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TW201302779A - 融合蛋白質及組合疫苗 - Google Patents

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TW201302779A
TW201302779A TW101112896A TW101112896A TW201302779A TW 201302779 A TW201302779 A TW 201302779A TW 101112896 A TW101112896 A TW 101112896A TW 101112896 A TW101112896 A TW 101112896A TW 201302779 A TW201302779 A TW 201302779A
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protein
pila
fusion protein
amino acid
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TW101112896A
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Normand Blais
Steve Labbe
Jan Poolman
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
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Publication date
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Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
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Abstract

本發明係關於包含流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白質E及菌毛蛋白A(Pilin A)之組合物。更特定而言，本申請案係關於包含蛋白質E及PilA之融合蛋白質及免疫原性組合物、包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。

Description

融合蛋白質及組合疫苗
本發明係關於包含流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae或H.influenzae)之蛋白質E及菌毛蛋白A之組合物。更特定而言，本申請案係關於包含蛋白質E及菌毛蛋白A之融合蛋白質及免疫原性組合物、包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。
本申請案主張2011年4月13日提出申請之美國專利申請案第61/474779號及2011年9月13日提出申請之美國專利申請案第61/534012號之優先權。
蛋白質E(PE)係具有黏著特性之外膜脂蛋白。其在無法分型之流感嗜血桿菌(NTHi)黏著至/侵襲上皮細胞中發揮作用。(J.Immunology 183：2593-2601(2009)；The Journal of Infectious Diseases 199：522-531(2009)；Microbes and Infection 10：87-96(2008))。其在有莢膜的流感嗜血桿菌及無法分型之流感嗜血桿菌二者中高度保守，且具有保守的上皮結合結構域。(The Journal of Infectious Diseases 201：414-419(2010))。當與作為參考菌株之流感嗜血桿菌Rd比較時，已在不同嗜血桿菌物種中描述13種不同點突變。在對數生長期及靜止期細菌中觀察到其表現。(WO 2007/084053)。
蛋白質E亦經由結合玻連蛋白而參與人類補體抗性。(Immunology 183：2593-2601(2009))。PE藉由結合結構域 PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR(SEQ ID NO.1，對應於SEQ ID NO.4之胺基酸84-108)結合玻連蛋白，玻連蛋白係末端補體路徑之重要抑制劑。(J.Immunology 183：2593-2601(2009))。
菌毛蛋白A(PilA)可能係與蹭行運動(twitching motility)有關之IV型流感嗜血桿菌菌毛(Tfp)之主要菌毛蛋白亞單位(Infection and Immunity,73：1635-1643(2005))。NTHi PilA係在活體內表現之保守黏著素。已顯示其與NTHi黏著、定殖及生物被膜形成有關。(Molecular Microbiology 65：1288-1299(2007))。
無法分型之流感嗜血桿菌係引起嬰兒及兒童中耳炎之重要且常見的呼吸病原體。NTHi僅次於肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，係兒童急性中耳炎之最常見原因(J.Immunology 183：2593-2601(2009)；Pediatrics 113：1451-1465(2004))。其係兒童及成人鼻竇炎之重要原因。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。其與成人慢性阻塞性肺病(COPD)之惡化風險增加有關。(Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3：109-115(2006))。另外，無法分型之流感嗜血桿菌引起成人社區獲得性肺炎，且可在發展中國家中引起兒童肺炎。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。
當前需要NTHi疫苗。
作為第一態樣，本發明提供式(I)之融合蛋白質，(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (式I)其中：X係信號肽或MHHHHHH(SEQ ID NO.2)；m係0或1；R1係胺基酸；n係0、1、2、3、4、5或6；A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E或其免疫原性片段、或來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段；Y係選自由下列組成之群：GG、SG、SS、GGG及(G)h，其中h係4、5、6、7、8、9或10；o係0或1；B係來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段、或來自流感嗜血桿菌之蛋白質E或其免疫原性片段；Z係GGHHHHHH(SEQ ID NO.3)；且p係0或1。
作為第二態樣，本發明提供包含式(I)之融合蛋白質之免疫原性組合物。該組合物可進一步包含醫藥上可接受之佐劑。該組合物可包含賦形劑。
在第三態樣中，本發明提供治療或預防完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病況或疾病的方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之融合蛋白質。
在第四態樣中，本發明提供治療或預防中耳炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之融合 蛋白質。
在第五態樣中，本發明提供治療或預防慢性阻塞性肺病惡化之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之融合蛋白質。
在第六態樣中，本發明提供治療或預防肺炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之融合蛋白質。
在第七態樣中，本發明提供包含式(I)之融合蛋白質之醫藥組合物，其用於治療或預防完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病況或疾病。醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之佐劑。
在第八態樣中，本發明提供編碼本發明蛋白質之核酸。
在第九態樣中，本發明提供產生本發明核酸之方法。
本發明之其他態樣在下文之特定實施例、實例及申請專利範圍之詳細說明中予以闡述。
除非本文中另外解釋或定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之含義相同的含義。例如，分子生物學方面之常見術語之定義可參見Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編輯)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science有限公司出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編輯)，Molecular Biology and Biotechnology： a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers公司出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文明確指示相反之情形，否則單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。類似地，除非上下文明確指示相反之情形，否則詞語「或」意欲包括「及」。應進一步瞭解，所給出之關於核酸或多肽之所有鹼基大小或胺基酸大小及所有分子量或分子質量值均為近似值，且提供用於說明。另外，所給出之關於物質(例如抗原)濃度或含量之數值界限可為近似值。因此，在指示濃度為(例如)約200 pg之情形下，該濃度意欲包括略微大於或略微小於(「約」或「~」)200 pg之值。
儘管在本發明之實踐或測試中可使用與彼等本文所闡述者類似或等效之方法及材料，但下文仍對適宜之方法及材料加以闡述。
術語「包含」意指「包括」。因此，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprises)」及變化形式(例如「包含(comprise)」及「包含(comprising)」)應理解為暗示包括所述化合物或組合物(例如，核酸、多肽、抗原)或步驟、或化合物或步驟之群組，但並不排除任一其他化合物、組合物、步驟或其群組。縮寫「例如(e.g.)」係衍生自拉丁文exempli gratia，且在本文中用以指示非限制性實例。因此，縮寫「例如(e.g.)」係術語「例如(for example)」之同義詞。
為有利於審閱本發明之各個實施例，提供以下術語解 釋。在本發明之上下文中提供額外術語及解釋。
本文所用之「個體」係哺乳動物，包括人類、非人類靈長類動物及非靈長類哺乳動物，例如齧齒類動物成員(包括但不限於小鼠及大鼠)及兔形目(Lagomorpha)成員(包括但不限於兔子)。
本文所用之「蛋白質E(Protein E)」、「蛋白質E(protein E)」、「Prot E」及「PE」意指來自流感嗜血桿菌之蛋白質E。蛋白質E可由以下胺基酸序列組成或包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO.4之胺基酸序列(MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK)以及在整個長度上與SEQ ID NO.4至少或確切地75%、77%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%一致之序列。來自流感嗜血桿菌之53個蛋白質E序列(表1，SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.57)之比較展示與如SEQ ID NO.4中所述之蛋白質E約77%至約100%一致。例如，在蛋白質E之胺基酸序列中，胺基酸20可為異白胺酸(I)或蘇胺酸(T)；胺基酸23可為丙胺酸(A)或纈胺酸(V)；胺基酸24可為離胺酸(K)或麩胺酸(E)；胺基酸31可為丙胺酸(A)或蘇胺酸(T)；胺基酸32可為脯胺酸(P)或丙胺酸(A)；胺基酸34可為蘇胺酸(T)或丙胺酸(A)；胺基酸37可為精胺酸(R)或麩醯胺酸(Q)；胺基酸47可為纈胺酸(V)或丙胺酸(A)；胺基酸57可為色胺酸(W)或 可不存在(-)；胺基酸70可為丙胺酸(A)或蘇胺酸(T)；胺基酸93可為麩醯胺酸(Q)或不存在(-)；胺基酸109可為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)；胺基酸119可為甘胺酸(G)或絲胺酸(S)；胺基酸153可為麩胺酸(E)或離胺酸(K)；胺基酸156可為絲胺酸(S)或白胺酸(L)；胺基酸160可為離胺酸(K)或天冬醯胺酸(N)；胺基酸161可為離胺酸(K)、異白胺酸(I)或不存在(-)；胺基酸162-195可不存在，或如SEQ ID NO.15中所述(其中(-)指示胺基酸166不存在)或如SEQ ID NO.16中所述；或其任一組合。
蛋白質E可由在選自由下列組成之群之任一或多個胺基酸處與SEQ ID NO.4不同之胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列：胺基酸20、胺基酸23、胺基酸24、胺基酸31、胺基酸32、胺基酸34、胺基酸37、胺基酸47、胺基酸57、胺基酸70、胺基酸93、胺基酸109、胺基酸119、胺基酸153、胺基酸156、胺基酸160、胺基酸161及胺基酸162-195，其中胺基酸20係蘇胺酸(T)；胺基酸23係纈胺酸(V)；胺基酸24係離胺酸(K)；胺基酸31係蘇胺酸(T)；胺基酸32係丙胺酸(A)；胺基酸34係丙胺酸(A)；胺基酸37係麩醯胺酸(Q)；胺基酸47係丙胺酸(A)；胺基酸57不存在(-)；胺基酸70係蘇胺酸(T)；胺基酸93不存在(-)；胺基酸109係異白胺酸(I)；胺基酸119係絲胺酸(S)；胺基酸153係離胺酸(K)；胺基酸156係白胺酸(L)；胺基酸160係天冬醯胺酸(N)；胺基酸161係離胺酸(K)或異白胺酸(I)；或胺基酸162-195係如SEQ ID NO.15中所述(其中(-)指示胺基酸166 不存在)或如SEQ ID NO.16中所述。
蛋白質E可為來自以下流感嗜血桿菌菌株之蛋白質E：3224A、RdKW20、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittEE、PittHH、PittII、R3021、22.4-21、3219C、3185、3241A、038144S1、810956、821246、840645、902550Z19、A840177、A860514、A950014、306543X4、A930105、901905U、A920030、3221B、27W116791N、N218、N163、N162、N107、N91、D211PG、D211PD、D201PG、D201PD、D198PG、D198PD、D195PD、D189PG、D189PD、D129CG、D124PG、D124PD、D58PG、D33OD、BS433、BS432、1714、1128或BS430。蛋白質E可為如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.57中任一者中所述之蛋白質E。
蛋白質E可為在整個長度上與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致之序列。蛋白質E可為在整個長度上與表1中之SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.57所述序列中之任一者至少95%一致之序列。
蛋白質E之免疫原性片段包含SEQ ID NO.4之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段。該等免疫原性片段可引發可結合SEQ ID NO.4之抗體。
蛋白質E之免疫原性片段可包含SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段。該等免疫原性片段可引發可結合衍生出該片段之全長序列的抗體。
蛋白質E之免疫原性片段包含SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.57之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段。該等免疫原性片段可引發可結合衍生出該片段之全長序列的抗體。
本文所用之「PilA」意指來自流感嗜血桿菌之菌毛蛋白A。PilA可由以下蛋白質序列組成或包含以下蛋白質序列：SEQ ID NO.58之蛋白質序列(MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ)以及與SEQ ID NO.58 80%至100%一致之序列。例如，PilA可與SEQ ID NO.58至少 80%、85%、90%、95%、97%或100%一致。來自流感嗜血桿菌之64個PilA序列(表2，SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121)之全長比較展示與如SEQ ID NO.58中所述之PilA約80%至100%一致。例如，在PilA之胺基酸序列中，胺基酸6可為麩醯胺酸(Q)或白胺酸(L)；胺基酸7可為麩醯胺酸(Q)或蘇胺酸(T)；胺基酸37可為麩醯胺酸(Q)或離胺酸(K)；胺基酸44可為丙胺酸(A)或絲胺酸(S)；胺基酸57可為丙胺酸(A)或絲胺酸(S)；胺基酸67可為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)；胺基酸68可為麩胺酸(E)或離胺酸(K)；胺基酸69可為蘇胺酸(T)或脯胺酸(P)；胺基酸71可為離胺酸(K)、天冬醯胺酸(N)、絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)；胺基酸73可為蘇胺酸(T)、絲胺酸(S)或甲硫胺酸(M)；胺基酸76可為離胺酸(K)、絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；胺基酸84可為蘇胺酸(T)或離胺酸(K)；胺基酸86可為丙胺酸(A)或纈胺酸(V)；胺基酸91可為離胺酸(K)或丙胺酸(A)；胺基酸94可為蘇胺酸(T)、異白胺酸(I)或離胺酸(K)；胺基酸96可為絲胺酸(S)或麩醯胺酸(Q)；胺基酸97可為天冬醯胺酸(N)或絲胺酸(S)；胺基酸99可為丙胺酸(A)或甘胺酸(G)；胺基酸103可為丙胺酸(A)或離胺酸(K)；胺基酸109可為天冬胺酸(D)、丙胺酸(A)或蘇胺酸(T)；胺基酸110可為甘胺酸(G)、天冬醯胺酸(N)或精胺酸(R)；胺基酸112可為絲胺酸(S)或麩胺酸(E)；胺基酸114可為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)；胺基酸116可為蘇胺酸(T)或麩醯胺酸(Q)；胺基酸118可為麩胺酸(E)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、離胺酸(K)或絲胺酸(S)；胺 基酸121可為絲胺酸(S)或丙胺酸(A)；胺基酸122可為丙胺酸(A)或蘇胺酸(T)；胺基酸123可為離胺酸(K)、蘇胺酸(T)或丙胺酸(A)；胺基酸128可為離胺酸(K)或蘇胺酸(T)；胺基酸135可為天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；胺基酸136可為丙胺酸(A)或蘇胺酸(T)；胺基酸145可為甘胺酸(G)或精胺酸(R)；胺基酸149可為麩醯胺酸(Q)或離胺酸(K)；或其任一組合。
Pil A可由在選自由下列組成之群之任一或多個胺基酸處與SEQ ID NO.58不同之胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列：胺基酸6、胺基酸7、胺基酸37、胺基酸44、胺基酸57、胺基酸67、胺基酸68、胺基酸69、胺基酸71、胺基酸73、胺基酸76、胺基酸84、胺基酸86、胺基酸91、胺基酸94、胺基酸96、胺基酸97、胺基酸99、胺基酸103、胺基酸109、胺基酸110、胺基酸112、胺基酸114、胺基酸116、胺基酸118胺基酸121、胺基酸122、胺基酸123、胺基酸128、胺基酸135、胺基酸136、胺基酸145及胺基酸149，其中胺基酸6係白胺酸(L)；胺基酸7係蘇胺酸(T)；胺基酸37係離胺酸(K)；胺基酸44係絲胺酸(S)；胺基酸57係絲胺酸(S)；胺基酸67係甘胺酸(G)；胺基酸68係離胺酸(K)；胺基酸69係脯胺酸(P)；胺基酸71係離胺酸(K)、絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)；胺基酸73係絲胺酸(S)或甲硫胺酸(M)；胺基酸76係絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；胺基酸84係離胺酸(K)；胺基酸86係纈胺酸(V)；胺基酸91係丙胺酸(A)；胺基酸94係異白胺酸(I)或離胺酸(K)；胺基酸96係麩 醯胺酸(Q)；胺基酸97係絲胺酸(S)；胺基酸99係甘胺酸(G)；胺基酸103係丙胺酸(A)；胺基酸109係天冬胺酸(D)或蘇胺酸(T)；胺基酸110係甘胺酸(G)或精胺酸(R)；胺基酸112係絲胺酸(S)；胺基酸114係蘇胺酸(T)；胺基酸116係蘇胺酸(T)；胺基酸118係麩胺酸(E)、丙胺酸(A)、離胺酸(K)或絲胺酸(S)；胺基酸121係絲胺酸(S)；胺基酸122係蘇胺酸(T)；胺基酸123係離胺酸(K)或丙胺酸(A)；胺基酸128係離胺酸(K)；胺基酸135係麩胺酸(E)；胺基酸136係蘇胺酸(T)；胺基酸145係精胺酸(R)；胺基酸149係離胺酸(K)。
