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DE69122777T2 - Zielgerichtete spezifische antikörper-superantigen konjugate und ihre präparation - Google Patents

Zielgerichtete spezifische antikörper-superantigen konjugate und ihre präparation

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DE69122777T2
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DE69122777T
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Mikael S-223 52 Lund Dohlsten
Gunnar S-223 51 Lund Hedlund
Terje S-240 21 Loeddekoeping Kalland
Eva S-752 52 Uppsala Kerblom
Peter S-214 34 Malmoe Lando
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Active Biotech AB
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Pharmacia and Upjohn AB
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörperkonjugate, welche die Fähigkeit besitzen, zytotoxische T-Zellen (CTLs) zu aktivieren. Die Konjugate sind für die Zerstörung unerwünschter Zellen, welche u.a. mit Krebsformen, Autoimmunerkrankungen, parasitischen Infestationen und bakteriellen, viralen und Pilz-Infektionen in Verbindung stehen, nutzbar.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wurden Versuche im Laufe der letzten Jahre unternommen, Antikörper in Kombination mit Mitteln, welche eine toxische Wirkung direkt auf Zielzellen ausüben (zytotoxische Mittel, Zytotoxine), zu verwenden, um eine selektive Wirkung auf Zielzellen zu schaffen und die unspezifische Wirkung auf andere Zellen zu verhindern oder zu verringern. Die vorgeschlagenen Kombinationen erstreckten sich von kovalent gebundenen Komplexen unter Verwendung von die Bindung herstellenden Molekülen und nicht kovalent gebundenen Komplexen bis zu einfachen Gemischen (z.B. Ghose et al., J. Natl. Cancer Inst. 61(1979)657-676 und Carlsson et al., Biotechnology 7(1989) 567-73). Vorgeschlagene Zytotoxine waren u.a. Diphterietoxin, Ricin, Untereinheit A von Ricin, Gelonin und Pseudomonas aeroginosa Exotoxin A (Takeda Chemical Ind., EP-A-336,405 und Pastan et al., WO-A-88/00703 und US-A-4,545,985 und Neorx, EP-A-306,943).
  • Mit dem Emporkommen der Hybridomtechnologie und der begleitenden Verfügbarkeit von monoklonalen Antiköpern war es möglich, das Konzept von Komplexen zwischen Antikörpern und zytotoxischen Mitteln dazu zu verwenden, um die zytotoxischen Mittel genauer auf die beabsichtigte Zielzellpopulation zu lenken.
  • In Hinblick auf die anerkannt zerstörende Wirkung von zytotoxischen Mitteln auf andere Zellen als die Zielzellen, hat man vorgeschlagen, die zytotoxischen Mittel mit Immunstimulatoren, welche T-Lymphozyten auslösen und CTLs aktivieren, zu ersetzen. Spezifische Vorschläge haben sich mit Antikörpern befaßt, welche mit
  • (i) Antikörpern, die gegen einen T-Zellrezeptor gerichtet sind, oder Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, sich an einen T-Zellrezeptor zu binden, (Mass. Inst. Techn., EP- A1-180,171);
  • (ii) Verbindungen, wie Antigene, Mitogene, andere Fremdproteine und Peptide, die zytotoxische T-Zellen aktivieren (Neorex Corp., EP-A1-334,300);
  • (iii) MHC-Antigenen (Behringwerke AG, EP-A1-352,761);
  • (iv) Antigenen, gegen welche das zu behandelnde Individuum immun ist (Med. Res. Counc. WO-A-90/11779 (veröff. 1990- 10-18)); und
  • (v) einem ungenannten bakteriellen Enterotoxin (Ochi und Wake, UCLA-Symposium: Cellular Immunity and the Immunotherapie of Cancers, 27. Jänner - 3. Februar 1990, Abstract CE 515. Seite 109) konjugiert sind.
  • Die hierfür vorgeschlagenen Immunstimulatoren waren entweder zu spezifisch oder zu allgemein in ihrer Wirkung. Beispielsweise aktivieren klassische Antigene nur etwa 1 von 10&sup5; T-Zellen, wohingegen Mitogene potentiell fähig sind, einen Großteil der T-Zellen zu aktivieren.
  • Es wurde erkannt, daß bestimmte Mittel die Aktivierung eines mäßigen Verhältnisses an T-Zellen vermitteln; d.i. sie aktivieren T-Zellen in einer relativ hohen Häufigkeit, aber weit entfernt von 100% (Fleischer et al., J. Exp. Med. 167 (1988)1697-1707; und White et al., Cell 56(1989)27-35, beide Artikel sind als Literaturhinweis miteingeschlossen). Diese Arten Mittel sind wirksamere Aktivatoren als klassische Antigene und wurden dementsprechend Superantigene genannt (siehe zum Nachschlagen Kappler und Marrak, Science 248:705,(1990)). Es wurde weiters gezeigt (Dohlsten et al., Immunol. 71(1990) 96-100; und Hedlund et al., Cell. Immunol 129(1990)426-34, beide Artikel sind als Literaturhinweise miteingeschlossen), daß die soweit bekannten Superantigene die Fähigkeit besitzen, sich an MHC Moleküle der Klasse II an Zielzellen zu binden und zytotoxische T-Zellen zu aktivieren, welche die eigentliche V-Beta-Kette des T-Zellrezeptors tragen. Die veröffentlichten Werte zeigen, daß die MHG Bindung eine Voraussetzung für eine T-Zellbindung und für das Auftreten einer Aktivierung ist. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß in Zukunft Superantigene gefunden werden, die durch eine V- alpha-Kette eines T-Zellrezeptors oder andere Oberflächenstrukturen, die nur auf Subpopulationen von T-Zellen gefunden werden, wirken.
  • Die immunmodulatorische Wirkung des Superantigens Staphylococcus Enterotoxin A (SEA) wurde ebenfalls von Platsoucas et al (Cell Immunol. 97(1986)371-85) beschrieben.
  • Die meisten der zur Zeit bekannten Superantigene wurden früher als Toxine erkannt und diese waren alle mikrobiellen Ursprungs. Staphylokokkenenterotoxine sind beispielsweise enterotoxisch und aktivieren T-Zellen, und die zwei Wirkungen sind voneinander unterscheidbar (Fleischer et al., Cell. Immunol. 118(1989)92-101; Alber et al., J. Immunol 144(1990) 4501-06; und Infect. Immun. 59(1991)2126-34).
  • Es wurde früher vorgeschlagen, Superantigene zu verwenden, um eine CTL-vermittelte Lyse von Zellen, welche MHC Klasse II Antigene tragen, auszurichten (Pharmacia AB, WO-A- 91/04053, veröff. 1991-04-04). WO-A-91/04053 berichtet über Superantigene, die in kovalente Immunkonjugate inkorporiert sind, erwähnt sie jedoch nicht ausdrücklich.
  • Zellen, denen MHC Klasse II fehlt, oder welche geringfügige Mengen Proteine der MHC Klasse II exprimieren, binden jedoch nicht genügend Menge an Superantigenen, um in wirksamer Weise deren Lyse durch CTLs auszurichten. Auf Grund des allgemeinen Überflusses an Zellen, welche MHC Klasse II Antigene tragen, und des Mangels an MHC Klasse II Antigenen an den meisten Tumorzellen, sollten Superantigene daher von geringem Wert für das spezifische Abtöten von solchen unerwünschten Zellen sein.
  • Wir haben jedoch gefunden, daß eine spezifische zellabtötende, durch CTLs vermittelte Wirkung mit Superantigenen erzielt werden kann, falls sie an einen Antikörper, welcher gegen ein Epitop gerichtet ist, das für die abzutötende Zelle spezifisch ist, kovalent gebunden sind. Die Aktivierung des Immunsystems kann Zielzellen, denen MHC Klasse II Antigene fehlen, anregen, diese zu exprimieren, was die erwünschte lytische Wirkung steigern kann.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung schafft neue Antikörper- Konjugate,
  • (i) umfassend (1) einen gegen Zielzellen gerichteten Antikörper und (2) ein Superantigen, d.i. eine Struktur, die erkannt wird, die (einwirken auf oder binden an) und T-Zellen, insbesondere CTLs, aktivieren;
  • (ii) Methoden zum Zerstören von Zielzellen, insbesondere in Verbindung mit therapeutischen Behandlungsmethoden, die für Säuger in Betracht gezogen werden, und zur spezifischen Aktivierung von T-Zellen, wie CTLs;
  • (iii) eine Methode der Synthese der Konjugate; und
  • (iv) pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Konjugate enthalten, und Herstellungsmethoden für die Zusammensetzungen.
  • Die Methoden zur Zerstörung von Zielzellen umfassen therapeutische Behandlungsmethoden für Krebs, Autoimmunität, virale Infektionen, bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen, parasitische Infestationen und andere Erkrankungen, deren Gegenstand es ist, bestimmte Zellen mit einem hohen Genauigkeitsgrad abzutöten. Die erfindungsgemäßen Konjugate können zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet werden, welche zur Zerstörung von mit den soeben angeführten Erkrankungen in Verbindung stehenden Zielzellen verwendet werden sollen. Die zu behandelnden Individuen sind normalerweise Tiere, vor allem Menschen.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Superantigenteil des Konjugats
  • Die neuen Antikörperkonjugate sind durch die Struktur, welche von den T-Zellen als Superantigen erkannt wird, gekennzeichnet. Die Konjugate sind normalerweise bei physiologischem pH löslich und in vitro sind sie im Serum löslich.
  • Bevorzugte Superantigene sind aus der Gruppe der Staphylokokkenenterotoxine (SE), wie SEA, SEB, SEC, SED und SEE, Toxoiden, aktiven Fragmenten oder Peptiden hiervon und anderen Substanzen mit im wesentlichen derselben Wirkungsweise zur Aktivierung von CTLs ausgewählt. Die Superantigene können andere mikrobielle Produkte (bakterielle genauso wie virale) wie Produkte von Staphylokokkenketten, z.B. Toxine des toxischen Schocksyndroms (TSST-1), von Streptococci, z.B. pyrogenes Exotoxin A, und bakterielle Exoproteine und durch Mycoplasma Arthritis erzeugte Proteine umfassen, welche eine ähnliche Kapazität aufweisen, mit T-Zellen in derselben Weise wie Superantigene in Wechselwirkung zu treten. Superantigene können durch Kultivierung ihrer natürlichen Bildner oder gentechnisch hergestellter Zellen (rekombinante Techniken) oder potentiell auch durch synthetische Peptidsynthese erhalten werden. Ein erfindungsgemäß verwendbares Superantigen sollte, wenn es im in dieser Beschreibung dargestellten Versuchsmodell verwendet wird, Wirkungen ausüben, die in Analogie mit dem, was wir im experimentellen Teil dieser Beschreibung darstellen, stehen.
