungssequenz (TCTAGA) ist in der Nähe des 5'-Endes des Oligonucleotids. Die letzten 15 Nucleotide am 3'-Ende jedes Oligonucleotids sind einander komplementär. Deshalb hybridisieren die zwei Oligonucleotide aneinander und können durch Inkubation mit dem Klenow- Fragment von E. coli-DNA-Polymerase verlängert werden, wodurch ein doppelsträngiges DNA-Segment erzeugt wird, das sowohl für ein Ribozym als auch für einen Transkriptionsterminator kodiert. Dieses Segment wird mit HindIII und XbaI verdaut, um überstehende ("sticky") Enden zu erzeugen, und dann anstelle des kurzen HindIII-XbaI-Segments stromabwärts des Spac-Promotors in pLIQ-1 inseriert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wird verwendet, um B. subtilis-Zellen zu transformieren, welche das vorstehend beschriebene modifizierte chromosomale ermC-Gen enthalten. pLIQ-1 enthält auch ein Chloramphenicol-Resistenzgen (Yansura & Henner, 1984), und Transformanten werden durch Züchtung in Anwesenheit von Chloramphenicol selektiert. Andere Resistenzmarker können selbstverständlich auch verwendet werden.
Wenn die selektierten Klone in Anwesenheit von IPTG gezüchtet werden, bestehen die von dem Spac-Promotor synthetisierten Transkripte aus drei Bereichen: einem 5'- Leader, der eine Kopie des E. coli-lac-Operators enthält, einem ermC-spezifischen Haseloff-Gerlach-Ribozym und einem 3'-Schwanz, der den Transkriptionsterminator enthält. Fig. 8 zeigt dieses Transkript, das an den modifizierten ermC-Leader gebunden ist. Die Pfeile zeigen die Stelle, an der die Spaltung stattfindet. Um zu entscheiden, welche Terminatorsequenz in das Transkript einzubauen ist, verwendeten wir ein Computerprogramm (Zuker, 1989, Zuker und Stiegler, 1981), um die Sekundärstrukturen vorherzusagen, die in dem Transkript wahrscheinlich gebildet werden. Das Programm sagte vorher, daß die comG-Terminatorsequenz wahrscheinlich nicht mit der Sequenz des Ribozyms wechselwirkt. Des weiteren sagte das Programm vorher, daß die Sequenzen, die mit dem ermC-Leader wechselwirken müssen, damit das Ribozym funktioniert, wahrscheinlich in einzelsträngiger Konformation vorliegen. Wenn Ribozyme konstruiert werden, um Ziele zu spalten, die in anderen Sequenzen als dem ermC-Leader enthalten sind, können die Sekundärstrukturen auf ähnliche Weise analysiert werden, um eine geeignete Terminatorsequenz zu selektieren, falls eine Terminatorsequenz eingebaut werden soll.
Ein Northern-Blot-Verfahren (Kornblum et al., 1988) kann verwendet werden, um zu bestätigen, daß die in transformierten Zellen synthetisierte Ribozymmenge von der Konzentration von IPTG abhängt.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer Plasmidbibliothek, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu screenende Ribozymmutanten-Sequenzen enthalten.
Die automatisierte Synthese von DNA tritt stufenweise auf, wobei am 3'-Ende des gewünschten Oligonucleotids begonnen wird. Wenn ein neues Nucleotid zu der wachsenden Oligonucleotidkette gegeben wird, wählt das automatische Synthetisiergerät eine geeignete Nucleotidvorläuferlösung aus den vier verfügbaren Lösungen aus (eine Lösung für jedes mögliche Nucleotid). In jeder beliebigen Stufe der Synthese führt die Substitution eines einzigen Nucleotids durch Gemische aller vier Nucleotide in einigen der Ketten zum Einbau einer Basermtutante an dieser Stelle (Hutchison III et al., 1986). Der Anteil der Oligonucleotide, welche Mutanten sind, hängt von der relativen Menge der "falschen" Nucleotidvorläufer ab, die in der jeweiligen Stufe vorhanden sind. In diesem Zusammenhang bedeuten die Ausdrücke "mutierte Nucleotide" und "falsche Nucleotide" Nucleotide, die sich von denjenigen in dem Ribozym unterscheiden, dessen Sequenz variiert wird.