PilA可為來自以下流感嗜血桿菌菌株之PilA：NTHi3219C、NTHi3224A、NTHi12、NTHi44、NTHi67、1054MEE、1729MEE、1728MEE、1885MEE、1060MEE、RdKW20、214NP、1236MEE、1714MEE、1128MEE、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittGG、PittII、R3021、22.4-21、3185A、3221B、3241A、038144S1、821246、840645、902550Z19、A840177、A920030、A950014、901905U、A920029、A930105、306543X4、N218、N163、N162、N120、N107、N92、N91、D219PG、D211PG、D211PD、D204CD、D198PG、D198PD、D195PD、D195CD、D189PG、D189PD、D124PG、D124PD、D124CG、D58PG、BS433、BS432、 BS430、1714或1128。來自流感嗜血桿菌菌株D204CD之PilA之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.106中，其中位置116上之X係麩醯胺酸(Q)或白胺酸(L)；關於位置116上之胺基酸之不明確性可藉由解析編碼胺基酸116之第二核苷酸之技術來澄清，從而明確菌株D204CD之PilA序列。PilA可為如SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者中所述之PilA。
PilA可為在整個長度上與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121(如表2中所述)中之任一者至少95%一致之序列。
PilA之免疫原性片段包含SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段。該等免疫原性片段可引發可結合衍生出該片段之全長序列的抗體。
例如，PilA之免疫原性片段包含SEQ ID NO.58之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段。該等免疫原性片段可引發可結合SEQ ID NO.58之抗體。
多肽間之一致性可藉由多種算法來計算。例如，可使用來自EMBOSS軟體包(免費軟體；EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000).Trends in Genetics 16(6)：276-277)之Needle程式及來自GCG®軟體包(Accelrys公司)之Gap程式。此Gap程式係闡述於Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中之Needleman-Wunsch算法之執行。已使用 BLOSUM62評分矩陣，且空位開放及擴展罰分分別為8及2。
查看所計算之比對，可觀察到兩個比較序列間之一致殘基。可藉由以下來計算一致性百分比：(1)計算一致殘基數除以比對長度，乘以100(例如，對於Needle程式分析)，(2)計算一致殘基數除以最長序列長度，乘以100，(3)計算一致殘基數除以最短序列長度，乘以100，或(4)計算一致殘基數除以比對殘基數，乘以100(若一個殘基在另一殘基之前，則該殘基為比對殘基)(例如，對於Gap程式分析)。
本文所用之「佐劑」意指當與疫苗、免疫治療劑或其他含有抗原或免疫原之組合物一起投與個體時增加或增強個體對所投與抗原或免疫原之免疫反應(與不存在佐劑下獲得之免疫反應相比)的化合物或物質。此不同於由National Cancer Institute of the United States Institutes of Health定義之在癌症治療上下文中作為初步治療後給予之額外治療以降低癌症復發之風險的「佐劑療法」。
保守取代已為業內所熟知且在序列比對電腦程式中通常將其設定為默認評分矩陣。該等程式包括PAM250(Dayhoft M.O.等人，(1978)，「A model of evolutionary changes in proteins」，「Atlas of Protein sequence and structure」5(3)M.O.Dayhoft(編輯)，345-352)，National Biomedical Research Foundation,Washington；及Blosum 62(Steven Henikoft及Jorja G.Henikoft(1992)，「Amino acid substitution matrices from protein blocks」),Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89(Biochemistry)：10915-10919。本發明進一步提供含有保守胺基酸取代之式(I)之融合蛋白質。例如，式(I)之融合蛋白質可含有如本文所述序列中之任一者中所闡述之流感嗜血桿菌PE或PilA(例如，闡述於SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一PE序列及/或闡述於SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一PilA序列)中之任一胺基酸之保守取代。
本文所用之「信號肽」係指存在於前體蛋白質上(通常在N末端)且通常在成熟蛋白質中不存在之短(小於60個胺基酸，例如，3至60個胺基酸)多肽。信號肽(sp)通常富含疏水胺基酸。信號肽指導轉譯蛋白質轉運穿過膜及/或轉譯蛋白質分泌。信號肽亦可稱為靶向信號、轉送肽、定位信號或信號序列。例如，信號序列可為共轉譯或轉譯後信號肽。
異源信號肽可在蛋白質轉運或分泌期間或之後藉由信號肽肽酶自融合蛋白質構建體裂解。例如，信號肽肽酶係信號肽肽酶I。「異源」信號肽係當存在於自然界中時不與蛋白質結合之信號肽。
本文所用之「治療」意指預防個體病況或疾病之症狀之發生、預防個體病況或疾病之症狀之復發、延遲個體病況或疾病之症狀之復發、降低個體病況或疾病之症狀之嚴重程度或頻率、減緩或消除病況進展及部分或完全消除個體疾病或病況之症狀。
本文所用之「視情況」意指隨後闡述之事件可發生或可 不發生，且包括發生之事件及不發生之事件。
NTHi引起之疾病之發病以鼻咽定殖開始。在鼻咽微環境內黏著及保持長期停留之機制視為NTHi之「毒力決定因素」。(Vaccine 28：279-289(2010))。
NTHi能夠黏著至人類宿主之黏膜上皮表面的重要性反映在由NTHi表現之黏著素之多樣性。例如，一些NTHi表現菌毛。其他黏著結構屬於蛋白質之自轉運蛋白家族；該等包括Hap、HMW1/HMW2及Hia/Hsf蛋白質。已闡述其他外膜蛋白質，例如P2蛋白質、P5蛋白質及OapA作為流感嗜血桿菌之黏著素。(Cellular Microbiology 4：191-200(2002)；Microbes and Infection 10：87-96(2008)；Vaccine 28：279-289(2010))。
中耳炎係80%之所有不足3週歲兒童患病之主要原因。(Expert Rev.Vaccines5：517-534(2006))。超過90%的兒童在7週歲之前會發生中耳炎(Current Opinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。在2000年，在美國因中耳炎而拜訪自設診所醫生(office-based physician)1600萬次，且配發約1300萬個抗細菌處方。(Pediatrics 113：1451-1465(2004))。在歐洲國家中，報導之急性中耳炎比率介於每個兒童每年(per child-year)0.125至1.24範圍內。(Expert Review of Vaccines 8：1479-1500(2009))。中耳炎係花費高之感染且係兒童接受抗生素之最常見原因。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。約70%之急性中耳炎病例係由細菌引起，其中肺炎鏈球 菌、無法分型之流感嗜血桿菌及黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)係主要的致病物(Expert Review of Vaccines 5：517-534(2006))。一子組兒童經歷復發性及慢性中耳炎，且該等易患耳炎之兒童長期具有中耳積液，此與聽力損失及言語及語言發育延遲有關。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。
繼在許多國家引入七價肺炎球菌疫苗後，一些研究已證實由流感嗜血桿菌引起之急性中耳炎之比例顯著增加，其中流感嗜血桿菌成為主要的病原體。(Pediatric Infectious Disease Journal 23：824-828；Pediatric Infectious Disease Journal 23：829-833(2004))。
由於中耳炎係多因素疾病，故使用接種疫苗策略來預防中耳炎之可行性一直成問題。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。然而，一項研究之結果表明，抗原可誘導至少部分對抗無法分型之流感嗜血桿菌之保護。(Lancet 367：740-748(2006))。一種研發疫苗抗原之途徑係使用遺傳上異源但大量表現之表面分子之抗原性保守區域。另一途徑係識別展示序列或功能表位保守之表面蛋白質。疫苗抗原之第三種考慮可為選擇在感染及定殖期間在人類宿主中表現之抗原。Murphy(Curr.Infect.Disease Reports 11：177-182(2009)陳述，儘管存在若干種潛在無法分型之流感嗜血桿菌候選抗原，但不能確定無疑地預測候選抗原是否將有效。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。描述為潛在疫苗抗原之一些 蛋白質係：嗜血桿菌黏著素蛋白(Hap)、高分子量(HMW)蛋白質1及2、流感嗜血桿菌黏著素(Hia)、D15蛋白質、HtrA熱休克蛋白、P2表面蛋白、脂蛋白D、P5絲束蛋白衍生肽、外膜蛋白質P4、外膜蛋白質(OMP)26(OMP26)、P6蛋白質、蛋白質E、IV型菌毛、脂寡糖及磷醯膽鹼。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009)；Expert Review of Vaccines 5：517-534(2006))。
毛絲鼠屬(chinchilla)模型係中耳炎及其預防之穩健且經驗證之動物模型(Expert Review of Vaccines 8：1063-1082(2009))。儘管毛絲鼠屬模型可模擬人類感染之自然過程，但其他人已提出，毛絲鼠屬模型之結果在各實驗室間可不同。(Current Opinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。
亦已使用多種其他齧齒類動物來誘導中耳炎，且匯總於Vaccine 26：1501-1524(2008)中。在中耳炎研究中通常研究鼠類動物模型。
殺菌性抗體之存在與防止發生由無法分型之流感嗜血桿菌引起之中耳炎有關。(Current Opinion in Infectious Disease 16：129-134(2003))。然而，免疫反應有效對抗NTHi無需具有殺菌性。僅僅與NTHi表面黏著素反應之抗體可減輕或消除毛絲鼠屬中耳炎。(Current Opinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。
慢性阻塞性肺病係慢性發炎性肺部疾病且係全世界範圍內患病及死亡之主要原因。在2005年，在美國，20例死亡 中約有1例以COPD作為根本原因。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。預計，在2020年，COPD將上升成為失能調整生命年數(disability adjusted life years)之第五主要原因，慢性致病殘性疾病(chronic invalidating disease)，且成為死亡之第三重要原因(Lancet 349：1498-1504(1997))。
COPD病程之特徵在於氣流受限之進行性惡化及肺功能之衰退。COPD可因頻繁且反覆急性惡化(AE)而變得麻煩，急性惡化會造成龐大的健康護理花費及高患病率。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。一項研究表明，約50%之COPD症狀急性惡化係由無法分型之流感嗜血桿菌、黏膜炎莫拉菌、肺炎鏈球菌及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。在20-30%之COPD惡化中發現流感嗜血桿菌；在10-15%之COPD惡化中發現肺炎鏈球菌；且在10-15%之COPD惡化中發現黏膜炎莫拉菌。(New England Journal of Medicine 359：2355-2365(2008))。已顯示，流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌及黏膜炎莫拉菌係香港、南韓及菲律賓枝氣管炎急性惡化之主要病原體，而克雷伯菌屬(Klebsiella spp.)、銅綠假單胞菌及不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)佔其他亞洲國家/地區(包括印度尼西亞、泰國、馬來西亞及臺灣)病原體之大部分(Respirology,(2011)16,532-539；doi：10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉國，20%之COPD患者顯示假單胞菌屬、克雷伯 菌屬、肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌之陽性痰培養物，而65%之AECOPD患者顯示假單胞菌屬、克雷伯菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、黏膜炎莫拉菌及其組合之陽性培養物。(Mymensingh Medical Journal 19：576-585(2010))。然而，已提出，兩種最重要之預防COPD惡化之措施係主動免疫及長期維持藥物療法。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。
當前需要有效對抗NTHi之疫苗。使用可在不同發病步驟起作用之抗原可提高疫苗之功效。本發明者已發現，PilA及PE可作為融合蛋白質有益地存在於本發明免疫原性組合物中。
本發明係關於式(I)之融合蛋白質，(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (式I)其中：X係信號肽或MHHHHHH(SEQ ID NO.2)；m係0或1；R1係胺基酸；n係0、1、2、3、4、5或6；A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E或其免疫原性片段、或來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段；Y係選自由下列組成之群：GG、SG、SS及(G)h，其中h係4、5、6、7、8、9或10；o係0或1；B係來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段、或來自 流感嗜血桿菌之蛋白質E或其免疫原性片段；Z係GGHHHHHH(SEQ ID NO.3)；且p係0或1。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中X係選自由來自下列之信號序列組成之群：CcmH(細胞色素C膜蛋白質H)、DsbA(周質蛋白質二硫化物異構酶I)、DsbB(二硫鍵膜蛋白質B)、FlgI(鞭毛肽多糖環蛋白質)、FocC(F1c陪伴分子(Chaperone)蛋白質)、MalE(麥芽糖轉運蛋白亞單位E)、NadA(喹啉酸鹽合酶亞單位A)、NikA(鎳ABC轉運蛋白組份A)、NspA(奈瑟球菌屬(Neisserial)表面蛋白質A)、Omp26(外膜蛋白質26)、OmpA(外膜蛋白質A)、OspA(外表面蛋白質A)、pelB(果膠酸裂解酶B)、PhoA(細菌鹼性磷酸酶)、PhtD(肺炎球菌組胺酸三聯蛋白質D)、PhtE(肺炎球菌組胺酸三聯蛋白質E)、SfmC(周質菌毛蛋白陪伴分子)、Sip1(表面免疫原性蛋白質)、TolB(Tol-Pal細胞莢膜複合物組份B)、TorA(三甲胺N-氧化物還原酶系統亞單位A)、TorT(三甲胺N-氧化物還原酶系統周質蛋白質T)及Yral(推定的周質菌毛蛋白陪伴分子)；或其任一亞群。在一個實施例中，X係共轉譯信號肽或轉譯後信號肽。在一個實施例中，X係來自FlgI之信號序列(flgI sp)。在另一特定實施例中，X係來自pelB之信號序列(pelB sp)。在另一實施例中，X係轉譯後信號肽。在另一實施例中，X係選自由來自FlgI、NadA及pelB之信號序列組成之群。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中m係1。在另一實施例中，m係0。
在一個特定實施例中，R1及n經定義其中(R1)n係富集小的通常親水胺基酸之1至6個胺基酸。親水胺基酸包括麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)及天冬醯胺酸(N)。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中n係選自由0、1、2及6組成之群。在一個特定實施例中，R1及n經定義其中(R1)n係選自由下列組成之群：D、E、ATNDDD(SEQ ID NO.178)及MD、或其任一子組。
在一個特定實施例中，n係選自由1、2及6組成之群。在一個特定實施例中，n係0。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係由選自由下列組成之群之胺基酸序列編碼之蛋白質E：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57；或SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.57之任一子組。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E胺基酸序列約75%至100%一致。在另一實施例中，A係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E胺基酸序列約90%至100%一致。在另一實施例中，A係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E胺基酸序列至少95%一致。在另一實施例中，A係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者中所述之蛋白質E至少95%一致。在一特定實施例中，A係具有SEQ ID NO：4中所述之胺基酸序列的蛋白質E。
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段。在另一實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E具有選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57；或SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.57之任一子組。在另一實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之胺基酸序列約75%至100%一致。在另一實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4約90%至100%一致。在另一實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致。更具體而言，在一個實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO.124 93%至100%一致。在一特定實施例中，A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E係SEQ ID NO.4。
在另一實施例中，A係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.4之胺基酸17-160(SEQ ID NO.122)、SEQ ID NO.4之胺基酸18-160(SEQ ID NO.123)、SEQ ID NO.4之胺基酸19-160(SEQ ID NO.124)、SEQ ID NO.4之胺基酸20-160(SEQ ID NO.125)及SEQ ID NO.4之胺基酸22-160(SEQ ID NO.126)。在另一實施例中，A係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.4之胺基酸17-160(SEQ ID NO.122)、SEQ ID NO.4之胺基酸18-160(SEQ ID NO.123)、SEQ ID NO.4之胺基酸19-160(SEQ ID NO.124)、SEQ ID NO.4之胺基酸20-160(SEQ ID NO.125)、SEQ ID NO.4之胺基酸22-160(SEQ ID NO.126)、SEQ ID NO.4之胺基酸23-160(SEQ ID NO.179)及SEQ ID NO.4之胺基酸24-160(SEQ ID NO.180)。在又一實施例中，A係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.4之胺基酸17-160(SEQ ID NO.122)、SEQ ID NO.4之胺基酸18-160(SEQ ID NO.123)、SEQ ID NO.4之胺基酸20-160(SEQ ID NO.125)、SEQ ID NO.4之胺基酸22-160(SEQ ID NO.126)、SEQ ID NO.4之胺基酸23-160(SEQ ID NO.179)及SEQ ID NO.4之胺基酸24-160(SEQ ID NO.180)。更具體而言，在一個實施例中，A係SEQ ID NO.124，即SEQ ID NO.4之胺基酸19-160。在另一實施例中，A係SEQ ID NO.125，即SEQ ID NO.4之胺基酸20-160。在另 一實施例中，A係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.4之胺基酸23-160(SEQ ID NO.179)及SEQ ID NO.4之胺基酸24-160(SEQ ID NO.180)。
