DE69120319T2 - Durch Einschliessen immobilisierte Biokatalysatoren und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Biokatalysators mit einer großen chemischen Festigkeit, in dem Mikrobenzellen oder ihre behandelten Substanzen mit wasserunlöslicher Polyuronsäure eingeschlossen werden.
• In den Fällen, wo Enzyme oder Mikroorganismen bei der Herstellung von Lebensmitteln, Arzneimitteln etc. als Biokatalysator verwendet werden, ist es gewerblich bevorzugt, ihre Wiederverwendung oder ihre kontinuierliche Verwendung dadurch zu ermöglichen, daß sie immobilisiert werden. Viele Immobilisierungsverfahren sind bisher entwickelt worden, und sie können grob in die folgenden drei Verfahren klassifiziert werden, d. h. das Trägeranbindungsverfahren, das Vernetzungsverfahren und das Einschlußverfahren.
• Unter diesen ist das Einschlußverfahren, bei dem der Einschluß in die Gelmatrix aus einem mehrwertigen Metallsalz von einer Polyuronsäure, wie Calciumalginat, erfolgt, im allgemeinen mit einer geringeren Inaktivierung der Enzymaktivität durch die Immobilisierung eines Biokatalysators verbunden, zum Teil, weil das Enzym und das Gel nicht direkt miteinander verbunden werden und zum Teil, weil die Reaktionsbedingungen zum Zeitpunkt der Immobilisierung mild sind. Deshalb wird dieses Verfahren als eines der nützlichsten Immobilisierungsverfahren angesehen.
• Dieses Verfahren weist jedoch das Problem auf, daß in einer Reaktionsflüssigkeit, die keine mehrwertigen Metallionen enthält, die ein Gel bilden, wie Calciumionen oder Aluminiumionen, bei einem pH-Wert oberhalb von 6 oder in einer Reaktionsflüssigkeit, die Ionen, wie Natriumionen, Phosphationen oder Sulfationen enthält, das Gel langsam quillt, mit der Konsequenz, daß die Biokatalysatoren anfangen, aus dem Gel zu lecken, und sie für den kontinuierlichen Dauerbetrieb ungeeignet werden. Dies hängt mit dem Phänomen zusammen, daß Calciumionen, die die Carboxylanionen von Alginsäure vernetzen, unter den obigen Bedingungen herausfallen.
• Um die Probleme zu vermeiden, die durch das Gelquellen verursacht werden, wurde das folgende Reaktionssystem und Gelverbesserungsverfahren versucht. Es handelt sich um:
• 1) Ein Verfahren, bei dem Calciumionen der Reaktionsflüssigkeit zugesetzt werden [z. B. Appl. Microbio. Biotechnol., 25, 186 (1986)].
• 2) Ein Verfahren, bei dem eine anorganische Substanz, wie ein gering lösliches Calciumsalz, in das Gel gemischt wird [z. B. JP-OS (kokai) Nr. 63-160584].
• 3) Ein Verfahren, bei dem das Gel mit einem polykationischen Hochpolymeren, wie Polyethylenimin beschichtet wird [z. B. Biotechnol. Bioeng., 26, 1393 (1984)].
• 4) Ein Verfahren, bei dem das Gel mit Glutaraldehyd oder Glutaraldehyd und Hexamethylendiamin beschichtet wird [z. B. Biotechnol. Bioeng., 21, 1697 (1979)].
• Das obige Verfahren 1) besitzt jedoch den Nachteil, daß die Calciumionen bei dem Trennungsschritt, dem Reinigungsschritt etc. bei der gewerblichen Anwendung dieses Verfahrens nachteilige Wirkungen ausüben. Desweiteren haben die Verfahren 2) und 3) den Nachteil, daß, da sie sich nicht wesentlich in der ionenvernetzten Struktur des Gels unterscheiden, das Gelquellen durch das Herausfallen der vernetzten Ionen mehr oder weniger unausweichlich ist. Das Verfahren 4) weist den Schwachpunkt auf, daß die Vernetzung einer Aldehydgruppe eine Vernetzung darstellt, bei der die Spaltung in einfacher Weise in Abhängigkeit von der Wirkung des pH-Wertes oder ähnlichem erfolgt.
