DE69111801T2

DE69111801T2 - VACCINE AGAINST HEPATITIS B.

Info

Publication number: DE69111801T2
Application number: DE69111801T
Authority: DE
Inventors: Thomas Howard Christopher; Carman Wiliam Frederick
Original assignee: Imperial College of London
Current assignee: Imperial College of London
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2011-03-26
Also published as: AU642729B2; PT97159A; IE911022A1; ZA912305B; JP3049018B2; CA2078694A1; AU7561391A; GR3017804T3; KR100208129B1; PT97159B; JPH11178591A; CA2078694C; GB9007024D0; US6099840A; JPH05505805A; DE69111801D1; EP0522030A1; WO1991014703A1; ES2075440T3; ATE125821T1

Abstract

A variant HBsAg protein of fragment thereof displaying the antigenicity of Hepatitis B virus surface antigen is disclosed, in which the variant protein or fragment thereof (vHBsAg) comprises a modified a determinant in which there is an amino acid other than glycine at position 145 of the HBsAg sequence. A vaccine comprising the vHBsAg is provided, as it is a kit for diagnostic in vitro detection of anti-vHBsAg antibodies and an antibody preparation comprising anti-vHBsAg antibodies.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle, die für Polypeptide mit der Spezifität eines viralen Hepatitis-B-Antigens codieren.The present invention relates to recombinant DNA molecules encoding polypeptides with the specificity of a viral hepatitis B antigen.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine Impfstoff-Zusammensetzung zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern in Menschen gegen ein verändertes Hepatitis-B-Virus.The invention particularly relates to a vaccine composition for stimulating the production of antibodies in humans against an altered hepatitis B virus.

Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein ernstes, weitverbreitetes Problem, aber nun sind Impfstoffe, die für eine Durchimpfung verwendet werden können, verfügbar, zum Beispiel das Produkt "Engerix-B" (SmithKline Beecham p.l.c.), das gentechnisch hergestellt wird.Infection with the hepatitis B virus (HBV) is a serious, widespread problem, but vaccines that can be used for universal vaccination are now available, for example the product "Engerix-B" (SmithKline Beecham p.l.c.), which is produced using genetic engineering.

Das Klonen von Genomen von Hepatitis-B-Virionen verschiedener Serotypen ist im Fachbereich wohlbekannt; siehe Miller et al., Hepatology 9 (1989), Seite 322 und die darin angegebene Literatur. Dane-Partikel, die Hepatitis-B-Virionen sind und die aus infizierten Patienten isoliert werden können, besitzen einen Durchmesser von etwa 42 nm. Sie bestehen jeweils aus einer Hülle, welche das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), ein Capsid (HBcAg), eine endogene Polymerase und ein DNA-Genom umfaßt. Ein drittes Polypeptid, das "e"-Antigen (HBeAg) wird von dem Hepatitis-B-Virus hergestellt und findet sich in gelöster Form im Serum.The cloning of genomes of hepatitis B virions of different serotypes is well known in the art; see Miller et al., Hepatology 9 (1989), page 322 and the literature cited therein. Dane particles, which are hepatitis B virions and can be isolated from infected patients, are approximately 42 nm in diameter. They each consist of an envelope comprising the hepatitis B surface antigen (HBsAg), a capsid (HBcAg), an endogenous polymerase and a DNA genome. A third polypeptide, the "e" antigen (HBeAg), is produced by the hepatitis B virus and is found in dissolved form in serum.

Im Handel erhältliche Impfstoffe gegen HBV enthalten das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) entweder in nativer oder in rekombinanter Form. Das authentische Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen kann aus dem Plasma infizierter Personen als ein Partikel von etwa 22 nm gewonnen werden, das aus zwei Proteinen besteht, die als P24 und sein glykosyliertes Derivat GP28 bekannt sind und die beide von der 226 Aminosäuren codierenden Sequenz des HBV-Genoms, bekannt als S-Protein-codierende Sequenz oder HBV-S-Gen, codiert werden; siehe Tiollais et al., Nature 317 (1985), Seite 489 und die darin angegebene Literatur. Die vollständige Aminosäuresequenz von HBsAg und die hierfür codierende Nucleotidsequenz ist in Valenzuela et al Nature 280 (1979), Seite 815 angegeben. In der vorliegenden Anmeldung wird das von Tiollais et al. (loco citato) zur Definition der Nucleotid- und Aminosäurepositionen verwendete Numerierungssystem verwendet.Commercially available vaccines against HBV contain the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in either native or recombinant form. The authentic hepatitis B virus surface antigen can be recovered from the plasma of infected individuals as a particle of approximately 22 nm consisting of two proteins known as P24 and its glycosylated derivative GP28, both of which are encoded by the 226 amino acid coding sequence of the HBV genome known as the S protein coding sequence or HBV S gene; see Tiollais et al., Nature 317 (1985), p. 489 and references cited therein. The complete amino acid sequence of HBsAg and the nucleotide sequence encoding it are given in Valenzuela et al. Nature 280 (1979), p. 815. In the present application, the numbering system used by Tiollais et al. (local citato) to define the nucleotide and amino acid positions is used.

Der Einbau von HBV-S-Gen codierenden Sequenzen unter der Kontrolle von Hefepromotoren in Expressionsvektoren, um eine Expression von HBsAg in S. cerevisiae zwecks Impfstofferzeugung zu ermöglichen, ist zum Beispiel von Harford et al. in Develop. Biol. Standard. 54: Seite 125 (1983), Valenzuela et al Nature 298, Seite 347 (1982) und Bitter et al J. Med. Virol. 25, Seite 123 (1988) beschrieben worden. Beschrieben wurde ebenfalls die Expression in Pinchia pastoris von Gregg et al., Biotechnology 5 (1987), Seite 479 (siehe auch die Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 226 846) sowie die Expression in Hansenula polymorpha (siehe EP-A-0 299 108).The incorporation of HBV S gene coding sequences under the control of yeast promoters into expression vectors to enable expression of HBsAg in S. cerevisiae for the purpose of vaccine production has been described, for example, by Harford et al. in Develop. Biol. Standard. 54: page 125 (1983), Valenzuela et al Nature 298, page 347 (1982) and Bitter et al J. Med. Virol. 25, page 123 (1988). Expression in Pinchia pastoris has also been described by Gregg et al., Biotechnology 5 (1987), page 479 (see also the publication of European patent application No. 0 226 846) and expression in Hansenula polymorpha (see EP-A-0 299 108).

Impfstoffe können auch aus hybriden immunogenen Partikeln, welche HBsAg-Protein umfassen, hergestellt werden, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 278 940 beschrieben ist.Vaccines can also be prepared from hybrid immunogenic particles comprising HBsAg protein, as described in European Patent Application No. 0 278 940.

Derartige Partikel können zum Beispiel das gesamte oder einen Teil oder Teile des HBsAg-Präkursor-Proteins enthalten, welches von der codierenden Sequenz codiert wird, die sich in dem HBV-Genom unmittelbar vor dem HBV-S-Gen befindet und hier als die Prä-S-codierende Sequenz bezeichnet wird. Die Prä-S-codierende Sequenz codiert normalerweise für 163 Aminosäuren (im Falle des HBV-Subtyps ay) und umfaßt eine Prä-S1-codierende Sequenz und eine Prä-S2-codierende Sequenz. Die letztere codiert für 55 Aminosäuren und geht der S-Protein-codierenden Sequenz unmittelbar voraus (für weitere Einzelheiten siehe EP-A-0 278 940).Such particles may, for example, contain all or part or parts of the HBsAg precursor protein encoded by the coding sequence located in the HBV genome immediately upstream of the HBV S gene, referred to herein as the pre-S coding sequence. The pre-S coding sequence normally encodes 163 amino acids (in the case of HBV subtype ay) and comprises a pre-S1 coding sequence and a pre-S2 coding sequence. The latter encodes 55 amino acids and immediately precedes the S protein coding sequence (for further details see EP-A-0 278 940).

Antigene Subtypen von HBV sind serologisch definiert, und es hat sich gezeigt, daß diese auf einzelne Veränderungen der Basensequenz im HBsAg-codierenden Bereich des Genoms zurückzuführen sind (Okamoto et al., J. Virol. 74 1987, 5463-5467). Alle bekannten antigenen Subtypen enthalten jedoch die "a"-Determinante, die aus den Aminosäuren 124 bis 147 des HBsAg besteht. Ein Antikörper zur "a"-Determinante verleiht Schutz gegen alle Subtypen. Durch In-vitro-Mutagenese konnte gezeigt werden, daß das Cystein an Position 147 und das Prolin an Position 142 für die Entfaltung der vollen Antigenität der "a"-Determinante wesentlich sind (Ashton et al J Med. Virol 29 1989, Seite 196).Antigenic subtypes of HBV are defined serologically and it has been shown that these are due to individual changes in the base sequence in the HBsAg-coding region of the genome (Okamoto et al., J. Virol. 74 1987, 5463-5467). However, all known antigenic subtypes contain the "a" determinant, which consists of amino acids 124 to 147 of HBsAg. An antibody to the "a" determinant confers protection against all subtypes. In vitro mutagenesis has shown that the cysteine at position 147 and the proline at position 142 are essential for the development of the full antigenicity of the "a" determinant (Ashton et al J Med. Virol 29 1989, page 196).

Während des letzten Jahrzehnts sind mehrere verschiedene mutmaßliche Varianten des Hepatitis-B-Virus (HBV) beschrieben worden.During the last decade, several different putative variants of the hepatitis B virus (HBV) have been described.

Mc Mahon et al. haben berichtet, daß bei einem mit monoklonalen Anti-HBsAg-Antikörpern behandelten Lebertransplantationspatienten, wie sich von einer DNA-Sequenzanalyse ableiten ließ, ein Austausch von Glycin gegen Arginin in der mutmaßlichen den monoklonalen Antikörper bindenden Domaine von HBsAg gefunden wurde (Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B viruses, September 1989). Dieses Ergebnis liefert jedoch keinerlei Anreiz für die Synthese einer veränderten HBsAg-Aminosäuresequenz oder für die Entwicklung einer hierauf basierenden Impfstoff-Zusammensetzung.Mc Mahon et al. reported that in a liver transplant patient treated with monoclonal anti-HBsAg antibodies, as deduced from DNA sequence analysis, an exchange of glycine for arginine in the putative monoclonal antibody binding domain of HBsAg was found (Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B viruses, September 1989). However, this result does not provide any incentive for the synthesis of an altered HBsAg amino acid sequence or for the development of a vaccine composition based on it.

