DE69111801T2

DE69111801T2 - Vakzin gegen hepatitis b.

Info

Publication number: DE69111801T2
Application number: DE69111801T
Authority: DE
Inventors: Thomas Howard Christopher; Carman Wiliam Frederick
Original assignee: Imperial College of London
Current assignee: Imperial College of London
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2011-03-26
Also published as: IE911022A1; IE67877B1; DK0522030T3; EP0522030A1; JP3049018B2; JPH05505805A; JP2876091B2; GR3017804T3; PT97159A; GB9007024D0; AU642729B2; ES2075440T3; CA2078694C; US6099840A; NZ237611A; KR100208129B1; CA2078694A1; AU7561391A; JPH11178591A; WO1991014703A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle, die für Polypeptide mit der Spezifität eines viralen Hepatitis-B-Antigens codieren.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine Impfstoff-Zusammensetzung zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern in Menschen gegen ein verändertes Hepatitis-B-Virus.
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein ernstes, weitverbreitetes Problem, aber nun sind Impfstoffe, die für eine Durchimpfung verwendet werden können, verfügbar, zum Beispiel das Produkt "Engerix-B" (SmithKline Beecham p.l.c.), das gentechnisch hergestellt wird.
Das Klonen von Genomen von Hepatitis-B-Virionen verschiedener Serotypen ist im Fachbereich wohlbekannt; siehe Miller et al., Hepatology 9 (1989), Seite 322 und die darin angegebene Literatur. Dane-Partikel, die Hepatitis-B-Virionen sind und die aus infizierten Patienten isoliert werden können, besitzen einen Durchmesser von etwa 42 nm. Sie bestehen jeweils aus einer Hülle, welche das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), ein Capsid (HBcAg), eine endogene Polymerase und ein DNA-Genom umfaßt. Ein drittes Polypeptid, das "e"-Antigen (HBeAg) wird von dem Hepatitis-B-Virus hergestellt und findet sich in gelöster Form im Serum.
Im Handel erhältliche Impfstoffe gegen HBV enthalten das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) entweder in nativer oder in rekombinanter Form. Das authentische Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen kann aus dem Plasma infizierter Personen als ein Partikel von etwa 22 nm gewonnen werden, das aus zwei Proteinen besteht, die als P24 und sein glykosyliertes Derivat GP28 bekannt sind und die beide von der 226 Aminosäuren codierenden Sequenz des HBV-Genoms, bekannt als S-Protein-codierende Sequenz oder HBV-S-Gen, codiert werden; siehe Tiollais et al., Nature 317 (1985), Seite 489 und die darin angegebene Literatur. Die vollständige Aminosäuresequenz von HBsAg und die hierfür codierende Nucleotidsequenz ist in Valenzuela et al Nature 280 (1979), Seite 815 angegeben. In der vorliegenden Anmeldung wird das von Tiollais et al. (loco citato) zur Definition der Nucleotid- und Aminosäurepositionen verwendete Numerierungssystem verwendet.
Der Einbau von HBV-S-Gen codierenden Sequenzen unter der Kontrolle von Hefepromotoren in Expressionsvektoren, um eine Expression von HBsAg in S. cerevisiae zwecks Impfstofferzeugung zu ermöglichen, ist zum Beispiel von Harford et al. in Develop. Biol. Standard. 54: Seite 125 (1983), Valenzuela et al Nature 298, Seite 347 (1982) und Bitter et al J. Med. Virol. 25, Seite 123 (1988) beschrieben worden. Beschrieben wurde ebenfalls die Expression in Pinchia pastoris von Gregg et al., Biotechnology 5 (1987), Seite 479 (siehe auch die Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 226 846) sowie die Expression in Hansenula polymorpha (siehe EP-A-0 299 108).
Impfstoffe können auch aus hybriden immunogenen Partikeln, welche HBsAg-Protein umfassen, hergestellt werden, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 278 940 beschrieben ist.
Derartige Partikel können zum Beispiel das gesamte oder einen Teil oder Teile des HBsAg-Präkursor-Proteins enthalten, welches von der codierenden Sequenz codiert wird, die sich in dem HBV-Genom unmittelbar vor dem HBV-S-Gen befindet und hier als die Prä-S-codierende Sequenz bezeichnet wird. Die Prä-S-codierende Sequenz codiert normalerweise für 163 Aminosäuren (im Falle des HBV-Subtyps ay) und umfaßt eine Prä-S1-codierende Sequenz und eine Prä-S2-codierende Sequenz. Die letztere codiert für 55 Aminosäuren und geht der S-Protein-codierenden Sequenz unmittelbar voraus (für weitere Einzelheiten siehe EP-A-0 278 940).
Antigene Subtypen von HBV sind serologisch definiert, und es hat sich gezeigt, daß diese auf einzelne Veränderungen der Basensequenz im HBsAg-codierenden Bereich des Genoms zurückzuführen sind (Okamoto et al., J. Virol. 74 1987, 5463-5467). Alle bekannten antigenen Subtypen enthalten jedoch die "a"-Determinante, die aus den Aminosäuren 124 bis 147 des HBsAg besteht. Ein Antikörper zur "a"-Determinante verleiht Schutz gegen alle Subtypen. Durch In-vitro-Mutagenese konnte gezeigt werden, daß das Cystein an Position 147 und das Prolin an Position 142 für die Entfaltung der vollen Antigenität der "a"-Determinante wesentlich sind (Ashton et al J Med. Virol 29 1989, Seite 196).
Während des letzten Jahrzehnts sind mehrere verschiedene mutmaßliche Varianten des Hepatitis-B-Virus (HBV) beschrieben worden.
Mc Mahon et al. haben berichtet, daß bei einem mit monoklonalen Anti-HBsAg-Antikörpern behandelten Lebertransplantationspatienten, wie sich von einer DNA-Sequenzanalyse ableiten ließ, ein Austausch von Glycin gegen Arginin in der mutmaßlichen den monoklonalen Antikörper bindenden Domaine von HBsAg gefunden wurde (Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B viruses, September 1989). Dieses Ergebnis liefert jedoch keinerlei Anreiz für die Synthese einer veränderten HBsAg-Aminosäuresequenz oder für die Entwicklung einer hierauf basierenden Impfstoff-Zusammensetzung.
In einem anderen Bericht wurden trotz der Anwesenheit spezifischer Antikörper (Anti-HBs) nach Immunisierung mit einem von zwei zugelassenen Hepatitis-B-Impfstoffen bei Kindern und Erwachsenen zirkulierendes Hepatitis-B-Oberflächenantigen festgestellt, was auf virale Replikation hinweist (Zanetti et al., Lancet, November 1988, Seite 1132). Die Analyse des HBsAg mit monoklonalen Antikörpern ergab, daß das zirkulierende Antigen nicht die "a"-Determinante trug oder daß diese Determinante maskiert war. Man kam zu dem Entschluß, daß das Auftreten einer Variante des Hepatitis-B-Virus entdeckt worden war, möglicherweise als Folge eines epidemiologischen Drucks in Verbindung mit einer Immunisierung in einem endemischen Infektionsgebiet. Die Variante wurde jedoch nicht weiter beschrieben.