• S. Birnbaum et al., 1981, Biotechnology Letters, Bd. 3, Nr. 8, S. 393-400, haben Mikrobenzellen (Saccharomyces cerevisiae) beschrieben, die durch Einschluß in ein Gelb aus wasserunlöslicher Polyuronsäure (Alginatgel) immobilisiert worden sind, die ein Vernetzungsmittel (Polyethylenimin), nämlich eine wasserlösliche Hochpolymerverbindung mit funktionellen Gruppen, die an die Carboxylgruppen der Polyuronsäure über Amid- und/oder Esterbindungen gebunden sind und dadurch die Polyuronsäure vernetzen, ist, enthalten. Um den immobilisierten Biokatalysator zu erhalten, sind drei verschiedene Verfahren beschrieben worden, die die bisher bekannten Alginatgele kovalent stabilisieren. Verfahren I und 11 umfassen das Inkontaktbringen des Gels aus wasserunlöslicher Polyuronsäure (Alginatgel), das die Mikrobenzellen einschließt, mit dem Vernetzungsmittel (Polyethylenimin) mit den funktionellen Gruppen und in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wobei es sich bei Methode I um Glutaraldehyd oder bei Methode 11 um Carbodiimid handelt. Die beschriebenen Stabilisierungen der Alginatgele stellen Kügelchen mit darin eingeschlossenen Biokatalysatoren bereit, die eine hohe Retention ihrer biologischen Aktivität und eine große Stabilität bei Kontakt mit komplexbildenden Anionen (Phosphatpuffer) aufweisen.
• Die Alginatgelkügelchen der Methode I des vorstehend genannten Dokuments werden gebildet, indem Polyethylenimin und Glutaraldehyd miteinander umgesetzt werden, um eine kovalente Bindung einzugehen, und die resultierende kovalente Bindung dann in ionischer Form an das Alginatgel-Polymere gebunden wird (vgl. S. 394, Z. 43-48, S. 395, Fig. 1 und S. 395, Z. 20 bis S. 396, Z. 4). Die gemäß Methode I hergestellten Alginatgelkügelchen unterscheiden sich somit von den erfindungsgemäß hergestellten Alginatkügelchen.
• Bei dem Verfahren zum Einschluß von lebenden Gesamtzellen, das in Verfahren 11 des vorstehend genannten Dokuments erwähnt ist, wurde, wie aus S. 393, Zusammenfassung, Z. 4 bis 6, S. 395, Z. 1 bis 12, S. 395, Fig. 1, Verfahren 11 klar ersichtlich ist, "das Alginatsol mit Carbodiimid und N- Hydroxysuccinimid behandelt (zur Bildung des aktiven Esters), mit den Zellen vermischt und in die Calciumlösung extrudiert. Nach dem Abspülen der Kügelchen mit Wasser wurden die Kügelchen in Polyethylenimin inkubiert."
• Gemäß Verfahren II des vorstehend genannten Dokuments werden die Kügelchen aus dem Calcium-Alginat-aktiven Estergel nach dem Waschen mit Wasser einer Reaktion mit einem Polyethylenimin (Vernetzungsmittel) unterworfen, d. h. nachdem inaktive Harnstoffderivate etc., welche Reaktionsrückstände des Carbodiimids sind, durch Waschen entfernt worden sind.
• Demgegenüber werden erfindungsgemäß die Gelkügelchen aus Polyuronsäure einer Reaktion mit einem Vernetzungsmittel in Gegenwart eines Kondensationsmittels unterworfen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das vorstehend genannte Dokument des Stands der Technik weder beschrieben noch nahegelegt.
• Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von durch Einschluß immobilisierten Biokatalysatoren des Typs bereitzustellen, der nur eine geringe Wirkung des pH-Wertes auf das Reaktionssystem aufweist und der in einem weiten pH-Bereich verwendbar ist, und ein Verfahren für die Herstellung von durch Einschluß immobilisierten Biokatalysatoren des Typs, welcher schwierig zu quellen ist, selbst wenn mehrwertige Metallionen, die das Gel bilden, wie Calciumionen oder Aluminiumionen, in dem Reaktionssystem im wesentlichen nicht vorhanden sind oder Ionen, die das Gel auflösen, wie Natriumionen, Ammoniumionen oder Phosphorsäureionen, in solch einem Reaktionssystem vorhanden sind, bereitzustellen.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von durch Einschluß immobilisierten Biokatalysatoren des Typs bereitzustellen, der in ausreichender Weise für den kontinuierlichen Dauerbetrieb geeignet ist.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von durch Einschluß immobilisierten Biokatalysatoren des Typs bereitzustellen, bei der die mit der Immobilisierung verbundene Verringerung der Aktivität des immobilisierten Biokatalysators gering ist.
• Unter diesen Umständen haben die Erfinder gefunden, daß die oben genannten Aufgaben der Erfindung dadurch erreicht werden können, daß eine Polyuronsäure über eine Amidbindung und/oder eine Esterbindung vernetzt wird.
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Biokatalysators, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
• (i) Mischen einer wäßrigen Lösung einer Polyuronsäure mit Mikrobenzellen oder Produkten, die sich davon ableiten;
• (ii) tropfenweise Zugabe des bei der Stufe (i) erhaltenen Gemisches in eine wäßrige Gelatine-Lösung unter Bildung eines Gels aus wasserunlöslicher Polyuronsäure, welches die Mikrobenzellen oder die Produkte, die sich davon ableiten, eingeschlossen enthält; und
• (iii) Behandlung des Gels mit einem Vernetzungsmittel, das in seinem Molekül mindestens zwei von solchen reaktiven Gruppen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminogruppe und einer Hydroxylgruppe, in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines Kondensationsmittels.
• Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung detaillierter erläutert.
• Die erfindungsgemäß verwendete Polyuronsäure wird üblicherweise als ein Gel für die Immobilisierung des Mikroorganismus durch Einschluß verwendet.
• Beispiele umfassen eine Alginsäure, eine Pectinsäure oder ein Gemisch davon.
• Das Vernetzungsmittel, das erfindungsgemäß zur Vernetzung einer Polyuronsäure verwendet werden soll, ist eines, das in seinem Molekül zwei oder mehr funktionelle Gruppen enthält, die eine Amidbindung und/oder eine Esterbindung durch die Reaktion mit einer Carboxylgruppe der Polyuronsäure bilden können. Beispiele für solche funktionellen Gruppe umfassen eine Aminogruppe, eine Hydroxygruppe oder eine funktionelle Derivatgruppe davon.
• Das hier verwendete Vernetzungsmittel ist bevorzugt, wenn es an sich wasserlöslich ist. Besonders bevorzugt ist eine wasserlösliche Hochpolymerverbindung.
• Spezielle Beispiele für das Vernetzungsmittel können eine monomere Verbindung, wie Ethylendiamin, Ethylenglykol, Glycerin, Ethanolamin, Diethanolamin oder Triethanolamin und eine Hochpolymerverbindung, wie Polyvinylalkohol, Polyalkylenimin (z. B. Polyethylenimin, Polypropylenimin, Polybutylenimin etc.), Polyallylamin oder Polyvinylamin, umfassen. Unter diesen ist die Hochpolymerverbindung wünschenswert. Vor allem sind Polyethylenimin oder Polyallylamin besonders bevorzugt im Hinblick auf die Verfügbarkeit und Reaktivität.
• Insbesondere ist das mittlere Molekulargewicht der Hochpolymerverbindung nicht beschränkt. Jedoch ist im Falle des Polyvinylalkohols ein Bereich von etwa 10 000 bis etwa 100 000 vorteilhaft, und im Falle des Polyalkylenimins ist ein Bereich von etwa 300 bis etwa 100.000, vorzugsweise etwa 1000 bis etwa 70 000, vorteilhaft. Weiterhin ist im Falle des Polyallylamins ein Bereich von etwa 5000 bis etwa 100 000 vorteilhaft. Im Falle des Polyvinylamins ist ein Bereich von etwa 10 000 bis etwa 50 000 vorteilhaft.
• Gleichzeitig ist als Mikroorganismus, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden soll, alle Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Strahlenpilze etc. anwendbar. Deren behandelte Substanzen können ebenfalls verwendet werden.
• Die behandelte Substanz umfaßt hier all jene, die durch Kultivierung einer zerstörten Substanz der Zelle, ihrer pulverisierten Substanz, ihrer selbstabgebauten Substanz etc. erhältlich sind. Desweiteren umfaßt die behandelte Substanz solche, die durch Agglutination oder zuvorige Immobilisierung der Zelle oder ihrer zerstörten Substanz erhältlich sind.
• Desweiteren kann zusätzlich zu den obigen Mikroorganismen die Erfindung auf die Immobilisierung von Tierzellen oder Pflanzenzellen durch Einschluß angewendet werden. Diese Tier- und Pflanzenzellen sind gut, selbst wenn es sich dabei nicht nur um natürlich vorkommende Zellen, sondern ebenfalls um solche handelt, die durch irgendwelche künstlichen Maßnahmen, wie Genrekombinationstechnik oder Zellfusionsstechnik, z. B. Hydridoma, erhalten wurden.
• Die Biokatalysatoren, die durch Einschluß immobilisiert worden sind, können gebildet werden, indem ein Gel der wasserunlöslichen Polyuronsäure, das die Mikrobenzellen oder ihre behandelten Substanzen enthält, und das obige Vernetzungsmittel in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines Kondensationsmittels umgesetzt werden.
• Als Kondensationsmittel kann z. Zt. ein wasserlösliches Carbodiimidreagens als ein bevorzugtes Beispiel genannt werden [J. Org. Chem. 21, 439 (1956)]. Dessen konkrete Beispiele können N-(3-Dimethylamino) propyl-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid umfassen. Diese Verbindung ist im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Co., Inc., etc. Sie ist leicht zugänglich und bevorzugt.
• Bei der Herstellung der unmittelbar beanspruchten, durch Einschluß immobilisierten Biokatalysatoren wird zunächst die Suspension der Biokatalyatoren, der Mikrobenzellen oder ihrer behandelten Substanzen hergestellt, wobei sie gleichförmig in einer wäßrigen Lösung einer wasserlöslichen Polyuronsäureverbindung, wie Natriumalginat, Calciumalginat oder Ammonium oder Pectinsäure, suspendiert werden.
