DE69033600T2

DE69033600T2 - Verfahren zur Isolierung von Haemopnilus influenzae Protein-E

Info

Publication number: DE69033600T2
Application number: DE69033600T
Authority: DE
Inventors: Bruce A. Green; Gary W. Zlotnick
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 2001-04-05
Anticipated expiration: 2010-03-10
Also published as: DK0462210T3; JP2955014B2; CA2047681A1; DE69012318D1; NO913518L; DE69012318T2; ES2063965T3; NO913518D0; FI914241A0; WO1990010458A1; ATE110965T1; KR100188323B1; CA2047681C; AU648251B2; ATE195076T1; ES2150450T3; EP0462210A1; JPH07508972A; FI914241A7; EP0462210B1

Description

Hintergrund

Haemonhilus influenzae werden in zwei Gruppen von Stämmen eingeteilt, in typisierbare und nicht typisierbare. Stämme, die eine bekannte Kapsel besitzen, werden durch die serologische Reaktion der Kapsel mit Referenzantiseren typisiert. Die Typen a-f sind identifiziert worden. Stämme, die nicht mit einem der Referenzanfiseren reagieren, sind nicht typisierbar.
H. influenzae Typ b (Hib) ist in den Vereinigten Staaten die häufigste Ursache der neonatalen Meningitis und anderer invasiver Infektionen (Fraser et al., 1974, Am. 1. Epidemiol. 100 : 29-34). Die höchste Häufigkeit kindlicher Meningitis liegt im Alter zwischen einem und fünf Jahren. Sechzig Prozent der durch Hib verursachten Meningitis Fälle liegen bei Kindern im Alter unter zwei Jahren (Fraser et al., supra).
Bekanntlich verursachen die nicht typisierbaren H. influenzae auch Erkrankungen, einschließlich Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, der nachgeburtlichen Sepsis und akuten fiebrigen Tracheobronchitis bei Erwachsenen (Murphy et al., 1985, J. Infect. Diseases 152: 1300-1307). Zudem sind die nicht typisierbaren H. influenzae ein häufiger ätiologischer Erreger der Mittelohrentzündung bei Kindern und Jugendlichen. Tatsächlich können etwa 20 bis 40% der Mittelohrentzündungen den H. influenzae zugeordnet werden. Kinder können multiple Infektionen desselben Organismus erfahren, da die Infektion keine lebenslange Immunität hervorruft. Gegenwärtig wird die chronische oder die wiederholte Ohrenentzündung durch Verabreichung von Antibiotika und wenn erforderlich, durch die Drainage des Innenohrs behandelt. H. influenzae Stämme werden auch als primäre Ursache der Sinusitis angesehen (Cherry 3. D. und J. P. Dudley, 1981, in Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Feigin und Cherry Herausgeber S. 103-105). Zudem verursachen H. influenzae auch neonatale Sepsis.
Das gegen Polyribosyl-Ribitol-Phosphat (PRP), das kapsuläre Polysaccarid von Hib, erzeugte Antiserum, erwies sich gegen Hib bakterizid und protektiv (Smith et al., 1973, Pediatrics 52: 637-644,; Anderson et al., 1972, 3. Clin. Inv. 51: 31-88). Der Anti-PRP-Antikörper ist jedoch gegen die nicht typisierbare H. influenzae Infektion unwirksam.
Die gegenwärtig verfügbaren Impfstoffe gegen H. influenzae sind alle gegen Hib gerichtet. Sie wirken alle durch die Erzeugung von Anti-PRP-Antikörper. Der Anti-PRP-Antikörper ist jedoch gegen nicht typisierbare H. influenzae, welchen entsprechend der Definition die PRP-Kapsel fehlt, unwirksam. Es besteht seit langem Bedarf für einen Impfstoffe zum Schutz gegen nicht typisierbare H. influenzae.