In einem anderen Bericht wurden trotz der Anwesenheit spezifischer Antikörper (Anti-HBs) nach Immunisierung mit einem von zwei zugelassenen Hepatitis-B-Impfstoffen bei Kindern und Erwachsenen zirkulierendes Hepatitis-B-Oberflächenantigen festgestellt, was auf virale Replikation hinweist (Zanetti et al., Lancet, November 1988, Seite 1132). Die Analyse des HBsAg mit monoklonalen Antikörpern ergab, daß das zirkulierende Antigen nicht die "a"-Determinante trug oder daß diese Determinante maskiert war. Man kam zu dem Entschluß, daß das Auftreten einer Variante des Hepatitis-B-Virus entdeckt worden war, möglicherweise als Folge eines epidemiologischen Drucks in Verbindung mit einer Immunisierung in einem endemischen Infektionsgebiet. Die Variante wurde jedoch nicht weiter beschrieben.In another report, despite the presence of specific antibodies (anti-HBs) after immunization with one of two licensed hepatitis B vaccines, circulating hepatitis B surface antigen was detected in children and adults, indicating viral replication (Zanetti et al., Lancet, November 1988, p. 1132). Analysis of HBsAg with monoclonal antibodies showed that the circulating antigen did not carry the "a" determinant or that this determinant was masked. It was concluded that the emergence of a variant of the hepatitis B virus had been discovered, possibly as a result of epidemiological pressure associated with immunization in an endemic area of infection. However, the variant was not further described.

Aus der Arbeit von Zanetti et al. wird deutlich, daß ein potentieller Nachteil bei den gegenwärtig verfügbaren Hepatitis-B-Impfstoffen darin besteht, daß sie - zumindest in einem Wirt mit einer dafür prädisponierten immunogenen Veranlagung - das Auftreten einer "Flucht-Mutante", d.h. eines replizierenden infektiösen Virus, das sich durch Mutation der neutralisierenden Immunität entzieht, zur Folge haben können. Solch ein verändertes Virus vermag zweifellos Krankheit auszulösen, und es kann angenommen werden, daß es übertragbar ist. Die Virus-Variante könnte daher ein ernstes Immunisierungsproblem hervorrufen, da sie nicht wirkungsvoll durch Antikörper neutralisiert wird, die von Impfstoffen erzeugt werden, welche auf dem normalen HBsAg beruhen.It is clear from the work of Zanetti et al. that a potential disadvantage of the currently available hepatitis B vaccines is that they may result in the emergence - at least in a host with a predisposed immunogenic predisposition - of an "escape mutant", i.e. a replicating infectious virus that evades neutralizing immunity by mutating. Such a modified virus is undoubtedly capable of causing disease and can be expected to be transmissible. The variant virus could therefore cause a serious immunization problem since it is not effectively neutralized by antibodies generated by vaccines based on the normal HBsAg.

Die vorliegende Erfindung überwindet den obigen mit den bekannten HBV-Impfstoffen verbundenen Nachteil oder mildert diesen zumindest.The present invention overcomes or at least mitigates the above disadvantage associated with the known HBV vaccines.

Erfindungsgemäß wird ein HBsAg-Protein oder ein Fragment davon geschaffen, das die Antigenität des HBV-Oberflächenantigens zeigt und dadurch gekennzeichnet ist, daß das Protein oder Fragment davon eine modifizierte "a"-Determinante umfaßt, in der sich an Position 145 der HBsAg-Sequenz eine hydrophilere Aminosäure als Glycin befindet.According to the invention, an HBsAg protein or a fragment thereof is created which exhibits the antigenicity of the HBV surface antigen and is characterized in that the protein or fragment thereof comprises a modified "a" determinant in which a more hydrophilic amino acid than glycine is located at position 145 of the HBsAg sequence.

Es versteht sich, daß das veränderte HBsAg auch Prä-S-Sequenzen enthalten kann, falls dies gewünscht wird.It is understood that the modified HBsAg may also contain pre-S sequences, if desired.

Das erfindungsgemäße veränderte HBsAg-Protein oder Fragment davon wird im folgenden als vHBsAg abgekürzt.The modified HBsAg protein or fragment thereof according to the invention is hereinafter abbreviated as vHBsAg.

Das vHBsAg liegt nicht in einer "natürlich vorkommenden" Form vor, sondern ist ein synthetisches oder hochgereinigtes Material, frei von Blutprodukten.The vHBsAg does not exist in a "naturally occurring" form, but is a synthetic or highly purified material, free of blood products.

Vorzugsweise entspricht das vHBsAg der Erfindung dem vollständigen HBsAg und ist abgesehen von dem geänderten Aminosäurerest an Position 145 mit dem normalen HBsAg identisch.Preferably, the vHBsAg of the invention corresponds to the complete HBsAg and is apart from the modified amino acid residue at position 145 identical to the normal HBsAg.

Vorzugsweise liegt das vHBsAg in hochgereinigter Form vor, zum Beispiel in einer Reinheit von mehr als 75%, insbesondere von mehr als 90% und ganz besonders bevorzugt von 95-100%.Preferably, the vHBsAg is in a highly purified form, for example in a purity of more than 75%, in particular more than 90% and most preferably of 95-100%.

In einer anderen Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoff-Zusammensetzung geschaffen, die eine immunprotektive Menge des vHBsAg zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt.In another aspect of the present invention there is provided a vaccine composition comprising an immunoprotective amount of the vHBsAg together with a suitable carrier.

Weitere Erscheinungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben.Further aspects of the invention are described below.

Das vHBsAg und der Impfstoff der Erfindung können dazu dienen, die durch das Auftreten einer "Flucht-Mutante" erfahrenen Probleme zu überwinden, einer Flucht-Mutante, wie sie oben definiert ist und in welcher die "a"-Determinante des viralen HBsAg eine Modifikation erfahren hat. Der Impfstoff der Erfindung besitzt insbesondere den Vorteil, daß er dazu verwendet werden kann, gegen ein verändertes HBV zu schützen und dessen Auftreten oder Übertragung zu verhindern, wobei das veränderte HBV hier als Träger einer modifizierten "a"-Determinante in der HBsAg-Aminosäuresequenz definiert wird, in welcher sich an Position 145 eine hydrophilere Aminosäure als Glycin befindet.The vHBsAg and the vaccine of the invention can serve to overcome the problems experienced by the appearance of an "escape mutant", an escape mutant as defined above in which the "a" determinant of the viral HBsAg has undergone a modification. The vaccine of the invention has in particular the advantage that it can be used to protect against and prevent the appearance or transmission of an altered HBV, the altered HBV being defined here as carrying a modified "a" determinant in the HBsAg amino acid sequence in which an amino acid more hydrophilic than glycine is present at position 145.

Demgemäß wird auch ein Verfahren zum Schutz eines Menschen gegen Krankheitssymptome, die mit einer Infektion mit diesem veränderten HBV in Zusammenhang stehen, geschaffen, welches Verfahren die Verabreichung einer ungefährlichen und wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Impfstoffes an den Menschen beinhaltet.Accordingly, there is also provided a method of protecting a human against symptoms of disease associated with infection with said altered HBV, which method comprises administering to said human a safe and effective amount of the vaccine of the invention.

Eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung liefert vHBsAg zur therapeutischen und insbesondere prophylaktischen Verwendung.A further aspect of the present invention provides vHBsAg for therapeutic and especially prophylactic use.

Die Erfindung sieht auch die Verwendung von vHBsAg bei der Herstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung zum Schutz eines Menschen gegen Krankheitssymptome vor, die mit einer Infektion mit dem besagten veränderten HBV in Zusammenhang stehen.The invention also provides for the use of vHBsAg in the manufacture of a vaccine composition for protecting a human against disease symptoms associated with infection with said altered HBV.

Bei der Verwendung zur Immunisierung von Menschen gegen ein existierendes verändertes HBV-Virus wird deutlich werden, daß die vHBsAg-Sequenz in dem Impfstoff normalerweise mit der vHBsAg-Sequenz in dem veränderten HBV-Virus übereinstimmt oder zu dieser antigenisch entspricht.When used to immunize humans against an existing altered HBV virus, it will be apparent that the vHBsAg sequence in the vaccine will normally be identical or antigenically equivalent to the vHBsAg sequence in the altered HBV virus.

Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 145 in dem vHBsAg der Erfindung derart, daß sie durch eine Punktmutation im GGA-Codon, das im normalen HBsAg für Glycin an Position 145 codiert, erhalten werden kann.Preferably, the amino acid at position 145 in the vHBsAg of the invention is such that it can be obtained by a point mutation in the GGA codon which encodes glycine at position 145 in normal HBsAg.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Modifikation an Position 145 in der "a"-Determinante von HBsAg der Austausch von Glycin gegen Arginin, da, wie weiter unten noch beschrieben, diese Modifikation bei einer klinisch isolierten HBV-Variante gefunden wurde.In a particularly preferred embodiment of the invention, the modification at position 145 in the "a" determinant of HBsAg is the exchange of glycine for arginine, since, as described below, this modification was found in a clinically isolated HBV variant.