• Erfindungsgemäß ist die Zusammensetzung dieser Suspension vorzugsweise so, daß die Polyuronsäureverbindung in einer Konzentration von 5 bis 100 g/l, insbesondere 10 bis 50 g/l, der Biokatalysator in einer Konzentration von 10 bis 900 g (Naßgewicht)/l, insbesondere 50 bis 200 g (Naßgewicht)/l, enthalten sind. Anschließend ist es zweckmäßig, daß die Immobilisierung und die Vernetzung unter Verwendung dieser Suspension gemäß einer der nachstehenden Verfahrensweisen durchgeführt wird. Bei diesen handelt es sich um:
• (1) ein Verfahren, bei welchem ein wasserunlösliches Gel in einer an sich bekannten Weise erhalten wird, welche tropfenweise Zugabe einer Suspension zu einer wäßrigen Gelierungslösung, enthaltend Calciumionen, Aluminiumionen oder dgl., Austragen des Gemisches, dessen Befeuchten etc., umfaßt, und dann wird dieses Gel in ein wäßriges Gemisch aus dem Vernetzungsmittel und dem Kondensationsmittel geworfen, gefolgt von Stehenlassen des Gemisches oder es wird gerührt;
• (2) ein Verfahren, bei dem ein Vernetzungsmittel mit einer Konzentration von 1 bis 200 g/l, vorzugsweise 10 bis 50 g/l, der Suspension zugesetzt wird und dann ein wasserunlösliches Gel in der bekannten Weise, wie oben beschrieben, erhalten wird. Dieses Gel wird dann in eine wäßrige Lösung eines Kondensationsmittels oder in ein wäßriges Gemisch aus solch einem Kondensationsmittel und einem Vernetzungsmittel geworfen, gefolgt von dem Stehenlassen oder dem Rühren des Gemisches; und
• (3) ein Verfahren, bei dem ein Vernetzungsmittel und ein Kondensationsmittel zu einer wäßrigen Gelierungslösung zugegeben werden, und eine Suspension tropfenweise zu dieser zugesetzt wird, und das Gemisch wird ausgetragen, befeuchtet etc., und im Anschluß daran wird es stehengelassen oder gerührt.
• Unter diesen Verfahren sind das Verfahren (1) und das Verfahren (2) bevorzugt. Insbesondere ist das Verfahren (1) bevorzugt.
• Der pH-Wert einer Behandlungslösung, die bei der obigen Gelierungs- und Vernetzungsbehandlung verwendet wird, beträgt vorzugsweise 2 bis 12, besonders bevorzugt 5 bis 8. Die Konzentration des Vernetzungsmittels beträgt hierbei vorzugsweise 1 bis 200 g/l, besonders bevorzugt 3 bis 100 g/l. Im Falle des Kondensationsmittels ist es wünschenswert, dieses in einer 0,1- bis 5fachen molaren Konzentration, bezogen auf die Molzahl einer Carboxylgruppe in der verwendeten Polyuronsäureverbindung, anzuwenden. Die Behandlungstemperatur und -zeit betragen vorzugsweise 5 bis 50ºC bzw. 1 bis 100 h. Weiterhin ist das bei der obigen Behandlung verwendete Lösungsmittel vorzugsweise Wasser, jedoch gibt es kein Problem, selbst wenn ein organisches Lösungsmittel, wie Alkohol, Aceton, Acetonitril, Ether oder Dimethylformamid oder ein Gemisch davon, falls erforderlich, verwendet wird.
• Ein Biokatalysator, der durch Einschluß nach Beendigung der Behandlung immobilisiert wird, kann in einer gewünschten Katalysereaktion verwendet werden, indem er durch Filtration gewonnen und dann gründlich in Wasser gewaschen wird.
• Der durch Einschluß immobilisierte Katalysator besitzt eine ausgezeichnete Eigenschaft dahingehend, daß er schwer quillt, wie oben beschrieben. Konkret beträgt das Gewicht des immobilisierten Biokatalysators, nachdem er in eine wäßrige 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatlösung in der 100fachen Menge des Gewichts des Biokatalysators gelegt und bei 40ºC über 2 h geschüttelt worden war, lediglich nicht mehr als das Doppelte des ursprünglichen Gewichtes.
• Die Form des durch Einschluß immobilisierten Biokatalysators ist nicht besonders eingeschränkt, und es gibt kein Problem, selbst wenn der Biokatalysator irgendeine Form, wie eine kugelartige, fibröse, filmartige, kubische etc. Form annimmt. Falls der beanspruchte Biokatalysator in der Form einer Faser oder eines Films vorliegt, beträgt seine Größe oder Dicke 5 mm oder weniger im Durchschnitt, vorzugsweise 2 mm oder weniger. Falls der Biokatalysator eine kugelartige oder kubische Form annimmt, beträgt sein Volumen 150 mm³ oder weniger im Durchschnitt, vorzugsweise 50 mm³ oder weniger.