蛋白質E-SEQ ID NO.4 MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸17-160-SEQ ID NO.122 SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸18-160-SEQ ID NO.123 AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸19-160-SEQ ID NO.124 QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸20-160-SEQ ID NO.125 I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸22-160-SEQ ID NO.126 KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸23-160-SEQ ID NO.179 AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸24-160-SEQ ID NO.180 EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係來自流感嗜血桿菌之PilA。在另一實施例中，式(I)之融合蛋 白質經定義其中A係具有選自由下列組成之群之胺基酸序列之來自流感嗜血桿菌之PilA：SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.120及SEQ ID NO.121；或SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121之任一子組。在另一實施例中，A係PilA，其中PilA與SEQ ID NO.58約80%至100%一致。在另一實施例 中，A係PilA，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致。在一特定實施例中，A係SEQ ID NO.58之PilA。
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中A係來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段。在另一實施例中，A係PilA之免疫原性片段，其中PilA與SEQ ID NO.58約80%至100%一致。例如，A係PilA之免疫原性片段，其中PilA具有選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.120及SEQ ID NO.121；或SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121之任一子組。在另一實施例中，A係PilA之免疫原性片段，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致。在一特定實施例中，A係來自流感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA之免疫原性片段，其中PilA係SEQ ID NO.58。
來自流感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA-SEQ ID NO.58 MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ
在另一實施例中，A係與SEQ ID NO.127約75%至100%一致之PilA之免疫原性片段。更具體而言，在一個實施例中，A係SEQ ID NO.127，即由SEQ ID NO.58之胺基酸40-149組成之片段。
來自流感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA之胺基酸40-149-SEQ ID NO.127.T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ
在另一實施例中，A係由SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者之胺基酸40-149組成之PilA之免疫原性片 段。在另一實施例中，A係與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者之胺基酸40-149至少95%一致之免疫原性片段。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中Y係選自由GG、SG及SS組成之群。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中Y係GG或SG。在一個特定實施例中，Y係GG。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中o係1。在另一實施例中，o係0。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中當A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E或來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段時，B係來自流感嗜血桿菌之PilA或來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段。例如，B係來自流感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA。在另一實施例中，B係具有選自由下列組成之群之胺基酸序列之來自流感嗜血桿菌之PilA：SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.86、 SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.120及SEQ ID NO.121；或SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121之任一子組。在另一實施例中，B係PilA，其中PilA與SEQ ID NO.58約80%至100%一致。在另一實施例中，B係PilA，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致。在一特定實施例中，B係SEQ ID NO.58之PilA。
在另一實施例中，B係PilA，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致，且A係PE，其中PE與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致。
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中當A係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段時，B係來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段。例如，B係來自流 感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA之免疫原性片段。在另一實施例中，B係PilA之免疫原性片段，其中PilA與SEQ ID NO：58約80%至100%一致。在另一實施例中，B係PilA之免疫原性片段，其中PilA具有選自由下列組成之群之胺基酸：SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.120及SEQ ID NO.121；或 SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121之任一子組。在另一實施例中，B係PilA之免疫原性片段，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致。在一特定實施例中，B係來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段，其中PilA具有SEQ ID NO.58中所述之胺基酸序列。在另一實施例中，B係PilA之由SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者之胺基酸40-149組成之免疫原性片段。更具體而言，在一個實施例中，B係如SEQ ID NO.127中所述之PilA片段。在另一實施例中，B係與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者之胺基酸40-149至少95%一致之免疫原性片段。
在一個特定實施例中，B係如SEQ ID NO.127中所述之PilA片段且A係選自由下列組成之群之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125及SEQ ID NO.126。更特定而言，B係如SEQ ID NO.127中所述之PilA片段且A係如SEQ ID NO.124(SEQ ID NO.4之蛋白質E之胺基酸19-160)中所述之蛋白質E片段。在另一實施例中，B係如SEQ ID NO.127中所述之PilA片段且A係如SEQ ID NO.125中所述之蛋白質E片段。
在另一實施例中，B係PilA之免疫原性片段，其中PilA與SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121中之任一者至少95%一致，且A係PE之免疫原性片段，其中PE與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致。
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中當A係 來自流感嗜血桿菌之PilA時，B係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E。例如，B係具有選自由下列組成之群之胺基酸序列的蛋白質E：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43 SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57；或SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.57之任一子組。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中B係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E胺基酸序列約75%至100%一致。在另一實施例中，B係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E胺基酸序列約90%至100%一致。例如，B係蛋白質E，其 中蛋白質E與SEQ ID NO：4中所述之蛋白質E至少95%一致。在另一實施例中，B係蛋白質E，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致。在一特定實施例中，B係具有SEQ ID NO：4中所述之胺基酸序列的蛋白質E。
在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中當A係來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段時，B係來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段。例如，B係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57；或SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.57之任一子組。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中B係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4中所述之蛋白質E胺基酸序列約75%至100%一致。在另一實施例中，B係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4中所述之蛋白質E胺基酸序列約90%至100%一致。在一特定實施例中，B係具有SEQ ID NO.4中所述之胺基酸序列的蛋白質E之免疫原性片段。在另一實施例中，B係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E與SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.57中之任一者至少95%一致。
在另一實施例中，B係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E片段：SEQ ID NO.4之胺基酸17-160(SEQ ID NO.122)、SEQ ID NO.4之胺基酸18-160(SEQ ID NO.123)、SEQ ID NO.4之胺基酸19-160(SEQ ID NO.124)、SEQ ID NO.4之胺基酸20-160(SEQ ID NO.125)及SEQ ID NO.4之胺基酸22-160(SEQ ID NO.126)。在另一實施例中，B係選自由下列組成之群之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段：SEQ ID NO.4之胺基酸17-160(SEQ ID NO.122)、SEQ ID NO.4之胺基酸18-160(SEQ ID NO.123)、SEQ ID NO.4之胺基酸19-160(SEQ ID NO.124)、SEQ ID NO.4之胺基酸20-160(SEQ ID NO.125)、SEQ ID NO.4之胺基酸22-160(SEQ ID NO.126)、SEQ ID NO.4之胺基酸23-160(SEQ ID NO.179)及SEQ ID NO.4之胺基酸24-160(SEQ ID NO.180)。更具體而言，在一個實施例中，B係如SEQ ID NO.123(SEQ ID NO.4之胺基酸18-160)中所述之蛋白質E片段。
在一個特定實施例中，當A係如SEQ ID NO.127中所述之PilA之免疫原性片段時，B係如SEQ ID NO.123(SEQ ID NO.4之胺基酸18-160)中所述之蛋白質E之免疫原性片段。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中p係0。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質經定義其中p係1。
在一個實施例中，式(I)之融合蛋白質係選自由下列組成之群：SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.146、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.182、SEQ ID NO.184、SEQ ID NO.186、SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.190、SEQ ID NO.192、SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.196、SEQ ID NO.198、SEQ ID NO.200、SEQ ID NO.202及SEQ ID NO.204；或其任一子組。在另一實施例中，式(I)之融合蛋白質與SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.146、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.182、SEQ ID NO.184、SEQ ID NO.186、SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.190、SEQ ID NO.192、SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.196、SEQ ID NO.198、SEQ ID NO.200、SEQ ID NO.202 或SEQ ID NO.204中之任一者約95%一致。
式(I)之融合蛋白質可在諸如哺乳動物(尤其人類)等個體中用作免疫原。特定而言，式(I)之融合蛋白質可用於在個體(尤其人類)中誘導對抗流感嗜血桿菌之免疫反應。更具體而言，式(I)之融合蛋白質可用於治療或預防中耳炎及/或AECOPD及/或肺炎。
本發明係關於包含來自流感嗜血桿菌之蛋白質E(或其免疫原性片段)及來自流感嗜血桿菌之PilA(或其免疫原性片段)之免疫原性組合物、及包含來自流感嗜血桿菌之蛋白質E(或其免疫原性片段)與來自流感嗜血桿菌之PilA(或其免疫原性片段)之融合蛋白質的免疫原性組合物。本發明亦係關於包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。
在一個實施例中，該等免疫原性組合物包含來自流感嗜血桿菌之蛋白質E(或其免疫原性片段)及來自流感嗜血桿菌之PilA(或其免疫原性片段)。蛋白質E可為SEQ ID NO.4或與SEQ ID NO.4至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之蛋白質E序列。
蛋白質E之免疫原性片段可為SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125或SEQ ID NO.126、或與SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125或SEQ ID NO.126中之任一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的序列。蛋白質E之免疫原性片段可為SEQ ID NO. 122、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.180或與SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.180中之任一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的序列。已描述當與作為參考菌株之來自流感嗜血桿菌Rd之蛋白質E進行比較時來自不同嗜血桿菌種類之蛋白質E之胺基酸差異。Microbes & Infection(「Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells」補遺[Microbes Infect.10(2008)87-97]，2010年7月6日可在線獲得，「正在評論中(Article in Press)」)提供來自流感嗜血桿菌菌株772之蛋白質E的序列。WO2002/28889提供來自流感嗜血桿菌菌株12085之蛋白質E的序列。
蛋白質E含有上皮細胞結合區域(PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR，SEQ ID NO.128)，已報導該結合區域在超過100種臨床NTHi分離株、有莢膜的流感嗜血桿菌及所分析之培養物收藏中心菌株中係保守的(Singh等人，J.Infect.Dis.201(3)：414-9(2010))。Singh等人報導，蛋白質E在NTHi及有莢膜的流感嗜血桿菌中高度保守(96.9%-100%一致，無信號肽)。在一個實施例中，蛋白質E片段包含SEQ ID NO.128(PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR)之結合區域。
PilA係在活體內表現之保守黏著素。來自流感嗜血桿菌 之64個PilA序列的全長比較展示約80%至100%一致性。
在另一實施例中，免疫原性組合物包含如藉由式(I)所定義之融合蛋白質。
在一個實施例中，本發明免疫原性組合物可與來自流感嗜血桿菌之其他抗原一起投與。例如，PE及PilA或式(I)之融合蛋白質可與來自流感嗜血桿菌之蛋白質D一起投與。蛋白質D可如WO91/18926中所述。在另一實施例中，免疫原性組合物可包括式(I)之融合蛋白質及來自流感嗜血桿菌之蛋白質D。
在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物可與來自已知亦引起中耳炎、AECOPD或肺炎之其他細菌種類之其他抗原一起投與。