Zur genaueren Beschreibung der Erfindung wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen, von denen:For a more detailed description of the invention, reference is made to the following figures, of which:

Figur 1 eine schematische Ansicht eines Teils der normalen HBsAg-Aminosäuresequenz darstellt, welche die zwei Schleifen der "a"-Determinante und den Glycinrest an Position 145 zeigt;Figure 1 is a schematic view of a portion of the normal HBsAg amino acid sequence showing the two loops of the "a" determinant and the glycine residue at position 145;

Figur 2 eine schematische Ansicht der Nucleotidsequenz eines klinisch isolierten veränderten HBsAg darstellt, welche für PCR und Sequenzierung verwendete Primer-Bindungsstellen und das an den Positionen 587-589 gefundene AGA-Codon zeigt, das aus einer G-zu-A-Punktmutation an Position 587 in der normalen Sequenz resultiert;Figure 2 is a schematic view of the nucleotide sequence of a clinically isolated altered HBsAg showing primer binding sites used for PCR and sequencing and the AGA codon found at positions 587-589, resulting from a G-to-A point mutation at position 587 in the normal sequence;

Figur 3 eine schematische Darstellung des S-Gens auf dem Plasmid pRIT10601 oder pRIT13438 zeigt, welche Oligonucleotid-Bindungsstellen für die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) angibt;Figure 3 shows a schematic representation of the S gene on plasmid pRIT10601 or pRIT13438 indicating oligonucleotide binding sites for the polymerase chain reaction (PCR);

Figur 4 eine schematische Darstellung des Plasmids pRIT13438 ist;Figure 4 is a schematic representation of plasmid pRIT13438;

Figur 5 eine schematische Darstellung des Plasmids pNN2deltaEcoRI ist; undFigure 5 is a schematic representation of the plasmid pNN2deltaEcoRI; and

Figur 6 eine schematische Darstellung des Plasmids pRIT12775 ist. Polylinker 1 ist wie folgt:Figure 6 is a schematic representation of plasmid pRIT12775. Polylinker 1 is as follows:

0,01/BglII.ClaI.HindIII.BamHI.AvaI.SmaI.AvaI.XhoI.SalI.0.01/BglII.ClaI.HindIII.BamHI.AvaI.SmaI.AvaI.XhoI.SalI.

In einer weiteren Erscheinungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des vHBsAg und der daraus erhaltenen Impfstoff-Zusammensetzung geschaffen.In a further aspect of the invention, a process for preparing the vHBsAg and the vaccine composition obtained therefrom is provided.

Das vHBsAg wird vorzugsweise synthetisch erhalten, u. zw. entweder durch Peptidsynthese oder, noch mehr bevorzugt, durch DNA-Rekombinationstechniken.The vHBsAg is preferably obtained synthetically, either by peptide synthesis or, more preferably, by recombinant DNA techniques.

Verfahren zur Konstruktion, Manipulation und Verifizierung rekombinanter DNA-Moleküle und -Sequenzen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Um an Position 145 des normalen HBV-S-Proteins von HBsAg (Siehe Figur 1) Glycin gegen eine andere Aminosäure auszutauschen, um das vHBsAg der Erfindung zu erhalten, ist es erforderlich, das GGA-Codon an Position 433-435 der S-Gen-Nucleotidsequenz in ein anderes Codon umzuwandeln, das für die gewünschte Aminosäure codiert.Methods for constructing, manipulating and verifying recombinant DNA molecules and sequences are well known in the art. To replace glycine at position 145 of the normal HBV S protein of HBsAg (See Figure 1) with another amino acid to obtain the vHBsAg of the invention, it is necessary to convert the GGA codon at position 433-435 of the S gene nucleotide sequence to another codon encoding the desired amino acid.

Bei einer speziellen Ausführungsform wird vorgezogen, das GGA-Codon in - besonders bevorzugt - AGA oder - weniger bevorzugt - CGA oder CGC oder CGG oder CGT oder AGG umzuwandeln, Tripletts, die sämtlich für Arginin codieren.In a specific embodiment, it is preferred to convert the GGA codon into - more preferably - AGA or - less preferably - CGA or CGC or CGG or CGT or AGG, triplets all encoding arginine.

Es stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, um die passende Sequenzveränderung zu bewirken. Ein geeignetes Verfahren ist die vollständige De-novo-Synthese der gewünschten codierenden Sequenz mittels Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung der Codonhäufigkeiten von Viren oder Hefen.Several methods are available to effect the appropriate sequence change. One suitable method is the complete de novo synthesis of the desired coding sequence by phosphite or phosphoramidite chemistry using the codon frequencies of viruses or yeast.

DNA-Synthese ist von mehreren Firmen auf kommerzieller Basis erhältlich. Ein Beispiel für eine solche Gensynthese wird von Hayden und Mandecki, DNA 7: Seite 571 (1988) und der darin angegebenen Literatur beschrieben.DNA synthesis is available from several companies on a commercial basis. An example of such gene synthesis is described by Hayden and Mandecki, DNA 7: page 571 (1988) and the literature cited therein.

Ein zweites Verfahren besteht darin ein geeignetes Restriktionsfragment von einem Vektor, der bereits das HBV-Genom enthäit, an einem einzelsträngigen Vektor zu klonieren und daran anschließend eine ortsspezifische In-vitro-Mutagenese auszuführen, wie dies von Bofstein und Shortle, Science 229, Seite 1193 (1982) beschrieben ist. Eine Kultur von E. coli K12, Stamm C600, welche das rekombinante Plasmid pRIT10601 enthält, das ein in pBR322 geklontes HBV-Genom des Subtyps ay umfaßt, wurde gemäß dem Budapester Abkommen am 2. Juni 1982 unter der Zugangsnummer ATCC 39132 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Aus solchen Klonen können durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken die Sequenz, die für das S-Gen codiert, welches das 226 Aminosäuren umfassende HBsAg-Protein definiert, oder längere Sequenzen, die für Prä-S-Polypeptide codieren, herausgeschnitten werden.A second method is to clone an appropriate restriction fragment from a vector already containing the HBV genome into a single-stranded vector and then perform in vitro site-directed mutagenesis as described by Bofstein and Shortle, Science 229, p. 1193 (1982). A culture of E. coli K12, strain C600, containing the recombinant plasmid pRIT10601, which includes an HBV genome of subtype ay cloned into pBR322, was deposited with the American Type Culture Collection under the Budapest Agreement on June 2, 1982, under the accession number ATCC 39132. From such clones, the sequence encoding the S gene, which defines the 226 amino acid HBsAg protein, or longer sequences encoding pre-S polypeptides can be excised by standard recombinant DNA techniques.

Ein geeignetes Restriktionsfragment ist das 575 bp große XbaI-AccI-Fragment aus der S-Gen-codierenden Region von pRIT10601. Für In-vitro-Mutagenese geeignete Vektorsysteme sind kommerziell erhältlich. Das so erhaltene mutierte Genfragment wird wieder in das S-Gen inseriert.A suitable restriction fragment is the 575 bp XbaI-AccI fragment from the S gene coding region of pRIT10601. Vector systems suitable for in vitro mutagenesis are commercially available. The mutated gene fragment thus obtained is reinserted into the S gene.

Ein drittes Verfahren ist die Durchführung der gewünschten Mutationsveränderung mittels der Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wie von Ho et al., Gene 77: Seite 51 (1989) beschrieben.A third method is to perform the desired mutational change using the polymerase chain reaction (PCR) technique, as described by Ho et al., Gene 77: page 51 (1989).

In jedem Fall kann die vHBsAg-codierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in jedem geeigneten Wirt exprimiert werden.In any case, the vHBsAg coding sequence can be expressed under the control of an appropriate promoter in any suitable host.

Expressionsvektoren, welche die für vHBsAg codierende DNA-Sequenz enthalten, sind neu und bilden eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung. Wirte, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, bilden noch eine weitere Erscheinungsform der Erfindung.Expression vectors containing the DNA sequence encoding vHBsAg are novel and constitute a further aspect of the present invention. Hosts transformed with these expression vectors constitute yet a further aspect of the invention.

In einer bevorzugten Erscheinungsform kann S. cerevisiae, Pinchia pastoris oder Hansenula polymorpha als Wirt verwendet werden, und die Expression erfolgt unter der Kontrolle eines Hefepromotors, wie des Hefepromotors TDH3 (Gyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Gen, siehe Valenzuela et al 1982 Bitter et al 1988 oben) oder PH05 (Miyanohara et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 80, Seite 1, 1983), MOX, FMDH (siehe EP-A-0 299 108) und AOX (siehe EP-A-0 226 846).In a preferred form, S. cerevisiae, Pinchia pastoris or Hansenula polymorpha can be used as host and expression is under the control of a yeast promoter, such as the yeast promoter TDH3 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, see Valenzuela et al 1982 Bitter et al 1988 supra) or PH05 (Miyanohara et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 80, page 1, 1983), MOX, FMDH (see EP-A-0 299 108) and AOX (see EP-A-0 226 846).

Der transformierte Wirt kann durch herkömmliche Mittel kultiviert oder vermehrt werden, und das vHBsAg kann extrahiert und gereinigt werden. Die Reinigung des HBsAg aus Hefezellen ist im Fachgebiet wohlbekannt und kann gemäß der US 4,649,192, US 4,683,294, US 4,694,074 oder US 4,738,926 erfolgen. Die Reinigung des erfindungsgemäßen vHBsAg wird auf analoge Weise durchgeführt.The transformed host can be cultured or propagated by conventional means and the vHBsAg can be extracted and purified. Purification of HBsAg from yeast cells is well known in the art and can be carried out according to US 4,649,192, US 4,683,294, US 4,694,074 or US 4,738,926. Purification of the vHBsAg of the invention is carried out in an analogous manner.

Impfstoffe, welche das vHBsAg enthalten, werden durch herkömmliche Techniken hergestellt und werden eine immunprotektive Menge des vHBsAg enthalten, vorzugsweise in einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung und gemischt mit einem oder adsorbiert an eines der verschiedenen bekannten Adjuvantien wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat. Mit "immunprotektiv" ist gemeint, daß genug vHBsAg verabreicht wird, um eine ausreichende durch protektive Antikörper ausgelöste oder zellvermittelte Immunantwort hervorzurufen, die einen Schutz gegen den infektiösen Erreger ohne ernste Nebenwirkungen gewährt. Die zu verabreichende Menge an vHBsAg wird davon abhängen, ob der Impfstoff mit einem Adjuvans versehen ist, und wird im allgemeinen zwischen 1 bis 1000 ug Protein umfassen, zum Beispiel 1 bis 200 ug Protein, stärker bevorzugt 5 bis 40 ug Protein. Die Größe und Anzahl der zu verabreichenden Dosen kann in Standard-Dosisbereich-Untersuchungen bestimmt werden, welche die Beobachtungen von Antikörpertitern und anderen Antworten in Personen einbeziehen.Vaccines containing the vHBsAg are prepared by conventional techniques and will contain an immunoprotective amount of the vHBsAg, preferably in a buffered physiological saline solution and mixed with or adsorbed to one of the various known adjuvants such as aluminum hydroxide and aluminum phosphate. By "immunoprotective" is meant that enough vHBsAg is administered to elicit a sufficient protective antibody-induced or cell-mediated immune response to provide protection against the infectious agent without serious side effects. The amount of vHBsAg to be administered will depend on whether the vaccine is adjuvanted and will generally comprise between 1 to 1000 ug protein, for example 1 to 200 ug protein, more preferably 5 to 40 ug protein. The size and number of doses to be administered can be determined in standard dose-ranging studies which incorporate observations of antibody titres and other responses in subjects.