• Der immobilisierte Biokatalysator ist ein Gel, das den Biokatalysator mit einer Struktur einschließt, bei der eine Carbonylgruppe der Polyuronsäure mit einer kovalenten Bindung, wie einer Amidbindung oder einer Esterbindung, vernetzt ist.
• Verglichen mit den herkömmlichen Gelen, die erhalten werden, indem ein Biokatalysator mit einem mehrwertigen Metallsalz von Polyuronsäure eingeschlossen wird, ist das Quellen, das von dem pH-Wert einer Reaktionsflüssigkeit oder dem Effekt von Ionen in der Reaktionsflüssigkeit abhängt, bemerkenswert inhibiert. Dieser immobilisierte Biokatalysator besitzt nämlich hohe chemische Festigkeit, und er weist eine dahingehende Wirkung auf, daß er für den gewerblichen Anwendungsbereich der Gele aus immobilisierter Polyuronsäure besser anwendbar ist.
[Beispiele]
• In dem folgenden Abschnitt wird die Erfindung anhand von Arbeitsbeispielen umfassend erläutert, jedoch soll die Erfindung durch diese Beispiele nicht beschränkt werden.
Beispiel 1
• Im Handel erhältliches Natriumalginat (Viskosität: 800 bis 1200 CP in 10 g/l einer wäßrigen Lösung bei 20ºC) wurde in einer hydrothermalen Lösung bei 600 bis 70ºC aufgelöst, wodurch 50 g/l einer wäßrigen Lösung hergestellt wurden. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt.
• Schrittweise wurden 60 ml der obigen wäßrigen Lösung zu 10 g (Naßgewicht) Pseudomonas putida (IFO 12996) zugegeben. Letztere enthielt Aminosäure-Racemase, die in einem Kulturmedium (pH-Wert von 7,2) mit der in Tabelle 1 dargestellten Zusammensetzung unterhalb von 30ºC über 24 h kultiviert worden war. Zu dem Gemisch wurde weiter Wasser zugegeben, um dessen Gesamtmenge auf 100 ml einzustellen, anschließend wurde es gut durchmischt.
• Dieses Gemisch wurde tropfenweise zu 400 ml einer wäßrigen 0,1 M Calciumchloridlösung zugegeben, und das Gemisch wurde schonend über zusätzliche 2 h als solches gerührt.
• Es resultierten 53,1 g (Naßgewicht) eines kugelförmigen Calciumalginatgels.
Tabelle 1
• K&sub2;PHO&sub4; 7 g
• KH&sub2;PO&sub4; 2 g
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3 g
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,2 g
• Hefeextrakt 1 g
• Polypepton 1 g
• FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 40 mg
• CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 40 mg
• AlCl&sub3; · 6H&sub2;O 10 mg
• MnSO&sub4; 5H&sub2;O 10 mg
• Glycerin 20 g
• Reines Wasser 1 l
• Anschließend wurde die Vernetzung des obigen Gels gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt.
• Dazu wurden 10 g/l einer wäßrigen Polyethyleniminlösung mit konzentrierter Schwefelsäure neutralisiert. Dann wurden 10,0 g des obigen Gels zu 49 ml einer vernetzten Lösung zugegeben, welche erhalten wurde, indem zur obigen wäßrigen Lösung 550 mg N-(3-Dimethylamino)propyl-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid zugegeben worden waren. Diese wurde schonend bei 23ºC über 12 h gerührt.
• Diese wurde filtriert/in Wasser gewaschen, wodurch 7,0 g gewünschter immobilisierter Mikrobenzellen von Pseudomonas putida hergestellt wurden.
• Durch die Verwendung der drei Arten von immobilisierten Mikrobenzellen, einschließlich der so erhaltenen Mikrobenzellen, wurde ihre Aminosäure-Racemase-Aktivitäten bestimmt. Als die drei Arten von immobilisierten Mikrobenzellen wurden die folgenden Typen (a) bis (c) verwendet.
• (a) Immobilisierte Mikrobenzellen, hergestellt in Beispiel 1,
• (b) immobilisierte Mikrobenzellen, die bloß mit Calciumchlorid immobilisiert worden sind, und
• (c) immobilisierte Mikrobenzellen, die gemäß Beispiel 1 hergestellt worden sind, ausgenommen, daß kein Carbodiimidmittel verwendet wurde.