In einem Verfahren zum Erzeugen von Mutanten schreitet die Synthese des ersten Oligonucleotids (das für das Ribozym kodiert) fort, bis die ersten 12 Nucleotide eingebaut worden sind, wobei eine Sequenz gebildet wird, die der Zielsequenz komplementär ist. An dieser Stelle werden alle vier der Vorläuferlösungen durch Gemische ersetzt, die beispielsweise 85% des "Wildtyp"-Nucleotids und 5% jedes der anderen drei Nucleotide enthalten. Die Synthese des Oligonucleotids wird dann fortgesetzt, bis die nächsten 22 Nucleotide eingebaut worden sind (die für die katalytische Domäne des Ribozyms kodieren). Somit ist in jedem dieser 22 Synthesezyklen eines der drei "mutierten" Nucleotide in 15% der wachsenden Stränge statistisch eingebaut worden. Die Synthese wird dann angehalten, und die Vorläufergemische werden durch die ursprünglichen reinen Lösungen ersetzt. Die Synthese wird dann fortgesetzt, bis die verbleibenden 12 Nucleotide, die der Zielsequenz komplementär sind, eingebaut worden sind. Die Produkt-DNA besteht daher aus einer vielfältigen Sammlung von Oligonucleotiden, die für verschiedene Ribozymmutanten kodieren. Diese Oligonucleotide werden dann mit dem zweiten Oligonucleotid hybridisiert, welches für den Transkriptionsterminator kodiert, verlängert und wie vorstehend beschrieben in ein geeignetes Plasmid kloniert, beispielsweise in pLIQ-1. Wir schätzen, daß eine einzelne Oligonucleotidpräparation eingesetzt werden kann, um mindestens ein Mikrogramm rekombinanter Plasmide zu konstruieren.
Da die Transformation von B. subtilis Plasmidoligomere erfordert (Contente & Dubnau, 1979) und daher relativ ineffizient ist, kann E. coli mit den rekombinanten Plasmiden transformiert werden, wodurch die Anzahl der Transformanten, die erhalten werden können, merklich erhöht wird. Des weiteren sollten, wenn die DNA durch Elektroporation in die Zellen überführt wird, dadurch etwa eine Milliarde Transformanten pro Mikrogramm Plasmid erhalten werden (Dower et al., 1988). Die Plasmide erhöhen deutlich die Anzahl an Transformanten, die erhalten werden können. Der Hauptvorteil des ersten Einführens der Plasmide in E. coli ist, daß der Anteil der Oligomere in der Plasmidpopulation während des Bakterienwachstums steigt (James et al., 1982). Die transformierten E. coli-Zellen werden auf Agarplatten gezüchtet, die Chloramphenicol enthalten, bis sie einen fast konfluenten Bakterienrasen bilden. Die Bakterien werden dann von den Platten abgekratzt und zur Herstellung von Plasmid- DNA verwendet. Die isolierten Plasmide werden dann durch Transformation in B. subtilis überführt. Als Ergebnis der Voramplifizierung in E. coli sollten etwa 10 Millionen B. subtilis-Transformanten erhalten werden. Etwa 97% dieser Mutanten kodieren für eine Ribozymmutante.
Die Anzahl der unterschiedlichen möglichen Mutantensequenzen, die 22 Nucleotide lang sind, d. h. die Länge der katalytischen Sequenz, die variiert werden soll, überschreitet 17 Trillionen. Wenn beispielsweise 10 Millionen Transformanten pro Experiment getestet werden sollen, sollte eine Strategie verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, eine Ribozymmutante mit erhöhter Aktivität zu selektieren. Die Anzahl der unterschiedlichen Sequenzen, die n Nucleotide lang sind und genau r Mutationen enthalten, Sn,r ist durch die folgende Formel gegeben:
Sn,r = [Cn,r] [3r]
worin Cn,r die Anzahl der Kombinationen von n Ereignissen mal r zu einer Zeit ist. Wenn n 22 ist, wie im Fall der katalytischen Domäne der hier beispielhaft genannten Ribozyme, sind die ersten acht Werte von Sn,r in der nachstehenden Tabelle angegeben. Aus einer Untersuchung der Tabelle geht hervor, daß selbst bei 10 000 000 Transformanten nur die unterschiedlichen Mutantenstränge umfangreich untersucht werden konnten, die fünf oder weniger Nucleotidsubstitutionen enthalten.