Das vHBsAg kann zwecks Formulierung des Impfstoffs auch mit anderen HBsAg wie dem normalen HBsAg oder homogenen oder zusammengesetzten HBsAg-Partikeln, welche das gesamte oder einen Teil oder Teile des Prä-S1- oder Prä-S2-Polypeptids enthalten, gemischt werden. Es kann auch mit hybriden HBsAg-Partikeln, welche Epitope von Proteinen anderer Organismen tragen, und mit anderen Immunogenen gemischt werden, um bivalente oder multivalente Impfstoffe zu bilden. Die Herstellung von Impfstoff wird allgemein in "Vaccines", herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, MD, U.S.A., 1978 beschrieben.The vHBsAg may also be mixed with other HBsAgs such as normal HBsAg or homogeneous or composite HBsAg particles containing all or part or parts of the pre-S1 or pre-S2 polypeptide to formulate the vaccine. It may also be mixed with hybrid HBsAg particles carrying epitopes from proteins of other organisms and with other immunogens to form bivalent or multivalent vaccines. The preparation of vaccine is generally described in "Vaccines", edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, MD, U.S.A., 1978.

Das vHBsAg kann als immunologisches Reagenz in Ausrüstungssätzen für den Nachweis von Infektionen mit einem veränderten HBV-Virus und dergleichen verwendet werden. Es kann auch verwendet werden, um mittels bekannter Verfahren polyklonale und monoklonale Antikörper zu vermehren, wobei einige dieser monoklonalen Antikörper spezifisch für das veränderte Antigen sein können und dann normales HBsAg nicht erkennen.The vHBsAg can be used as an immunological reagent in kits for the detection of infections with an altered HBV virus and the like. It can also be used to multiply polyclonal and monoclonal antibodies by known methods, some of these monoclonal antibodies may be specific for the altered antigen and then do not recognize normal HBsAg.

Demgemäß liefert eine weitere Erscheinungsform der Erfindung einen Ausrüstungssatz für den diagnostischen In-vitro-Nachweis von Anti-vHBsAg-Antikörpern in einem biologischen Medium und insbesondere von neutralisierenden Antikörpern nach einer Impfung, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:Accordingly, a further aspect of the invention provides a kit for the in vitro diagnostic detection of anti-vHBsAg antibodies in a biological medium and in particular of neutralizing antibodies following vaccination, characterized in that it comprises:

(a) vHBsAg wie hierin definiert und(a) vHBsAg as defined herein and

(b) zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion geeignete Mittel.(b) means suitable for detecting the antigen-antibody reaction.

In einer weiteren Erscheinungsform liefert die Erfindung ein den Anti-vHBsAg-Antikörper enthaltendes Antikörper-Präparat zur Verwendung bei der Vorbeugung gegen oder Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen bei Menschen. Die Erfindung ist in einem Verfahren zur Behandlung von Menschen mit einer wirksamen Menge derartiger Anti-vHBsAg-Antikörper zwecks Vorbeugung gegen oder Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen anwendbar.In a further aspect, the invention provides an antibody preparation containing the anti-vHBsAg antibody for use in preventing or treating hepatitis B infection in humans. The invention is embodied in a method of treating humans with an effective Amount of such anti-vHBsAg antibodies for the prevention or treatment of hepatitis B infections.

Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert werden.The invention will now be illustrated by the following examples.

example 1 Identification of a modified hepatitis B virus ("escape mutant") (a) Procedure (i) Immunization with HBV vaccine

1982 wurden in Italien mehrere Versuche mit HBV-Impfstoff begonnen. Verschiedene Zentren nahmen daran teil, von denen eines, die 4. Abteilung für Infektionskrankheiten am D.-Cotugno-Hospital in Neapel, 1590 Personen beobachtete. Die Region, aus der die meisten dieser Patienten kamen, die Campania, zeigt eine HBsAg-Häufigkeit von mehr als 5%. Die Patienten waren zum überwiegenden Teil Kinder von positiven HBsAg-Trägern aus zwei Regionen Süditaliens, die entweder mit HB-VAX (Merck Sharp und Döhme) oder mit HEVAC-B (Pasteur) geimpft wurden, beide aus Plasma gewonnene Impfstoffe. Es wurden Dosisgaben von 20 ug des ersteren für Erwachsene (10 ug für Kinder) zum Zeitpunkt 0,1 und 6 Monate oder 5 ug des letzteren zum Zeitpunkt 0, 1, 2 und 14 Monate verabreicht. Säuglingen wurden außerdem bei der Geburt und im Alter von 1 Monat 0,5 ml Hepatitis-B-Hyperimmunglobulin (HBIg) (Biagini), hergestellt mittels des Chonschen Ethanolfraktionierungsverfahrens, verabreicht. Mehrere familiäre Kontaktpersonen von Trägern, sowohl Erwachsene als auch Kinder, wurden ebenfalls geimpft.In 1982, several trials with HBV vaccine were started in Italy. Various centers participated, one of which, the 4th Infectious Diseases Department of the D. Cotugno Hospital in Naples, observed 1590 subjects. The region from which most of these patients came, Campania, shows an HBsAg frequency of more than 5%. The patients were mostly children of positive HBsAg carriers from two regions of southern Italy, who were vaccinated either with HB-VAX (Merck Sharp and Döhme) or with HEVAC-B (Pasteur), both plasma-derived vaccines. Doses of 20 µg of the former for adults (10 µg for children) at 0, 1 and 6 months or 5 µg of the latter at 0, 1, 2 and 14 months were administered. Infants were also given 0.5 ml of hepatitis B hyperimmune globulin (HBIg) (Biagini) prepared by the Chon ethanol fractionation method at birth and at 1 month of age. Several family contacts of carriers, both adults and children, were also vaccinated.

(ii) Hepatitis markers

Blutproben wurden unter Verwendung handelsüblicher Ausrüstungssätze (Abbott Laboratories) auf HBsAg, HBeAg, Anti-HBe, Anti-HBs und Anti-HBc getestet. Anti-HBs wurde durch Vergleich mit einer Standard-Kurve, die mittels Quantifizierungstafel (Abbott Laboratories) erzeugt wurde, geschätzt. HBsAg-Positivität wurde sowohl durch Testwiederholung als auch durch Neutralisierung unter Verwendung des "HBsAg Confirmatory Assay" bestätigt. HBsAg-Neutralisierung erfolgte mittels eines Serums, das fast ausschließlich Anti-a enthielt. Seren von Patienten mit Markern für virale Replikation wurden auch auf Alanin-Aminotransferase-Spiegel (ALT) getestet.Blood samples were tested for HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBs and anti-HBc using commercial kits (Abbott Laboratories). Anti-HBs was estimated by comparison with a standard curve generated using a quantification chart (Abbott Laboratories). HBsAg positivity was confirmed by both retesting and neutralization using the HBsAg Confirmatory Assay. HBsAg neutralization was achieved using a serum that contained almost exclusively anti-a. Sera from patients with markers of viral replication were also tested for alanine aminotransferase (ALT) levels.

(iii) HBsAg and anti-HBs subtyping

Die Subtypisierung von HBsAg wurde an den Trägerkontaktpersonen von 5 infizierten Säuglingen und 5 infizierten Kindern, an 6 von 8 der familiären Kontaktpersonen infizierter Erwachsener und an den Fäilen AS, AA und AE sowie 2 der Erwachsenenfälle vorgenommen. Zur Subtypisierung wurden mit Anti-a, Anti-d oder Anti-y beschichtete Perlen (Sorin Biomedica) über Nacht bei Raumtemperatur mit Serum inkubiert. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 13,2 uCi ¹²&sup5;I-Schaf-Anti-HBs zugesetzt, 1 Stunde lang bei 45ºC stehen gelassen, gewaschen und in einem Szintillationszähler quantifiziert. Eine Probe wurde als ay angesehen, wenn die erhaltenen Zählwerte bei Verwendung von entweder Anti-a oder Anti-y auf der festen Phase den Mittelwert der negativen Kontrollen (von 7 gesunden HBV-negativen Personen) um das 2,1-fache übertrafen und der mit den Anti-d-Perlen erhaltene geringer war als der Grenzwert. Proben wurden als nur y-reaktiv betrachtet, wenn die Zählwerte bei Zugabe zu Anti-y auf der festen Phase größer waren als der Grenzwert, jedoch bei Zugabe zu Anti-a- oder Anti-d-Festphasen unterhalb des Grenzwerts lagen.HBsAg subtyping was performed on carrier contacts of 5 infected infants and 5 infected children, 6 of 8 family contacts of infected adults, and cases AS, AA and AE and 2 of the adult cases. For subtyping, beads coated with anti-a, anti-d or anti-y (Sorin Biomedica) were incubated with serum overnight at room temperature. After washing with distilled water, 13.2 uCi 125I sheep anti-HBs were added, left for 1 hour at 45ºC, washed and quantified in a scintillation counter. A sample was considered ay if the counts obtained using either anti-a or anti-y on the solid phase exceeded the mean of the negative controls (of 7 healthy HBV-negative individuals) by 2.1-fold and that obtained with the anti-d beads was less than the cutoff. Samples were considered y-only reactive if the counts were greater than the cutoff when added to anti-y on the solid phase but were below the cutoff when added to anti-a or anti-d solid phases.