達成期望治療或生物效應所需要之免疫原性組合物的量將取決於多個因素，例如其擬定用途、投與方式、接受者及所治療病況之類型及嚴重程度，且最終將由主治醫師或獸醫自行決定。通常，例如，用於治療人類完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病況的典型劑量預期可介於約0.003 mg至約0.090 mg範圍內。更具體而言，用於治療人類完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病況的典型劑量可介於約0.01 mg至約0.03 mg融合蛋白質範圍內。免疫原性組合物可含有其他抗原；對於每一其他抗原，用於治療人類完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病況的典型劑量可介於約0.01 mg至約0.03 mg範圍內。該劑量可作為單一單位劑量投與。亦可投與若干單獨單位劑量。例如，單獨單位劑量 可在生命中第一年內作為單獨初始劑量投與或每隔一定時間(例如，每1年、5年或10年)作為單獨加強劑量投與。
包含本發明免疫原性組合物之調配物可配合合適途徑投與，例如，藉由肌內、舌下、經皮、皮內或鼻內途徑。該等調配物可藉由熟習此項技術者所習知之任一方法來製備。
本發明免疫原性組合物可額外包含佐劑。當術語「佐劑」用於本說明書中時，其係指與免疫原性組合物一起投與以加強患者對組合物之免疫原性組份之免疫反應的物質。
適宜佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明礬，但亦可為鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或可為醯化酪胺酸或醯化糖、經陽離子或陰離子衍化之多醣或聚磷腈之不溶性懸浮液。在一個實施例中，融合蛋白質、PE或PilA可吸附至磷酸鋁上。在另一實施例中，融合蛋白質、PE或PilA可吸附至氫氧化鋁上。在第三實施例中，可使用明礬作為佐劑。
促進主要Th1反應之適宜佐劑系統包括：脂質A之無毒性衍生物、單磷醯脂質A(MPL)或其衍生物，尤其3-去-O-醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)(其製備可參見GB 2220211 A)；及單磷醯脂質A、較佳3-去-O-醯基化單磷醯脂質A與鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳液之組合。在該等組合中，抗原及3D-MPL含於同一微粒結構中，從而能夠更高效地遞送抗原性及免疫刺激性信號。研究已顯示， 3D-MPL能夠進一步增強吸附至明礬之抗原之免疫原性(Thoelen等人，Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1)。
AS01係含有MPL(3-O-去醯基-4'-單磷醯脂質A)、QS21(奎拉雅屬皂樹(Quillaja Saponaria Molina)，部分21)，Antigenics,New York,NY,USA)及脂質體之佐劑系統。AS01B係含有MPL、QS21及脂質體(50 μg MPL及50 μg QS21)之佐劑系統。AS01E係含有MPL、QS21及脂質體(25 μg MPL及25 μg QS21)之佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01。在另一實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01B或AS01E。在一特定實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01E。
AS03係含有存於油/水(o/w)乳液中之α-生育酚及角鯊烯的佐劑系統。AS03A係含有存於o/w乳液中之α-生育酚及角鯊烯(11.86 mg生育酚)的佐劑系統。AS03B係含有存於o/w乳液中之α-生育酚及角鯊烯(5.93 mg生育酚)的佐劑系統。AS03C係含有存於o/w乳液中之α-生育酚及角鯊烯(2.97 mg生育酚)的佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS03。
AS04係含有吸附於鋁鹽(500 μg Al3+)上之MPL(50 μg MPL)的佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS04。
涉及使用QS21及3D-MPL之系統揭示於WO 94/00153中。QS21用膽固醇驟冷之組合物揭示於WO 96/33739中。 涉及存於水包油乳液中之QS21、3D-MPL及生育酚之另一佐劑調配物闡述於WO 95/17210中。在一個實施例中，免疫原性組合物額外包含皂苷，該皂苷可為QS21。調配物亦可包含水包油乳液及生育酚(WO 95/17210)。含有未甲基化CpG之寡核苷酸(WO 96/02555)及其他免疫調節性寡核苷酸(WO 0226757及WO 03507822)亦為TH1反應之較佳誘導劑且適宜用於本發明。
其他佐劑係選自以下之群組：金屬鹽、水包油乳液、類鐸受體激動劑(尤其類鐸受體2激動劑、類鐸受體3激動劑、類鐸受體4激動劑、類鐸受體7激動劑、類鐸受體8激動劑及類鐸受體9激動劑)、皂苷或其組合。
本發明提供製備包含式(I)之融合蛋白質與佐劑之組合之免疫原性組合物的方法。
本發明進一步提供含有本發明免疫原性組合物及醫藥上可接受之賦形劑的疫苗。
可能的賦形劑包括精胺酸、普流羅尼酸(pluronic acid)及/或聚山梨酯。在一較佳實施例中，使用聚山梨酯80(例如，TWEEN® 80)。在另一實施例中，使用約0.03%至約0.06%之最終濃度。具體而言，可使用約0.03%、0.04%、0.05%或0.06%聚山梨酯80(w/v)之最終濃度。
本發明提供製備包含式(I)之融合蛋白質與醫藥上可接受之賦形劑之組合之免疫原性組合物或疫苗的方法。
本發明亦提供編碼本發明蛋白質之核酸。術語「核酸」係指核苷酸之聚合形式。核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核 糖核苷酸、或核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之修飾形式。該術語包括單鏈及雙鏈形式之DNA。該等核酸較佳實質上不含其他核酸。
本發明提供產生本發明核酸之方法。本發明核酸可藉由熟習此項技術者所習知之方法來製備。例如，本發明核酸可部分或完全合成得到。該等核酸可藉由消化較長胺基酸或連接較短胺基酸來製備。
以下實例僅意欲用於說明，且並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
在該等實例中，下列術語具有以下所指示含義：6×his=6個組胺酸；×g=離心力(重力數)；ATP=三磷酸腺苷；BCA=二喹啉甲酸；BSA=牛血清白蛋白；℃=攝氏度；CaCl2=氯化鈣；CV=管柱體積；DNA=去氧核糖核酸；DSC=差示掃描量熱法；DTT=二硫蘇糖醇；dNTP=三磷酸去氧核苷；EDTA=乙二胺四乙酸；FT=流通物(flow through)； HCl=氯化氫；His=his=組胺酸；HEPES=4-(2-羥基乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸；IMAC=固定金屬親和層析；IPTG=異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷；KCl=氯化鉀；K2HPO4=磷酸氫二鉀；KH2PO4=磷酸二氫鉀；LDS=十二烷基硫酸鋰；L=升；MES=2-(N-嗎啉基)乙磺酸；MgCl2=氯化鎂；ml=毫升；RPM=每分鐘轉數；min=分鐘；mM=毫莫耳濃度；μL=微升；NaCl=氯化鈉；Na2HPO4=磷酸氫二鈉；NaH2PO4=磷酸二氫鈉；ng=毫微克；nm=奈米；O/N=過夜；PBS=磷酸鹽緩衝鹽水； PCR=聚合酶鏈反應；SB=試樣緩衝液；sec=秒；w/v=重量/體積。
實例 實例1：融合蛋白質
產生具有不同信號肽及胺基酸連接體序列之融合蛋白質。該等融合蛋白質使得能夠分泌蛋白質E及PilA(或其片段)，而不限於單一細菌菌株。該融合蛋白質在藉由信號肽肽酶移除異源信號肽後釋放至周質中。自細菌純化之融合蛋白質不含異源信號肽。自細菌移除「純化」蛋白質且其無信號肽。
下表描述所製造之融合蛋白質構建體。
下文敍述表3中所列示之信號肽及質粒中之每一者的DNA及胺基酸序列。
信號序列：
pelB信號肽(DNA)-SEQ ID NO.129：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcc
pelB信號肽(胺基酸)-SEQ ID NO.130：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA
FlgI信號肽(DNA)-SEQ ID NO.131：atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct
FlgI信號肽(胺基酸)-SEQ ID NO.132：MIKFLSALIL LLVTTAAQA
NadA信號肽(DNA)-SEQ ID NO.133：atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggca
NadA信號肽(胺基酸)-SEQ ID NO.134：MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA
融合蛋白質構建體序列：
單下劃線部分之胺基酸序列係來自流感嗜血桿菌菌株86-028NP之PilA。加粗下劃線部分之胺基酸序列係衍生自流感嗜血桿菌菌株772之蛋白質E。
LVL312(DNA)-SEQ ID NO.135：atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagc aacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL312(蛋白質)：(flgI sp)(E)(PilA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18-160)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.136 MIKFLSALIL LLVTTAAQAE TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGHHH HHH
LVL291(DNA)-SEQ ID NO.137：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL291(蛋白質)(pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.138 MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL268(DNA)-SEQ ID NO.139：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgatattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL268(蛋白質)：(pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.140：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL269(DNA)-SEQ ID NO.141：atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggcagccacaaacgacgacgataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcac gttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL269(蛋白質)：(nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.142 MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALAATNDDDK AEQNDVKLAP PTDVRSGYIR LVKNVNYYID SESIWVDNQE PQIVHFDAVV NLDKGLYVYP EPKRYARSVR QYKILNCANY HLTQVRTDFY DEFWGQGLRA APKKQKKHTL SLTPDTTLYN AAQI ICANYG EAFSVDKKGG TKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATG NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGHHHHHH
LVL270(DNA)-SEQ ID NO.143：atgcaccaccaccaccaccacagcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaag tacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL270(蛋白質)：(MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.144：MHHHHHHSAQ IQKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ
LVL315(DNA)-SEQ ID NO.145：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL315(蛋白質)：(pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.146：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIBLVKNV NYYIDSFSIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH
LVL317(DNA)-SEQ ID NO.147：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgat gaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL317(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.148：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ
LVL318(DNA)-SEQ ID NO.149：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL318(蛋白質)：(pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.150：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL702(DNA)-SEQ ID NO.181：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL702(蛋白質)：(pclB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.182：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAIQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLYKNV NYYTDSESTW VDNQEPQTVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH
LVL736(DNA)-SEQ ID NO.183：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttc tatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL736(蛋白質)：(pclB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.184：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQGG HHHHHH
LVL737(DNA)-SEQ ID NO.185：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctat gatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL737(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.186：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQGGH HHHHH
LVL738(DNA)-SEQ ID NO.187：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL738(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.188：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQGGHHHHH H
LVL739(DNA)-SEQ ID NO.189：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgggga cagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL739(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.190：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQGGHHHHHH
LVL740(DNA)-SEQ ID NO.191：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacag ggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL740(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH)-SEQ ID NO.192：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT QGGHHHHHH
LVL735(DNA)-SEQ ID NO.193：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL735(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.194：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAIOKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL778(DNA)-SEQ ID NO.195：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttc tatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL778(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.196：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNFTTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQ
LVL779(DNA)-SEQ ID NO.197：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctat gatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL779(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.198：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQERQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQ
LVL780(DNA)-SEQ ID NO.199：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL780(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.200：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ
LVL781(DNA)-SEQ ID NO.201：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgggga cagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL781(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.202：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQ
LVL782(DNA)-SEQ ID NO.203：atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacag ggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL782(蛋白質)：(pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149)-SEQ ID NO.204：MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY GEAESVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT Q