Aus der Arbeit von Zanetti et al. wird deutlich, daß ein potentieller Nachteil bei den gegenwärtig verfügbaren Hepatitis-B-Impfstoffen darin besteht, daß sie - zumindest in einem Wirt mit einer dafür prädisponierten immunogenen Veranlagung - das Auftreten einer "Flucht-Mutante", d.h. eines replizierenden infektiösen Virus, das sich durch Mutation der neutralisierenden Immunität entzieht, zur Folge haben können. Solch ein verändertes Virus vermag zweifellos Krankheit auszulösen, und es kann angenommen werden, daß es übertragbar ist. Die Virus-Variante könnte daher ein ernstes Immunisierungsproblem hervorrufen, da sie nicht wirkungsvoll durch Antikörper neutralisiert wird, die von Impfstoffen erzeugt werden, welche auf dem normalen HBsAg beruhen.
Die vorliegende Erfindung überwindet den obigen mit den bekannten HBV-Impfstoffen verbundenen Nachteil oder mildert diesen zumindest.
Erfindungsgemäß wird ein HBsAg-Protein oder ein Fragment davon geschaffen, das die Antigenität des HBV-Oberflächenantigens zeigt und dadurch gekennzeichnet ist, daß das Protein oder Fragment davon eine modifizierte "a"-Determinante umfaßt, in der sich an Position 145 der HBsAg-Sequenz eine hydrophilere Aminosäure als Glycin befindet.
Es versteht sich, daß das veränderte HBsAg auch Prä-S-Sequenzen enthalten kann, falls dies gewünscht wird.
Das erfindungsgemäße veränderte HBsAg-Protein oder Fragment davon wird im folgenden als vHBsAg abgekürzt.
Das vHBsAg liegt nicht in einer "natürlich vorkommenden" Form vor, sondern ist ein synthetisches oder hochgereinigtes Material, frei von Blutprodukten.
Vorzugsweise entspricht das vHBsAg der Erfindung dem vollständigen HBsAg und ist abgesehen von dem geänderten Aminosäurerest an Position 145 mit dem normalen HBsAg identisch.
Vorzugsweise liegt das vHBsAg in hochgereinigter Form vor, zum Beispiel in einer Reinheit von mehr als 75%, insbesondere von mehr als 90% und ganz besonders bevorzugt von 95-100%.
In einer anderen Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoff-Zusammensetzung geschaffen, die eine immunprotektive Menge des vHBsAg zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt.
Weitere Erscheinungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben.
Das vHBsAg und der Impfstoff der Erfindung können dazu dienen, die durch das Auftreten einer "Flucht-Mutante" erfahrenen Probleme zu überwinden, einer Flucht-Mutante, wie sie oben definiert ist und in welcher die "a"-Determinante des viralen HBsAg eine Modifikation erfahren hat. Der Impfstoff der Erfindung besitzt insbesondere den Vorteil, daß er dazu verwendet werden kann, gegen ein verändertes HBV zu schützen und dessen Auftreten oder Übertragung zu verhindern, wobei das veränderte HBV hier als Träger einer modifizierten "a"-Determinante in der HBsAg-Aminosäuresequenz definiert wird, in welcher sich an Position 145 eine hydrophilere Aminosäure als Glycin befindet.
Demgemäß wird auch ein Verfahren zum Schutz eines Menschen gegen Krankheitssymptome, die mit einer Infektion mit diesem veränderten HBV in Zusammenhang stehen, geschaffen, welches Verfahren die Verabreichung einer ungefährlichen und wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Impfstoffes an den Menschen beinhaltet.
Eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung liefert vHBsAg zur therapeutischen und insbesondere prophylaktischen Verwendung.
Die Erfindung sieht auch die Verwendung von vHBsAg bei der Herstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung zum Schutz eines Menschen gegen Krankheitssymptome vor, die mit einer Infektion mit dem besagten veränderten HBV in Zusammenhang stehen.
Bei der Verwendung zur Immunisierung von Menschen gegen ein existierendes verändertes HBV-Virus wird deutlich werden, daß die vHBsAg-Sequenz in dem Impfstoff normalerweise mit der vHBsAg-Sequenz in dem veränderten HBV-Virus übereinstimmt oder zu dieser antigenisch entspricht.
Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 145 in dem vHBsAg der Erfindung derart, daß sie durch eine Punktmutation im GGA-Codon, das im normalen HBsAg für Glycin an Position 145 codiert, erhalten werden kann.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Modifikation an Position 145 in der "a"-Determinante von HBsAg der Austausch von Glycin gegen Arginin, da, wie weiter unten noch beschrieben, diese Modifikation bei einer klinisch isolierten HBV-Variante gefunden wurde.
Zur genaueren Beschreibung der Erfindung wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen, von denen:
Figur 1 eine schematische Ansicht eines Teils der normalen HBsAg-Aminosäuresequenz darstellt, welche die zwei Schleifen der "a"-Determinante und den Glycinrest an Position 145 zeigt;
Figur 2 eine schematische Ansicht der Nucleotidsequenz eines klinisch isolierten veränderten HBsAg darstellt, welche für PCR und Sequenzierung verwendete Primer-Bindungsstellen und das an den Positionen 587-589 gefundene AGA-Codon zeigt, das aus einer G-zu-A-Punktmutation an Position 587 in der normalen Sequenz resultiert;
Figur 3 eine schematische Darstellung des S-Gens auf dem Plasmid pRIT10601 oder pRIT13438 zeigt, welche Oligonucleotid-Bindungsstellen für die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) angibt;
Figur 4 eine schematische Darstellung des Plasmids pRIT13438 ist;
Figur 5 eine schematische Darstellung des Plasmids pNN2deltaEcoRI ist; und
Figur 6 eine schematische Darstellung des Plasmids pRIT12775 ist. Polylinker 1 ist wie folgt:
0,01/BglII.ClaI.HindIII.BamHI.AvaI.SmaI.AvaI.XhoI.SalI.
In einer weiteren Erscheinungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des vHBsAg und der daraus erhaltenen Impfstoff-Zusammensetzung geschaffen.
Das vHBsAg wird vorzugsweise synthetisch erhalten, u. zw. entweder durch Peptidsynthese oder, noch mehr bevorzugt, durch DNA-Rekombinationstechniken.
Verfahren zur Konstruktion, Manipulation und Verifizierung rekombinanter DNA-Moleküle und -Sequenzen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Um an Position 145 des normalen HBV-S-Proteins von HBsAg (Siehe Figur 1) Glycin gegen eine andere Aminosäure auszutauschen, um das vHBsAg der Erfindung zu erhalten, ist es erforderlich, das GGA-Codon an Position 433-435 der S-Gen-Nucleotidsequenz in ein anderes Codon umzuwandeln, das für die gewünschte Aminosäure codiert.