Die Anzahl der Transformanten mit Sequenzen, die n Nucleotide lang sind und genau r Mutationen enthalten, Nn,r, von denen erwartet wird, daß sie in einer Population mit 10 000 000 Transformanten auftreten, ist durch die folgende Formel gegeben.:
Nn,r = 10 000 000 [Cn,r] [(3p)r] [1-3p)(n-r)]
worin p die Häufigkeit ist, in der ein spezielles mutiertes Nucleotid das Wildtyp-Nucleotid an einer gegebenen Position in der Sequenz ersetzt. Bei der vorstehenden Beschreibung der Synthese der Sammlung von mutierten Oligonucleotiden wurde p auf 0,05 festgelegt. Wenn n 22 ist, wie im Fall der katalytischen Domäne der in diesen Beispielen beschriebenen Ribozyme, sind die ersten acht Werte von Nn,r in der nachstehenden Tabelle angegeben. Aus einer Untersuchung der Werte in der Tabelle geht hervor, daß wenn die Substitutionsfrequenz, p, durch Andern der Anteile der Nucleotide in den Vorläufergemischen geändert wird, die Art, in der das Auswahlexperiment für die 22 Nucleotide verändert wird, variiert. Niedrigere Werte von p ergeben sich bei einer sorgfältigen Untersuchung der unterschiedlichen Sequenzen, die nur einige wenige Nucleotidsubstitutionen haben. Niedrigere Werte von p ergeben sich aber auch bei einer relativ geringen Anzahl von Sequenzen, die mehrfache Substitutionen haben, die erhöhte Ribozymaktivität verleihen könnten. Höhere Werte von p ergeben andererseits eine größere Repräsentation von relativ komplexen Mutanten auf Kosten einer gründlichen Untersuchung von kleineren Veränderungen.
Unsere bevorzugte Strategie zieht in Betracht, daß nicht alle Wahrscheinlichkeiten direkt untersucht werden können. Statt dessen wird ein relativ gemäßigter Wert von p (0,05) verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von vorteilhaften Änderungen, an denen nur wenige Mutationen beteiligt sind, zu erhöhen. Sobald diese Mutationen identifiziert worden sind, kann die Synthese einer Sammlung von Mutantensequenzen wiederholt werden, wobei jedoch mit einer oder mehreren der in der ersten Sammlung identifizierten vorteilhaften Sequenzen gestartet wird und wobei stringentere Selektionsbedingungen eingesetzt werden (beispielsweise niedrigere Konzentrationen von IPTG). Somit ahmt diese Strategie die Evolution von Genen in der Natur nach. Das Selektionsverfahren kann mehrmals wiederholt werden. Mit jedem Zyklus der Mutation und Selektion sollten kleine Änderungen die Effizienz des Ribozyms verbessern. Auf diese Weise wird ein Ribozym selektiert, das für die Spaltung eines Substrats unter physiologischen Bedingungen wesentlich geeigneter ist als das Ausgangsribozym, dessen Sequenz variiert wird. Das erhaltene Ribozym ist auch bei der Katalysierung der Spaltung in trans wesentlich effizienter als der natürliche Hammerkopf, der dahingehend evolviert ist, die Spaltung in cis zu katalysieren.
Wir haben Mutationen untersucht, bei denen bei allen 22 Nucleotiden der katalytischen Domäne Mutationen eingeführt wurden, obwohl die einzigen konservierten Sequenzen (Forster & Symons, 1987b) solche sind, die die Haarnadelstruktur umgeben (vergl. Fig. 1B). Wir haben diesen Weg gewählt, weil der Mechanismus der Katalyse noch nicht verstanden wird, und die Identität der Sequenzen, die diese Haarnadel bilden, die Spaltungsrate erheblich beeinflussen (Heus et al., 1990). In einem anderen Ansatz kann jedoch eine geringere Zahl von Nucleotiden als Ziele für die Selektion dienen, wenn davon ausgegangen wird, daß diese Nucleotide auf die katalytische Aktion des Ribozyms einen größeren Einfluß haben.
Beispielsweise können die zehn nicht hybridisierten Nucleotide, die in Fig. 1B gezeigt sind, "CUGAUGA ... GAA" variiert werden, und die anderen Nucleotide in der 22 Nucleotide langen katalytischen Sequenz können beibehalten werden, was auf der Annahme beruht, daß diese Nucleotide für die Katalyse der Spaltung der Ziel-RNA stärker verantwortlich sind.