Die Spezifität der Reaktivität wurde durch Neutralisierung mit monoklonalen Antikörpern (Sorin Biomedica) bestätigt. HBsAg-positive Sera wurden vor der Subtypisierung mit monospezifischen Anti-a-, Anti-d- oder Anti-y-Antikörpern gemischt. Als Kontrolle wurde ein HBsAg-haltiges Referenzserum verwendet.The specificity of the reactivity was confirmed by neutralization with monoclonal antibodies (Sorin Biomedica). HBsAg-positive sera were mixed with monospecific anti-a, anti-d or anti-y antibodies before subtyping. A reference serum containing HBsAg was used as a control.

Anti-HBs-Subtypisierung wurde an den Fällen AS, AA und an 2 der Erwachsenenfälle mittels eines Sandwich-RIA vorgenommen, bei dem ein rekombinantes HBsAg (rHBsAg) eines Subtyps auf der festen Phase und ein radioiodiertes eines anderen Subtyps als die Sonde verwendet wurden. Polystyrolperlen wurden mit entweder ad- oder ay-rHBsAg beschichtet. Zum Auffinden von Anti-a wurden 0,2 ml Serum über Nacht bei Raumtemperatur mit Perlen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Perlen 2 Stunden bei 40ºC mit radioiodiertem rHBsAg inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Radioaktivität der Perlen gezählt. Für den ad-Subtyp-Test wurden mit ad beschichtete Perlen mit marklertem ad-rHBsAg sondiert; in gleicher Weise wurde beim ay-Test verfahren. Proben mit Zählwerten von mehr als dem 4-fachen des Mittelwertes der negativen Kontrollen waren positiv. Titer wurden in mIU/ml bezogen auf eine Standard-Tafel ausgedrückt. Der Prozentsatz an Anti-a in einem Serum wurde bestimmt durch die Berechnung: Anti-a durch Anti-ad oder Anti-ay mal 100.Anti-HBs subtyping was performed on cases AS, AA, and 2 of the adult cases using a sandwich RIA using a recombinant HBsAg (rHBsAg) of one subtype on the solid phase and a radioiodinated one of another subtype as the probe. Polystyrene beads were coated with either ad- or ay-rHBsAg. To detect anti-a, 0.2 ml of serum was incubated with beads overnight at room temperature. After washing, beads were incubated with radioiodinated rHBsAg for 2 hours at 40ºC. After washing, the radioactivity of the beads was counted. For the ad subtype test, ad-coated beads were probed with labeled ad-rHBsAg; the same procedure was used for the ay test. Samples with counts greater than 4 times the mean of the negative controls were positive. Titers were expressed in mIU/ml relative to a standard panel. The percent of anti-a in a serum was determined by the calculation: anti-a divided by anti-ad or anti-ay times 100.

(iv) Patients for sequencing studies

Eine HBsAg-, HBeAg- und Anti-HBc-positive Trägerin (Patient IE) mit einem ALT von 105 wurde am 5. März 1983 von einem männlichen Kind (AS) entbunden. Der Vater war Anti-HBc- und Anti-HBs-positiv. Zum Zeitpunkt der Geburt und 1 Monat später wurden dem Jungen 1,5 ml HBIg verabreicht und er wurde im Alter von 3 Monaten, 4 Monaten und 9 Monaten mit HB-VAX (Merck Sharp und Dohme) geimpft. Für Sequenzierungsuntersuchungen wurden Sera von der Mutter zum Zeitpunkt der Entbindung, vom Kind im Alter von 11 Monaten (HBsAg-, HBeAg- und Anti-HBc-positiv; Anti-HBs 420 mIU/ml; ALT 120) und 5 Jahre später (HBsAg- und HBeAg-positiv, Anti-HBs-negativ; ALT 36) gewählt. Überdies wurden Sera von 4 nach dem Zufallsprinzip ausgewählten italienischen HBeAg-positiven Trägern, die nicht an der Studie teilnahmen, und von 3 britischen HBsAg-positiven Patienten sequenziert.An HBsAg, HBeAg and anti-HBc positive carrier (patient IE) with an ALT of 105 gave birth to a male child (AS) on March 5, 1983. The father was anti-HBc and anti-HBs positive. At the time of birth and 1 month later, the boy was administered 1.5 ml of HBIg and vaccinated with HB-VAX (Merck Sharp and Dohme) at 3 months, 4 months and 9 months of age. Sera from the mother at delivery, from the child at 11 months of age (HBsAg, HBeAg and anti-HBc positive; anti-HBs 420 mIU/ml; ALT 120) and 5 years later (HBsAg and HBeAg positive, anti-HBs negative; ALT 36) were selected for sequencing studies. In addition, sera from 4 randomly selected Italian HBeAg-positive carriers who did not participate in the study and from 3 British HBsAg-positive patients were sequenced.

(v) PCR and direct sequencing

50 ul Serum wurden in 25 mM Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,5% SDS und 1 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) in einem Volumen von 200 ul über Nacht bei 37ºC verdaut. Nach 2 Phenol/Chloroform- und 2 Chloroform-Extraktionen wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt, und das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 20 ul Wasser resuspendiert. PCR wurde an 10 ul der DNA mit jeweils 300 pmol der Primer BCS2 und BCS4 unter Verwendung des Verfahrens von Carman et al Lancet, 1989, ii, 588-591 durchgeführt. Einzelheiten der Zielsequenz, Primer-Bindungsstellen und Primersequenzen sind in Figur 2 angegeben.50 µl of serum was digested in 25 mM sodium acetate, 2.5 mM EDTA, 0.5% SDS and 1 mg/ml proteinase K (Boehringer Mannheim) in a volume of 200 µl overnight at 37ºC. After 2 phenol/chloroform and 2 chloroform extractions, the DNA was precipitated with ethanol and the pellet was washed with 70% ethanol. The pellet was resuspended in 20 µl of water. PCR was performed on 10 µl of the DNA with 300 pmol each of primers BCS2 and BCS4 using the method of Carman et al Lancet, 1989, ii, 588-591. Details of the target sequence, primer binding sites and primer sequences are given in Figure 2.

Nach einer Agarosegelelektrophorese mit 10 ul des Reaktionsansatzes zwecks Bestätigung des Vorhandenseins amplifizierter DNA wurde das übrige Material durch eine G-50-Sephadexsäule (Pharmacia) laufen gelassen und mit Ethanol ausgefallt. Nach drei Waschgängen mit 70%igem Ethanol wurde das Pellet in 20 ul Wasser resuspendiert. In der Zwischenzeit wurden 10 pmol des Sequenzierprimers BCS3 in einem Standardpuffer mit 10 uCi Gamma³²P-ATP unter Verwendung von 10 U Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 20 ul endmarkiert. Der Sequenzierprimer wurde nach dem Markieren nicht säulengereinigt.After agarose gel electrophoresis of 10 μl of the reaction mixture to confirm the presence of amplified DNA, the remaining material was passed through a G-50 Sephadex column (Pharmacia) and ethanol precipitated. After three washes with 70% ethanol, the pellet was resuspended in 20 μl of water. In the meantime, 10 pmol of the sequencing primer BCS3 was end-labeled in a standard buffer containing 10 uCi gamma32P-ATP using 10 U polynucleotide kinase (Boehringer Mannheim) in a final volume of 20 μl. The sequencing primer was not column purified after labeling.

4 ul der DNA wurden zu 4 ul des markierten BCS3 in Gegenwart von 2 ul 5X-Puffer, wie er in dem Sequenase-Kit (United States Biochemicals) mitgeliefert wird, zugesetzt, auf 95ºC erhitzt und langsam auf 50ºC abgekühlt. Es wurden die Anweisungen des Herstellers eingehalten, mit der Ausnahme, daß der Markierungsschritt weggelassen wurde und die Terminationsgemische mit einer gleichen Menge an Wasser verdünnt wurden. Die Reaktionsansätze wurden auf einem 5%igen Sequagel-Polyacrylamidharnstoffgel (National Diagnostics) einer Elektrophorese unterzogen.4 μl of DNA was added to 4 μl of labeled BCS3 in the presence of 2 μl of 5X buffer as supplied in the Sequenase kit (United States Biochemicals). added, heated to 95ºC and slowly cooled to 50ºC. The manufacturer's instructions were followed except that the labeling step was omitted and the termination mixtures were diluted with an equal amount of water. The reactions were electrophoresed on a 5% Sequagel polyacrylamide urea gel (National Diagnostics).

(vi) Determination of hydrophobicity

Die Aminosäuren 139 bis 147 der "a"-Determinante vom normalen und dem mutierten HBsAg wurden unter Verwendung von Prosis-Software (Pharmacia) analysiert.Amino acids 139 to 147 of the "a" determinant of normal and mutated HBsAg were analyzed using Prosis software (Pharmacia).

(b) Results (i) Subtyping studies

Von den 1590 Impflingen entwickelten 44 (2,8%) HBsAg, von denen 12 eine nur schwache Reaktivität und keine weiteren HBV-Marker zeigten. Einzelheiten wurden anhand von 18 dieser Patienten gewonnen: 5 Säuglingen, deren Mütter Trägerinnen waren, 5 familiären Kontaktpersonen von Kindern und 8 familiären Kontaktpersonen von Erwachsenen.Of the 1590 vaccinees, 44 (2.8%) developed HBsAg, of which 12 showed only weak reactivity and no other HBV markers. Details were obtained from 18 of these patients: 5 infants whose mothers were carriers, 5 family contacts of children, and 8 family contacts of adults.

Bei allen Kontaktpersonen der infizierten Säuglinge und Kinder und bei 6 der 8 (sämtlich getestet) Kontaktpersonen von Erwachsenenfällen wurde der HBV-Subtyp ay festgestellt. Die Mutter von Fall AS wurde bei zwei Gelegenheiten als ay eingestuft, das erste Mal 2 Monate nach der Entbindung. Im Alter von 12 und 18 Monaten wurde beim Patienten AS eine schwache Positivität für Subtyp y und mit 46 Monaten, 6 Monate, nachdem Anti-HBs unnachweisbar geworden war, eine ay-Positivität festgestellt. Fall AA war 2 Jahre nach Beginn der Impfung, Fall AE 9 Monate danach und beide Erwachsenenfälle waren (26 und 28 Monate nach Immunisierung) nur y-positiv.HBV subtype ay was detected in all contacts of infected infants and children and in 6 of 8 (all tested) contacts of adult cases. The mother of case AS was classified as ay on two occasions, the first time 2 months after delivery. Patient AS was found to be weakly positive for subtype y at 12 and 18 months of age and ay-positive at 46 months, 6 months after anti-HBs became undetectable. Case AA was 2 years after vaccination initiation, case AE 9 months after, and both adult cases were only y-positive (26 and 28 months after immunization).