Bei einer speziellen Ausführungsform wird vorgezogen, das GGA-Codon in - besonders bevorzugt - AGA oder - weniger bevorzugt - CGA oder CGC oder CGG oder CGT oder AGG umzuwandeln, Tripletts, die sämtlich für Arginin codieren.
Es stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, um die passende Sequenzveränderung zu bewirken. Ein geeignetes Verfahren ist die vollständige De-novo-Synthese der gewünschten codierenden Sequenz mittels Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung der Codonhäufigkeiten von Viren oder Hefen.
DNA-Synthese ist von mehreren Firmen auf kommerzieller Basis erhältlich. Ein Beispiel für eine solche Gensynthese wird von Hayden und Mandecki, DNA 7: Seite 571 (1988) und der darin angegebenen Literatur beschrieben.
Ein zweites Verfahren besteht darin ein geeignetes Restriktionsfragment von einem Vektor, der bereits das HBV-Genom enthäit, an einem einzelsträngigen Vektor zu klonieren und daran anschließend eine ortsspezifische In-vitro-Mutagenese auszuführen, wie dies von Bofstein und Shortle, Science 229, Seite 1193 (1982) beschrieben ist. Eine Kultur von E. coli K12, Stamm C600, welche das rekombinante Plasmid pRIT10601 enthält, das ein in pBR322 geklontes HBV-Genom des Subtyps ay umfaßt, wurde gemäß dem Budapester Abkommen am 2. Juni 1982 unter der Zugangsnummer ATCC 39132 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Aus solchen Klonen können durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken die Sequenz, die für das S-Gen codiert, welches das 226 Aminosäuren umfassende HBsAg-Protein definiert, oder längere Sequenzen, die für Prä-S-Polypeptide codieren, herausgeschnitten werden.
Ein geeignetes Restriktionsfragment ist das 575 bp große XbaI-AccI-Fragment aus der S-Gen-codierenden Region von pRIT10601. Für In-vitro-Mutagenese geeignete Vektorsysteme sind kommerziell erhältlich. Das so erhaltene mutierte Genfragment wird wieder in das S-Gen inseriert.
Ein drittes Verfahren ist die Durchführung der gewünschten Mutationsveränderung mittels der Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wie von Ho et al., Gene 77: Seite 51 (1989) beschrieben.
In jedem Fall kann die vHBsAg-codierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in jedem geeigneten Wirt exprimiert werden.
Expressionsvektoren, welche die für vHBsAg codierende DNA-Sequenz enthalten, sind neu und bilden eine weitere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung. Wirte, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, bilden noch eine weitere Erscheinungsform der Erfindung.
In einer bevorzugten Erscheinungsform kann S. cerevisiae, Pinchia pastoris oder Hansenula polymorpha als Wirt verwendet werden, und die Expression erfolgt unter der Kontrolle eines Hefepromotors, wie des Hefepromotors TDH3 (Gyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Gen, siehe Valenzuela et al 1982 Bitter et al 1988 oben) oder PH05 (Miyanohara et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 80, Seite 1, 1983), MOX, FMDH (siehe EP-A-0 299 108) und AOX (siehe EP-A-0 226 846).
Der transformierte Wirt kann durch herkömmliche Mittel kultiviert oder vermehrt werden, und das vHBsAg kann extrahiert und gereinigt werden. Die Reinigung des HBsAg aus Hefezellen ist im Fachgebiet wohlbekannt und kann gemäß der US 4,649,192, US 4,683,294, US 4,694,074 oder US 4,738,926 erfolgen. Die Reinigung des erfindungsgemäßen vHBsAg wird auf analoge Weise durchgeführt.
Impfstoffe, welche das vHBsAg enthalten, werden durch herkömmliche Techniken hergestellt und werden eine immunprotektive Menge des vHBsAg enthalten, vorzugsweise in einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung und gemischt mit einem oder adsorbiert an eines der verschiedenen bekannten Adjuvantien wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat. Mit "immunprotektiv" ist gemeint, daß genug vHBsAg verabreicht wird, um eine ausreichende durch protektive Antikörper ausgelöste oder zellvermittelte Immunantwort hervorzurufen, die einen Schutz gegen den infektiösen Erreger ohne ernste Nebenwirkungen gewährt. Die zu verabreichende Menge an vHBsAg wird davon abhängen, ob der Impfstoff mit einem Adjuvans versehen ist, und wird im allgemeinen zwischen 1 bis 1000 ug Protein umfassen, zum Beispiel 1 bis 200 ug Protein, stärker bevorzugt 5 bis 40 ug Protein. Die Größe und Anzahl der zu verabreichenden Dosen kann in Standard-Dosisbereich-Untersuchungen bestimmt werden, welche die Beobachtungen von Antikörpertitern und anderen Antworten in Personen einbeziehen.
Das vHBsAg kann zwecks Formulierung des Impfstoffs auch mit anderen HBsAg wie dem normalen HBsAg oder homogenen oder zusammengesetzten HBsAg-Partikeln, welche das gesamte oder einen Teil oder Teile des Prä-S1- oder Prä-S2-Polypeptids enthalten, gemischt werden. Es kann auch mit hybriden HBsAg-Partikeln, welche Epitope von Proteinen anderer Organismen tragen, und mit anderen Immunogenen gemischt werden, um bivalente oder multivalente Impfstoffe zu bilden. Die Herstellung von Impfstoff wird allgemein in "Vaccines", herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, MD, U.S.A., 1978 beschrieben.
Das vHBsAg kann als immunologisches Reagenz in Ausrüstungssätzen für den Nachweis von Infektionen mit einem veränderten HBV-Virus und dergleichen verwendet werden. Es kann auch verwendet werden, um mittels bekannter Verfahren polyklonale und monoklonale Antikörper zu vermehren, wobei einige dieser monoklonalen Antikörper spezifisch für das veränderte Antigen sein können und dann normales HBsAg nicht erkennen.
Demgemäß liefert eine weitere Erscheinungsform der Erfindung einen Ausrüstungssatz für den diagnostischen In-vitro-Nachweis von Anti-vHBsAg-Antikörpern in einem biologischen Medium und insbesondere von neutralisierenden Antikörpern nach einer Impfung, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:
(a) vHBsAg wie hierin definiert und
(b) zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion geeignete Mittel.
In einer weiteren Erscheinungsform liefert die Erfindung ein den Anti-vHBsAg-Antikörper enthaltendes Antikörper-Präparat zur Verwendung bei der Vorbeugung gegen oder Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen bei Menschen. Die Erfindung ist in einem Verfahren zur Behandlung von Menschen mit einer wirksamen Menge derartiger Anti-vHBsAg-Antikörper zwecks Vorbeugung gegen oder Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen anwendbar.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert werden.