上述序列所來源之PE及PilA的全長序列分別闡述於SEQ ID NO.4(PE)及SEQ ID NO.58(PilA)中。
實例2：載體構建及轉化
用於擴增來自流感嗜血桿菌菌株772之PE的引物係基於流感嗜血桿菌菌株Hi Rd之序列來設計。5'引物序列與NTHi 772序列相比含有1個核苷酸差異，與目前報導之NTHi 772基因組序列相比在位置24上引入胺基酸差異。融合蛋白質構建體中之胺基酸24係E(麩胺酸)而非如NTHi 772中所見之K(離胺酸)。
來自流感嗜血桿菌菌株Rd之PE之DNA序列-SEQ ID NO.151 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggtgaatttagataggggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagattttgaattgtgcaaattatcatttaactcaaatacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaattatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa
來自流感嗜血桿菌菌株Rd之PE之蛋白質序列-SEQ ID NO.152 MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDRGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQIRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGKAFSVDKK
來自流感嗜血桿菌菌株772之PE之DNA序列(如Microbes & Infection,「Ideniification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells」補遺[Microbes Infect.10(2008)87-97]，2010年7月6日可在線獲得，「正在評論中」中所述)-SEQ ID NO.153 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatcc aaaaggctaaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaa
來自流感嗜血桿菌菌株772之PE之蛋白質序列(如Microbes & Infection,「Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells」補遺[Microbes Infect.10(2008)87-97]，2010年7月6日可在線獲得，「正在評論中」中所述)-SEQ ID NO.154 MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAKQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
載體構建：
為產生LVL312、LVL291、LVL268、LVL269、LVL270、LVL702、LVL735、LVL778、LVL779、LVL780、LVL781及LVL782，製備以下組份之聚合酶鏈反應(PCR)製備品(具體組份隨後例示)：將36.6 μl去離子水、5 μl緩衝液1 10×、5 μl dNTPs 2 mM、2 μl MgCl2 25 mM、0.4 μl引物1(50 μM)、0.4 μl引物2(50 μM)、0.5 μl模板 (100 ng/μl)及0.4 μl 2.5個單位/μl之KOD HiFi DNA聚合酶(NOVAGEN®)調配在一起。聚合酶鏈反應涉及25個循環之在98℃下變性15秒、在55℃下退火2秒及在72℃下引物延伸20秒。使用QIAQUICK® PCR純化套組(QIAGEN®)來純化PCR產物。在供應商建議之條件下使用此產物：向1體積PCR製備品中添加5體積之QIAQUICK® PCR純化套組中提供之緩衝液PB。隨後藉由渦漩將PCR製備品與緩衝液PB混合。將QIAQUICK®管柱放置於2 ml收集管中。為使PCR製備品中之DNA結合至管柱，將混合試樣施加至QIAQUICK®管柱中並在14 000 RPM下離心30-60秒。棄除流通物，並將QIAQUICK®管柱放置回同一管中。洗滌結合之DNA時，將0.75 ml QIAQUICK® PCR純化套組中提供之緩衝液PE添加至QIAQUICK®管柱中，並將管柱在14 000 RPM下離心30-60秒。棄除流通物，並將QIAQUICK®管柱放置回同一管中。將QIAQUICK®管柱於2 ml收集管中再一次離心1分鐘以移除殘留之洗滌緩衝液。將每一QIAQUICK®管柱放置於乾淨的1.5 ml微型離心管中。溶析DNA時，向QIAQUICK®膜中心添加33 μl水，並將管柱在14 000 RPM下離心1分鐘。限制性酶及相關緩衝液係自New England BioLabs獲得。例如，將約5 μl pET26b載體(100 ng/μl)、2 μl NE緩衝液2(New England Biolabs，1×NE緩衝液2：50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM二硫蘇糖醇，在25℃下pH為7.9)、1 μl NdeI(20 000個單位/ml)、1 μl HindIII(20 000個單位/ml)及11 μl去離子水混合，並在37℃下培育2小時以進行DNA消化。隨後，使用QIAQUICK® PCR純化套組(QIAGEN®)用上文所述之程序實施第二步驟之純化。
使用來自New England BioLabs之Quick T4 DNA連接酶及快速連接反應緩衝液實施連接。例如，將存於10 μl去離子水中之約10 ng載體及30 ng插入物與10 μl 2×快速連接反應緩衝液(New England Biolabs，132 mM Tris-HCl、20 mM MgCl2、2 mM二硫蘇糖醇、2 mM ATP、15%聚乙二醇，在25℃下pH為7.6)及1 μl Quick T4 DNA連接酶(New England Biolabs)混合。將酶促反應在室溫下培育5分鐘，隨後轉化。
為產生LVL315、LVL317、LVL318、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739及LVL740，製備以下組份之PCR製備品：40 μl去離子水、5 μl反應緩衝液10×、1 μl dNTPs混合物、1 μl引物1(10 μM)、1 μl引物2(10 μM)、1 μl模板(25 ng/μl)及1 μl 2.5個單位/μl之PfuUltra高保真度DNA聚合酶(QuikChange II定點誘變套組，Agilent Technologies，Stratagene Division)調配在一起。聚合酶鏈反應涉及1個循環之在95℃下變性30 sec，18個循環之在95℃下變性30 sec、在55℃下退火1 min及在68℃下引物延伸5 min 30 sec。將PCR產物在37℃下使用1 μl DpnI限制性酶消化1小時，隨後轉化。
用於擴增之PCR引物序列之詳細列示在表4中說明。
為產生pRIT16711，藉由PCR自NTHi菌株772之基因組 DNA擴增編碼SEQ ID NO.4之胺基酸22-160之PE基因片段(不包括編碼其對應分泌信號之序列)。基於所獲得之菌株Hi Rd序列(在那時，772序列尚未知)來設計擴增引物。5'引物序列與NTHi 772序列(序列如現在可獲得)相比含有1個突變，在PE編碼序列中在位置24上引入1個胺基酸差異，麩胺酸(E)代替離胺酸(K)。PCR擴增後，使用BamHI及XhoI限制位點將插入物選殖於pET-26(+)表現載體(NOVAGEN®)中。
為產生pRIT16671，自NTHi菌株86-028NP之基因組DNA擴增編碼PilA基因片段(SEQ ID NO.58之胺基酸40-149，SEQ ID NO.127)之DNA片段(不包括其前導肽以及所預測疏水α螺旋之一部分)，並選殖至pET15表現載體中。使用載體pRIT16790(含有來自NTHi菌株86-028NP之胺基酸40-149)作為模板來產生載體pRIT16671。藉由PCR使用載體pRIT16790及引物MDES PILA-3及MDES PILA-4來擴增PilA基因片段。使用NdeI/XhoI限制位點將PilA片段選殖至pET-26表現載體中。將編碼6個組胺酸(his)胺基酸之DNA序列納入5'引物中，以在PilA序列之N末端(MDES PILA-3)添加6個組胺酸(6×his)。
為產生LVL312(FlgI信號肽-E-PilA片段-GG-PE片段-GGHHHHHH)，使用pRIT16671載體作為模板使用引物CAN534及CAN537實施聚合酶鏈反應，以擴增PilA基因(胺基酸40-149/菌株86-028NP)。將對應於FlgI信號肽(sp)及麩胺酸(E)胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN534)中。為使 PilA序列連接至PE序列，將對應於兩個甘胺酸(GG)胺基酸連接體及N末端PE胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN537)中。使用pRIT16711載體作為模板使用引物CAN536及CAN538實施另一聚合酶鏈反應，以擴增PE基因(胺基酸18-160)。將對應於C末端PilA胺基酸及GG胺基酸之DNA序列納入5'引物中，以使pilA連接至PE序列(CAN536)。將對應於GG胺基酸連接體及6×his胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN538)中。最後，為產生LVL312，實施第三聚合酶鏈反應以擴增PilA及PE基因，以利用N末端之FlgI信號肽、介於FlgI與pilA之間之麩胺酸(E)胺基酸、介於PilA與PE序列之間之GG連接體及C末端之介於PE與6×his胺基酸之間之GG連接體融合。為達成此擴增，使用上文所述之兩個聚合酶鏈反應之產物作為模板且使用引物CAN534及CAN538。將對應於NdeI限制位點之DNA序列納入5'引物中，且將HindIII限制位點納入3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL291(PelB信號肽-PE片段-GG-PilA片段-GG-6×his)，使用pRIT16711載體作為模板，使用引物CAN544及CAN546實施聚合酶鏈反應，以擴增PE基因(胺基酸19-160)。將對應於pelB信號肽(sp)胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN544)中。為使PilA序列連接至PE序列，將對應於GG胺基酸連接體及N末端PilA胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN546)中。使用pRIT16671載體作為模板，使用引物CAN545及CAN535實施另一聚合酶鏈反應，以擴增PilA基 因(SEQ ID NO.58之胺基酸40-149，SEQ ID NO.127)。將對應於C末端PE胺基酸及GG胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN545)中，以使PilA序列連接至PE序列。將對應於連接體GG胺基酸及6×his胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN535)中。最後，為產生LVL291，實施第三聚合酶鏈反應，以擴增PE及PilA基因，以利用N末端之pelB信號肽、介於PE與PilA序列之間之GG連接體及介於PilA與C末端之6×his胺基酸之間之GG連接體融合。為達成此擴增，使用上文所述之兩個聚合酶鏈反應之產物作為模板且使用引物CAN544及CAN535。將對應於NdeI限制位點之DNA序列納入5'引物中，且將HindIII限制位點納入3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL268(pelB信號肽-D-PE片段-GG-PilA片段-GG-6×his)，使用pRIT16711載體作為模板，使用引物CAN547及CAN546實施聚合酶鏈反應，以擴增PE基因(胺基酸20-160)。將對應於pelB信號肽(sp)胺基酸及天冬胺酸(D)胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN547)中。為使PilA序列連接至PE序列，將對應於GG胺基酸連接體及N末端PilA胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN546)中。使用pRIT16671載體作為模板，使用CAN545及CAN535實施另一聚合酶鏈反應，以擴增PilA基因(胺基酸40-149/NTHi菌株86-028NP)。將對應於C末端PE胺基酸及GG胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN545)中，以使PilA序列連接至PE 序列。將對應於連接體GG胺基酸及6×his胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN535)中。最後，為產生LVL268，實施第三聚合酶鏈反應，以擴增PE及PilA基因，以利用N末端之pelB信號肽、介於pelB信號肽與PE之間之D胺基酸、介於PE與pilA序列之間之GG連接體及介於PilA與C末端之6×his胺基酸之間之GG連接體融合。為達成此擴增，使用上文所述之兩個聚合酶鏈反應之產物作為模板且使用引物CAN547及CAN535。將對應於NdeI限制位點之DNA序列納入5'引物中，且將HindIII限制位點納入3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL269(NadA信號肽-ATNDDD-PE片段-GG-PilA片段-GG-6×his)，使用pRIT16711載體作為模板使用引物CAN548及CAN546實施聚合酶鏈反應，以擴增PE基因(SEQ ID NO.4之胺基酸22-160)。將對應於pelB信號肽(sp)胺基酸及ATNDDD胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN548)中。為使PilA序列連接至PE序列，將對應於GG胺基酸連接體及N末端PilA胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN546)中。使用pRIT16671載體作為模板使用引物CAN545及CAN535實施另一聚合酶鏈反應，以擴增PilA基因(SEQ ID NO.58之胺基酸40-149，SEQ ID NO.127)。將對應於C末端PE胺基酸及GG胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN545)中，以使PilA序列連接至PE序列。將對應於連接體GG胺基酸及6×his胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN535)中。 最後，為產生LVL269，實施第三聚合酶鏈反應以擴增PE及PilA基因，以利用N末端之NadA信號肽、介於pelB信號肽與PE之間之ATNDDD胺基酸、介於PE與pilA序列之間之GG連接體及介於PilA與C末端之6×his胺基酸之間之GG連接體融合。為達成此擴增，使用上文所述之兩個聚合酶鏈反應之產物作為模板且使用引物CAN548及CAN535。將對應於NdeI限制位點之DNA序列納入5'引物中，且將HindIII限制位點納入3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL270(M-6×His-PE片段-GG-PilA片段)，使用pRIT16711載體作為模板使用引物CAN540及CAN542實施聚合酶鏈反應，以擴增PE基因(胺基酸17-160)。將對應於6×his胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN540)中。為使PilA序列連接至PE序列，將對應於GG胺基酸連接體及N末端PilA胺基酸之DNA序列納入3'引物(CAN542)中。使用pRIT16671載體作為模板使用引物CAN541及CAN543實施另一聚合酶鏈反應，以擴增PilA基因(胺基酸40-149/NTHi菌株86-028NP)。將對應於C末端PE胺基酸及GG胺基酸之DNA序列納入5'引物(CAN541)中，以使PilA連接至PE序列。最後，為產生LVL270，實施第三聚合酶鏈反應以擴增6-his-PE-GG-PilA基因以達成融合。為達成此擴增，使用上文所述之兩個聚合酶鏈反應之產物作為模板且使用引物CAN540及CAN543。將對應於NdeI限制位點之DNA序列納入5'引物中，且將HindIII限制位點納入3'引物中。隨後 將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL315(pelB信號肽-MD-PE片段-GG-PilA片段-GG-6×his)，使用LVL291作為模板使用引物CAN670及CAN671且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)實施定點誘變，以使N末端PE胺基酸序列自QIQ改變成MD。
為產生LVL317(pelB信號肽-PE片段-GG-pilA片段)，使用LVL291作為模板使用引物CAN678及CAN679且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)實施定點誘變，以在PilA基因與對應於GGHHHHHH胺基酸殘基(SEQ ID NO：3)之DNA序列之間納入終止密碼子。
為產生LVL318(pelB信號肽-MD-PE-GG-PilA)，使用LVL315作為模板使用引物CAN678及CAN679且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)實施定點誘變，以在PilA基因與對應於GGHHHHHH胺基酸殘基(SEQ ID NO：3)之DNA序列之間納入終止密碼子。
為產生LVL702(LVL291△Q)，使用LVL291載體作為模板使用引物CAN1517及CAN1518實施聚合酶鏈反應。將對應於LVL291序列上之位置23上之胺基酸Q的三個核苷酸之刪除納入5'引物。LVL702與LVL291間之唯一差異係LVL291序列上之位置23上之胺基酸Q的刪除。將NdeI及 HindIII限制位點分別納入5'及3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL735(LVL317△Q)，使用LVL317載體作為模板使用引物CAN1517及CAN1519實施聚合酶鏈反應。將對應於LVL317序列上之位置23上之胺基酸Q的三個核苷酸之刪除納入5'引物。LVL735與LVL317間之唯一差異係LVL317序列上之位置23上之胺基酸Q的刪除。將NdeI及HindIII限制位點分別納入5'及3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
為產生LVL736(LVL291+SA)，實施定點誘變以在LVL291序列上之胺基酸22與23之間添加胺基酸S及A。使用LVL291作為模板使用引物CAN1531及CAN1532且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)。
為產生LVL737(LVL291+A)，實施定點誘變以在LVL291序列上之胺基酸22與23之間添加胺基酸A。使用LVL291作為模板使用引物CAN1529及CAN1530且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)。
為產生LVL738(LVL291△QIQ)，實施定點誘變以刪除LVL291序列上之位置23至25上之胺基酸Q、I及Q。使用LVL291作為模板使用引物CAN1523及CAN1524且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)。
為產生LVL739(LVL291△QIQK)，實施定點誘變以刪除LVL291序列上之位置23至26上之胺基酸Q、I、Q及K。使用LVL291作為模板使用引物CAN1525及CAN1526且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)。
為產生LVL740(LVL291△QIQKA)，實施定點誘變以刪除LVL291序列上之位置23至27上之胺基酸Q、I、Q、K及A。使用LVL291作為模板使用引物CAN1527及CAN1528且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)。
為產生LVL778(LVL736△6×His標籤)、LVL779(LVL737△6×His標籤)、LVL780(LVL738△6×His標籤)、LVL781(LVL739△6×His標籤)及LVL782(LVL740△6×His標籤)，分別使用LVL736、LVL737、LVL738、LVL739及LVL740載體作為模板使用引物CAN1669及CAN543實施聚合酶鏈反應。6×His標籤之刪除對應於C末端序列之胺基酸序列GGHHHHHH(SEQ ID NO.3)。將此刪除納入3'引物。將NdeI及HindIII限制位點分別納入5'及3'引物中。隨後將所產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN®)中。