Das äußere Membran-Protein "E" von H. influenzae ist ein Lipoprotein, mit einem Molekulargewicht von etwa 28 000 Dalton und einer wie in Abb. 1 dargestellten Aminosäuresequenz. Protein "E" und Peptide und Proteine, die Protein "E" Epitope besitzen, können für die Impfung gegen nicht typisierbare und typisierbare H. influenzae verwendet werden, wie in unserer gleichzeitig anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 909051 12.0, Publikationsnr. EP-A-0 462 210 diskutiert. Die Peptide und Proteine können in univalenten Impfstoffen oder in multivalenten Impfstoffen in Verbindung mit anderen Antigenen der typisierbaren oder nicht typisierbaren H. influenzae (z. B. als Gemische, Fusion oder Konjugate damit) oder mit Antigenen anderer infektiöser Bakterien, Viren oder Parasiten verwendet werden. Die Peptide und Proteine rufen einen biologisch aktiven (bakterizid und/oder opsonisch) Antikörper gegen H. influenzae hervor. Protein "E" wirkt in Synergie mit anderen äußeren Membran-Proteinen von H. influenzae, indem es kreuzreakti ve, bakterizide Antikörperantworten, insbesondere gegen nicht typisierbare Stämme von H. influenzae, hervorruft und deshalb sind die Peptide oder Proteine dieser Erfindung besonders wirksam, wenn sie zusammen mit diesen Proteinen verabreicht werden. Zudem kann der für Epitope von Protein "E" spezifische Antikörper zur passiven Immunisierung gegen H. influenzae (entweder allein oder in Verbindung mit einem Antikörper gegen Epitope von anderen äußeren Membran-Proteinen) und bei diagnostischen Assays für den Organismus verwendet werden.
Protein "E" kann durch Reinigung aus H. influenzae erhalten werden. Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Protein "E" in Form eines nativen Lipoproteins aus H. influenzae durch differenzielle Detergenzien-Extraktion, wobei eine im wesentlichen endotoxin-freie Präparation geliefert wird, ohne daß dabei Mittel verwendet werden, die für den Menschen als schädlich angesehen werden. Protein "E" kann auch durch rekombinante DNA-Verfahren in lipider oder nicht-lipider Form oder durch Proteinsynthese (siehe EP-A-0 462 210) hergestellt werden. Epitope Oligopeptide und andere Fragmente von Protein "E" und Analoge davon können durch rekombinante DNA-Verfahren, durch chemische Synthese, oder durch chemische oder enzymatische Spaltung hergestellt werden. Diese Peptide oder Proteine können ihrerseits mit anderen Antigenen von H. influenzae oder mit Antigenen anderer Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Pilze oder Parasiten) durch chemische oder durch genetische Kupplungsverfahren fusioniert oder konjugiert werden, um multivalente antigene Konjugate und Fusionspeptide oder -proteine herzustellen. Die Peptide oder Proteine können für die Konjugation, z. B. durch Addition von Aminosäuren oder anderen Kupplungsgruppen, modifiziert werden. Zur Impfung können die Peptide oder Proteine in jeder der beschriebenen Formen in pharmazeutisch verträglichen Trägern gegebenenfalls mit Zusätzen, wie Adjuvantien, formuliert werden.
EP-A-0 462 210 beschreibt isolierte Nucleinsäuresequenzen, die das native Protein "E" oder jede der verschiedenen Peptid- oder Proteinderivate von Protein "E" kodieren. Die Sequenzen können in geeigneten Expressionssystemen zur Herstellung von Protein "E" oder jedem der abgeleiteten Peptide oder Proteine eingebaut werden. Zudem können die Gen-Fragmente oder Oligonucleotide in Nucleinsäure-Hybridisierungs- Assays als Sonden verwendet werden.