Beispiel 1

Identifizierung eines veränderten Hepatitis-B-Virus ("Flucht-Mutante")

(a) Verfahren

(i) Immunisierung mit HBV-Impfstoff

1982 wurden in Italien mehrere Versuche mit HBV-Impfstoff begonnen. Verschiedene Zentren nahmen daran teil, von denen eines, die 4. Abteilung für Infektionskrankheiten am D.-Cotugno-Hospital in Neapel, 1590 Personen beobachtete. Die Region, aus der die meisten dieser Patienten kamen, die Campania, zeigt eine HBsAg-Häufigkeit von mehr als 5%. Die Patienten waren zum überwiegenden Teil Kinder von positiven HBsAg-Trägern aus zwei Regionen Süditaliens, die entweder mit HB-VAX (Merck Sharp und Döhme) oder mit HEVAC-B (Pasteur) geimpft wurden, beide aus Plasma gewonnene Impfstoffe. Es wurden Dosisgaben von 20 ug des ersteren für Erwachsene (10 ug für Kinder) zum Zeitpunkt 0,1 und 6 Monate oder 5 ug des letzteren zum Zeitpunkt 0, 1, 2 und 14 Monate verabreicht. Säuglingen wurden außerdem bei der Geburt und im Alter von 1 Monat 0,5 ml Hepatitis-B-Hyperimmunglobulin (HBIg) (Biagini), hergestellt mittels des Chonschen Ethanolfraktionierungsverfahrens, verabreicht. Mehrere familiäre Kontaktpersonen von Trägern, sowohl Erwachsene als auch Kinder, wurden ebenfalls geimpft.

(ii) Hepatitis-Marker

Blutproben wurden unter Verwendung handelsüblicher Ausrüstungssätze (Abbott Laboratories) auf HBsAg, HBeAg, Anti-HBe, Anti-HBs und Anti-HBc getestet. Anti-HBs wurde durch Vergleich mit einer Standard-Kurve, die mittels Quantifizierungstafel (Abbott Laboratories) erzeugt wurde, geschätzt. HBsAg-Positivität wurde sowohl durch Testwiederholung als auch durch Neutralisierung unter Verwendung des "HBsAg Confirmatory Assay" bestätigt. HBsAg-Neutralisierung erfolgte mittels eines Serums, das fast ausschließlich Anti-a enthielt. Seren von Patienten mit Markern für virale Replikation wurden auch auf Alanin-Aminotransferase-Spiegel (ALT) getestet.

(iii) HBsAg - und Anti-HBs-Subtypisierung

Die Subtypisierung von HBsAg wurde an den Trägerkontaktpersonen von 5 infizierten Säuglingen und 5 infizierten Kindern, an 6 von 8 der familiären Kontaktpersonen infizierter Erwachsener und an den Fäilen AS, AA und AE sowie 2 der Erwachsenenfälle vorgenommen. Zur Subtypisierung wurden mit Anti-a, Anti-d oder Anti-y beschichtete Perlen (Sorin Biomedica) über Nacht bei Raumtemperatur mit Serum inkubiert. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 13,2 uCi ¹²&sup5;I-Schaf-Anti-HBs zugesetzt, 1 Stunde lang bei 45ºC stehen gelassen, gewaschen und in einem Szintillationszähler quantifiziert. Eine Probe wurde als ay angesehen, wenn die erhaltenen Zählwerte bei Verwendung von entweder Anti-a oder Anti-y auf der festen Phase den Mittelwert der negativen Kontrollen (von 7 gesunden HBV-negativen Personen) um das 2,1-fache übertrafen und der mit den Anti-d-Perlen erhaltene geringer war als der Grenzwert. Proben wurden als nur y-reaktiv betrachtet, wenn die Zählwerte bei Zugabe zu Anti-y auf der festen Phase größer waren als der Grenzwert, jedoch bei Zugabe zu Anti-a- oder Anti-d-Festphasen unterhalb des Grenzwerts lagen.
Die Spezifität der Reaktivität wurde durch Neutralisierung mit monoklonalen Antikörpern (Sorin Biomedica) bestätigt. HBsAg-positive Sera wurden vor der Subtypisierung mit monospezifischen Anti-a-, Anti-d- oder Anti-y-Antikörpern gemischt. Als Kontrolle wurde ein HBsAg-haltiges Referenzserum verwendet.
Anti-HBs-Subtypisierung wurde an den Fällen AS, AA und an 2 der Erwachsenenfälle mittels eines Sandwich-RIA vorgenommen, bei dem ein rekombinantes HBsAg (rHBsAg) eines Subtyps auf der festen Phase und ein radioiodiertes eines anderen Subtyps als die Sonde verwendet wurden. Polystyrolperlen wurden mit entweder ad- oder ay-rHBsAg beschichtet. Zum Auffinden von Anti-a wurden 0,2 ml Serum über Nacht bei Raumtemperatur mit Perlen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Perlen 2 Stunden bei 40ºC mit radioiodiertem rHBsAg inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Radioaktivität der Perlen gezählt. Für den ad-Subtyp-Test wurden mit ad beschichtete Perlen mit marklertem ad-rHBsAg sondiert; in gleicher Weise wurde beim ay-Test verfahren. Proben mit Zählwerten von mehr als dem 4-fachen des Mittelwertes der negativen Kontrollen waren positiv. Titer wurden in mIU/ml bezogen auf eine Standard-Tafel ausgedrückt. Der Prozentsatz an Anti-a in einem Serum wurde bestimmt durch die Berechnung: Anti-a durch Anti-ad oder Anti-ay mal 100.