轉化
大腸桿菌(Escherichia coli)BLR(DE3)或大腸桿菌HMS(DE3)細胞係按照標準方法用經CaCl2處理之細胞使用質粒DNA來轉化。(Hanahan D.«Plasmid transformation by Simanis.»In Glover,D.M.(編輯)，DNA cloning.IRL Press London.(1985)：第109-135頁)。簡言之，將BLR(DE3)或HMS174(DE3)感受態細胞在冰上慢慢解凍。使用50-100 μl感受態細胞混合約4 μl質粒(10-100 ng)。隨後，將此調配物在冰上培育30 min。為實施轉化反應，將調配物在42℃下脈衝加熱45秒，隨後在冰上培育2分鐘。向經轉化細胞中添加約0.5 ml SOC培養基(含有分解代謝抑制物之超級最佳培養液(Super Optimal broth with Catabolite repression))，並將細胞培養物在37℃下培育1小時，隨後鋪板於含有50 μg/ml卡那黴素(kanamycin)之Luria-Bertani(LB)瓊脂上。鋪板約100 μl經轉化細胞培養物並在37℃下培育過夜。
BLR(DE3)：BLR係BL21(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)之recA -衍生物。用於表現重組蛋白質之此大腸桿菌菌株提高質粒單體產率，且可有助於穩定含有重複序列或其產物可引起DE3原噬菌體損失之靶質粒。(Studier,F.W.(1991)J.Mol.Biol.219：37-44)。大腸桿菌BLR(DE3)之詳細基因型已由NOVAGEN®公佈。(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm△(srl-recA)306：：Tn10(TetR)(DE3)。
HMS174(DE3)：HMS174菌株在K-12背景中提供recA突變。與BLR一樣，該等菌株可穩定某些產物可引起DE3原噬菌體損失之靶基因。大腸桿菌HMS174(DE3)之詳細基因型已由NOVAGEN®公佈。(F-recA1 hsdR(rK12-mK12+)(DE3)(Rif R)。
使用BLR(DE3)產生帶有His標籤之構建體及該等構建體之表徵闡述於實例3至實例6中 實例3：使用搖瓶實施蛋白質表現
通常，將接種經重組質粒轉化之大腸桿菌BLR(DE3)之一塊鋪滿瓊脂板剝離，再懸浮於培養基中並用於接種800 ml LB培養液(Becton,Dickinson and Company)±1%(重量/體積，w/v)葡萄糖(Laboratoire MAT，目錄號：GR-0101)及50 μg/ml卡那黴素(Sigma)，以獲得介於0.1與0.2之間的O.D.600nm。將培養物在37℃下於250 RPM攪動下培育，以達到約0.8之O.D.600nm。
隨後收集1 ml每一培養物，在14 000 RPM下離心5分鐘，並將上清液及沈澱物在-20℃下單獨冷凍。
在O.D.600nm約等於0.8時，將BLR(DE3)培養物冷卻(-20℃下20分鐘或4℃下1小時，較佳為4℃下1小時)，隨後藉由添加1 mM異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG；EMD Chemicals公司，目錄號：5815)並在250 RPM攪動下在16℃、22℃及30℃下培育過夜或在37℃下培育3小時(較佳為在22℃下培育過夜)來誘導重組蛋白質之表現。在誘導期後，將培養物在14 000 RPM下離心5分鐘或在6 000 RPM下離心15分鐘，並將上清液(培養基部分試樣)及沈澱物(含有可溶及不可溶部分)在-20℃下單獨冷凍。
使用該等條件來實施周質蛋白質表現。
實例4：使用搖瓶、細胞糊狀物、帶有His標籤之構建體來實施蛋白質純化
將在誘導後獲得之每一細菌沈澱物再懸浮於20 mM含有500 mM NaCl之4-(2-羥基乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液(pH 8.0)、10 mM咪唑及Roche COMPLETE®蛋白酶抑制劑混合液中(1個錠劑/50 ml含有500 mM NaCl之HEPES緩衝液，Roche COMPLETE® ULTRA錠劑，Roche Diagnostics公司)。
或者，可使用20-50 mM N,N-二羥乙基甘胺酸緩衝液來代替含有NaCl之HEPES緩衝液。例如，可使用20 mM N,N-二羥乙基甘胺酸緩衝液。使用Constant System 1.1 KW 2×30 000 PSI(磅/平方英吋)來裂解細菌。藉由在20 000 g下於4℃下離心20 min將可溶(上清液)及不可溶(沈澱物)組份分開。
帶有6-His標籤之蛋白質係在天然條件下利用固定金屬親和層析(IMAC)使用PROFINIATM蛋白質純化方案(Bio-Rad Laboratories公司)來純化。將可溶組份加載於5 ml His Trap管柱(Bio-Rad Laboratories公司)上，該管柱經用於細菌再懸浮之相同緩衝液預平衡；以至多5 ml/min添加可溶組份(產生「流通物部分」)。加載於管柱上之後，用10管柱體積之相同緩衝液以10 ml/min之速率洗滌管柱(產生「洗滌部分1」)。使用20 mM N,N-二羥乙基甘胺酸緩衝液或20 mM HEPES緩衝液(pH 8.0)(含有500 mM NaCl及20 mM咪唑)實施第二次洗滌，從而產生「洗滌部分2」。使用2管柱體積之20 mM HEPES緩衝液或50 mM N,N-二羥乙基甘胺酸緩衝液(pH 8.0)(含有500 mM NaCl及250 mM咪 唑)以10 ml/min之速率實施溶析，從而產生「溶析部分」。
為提高蛋白質之純度，集中來自IMAC之陽性溶析部分，並加載於尺寸排除層析(SEC)管柱(HILOADTM SUPERDEXTM 200 26/60，來自GE Healthcare)上，該管柱在不含鈣或鎂之磷酸鹽緩衝鹽水(NaCl 137 mM、KCl 2.7 mM、Na2HPO4 8.1 mM、KH2PO4 1.47 mM，pH 7.4)中預平衡。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析溶析部分試樣。使用Centricon 10 000 MW(Millipore)濃縮試樣。
使用分光計測定蛋白質濃度。
實例5：帶有His標籤之構建體之SDS-PAGE及西方墨點分析以及未帶有His標籤之LVL317及LVL318構建體之SDS-PAGE分析 可溶及不可溶部分製備
例如，將1 ml誘導後培養物(見例如上文實例3)在14 000 RPM下離心2 min。將沈澱物使用40 μl BUGBUSTER®蛋白質提取試劑(NOVAGEN®,EMD4 Biosciences,Merck)再溶解，從而產生細胞懸浮液。將細胞懸浮液在旋轉臺上在室溫下培育10 min。隨後將細胞懸浮液在14 000 RPM下離心2 min以分離可溶部分。將所得沈澱物(不可溶部分)使用70 μl去離子水、5 μl二硫蘇糖醇(DTT)1M及25 μl NUPAGE® LDS(十二烷基硫酸鋰)試樣緩衝液4×(INVITROGENTM)再溶解。將可溶部分(再溶解沈澱物之細胞懸浮液的上清液)添加至30 μl去離子水、5 μl DTT 1M及25 μl 4×LDS試樣緩 衝液中。
培養基部分製備
例如，製備培養基部分時，藉由添加500 μl RC試劑I(Bio-Rad Laboratories公司)將100 μl來自離心後經誘導全細胞培養物(見例如上文實例3)之上清液濃縮；混合試樣並在室溫下培育1 min。隨後，向試樣中添加500 μl試劑II(Bio-Rad Laboratories公司)並混合。將此調配物在14 000 RPM下離心10 min。將沈澱物使用28 μl去離子水、2 μl DTT 1M及10 μl 4×LDS SB再溶解。
純化部分製備
例如，藉由添加70 μl試樣、5 μl DTT 1M及25 μl 4×LDS試樣緩衝液來製備純化蛋白質(例如，如實例4中所述來獲得)，以用於SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE分析及轉移至硝化纖維素膜
按照製造商建議(Invitrogen)使用NUPAGE® Bis-Tris 4-12%凝膠來實施SDS-PAGE分析及轉移至硝化纖維素膜。在供應商建議之條件下實施試樣、緩衝液及遷移條件之準備。
在一個實例中，將凝膠加載20 μl來自包含70 μl純化蛋白質部分、5 μl DTT 1M及25 μl 4×LDS SB之預製混合液之試樣。
在NUPAGE® Bis-Tris 4-12%凝膠上分析試樣之後，將蛋白質轉移至硝化纖維素膜。
將硝化纖維素膜在37℃、60 RPM下使用3%奶/PBS 1×新 鮮溶液阻斷30分鐘。阻斷培育後，添加以1：1000稀釋於3%奶/PBS 1×新鮮溶液中之一級抗體(6×His標籤®抗體，Abcam PLC，目錄號：ab9108)，並在37℃、60 RPM下保持1小時。此後，將膜在室溫下使用0.02%聚山梨酯20(例如，TWEENTM 20)/PBS 1×洗滌三次，每次5分鐘。添加使用3%奶/PBS 1×新鮮溶液以1：14 000稀釋之二級抗體(鹼性磷酸酶(AP)兔抗IgG(H+L)兔，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)。將膜在37℃、60 RPM下培育1小時。此後，將膜在室溫下使用0.02%聚山梨酯20(例如，TWEENTM 20)/PBS 1×洗滌三次，每次5分鐘，隨後將膜暴露於5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍四唑(例如，BCIP®/NBT，來自Sigma-Aldrich®，1個錠劑/10 ml水)。
融合蛋白質構建體LVL291、LVL268及LVL269之經誘導細菌提取物之SDS-PAGE參見圖1。對於LVL291、LVL268及LVL269，在誘導(ind)之前及之後加載不可溶部分(I)、可溶部分(S)及培養基部分(M)。
與融合蛋白質構建體LVL291、LVL268及LVL269之純化提取物相關之SDS-PAGE及西方墨點參見圖2。對於LVL291、LVL268及LVL269之純化，加載流通物部分(Ft)、洗滌部分(W)及溶析部分(E)。使用抗his標籤來探測提取物。
融合蛋白質構建體LVL291及LVL315之經誘導細菌及純化提取物之SDS-PAGE參見圖3。對於LVL291及LVL315，加載培養基部分(M)、可溶部分(Sol)、不可溶部分(Ins)、 流通物部分(Ft)、洗滌部分1(W1)、洗滌部分2(W2)及溶析部分(E)。
融合蛋白質構建體LVL312之經誘導細菌及純化提取物之SDS-PAGE參見圖4。對於LVL312，加載培養基部分(M)、可溶部分(Sol)、不可溶部分(Ins)、流通物部分(Ft)、洗滌部分1(W1)、洗滌部分2(W2)及溶析部分(E)。
融合蛋白質構建體LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740及pET26b載體(陰性對照)之經誘導細菌提取物之可溶部分的SDS-PAGE參見圖25。(a)實驗1(b)實驗2(c)實驗3。PE-PilA融合蛋白質由箭頭指示。
來自實驗1、2及3之可溶部分中融合蛋白質之平均譜帶百分比參見圖26。
分別用於圖5及圖6中之SDS-PAGE分析之LVL317及LVL318細菌提取物通常係如上文所述來製備。
圖5.融合蛋白質構建體LVL317之經誘導(1 mM及10 μM IPTG)細菌提取物之SDS-PAGE。誘導之前(NI)及誘導之後(In)之提取物、可溶部分(S)、不可溶部分(I)。
圖6.融合蛋白質構建體LVL318之經誘導(1 mM及10 μM IPTG)細菌提取物之SDS-PAGE。誘導之前(NI)及誘導之後(In)之提取物、培養基部分(M)、可溶部分(S)、不可溶部分(I)。
將藉由SDS-PAGE分離之蛋白質轉移至Immobilon-P膜。剪下經考馬斯藍(Coomassie Blue)染色之蛋白質譜帶並置 於序列分析儀反應器中。按照製造商方案使用Applied Biosystems PROCISE®蛋白質序列分析儀(型號為494-cLC)來實施測序。
實例6：LVL291融合蛋白質表徵 LVL291之物理性質：LVL291中之PE及PilA之摺疊及熔點圓偏光二色性： 二級結構之分析
利用圓偏光二色性(CD)藉由量測由於結構不對稱而引起之左旋偏振光對右旋偏振光之吸收差異來測定蛋白質之二級結構組成。蛋白質呈現β-片層、α-螺旋抑或無規捲曲結構，遠UV區域(190-250 nm)中CD譜之形狀及強度不同。可藉由與參考譜進行比較來計算給定蛋白質試樣中各二級結構之相對豐度。
遠UV譜係使用0.01 cm之光程自178 nm至250 nm以1 nm解析度及帶寬在Jasco J-720分光偏振計上量測。藉由Peltier恒溫控制RTE-111單元塊將單元溫度維持在23℃。 量測期間維持10 L/min之氮氣流動。
結果：
所獲得之PE(來自構建體pRIT16762)、PilA(來自構建體pRIT 16790)及PE-PilA蛋白質之遠UV CD譜係含有α及β結構之混合物之摺疊蛋白質之特徵，但與PilA及PE-PilA相比，PE顯著富集α螺旋(圖7，PE、PilA及PE-PilA融合蛋白質之CD譜)。
計算不同譜，以評價一起結合於嵌合蛋白質中之後PE及PilA個別蛋白質之摺疊之完整性且隨後驗證二者間之可能相互作用。
˙當將PE及PilA遠UV譜組合時，所得譜與PE-PilA嵌合體之譜重合(圖8，PE及PilA CD譜之組合)。此結果表明，PE-PilA嵌合體含有在個別組份中所檢測到之所有二級結構。其亦表明，蛋白質之融合對個別組份之二級結構無較大影響，且因此，無論蛋白質係單獨的抑或融合的，PE及PilA之摺疊無顯著不同。
熔點評價：
為評價融合時之表現是否對個別蛋白質之熱力學性質具有影響，藉由利用圓偏光二色性監測α螺旋隨溫度之去摺疊來評價PE、PilA及PE-PilA之熔點。
α螺旋存在之特徵在於222 nm下之圓偏光二色性信號極低，因此溫度增加期間222 nm下之CD信號顯著增加指示蛋白質變性。測定蛋白質經歷二級結構損失之溫度使得能夠測定熔點(Tm)，其對應於一半蛋白質失去其結構之溫 度。
熔點可藉由鑒定自溫度對CD 222 nm圖獲得之熱變性曲線上的拐點來測定。
˙藉由遠UV CD所測定之PilA及PE之熔點分別為52℃及68℃(圖9，PilA熱變性曲線；圖10，PE熱變性曲線)。
˙PE-PilA融合蛋白質呈現兩個不同之Tm，即48℃及71℃(圖11，PE-PilA融合蛋白質之熱變性曲線)。該等值指示，PE及PilA蛋白質在結合成嵌合體後仍獨立地摺疊，且無論其係分離的抑或融合的，其在相近溫度下去摺疊。PilA部分在48℃下之去摺疊未引起沈澱或影響PE部分之Tm(71℃)的觀察結果強烈指示，融合體內PE與PilA間之相互作用極小，且其彼此間無較大之可觀察到之影響。蛋白質之熔點對多種外部條件敏感，包括緩衝液組成或相互作用分子之存在；PE與PilA融合後未觀察到較大變化強烈指示，PE及PilA結合在一起後，該二者之大部分結構及性質得以保持。
實例7：發酵方法
本發明之融合蛋白質可藉由熟習此項技術者所習知之方法來製備。
實例8：PE、PilA及LVL317之蛋白質純化 自pRIT16762之PE蛋白質純化：
為產生pRIT16762表現載體，使用BamHI及NcoI限制性酶來消化pRIT16711載體，以刪除介於信號序列(pelB)與 PE之間的6個胺基酸殘基。所獲得之載體稱為pRIT16712。在此載體中，在信號序列pelB與PE：MDP之間存在3個胺基酸。在第二步驟中，使用pRIT16712作為模板使用引物MnoNTHi-44及MnoNTHi-45(闡述於表4中)且使用QuikChange II定點誘變套組(Agilent Technologies,Stratagene Division)實施定點誘變，以使胺基酸序列自MDP改變成QIQ。
將含有PE QIQ(來自pRIT16762構建體)之大腸桿菌BLR(DE3)工作種子(working seed)自-80℃解凍，並用於製備100 ml存於LB培養液中之預培養物，該製備係藉由在37℃下於215 RPM下攪動下過夜培育來實施。過夜培育後，給8個含有800 ml LB APS之燒瓶接種12.5 ml預培養物，且量測OD600為約0.06。將培養物在37℃下在振盪下培育3h。OD600為約0.9時，添加1 mM IPTG以開始誘導。誘導期間，將培養物在22℃下在振盪下培育19h。誘導後，OD600為約2.2。將細胞培養物轉移至1 L離心袋中，置於1 L瓶內並在4℃下在6,000×g下離心30分鐘，並棄除上清液。保存1 ml誘導前及誘導後之培養物及上清液分液，以用於以後的分析。
經PE QIQ誘導之BLR(DE3)的裂解
將離心袋自離心瓶取出，打開，並將沈澱物自袋排放到燒杯中。將8份沈澱物聚集在一起，並再懸浮於100 ml結合緩衝液(20 mM Hepes、10 mM咪唑、500 mM NaCl，pH 8.01)中。用來自Constant Systems有限公司之TS Series Bench Top細胞破碎器(1×30 kPsi；1×15 kPsi)使含有PE QIQ構建體之大腸桿菌BLR(DE3)破碎。將裂解物在6000 RPM、4℃下離心30分鐘。保留上清液並加載於IMAC管柱上。
PE QIQ之IMAC純化
IMAC管柱(BioRad,Bio-Scale Mini Profinity IMAC筒柱5 ml)係用5CV之結合緩衝液(20 mM HEPES、10 mM咪唑、500 mM NaCl，pH 8.01)在5 ml/min下平衡。將100 ml裂解物上清液以2.5 mL/min加載於IMAC上。以50 ml流份收集流通物，以用於以後的分析。用3CV之結合緩衝液洗滌管柱以移除未結合之蛋白質。在一份15 ml分液中在50 ml管中收集含有未結合蛋白質之試樣。用2CV之洗滌緩衝液(20 mM HEPES、20 mM咪唑、500 mM NaCl，pH 8.01)洗滌管柱，以2 ml流份收集於96孔板中。隨後將結合之蛋白質用6CV之100%溶析緩衝液(20 mM HEPES、250 mM咪唑、500 mM NaCl，pH 8.01)溶析。將所溶析之蛋白質以2 ml流份收集於96孔板中。以5 ml/min實施洗滌及溶析。
PE QIQ之IMAC池之尺寸排除層析(SEC)
SEC管柱(GE healthcare,HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75製備級，60 cm高，約319 ml體積)係用3CV之SEC緩衝液(20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 8.49)平衡。將11 ml IMAC溶析物以2.5 ml/min之流速加載至管柱上。自0.3CV至0.9CV收集2 ml流份。實施兩次實驗，隨後藉由SDS-PAGE對各流份進行分析。將來自兩次實驗之含有Prot E蛋 白質之流份集中在一起(「SEC池」，總體積約為48 ml)。向SEC池中添加500 mM精胺酸。
上述SEC方案中所產生之PE QIQ集中試樣之定量
用來自Bio-Rad RC DCTM套組之RCDC(還原劑及去污劑相容(Reducing Agent and Detergent Compatible))方法遵循製造商方案來給SEC池定量： 對於每一測試試樣及標準品，將25 μL以一式兩份分配於微量離心機管中。向每一管中添加125 μL Bio-Rad RC試劑I；使每一管渦漩並在室溫下培育1分鐘。向每一管中添加125 μL Bio-Rad RC試劑II；使每一管渦漩，並隨後在14,000×g下離心5分鐘。藉由將該等管倒置在乾淨的吸附紗紙上從而使液體能夠完全自該等管排出來棄除上清液。向每一管中添加25.4 μL試劑A(之前藉由每1 ml試劑A混合20 μL試劑S來製備)；使每一管渦漩並在室溫下培育5分鐘，或直至沈澱完全溶解。使其渦漩，隨後進行下一步驟。向每一管中添加200 μL DC試劑B，並立即使其渦漩。在室溫下培育15分鐘。將所有試樣轉移至96孔板中，並在750 nm下讀取吸光度，以測定每一未知蛋白質試樣之蛋白質濃度。
ProtE濃度係1.069 mg/ml。
帶有His標籤之PilA蛋白質之純化： PilA係遵循以下通用程序來純化：
將含有編碼PilA或其片段之構建體的大腸桿菌細胞懸浮於BUGBUSTER®及BENZONASE®核酸酶(NOVAGEN®) (例如10 ml BUGBUSTER®及10 ul BENZONASE®核酸酶)中。將細胞裂解物在室溫下於旋轉臺上混合(例如)15分鐘。將細胞裂解物在4℃下於(例如)16,000 g下離心20分鐘。將含有蛋白質之上清液添加至含有Ni NTA HIS．BIND®樹脂之Ni NTA管柱中，並在4℃下混合(例如)1小時。該管柱可由2 ml Ni NTA HIS．BIND®樹脂(NOVAGEN®)及10 ml 1×結合緩衝液(來自NOVAGEN®之Ni-NTA緩衝液套組)組成。隨後收集管柱流通物。將樹脂用1×洗滌緩衝液洗滌兩次，該洗滌緩衝液含有(例如)300 mM NaCl、50 mM NaH2PO4、25 mM咪唑，pH為8.0。藉由重力流動來收集洗滌液。蛋白質係用1×溶析緩衝液(例如，300 mM NaCl、50 mM NaH2PO4、250 mM咪唑，pH 8.0)自管柱溶析。可藉由用結合緩衝液透析及如上文所述再次流過Ni NTA管柱對蛋白質實施進一步純化。
PilA之凝血酶裂解。
隨後將PilA與凝血酶(以1/50稀釋)在室溫下一起培育16 h，以移除組胺酸標籤。
經凝血酶裂解之PilA之尺寸排除層析(SEC)。
SEC管柱(GE healthcare,HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75製備級，60 cm高，約319 ml體積)係用5CV之SEC緩衝液(20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 8.52)平衡。將約10 ml經裂解PilA以2.5 ml/min之流速加載至管柱上。自0.3CV至0.9CV收集2 ml流份。實施兩次實驗，隨後藉由SDS-PAGE對各流份進行分析。將來自兩次實驗之含有經裂解 PilA之流份集中在一起(「SEC池」，總體積約為52 ml)。