  • Die bevorzugten Superantigene haben die potentielle Fähigkeit, bis zu etwa 1-40% der Isoformen eines polymorphen T-Zell-Oberflächenproteins, verbunden mit der Aktivierung von CTLs, vorzugsweise der V-beta-Kette des T-Zellrezeptors, zu binden.
    • Der Antikörperteil der Konjugate
  • Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper (mab), obgleich polyklonale verwendet werden können, solange sie eine genügend enge Spezifität schaffen. Die Bezeichnung Antikörper bezieht sich auf Antikörper im allgemeinen und umfaßt somit aktive Fragmente von Antikörpern und andere Moleküle, welche die Bindungsfähigkeit eines Antikörpers nachahmen, unter der Voraussetzung, daß sie die geeignete Spezifität, Bereitschaft und Affinität gegenüber der in Frage stehenden Zielzelle haben. Dies umfaßt gentechnisch hergestellte (rekombinant hergestellte) Antikörper und Antikörperderivate oder andere ähnlich bindende Strukturen. In der einen Ausführungsform ist der Antikörper spezifisch für eine Antigendeterminante an Tumorzellen, beispielsweise einer mit einem Dickdarmkarzinom verbundenen Determinante (Epitop, Struktur). Es ist auch denkbar, daß der Antikörper für eine Antigendeterminante an für Autoimmunität verantwortlichen Zellen, virusinfizierten Zellen, Bakterien, Parasiten oder Pilzen oder anderen unerwünschten Zellen spezifisch sein kann. Abhängig von der Wirksamkeit des Konjugats, kann der Antikörper auf ein Antigen gerichtet werden, das den Antikörper nach der Bindung einverleibt, obwohl angenommen wird, daß solche Antikörperspezifitäten nicht bevorzugt werden.
  • Monoklonale, in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung untersuchte Antikörper sind der C215 Antikörper, der gegen ein Antigen in der GA-733 Familie gerichtet ist (siehe beispielsweise EP-A-376,746 und darin zitierte Literaturhinweise und Larsson et al., Int. J. Canc. 42(1988)877-82), der C242 Antikörper (Larsson et al., Int. J. Canc. 42(1988)877- 82) und der Thy-1.2 Antikörper (mab C, Opitz et al., Immunobiol. 160(1982)438-). Es ist denkbar, daß mabs mit Spezifitäten für andere Zielzell-Oberflächenstrukturen brauchbar sind. Die Herstellung von Monoklonalen, welche gegen für ausgewählte Zielzellen einzigartige Epitope gerichtet sind, ist im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise die obgenannten Veröffentlichungen. Bezeichnungen, wie gegen das C242 Epitop oder das C215 Epitop gerichtete monoklonale Antikörper, umfassen Antikörper, welche mit kreuzreagierenden Epitopen reagieren.
  • Von den bis jetzt getesteten drei Monoklonalen sind C215 Konjugate höchstwahrscheinlich von geringerer Wichtigkeit, da sie mit einem Epitop an einem Tumorantigen, das häufig auch von normalen Zellen exprimiert wird, reagieren. C242 Konjugate scheinen besser auf Werten der Spezifität zu basieren, obwohl unsere Ergebnisse anzeigen, daß sie höhere Dosierungen erforden. Gegen Thy-1.2 gerichteter mab C ist möglicherweise von geringem Wert zum Anpeilen menschlicher Krebszellen, da das Thy-1.2 Antigen für eine nicht menschliche Säuger-Tumorzelle spezifisch ist.
  • Eine Hybridomzell-Linie, welche den monoklonalen Antikörper C242 erzeugt, wurde am 26. Jänner 1990 unter der Nummer ECACC 90012601 an der European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wilts, U.K. hinterlegt.
    • Die das Superantigen an den Antikörper bindende Struktur
  • Bei dem bevorzugten, erfindungsgemäßen Konjugat ist das Superantigen an das Antigen durch eine kovalente Bindung (-B-) kovalent gekoppelt. Falls es wichtig ist, daß das Konjugat sich nicht zersetzt, wenn es an die abzutötenden Zellen verabreicht wird, beispielsweise an ein Tier, sollte die Bindung im wesentlichen für eine ausreichende Zeitspanne stoffwechselstabil sein, damit die Wirkung erzielt werden kann. Weiters ist von Vorteil, daß die Bindung als solche selbst keinen Anlaß für immunologische Reaktionen gibt. Im allgemeinen soll die Bindung inert in dem Sinne sein, daß das Konjugat eine effiziente Zielzellbindungsspezifität (antitumor, antiviral usw.) und eine effiziente Fähigkeit, zytotoxische T-Zellen zu aktivieren, behält.
  • In der Wissenschaft, genauso wie in der Patentliteratur, wurden einige funktionelle Gruppen für die Bindungsstrukturen von Immunkonjugaten vorgeschlagen. Demgemäß kann die Bindung -B- in unseren neuen Konjugaten Strukturen enthalten, welche aus der Gruppe bestehend aus
  • (i) Amiden und Hydraziden (Amide -CONR&sub1;- oder NR&sub1;CO-, worin jede der freien Valenzen an ein gesättigtes Kohlenstoffatom bindet, und R&sub1; Wasserstoff oder ein Alkylsubstituent, wie niedrig Alkyl (C&sub1;&submin;&sub6;), oder der alpha-N-Substituent einer natürlich vorkommenden alpha-Aminosäure, vorzugsweise einer hydrophilen Aminosäure, sein kann und Hydrazide = -CONHNH- oder -NHNHOC-, worin jede der freien Valenzen an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist);
  • (ii) Thioethern und Disulfiden (-Sr-, worin jede der freien Valenzen jeweils direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom bindet und S ein Schwefelatom und r eine ganze Zahl 1 oder 2 ist);
  • (iii) geraden, verzweigten oder ringförmigen Kohlenwasserstoffketten, welche gesättigt sind und welche möglicherweise mit einer oder mehreren Hydroxy- oder Aminogruppen substituiert sein können;
  • (iv) Ethern (-O-, worin jede der freien Valenzen direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom bindet); und
  • (v) primärem Amin oder disubstituiertem Hydrazin (-NH- beziehungsweise -NH-NH-, worin jede der freien Valenzen direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom bindet).
  • Die Länge der Brücke sollte innerhalb der Bereiche liegen, welche normalerweise auf technischem Gebiet in Betracht gezogen werden, d.i. kürzer als 180 Atome, wie < 100 Atome, jedoch länger als 3-6, vorzugsweise länger als 16 Atome.
  • Die bevorzugte Bindung ist hydrophil und sollte keinen aromatischen Ring enthalten. Bevorzugte hydrophile Strukturen, die Teil der Bindung -B- bilden können, sind: (i) Polypeptidketten der natürlich vorkommenden hydrophilen alpha- Aminosäuren (z.B. Asparaginsäure und ihre Amide, Glutaminsäure und ihre Amide, Lysin, Arginin, Glycin, Threonin, Serin und möglicherweise auch Histidin); (ii) Oxaalkylenketten, wie (-O(CH&sub2;)n)n'-, worin n eine ganze Zahl von 2-5, vorzugsweise 2-3, ist und n' eine ganze Zahl von 1-20 sein kann; und (iii) -S- (Thioether), -O- (Ether) und unsubstituierte Amide (-CONH-), wobei alle diese an kurze, unsubstituierte Kohlenwasserstoffketten (C&sub1;&submin;&sub4;), vorzugsweise 1 oder 2 Kohlenstoffatome enthaltend, gebunden sind.
  • Hydrophile Aminosäuren können in hydrophilen Strukturen des Typs (F-(Pro)n)mF vorliegen, worin F eine Aminosäuresequenz, vorzugsweise 4-8 Reste, darstellt, in welcher jede Aminosäure einzeln aus Serin, Glycin und Threonin ausgewählt wird, m eine ganze Zahl von 1-4 ist und n eine ganze Zahl von 4-8 ist (Cetus Corp., WO-A-85/03508).
  • Die Bindung -B- kann entweder an bestimmten Stellen im Antikörper- oder Superantigenteil des Konjugats oder wahllos gebunden sein. Potentielle Stellen sind ein endständiges Amino, endständiges Carboxy und ein Lysinrest (omega-Aminogruppe). Falls der Antikörper oder das Superantigen eine Thiolgruppe oder Disulfidgruppe (Cystin beziehungsweise Cystein) tragen, können diese Gruppen auch zur kovalenten Kopplung verwendet werden, außer sie sind für die Aktivität des aktiven Teils des Konjugats nicht essentiell. Wenn sie vorliegen, können Kohlenwasserstoffstrukturen zu Aldehydgruppen oxidiert werden, die ihrerseits zur Bindung des anderen Teils des Konjugats verwendet werden können (cf. Cetus Corp., EP-A-240,200).
  • Das erfindungsgemäße Konjugat sollte keine bedeutende Menge an Esterbindungen und labilen Amidbindungen, die insbesondere nicht mit Tyrosin beziehungsweise Histidinresten gebildet sind, enthalten. Falls solche Bindungen während der Synthese gebildet wurden, können sie unter Verwendung von Hydroxylamin entfernt werden (Endo et al., Cancer Res. 48(1988)3330-3335).
  • Die Anzahl der Superantigenteile, die pro aktivem Antikörperteil vorliegen kann, ist normalerweise 1-5, vorzugsweise 1 oder 2.
  • In einer der bevorzugten Arten soll die Konjugatsubstanz in Hinblick auf das Superantigen pro Antikörper und/oder die in den Superantigen- beziehungsweise Antikörperteilen verwendeten Bindungsstellen und/oder die Bindung -B- im wesentlichen einheitlich sein. In anderen Worten, sollten alle einzelnen Konjugatmoleküle in der Konjugatsubstanz in Bezug auf diese Variablen gleich sein.
  • Die Substanz sollte im wesentlichen frei von nicht konjugierten Antikörpern oder nicht konjugierten Superantigenen sein.
  • Das genaue Verhältnis von Superantigen zu Antikörper, Bindungsstruktur usw. für das optimale Konjugat hängt von dem ausgewählten Monoklonal (einschließlich Klasse, Unterklasse, Erzeugerklon, Spezifität) und dem ausgewählten Superantigen ab. Die in dieser Beschreibung angeführten experimentellen Modelle erlauben auch für andere Superantigene und andere Antikörper das Auffinden optimaler Parameter.
  • Gemäß der bis zum Anmeldedatum umfassendst untersuchte erfindungsgemäße Ausführungsform, besteht die Bindung -B- aus der Struktur
  • -SrRCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCOY- (I)
  • Die freien Valenzen in dieser Formel I binden jeweils an die aktiven Teile. Dies findet entweder direkt oder durch weitere divalente, inerte Strukturen, die in der Brücke -B- enthalten sind, statt.