(iv) Patienten für Sequenzierungsuntersuchungen

Eine HBsAg-, HBeAg- und Anti-HBc-positive Trägerin (Patient IE) mit einem ALT von 105 wurde am 5. März 1983 von einem männlichen Kind (AS) entbunden. Der Vater war Anti-HBc- und Anti-HBs-positiv. Zum Zeitpunkt der Geburt und 1 Monat später wurden dem Jungen 1,5 ml HBIg verabreicht und er wurde im Alter von 3 Monaten, 4 Monaten und 9 Monaten mit HB-VAX (Merck Sharp und Dohme) geimpft. Für Sequenzierungsuntersuchungen wurden Sera von der Mutter zum Zeitpunkt der Entbindung, vom Kind im Alter von 11 Monaten (HBsAg-, HBeAg- und Anti-HBc-positiv; Anti-HBs 420 mIU/ml; ALT 120) und 5 Jahre später (HBsAg- und HBeAg-positiv, Anti-HBs-negativ; ALT 36) gewählt. Überdies wurden Sera von 4 nach dem Zufallsprinzip ausgewählten italienischen HBeAg-positiven Trägern, die nicht an der Studie teilnahmen, und von 3 britischen HBsAg-positiven Patienten sequenziert.

(v) PCR und direkte Sequenzierung

50 ul Serum wurden in 25 mM Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,5% SDS und 1 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) in einem Volumen von 200 ul über Nacht bei 37ºC verdaut. Nach 2 Phenol/Chloroform- und 2 Chloroform-Extraktionen wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt, und das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 20 ul Wasser resuspendiert. PCR wurde an 10 ul der DNA mit jeweils 300 pmol der Primer BCS2 und BCS4 unter Verwendung des Verfahrens von Carman et al Lancet, 1989, ii, 588-591 durchgeführt. Einzelheiten der Zielsequenz, Primer-Bindungsstellen und Primersequenzen sind in Figur 2 angegeben.
Nach einer Agarosegelelektrophorese mit 10 ul des Reaktionsansatzes zwecks Bestätigung des Vorhandenseins amplifizierter DNA wurde das übrige Material durch eine G-50-Sephadexsäule (Pharmacia) laufen gelassen und mit Ethanol ausgefallt. Nach drei Waschgängen mit 70%igem Ethanol wurde das Pellet in 20 ul Wasser resuspendiert. In der Zwischenzeit wurden 10 pmol des Sequenzierprimers BCS3 in einem Standardpuffer mit 10 uCi Gamma³²P-ATP unter Verwendung von 10 U Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 20 ul endmarkiert. Der Sequenzierprimer wurde nach dem Markieren nicht säulengereinigt.
4 ul der DNA wurden zu 4 ul des markierten BCS3 in Gegenwart von 2 ul 5X-Puffer, wie er in dem Sequenase-Kit (United States Biochemicals) mitgeliefert wird, zugesetzt, auf 95ºC erhitzt und langsam auf 50ºC abgekühlt. Es wurden die Anweisungen des Herstellers eingehalten, mit der Ausnahme, daß der Markierungsschritt weggelassen wurde und die Terminationsgemische mit einer gleichen Menge an Wasser verdünnt wurden. Die Reaktionsansätze wurden auf einem 5%igen Sequagel-Polyacrylamidharnstoffgel (National Diagnostics) einer Elektrophorese unterzogen.

(vi) Ermittlung der Hydrophobie

Die Aminosäuren 139 bis 147 der "a"-Determinante vom normalen und dem mutierten HBsAg wurden unter Verwendung von Prosis-Software (Pharmacia) analysiert.

(b) Ergebnisse

(i) Subtypisierungs-Untersuchungen

Von den 1590 Impflingen entwickelten 44 (2,8%) HBsAg, von denen 12 eine nur schwache Reaktivität und keine weiteren HBV-Marker zeigten. Einzelheiten wurden anhand von 18 dieser Patienten gewonnen: 5 Säuglingen, deren Mütter Trägerinnen waren, 5 familiären Kontaktpersonen von Kindern und 8 familiären Kontaktpersonen von Erwachsenen.
Bei allen Kontaktpersonen der infizierten Säuglinge und Kinder und bei 6 der 8 (sämtlich getestet) Kontaktpersonen von Erwachsenenfällen wurde der HBV-Subtyp ay festgestellt. Die Mutter von Fall AS wurde bei zwei Gelegenheiten als ay eingestuft, das erste Mal 2 Monate nach der Entbindung. Im Alter von 12 und 18 Monaten wurde beim Patienten AS eine schwache Positivität für Subtyp y und mit 46 Monaten, 6 Monate, nachdem Anti-HBs unnachweisbar geworden war, eine ay-Positivität festgestellt. Fall AA war 2 Jahre nach Beginn der Impfung, Fall AE 9 Monate danach und beide Erwachsenenfälle waren (26 und 28 Monate nach Immunisierung) nur y-positiv.
Diese Ergebnisse wurden mittels monoklonaler Reagenzien bestätigt. Alle Fälle mit y-haltigen Seren wurden mit Anti-y, jedoch nicht mit Anti-a neutralisiert.
Die Subtypisierung von Anti-HBs ergab, daß 50-70% der Antikörper Anti-a waren. Beim Patienten AS waren in einem Alter von 6 Monaten und danach etwa 90% gegen die a-Determinante gerichtet.