Diese Ergebnisse wurden mittels monoklonaler Reagenzien bestätigt. Alle Fälle mit y-haltigen Seren wurden mit Anti-y, jedoch nicht mit Anti-a neutralisiert.These results were confirmed using monoclonal reagents. All cases with y-containing sera were neutralized with anti-y but not with anti-a.

Die Subtypisierung von Anti-HBs ergab, daß 50-70% der Antikörper Anti-a waren. Beim Patienten AS waren in einem Alter von 6 Monaten und danach etwa 90% gegen die a-Determinante gerichtet.Subtyping of anti-HBs revealed that 50-70% of the antibodies were anti-a. In patient AS, at 6 months of age and thereafter, approximately 90% were directed against the a-determinant.

(ii) Sequencing of the "a" determinant

Durch Sequenzierung wurde beim Patienten AS eine Einzelmutation von Guanosin zu Adenosin (G zu A) an Position 587 (gezählt ab der einmalig vorhandenen EcoR1-Stelle des HBV-Genoms) festgestellt, die an der Aminosäure 145 des HBsAg einen Aminosäureaustausch von Glycin gegen Arginin zur Folge hat. Dieser Austausch hat sich als stabil erwiesen und war sowohl im Alter von 11 Monaten als auch im Alter von 5 Jahren vorhanden. Die Mutter, IE, und die Kontrollpatienten wiesen an dieser Stelle in dem Epitop Glycin auf, wie in allen bisher veröffentlichten Sequenzen. Sonst war die Sequenz der a-Determinante bei den Patienten AS und IE die gleiche und entsprach den früher veröffentlichten.Sequencing revealed a single mutation from guanosine to adenosine (G to A) at position 587 (counting from the unique EcoR1 site of the HBV genome) in patient AS, which results in an amino acid exchange of glycine for arginine at amino acid 145 of HBsAg. This exchange was found to be stable and was present at both 11 months and 5 years of age. The mother, IE, and the control patients had glycine at this position in the epitope, as in all previously published sequences. Otherwise, the sequence of the a-determinant in patients AS and IE was the same and corresponded to those published previously.

(iii) Hydrophobicity diagram

Es wurde die relative Hydrophobiität der zweiten Schleife der a-Determinante von normalem HBsAg und diejenige vom Patienten AS bestimmt. Mittels des Verfahrens von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 1982, 105-132 wurde festgestellt, daß sich der mittlere Hydrophobizitäts-Index für die zweite Schleife von -1,3 auf -1,9 verändert hatte und bei Verwendung des Verfahrens von Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 1981, 3814-3828) von -0,5 auf -0,9.The relative hydrophobicity of the second loop of the a-determinant of normal HBsAg and that of patient AS was determined. Using the method of Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 1982, 105-132, it was found that the mean hydrophobicity index for the second loop had changed from -1.3 to -1.9 and using the method of Hopp and Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 1981, 3814-3828) from -0.5 to -0.9.

Example 2 Construction of an altered S gene coding sequence of the ay serotype, which includes an exchange of Gly for Arg at amino acid position 145

Vier Oligonucleotidprimer, BC17, BC144, BC145 und BC146, mit den unten angegebenen Sequenzen wurden durch herkömmliche Phosphoramidit-Chemie in einem DNA-Synthesegerät Biosearch 8600 gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert.Four oligonucleotide primers, BC17, BC144, BC145, and BC146, with the sequences given below were synthesized by conventional phosphoramidite chemistry in a Biosearch 8600 DNA synthesizer according to the manufacturer’s instructions.

BC17 5' GTCTAGACTGGTGGTGGACT3'BC17 5' GTCTAGACTGGTGGTGGACT3'

BC144 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATA 3'BC144 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATA 3'

BC145 5' CTTCGGACAGAAATTGCACCT 3'BC145 5' CTTCGGACAGAAATTGCACCT 3'

BC146 5' AGGTGCAATTTCTGTCCGAAG 3'BC146 5' AGGTGCAATTTCTGTCCGAAG 3'

Diese Oligonucleotide besitzen Homologie zur ay-S-Gen-Sequenz auf pRIT10601, wie in Figur 3 gezeigt, und werden als Primer für die Nucleotidverlängerung durch Tag-Polymerase mit dem ay-S-Gen als Matrize verwendet. Die unterstrichenen AGA- und TCT-Tripletts auf BC145 und BC146 codieren für den gewünschten Arg145-Austausch. Überdies ermöglicht die Sequenz GAATTCG auf BC144 die Einführung eines EcoRI-Restriktionsorts ein bp distal vom TAA-Terminationscodon der S-Gen-codierenden Sequenz. Die PCR-Reaktion wird nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer Cetus) unter Verwendung von entweder pRIT10601 oder des in Figur 4 dargestellten Plasmids pRIT13438 als Matrize durchgeführt. pRIT13438 ist ein herkömmlicher E.-coli-Vektor, der eine vollständige ay-S-Gen-codierende Sequenz enthält, die aus pRIT10601 stammt und von EcoR1- und BglII-Restriktionsorten flankiert wird, welche durch In-vitro-Manipulation eingeführt wurden. Etwa 1 bis 10 ng Matrizen-DNA wird mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% (Gew/Vol) Gelatine, jeweils 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, jeweils 1 uM des gewünschten Primers und 2,5 Einheiten Tag-Polymerase in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern gemischt. Es werden zwei getrennte Reaktionsgemische angesetzt, wobei das eine BC17 und BC146 mit der Matrize enthält und das andere BC144 und BC145 mit der Matrize enthält.These oligonucleotides have homology to the ay-S gene sequence on pRIT10601, as shown in Figure 3, and are used as primers for nucleotide extension by tag polymerase using the ay-S gene as a template. The underlined AGA and TCT triplets on BC145 and BC146 encode the desired Arg145 exchange. Moreover, the sequence GAATTCG on BC144 allows the introduction of a EcoRI restriction site one bp distal to the TAA termination codon of the S gene coding sequence. The PCR reaction is carried out according to the manufacturer's instructions (Perkin Elmer Cetus) using either pRIT10601 or the plasmid pRIT13438 shown in Figure 4 as a template. pRIT13438 is a conventional E. coli vector containing a complete ay S gene coding sequence derived from pRIT10601 flanked by EcoR1 and BglII restriction sites introduced by in vitro manipulation. Approximately 1 to 10 ng of template DNA is mixed with 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (w/v) gelatin, 200 µM each of dATP, dGTP, dCTP and dTTP, 1 µM each of the desired primer and 2.5 units of tag polymerase in a final volume of 100 microliters. Two separate reaction mixtures are prepared, one containing BC17 and BC146 with the template and the other containing BC144 and BC145 with the template.

Die zwei Gemische werden unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, bezogen von Van der Heyden, Brüssel, Belgien) 25 Zyklen von Denaturierung (2 min, 94ºC), Annealing (2 min, 48ºC) und Verlängerung (2 min, 72ºC) ausgesetzt, gefolgt von einem Zykius mit einer 15-minütigen Verlängerungszeit bei 72ºC. Das Vorhandensein des gewünschten amplifizierten Fragments in jeder Mischung wird durch konventionelle Agarosegelelektrophorese bestätigt, und die Fragmente werden durch das Laufenlassen über Centricon-100-Säulen (Amicon Division, W.R. Grace and Co, erhältlich von Van der Heyden, Brüssel, Belgien) gereinigt. Etwa 1 bis 10 ng jedes amplifizierten Fragments wird in einem einzelnen Reaktionsansatz mit den Primern BC17 und BC144 gemischt und genau wie oben beschrieben amplifiziert, ausgenommen, daß das Annealing bei 60ºC erfolgt.The two mixtures are subjected to 25 cycles of denaturation (2 min, 94ºC), annealing (2 min, 48ºC) and extension (2 min, 72ºC) using a DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, purchased from Van der Heyden, Brussels, Belgium), followed by a cycle with a 15-minute extension time at 72ºC. The presence of the desired amplified fragment in each mixture is confirmed by conventional agarose gel electrophoresis and the fragments are purified by passage over Centricon-100 columns (Amicon Division, W.R. Grace and Co, purchased from Van der Heyden, Brussels, Belgium). Approximately 1 to 10 ng of each amplified fragment is mixed with primers BC17 and BC144 in a single reaction and amplified exactly as described above, except that annealing is performed at 60ºC.

Anstelle von BC17 und BC144 können auch die weiteren Oligonucleotidprimer BC90 und BC153 mit den unten gezeigten Sequenzen verwendet werden.Instead of BC17 and BC144, the other oligonucleotide primers BC90 and BC153 with the sequences shown below can also be used.

BC90 5' ATGGAGAACATCACATCAGCATTCCTAGGA 3'BC90 5' ATGGAGAACATCACATCAGCATTCCTAGGA 3'

BC153 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATACCCAAAGACAAAA 3'BC153 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATACCCAAAGACAAAA 3'

BC90 besitzt Homologie zum 5'-Ende der ay-S-Gen-Sequenz, beginnend am Initiationscodon. BC153 überlappt BC144.BC90 has homology to the 5' end of the ay-S gene sequence starting at the initiation codon. BC153 overlaps BC144.