  • n ist eine ganze Zahl > 0, z.B. 1-20, vorzugsweise 2 oder > 2 und in vielen Fällen < 10. m ist 1 oder 2.
  • S ist ein Schwefelatom und ist mit jeder seiner Valenzen direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden (-Sr- = ein Thioether oder ein Disulfid). r ist eine ganze Zahl 1 oder 2.
  • Y ist -NH-, -NHNH- oder -NHN=CH-, die an deren linken Enden an die CO-Gruppe, die in der Formel I am rechten Ende gezeigt ist, und an deren rechten Enden an ein gesättigtes Kohlenstoffatom oder an eine Carbonylgruppe (nur wenn Y gleich -NHNH-) gebunden sind.
  • R ist vorzugsweise Alkylen (mit 1-4 Kohlenstoffatomen, oft 1 oder 2 Kohlenstoffatome), das möglicherweise mit einem oder mehr (1-3, im bevorzugten Fall < 2) Hydroxygruppen (OH) substituiert ist.
    • Herstellung des Antikörper-Superantigen-Konjugats
  • Die erfindungsgemäßen Antikörperkonjugate können erhalten werden, indem sie aus Kulturmedien von Zellen, welche sie produzieren, oder aus anderen Medien, in welchen sie synthetisiert wurden, angereichert und gereinigt werden.
  • Die Synthese unserer neuen Konjugate kann durch im Stand der Technik bekannte Techniken zur Konjugatsynthese, d.i. gentechnisch (rekombinante Techniken) oder über den geeigneten Antikörper und das Superantigen durch klassische Kopplungsreaktionen an den geeigneten funktionellen Gruppen, durchgeführt werden. Die in Proteinen vorliegenden und normalerweise verwendeten funktionellen Gruppen sind:
  • (i) Kohlenwasserstoffstrukturen. Diese Struktur kann zu Aldehydgruppen oxydiert werden, die ihrerseits mit einer Verbindung, enthaltend die H&sub2;NNH- Gruppe, zur Bildung einer -C=NH-NH- Gruppe umgesetzt werden.
  • (ii) Thiolgruppe (HS-). Die Thiolgruppe kann mit einer Verbindung, enthaltend eine thiolreaktive Gruppe, zur Bildung einer Thioethergruppe oder Disulfidgruppe umgesetzt werden. Freie Thiolgruppen von Proteinen liegen in Cystinresten vor und können durch Thiolierung oder Disulfidspaltung in native Cysteinreste auf Proteinen eingebaut werden.
  • (iii) freie Aminogruppen (H&sub2;N-) in Aminosäureresten. Eine Aminogruppe kann mit einer Verbindung, enthaltend eine elektrophile Gruppe, wie eine aktivierte Carboxygruppe, zur Bildung einer Amidgruppe umgesetzt werden. Die freie Aminogruppe ist vorzugsweise ein endständiges Amino oder eine omega-Aminogruppe eines Lysinrests.
  • (iv) freie Carboxygruppen in Aminosäureresten. Eine Carboxygruppe kann in eine reaktive (aktivierte) Carboxygruppe umgewandelt werden und dann mit einer Verbindng, enthaltend eine Aminogruppe, zur Bildung einer Amidgruppe umgesetzt werden. Es müssen dann jedoch Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Amidbildung mit den Aminogruppen, die meist gemeinsam mit Carboxygruppen im selben Protein vorliegen, zu minimieren. Die freie Carboxygruppe ist vorzugsweise ein endständiges Carboxy oder eine Carboxygruppe einer zweiwertigen alpha-Aminosäure.
  • Die Verbindungen, welche eine H&sub2;NNH- Gruppe, eine thiolreaktive Gruppe, eine aktivierte Carboxygruppe oder eine Aminogruppe tragen, können bifunktionelle Kopplungsreagenzien oder ein Antikörper oder ein Superantigen sein. Die Gruppen sind direkt an gesättigte Kohlenstoffatome gebunden, mit Ausnahme der H&sub2;NNH- Gruppe, die als Alternative auch an einen Carbonylkohlenstoff gebunden sein kann. Die Gruppen können auf den Antikörper oder das Superantigen durch bekannte Derivatisierung eingebaut werden.
  • Rekombinante Techniken bieten effiziente Mittel zur Herstellung von Konjugaten, in welchen die Teile spezifisch von einer endständigen Carboxygruppe in einer Hälfte zu einer endständigen Aminogruppe in der anderen Hälfte miteinander verbunden sind. Es kann eine mit der angewendeten Technik übereinstimmende Bindungsstruktur eingeführt werden.
  • Die verwendeten Reagenzien sind so ausgewählt, daß sie die Bindung -B-, wie oben ausgeführt, schaffen. Übliche bifunktionelle Reagenzien haben die Formel Z-B'-Z', worin Z und Z' funktionelle Gruppen sind, die wechselweise miteinander verträglich sind und eine kovalente Kopplung an einer am Protein vorliegenden funktionellen Gruppe gestatten. Siehe oben. B' ist eine inerte Brücke, die dieselben Strukturen, wie oben für die Bindung -B- angegeben, enthalten kann. Insbesondere Z und Z' können gleich oder verschieden und aus einer Thiolgruppe, thiolreaktiven Gruppe, einem aktivierten Carboxy, -CONHNH&sub2; usw. ausgewählt sein. Zur Erklärung diese Gruppen siehe unten unter der Überschrift Neue Reagenzien.
  • Die Methode, welche wir für die im experimentellen Teil eingesetzten Konjugate verwendet haben, umfaßt die Stufen
  • (i) des Umsetzens des Antikörpers oder Superantigens mit einem organischen Reagens, enthaltend eine thiolreaktive Gruppe und eine aminoreaktive Gruppe, zur Bildung eines die thiolreaktive Gruppe tragenden Antikörpers oder Superantigens, und
  • (ii) des Umsetzens des restlichen Teils des Superantigens und des Antikörpers mit einem organischen Reagens, enthaltend eine Thiolgruppe oder eine geschützte Thiolgruppe und eine aminoreaktive Gruppe, zur Bildung eines die Thiolgruppe oder die geschützte Thiolgruppe tragenden Superantigens oder Antikörpers, worauf
  • (iii) die erhaltenen Produkte aus den Stufen (i) beziehungsweise (ii) miteinander zur Bildung eines Konjugats, in welchem das Superantigen mit dem Antikörper über ein Disulfid oder einen Thioether verbunden ist, umgesetzt werden.
  • Die Kopplungsbedingungen für jede Gruppe sind per se, wie in der Proteinchemie angewendet, bekannt. Die Kopplung kann stufenweise oder in einem Schritt unter Bildung funktioneller Zwischengruppen, die durch inerte Spacer-Arme mit dem Ausgangsmaterial verbunden werden, fortschreiten. Im allgemeinen sind die Bedingungen, unter welchen die Synthese und Reinigung/Gewinnung des Konjugats stattfinden, für die involvierten Proteine immer nicht-denaturierend. Dies bedeutet normalerweise ein wässeriges Medium und einen pH-Wert und eine Temperatur in den Bereichen pH 3-10 beziehungsweise 0º-50ºC. Die genauen Werte hängen von den umzusetzenden Gruppen und dem zu gewinnenden Konjugat ab. Siehe mehr unter der Überschrift Neue Reagenzien.
    • Neue Reagenzien (entwickelt in Verbindng mit der Erfindung)
  • Für die chemische Synthese von Konjugaten mit der Bindung -B- haben wir ein neues heterobifunktionelles Reagens entwickelt, das mit der allgemeinen Formel II übereinstimmt:
  • Z&sub1;RCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mZ&sub1;' (II)
  • m und n haben dieselbe Bedeutung, wie oben für Formel (I). Z&sub1; ist eine HS-reaktive, elektrophile Gruppe, Thiol (-SH) oder geschütztes Thiol (z.B. AcS-), unter der Maßgabe, daß eine Thiolgruppe und eine Hydroxygruppe nicht an ein und dasselbe Kohlenstoffatom in R gebunden sein dürfen. Beispiele für HS- reaktive, elektrophile Gruppen sind:
  • (i) Halogen, das an ein gesättigtes Kohlenstoffatom, vorzugsweise in Form eines alpha-Halogenalkylcarbonyls (z.B. Z&sub1;CH&sub2;CO-), gebunden ist;
  • (ii) aktiviertes Thiol, vorzugsweise ein sogenanntes reaktives Disulfid (-SSR&sub1;), das an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist;
  • (iii) 3,5-Dioxo-1-azacyclopent-3-en-1-yl.
  • Zur Definition eines reaktiven Disulfids siehe z.B. EP-A- 128,885, welche als Literaturhinweis miteinbezogen ist.
  • Z&sub1; ist ein aktiviertes Carboxy, d.i. eine elektrophile Gruppe. Beispiele sind Carbonsäurehalogenide (-COCl, -COBr und -COJ), gemischte Carbonsäureanhydride (-COOOCR&sub1;), reaktive Ester, wie N-Succinimidyloxycarbonyl, -C(=NH)-OR&sub2;, 4- Nitrophenylcarboxylat (-CO-OC&sub6;H&sub4;NO&sub2;) usw. R&sub1; und R&sub2; können niedrig Alkyl (C&sub1;-C&sub6;) und R&sub2; auch Benzyl sein.
  • Einer der Vorteile unserer neuen Reagenzien ist der, daß sie zu einheitlichen Konjugatsubstanzen in Bezug auf die ganze Zahl n in der Struktur (OCH&sub2;CH&sub2;)n führen, d.i. n ist für jedes einzelne Molekül einer gegebenen Konjugatsubstanz gleich.
  • Funktionelle Gruppen, welche mit Z&sub1;' und Z&sub1; reagieren, können an aktiven, nativen Antikörpermolekülen oder nativen Superantigenen vorliegen oder können an diese eingeführt werden. Die Z&sub1;'und Z&sub1; - Enden können dann selektiv mit dem geeigneten Antikörper oder Superantigen in einer für diese Arten von Gruppen an sich bekannten Weise umgesetzt werden.
  • Bekannte Techniken umfassen eine Kettenverlängerung, entweder ausgehend von unserem neuen Reagens oder von den zu konjugierenden Verbindungen.