(ii) Sequenzierung der "a"-Determinante

Durch Sequenzierung wurde beim Patienten AS eine Einzelmutation von Guanosin zu Adenosin (G zu A) an Position 587 (gezählt ab der einmalig vorhandenen EcoR1-Stelle des HBV-Genoms) festgestellt, die an der Aminosäure 145 des HBsAg einen Aminosäureaustausch von Glycin gegen Arginin zur Folge hat. Dieser Austausch hat sich als stabil erwiesen und war sowohl im Alter von 11 Monaten als auch im Alter von 5 Jahren vorhanden. Die Mutter, IE, und die Kontrollpatienten wiesen an dieser Stelle in dem Epitop Glycin auf, wie in allen bisher veröffentlichten Sequenzen. Sonst war die Sequenz der a-Determinante bei den Patienten AS und IE die gleiche und entsprach den früher veröffentlichten.

(iii) Hydrophobizitätsdiagramm

Es wurde die relative Hydrophobiität der zweiten Schleife der a-Determinante von normalem HBsAg und diejenige vom Patienten AS bestimmt. Mittels des Verfahrens von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 1982, 105-132 wurde festgestellt, daß sich der mittlere Hydrophobizitäts-Index für die zweite Schleife von -1,3 auf -1,9 verändert hatte und bei Verwendung des Verfahrens von Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 1981, 3814-3828) von -0,5 auf -0,9.

Beispiel 2

Konstruktion einer veränderten S-Gen-codierenden Sequenz des ay-Serotyps. die einen Austausch von Gly gegen Arg an der Aminosäureposition 145 umfaßt