• In einen kegelförmigen Kolben mit 30 ml Kapazität wurden 50 Kügelchen von jeder Art gegeben, und dazu wurden 5 ml einer wäßrigen L-Serinlösung (0,1 mol/l), deren pH-Wert auf 7,8 mit Natriumhydroxid eingestellt worden war, zugegeben. Es wurde bei 37ºC über 1 h geschüttelt. Der Racemisierungsgrad von L-Serin in D-Serin in diesem Zeitintervall wurde mittels einer chiralen Säulenchromatographie bestimmt. Die immobilisierten Mikrobenzellen wurden nach der Bestimmung in Wasser über 5 min gewaschen, und die gleiche Aktivitätsbestimmung wurde dreimal wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Immobilisierte Mikrobenzellen Aminosäure-Racemisierungsaktivität* Erstens Zweitens Drittens Viertens Vor dem Test Geldurchmesser Nach dem Test Quellgrad (fach)** Bemerkungen: * Dargestellt durch den relativen Wert, der dadurch erhalten wurde, daß der Racemisierungsgrad bei der ersten Aktivitätsbestimmung als 100 für jede Art der immobilisierten Mikrobenzellen festgelegt wurde. ** Durchschnittlicher Wert von 10 Kügelchen. *** Quellgrad = (Geldurchmesser nach dem Test)/(Geldurchmesser vor dem Test)
Beispiel 2
• Drei Arten immobilisierter Mikrobenzellen einschließlich der obigen immobilisierten Mikrobenzellen wurden in die Säule gefüllt, um ihre Aktivitätslebensdauer bei der kontinuierlichen Reaktion zu bestimmen. Als drei Arten immobilisierter Mikrobenzellen wurden die folgenden Typen (a) bis (c) verwendet:
• (a) Immobilisierte Mikrobenzellen, hergestellt in Beispiel 1,
• (b) immobilisierte Mikrobenzellen, welche bloß mit Calciumchlorid immobilisiert worden sind, und
• (c) immobilisierte Mikrobenzellen, die gemäß Beispiel 1
• hergestellt worden sind, ausgenommen, daß kein Polyethylenimin verwendet wurde.
• 5 g von jeder Art der immobilisierten Mikrobenzellen wurden in eine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 14 mm und einer Länge von 12 cm gefüllt (die Füllhöhe betrug etwa 7 cm). Eine wäßrige L-Serinlösung (0,15 mol/l), die in 0,1 mol/l einer Tris-Pufferlösung aufgelöst worden war, wurde durch diese Säule über 7 Tage bei 30ºC in dem Aufstromsystem mit 20 ml/h durchgeleitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Immobilisierte Mikrobenzellen Racemisierungsgrad 1. Tag Das gequollene Gel trat aus der Säule aus. Der Racemisierungsgrad (%) = (Menge an D-Serin)/(Menge an D-Serin) + (Menge an L-Serin) · 100 (%)
Beispiel 3
• Escherichia coli K-12 YK 2009 (FERM BP-3244) wurde in einen kegelförmigen Kolben mit 500 ml Kapazität inokuliert, der 100 ml eines Kulturmediums mit einer in Tabelle 4 dargestellten Zusammensetzung enthielt, und dann bei 37ºC über 24 h kultiviert. Zusätzlich wurden 2 Vol./Vol.-% der Kultur in 100 ml eines Kulturmediums mit einer in Tabelle 5 dargestellten Zusammensetzung inokuliert, und eine Indolacrylsäure wurde zu dem Kulturmedium in einer Konzentration von 100 µg/ml zugegeben. Dessen Kultivierung wurde bei 37ºC über 5 h unter Schütteln durchgeführt. Zu 5 g (Naßgewicht) der durch Zentrifugieren gesammelten Mikrobenzellen wurden 20 g einer physiologischen Kochsalzlösung und 25 g eines in Beispiel 1 hergestellten wäßrigen Natriumalginats (50 g/l) zugegeben, und anschließend wurde unter Eiskühlung dieses gut vermischt.
Tabelle 4
• K&sub2;PHO&sub4; 7,0 g
• KH&sub2;PO&sub4; 2,0 g
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,0 g
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,1 g
• Glucose 2,0 g
• Wasser 11
Tabelle 5
• Trypton 10 g
• Hefeextrakt 5 g
• NaCl 5 g
• Wasser 11
• pH 7,2
• Dieses wurde tropfenweise zu 50 ml einer wäßrigen 0,2 M Calciumchloridlösung bei 10ºC zugegeben. Nach dieser tropfenweisen Zugabe wurde das Gemisch schonend über weitere 2 h gerührt, wodurch ein kugelförmiges Calciumalginatgel hergestellt wurde. Gleichzeitig wurde eine Flüssigkeit der Vernetzungsmittel mit der in Tabelle 6 dargestellten Zusammensetzung unter Eiskühlung hergestellt. Sofort nach der Herstellung der Flüssigkeit der Vernetzungsmittel wurde das obige Gel in die Flüssigkeit geworfen und bei 30ºC über 50 h geschüttelt. Dieses wurde filtriert, und der Rückstand wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung gespült, wodurch 12 g immobilisierte Mikrobenzellen von Escherichia coli (durchschnittlicher Geldurchmesser von 1,2 mm) hergestellt wurden.