  • Eine Kettenverlängerung unter Verwendung unseres neuen Reagens kann z.B. zu Konjugaten führe, in welchen -B-:
  • (1) - OR'-Sr-RCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCOY-; O ist an NH gebunden,
  • (2) -COR'-Sr-RCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCONHNH-R"NHN=-; N= ist gewöhnlich an einen sp²-hybridisierten Kohlenstoff, abgeleitet von einer oxydierten Kohlenwasserstoffstruktur, in einem Antikörper oder Superantigen (wenn es ein Glycoprotein ist) gebunden,
  • (3) - O(CH&sub2;)mO(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH&sub2;CH&sub2;NHCOR'-Sr-(fortges.) (fortges.)-RCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCOY-; - O- ist an NH gebunden,
  • (4) -CO(CH&sub2;)mO(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH&sub2;CH&sub2;NHCOR'-Sr-(fortges.) (fortges.)-RCONHCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCONHNH-R"NHN=; N= ist wie oben in (2) gebunden,
  • R, R' und R" sind Alkylen, ausgewählt in derselben Weise, wie R in Formel (I). r hat dieselbe Bedeutung wie oben.
  • Das Reagens (Formel II) kann ausgehend von Verbindungen hergestellt werden, die mit der Formel III überinstimmen:
  • NH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)nO(CH&sub2;)mCOOH (III)
  • m ist gleich einer ganzen Zahl 1 oder 2. n ist gleich einer ganzen Zahl 1-20, wie 2-20 oder 3-9.
  • Die Synthese gewisser Verbindungen, die mit der Formel III übereinstimmen, mit m = 1 und 2, und n = 1 - 10, wurde zuvor beschrieben (Jullien et al., Tetrahedron Letters 29 (1988)3803-06; Houghton und Southby, Synth.Commun. 19(18) (1989)3199-3209; und EP-A-410,280 (veröffentl. 20.1.91) und Slama und Rando, Carbohydrate Research 88(1981)213-221 und Biochemistry 19(1980)4595-4600).
  • Neue, mit der Formel II übereinstimmende Reagenzien können synthetisiert werden, indem eine Verbindung der Formel III mit einem, an sich bekannten, bifunktionellen Reagens der Formel Z-B'-Z' umgesetzt wird, worin Z = Z&sub1;, B' = R", der wie vorher für R und R' definiert ist, und Z'= ein wie oben definiertes, aktiviertes Carboxy. Nach der Reaktion wird die -COOH - Funktion in eine aktivierte Carboxygruppe, z.B. Z&sub1;' = aktivierter Ester, wie N-Succinimidyloxycarbonyl, 4-Nitrophenyloxycarbonyl, 2,4-Dinitrophenyloxycarbonyl usw., umgewandelt.
  • Die neuen Verbindungen der Formel (III) und ihre neuen Derivate stimmen mit Polyethern mit der allgemeinen Formel:
  • XCH&sub2;CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;-)nOCH&sub2;Y (IV)
  • überein, n ist eine ganze Zahl von 2-20, vorzugsweise 3-20 oder 3-9. X ist H&sub2;N-, einschließlich der protonierten Form hiervon (+H&sub3;N-) oder substituiertes H&sub2;N-, das, vorzugsweise durch Hydrolyse oder Reduktion in H&sub2;N- umwandelbar ist. Beispiele sind unsubstituiertes Amino (H&sub2;N-); Nitro; Amido (Carbamido), wie niedrig Acylamido (Formylamido, Acetylamido.... Hexanoylamido) einschließlich Acylamidogruppen, die elektronenabziehende Substituenten am alpha Kohlenstoffatom des Acylteils haben und dann insbesondere CF&sub3;CONH-, CH&sub3;COCH&sub2;CONH- usw; Phtalimidoyl, welches möglicherweise ringsubstituiert ist; Carbamato (insbesondere R&sub1;'OCONH- und (R&sub1;'OCO)(R&sub2;'OCO)N-, wie N-(t-Butyloxycarbonyl)amino (Boc), N- (Benzyloxycarbonyl)amino und di(N-Benzyloxycarbonyl)amino (Z beziehungsweise diZ), welche möglicherweise ringsubstituiert sind; Alkylamino, in welchem die Kohlenstoffatombindung zum Stickstoffatom alpha zu einem aromatischen System ist, wie N- Monobenzylamino und Dibenzylamino, N-Tritylamino (Triphenylmethylamino) usw., einschließlich analoger Gruppen, wo das Methylkohlenstoffatom (einschließlich Benzylkohlenstoffatom) durch ein Siliziumatom (Si) ersetzt ist, wie N,N-Di(tertbutylsilyl)amino; und 4-Oxo-1,3,5-triazin-1-yl, einschließlich solcher, die mit niedrig Alkyl in ihren 3- und/oder 5- Stellungen substituiert sind.
  • R&sub1;' und R&sub2;' stehen oben und weiterhin für niedrig Alkyl, insbesondere sekundäre und tertiäre Alkylgruppen, und eine Methylgruppe, die mit 1-3 Phenylgruppen, die möglicherweise ringsubstituiert sind, sububstituiert ist. Niedrig Alkyl- und niedrig Acylgruppen haben 1-6 Kohlenstoffatome.
  • Y ist Carboxy (-COOH, einschließlich -COO&supmin;) oder eine Gruppe, die in Carboxy, vorzugsweise durch Hydrolyse oder Oxidation, umwandelbar ist. Die wichtigsten Gruppen sind die Estergruppen, in welchen das Carbonylkohlenstoffatom oder das entsprechende Atom in orto-Estern an die Methylengruppe am rechten Ende der Formel (I) gebunden ist. Beispiele sind Alkylestergruppen (-COOR&sub1;'); orto-Estergruppen (-C(OR&sub3;')&sub3;) und wie oben definierte reaktive Estergruppen. R&sub3;' hat dieselbe Bedeutung wie vorher für R&sub1;' angegeben.
  • Andere Y-Gruppen sind -CHO, -CN, -CONH&sub2;, -CONR&sub1;'R&sub2;', worin R&sub1;' und R&sub2;' dieselbe Bedeutung wie vorher haben.
  • Die Verbindung aus Formel IV kann aus bekannten Ausgangsmaterialien durch an sich bekannte Kombinationsmethoden synthetisiert werden. Geeignete Syntheserouten sind:
  • A. Bildung der Kette.
  • B. Umwandlung von endständigen, funktionellen Gruppen.
  • C. Umwandlung eines symmetrischen Polyethers in einen unsymmetrischen Ether.
  • D. Spaltung einer bisymmetrischen Kette in zwei gleiche Fragmente.
  • Geeignete Ausgangsmaterialien mit der sich wiederholenden Einheit -OCH&sub2;CH&sub2;- sind im Handel erhältlich. Beispiele sind Oligoethylenglycole mit 2 bis 6 sich wiederholenden Einheiten. Andere passende Verbindngen mit gleichen endständigen Gruppen sind entsprechende Dicarbonsäuren und Diamine.
  • Geeignete Ausgangsmaterialien mit unterschiedlichen endständigen Gruppen sind omega-Hydroxymonocarbonsäuren, in welchen die endständigen Gruppen voneinander durch eine reine Polyethylenoxidbrücke getrennt sind. Solche Verbindungen mit bis zu 5 sich wiederholendenEinheiten wurden im Stand der Technik (Nakatsuji, Kawamura und Okahara, Synthesis (1981) S.42) beschrieben.
    • Pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Herstellung
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt Formulierungen, die als solche auf dem Gebiet bekannt sind, jetzt aber unser neues Konjugat enthalten. Somit können die Zusammensetzungen in Form eines lyophilisierten, teilchenförmigen Materials, einer sterilen oder aseptisch hergestellten Lösung, einer Tablette, einer Ampulle usw. sein. Träger, wie Wasser (vorzugsweise auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert, wie PBS) oder andere inerte Fest- oder Flüssigmaterialien, können zugegen sein. Allgemein ausgedrückt, werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem das Kunjugat mit einem oder mehreren wasserunlöslichen oder wasserlöslichen, wässerigen oder nicht wässerigen Trägern, falls nötig zusammen mit geeigneten Zusätzen und Hilfsmitteln, vermischt, darin gelöst, daran gebunden oder auf andere Weise damit kombiniert wird. Es ist dringend notwendig, daß die Träger und Bedingungen die Aktivität des Konjugats nicht nachteilig beeinträchtigen. Wasser als solches ist in der Bezeichnung Träger enthalten.
    • Verabreichung und Anwendungsmethoden
  • Normalerweise werden die Konjugate in vorgefertigten Dosen verkauft und verabreicht, wobei jede eine wirksame Konjugatmenge enthält, von der auf Grundlage des jetzt gezeigten Ergebnisses angenommen wird, daß sie im Bereich von 10 µg - 50 mg liegt. Die genaue Dosierung variiert von Fall zu Fall und hängt vom Gewicht und Alter des Patienten, dem Verabreichungsweg, der Art der Erkrankung, dem Antikörper, dem Superantigen, der Bindung -B- usw. ab.
  • Der Verabrichungsweg ist auf dem Gebiet allgemein bekannt, d.i. eine, eine Zielzelle lysierende, wirksame Menge oder eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Konjugats wird mit den Zielzellen in Berührung gebracht. Für die oben ausgeführten Indikationen bedeutet dies meistens parenterale Verabreichung, wie Injektion oder Infusion (subcutan, intravenös, intra-arteriell, intramuskulär) an ein Säugetier, wie den Menschen. Das Konjugat kann lokal oder systemisch an das zu behandelne Individuum verabreicht werden.
  • Mit "Zielzelle lysierende, wirksame Menge" ist gemeint, daß die Menge zur Aktivierung und Ausrichtung von CTLs zur Zerstörung der Zielzelle effektiv ist.
  • Die Erfindung wird in den beigefügten Patentansprüchen, die Teil der Beschreibung sind, gekennzeichnet. Die Erfindung wird nun durch eine Anzahl von Ausführungsformen, die das von uns entdeckte, allgemeine Konzept in keiner Weise einschränken, erläutert. Der experimentelle Teil zeigt in Teil I die chemische Synthese von Konjugaten und in Teil II die Wirkungen von in Beispiel 4 hergestellten Konjugaten auf die Aktivierung von T-Zellen zur Lyse von Zielzellen.
    • EXPERIMENTELLER TEIL. TEIL 1. HERSTELLUNG DER omega-AMINO-PEG-CARBONSÄURE. Isopropyl-8-hydroxy-3,6-dioxaoctanoat (1).