Vier Oligonucleotidprimer, BC17, BC144, BC145 und BC146, mit den unten angegebenen Sequenzen wurden durch herkömmliche Phosphoramidit-Chemie in einem DNA-Synthesegerät Biosearch 8600 gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert.
BC17 5' GTCTAGACTGGTGGTGGACT3'
BC144 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATA 3'
BC145 5' CTTCGGACAGAAATTGCACCT 3'
BC146 5' AGGTGCAATTTCTGTCCGAAG 3'
Diese Oligonucleotide besitzen Homologie zur ay-S-Gen-Sequenz auf pRIT10601, wie in Figur 3 gezeigt, und werden als Primer für die Nucleotidverlängerung durch Tag-Polymerase mit dem ay-S-Gen als Matrize verwendet. Die unterstrichenen AGA- und TCT-Tripletts auf BC145 und BC146 codieren für den gewünschten Arg145-Austausch. Überdies ermöglicht die Sequenz GAATTCG auf BC144 die Einführung eines EcoRI-Restriktionsorts ein bp distal vom TAA-Terminationscodon der S-Gen-codierenden Sequenz. Die PCR-Reaktion wird nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer Cetus) unter Verwendung von entweder pRIT10601 oder des in Figur 4 dargestellten Plasmids pRIT13438 als Matrize durchgeführt. pRIT13438 ist ein herkömmlicher E.-coli-Vektor, der eine vollständige ay-S-Gen-codierende Sequenz enthält, die aus pRIT10601 stammt und von EcoR1- und BglII-Restriktionsorten flankiert wird, welche durch In-vitro-Manipulation eingeführt wurden. Etwa 1 bis 10 ng Matrizen-DNA wird mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% (Gew/Vol) Gelatine, jeweils 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, jeweils 1 uM des gewünschten Primers und 2,5 Einheiten Tag-Polymerase in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern gemischt. Es werden zwei getrennte Reaktionsgemische angesetzt, wobei das eine BC17 und BC146 mit der Matrize enthält und das andere BC144 und BC145 mit der Matrize enthält.
Die zwei Gemische werden unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, bezogen von Van der Heyden, Brüssel, Belgien) 25 Zyklen von Denaturierung (2 min, 94ºC), Annealing (2 min, 48ºC) und Verlängerung (2 min, 72ºC) ausgesetzt, gefolgt von einem Zykius mit einer 15-minütigen Verlängerungszeit bei 72ºC. Das Vorhandensein des gewünschten amplifizierten Fragments in jeder Mischung wird durch konventionelle Agarosegelelektrophorese bestätigt, und die Fragmente werden durch das Laufenlassen über Centricon-100-Säulen (Amicon Division, W.R. Grace and Co, erhältlich von Van der Heyden, Brüssel, Belgien) gereinigt. Etwa 1 bis 10 ng jedes amplifizierten Fragments wird in einem einzelnen Reaktionsansatz mit den Primern BC17 und BC144 gemischt und genau wie oben beschrieben amplifiziert, ausgenommen, daß das Annealing bei 60ºC erfolgt.
Anstelle von BC17 und BC144 können auch die weiteren Oligonucleotidprimer BC90 und BC153 mit den unten gezeigten Sequenzen verwendet werden.
BC90 5' ATGGAGAACATCACATCAGCATTCCTAGGA 3'
BC153 5' TTGGAATTCGTTAAATGTATACCCAAAGACAAAA 3'
BC90 besitzt Homologie zum 5'-Ende der ay-S-Gen-Sequenz, beginnend am Initiationscodon. BC153 überlappt BC144.
Es wurden zwei PCR-Reaktionsgemische angesetzt, wobei in dem einen BC90 und BC146 zusammen mit pRIT13438-DNA als Matrize und weitere Bestandteile wie oben angegeben und in dem anderen BC145 und BC153 zusammen mit pRIT13438 als Matrize und weitere Bestandteile wie oben angegeben enthalten waren. Die Zwei Gemische wurden dann 25 Zyklen von Denaturierung (2 min, 94ºC), Annealing (2 min, 48ºC) und Verlängerung (2 min, 72ºC) unterzogen, um eine Amplifikation zu ermöglichen. Dann wurden das gewünschte 445-bp-Fragment aus der BC90/BC146-Amplifikation und das 267-bp-Fragment aus der BC145/BC153-Amplifikation durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Elektroelution aufgereinigt.
Etwa 10ng jedes Fragments wurden dann gemischt und in Gegenwart der Oligonucleotide BC90 und BC153 unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie oben beschrieben 25 PCR-Amplifikationszyklen unterzogen. Das resultierende amplifizierte Fragment von etwa 690 bp Länge wurde gesammelt und enthält einmalig vorkommende Erkennungsstellen für die Endonucleasen XbaI und EcoRI.
Die Verwendung (iieser spezifischen Oligonucleotidprimer, der ay-S-Gen-Matrize und der PCR-Reaktion führt zur Erzeugung eines veränderten 590 bp großen S-ay-Fragments, das den Arg145-Austausch und 5'-XbaI- sowie 3'-EcoRI-Verlängerungen aufweist. Das gewünschte Fragment wird vorzugsweise von Primern und anderen Produkten der PCR-Reaktion gereinigt, indem es über eine Centricon-100-Säule geschickt wird. Das Fragment wird dann mittels konventioneller Klonierungstechniken an die Stelle des entsprechenden XbaI-EcoRI-Fragments einer normalen viralen codierenden Sequenz gesetzt, die vorzugsweise mit einem Hefepromotor fusioniert ist. Ein für diese Zwecke geeigneter Vektor ist pNN2deltaEcoRI, gezeigt in Figur 5, bei dem eine S-codierende Sequenz des Serotyps ad mit dem Hefepromotor TDH3 fusioniert worden ist und sich stromaufwärts des Hefetranskriptionsterminators ARG3 befindet, um eine Expressionskassette zu bilden. Die Konstruktion und Verwendung solcher Expressionskassetten wird in der EP-A-0 278 940 gelehrt. Für einen Fachmann ist ersichtlich, daß jeder geeignete Vektor dieses Typs verwendet werden kann, je nachdem, welche Promotor- und Transkriptionsterminator-Fragmente zur Kontrolle der Expression in den als Wirt gewählten Hefearten gewählt werden. Überdies könnten durch Verwendung von anderen Primern als BC144 andere Restriktionsorte am 3'-Ende des veränderten Fragments eingeführt werden. Weiters liegen alle zu einem Austausch von Aminosäuren führenden Nucleotidunterschiede zwischen bekannten HBV-Isolaten der Serotypen adw und ayw stromabwärts der XbaI-Stelle, so daß der Einbau des durch PCR erhaltenen veränderten XbaI-EcoRI-Fragments in pNN2deltaEcoRI zu einer ayw-codierenden Sequenz führt.
Etwa 1,5 ug des aus den oben beschriebenen PCR-Reaktionen mit BC90, BC153, BC145 und BC146 resultierenden 690-bp-Fragments wurden mit den Endonucleasen XbaI und EcoRI verdaut, und etwa 0,15 ug des verdauten Fragments wurden mit etwa 50 ng des Vektors pRIT12642, der mit den Endonucleasen XbaI und EcoRI verdaut und dephosphoryliert worden war, gemischt und ligiert. pRIT12642 ist mit dem in Figur 5 gezeigten Vektor pNN2deltaEcoRI genau identisch. Aus dem Ligationsgemisch wurde ein Plasmid gewonnen und mit pRIT13555 bezeichnet, das das die modifizierte S-codierende Sequenz tragende XbaI-EcoRI-Fragment, eingesetzt zwischen den XbaI- und EcoRI-Stellen auf dem Vektor pRIT12642, enthält, so daß eine Expressionskassette gebildet wird, in der sich die veränderte ay-codierende Sequenz 3' zum und unter der Kontrolle des Promotors TDH3 befindet.
Die wie oben beschrieben erhaltene resultierende vHBsAg-Expressionskassette wird als ein 2,89-kb-Fragment aus dem ein pNN2deltaEcoRI-Derivat darstellenden Plasmid durch Verdauung mit den Endonucleasen BglII und SalI herausgeschnitten und in irgendeinen Vektor der Wahl zur Einführung in Hefe inseriert. Ein geeigneter Vektor mit hoher Kopienzahl ("multicopy"-Vektor) für S. cerevisiae ist pRIT12775, schematisch in Figur 6 dargestellt, der einen Polylinker inseriert zwischen der EcoRI-Stelle und der SalI-Stelle auf dem pBR327-Replikon enthält und der mittels herkömmlicher DNA-Manipulationstechniken unter Verwendung wohlbekannter DNA-Fragmente hergestellt wurde. Durch Endonucleaseverdauung wurde das 2,98-BglII-SalI-Kassettenfragment aus pRIT13555 gewonnen und durch herkömmliche Klonierungstechniken zwischen die BglII- und die SalI-Stelle von pRIT12775 inseriert, um das Plasmid pRIT13557 zu bilden. Wenn es wünschenswert ist, die Kassette in das Hefegenom einzubauen, wird ein integrativer Vektor wie der bei Jacobs et al., Gene 80, Seite 279 (1989) beschriebene bevorzugt. Wenn eine Insertion der vHBsAg-Expressionskassette in pRIT12775 durchgeführt wird, werden Hefezellen einer Leucin2-Mangelmutante durch das Verfahren von Ito et al., J. Bacteriol. 153: Seite 163 (1983) transformiert, wobei auf Leucin-unabhängige Transformanten hin selektiert wird. Ein geeigneter Empfängerstamm mit einer doppelten leu2-Mutation ist der Stamm DC5, der gemäß dem Budapester Abkommen am 2. Juni 1982 unter der Zugangsnummer ATCC 20630 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden ist.
Ein weiterer geeigneter Stamm ist ein cirº-Abkömmling von DC5, der gemäß dem Budapester Abkommen am 18. August 1986 unter der Zugangsnummer ATCC 20820 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden ist. Der Stamm DC5 cirº wurde mittels des oben angeführten Verfahrens von Ito et al. mit pRIT13557-DNA transformiert und auf Leucin-unabhängige Kolonien hin selektiert. Es wurde eine Transformanten-Kolonie zurückbehalten und subkultiviert, um den mit Y1648 bezeichneten Stamm zu etablieren.
Eine die vHBsAg-codierende Sequenz tragende Expressionskassette kann auch in Wirtszellen von S. cerevisiae, H. polymorpha oder P. pastoris eingeführt werden, die weitere Expressionskassetten tragen, so daß zusammengesetzte HBsAg-Partikel gebildet werden, die ein Gemisch zweier oder mehrerer Polypeptidarten enthalten.
Konventionelle Klonierungstechniken wurden verwendet, um eine 2,98-kb-Expressionskassette zu konstruieren, die aus dem Hefepromotor TDH3, der codierenden Sequenz des S-Gens vom Subtyp ay aus pRIT10601 und dem Hefeterminator-Fragment ARG3 besteht. Diese Kassette wurde dann zwischen der BglII- und der SalI-Stelle von pRIT12775 inseriert, um pRIT13558 zu bilden. pRIT13558 wurde dann durch Transformation unter Verwendung der oben angeführten Technik von Ito et al. in den Empfängerstamm DC5 cirº eingeführt, wobei auf Leucin-Unabhängigkeit selektiert wurde. Es wurde eine Transformanten-Kolonie zurückbehalten und subkultiviert, um den mit Y1654 bezeichneten Stamm zu etablieren.
Der Stamm Y1654 exprimiert HBsAg des Subtyps ay, das als Kontrolle bei der Untersuchung der Eigenschaften des vHBsAg der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Die Subklonierung und Expression von Partikeln des Subtyps ay in Hefe unter Verwendung von pRIT10601 als Ausgangsmaterial und des Hefepromotors ARG3 ist von De Wilde et al. in Devel. Biol. Standard. 59, 99-107 (1985) beschrieben worden.
Es werden Kulturen von Y1648 und Y1654 gezüchtet und das HBsAg extrahiert und in den rohen Zellextrakten mittels AUSRIA-Radioimmunoassay (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, U.S.A.) gemessen. Unten sind die Ergebnisse des Tests von jeweils zwei Kulturen von Y1648 und Y1654 angegeben STAMM KULTUR NUMMER PROTEIN (g/l Kultur) HBsAg durch AUSRIA HBsAg als Prozent Protein
Stamm Y1648 produziert im Vergleich zu Stamm Y1654 etwa 10-mal weniger aufscheinendes AUSRIA-reaktives Material. Western-Blotting roher Zellextrakte unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers HBS1 (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, Belgien), der das denaturierte und reduzierte HBV-Oberflächenantigen-Polypeptid erkennt, zeigte, daß Y1648 etwa dieselbe Menge an HBS1-reaktivem Protein mit einer Molekülmasse von 24k wie Y1654 produzierte.
Verfahren zur Kultivierung von Hefezellen, Extraktion und Untersuchung von HBsAg sowie Western-Blotting-Verfahren sind in der EP-A-0 278 940 und EP-A-0 414 374 zu finden, die hiermit beide durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Oberflächenantigen-Material wurde durch herkömmliche Verfahren gemäß den oben angeführten US-Patenten 4,649,192 und 4,683,294 aus Zellextrakten von sowohl Y1648 als auch Y1654 gewonnen und gereinigt.
Die Präparationen bestanden aus im wesentlichen reinem HBV-Oberflächenantigen-Protein, wie die Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung ergab, die einzelne Hauptbanden von Protein bei 24k zusammen mit Spuren von Dimeren und Multimeren zeigte.
Zwei Präparationen von aus Hefe stammendem HBsAg aus Stamm Y1654 lieferten AUSRIA/Protein-Verhältnisse von 1,64 und 2,79, während zwei vHBsAg-Präparationen aus Stamm Y1648 verringerte AUSRIA/Protein-Verhältnisse von 0,1 und 0,13 lieferten.
Gereinigtes vHBsAg von Stamm Y1648 wurde nach Färbung mit Uranylacetat elektronenmikroskopisch untersucht. Das Material zeigte die Anwesenheit sphärischer Partikel, wie sie für das HBV-Oberflächenantigen typisch sind.