Es wurden zwei PCR-Reaktionsgemische angesetzt, wobei in dem einen BC90 und BC146 zusammen mit pRIT13438-DNA als Matrize und weitere Bestandteile wie oben angegeben und in dem anderen BC145 und BC153 zusammen mit pRIT13438 als Matrize und weitere Bestandteile wie oben angegeben enthalten waren. Die Zwei Gemische wurden dann 25 Zyklen von Denaturierung (2 min, 94ºC), Annealing (2 min, 48ºC) und Verlängerung (2 min, 72ºC) unterzogen, um eine Amplifikation zu ermöglichen. Dann wurden das gewünschte 445-bp-Fragment aus der BC90/BC146-Amplifikation und das 267-bp-Fragment aus der BC145/BC153-Amplifikation durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Elektroelution aufgereinigt.Two PCR reaction mixtures were prepared, one containing BC90 and BC146 together with pRIT13438 DNA as template and other components as above and in the other BC145 and BC153 were included together with pRIT13438 as template and other ingredients as indicated above. The two mixtures were then subjected to 25 cycles of denaturation (2 min, 94ºC), annealing (2 min, 48ºC) and extension (2 min, 72ºC) to allow amplification. Then the desired 445 bp fragment from BC90/BC146 amplification and the 267 bp fragment from BC145/BC153 amplification were purified by polyacrylamide gel electrophoresis and electroelution.

Etwa 10ng jedes Fragments wurden dann gemischt und in Gegenwart der Oligonucleotide BC90 und BC153 unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie oben beschrieben 25 PCR-Amplifikationszyklen unterzogen. Das resultierende amplifizierte Fragment von etwa 690 bp Länge wurde gesammelt und enthält einmalig vorkommende Erkennungsstellen für die Endonucleasen XbaI und EcoRI.Approximately 10 ng of each fragment was then mixed and subjected to 25 cycles of PCR amplification in the presence of oligonucleotides BC90 and BC153 under the same reaction conditions as described above. The resulting amplified fragment of approximately 690 bp in length was collected and contains unique recognition sites for the endonucleases XbaI and EcoRI.

Die Verwendung (iieser spezifischen Oligonucleotidprimer, der ay-S-Gen-Matrize und der PCR-Reaktion führt zur Erzeugung eines veränderten 590 bp großen S-ay-Fragments, das den Arg145-Austausch und 5'-XbaI- sowie 3'-EcoRI-Verlängerungen aufweist. Das gewünschte Fragment wird vorzugsweise von Primern und anderen Produkten der PCR-Reaktion gereinigt, indem es über eine Centricon-100-Säule geschickt wird. Das Fragment wird dann mittels konventioneller Klonierungstechniken an die Stelle des entsprechenden XbaI-EcoRI-Fragments einer normalen viralen codierenden Sequenz gesetzt, die vorzugsweise mit einem Hefepromotor fusioniert ist. Ein für diese Zwecke geeigneter Vektor ist pNN2deltaEcoRI, gezeigt in Figur 5, bei dem eine S-codierende Sequenz des Serotyps ad mit dem Hefepromotor TDH3 fusioniert worden ist und sich stromaufwärts des Hefetranskriptionsterminators ARG3 befindet, um eine Expressionskassette zu bilden. Die Konstruktion und Verwendung solcher Expressionskassetten wird in der EP-A-0 278 940 gelehrt. Für einen Fachmann ist ersichtlich, daß jeder geeignete Vektor dieses Typs verwendet werden kann, je nachdem, welche Promotor- und Transkriptionsterminator-Fragmente zur Kontrolle der Expression in den als Wirt gewählten Hefearten gewählt werden. Überdies könnten durch Verwendung von anderen Primern als BC144 andere Restriktionsorte am 3'-Ende des veränderten Fragments eingeführt werden. Weiters liegen alle zu einem Austausch von Aminosäuren führenden Nucleotidunterschiede zwischen bekannten HBV-Isolaten der Serotypen adw und ayw stromabwärts der XbaI-Stelle, so daß der Einbau des durch PCR erhaltenen veränderten XbaI-EcoRI-Fragments in pNN2deltaEcoRI zu einer ayw-codierenden Sequenz führt.The use of these specific oligonucleotide primers, the ay S gene template and the PCR reaction results in the generation of an altered 590 bp S ay fragment having the Arg145 substitution and 5'-XbaI and 3'-EcoRI extensions. The desired fragment is preferably purified from primers and other products of the PCR reaction by passing it over a Centricon-100 column. The fragment is then placed in place of the corresponding XbaI-EcoRI fragment of a normal viral coding sequence, preferably fused to a yeast promoter, using conventional cloning techniques. A vector suitable for this purpose is pNN2deltaEcoRI, shown in Figure 5, in which a serotype ad S coding sequence has been fused to the yeast promoter TDH3 and is located upstream of the yeast transcription terminator ARG3. to form an expression cassette. The construction and use of such expression cassettes is taught in EP-A-0 278 940. It will be apparent to a person skilled in the art that any suitable vector of this type can be used, depending on which promoter and transcription terminator fragments are chosen to control expression in the yeast species chosen as host. Moreover, by using primers other than BC144, other restriction sites could be introduced at the 3' end of the altered fragment. Furthermore, all nucleotide differences leading to an exchange of amino acids between known HBV isolates of serotypes adw and ayw downstream of the XbaI site, so that incorporation of the PCR-derived altered XbaI-EcoRI fragment into pNN2deltaEcoRI results in an ayw coding sequence.

Etwa 1,5 ug des aus den oben beschriebenen PCR-Reaktionen mit BC90, BC153, BC145 und BC146 resultierenden 690-bp-Fragments wurden mit den Endonucleasen XbaI und EcoRI verdaut, und etwa 0,15 ug des verdauten Fragments wurden mit etwa 50 ng des Vektors pRIT12642, der mit den Endonucleasen XbaI und EcoRI verdaut und dephosphoryliert worden war, gemischt und ligiert. pRIT12642 ist mit dem in Figur 5 gezeigten Vektor pNN2deltaEcoRI genau identisch. Aus dem Ligationsgemisch wurde ein Plasmid gewonnen und mit pRIT13555 bezeichnet, das das die modifizierte S-codierende Sequenz tragende XbaI-EcoRI-Fragment, eingesetzt zwischen den XbaI- und EcoRI-Stellen auf dem Vektor pRIT12642, enthält, so daß eine Expressionskassette gebildet wird, in der sich die veränderte ay-codierende Sequenz 3' zum und unter der Kontrolle des Promotors TDH3 befindet.Approximately 1.5 µg of the 690 bp fragment resulting from the PCR reactions with BC90, BC153, BC145 and BC146 described above was digested with the endonucleases XbaI and EcoRI, and approximately 0.15 µg of the digested fragment was mixed and ligated with approximately 50 ng of the vector pRIT12642 digested and dephosphorylated with the endonucleases XbaI and EcoRI. pRIT12642 is exactly identical to the vector pNN2deltaEcoRI shown in Figure 5. A plasmid was obtained from the ligation mixture and designated pRIT13555, which contains the XbaI-EcoRI fragment carrying the modified S-coding sequence inserted between the XbaI and EcoRI sites on the vector pRIT12642, so that an expression cassette is formed in which the modified ay-coding sequence is located 3' to and under the control of the promoter TDH3.

Die wie oben beschrieben erhaltene resultierende vHBsAg-Expressionskassette wird als ein 2,89-kb-Fragment aus dem ein pNN2deltaEcoRI-Derivat darstellenden Plasmid durch Verdauung mit den Endonucleasen BglII und SalI herausgeschnitten und in irgendeinen Vektor der Wahl zur Einführung in Hefe inseriert. Ein geeigneter Vektor mit hoher Kopienzahl ("multicopy"-Vektor) für S. cerevisiae ist pRIT12775, schematisch in Figur 6 dargestellt, der einen Polylinker inseriert zwischen der EcoRI-Stelle und der SalI-Stelle auf dem pBR327-Replikon enthält und der mittels herkömmlicher DNA-Manipulationstechniken unter Verwendung wohlbekannter DNA-Fragmente hergestellt wurde. Durch Endonucleaseverdauung wurde das 2,98-BglII-SalI-Kassettenfragment aus pRIT13555 gewonnen und durch herkömmliche Klonierungstechniken zwischen die BglII- und die SalI-Stelle von pRIT12775 inseriert, um das Plasmid pRIT13557 zu bilden. Wenn es wünschenswert ist, die Kassette in das Hefegenom einzubauen, wird ein integrativer Vektor wie der bei Jacobs et al., Gene 80, Seite 279 (1989) beschriebene bevorzugt. Wenn eine Insertion der vHBsAg-Expressionskassette in pRIT12775 durchgeführt wird, werden Hefezellen einer Leucin2-Mangelmutante durch das Verfahren von Ito et al., J. Bacteriol. 153: Seite 163 (1983) transformiert, wobei auf Leucin-unabhängige Transformanten hin selektiert wird. Ein geeigneter Empfängerstamm mit einer doppelten leu2-Mutation ist der Stamm DC5, der gemäß dem Budapester Abkommen am 2. Juni 1982 unter der Zugangsnummer ATCC 20630 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden ist.The resulting vHBsAg expression cassette obtained as described above is excised as a 2.89 kb fragment from the pNN2deltaEcoRI derivative plasmid by digestion with the endonucleases BglII and SalI and inserted into any vector of choice for introduction into yeast. A suitable high copy number ("multicopy" vector) for S. cerevisiae is pRIT12775, shown schematically in Figure 6, which contains a polylinker inserted between the EcoRI site and the SalI site on the pBR327 replicon and which was constructed by conventional DNA manipulation techniques using well-known DNA fragments. The 2.98 BglII-SalI cassette fragment was recovered from pRIT13555 by endonuclease digestion and inserted between the BglII and SalI sites of pRIT12775 by conventional cloning techniques to form plasmid pRIT13557. If it is desirable to incorporate the cassette into the yeast genome, an integrative vector such as that described in Jacobs et al., Gene 80:279 (1989) is preferred. If insertion of the vHBsAg expression cassette into pRIT12775 is performed, yeast cells are transformed into a leucine2-deficient mutant by the method of Ito et al., J. Bacteriol. 153:163 (1983), selecting for leucine-independent transformants. A suitable recipient strain with a double leu2 mutation is strain DC5, which was deposited in the American Type Culture Collection under the Budapest Agreement on June 2, 1982, under accession number ATCC 20630.