Kurzbeschreibung der Abbildung

Abb. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Protein "E". Die Aminosäuresequenz des oben dargestellten reifen Proteins "E" ist von der DNA-Sequenz abgeleitet. Die unterstrichene Sequenz wurde durch die Aminosäuresequenzierung der Peptide, welche durch Verdau des gereinigten Proteins "E" mit verschiedenen Proteasen erhalten wurden (siehe EP-A-0 462 210), bestätigt.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Protein "E" ist ein äußeres Membran-Protein von H. influenzae, mit einem Molekulargewicht von etwa 28000 Dalton und einer wie in Abb. 1 dargestellten Aminosäuresequenz. Es wurde jetzt gefunden, daß Protein "E" als ein Lipoprotein in Verbindung mit dem äußeren Membran-Zellwand-Komplex von Bakterien existiert.
Protein "E" hat mehrere Eigenschaften, die es (und die Peptide und Proteine, die Protein "E"- Epitope haben) besonders wertvoll für die Impfung gegen nicht typisierbare H. influenzae machen. Protein "E" kann eine bakterizide Immunantwort gegen nicht typisierbare H. influenzae hervorzurufen. Es ist von Bedeutung, daß Protein "E" innerhalb der H. influenzae Stämme hoch konserviert ist. Das Protein wurde sowohl durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) als auch durch Western Blot Analyse in allen getesteten H. influenzae Stämmen nachgewiesen und zudem weisen die Daten der monoklonalen Antikörper darauf hin, daß das Protein hoch konserviert ist. Somit kann das Protein eine Immunantwort gegen verschiedene Stämme der nicht typisierbaren H. influenzae induzieren. Des weiteren bringt Protein "E" bakterizide Antikörper hervor, die in Synergie mit Antikörpern gegen andere äußere Membran-Proteine von H. influenza wirken. Deshalb kann das Protein in Verbindung mit anderen äußeren Membran-Proteinen verwendet werden, um eine noch wirksamere bakterizide Antwort zu induzieren.
Die Proteine können zur Konjugation an anderen Molekülen, z. B. durch die Anbindung von derartigen Kupplungsgruppen, wie die Aminosäuren Cystein und Lysin oder durch andere Verbindungsgruppen, modifiziert werden.
Wie in EP-A-0 462 210 beschrieben, kann Protein "E" in vielen verschiedenen Formen in Impfstoffen und in diagnostischen Verfahren verwendet werden (z. B. allein, in Gemischen oder als Konjugate und Fusionen). Für diese Zwecke können die Peptide und Proteine durch Isolierung aus H. influenzae, durch chemische Synthese oder durch Expression als rekombinante Moleküle hergestellt werden. Die Verfahren zur Anwendung der Peptide und Proteine und die Verfahren zu ihrer Herstellung werden in EP-A-0 462 210 diskutiert.

Reinigung von FProtein "E"