Beispiel 3

Herstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung

Einer sterilen, gepufferten wässerigen Lösung von 3% Aluminiumhydroxid in 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,8 wird unter ständigem Rühren das im gleichen Puffer befindliche vHBsAg von Beispiel 2 bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 40 ug Protein und 0,5 mg Aluminium (Al³&spplus;) pro ml zugesetzt. Es wird dann Thimerosal (Natriummerthiolat) bis zu einer Endkonzentration von 1 in 20.000 (Gew/Vol) als Konservierungsstoff zugesetzt.
Der Impfstoff eignet sich für die parenterale Verabreichung an Menschen.

Claims

1. Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Protein oder Fragment davon, das die Antigenität des HBV-Oberflächenantigens zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Protein oder Fragment davon (vHBsAg) eine modifizierte "a"-Determinante umfaßt, in der sich an Position 145 der HBsAg-Sequenz eine hydrophilere Aminosäure als Glycin befindet.

2. vHBsAg nach Anspruch 1, bei dem die Aminosäure an Position 145 durch eine Punktmutation im GGA-Codon erhalten werden kann, welches im normalen HBsAg für Glycin an Position 145 codiert.

3. vHBsAg nach Anspruch 1 oder 2, das abgesehen von dem geänderten Aminosäurerest an Position 145 mit dem normalen HBsAg-S-Protein idenfisch ist.

4. vHBsAg nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Modifikation an Position 145 der Austausch von Glycin gegen Arginin ist.

5. vHBsAg nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das einen höheren Reinheitsgrad als 75 % besitzt.

6. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die fuhr ein vHBsAg nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

7. Wirt, der mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert ist.

8. Impfstoff-Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines vHBsAg nach Anspruch 5, gemischt mit einem geeigneten Träger oder Adjuvans, umfaßt.

9.Verfahren zur Herstellung eines vHBsAg nach einem der Anskrüche 1 bis 5, welches Verfahren die Schritte der Kultivierung eines Wirts nach Anspruch 7 in einem geeigneten Kulturmedium und der Aufreinigung des produzierten vHBsAg bis zum erforderlichen Reinheitsgrad umfaßt.

10. Verwendung eines vHBsAg nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines Menschen gegen eine Erkrankung, die mit HBV in Zusammenhang steht.

11. Ausrüstungssatz für den diagnostischen In-vitro-Nachweis von Anti-vHBsAg-Antikörpern in einem biologischen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß der Satz umfaßt:

(a) vHBsAg nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und

(b) zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion geeignete Mittel.

12. Antikörper-Präparat, umfassend Antikörper gegen vHBsAg, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist, zur Verwendung bei der Vorbeugung gegen, der Diagnose oder Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen bei Menschen.