  • Natrium (23 g, 1,0 Mol) in Form von Plättchen wurde anteilsweise zu Diethylenglycol (500 ml) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Als das Natrium vollständig umgesetzt war, wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und Bromessigsäure (76 g, 0,5 Mol) unter Rühren zugesetzt. Nach 18 Stunden bei 100ºC wurde der Überschuß an Diethylenglycol bei etwa 4 mm Hg abdestilliert. Hiernach wurde Isopropylalkohol (400 ml) und anteilsweise Acetylchlorid (51 g, 0,65 Mol) zugesetzt. Nach dem Rühren während 18 Stunden bei 65ºC wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Natriumacetat (3,5 g, 0,15 Mol) neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat annähernd zur Trockene eingedampft, worauf es in Wasser (200 ml) gelöst wurde. Die wässerige Phase wurde mit 1,1,1- Trichlorethan (3x50ml) extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen wurden mit Wasser (20 ml) gewaschen. Das Produkt wurde aus den gesammelten wässerigen Phasen mit Dichlormethan (50 ml), das nach dem Abdampfen ein Öl ergab (55 g), extrahiert.
    • Isopropyl-11-hydroxy-3,6,9-trioxaundecanoat (2).
  • Natrium (23 g, 1,0 Mol) in Form von Plättchen wurde anteilsweise zu Triethylenglycol (700 ml) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Als das Natrium vollständig umgesetzt war, wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und Bromessigsäure (76 g, 0,5 Mol) unter Rühren zugesetzt. Nach 18 Stunden bei 100ºC wurde der Überschuß an Diethylenglycol bei etwa 4 mm Hg abdestilliert. Hiernach wurde Isopropylalkohol (400 ml) und anteilsweise Acetylchlorid (51 g, 0,65 Mol) zugesetzt. Nach dem Rühren während 18 Stunden bei 65ºC wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Natriumacetat (3,5 g, 0,15 Mol) neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat annähernd zur Trockene eingedampft, worauf es in Wasser (200 ml) gelöst wurde. Die wässerige Phase wurde mit 1,1,1- Trichlorethan (3x50ml) extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen wurden mit Wasser (20 ml) gewaschen. Das Produkt wurde aus den gesammelten wässerigen Phasen mit Dichlormethan (50 ml) extrahiert, das nach dem Abdampfen ein Öl ergab. ¹H-n.m.r.(CDCl&sub3;); 1,26(d,6H);3,07(s,2H);3,6-3,8(m,12H); 4,11(s,2H);5,09(m,1 H)
    • 8-(N-Phtalimidoyl)-3,6-dioxaoctanol (3).
  • 8-Chlor-3,6-dioxaoctanol (365 g, 2,2 Mol, hergestellt aus Triethylenglycol und SOCl&sub2;) wurde in Dimethylformamid (400 ml) gelöst und Kaliumphtalimid (370 g, 2,0 Mol) unter Rühren zugesetzt. Nach dem Rühren während 18 Stunden bei 110ºC wurde Dimethylformamid bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in Toluol (1,5 l) bei 40-50ºC suspendiert und Kaliumchlorid abfiltriert. Das Produkt kristallisiert beim Kühlen (-10ºC) aus. Eine zweite Fraktion ist durch Einengen der Mutterlauge und Wiederholen des Kristallisationsvorganges erhältlich.
  • ¹H-n.m.r.(CDCl&sub3;); 2,90(s,1H);3,51-3,56(m,2H);3,60-3,68 (m,6H);3,73-3,78(t,2H);3,89-3,94(t,2H);7,70-7,89(m,4H).
    • Isopropyl-17-(N-phtalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoat (4).
  • Eine Lösung von Pyridin (2,8 ml, 35 mMol) in Dichlormethan (30 ml) wurde unter Rühren bei etwa -5ºC tropfenweise zu einer Lösung von 8-(N-Phtalimidoyl)-3,6-dioxaoctanol (3) (8,5 g, 36 mMol) und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (10,2 g, 36 mMol) in Dichlormethan zugesetzt. Nach etwa 30 Minuten wurden die organischen Phasen mit 0,5 M Salzsäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen (Na&sub2;SO&sub4;) und Filtrieren wurden Isopropyl-8-hydroxy-3,6-dioxaoctanoat (1) (12 g, 48 mMol) und Na&sub2;PO&sub4; (6,5, 46 mMol) zugesetzt, und das Gemisch wurde während 20 Stunden heftig bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen 1,1,1-Trichlorethan und Wasser verteilt. Das Eindampfen der organischen Phase führte zu einem Öl (13 g).
  • ¹H-n.m.r.(CDCl&sub3;); &delta;1,26(d,6H);3,58-3,76(m,18H); 3,90(t,2H);4,11(s,2H);5,09(m,1H);7,70-7,89(m,4H).
    • 17-(N-Phtalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (5).
  • Isopropyl-17-(N-phtalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoat (4) (13 g) wurde in Tetrahydrofuran (50 ml) und Salzsäure (konz., 50 ml) gelöst. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit Wasser (200 ml) verdünnt, und Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck entfernt. Die Wasserphase wurde mit Toluol (1x) gewaschen und mit Dichlormethan (2x) extrahiert. Trocknen (Na&sub2;SO&sub4;) und Eindampfen der organischen Phase führten zu einem Produkt in Form eines Öls (8,5 g).
  • ¹H-n.m.r.(CDCl&sub3;); &delta;3,57-3,76(m,18H);3,91(t,2H); 4,11(s,2H);4,8(br,2H);7,65-7,90(m,4H).
    • Isopropyl-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoat (6).
  • 17-(N-Phtalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (5) (8,5 g) wurde in 150 ml Ethanol und 3 ml Hydrazinhydrat gelöst. Die Lösung wurde während 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf HCl (100 ml, 3M) zugesetzt und die Lösung sodann während 3 Stunden unter Rückfluß gehalten wurde. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur und Filtration, wurde das pH eingestellt (pH 9, NaOH) und das Filtrat annähernd zur Trokkene eingedampft. Wasser wurde zugesetzt und nochmaliges Eindampfen annähernd zur Trockene durchgeführt, worauf das pH der Lösung eingestellt wurde (pH 4, HCl), gefolgt von Eindampfen zur Trockene. Das Produkt wurde mit Isopropanol (100 ml) und Acetylchlorid (2 ml) über Nacht bei Raumtemperatur behandelt und eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser gesammelt und mit Dichlormethan bei alkalischem pH (7-11) extrahiert. Das Eindampfen führte zum Produkt (3,3 g). ¹H-n.m.r.(CH&sub3;OD): &delta;1,26(d,6H);3,17(t,2H);3,65-3,80(m,18H); 4,16(s,2H);5,07(m,1H) FORMELN VON SYNTHETISIERTEN AMINO-PEG-CARBONSÄUREN. Verbindung N-Phtalimidoyl
    • HERSTELLUNG VON BIFUNKTIONELLEN REAGENZIEN UND KOPPLUNGSPRODUKTEN
  • Die Strukturformeln sind auf einer separaten Seite angegeben.
    • Beispiel 1 Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von von 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure A. Herstellung von 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecansäure (A)
  • Isopropyl-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoat (siehe Teil I des experimentellen Teiles) (1,1 g; 3,2 mMol) wurden in 3 ml 1 M Natriumhydroxidlösung gelöst und 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es wurden 1,5 m l 6 M Salzsäure zugesetzt und das Gemisch zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und filtriert, wobei nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 545 mg 17-Amino- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure erhalten wurden. 460 mg (1,39 mMol) dieser Verbindung wurden in 10 ml Boratpuffer, pH 8,4, gelöst. Die Lösung wurde mit Stickstoffgas entlüftet. Eine Lösung von 432 mg (1,52 mMol) N-Succinimidyl-2-iodoacetat in 5 ml Dioxan wurde tropfenweise während 1 min zugegeben, das pH wurde durch Zusatz von 5 M NaOH auf 8,4 gehalten. Die Reaktionslösung wurde 15 min lang, während Stickstoffgas eingeleitet wurde, gerührt. Gemäß Dünnschichtchromatographie (Elutionsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;-MeOH 60:35) war die Umsetzung in einigen wenigen Minuten beendet. Nach 15 min wurde das pH der Lösung auf 3 eingestellt und die Lösung eingefroren und lyophilisiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf einer Phasenumkehrkolonne PEP-RPC HR 30/26 (Pharmacia Biosystems AB) unter Anwendung eines Gradienten von 0-13 % Acetonitril mit 0,1 % Trifluoressigsäure, gefolgt von einer isocratischen Trennung bei 13 % Acetonitril, 0,1 % TFA, fraktioniert. Die Fraktionen mit dem gewünschten Peak wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei 351 mg 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (A) erhalten wurden. Ausbeute: 76 %.
  • Die Struktur des Produkts wurde mit Hilfe seines NMR-Spektrums festgestellt. ¹H NMR Spektrum (D&sub2;O), ausgedrückt als &delta;- Werte:
    • B. Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von 17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (B)
  • Hydroxysuccinimid (4,5 mg; 39 µMol) wurde in eine Reaktionsampulle eingewogen. 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (A) (18,3 mg; 39 µMol) wurde in 0,55 ml getrocknetem Dioxan gelöst und zur Reaktionsampulle hinzugefügt. Die Reaktionsampulle wurde mit Stickstoffgas entlüftet, wonach tropfenweise eine Lösung von 8,0 mg (39 µMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,15 ml getrocknetem Dioxan in die Reaktionsampulle eingetragen wurde. Die Ampulle wurde mit Stickstoffgas gefüllt, verschlossen und ins Dunkle gestellt. Die Reaktionslösung wurde 3,5 h lang gerührt. Die gebildete Fällung wurde durch Fitration entfernt. Der Prozentanteil an gebildetem Produkt B im Filtrat wurde durch NMR-Analyse bestimmt und betrug 89 %.
    • Beispiel 2. Herstellung von (17-Iodoacetylamino- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)immunoglobulin (C) A. Monoklonaler Antikörper Mab C215
  • Ein monoklonaler Antikörper der Immunoglobulinklasse IgG2a (Mab C215) (34 mg; 0,218 µMol), gelöst in 17,7 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 8,1, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid, wurde in eine Reaktionsampulle eingetragen. 146 µl einer Dioxanlösung enthaltend 3,6 mg (6,4 µMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (B) wurden in die Pufferlösung injiziert und die Reaktion war unter Rühren während 25 min bei Raumtemperatur beendet. Die Reaktionsampulle wurde mit Folie abgedeckt, um das Licht zu vermeiden. Überschüssiges Reagens B wurde durch Fraktionieren an einer Sephadex G 25 K 26/40-Säule unter Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers, pH 7,5, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid als Elutionsmittel entfernt. Die das gewünschte Produkt C enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt. Die Lösung (22 ml) wurde in einer Amicon-Zelle durch ein YM 30-Filter auf 8 ml eingeengt. Die Konzentration und der Substitutionsgrad wurden durch Aminosäureanalyse bestimmt und betrugen 4,7 mg/ml bzw. 18 Spacer pro Mab C215.