Das native Protein "E" kann aus H. influenzae durch das Verfahren der differentiellen Detergenzien- Extraktion gereinigt werden. Das Verfahren basiert auf der Verwendung von Sulfobetain-Detergenzien, welche selektiv äußeres Membran-Protein von H. influenzae extrahieren können. Das Verfahren bezieht nicht die Verwendung von denaturierenden und reduzierenden Mitteln, wie Natriumdodecylsulfat bzw. 2-Mercaptoethanol (siehe Munson et al., 1984, Infect. Immun. 49: 544-49), ein, welche die wichtigen antigenen Epitope des Proteins zerstören können und die zur Verabreichung an Menschen weithin nicht als sicher akzeptiert werden.
Das Verfahren erfordert als erstes die Gewinnung der äußeren Membranbestandteile von H. influenzae Zellen. Äußere Membranbestandteile können aus einer Gesamtzell-Membran-Fraktion hergestellt werden. Gesamtmembran-Fraktionen werden im allgemeinen durch differentielle Sedimentation nach der Spaltung von H. influenzae Zellen durch Verfahren wie Ultraschall, Mahlen oder Treiben durch eine French-Presse oder durch andere Homogenisationsvorrichtungen hergestellt. Die Gesamtmembran-Fraktion wird dann durch die Dichtegradienten-Sedimentierung oder durch die differentielle Solubilisierung der inneren Membranbestandteile mit bestimmten Detergenzien, wie Polyoxyethylenoctylphenol (Triton X-1001M) oder N- Laurylsarkosin-Natriumsalz (Sarkosyl), in innere und äußere Membranen fraktioniert. In der bevorzugten Ausführung werden die äußeren Zellmembranbestandteile durch differentielle Solubilisierung der inneren Membranen in 0,1-2% (w/v) Triton X-100TM in 10 mM HEPES-NaOH 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,4 hergestellt. Diese Extraktion wird im allgemeinen zweimal ausgeführt.
Als eine alternative Quelle der äußeren Membranbestandteile kann ein Kulturmedium von H. influenzae Zellen verwendet werden. Das Medium enthält Schutzbestandteile (sogenannte "Blebs") der äußeren Membran des Bakteriums. Siehe Loeb, M. R. (1987) Infection and Immunitv 55 (11): 2612-2618.
Eine Subfraktion der Präparation der äußeren Membranbestandteile, die mit Protein "E" angereichert ist, kann durch Extraktion mit einer wässrigen Lösung von 0,1-2% (vorzugsweise 1%) Sarkosyl bei pH 8,0 hergestellt werden. Diese Extraktion wird im allgemeinen zwei oder dreimal ausgeführt und sie entfernt den hauptsächlichen Proteinbestandteil sowie andere Materialien.
Die Solubilisierung von Protein "E" aus dem äußeren Membran-Zellwand-Komplex kann dann durch eine differentielle Zwei-Schritt-Solubilisierung mit Sulfobetain-Detergenzien erreicht werden. Im ersten Schritt wird eine wässrige Lösung von 0,1-10%, im allgemeinen 0,1-2% (w/v) Dodecylsulfobetain (ZwittergentTM 3-12) verwendet, um die von Protein "E" verschiedenen äußeren Membran-Proteine zu entfernen. Vorzugsweise wird eine 1% Lösung verwendet und die Extraktion wird gebräuchlicherweise 2-3 mal ausgeführt. Die verbleibenden unlöslichen Bestandteile werden dann mit einer wässrigen Tetradecyl- oder Hexadecylsulfobetain-Lösung (ZwittergentTM 3-14 oder 3-16) unter den gleichen Bedingungen extrahiert. Diese Extraktion führt zur Solubilisierung von Protein "E".
Nach der Solubilisierung kann die weitere Reinigung von Protein "E" durch übliche Verfahren, die die Tonenaustausch-, die Molekularsieb-, die hydrophobe, die Umkehrphasen- oder die Absorptions- (z. B. Hydroxylapatit) chromatografie, die Afflnitätschromatografie, die Chromatofokussierung, die isoelektrische Fokussierung und die präparative Elektrophorese einschließen, erreicht werden.
Protein "E kann durch diese Verfahren im wesentlichen frei von bakteriziden Endotoxin gereinigt werden und ist für die Verabreichung an Menschen geeignet. Die gereinigte Präparation von Protein "E" kann als Impfstoff für H. influenzae allein oder in einem Gemisch mit Antigenen anderer Organismen, die in die Mittelohrentzündung verwickelt sind, formuliert werden. Wenn erwünscht kann das Protein durch übliche chemische oder enzymatische Verfahren fragmentiert werden, um antigen Segmente herzustellen.

Ausführung

I. Isolierung von Protein "E"

Isolierung von Haemonhilus Zellhüllen

Zellhüllen wurden aus Eagan-Zellen des Hib Stamms isoliert, die entweder in Hirn-Herz- Infusionsmedium, welches 10 ug 1 ml Hämin und 1 ug 1 ml NAD (BHI 1 XV) enthält oder in mMIC (Modifikation nach Herriott et al., J. Bacteriol., 101: 513-516 (1970)) Medium wuchsen. Die Zellen wurden aus den Flüssigkulturen durch 10-minütige Zentrifugation bei 10 000 · g, 4 C geerntet. Das Zellpellet wurde gewogen und in 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,4), 1 mM EDTA resuspendiert, wobei das Volumen gleich dem fünffachen Feuchtgewicht der Zellen ist. Die Zellen wurden durch Verwendung eins Gaulin-Homogenisators gespalten. Um die ungespaltenen Zellen und die große Debris zu entfernen, wurde die gespaltene Zellsuspension 5 Minuten bei 10 000 · g bei 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und NaCl wurde bis zu 0,5 M zugesetzt. Die Zellmembranen wurden durch Zentrifugation bei 100 000 · g bei 4 C für etwa 1 Stunde pelletiert.
Ein äußerer Membran-Zellwand-Komplex wurde durch die Entfernung der inneren Membranen aus der Gesamtmembran-Fraktion durch die wiederholte Extraktion der Gesamtmembran-Fraktion mit 2% Triton X-100 in 10 mM HEPES-NaOH, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,4 erhalten. Der unlösliche Rückstand, der den äußeren Membran-Zellwand-Komplex enthält, wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 350 000 · g bei 4 C pelletiert. Dieser Komplex wurde dann in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8 resuspendiert und bei 4 C gelagert.