BEISPIEL 5

In diesem Beispiel werden Transformanten ausgewählt, welche die effizientesten Ribozymmutanten exprimieren.
Die Bibliothek von transformierten B. subtilis-Klonen wird auf Agar gezüchtet, der 10 Mikrogramm/ml Tylosin und variierende Konzentrationen von IPTG enthält (zwischen 0 und 1000 Mikrogramm/ml). Es sollten in Abwesenheit von IPTG keine Kolonien wachsen, weil nicht genügend Ribozyme synthetisiert werden, um den Zellen das Wachstum in Anwesenheit von Tylosin zu ermöglichen. In Anwesenheit von IPTG werden viel mehr Ribozyme in jeder Zelle synthetisiert. Die meisten Klone sind jedoch immer noch unfähig zu wachsen, weil die Ribozyme, die sie synthetisieren, in vivo nicht ausreichend aktiv sind. Die überlebenden Klone enthalten eine Ribozymmutante, die erheblich aktiver ist als der Wildtyp.
Wie vorstehend ausgeführt, wird die Antibiotika- Resistenz durch die Dissoziation der RNA-Fragmente bewirkt, die gebildet werden, wenn das Ribozym die ermC-mRNA spaltet.
Bei niedrigeren IPTG-Konzentrationen werden weniger Moleküle des Ribozyms transkribiert. Es wird die IPTG- Konzentration bestimmt, bei der nur etwa 20 bis 30 Klone fähig sind zu überleben. Die Klone, die bei dieser niedrigen IPTG-Konzentration wachsen, enthalten die effizientesten Ribozymmutanten. Die am schnellsten wachsenden Klone aus dieser Sammlung werden für weitere Studien isoliert. Diese Klone werden getestet, um zu bestätigen, daß sie gegen Tylosin empfindlich sind und daß sie fähig sind, in Tylosin zu wachsen, wenn entweder IPTG oder Erythromycin anwesend ist. Aktive Ribozymmutanten können von konstitutiven Mutanten von ermC unterschieden werden, weil die konstitutiven Mutanten in Abwesenheit eines Induktors gegen Tylosin resistent sind, während die Ribozymmutanten dies nicht sind.
Plasmid-DNA von selektierten Klonen wird isoliert, und das HindIII-XbaI-Fragment von jedem Klon wird sequenziert, um zu bestimmen, welche Nucleotidsubstitutionen in der katalytischen Domäne des Haseloff-Gerlach-Ribozyms für die erhöhte Aktivität in vivo verantwortlich sind.

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Claims

1. Verfahren zum Screenen von Ribozymen auf die Wirksamkeit zum Spalten von RNA, welches umfaßt:

(a) Herstellen mehrerer Vektoren, die für Ribozyme mit unterschiedlichen Sequenzen kodieren, wobei die Ribozyme auf ihre Wirksamkeit zum Spalten von RNA, die eine Ziel-RNA-Sequenz enthält, gescreent werden soll;

(b) Bereitstellen von Zellen, welche die Ziel-RNA-Sequenz enthaltende RNA enthalten und die, wenn die RNA durch eines der Ribozyme in ausreichender Menge gespalten wird, in einem vorher ausgewählten Kulturmedium überleben;

(c) Ausstatten der Zellen mit den Vektoren;

(d) Kultivieren der Zellen in dem vorher ausgewählten Kulturmedium unter Bedingungen, bei denen die Ribozyme exprimiert werden; und

(e) Selektieren der überlebenden Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die bereitgestellten Zellen eine Messenger-RNA exprimieren, welche die Ziel- RNA-Sequenz enthält, und wenn die Messenger-RNA durch eines der Ribozyme gespalten wird, bewirkt sie die Expression eines Polypeptids, das in ausreichender Menge bewirken kann, daß die Zellen in dem vorher ausgewählten Kulturmedium überleben.