PilA SEC池之定量。
該SEC池係用如上文所述之RCDC方法來定量。經裂解PilA之濃度係5.37 mg/ml。
用PBS 1×pH 7.4透析PilA SEC池(透析因子=1600)並藉由RCDC定量
藉由RCDC測定之透析後濃度係3.0 mg/ml。
LVL317之純化 滲透衝擊
由於LVL317融合蛋白質係在細菌周質中表現及加工，故藉由滲透衝擊來提取蛋白質。
將來自4 L發酵罐培養物之含有LVL317之冷凍(-20℃)所收穫大腸桿菌B2448細胞糊集中，並再懸浮於由24 mM Tris-HCl、16%(w/v)蔗糖、9.9%(w/v)葡萄糖、10 mM EDTA組成之高滲緩衝液(pH 8.0)中，直至最後體積為4L。將懸浮液在室溫下使用安裝於RW 16基礎攪拌器上之3-葉片推進器在中等速度下輕輕混合30 min。將懸浮液在室溫下在15,900×g下離心30分鐘。保留上清液(SN1)以用於凝膠分析。
將所得沈澱物再懸浮於高滲溶液(38 mM MgCl2)中，並在室溫下混合30 min。將混合物在室溫下在15,900×g下離心30分鐘，並在上清液(SN2)中回收抗原。
SN2之澄清係藉由以600 ml/min之流速過濾通過0.45/0.2 μm聚醚碸Sartorius Sartopore 2 MidiCap過濾器來實施。
用20 mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0)以1：3稀釋SN2，視需要將pH調節至7.0，且藉由以600 ml/min過濾通過0.45/0.2 μm聚醚碸Sartorius Sartopore 2 MidiCap過濾器來實施另一次澄清。
SP SEPHAROSE TM 快速流動(SP FF)層析
加載經稀釋/經過濾之SN2，並捕獲於存於14 cm ID(內徑)×20 cm長管柱(管柱體積為3100 ml)中之強陽離子交換樹脂(SP SEPHAROSETM FF-GE Healthcare)上，該管柱係用2CV之20 mM NaH2PO4/Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)平衡。用5CV之20 mM NaH2PO4/Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)洗滌管柱後，藉由將相同洗滌緩衝液中之NaCl之濃度增加至高達100 mM使抗原(含於LVL317內)溶析。
典型SP SEPHAROSETM快速流動層析圖見圖12。
Q SEPHAROSE TM 快速流動(Q FF)層析
將存在於SP FF溶析物中之抗原用20 mM Tris pH 8.5以1：4進行稀釋，視需要將pH調節至8.5，並通過存於14 cm ID×11.8 cm長管柱(管柱體積為1800 ml)中之強陰離子交換樹脂(Q SEPHAROSETM FF-GE Healthcare)，該管柱係用2CV之20 mM Tris緩衝液(pH 8.5)平衡。在流通物部分中回收抗原。
典型Q SEPHAROSETM快速流動層析圖見圖13。
濃縮、透濾、聚山梨酯80添加及無菌過濾
將含有抗原之Q FF流通物基於層析圖UV濃縮至高達0.7-0.8 mg/ml，並用5DV之10 mM KH2PO4/K2HPO4緩衝液(pH 6.5)使用Pellicon-2TM 10 kDa截止膜(Millipore)透濾。
使用5%原液將聚山梨酯80(例如，TWEENTM 80)添加至超濾滲餘物中，並在4℃下用磁力攪拌器在130 rpm下攪動30分鐘。聚山梨酯80之最終濃度係0.04%。藉由過濾通過0.45/0.2 μm乙酸纖維素膜(Sartobran 300,Sartorius)將超濾滲餘物滅菌。將經純化本體儲存在-20℃或-80℃下。藉由AAA(胺基酸分析)量測之絕對蛋白質濃度係0.737 mg/ml。
實例9：聚山梨酯80之用途
滴定實驗指示，在無菌過濾之前向經純化本體中添加聚山梨酯80(具體而言，TWEENTM 80)至0.04%(w/v)之最終濃度會減少絲狀顆粒形成及聚集。
根據DSC分析，TWEENTM 80降低在冷凍/解凍循環後在-20℃下儲存後及在4℃、-20℃及-80℃及37℃下儲存4天後所見到之結構變化程度(30-45℃)。
實例10：LVL317之SDS-PAGE及西方墨點分析 SDS-PAGE及西方墨點分析：
如下文所述加載NUPAGE® Bis-Tris 4-12%凝膠與10 μg存於含有50 mM DTT並在95℃下加熱5 min之NUPAGE® LDS試樣緩衝液中之試樣(對於具有低濃度之試樣，加載20 μL試樣)。遷移：在200伏特下在室溫(RT)下在NUPAGE® MES運行緩衝液中35分鐘。在速溶藍色(Instant blue)(Novexin目錄號為ISB01L)中凝膠染色2小時，並在水中去染色過夜。
泳道內容物：
1：MW標準品(10 μL) 2：開始(總部分)(10 μg)
3：SN1未經過濾(10 μg) 4：SN2未經過濾(10 μg)
5：未經提取(10 μg) 6：加載SP FF(10 μg)
7：流通物SP FF(6.9 μg) 8：洗滌SP FF(20 μL)
9：溶析SP FF(10 μg) 10：剝離SP FF(10 μg)
11：加載Q FF(8.9 μg) 12：溶析Q FF(9.8 μg)
13：剝離Q FF(4.8 μg)
14：摻入0.04% TWEENTM 80之前之TFF滲餘物(10 μg)
15：經純化本體未經過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
16：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
17：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(20 μg+摻入的大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg))
18：大腸桿菌細胞裂解物Rix(2 μg)
19：大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg)
20：大腸桿菌細胞裂解物Rix(0.5 μg)
來自PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的SDS-PAGE見圖14。
對於西方墨點，將蛋白質在4℃下在30伏特下於NUPAGE®轉移緩衝液+20%甲醇、0.1% SDS中過夜轉移於硝化纖維素膜上。將膜用50 mM Tris、150 mM NaCl pH 7.4+5%無脂肪奶粉阻斷1小時，在稀釋於阻斷緩衝液中之兔多株一級抗體(抗Prot-E 1/50 000及抗大腸桿菌(BLR)1/1 000)中 培育2小時，在50 mM Tris pH 7.4+0.05% Tween 20中洗滌3×5分鐘，在二級抗體(偶聯至鹼性磷酸酶之山羊抗兔抗體，以1/5000稀釋於阻斷緩衝液中)中培育1小時，在洗滌緩衝液中洗滌3×5分鐘，並在BCIP/NBT受質(每10 ml 1個錠劑)中顯影。所有培育均係以每一膜25 ml實施。
PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的西方墨點見圖15。使用兔多株抗PE實施墨點分析。
泳道內容物：
1：MW標準品(10 μL) 2：開始(總部分)(10 μg)
3：SN1未經過濾(10 μg) 4：SN2未經過濾(10 μg)
5：未經提取(10 μg) 6：加載SP FF(10 μg)
7：流通物SP FF(6.9 μg) 8：洗滌SP FF(20 μL)
9：溶析SP FF(10 μg) 10：剝離SP FF(10 μg)
11：加載Q FF(8.9 μg) 12：溶析Q FF(9.8 μg)
13：剝離Q FF(4.8 μg)
14：摻入0.04% TWEENTM 80之前之TFF滲餘物(10 μg)
15：經純化本體未經過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
16：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
17：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80
(20 μg+摻入的大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg))
18：大腸桿菌細胞裂解物Rix(2 μg)
19：大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg)
20：大腸桿菌細胞裂解物Rix(0.5 μg)
PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的西方墨點見圖16。使用兔多株抗大腸桿菌(BLR)實施墨點分析。
泳道內容物：
1：MW標準品(10 μL) 2：開始(總部分)(10 μg)
3：SN1未經過濾(10 μg) 4：SN2未經過濾(10 μg)
5：未經提取(10 μg) 6：加載SP FF(10 μg)
7：流通物SP FF(6.9 μg) 8：洗滌SP FF(20 μL)
9：溶析SP FF(10 μg) 10：剝離SP FF(10 μg)
11：加載Q FF(8.9 μg) 12：溶析Q FF(9.8 μg)
13：剝離Q FF(4.8 μg)
14：摻入0.04% TWEENTM 80之前之TFF滲餘物(10 μg)
15：經純化本體未經過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
16：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80(10 μg)
17：經純化本體，經無菌過濾，摻入0.04% TWEENTM 80
(20 μg+摻入的大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg))
18：大腸桿菌細胞裂解物Rix(2 μg)
19：大腸桿菌細胞裂解物Rix(1 μg)
20：大腸桿菌細胞裂解物Rix(0.5 μg)
SDS-PAGE及西方墨點圖注解：PE-PilA融合蛋白質以30 kDa遷移。藉由滲透衝擊之提取在細菌周質中提取表現及加工之融合蛋白質，並減少來自細菌之污染。在高滲處理 期間會有少量融合蛋白質損失(泳道3)。小部分未藉由高滲處理提取出來，且仍然與細胞結合(泳道5)。在SP FF流通物(泳道7)中及在兩個管柱之剝離部分(泳道10及13)中會有少量損失。由於剝離部分之總體積較小，故融合蛋白質之損失不明顯。在剝離部分中可以看到遞降譜帶，但在最終產物中看不到。在經純化本體中無明顯的來自大腸桿菌宿主細胞蛋白質之污染(泳道16)。
對LVL735及LVL778之分析獲得與LVL317類似之性質。
實例11：PE、PilA及LVL317之熔點數據
將未帶His標籤之PE-PilA融合蛋白質(LVL317)之熱轉變與如上文所述經純化之帶有his標籤之PE(如實例8中所述)及經裂解PilA(如實例8中所述)蛋白質之熱轉變進行比較。
在DSC之前，將PE及PilA在10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 6.5+0.04% Tween 80(1：250之試樣：緩衝液體積比)中透析過夜，以使其存於與融合蛋白質相同之緩衝液中。透析後，藉由BCA量測蛋白質濃度，並調節至300 μg/ml(PE)及500 μg/ml(PilA)。
在來自MicroCal,LLC(GE Healthcare之一個部門)之VPTM-DSC上實施分析。使用最終的透析緩衝液作為參考並自掃描減除。DSC掃描速率係90℃/hr。為評價量測調配後最終容器(FC)中熱轉變之能力，將融合蛋白質稀釋至FC濃度(60 μg/ml)。最終容器數據未顯示。
結果：
PE-PilA融合蛋白質及PE及PilA蛋白質之熱轉變見圖17。曲線：PilA(1)，蛋白質E(Prot E，PE)(2)，PE-PilA PB未經稀釋，737 μg/ml(3)，及PE-PilA PB稀釋至FC濃度60 μg/ml(4)。
對於經純化融合蛋白質(LVL317)，檢測到兩種轉變(曲線3及4)。
PE-PilA融合蛋白質之Tm1(53.7℃)與PilA轉變(53℃)類似。
與PE轉變(63℃)相比，PE-PilA之Tm2明顯變化(66.1℃)。兩種結構域之融合似乎會使PE片段穩定。
經稀釋融合蛋白質與未經稀釋者相比Tm2之此偏移係由急劇下降斜坡引起之濃度假像，此係濃度依賴性聚集之典型特徵。
LVL735及LVL778之抗原摺疊分析與LVL317類似。
實例12：Balb/c小鼠中PE-PilA融合蛋白質構建體LVL291之抗PilA免疫原性反應。
在Balb/c小鼠中評價針對調配於AS03A中之經純化LVL291 PE-PilA融合蛋白質(不含異源信號肽之LVL291融 合蛋白質)的免疫反應。在第0、14及28天藉由肌內途徑用10 μg PE(來自載體pRIT16762)、PilA(來自載體pRIT16790)或PE-PilA(每一者均調配於AS03A中)使動物(20只小鼠/群組)免疫。對照群組僅接種AS03A。在第42天採集之個別血清中測定針對每一抗原之抗體反應。使用陰性對照時未獲得抗體反應。如圖18中所示，與用單價PilA免疫之小鼠中之抗體反應相比，用PE-PilA融合物免疫之小鼠中之針對PilA的抗體反應較強。用融合蛋白質免疫之小鼠與用單價PE免疫之小鼠中的針對PE的抗體反應類似。GMT=幾何平均效價。收集數據，並用在WINDOWS®(Microsoft)下運行之SOFTMAX® Pro軟體(Molecular Devices)進行分析；使用四參數邏輯對數函數來計算標準曲線。四參數邏輯對數函數以高精確度描述參考血清之曲線，當以光密度-對-濃度(log)比例描繪時展示明顯的S形。藉由標準曲線內插來計算每一小鼠血清試樣稀釋度下之抗體濃度。品質對照血清及未知血清試樣中之抗體係藉由取位於參考稀釋曲線之工作範圍(10-80%)內之所有稀釋之值的平均值來獲得。
結果顯示於圖18中，其圖示Balb/c小鼠模型中對LVL291 PE-PilA融合蛋白質及對單價PE及PilA之抗體反應。
實例13：鼠類鼻咽定殖模型.用PE-PilA免疫.用NTHi菌株86-028NP及NTHi菌株3224A攻毒。
Balb/c雌性小鼠(20只/群組)係在第0及14天用6 μg與LT(大腸桿菌之熱不穩定毒素)調配在一起之經純化PE-PilA融合蛋白質(LVL291，用86-028NP攻毒；LVL317，用菌株 3224A攻毒)且在第28天用存於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之經純化PE-PilA融合蛋白質經鼻內免疫。對照小鼠(20只/群組)僅接種LT。隨後用5×106個CFU(菌落形成單位)之同源NTHi菌株86-028NP及異源NTHi菌株3224A經鼻內對小鼠攻毒。同源性及異源性係藉由參考用以使小鼠免疫之NTHi菌株來確定。計數在攻毒後第1天及第2天取出之鼻腔內容物中的細菌菌落。D1=第1天。D2=第2天。
PE-PilA接種使得攻毒後第1天及第2天鼻咽中NTHi菌株86-028NP及菌株3224A之清除增加。
用NTHi菌株86-028NP實施實驗時：使用計數之log10值作為反應、以群組(4個層面)及天數(2個層面)為固定因子來實施2因子固定ANOVA。排除方差非齊性假定，並將非齊性方差模型擬合至數據。兩個因子之間未檢測到明顯相互作用。與對照群組(LT)相比，融合PE-PilA群組(每只小鼠6 μg)明顯減少CFU；幾何平均比等於0.06，95%置信區間為0.01,0.25。
用NTHi菌株3224A實施實驗時：使用log10值作為反應、以群組、天數及實驗為固定因子來實施3因子固定ANOVA。Shapiro-Wilk及Levene檢驗不排除正態及方差齊性假定。在任兩個因子之間或在三個因子之間未檢測到明顯的相互作用，且在分析中僅保留主要因子。與對照群組相比，PE-PilA/LT顯著減少CFU；幾何平均比等於0.11，95%置信區間為0.02,0.61。
PE-PilA融合蛋白質接種對小鼠鼻咽中NTHi菌株86- 028NP細菌清除之影響見圖19。
PE-PilA融合蛋白質接種對小鼠鼻咽中NTHi菌株3224A細菌清除之影響見圖20。
實例14：鼠類鼻咽定殖模型。用PilA免疫。用NTHi菌株3219C攻毒。
雌性OF1小鼠(20只小鼠/群組)係在第0及14天用3 μg用LT調配之PilA(來自載體16790)且在第28天用3 μg存於PBS中之PilA經鼻內免疫。對照小鼠僅接種LT。隨後用5×106個CFU之NTHi菌株3219C經鼻內對小鼠攻毒。計數在攻毒後第3天及第4天取出之鼻腔內容物中的細菌菌落。D3=第3天。D4=第4天。
PilA接種對小鼠鼻咽中細菌清除之影響見圖21。
實例15：鼠類鼻咽定殖模型。用PE免疫。用NTHi菌株3224A攻毒。
Balb/c雌性小鼠(20只小鼠/群組)係在第0及14天用3 μg用LT調配之PE(來自載體pRIT16762)且在第28天用3 μg存於PBS中之PE經鼻內免疫。對照小鼠僅接種LT。隨後用5×106個CFU之NTHi菌株3224A經鼻內對小鼠攻毒。計數在攻毒後第3天及第4天取出之鼻腔內容物中的細菌菌落。在第3天(D3)檢查10只小鼠。在第4天(D4)檢查10只小鼠。使用用於統計學分析之Dunn檢驗，PE接種使得攻毒後第4天鼻咽中NTHi之清除顯著增加(圖22)。
PE接種對小鼠鼻咽中細菌清除之影響見圖22。
實例16：玻連蛋白結合。LVL317及LVL735 PE-PilA融合 蛋白質對玻連蛋白結合之抑制。
評價經純化LVL317 PE-PilA融合蛋白質構建體中之PE結合玻連蛋白的能力。將微量滴定板(POLYSORPTM,Nunc,Thermo Fisher Scientific)塗覆PE(來自載體pRIT16762)或經純化LVL317 PE-PilA融合蛋白質(10 μg/ml)。將板用150 mM NaCl-0.05%聚山梨酯20(例如，TWEENTM 20)洗滌四次，並用1% PBS-BSA阻斷1至2小時。洗滌四次後，添加玻連蛋白(玻連蛋白來自人類血漿，SIGMA-ALDRICH®)(10 μg/ml)，兩倍稀釋(12次稀釋)，並將該等板在室溫下培育1h。隨後將該等板用150 mM NaCl-0.05%聚山梨酯20(例如，TWEENTM 20)洗滌四次。洗滌後，使用過氧化物酶綿羊抗人類玻連蛋白(US Biological)檢測結合之玻連蛋白，隨後添加鄰苯二胺/H2O2受質。顯色與固定至玻連蛋白之抗體的量成正比。
見圖23：(a)結合至玻連蛋白之LVL317 PE-PilA融合蛋白質。PilA=來自NTHi菌株86-028NP之PilA(如對於pRIT16790所述)；PE=蛋白質E(如對於pRIT16762所述)；及(b)結合至玻連蛋白之LVL317及LVL735 PE-PilA融合蛋白質。
實例17：玻連蛋白結合。抗LVL291 PE-PilA融合蛋白質抗體對玻連蛋白結合之抑制。
將微量滴定板(POLYSORPTM,Nunc,Thermo Fisher Scientific)塗覆PE(來自載體pRIT16762)或經純化PE-PilA融合蛋白質(10 μg/ml)。將板用150 mM NaCl-0.05%聚山梨 酯20(例如，TWEENTM 20)洗滌四次，並用1% PBS-BSA阻斷1至2小時。洗滌後，添加50 μg/ml玻連蛋白(玻連蛋白來自人類血漿，SIGMA-ALDRICH®)，並將經純化抗體抗PE-PilA(在本實驗室內部產生及純化)兩倍連續稀釋，並在室溫下培育1 h。隨後將該等板用150 mM NaCl-0.05%聚山梨酯20(例如，TWEENTM 20)洗滌四次。洗滌四次後，使用過氧化物酶綿羊抗人類玻連蛋白(US Biological)檢測結合之玻連蛋白，隨後添加鄰苯二胺/H2O2受質。顯色與固定至玻連蛋白之抗體的量成正比。
觀察到抗PE-PilA多株抗體抑制玻連蛋白結合至PE。
抗PE-PilA融合蛋白質多株抗體對玻連蛋白結合之抑制見圖24。
實例18：LVL291 PE-PilA融合蛋白質之抗原性ELISA。
在抗原性測試中以單價蛋白質作為對照來驗證經純化LVL291 PE-PilA融合蛋白質。在夾心式ELISA中測試融合蛋白質，該ELISA係以針對編碼SEQ ID NO：4之胺基酸22至160的PE基因片段(如對於pRIT16711所述)或針對NTHi菌株86-028NP之PilA(來自載體pRIT16790)產生之多株抗體(兔及天竺鼠)研發。
添加100 ng/ml PilA或PE，並連續兩倍稀釋。培育30分鐘並洗滌後，藉由在用PE或PilA免疫後獲得之兔多株血清來檢測結合之抗原。使用過氧化物酶抗兔Ig(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)來檢測結合之抗體，隨後添加鄰苯二胺/H2O2受質。顯色與所存在抗原的量成正 比。使用用於微量滴定板之分光光度計來量測吸光度讀數。試樣之抗原性係藉由與全長PE或全長PilA參考抗原之曲線進行比較來測定，且以μg/ml表示。參考代表100%抗原性。
如在表6中所觀察到：與單價PE及PilA抗原相比，使用經純化LVL291 PE-PilA融合蛋白質時觀察到抗原性。
實例19：LVL735 PE-PilA融合蛋白質之免疫原性。
雌性Balb/c小鼠(n=34)係在第0、14及28天用50 μl疫苗調配物藉由肌內途徑免疫，該疫苗調配物含有1 μg、0.2 μg或0.04 μg調配在AS01E或AlPO4(磷酸鋁)內之PE-PilA融合蛋白質LVL317或LVL735。在第42天採集之個別血清中測定對PE及PilA之抗體反應，並量測對PE及PilA之IgG含量，且以μg/ml表示。
LVL317及LVL735之PE及PilA抗體反應見圖27。GMC= 幾何平均濃度。GMT=幾何平均效價。IC=置信區間。
實例20：在小鼠無法分型之流感嗜血桿菌鼻咽定殖模型中LVL735及LVL317融合蛋白質之保護功效。