Ein weiterer geeigneter Stamm ist ein cirº-Abkömmling von DC5, der gemäß dem Budapester Abkommen am 18. August 1986 unter der Zugangsnummer ATCC 20820 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden ist. Der Stamm DC5 cirº wurde mittels des oben angeführten Verfahrens von Ito et al. mit pRIT13557-DNA transformiert und auf Leucin-unabhängige Kolonien hin selektiert. Es wurde eine Transformanten-Kolonie zurückbehalten und subkultiviert, um den mit Y1648 bezeichneten Stamm zu etablieren.Another suitable strain is a cirº derivative of DC5, which was deposited in the American Type Culture Collection under the Budapest Agreement on August 18, 1986, under accession number ATCC 20820. The DC5 cirº strain was transformed with pRIT13557 DNA using the method of Ito et al. above and selected for leucine-independent colonies. A transformant colony was retained and subcultured to establish the strain designated Y1648.

Eine die vHBsAg-codierende Sequenz tragende Expressionskassette kann auch in Wirtszellen von S. cerevisiae, H. polymorpha oder P. pastoris eingeführt werden, die weitere Expressionskassetten tragen, so daß zusammengesetzte HBsAg-Partikel gebildet werden, die ein Gemisch zweier oder mehrerer Polypeptidarten enthalten.An expression cassette carrying the vHBsAg coding sequence can also be introduced into host cells of S. cerevisiae, H. polymorpha or P. pastoris carrying other expression cassettes to form composite HBsAg particles containing a mixture of two or more polypeptide species.

Konventionelle Klonierungstechniken wurden verwendet, um eine 2,98-kb-Expressionskassette zu konstruieren, die aus dem Hefepromotor TDH3, der codierenden Sequenz des S-Gens vom Subtyp ay aus pRIT10601 und dem Hefeterminator-Fragment ARG3 besteht. Diese Kassette wurde dann zwischen der BglII- und der SalI-Stelle von pRIT12775 inseriert, um pRIT13558 zu bilden. pRIT13558 wurde dann durch Transformation unter Verwendung der oben angeführten Technik von Ito et al. in den Empfängerstamm DC5 cirº eingeführt, wobei auf Leucin-Unabhängigkeit selektiert wurde. Es wurde eine Transformanten-Kolonie zurückbehalten und subkultiviert, um den mit Y1654 bezeichneten Stamm zu etablieren.Conventional cloning techniques were used to construct a 2.98 kb expression cassette consisting of the yeast promoter TDH3, the coding sequence of the S gene subtype ay from pRIT10601, and the yeast terminator fragment ARG3. This cassette was then inserted between the BglII and SalI sites of pRIT12775 to form pRIT13558. pRIT13558 was then introduced into the recipient strain DC5 cirº by transformation using the technique of Ito et al. above, selecting for leucine independence. A transformant colony was retained and subcultured to establish the strain designated Y1654.

Der Stamm Y1654 exprimiert HBsAg des Subtyps ay, das als Kontrolle bei der Untersuchung der Eigenschaften des vHBsAg der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.Strain Y1654 expresses HBsAg of subtype ay, which can be used as a control in investigating the properties of the vHBsAg of the present invention.

Die Subklonierung und Expression von Partikeln des Subtyps ay in Hefe unter Verwendung von pRIT10601 als Ausgangsmaterial und des Hefepromotors ARG3 ist von De Wilde et al. in Devel. Biol. Standard. 59, 99-107 (1985) beschrieben worden.The subcloning and expression of particles of the ay subtype in yeast using pRIT10601 as starting material and the yeast promoter ARG3 has been described by De Wilde et al. in Devel. Biol. Standard. 59, 99-107 (1985).

Es werden Kulturen von Y1648 und Y1654 gezüchtet und das HBsAg extrahiert und in den rohen Zellextrakten mittels AUSRIA-Radioimmunoassay (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, U.S.A.) gemessen. Unten sind die Ergebnisse des Tests von jeweils zwei Kulturen von Y1648 und Y1654 angegeben STAMM KULTUR NUMMER PROTEIN (g/l Kultur) HBsAg durch AUSRIA HBsAg als Prozent ProteinCultures of Y1648 and Y1654 are grown and HBsAg is extracted and detected in the crude cell extracts using AUSRIA radioimmunoassay (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, USA). Below are the results of testing two cultures each of Y1648 and Y1654 STRAIN CULTURE NUMBER PROTEIN (g/l culture) HBsAg by AUSRIA HBsAg as percent protein

Stamm Y1648 produziert im Vergleich zu Stamm Y1654 etwa 10-mal weniger aufscheinendes AUSRIA-reaktives Material. Western-Blotting roher Zellextrakte unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers HBS1 (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, Belgien), der das denaturierte und reduzierte HBV-Oberflächenantigen-Polypeptid erkennt, zeigte, daß Y1648 etwa dieselbe Menge an HBS1-reaktivem Protein mit einer Molekülmasse von 24k wie Y1654 produzierte.Strain Y1648 produces approximately 10-fold less apparent AUSRIA-reactive material than strain Y1654. Western blotting of crude cell extracts using the monoclonal antibody HBS1 (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, Belgium), which recognizes the denatured and reduced HBV surface antigen polypeptide, showed that Y1648 produced approximately the same amount of HBS1-reactive protein with a molecular mass of 24k as Y1654.

Verfahren zur Kultivierung von Hefezellen, Extraktion und Untersuchung von HBsAg sowie Western-Blotting-Verfahren sind in der EP-A-0 278 940 und EP-A-0 414 374 zu finden, die hiermit beide durch Bezugnahme aufgenommen werden.Methods for culturing yeast cells, extracting and assaying HBsAg and Western blotting techniques can be found in EP-A-0 278 940 and EP-A-0 414 374, both of which are hereby incorporated by reference.

Oberflächenantigen-Material wurde durch herkömmliche Verfahren gemäß den oben angeführten US-Patenten 4,649,192 und 4,683,294 aus Zellextrakten von sowohl Y1648 als auch Y1654 gewonnen und gereinigt.Surface antigen material was obtained and purified from cell extracts of both Y1648 and Y1654 by conventional methods according to US Patents 4,649,192 and 4,683,294 cited above.

Die Präparationen bestanden aus im wesentlichen reinem HBV-Oberflächenantigen-Protein, wie die Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung ergab, die einzelne Hauptbanden von Protein bei 24k zusammen mit Spuren von Dimeren und Multimeren zeigte.The preparations consisted of essentially pure HBV surface antigen protein as determined by SDS-PAGE and silver staining, which showed single major bands of protein at 24k together with traces of dimers and multimers.

Zwei Präparationen von aus Hefe stammendem HBsAg aus Stamm Y1654 lieferten AUSRIA/Protein-Verhältnisse von 1,64 und 2,79, während zwei vHBsAg-Präparationen aus Stamm Y1648 verringerte AUSRIA/Protein-Verhältnisse von 0,1 und 0,13 lieferten.Two preparations of yeast-derived HBsAg from strain Y1654 yielded AUSRIA/protein ratios of 1.64 and 2.79, while two vHBsAg preparations from strain Y1648 yielded reduced AUSRIA/protein ratios of 0.1 and 0.13.

Gereinigtes vHBsAg von Stamm Y1648 wurde nach Färbung mit Uranylacetat elektronenmikroskopisch untersucht. Das Material zeigte die Anwesenheit sphärischer Partikel, wie sie für das HBV-Oberflächenantigen typisch sind.Purified vHBsAg from strain Y1648 was examined by electron microscopy after staining with uranyl acetate. The material showed the presence of spherical particles typical for the HBV surface antigen.

Example 3 Preparation of a vaccine composition

Einer sterilen, gepufferten wässerigen Lösung von 3% Aluminiumhydroxid in 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,8 wird unter ständigem Rühren das im gleichen Puffer befindliche vHBsAg von Beispiel 2 bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 40 ug Protein und 0,5 mg Aluminium (Al³&spplus;) pro ml zugesetzt. Es wird dann Thimerosal (Natriummerthiolat) bis zu einer Endkonzentration von 1 in 20.000 (Gew/Vol) als Konservierungsstoff zugesetzt.To a sterile, buffered aqueous solution of 3% aluminum hydroxide in 10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 6.8, with constant stirring, is added the vHBsAg of Example 2 in the same buffer to a final concentration of 5 to 40 µg protein and 0.5 mg aluminum (Al³⁺) per ml. Thimerosal (sodium merthiolate) is then added to a final concentration of 1 in 20,000 (w/v) as a preservative.

Der Impfstoff eignet sich für die parenterale Verabreichung an Menschen.The vaccine is suitable for parenteral administration to humans.

Claims

1. Hepatitis B surface antigen protein or fragment thereof which exhibits the antigenicity of the HBV surface antigen, characterized in that said protein or fragment thereof (vHBsAg) comprises a modified "a" determinant in which a more hydrophilic amino acid than glycine is located at position 145 of the HBsAg sequence.

2. vHBsAg according to claim 1, wherein the amino acid at position 145 can be obtained by a point mutation in the GGA codon, which in the normal HBsAg codes for glycine at position 145.

3. vHBsAg according to claim 1 or 2, which is identical to the normal HBsAg S protein apart from the modified amino acid residue at position 145.

4. vHBsAg according to claim 1, 2 or 3, wherein the modification at position 145 is the exchange of glycine for arginine.

5. vHBsAg according to one of claims 1 to 4, which has a higher degree of purity than 75%.

6. Expression vector comprising a DNA sequence encoding a vHBsAg according to any one of claims 1 to 4.

7. A host transformed with the vector of claim 6.

8. A vaccine composition comprising an effective amount of a vHBsAg according to claim 5, mixed with a suitable carrier or adjuvant.

9. A process for producing a vHBsAg according to any one of claims 1 to 5, which process comprises the steps of culturing a host according to claim 7 in a suitable culture medium and purifying the vHBsAg produced to the required degree of purity.

10. Use of a vHBsAg according to any one of claims 1 to 5 in the manufacture of a vaccine for protecting a human against a disease associated with HBV.

11. Kit for the in vitro diagnostic detection of anti-vHBsAg antibodies in a biological medium, characterized in that the kit comprises:

(a) vHBsAg according to any one of claims 1 to 5 and

(b) means suitable for detecting the antigen-antibody reaction.

12. An antibody preparation comprising antibodies against vHBsAg as defined in any one of claims 1 to 5 for use in the prevention, diagnosis or treatment of hepatitis B infections in humans.