3. Verfahren nach Anspruch 2 zum Screenen von Ribozymmutanten, wobei

(a) die mehreren Vektoren Ribozymmutanten kodieren;

(b) das Überleben der Zellen von der Spaltung einer Haarnadelstruktur, die in der Messenger-RNA enthalten ist, durch ein Ribozym abhängt, wobei die Spaltung die Sekundärstruktur der Messenger-RNA dahingehend ändert, daß eine Ribosomen-Bindungsstelle freigelegt wird und die Translation einer Sequenz der Messenger-RNA, die für ein Polypeptid kodiert, ermöglicht, was den Zellen in dem vorher ausgewählten Kulturmedium das Überleben ermöglicht, und wobei die Zellen, die überleben, ausgewählt werden, um die Nukleotidsequenz der wirksamsten Ribozymmutanten zu bestimmen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Polypeptid eine Antibiotikaresistenz bewirkt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Messenger-RNA eine ermC-Messenger-RNA ist, die für Leader- und Methylasepolypeptide kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle eine einzelne Kopie des ermC-Gens enthält.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor ein Plasmid ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen Bakterien sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bakterien B. subtilis sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die Synthese des Ribozyms unter der Kontrolle eines Operators ist und ein Induktor in einer Menge zugegeben wird, die bewirkt, daß nur einige der Zellen aufgrund einer wirksamen Spaltung der Messenger-RNA durch das Ribozym überleben.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ribozym einen Transkriptionsterminator enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Transkriptionsterminator der hauptsächliche rho-abhängige Transkriptionsterminator des comG-Gens von B. subtilis ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei bakterielle Zellen bereitgestellt werden, die eine Messenger- RNA exprimieren, die eine Spaltungsstelle in einer Haarnadelschleife der ermC-Leader-Messenger-RNA enthält, die Spaltung dieser Stelle durch ein Ribozym eine Veränderung in der Struktur der ermC-Messenger-RNA bewirkt und eine Ribosomenbindungsstelle freilegt, um die Synthese von Methylase zu ermöglichen, die in ausreichender Menge bewirkt, daß die Zelle in den vorher ausgewählten Kulturmedien überlebt, welche die Macrolid-Lincosamid-Streptogramin-B-(MLS)- Antibiotika enthalten.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ribozyme vom Haselhoff-Gerlach-Typ sind.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die durch das Ribozym spaltbare Sequenz GUC, GUU oder GUA ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die durch das Ribozym spaltbare Sequenz GUC ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 16, wobei die Zellen in Medien kultiviert werden, die das MLS-Antibiotikum Tylosin enthalten.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 17 zum Screenen von Haselhoff-Gerlach-Ribozymen, wobei die Spaltstelle eine nicht native Spaltstelle ist, die sich etwa an der Position 109 der Haarnadelschleife der ermC-Leader-Messenger-RNA befindet, wobei die Spaltung dieser Stelle durch Ribozyme, die in den Zellen induzierbar exprimiert werden, bewirkt, daß die Zellen in vorher ausgewählten Kulturmedien, die Tylosin enthalten, überleben.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Sequenz in der ermC Haarnadelschleife, welche die spaltbare Stelle enthält, eine Zielsequenz ist, die nicht eine natürliche ermC- Sequenz ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die nicht ermC- Sequenz eine HIV-1-RNA-Sequenz ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die HIV-1-Sequenz aus dem Integrase-Gen stammt.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Expression des Ribozyms unter der Kontrolle eines lac-Operators ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ribozym durch ein rekombinantes Plasmid exprimiert wird, das einen spac-Promotor enthält.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vektoren für Ribozyme kodierende DNA enthalten, die in einem DNA-Synthetisiergerät hergestellt wird, das Nukleotidvorläufer aus vier Lösungen auswählt, um die Oligonukleotide durch allmähliche Zugabe zu konstruieren, und wobei ein Gemisch von Nukleotiden in mindestens einer der vier Lösungen eingesetzt wird, um Nukleotide während der allmählichen Zugabe statistisch einzubauen, wobei verschiedene zu screenende Oligonukleotide erzeugt werden.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Gemische von Oligonukleotid-Vorläufern in allen vier Lösungen verwendet werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei jedes der vier Gemische von Oligonukleotid-Vorläufern etwa 85% Wildtyp- Vorläufer und etwa 5% jedes der verbleibenden drei Oligonukleotid-Vorläufer umfaßt.