    • B. Monoklonaler Antikörper Mab C242
  • Ein monoklonaler Antikörper (Mab C242) der Immunoglobulinklasse IgG 1 wurde mit dem 15-, 20- bzw. 22-fachen molaren Überschuß des N-Hydroxysuccinimidesters von 17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (B) nach der im Beispiel 2.A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt, wobei Nona-, Dodeca- und Tetradeca-(17-iodoacetylamino)-3,6,9,- 12,15-pentaoxaheptadecanoylamino-Mab C242 erhalten wurden (C).
    • C. Monoklonaler Antikörper Mab C
  • Ein monklonaler Antikörper Mab(C) der Immunoglobulinklasse IgG 2a wurde mit einem 14- bzw. 18-fachen malaren Überschuß des N-Hydroxysuccinimidesters von 17-Iodoacetylamino-3,6,9,- 12,15-pentaoxaheptadecansäure (B) nach der in Beispiel 2A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt, wobei Tetra- und Hepta- (17-Iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)- Mab C erhalten wurden. (C)
    • Beispiel 3. Herstellung von 2-Mercaptopropionylamino- Eu³-bezeichnetem Staphylokokkenenterotoxin A (SEA) A. Herstellung des Eu³-bezeichneten SEA (D)
  • SEA (ein gefriergetrocknetes Produkt der Toxin Technology Inc.) (2 mg; 72 nMol) wurde in 722 µl Milli-Q Wasser gelöst und in ein 15 ml Polypropylenrohr eingebracht. Es wurden 100 µl 0,1 M Boratpuffer, pH 8,6, und sodann 2160 nMol Eu³-Chelatreagenzien (Pharmacia Wallace Oy) in 178 µl Milli-Q hinzugefügt. Die Reaktion war über Nacht bei Raumtemperatur beendet. Überschüssiges Reagens wurde durch Fraktionierung der Reaktionslösung an einer Sephadex G 25 PD 10-Säule (Pharmacia Biosystems AB) unter Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers, pH 8,0, als Elutionsmittel entfernt. Die Fraktionen mit dem gewünschten Produkt D wurden gesammelt. Die Lösung (3 ml) wurde in einer Amicon-Zelle durch ein YM5-Filter auf ein Volumen von 0,8 ml eingeengt. Die Konzentration wurde mit Aminosäureanalyse bestimmt und betrug 1,7 mg/ml. Der Substitutionsgrad wurde durch Vergleich mit einer EuCl&sub3;- Standardlösung bestimmt und betrug 0,8 Eu³&spplus; pro SEA.
    • B1. Herstellung von 3-(2-Pyridyldithio)propionylamino Eu³&spplus;- bezeichnetem SEA (E) und 3-Mercaptopropionylamino Eu³&spplus;- bezeichnetem SEA (F)
  • Eu³&spplus;-SEA (1,24 mg; 44,8 nMol) in 0,75 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, wurde in ein 15 ml Polypropylenrohr eingetragen. 35 µl (180 nMol) einer Lösung von 1,6 mg N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-propionat in 1 ml Ethanol wurden zum Rohr hinzugefügt und die Reaktionslösung wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Produkt E wurde nicht isoliert, bevor es zum Produkt F reduziert wurde.
  • Die Reaktionslösung von oben wurde mit 20 µl 0,2 M Eu³&spplus;- Citratlösung und 50 µl 2 M Essigsäure versetzt, um das pH auf 5 einzustellen. Sodann wurde eine Lösung von 3,1 mg Dithiotreitol (Merck) in 0,1 ml 0,9 % Natriumchlorid hinzugefügt und die Reaktionslösung 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gesamtvolumen auf 1 ml durch Zusatz von 50 µl einer 0,9 % Natriumchloridlösung eingestellt. Die Reaktionslösung (1 ml) wurde auf eine Sephadex G25 NAP-10-Säule (Pharmacia Biosystems AB) aufgebracht und das gewünschte Produkt F wurde durch Zusatz von 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid, eluiert. Das eluierte Produkt F wurde in einem 15 ml Polypropylenrohr gesammelt und sofort in der Synthese des Produkts G verwendet, um eine Rückoxidation zu einer Disulfidverbindung zu vermeiden.
    • B2. Herstellung von 2-Mercaptopropionylaminostaphylokokkenenterotoxin A (SEA) (F2)
  • Natives SEA (gefriergetrocknetes Produkt der Toxin Technology Inc) oder rekombinant hergestelltes SEA (rSEA) wurde mit einem 2-fachen molaren Überschuß an N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat nach der in Beispiel 3B1 beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt.
  • Der Substitutionsgrad wurde durch UV-Analyse nach Carlsson et al (Biochem. J. 173(1978)723-737) bestimmt und betrug 1,9 Mercaptopropionylgruppen pro SEA.
    • Beispiel 4. Herstellung des SEA-monoklonalen Antikörperkonjugats (G1 och G2) A. Konjugate zwischen Eu³&spplus;-SEA und Mab C125 (G1)
  • Zu der in Beispiel 3B beschriebenen Lösung von 4-Mercaptopropionylamino Eu³&spplus; bezeichneten SEA (F) wurden 1,2 ml einer Lösung von Octadeca-(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C 215 (C) (4 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid, hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur beendet. Nicht umgesetzte Iodalkylgruppen wurden sodann durch Zusatz von 5 µl (1,2 µMol) einer Lösung von 20 µl Mercaptoethanol in 1 ml Wasser blockiert. Die Reaktionslösung wurde 4 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann filtriert. Das Filtrat wurde sodann auf einer Superose 12 HR 16/50-Säule (Pharmacia Biosystems AB) unter Verwendung eines 0,002 M Phosphatpuffers, pH 7,5, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid, fraktioniert. Die Fraktionen mit dem gewünschten Produkt G wurden gesammelt und analysiert. Der Proteingehalt, bestimmt durch Aminosäureanalyse, betrug 0,22 mg/l. Der Substitutionsgrad betrug ein SEA pro IgG, bestimmt durch Eu³&spplus;-Bestimmung. Das Produkt wurde auch auf seine immunstimulierenden Eigenschaften und Antikörper-Bindungskapazität untersucht.
  • Durch Erhöhung der Menge an Verbindung (F) in bezug auf Verbindung (C) wurde ein höherer Substitutionsgrad beobachtet.
    • B. Konjugate zwischen rSEA und Mab C215 (G2)
  • Octadeca(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C215 (C) wurde mit einem 1,8-fachen molaren Überschuß von 2-Marcaptopropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Die Zusammensetzung des Konjugats wurde durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE) auf Phast-Gel , Gradient 4-15, analysiert und die Bindungen wurden mit Phast IMAGE (Pharmacia Biosystems AB) abgetastet. Das erhaltene Konjugat bestand aus 6 % Mab C215 mit drei SEA, 15 % mit zwei SEA, 28 % mit einem SEA und 51 % unsubstituiertem Mab C215.
  • In einem anderen Versuch wurde ein 2,7-facher molarer Überschuß an F2 angewendet und ergab ein Konjugat mit der Zusammensetzung 15 % Mab C215 mit drei SEA, 25 % mit zwei SEA, 34 % mit einem SEA und 26 % unsubstituiertem Mab C215.
    • C. Konjugate zwischen rSEA und Mab C242
  • C1. Tetradeca(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C242 (C) wurde mit einem 3,2-fachen molaren Überschuß an 2-Mercapropropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Die Zusammensetzung des Konjugats wurde wie in Beispiel 4B beschrieben analysiert und bestand aus 4 % Mab C242 mit vier SEA, 12 % mit drei SEA, 28 % mit zwei SEA, 36 % mit einem SEA und 20 % ungesättigtem Mab C242.
  • Es wurde dieselbe Reaktion durchgeführt, das Reaktionsprodukt jedoch 4 h lang mit 0,2 M Hydroxylamin behandelt, bevor es in der Säule fraktioniert wurde, um unstabile Bindungen zwischen Mab C242 und dem Spacer und zwischen SEA und der Mercaptopropionylgruppe zu entfernen. Das gebildete Konjugat hatte die Zusammensetzung 1 % Mab C242 mit vier SEA, 12 % mit drei SEA, 27% mit zwei SEA, 36 % mit einem SEA und 24 % unsubstituiertem Mab.
  • C2. Dodeca(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C242 (C) wurde mit einem 3-fachen molaren Überschuß an 2-Mercaptopropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Das erhaltene Konjugat hatte die Zusammensetzung 6 % Mab C242 mit drei SEA, 26 % mit zwei SEA, 36 % mit einem SEA und 31 % unsubstituiertem Mab C242.
  • C3. Nona-(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C242 (C) wurde mit einem 3-fachen molaren Überschuß an 2-Mercaptopropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Das erhaltene Konjugat hatte die Zusammensetzung 13 % Mab C242 mit zwei SEA, 39 % mit einem SEA und 46 % unsubstituiertem Mab C242.
    • D. Konjugate zwischen rSEA und Mab C
  • D1. Hepta(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C wurde mit einem 5,4-fachen molaren Überschuß an 2-Mercaptopropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4A beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Die Zusammensetzung des Konjugats wurde wie in Beispiel 4B beschrieben analysiert und bestand aus 15 % mit vier SEA, 24 % mit drei SEA, 29 % mit zwei SEA, 19 % mit einem SEA, 3 % unsubstituiertem Mab C und 10 % in einer dimeren Form.
  • Dieselbe Reaktion wurde in Gegenwart von 0,2 M Hydroxylamin durchgeführt, um unstabile Bindungen zwischen Mab C und Spacer und zwischen SEA und der Mercapropropionylgruppe zu entfernen. Das gebildete Konjugat hatte die folgende Zusammensetzung 11 % Mab C mit drei SEA, 24 % mit zwei SEA, 30 % mit einem SEA, 18% unsubstituiertem Mab C und 17 % in einer dimeren Form.
  • D2. Tetra(17-iodoaetylamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C wurde mit einem 5,7-fachen molaren Überschuß an 2-Mercaptopropionylamino-rSEA (F2) nach der in Beispiel 4B beschriebenen Arbeitsweise umgesetzt. Das Konjugat hatte die folgende Zusammensetzung 8 % Mab C mit vier SEA, 18 % mit drei SEA, 30 % mit zwei SEA, 26 % mit einem SEA, 5 % unsubstituiertem Mab C und 12 % in einer dimeren Form.
    • Beispiel 5. Herstellung von [17-(3-Mercaptopropionylamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino]-rSEA (I) A. Herstellung von 17-[3-(2-Pyridyldithio)propionylamino]-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)-rSEA (H)
  • Eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von 17-[3-(2-Pyridyldithio)propionylaminol-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecansäure (K) (0,53 mg (896 nMol) in 43 µl Dioxan) wurde in eine Lösung von 3,67 mg (128 nMol) rSEA in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,9 % Natriumchlorid, injiziert. Die Reaktion war in 30 min bei Raumtemperatur beendet. 100 µl wurden für die Analyse des Substitutionsgrades entnommen, der Rest wurde gefriergelagert, bis er zum Produkt I reduziert wurde.