Isolierung von Protein "E" aus Haemophilus Zellhüllen

Die verunreinigenden Proteine wurden wie folgt aus den H. influenzae Zellhüllen durch differentielle Detergenzien-Extraktion solubilisiert. Die wie oben beschrieben hergestellten Zellhüllen wurden schrittweise extrahiert, zweimal mit 1% Sarkosyl in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8 und das unlösliche Material wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 350 000 · g bei 20ºC erhalten, und dann zweimal mit 1% ZwittergentTM 3-12 in demselben Puffer, 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8. Das Protein "E" wurde dann aus dem unlöslichen verbleibenden äußeren Membran-Zellwand-Material durch Extraktion mit 1% Zwittergent~ 3-14 in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8 solubilisiert. Diese Extraktion wurde 3 mal wiederholt. Die solubilisierten Protein "E" enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und über eine mit 50 mM Tris- HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8, konditionierte DEAE-Säule gegeben. Das Protein "E" wurde unter diesen Bedingungen nicht gebunden, jedoch die hauptsächlichen Proteinverunreinigungen wurden gebunden. Die durchlaufenden, Protein "E" enthaltenden Fraktionen wurde dann über eine mit 50 mM Tris-HCl, pH 8, konditionierte Hydroxylapatit-Säule gegeben. Unter diesen Bedingungen wurde das Protein "E" gebunden. Die Hydroxylapatit-Säule mit dem adsorbierten Protein "E" wurde dann mit einem Säulenvolumen an 50 mM Tris-HCl, pH 8 gewaschen. Das Protein "E" wurde mit 1% ZwittergentTM 3-14 in 0,3 M zweibasigen Phosphat, pH 8 vom Hydroxylapatit eluiert. Die Protein "E" enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, durch Diafiltration konzentriert und mit Ethanol ausgefällt. Das ausgefällte Protein "E" wurde dann wieder durch differentielle Detergenzien-Extraktion solubilisiert. Der Niederschlag wurde zunächst mit 1% Octylglukosid in 50 mM Tris-HCl, pH 8 extrahiert und das unlösliche Protein "E" verblieb im Niederschlag. Das Protein "E" wurde dann mit 1% ZwittergentTM 3-14 in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8 solubilisiert. Besonders bevorzugt wurden die durch die DEAE-Säule durchlaufenden Fraktionen über eine 5 SepharoseTM (Pharmacia) Fast-Flow-Säule (Kationenaustauscher-Säule) gegeben, die vorher mit 50 mM Tris-HCl, 50 mM Na&sub2;EDTA (pH 8), welches 0,1% ZwittergentTM 3-14 enthält, konditioniert wurde. Protein "E" wurde an der Säule adsorbiert und mit einem 0-0,5 M NaCl-Gradienten im selben Puffer eluiert. Protein "E", das wie oben beschrieben hergestellt wurde und das im wesentlichen rein und endotoxin-frei ist, könnte wie früher beschrieben konzentriert werden oder so verwendet werden, wie es eluiert wurde.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Protein "E" aus H. influenzae, welches die in Abb. 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, umfassend:

a. Gewinnung einer Präparation von Bestandteilen der äußeren Membran von H. influenzae;

b. Extraktion der Präparation mit einer wässrigen Lösung von N-Lauroyl-Sarkosin-Natriumsalz;

c. Extraktion des unlöslichen Rückstandes aus Schritt b mit einer wässrigen Lösung von Dodecylsulfobetain;

d. Extraktion des unlöslichen Rückstandes aus Schritt c mit einer wässrigen Lösung von Tetradecyl- oder Hexadecylsulfobetain, um Protein "E" zu solubilisieren; und

e. Gewinnung der Protein "E" enthaltenden wässrigen Lösung.