Tabelle 6
• Eine wäßrige 30%ige Polyethyleniminlösung (Molekulargewicht von etwa 70 000) 3,6 g
• 6 N Chlorwasserstoffsäure 2,6 g
• N-(3-Dimethylamino)-propyl-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid 1,2 g
• pH 6,5
• Die Tryptophansyntase-Aktivität dieser immobilisierten Mikrobenzellen von Escherichia coli wurde gemäß der Methode von Yanof sky et al. [O.H. Smith and C. Yanof sky, Methods in Enzymology, Bd. 5, 794-804 (1962)] gemessen. Der erhaltene Wert betrug 46 µmol/g-Gel · 20 min.
Beispiel 4
• Escherichia coli K-12 YK 3004 (FERM BP-1735) wurde in einen kegelförmigen Kolben mit 500 ml Kapazität inokuliert, der 100 ml eines Kulturmediums mit einer in Tabelle 7 dargestellten Zusammensetzung enthielt, und dann bei 37ºC über 13 h kultiviert. Desweiteren wurden 2 Vol./Vol. -% der Kultur in 1,5 l (pH-Wert von 7,2, 37ºC) eines Kulturmediums mit einer in Tabelle 8 dargestellten Zusammensetzung inokuliert. Die Rührkultur wurde durchgeführt, während ein 3 l Fermenter mit Luft versetzt wurde. Zu dem Zeitpunkt, wenn die Trübung (OD660 nm) des Kulturfiltrats 15 oder einen ähnlichen Wert erreicht hatte, wurden MgSO&sub4; · 7H&sub2;O und FeSO&sub4; · 7H&sub2;O so zugesetzt, daß die jeweiligen Endkonzentrationen 400 mg/l bzw. 100 mg/l waren.
Tabelle 7
• K&sub2;PHO&sub4; 5,5 g
• KH&sub2;PO&sub4; 1,6 g
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3 g
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,1 g
• Polypepton 1 g
• Hefeextrakt 1 g
• Ampicillin 50 mg
• Glucose 5 g
• Wasser 11
Tabelle 8
• K&sub2;PHO&sub4; 11,0 g
• KH&sub2;PO&sub4; 3,2 g
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 6 g
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,2 g
• Polypepton 1 g
• Hefeextrakt 1 g
• FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 50 mg
• Glucose 10 g
• Wasser 11
• Weiterhin wurde die Konzentration des in dem Kulturfiltrat gelösten Sauerstoffs mittels einer Elektrode von gelöstem Sauerstoff gemessen. Zu dem Zeitpunkt, wenn die Glucosekonzentration Null erreicht hatte und der Wert des gelösten Sauerstoffs des Kulturfiltrats sich zu erhöhen begann, wurde Glucose so zugesetzt, daß sie eine Konzentration von 1% aufwies. Zu dem Zeitpunkt, wenn die Kultivierung fortgesetzt worden war und kein weiterer Anstieg des ID&sub6;&sub6;&sub0; beobachtet wurde, wurde die Kultivierung beendet und die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Durch Verwendung von 5 g (Naßgewicht) der Zellen wurden 11,5 g immobilisierte Zellen von Escherichia coli gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 3 erhalten. Die Tryptophanase-Aktivität dieser immobilisierten Mikrobenzellen wurde in der folgenden Weise gemessen. Nämlich eine in Tabelle 9 dargestellte Reaktionsflüssigkeit wurde zu den immobilisierten Mikrobenzellen von Escherichia coli gegeben und dessen Schütteln wurde bei 37ºC über 1 h durchgeführt. Die immobilisierten Mikrobenzellen wurden filtriert, und Wasser wurde zu dem Filtrat zugesetzt, um dessen Gesamtmenge auf 1 l einzustellen. Das resultierende L- Tryptophan wurde komplett aufgelöst und seine gebildete Menge wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (LC-SA, ein Produkt von Shimadzu Seisakujo) bestimmt. Als Ergebnis betrug der Tryptophanase-Aktivitätswert der immobilisierten Mikrobenzellen von Escherichia coli 0,24 g- Tryptophan/g-Gel h.
Tabelle 9
• Indol 1,5 g
• L-Serin 10 g
• KCl 0,2 g
• Pyridoxal-5'-phosphorsäure 0,5 mg
• Die Gesamtmenge wurde auf 50 ml (pH-Wert von 9,0) unter Verwendung einer 100 mM Tris-Pufferlösung gebracht.