  • Der Substitutionsgrad wurde durch Entsalzen von 100 µl der Reaktionslösung auf einer Sephadex G50 NICK-Säule (Pharmacia Biosystems AB) und Analyse des Eluats durch UV-Spektroskopie nach Carlsson et al (Biochem. J. 173(1978)723-737) ermittelt. Es waren 2,7 Spacer an rSEA gekoppelt.
    • B. Herstellung von [17-(3-Mercaptopropionylamino)-3,6,9,- 12,15-pentaoxaheptadecanoylamino]-rSEA (I)
  • Das pH der Reaktionslösung mit Produkt H (0,9 ml) wurde mit 2 HCl auf pH 4,4 eingestellt und 2,9 mg Dithiotreitol, gelöst in 75 µl 0,9 % Natriumchlorid wurden hinzugefügt. Die Reduktion war in 30 min beendet. Die Reaktionslösung wurde auf eine Sephadex G25 NAP 10-Säule (Pharmacia Biosystem AB) aufgebracht und mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, mit 0,9 % NaCl eluiert und unmittelbar zur Synthese von Produkt J in Beispiel 11 verwendet.
    • Beispiel 6. Herstellung von SEA-monoklonalem Antikörperkonjugat J mit doppeltem Spacer
  • Dodeca(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)Mab C242 (C) (4,2 mg, 27 nMol in 1.0 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, mit 0,9 % NaCl) wurde während 43 h mit [17- (3-Mercaptopropionylamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoylamino)-rSEA (1) (1,17 mg, 42 nMol in 1 ml des obigen Puffers) in der Dunkelheit in einer Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Sodann wurden 1,14 µMol Mercaptoethanol hinzugefügt. Nach einer weiteren 1 h wurde die Reaktionslösung auf einer Superdex 200 HR 16/65-Säule fraktioniert. Das Produkt wurde mit 2 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, mit 0,9% NaCl eluiert. Die Fraktionen mit dem gewünschen Produkt J wurden gesammelt und wie in Beispiel 4B beschrieben analysiert. Das Konjugat bestand aus 9 % Mab C242 mit zwei SEA, 25 % mit einem SEA und 66 % unsubstituiertem Mab C242.
    • EXPERIMENTELLER TEIL II Wirkungen von Superantigen-Antikörper-Konjugaten auf Zellen
  • Das in den folgenden Versuchen verwendete bakterielle Toxin war Staphylococcus enterotoxin A (SEA), erhalten von Toxin Technologies (WI; USA) oder als rekombinantes Protein von E.Coli hergestellt.
  • Die Antikörper waren C215, C242 und Thy-1.2 mAbs. C215 ist ein IgG2a mAb, der gegen Zell-Linien von menschlichem Dickdarmkarzinom gezüchtet wurde, und mit einem 37kD Proteinantigen an einigen menschlichen Dickdarmzell-Linien reagiert. Literaturhinweise zu diesen mAbs wurden oben angeführt. Die Konjugate wurden wie im vorangehenden Teil hergestellt.
  • Vor dem Prioritätsdatum wurden Untersuchungen nur mit SEA-C215 mAb Konjugaten, die mit Eu³&spplus; bezeichnet waren, durchgeführt. Während des Prioritätsjahres wurden die Ergebnisse mit nicht bezeichneten SEA-215, SEA-242 und SEA- Thy-1.2 mAb Konjugaten bestätigt. Die nun angeführten Ergebnisse beziehen sich auf unbezeichnete Konjugate.
  • Zur Bestimmung der Zytotoxizität, vermittelt durch das SEA-C215 mAb Konjugat und das unkonjugierte SEA und dem C215 mAb, gegen Dickdarmkarzinomzellen, denen MHC Klasse II fehlt oder die geringe aber unbestimmbare Mengen MHC Klasse II exprimieren, haben wir verschiedene menschliche SEA-erweiterte T-Zell-Linien als Effektorzellen und eine Kultur Dickdarmkarzinomzellen und MHC Klasse II&spplus; Raji Zellen als Zielzellen verwendet. Den Dickdarmkarzinomzell-Linien Colo205, SW620 und WiDr fehlten allen die Expression von MHC Klasse II, wie durch Färbung mit mAb gegen HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ und durch FACS-Analse bestimmt wurde. Die SEA-erweiterten T-Zell- Linien wurden aus periphärem Blut durch wöchentliche Restimulationen mit Mitomycin C-behandelten Klasse II&spplus; BSM Lymphomzellen, die mit SEA in Gegenwart von rekombinantem IL-2 (20 Einheiten/ml) vorher umhüllt waren, gebildet. Diese T- Zell-Linien waren gegen mit SEA umhüllte Raji oder BSM Zellen stark zytotoxisch, aber nicht gegen nicht umhüllte Zellen oder mit Staphylokokkenenterotoxin B (SEB) umhüllte Zellen. Das durch SEA induzierte Abtöten ist abhängig von der Wechselwirkung von SEA mit MHC Klasse II an der Zielzelle, wie durch die Verwendung von blockierenden HLA-DR Antikörpern, MHC Klasse II&supmin; Raji Zellmutanten und HLA-DR transfizierten L- Zellen bestimmt wurde (Dohlsten et al., Immunology 71 (1990) 96-100. Diese T-Zell-Linien konnten zum Abtöten von C215&spplus; MHC Klasse II&supmin; Dickdarmkarzinomzellen durch das C215-SEA Konjugat aktiviert werden. Im Gegensatz dazu, waren unkonjugiertes SEA und C215 mAb nicht fähig, mehr als nur geringfügiges Abtöten durch T-Zellen gegen die C215&spplus; MHC Klasse II&supmin; Dickdarmkarzinomzellen zu induzieren. Die vom Staphylokokkenenterotoxin- Antikörper Konjugat abhängige zellvermittelte Zytotoxizität war von der Bindung des SEA-C215 mAb Konjugats an die C215&spplus; Tumorzellen abhängig. Die Spezifität dieser Bindung wurde durch die Tatsache gezeigt, daß überschüssiger, unkonjugierter C215 mAb, jedoch nicht die unbedeutenden C242 und w6/32 mAb, die Lyse der Dickdarmkarzinomzellen hemmen. CD4&spplus; und CD8&spplus; T-Zellen zeigten ein Abtöten von mit SEA-C215 behandelten C215&spplus; Dickdarmkarzinomzellen, lysierten jedoch nicht mit SEA behandelte Zellen. Die Wechselwirkung von T-Zellen mit SEA-C215 mAb Konjugat, gebunden an MHC Klasse II&supmin; Tumorzellen, scheint eine Wechselwirkung mit spezifischen V-beta TCR Sequenzen in ähnlicher Weise, wie früher für SEA induziertes Abtöten von MHC Klasse II&spplus; Zellen gezeigt wurde, zu beinhalten. Dies zeigte sich durch die Wechselwirkung einer SEA-spezifischen, jedoch nicht einer SEB-spezifischen, autologen T- Zell-Linie mit dem C215-SEA Konjugat. C242 mAb und Thy-1.2 mAb Konjugate zeigen eine Aktivität in Analogie mit dem C215 mAb Konjugat.
    • Bezeichnung mit Chrom und Inkubation der Zielzellen mit SEA
  • 0,75x10&sup6; Zielzellen und 150 µCi &sup5;¹Chrom (Amersham Corp., Arlington Hights, England) wurden während 45 minuten bei 37ºC in einem Volumen von 100 µl inkubiert. Die Zellen wurden im vollständigen Medium, enthaltend RPMI-1640 Medium (Gibco, Paisley, GBR), ergänzt mit 2,8% (Vol./Vol.) 7,5% NaHCO&sub3;, 1% Natriumpyrovat, 2% 200 mM L-Glutamin, 1% 1 M Hepes, 1% 10 mg/ml Gentamycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS, Gibco, Paisley, GBR), gehalten. Nach der Inkubation wurden die Zellen ein Mal im vollständigen Medium ohne FCS gewaschen und während 60 Minuten bei 37ºC inkubiert und gewaschen und im vollständigen Medium, enthaltend 10% FCS nochmals suspendiert. 5x10³ Zielzellen wurden jeder Vertiefung der U-Boden- Mikrotiterplatten zu 96 Vertiefungen zugesetzt (Costar, Cambridge, USA).
    • Zytotoxizitätsversuch
  • Die Effektorzellen wurden zu unterschiedlichen Effektor/Zielzell-Verhältnissen den Vertiefungen zugesetzt. Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung war 200 µl. Jeder Test wurde dreifach durchgeführt. Die Platten wurden 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, wonach das freigesetzte Chrom geerntet wurde. Die Menge an &sup5;¹Cr wurde in einem Gamma-Zähler bestimmt (Cobra Auto-gamma, Packard). Der Prozentsatz Zytotoxizität wurde durch die Formel % Zytotoxizität = (X-M)/(T- M) * 100 errechnet, worin X die in der Testprobe erhaltene Chromfreisetzung in cpm ist, M die spontane Chromfreisetzung von mit dem Medium inkubierten Zielzellen ist und T die Gesamtfreisetzung an Chrom, die durch Inkubieren der Zielzellen mit 1% Natriumdodecylsulfat erhalten wurde, ist.
    • ERGEBNISSE
  • SEA-C242, SEA-C215 und SEA-anti-Thy-1.2 mAb Konjugate binden sich an Zellen, welche die relevanten Epitope der jeweiligen mAbs exprimieren, und an MHC Klasse II&spplus; Zellen. Unkonjugiertes SEA verbindet sich andererseits nur mit MHC Klasse II&spplus; Zellen. Unkonjugierte C215, C242 und Thy-1.2 mAbs binden an die relevanten Zellen, aber nicht an Raji Zellen. (Tabelle 1)
  • Menschliche T-Zell-Linien lysierten die MHC Klasse II&supmin; SW620, Colo205 und WiDR Zellen in Gegenwart von SEA-C215 mAb Konjugat, jedoch nicht in Gegenwart von unkonjugiertem SEA und C215 mAb (Fig. 1). Die Lyse von Dickdarmkarzinomzellen war bei 10-100 ng/ml SEA-C215 mAb Konjugat zu sehen. Hohe Lysewerte bei verschiedenen Verhältnissen von Effektor zu Ziel wurden mit SEA-C215 mAb Konjugat gegen SW620 beobachtet (Fig. 1). Im Gegensatz dazu, vermittelte unkonjugiertes SEA oder C215 mAb bei allen getesteten Effektor zu Ziel - Verhältnissen keine Zytotoxizität gegen SW620 Zellen. Dies zeigt an, daß die Kapazität, MHC Klasse II&supmin; Colo205 Zellen zu lysieren, auf das Konjugat beschränkt ist und durch unkonjugiertes SEA und C215 mAb nicht induziert werden kann. SEA und das SEA-C215 mAb Konjugat, aber nicht der C215 mAb vermittelten das Abtöten durch T-Zellen von MHC Klasse II&spplus; Raji Zellen und von mit Interferon behandelten MHC Klasse II&spplus; Colo205 Zellen (Fig. 1).
  • Um zu zeigen, daß die vom SEA-C215 mAb Konjugat vermittelte Lyse eine spezifische Bindung des Konjugats zum C215 mAb Molekül an den Zielzellen miteinschließt, haben wir Blokkierungsuntersuchungen mit überschüssigem, unkonjugiertem C215 mAb und mAb C242 durchgeführt, welche sich an ein unbedeutendes Antigen an den Dickdarmkarzinomzellen (in Bezug auf die C215 mAb Bindung) binden. Zugabe von mAb C215 hat die Zytotoxizität stark blockiert, wohingegen der C242 mAb keinen Einfluß hatte (Fig. 2). In gleicher Weise wurde die Lyse durch ein SEA-C242 mAb Konjugat spezifisch durch einen Überschuß an unkonjugiertem C242 mAb, aber nicht durch C215 mAb, blockiert.
  • Die Kapazität vom SEA-C215 mAb Konjugat, eine T-Zellabhängige Lyse von MHC Klasse II SW640 Dickdarmkarzinomzellen zu induzieren, wurde bei den beiden CD4&spplus; und CDB&spplus; T-Zellpopulationen beobachtet (Tabelle 2). SEA hat keine dieser T-Zell- Teilmengen aktiviert, ein Abtöten von SW620 Zellen zu vermitteln, hat aber die Lyse von MHC Klasse II&spplus; Raji Zellen induziert (Tabelle 2).
  • Das SEA-C215 mAb Konjugat induzierte die Lyse von SW620 und Raji Zellen durch eine mit SEA erweiterte T-Zell-Linie, aber nicht durch eine mit SEB erweiterte T-Zell-Linie (Fig. 3). Die Spezifität der SEA- und SEB-Linien zeigt sich durch ihre selektive Antwort auf SEA beziehungsweise SEB, wenn sie an Raji Zellen ausgesetzt werden (Fig. 4). Dies zeigt an, daß das SEA-C215 mAb Konjugat ähnliche V-beta TCR Spezifität wie unkonjugiertes SEA behält.
    • Legende zu den Figuren
  • Fig. 1. Das SEA-C215 mAb Konjugat richtet CTLs gegen MHC Klasse II&supmin; Dickdarmkarzinomzellen. Die obere, linke Tafel zeigt die Wirkung von SEA responsiven CTLs gegen SW620 Zellen bei verschiedenen Effektor zu Ziel - Verhältnissen, in Abwesenheit (-) oder Anwesenheit von SEA-C215 mAb Konjugat, SEA, C215 und einem Gemisch aus C215 und SEA (C215+SEA) bei einer Konzentration von 1 µg/ml jedes Zusatzes. Die anderen Tafeln zeigen die Kapazität von SEA-C215 mAb Konjugat und SEA, SEA responsive CTLs gegen die C215+MHC Klasse II&supmin; Dickdarmkarzinomzell-Linien SW620, Colo205 und WiDr, mit Interferon behandelte MHC Klasse II&spplus; C215&spplus; Colo205 Zellen und C215-MHC Klasse II&spplus; Raji Zellen zu richten. Das Verhältnis von Effektor zu Ziel war 30:1. Ein Zusatz von unkonjugiertem C215 mAb mit einigen Konzentrationen hat kein Zielen von CTL gegen diese Zell-Linien induziert. Die FACS-Analyse an SW620 Zellen, Colo205 und WiDr Zellen unter Verwendung von mAbs gegen HLA- DR, -DP, -DQ hat keine Oberflächenexpression von MHC Klasse II angezeigt, wohingegen eine reichliche Expression von HLA- DR, -DP und -DQ an Raji Zellen und HLA-DR und -DP an mit Interferon behandelten Colo205 Zellen bestimmt wurde. Colo205 Zellen wurden mit 1000 Einheiten/ml an rekombinantem Interferon-Gamma 48 Stunden vor der Verwendung im CTL-Versuch behandelt.
  • Fig, 2. Das durch das SEA-C215 mAb Konjugat und SEA-C242 mAb Konjugat induzierte CTL-Zielen gegen Dickdarmkarzinomzellen hängt von der Antigenselektivität des mAb ab. Die Lyse von Colo205 Zellen durch eine SEA responsive CTL-Linie in Gegenwart von SEA-C215 mAb und SEA-C242 mAb Konjugat (3 µg/ml) wird durch Zugabe von unkonjugiertem C215 beziehungsweise C242 mAbs (30 µg/ml) blockiert. Die unkonjugierten mAb oder das Kontrollmedium (-) wurden den Zielzellen 10 Minuten vor den Konjugaten zugesetzt.
  • Fig. 3. Die Lyse von mit SEA-C215 mAb Konjugat umhüllten Dickdarmkarzinomzellen wird durch für SEA, aber nicht für SEB respondierende CTLs vermittelt. Autologe, für SEA und SEB selektive T-Zell-Linien wurden mit einem Effektor zu Ziel - Verhältnis von 10:1 gegen SW620 und Raji Zielzellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von SEA-C215 mAb Konjugat, einem Gemisch von unkonjugiertem C215 mAb und SEA (C215+SEA) und unkonjugiertem C215 mAb und SEB (C215+SEB) bei Konzentrationen von 1 µg/ml jedes Zusatzes, verwendet.
  • Fig. 4. Die durch das SEA-C242 mAb Konjugat und SEA- Anti-Thy-1.2 mAb Konjugat induzierte Zytotoxizität gegen deren Zielzellen (Colo205 Tumorzellen beziehungsweise EL-4 Tumorzellen). Tabelle 1 SEA-C215 mAb Konjugat bindet an C215&spplus; Dickdarmkarzinomzellen und MHC Klasse II&spplus; Raji Zellen
  • Die Zellen wurden mit den verschiedenen Kontroll-Zusätzen (PBS-BSA) während 30 Minuten auf Eis inkubiert, gewaschen und wie unten beschrieben bearbeitet. Die Färbung von C215 mAb und C242 mAb, gebunden an Colo205 Zellen, und von anti-Thy- 1.2, gebunden an EL-4 Zellen, wurde unter Verwendung von bezeichnetem FITC Kaninchen anti Maus 1 g bestimmt. Die Färbung von SEA zu Raji-Zellen wurde unter Verwendung eines anti-SEA-Serums von Kaninchen, gefolgt von einem FITC-Schwein anti Kaninchen 1 g, bestimmt. Die Färbung von SEA-C215 mAb Konjugat zu Colo 205 und Raji Zellen wurde unte Anwendung der oben für C215 mAb und SEA beschriebenen Arbeitsweisen bestimmt. Die FACS-Analyse wurde an einem FACS star plus von Becton und Dickinson durchgeführt. Die Färbung mit nur den zweiten und dritten Stufen wurde verwendet, um den Hintergrund zu definieren. Tabelle 2 CD4&spplus; und CD8&spplus; CTLs lysieren Dickdarmkarzinomzellen, wobei sie das C215-SEA Konjugat darstellen.
  • A) Die CTLs (SEA-3) wurden mit Effektor zu Ziel - Verhältnissen von 30:1 in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von SEA und C215-SEA zu 1 µg/ml verwendet.

Claims (17)

1. Ein lösliches Antikörperkonjugat, bestehend aus einem Antikörper und einem Superantigen.
2. Ein Konjugat nach Anspruch 1, worin
(i) der Antikörper für eine Zelloberflächenstruktur an einer mit einer Erkrankung in Verbindung stehenden Zielzelle spezifisch ist, und
(ii) das Superantigen von T-Zellen erkennbar ist und die Fähigkeit besitzt, zytotoxische T-Zellen (CTLs) zu aktivieren.
3. Ein Konjugat nach Anspruch 2, worin das Superantigen die Fähigkeit besitzt, mit Teilen des T-Zellrezeptorkomplexes in Wechselwirkung zu treten.
4. Ein Konjugat nach Anspruch 3, worin das Superantigen mit der V&beta;-Kette des T-Zellrezeptors in Wechselwirkung tritt.
5. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 2-4, worin die Zielzelle mit einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Autoimmunität, parasitische Infestation und mikrobielle Infektion, in Zusammenhang steht und der Antikörper spezifisch gegen eine Antigendeterminante (Epitop), die an der Zielzelle vorliegt, gerichtet ist.
6. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 2-5, worin die Erkrankung Krebs ist und der Antikörper gegen eine, an einer Tumorzelle vorhandenen Antigendeterminante (Epitop) gerichtet ist.
7. Ein Konjugat nach Anspruch 6, worin die Tumorzelle eine mit einem Dickdarmkarzinom in Verbindung stehende Zelle ist.
8. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-7, worin der Antikörper spezifisch gegen das C242 Epitop gerichtet ist.
9. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-8, worin es zumindest 1-5 Superantigenteile pro Antikörperteil gibt.
10. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-9, worin der Antikörper monoklonal ist.
11. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-10, worin das Superantigen ein Staphylokokkenenterotoxin ist.
12. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-11, worin das Superantigen ein Staphylokokkenenterotoxin A ist.
13. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-12, worin der Superantigenteil und der Antikörperteil miteinander über eine organische Bindungsstruktur, die zumindest eine Amidstruktur umfaßt, verbunden sind.
14. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-13, worin das Konjugat rekombinant hergestellt wurde.
15. Ein Konjugat nach einem der Ansprüche 2-14 zur Verwendung in therapeutischen Behandlungen, wobei unerwünschte Zellen in Säugern, vorzugsweise Menschen, zerstört werden, wobei diese Zellen eine Struktur exprimieren, gegen welche der Antikörperteil des Konjugats gerichtet ist.
16. Ein Konjugat nach Anspruch 15, worin die unerwünschten Zellen mit Krebs, Autoimmunität, einer durch ein Virus, ein Bakterium oder einen Pilz verursachten Infektion oder einer durch einen Parasit verursachten Infestation in Zusammenhang stehen.
17. Die Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 2-14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche zur Behandlung von Krebs, Autoimmunität, einer durch ein Virus, ein Bakterium oder einen Pilz verursachten Infektion oder einer durch einen Parasit verursachten Infestation bestimmt ist.
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