Beispiel 5
• Brevibacterium flavum JM 233-AB-41 (FERM BP-1498) wurde in einen kegelförmigen Kolben mit 500 ml Kapazität inokuliert, der 100 ml eines Kulturmediums mit einer in Tabelle 10 dargestellten Zusammensetzung enthielt, und dann bei 30ºC über 24 h kultiviert. Desweiteren wurden 2 Vol./Vol.-% der genannten Kultur in ein Kulturmedium (pH-Wert von 7,6) mit einer in Tabelle 11 dargestellten Zusammensetzung inokuliert. Die Rührkultivierung wurde bei 33ºC 20 h durchgeführt, während ein 3 l Fermenter mit Luft versetzt wurde. Unter Verwendung von 5 g (Naßgewicht) der durch Zentrifugation gewonnenen Zellen wurden 15 g immobilisierte Mikrobenzellen von Brevibacterium flavum gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 3 erhalten. Deren Aspartase-Aktivität wurde in der folgenden Weise gemessen. Nämlich eine in Tabelle 12 dargestellte Reaktionsflüssigkeit wurde zu den immobilisierten Mikrobenzellen von Brevibacterium flavum zugegeben, und deren Schütteln wurde bei 46ºC über 1 h durchgeführt. Die Menge, um die die Asparaginsäure abgenommen hatte, wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (LC-5A, ein Produkt von Shimadzu Seisakujo) bestimmt. Als Ergebnis betrug die Aspartase-Aktivität der immobilisierten Mikrobenzellen von Brevibacterium flavum 130 µmol/g-Gel · h.
Tabelle 10
• Harnstoff 4 g
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,5 g
• K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g
• MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5 g
• Hefeextrakt 1 g
• Casaminosäure 1 g
• Biotin 200 µg
• Thiaminhydrochlorid 100 µg
• FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 6 mg
• Wasser 11
Tabelle 11
• (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 23 g
• KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g
• K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5 g
• Hefeextrakt 3 g
• Casaminosäure 3 g
• Biotin 200 µg
• Thiaminhydrochlorid 100 µg
• FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 20 mg
• MnSO&sub4;4-6H&sub2;O 20 g
• Wasser 11
Tabelle 12
• L-Aspartinsäure 100 µmol
• MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 10 µmol
• Tween 20* 1 µl
• Probenflüssigkeit 0,1 ml
• Bemerkung: * steht für eine Warenbezeichnung des nicht ionischen grenzflächenaktiven Mittels, einem Produkt von Wako Junyaku K.K.
• Dessen Gesamtmenge wurde auf 1 ml (pH-Wert von 7,4) mit einer 100 mM Tris-Pufferlösung gebracht.
Beispiel 6
• Jeweils 1 g der insgesamt sechs Arten der erfindungsgemäßen immobilisierten Mikrobenzellen, die in den Beispielen 1, 3 und 5 hergestellt worden waren, und der immobilisierten Mikrobenzellen, die in jedem dieser Beispiele hergestellt worden waren, mit der Ausnahme, daß kein Vernetzungsmittel verwendet worden war, wurden in einen kegelförmigen Kolben mit 200 ml Kapazität gegeben, der 100 ml 0,2 M Na&sub2;HPO&sub3; (pH- Wert von 9) enthielt und dessen Schütteln wurde bei 40ºC über 1,5 h durchgeführt. In Tabelle 13 ist das Ergebnis dargestellt, das erhalten wurde, indem das Gewicht der immobilisierten Mikrobenzellen, die durch Filtern gewonnen wurden, um den Quellgrad zu bestimmen, bestimmt wurde. Tabelle 13 Immobilisierte Mikrobenzellen Pseudomonas putida Escherichia coli Brevibacterium flavum Erfindungsgemäße immobilisierte Mikrobenzellen Immobilisierte Mikrobenzellen ohne Verwendung eines Vernetzungsmittels

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Biokatalysators, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

(i) Mischen einer wäßrigen Lösung einer Polyuronsäure mit Mikrobenzellen oder Produkten, die sich davon ableiten;

(ii) tropfenweise Zugabe des bei der Stufe (i) erhaltenen Gemisches in eine wäßrige Gelatine-Lösung unter Bildung eines Gels aus wasserunlöslicher Polyuronsäure, welches die Mikrobenzellen oder die Produkte, die sich davon ableiten, eingeschlossen enthält; und

(iii) Behandlung des Gels mit einem Vernetzungsmittel, das in seinem Molekül mindestens zwei von solchen reaktiven Gruppen enthält, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer Aminogruppe und einer Hydroxylgruppe, in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines Kondensationsmittels.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyuronsäure eine Alginsäure, eine Pectinsäure oder ein Gemisch davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel eine wasserlösliche Hochpolymerverbindung ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel von mindestens einer Art, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polyalkyenimin, Polyallyalamin und Polyvinyamin, ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kondensationsmittel ein wasserlösliches Carbodiimid ist.