雌性Balb/c小鼠係在第0及14天用10 μl含有5.8 μg LVL735或LVL317與0.5 μg大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)之混合物之疫苗調配物經鼻內免疫接種。在第28天投與5.8 μg不含佐劑之LVL735或LVL317加強劑量。對照小鼠僅在第0及14天接種LT及在第28天接種PBS。在第42天，用5×106個cfu之NTHi 3224A菌株經鼻內對動物攻毒。計算攻毒後第1天及第2天取出之鼻腔內容物中的細菌菌落數(n=10/時間點)。將鼻腔內容物在培養基中均質化，並實施細菌定量。結果係以CFU/ml表示。
LVL735及LVL317接種對小鼠無法分型之流感嗜血桿菌鼻咽定殖模型中之細菌清除的影響見圖28。
圖1.融合蛋白質構建體LVL291、LVL268及LVL269之經誘導細菌提取物之SDS-PAGE。對於LVL291、LVL268及LVL269，在誘導(ind)之前及之後加載不可溶部分(I)、可溶部分(S)及培養基部分(M)。
圖2.融合蛋白質構建體LVL291、LVL268及LVL269之與純化提取物相關之SDS-PAGE及西方墨點。對於LVL291、LVL268及LVL269之純化，加載流通物部分(Ft)、洗滌部分(W)及溶析部分(E)。使用抗his標籤來探測提取物。
圖3.融合蛋白質構建體LVL291及LVL315之經誘導細菌 及純化提取物的SDS-PAGE。對於LVL291及LVL315，加載培養基部分(M)、可溶部分(Sol)、不可溶部分(Ins)、流通物部分(Ft)、洗滌部分1(W1)、洗滌部分2(W2)及溶析部分(E)。
圖4.融合蛋白質構建體LVL312之經誘導細菌及純化提取物的SDS-PAGE。對於LVL312，加載培養基部分(M)、可溶部分(Sol)、不可溶部分(Ins)、流通物部分(Ft)、洗滌部分1(W1)、洗滌部分2(W2)及溶析部分(E)。
圖5.融合蛋白質構建體LVL317之經誘導(1 mM及10 μM IPTG)細菌提取物之SDS-PAGE。誘導之前(NI)及誘導之後(In)之提取物、可溶部分(S)、不可溶部分(I)。
圖6.融合蛋白質構建體LVL318之經誘導(1 mM及10 μMIPTG)細菌提取物之SDS-PAGE。誘導之前(NI)及誘導之後(In)之提取物、培養基部分(M)、可溶部分(S)、不可溶部分(I)。
圖7. PE、PilA及PE-PilA融合蛋白質之CD譜。
圖8. PE與PilA CD譜之組合。
圖9. PilA熱變性曲線。
圖10. PE變性曲線。
圖11. PE-PilA融合蛋白質熱變性曲線。
圖12.典型SP SepharoseTM快速流動層析圖。
圖13.典型Q SepharoseTM快速流動層析圖。
圖14.來自PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的SDS-PAGE。
圖15. PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的西方墨點。使用兔多株抗PE實施墨點分析。
圖16. PE-PilA融合蛋白質之純化過程之過程中試樣的西方墨點。使用兔多株抗大腸桿菌(BLR)實施墨點分析。
圖17. PE-PilA融合蛋白質及PE及PilA蛋白質之熱轉變。 曲線：PilA(1)，蛋白質E(Prot E，PE)(2)，PE-PilA經純化本體未經稀釋，737 μg/ml(3)，及PE-PilA經純化本體稀釋至最終容器濃度60 μg/ml(4)。
圖18. Balb/c小鼠模型中對LVL291 PE-PilA融合蛋白質及對單價PE及PilA之抗體反應。
圖19. PE-PilA融合蛋白質接種對小鼠鼻咽中NTHi菌株86-028NP細菌清除之影響。
圖20. PE-PilA融合蛋白質接種對小鼠鼻咽中NTHi菌株3224A細菌清除之影響。
圖21. PilA接種對小鼠鼻咽中細菌清除之影響。
圖22. PE接種對小鼠鼻咽中細菌清除之影響。
圖23.(a)結合至玻連蛋白之LVL317 PE-PilA融合蛋白質；及(b)結合至玻連蛋白之LVL317及LVL735 PE-PilA融合蛋白質。
圖24.抗PE-PilA融合蛋白質多株抗體對玻連蛋白結合之抑制。
圖25.融合蛋白質構建體LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740及pET26b載體(陰性對照)之經誘導細菌提取物之可溶部分的SDS-PAGE。(a)實 驗1(b)實驗2(c)實驗3。PE-PilA融合蛋白質由箭頭指示。
圖26.來自實驗1、2及3之可溶部分中融合蛋白質之平均譜帶百分比。
圖27. LVL317及LVL735之PE及PilA抗體反應。
圖28. LVL735及LVL317接種對小鼠無法分型之流感嗜血桿菌鼻咽定殖模型中細菌清除之影響。
<110> 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL269
<400> 141
<210> 142
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL269
<400> 142
<210> 143
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL270
<400> 143
<210> 144
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL270
<400> 144
<210> 145
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL315
<400> 145
<210> 146
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL315
<400> 146
<210> 147
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL317
<400> 147
<210> 148
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL317
<400> 148
<210> 149
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL318
<400> 149
<210> 150
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL318
<400> 150
<210> 151
<211> 483
<212> DNA
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 151
<210> 152
<211> 160
<212> PRT
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 152
<210> 153
<211> 480
<212> DNA
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 153
<210> 154
<211> 160
<212> PRT
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 154
<210> 155
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 155
<210> 156
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 156
<210> 157
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 157
<210> 158
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 158
<210> 159
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 159
<210> 160
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 160
<210> 161
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 161
<210> 162
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 162
<210> 163
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 163
<210> 164
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 164
<210> 165
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 165
<210> 166
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 166
<210> 167
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 167
<210> 168
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 168
<210> 169
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 169
<210> 170
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 170
<210> 171
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 171
<210> 172
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 172
<210> 173
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 173
<210> 174
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 174
<210> 175
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 175
<210> 176
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 176
<210> 177
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白質
<400> 177
<210> 178
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 178
<210> 179
<211> 138
<212> PRT
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 179
<210> 180
<211> 137
<212> PRT
<213> 流感嗜血桿菌
<400> 180
<210> 181
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL702
<400> 181
<210> 182
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL702
<400> 182
<210> 183
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL736
<400> 183
<210> 184
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL736
<400> 184
<210> 185
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL737
<400> 185
<210> 186
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL737
<400> 186
<210> 187
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL738
<400> 187
<210> 188
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL738
<400> 188
<210> 189
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL739
<400> 189
<210> 190
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL739
<400> 190
<210> 191
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL740
<400> 191
<210> 192
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL740
<400> 192
<210> 193
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL735
<400> 193
<210> 194
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL735
<400> 194
<210> 195
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL778
<400> 195
<210> 196
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL778
<400> 196
<210> 197
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL779
<400> 197
<210> 198
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL779
<400> 198
<210> 199
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL780
<400> 199
<210> 200
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL780
<400> 200
<210> 201
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL781
<400> 201
<210> 202
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL781
<400> 202
<210> 203
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL782
<400> 203
<210> 204
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LVL782
<400> 204
<210> 205
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 205
<210> 206
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 206
<210> 207
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 207
<210> 208
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 208
<210> 209
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 209
<210> 210
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 210
<210> 211
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 211
<210> 212
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 212
<210> 213
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 213
<210> 214
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 214
<210> 215
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 215
<210> 216
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 216
<210> 217
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 217
<210> 218
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 218
<210> 219
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白質
<400> 219

Claims (50)

  1. 一種式I之融合蛋白質，(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (式I)其中：X係信號肽或MHHHHHH(SEQ ID NO.2)；m係0或1；R1係胺基酸；n係0、1、2、3、4、5或6；A係來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)之蛋白質E或其免疫原性片段、或來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段；Y係選自由下列組成之群：GG、SG、SS、GGG及(G)h，其中h係4、5、6、7、8、9或10；o係0或1；B係來自流感嗜血桿菌之PilA或其免疫原性片段、或來自流感嗜血桿菌之蛋白質E或其免疫原性片段；Z係GGHHHHHH(SEQ ID NO.3)；且p係0或1。
  2. 如請求項1之融合蛋白質，其中X係選自由FlgI、NadA及pelB組成之群。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中m係0。
  4. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中n係0。
  5. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E係選自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.57中之任一者。
  6. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中A係如SEQ ID NO：124中所述之來自流感嗜血桿菌之蛋白質E之免疫原性片段。
  7. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中Y係GG。
  8. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中B係PilA之免疫原性片段，其中PilA係選自SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121中之任一者。
  9. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中B係如SEQ ID NO：127中所述之來自流感嗜血桿菌之PilA之免疫原性片段。
  10. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中A係蛋白質E之免疫原性片段，其中蛋白質E係選自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.57中之任一者，且其中B係PilA之免疫原性片段，其中PilA係選自SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.121中之任一者。
  11. 如請求項10之融合蛋白質，其係用於治療或預防中耳炎。
  12. 如請求項10之融合蛋白質，其係用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
  13. 如請求項10之融合蛋白質，其係用於治療或預防肺炎。
  14. 如請求項10之融合蛋白質，其係用於治療或預防流感嗜血桿菌感染或疾病。
  15. 如請求項14之融合蛋白質，其係用於治療或預防NTHi感染或疾病。
  16. 一種融合蛋白質，其係選自由下列組成之群：SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.146、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.182、SEQ ID NO.184、SEQ ID NO.186、SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.190、SEQ ID NO.192、SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.196、SEQ ID NO.198、SEQ ID NO.200、SEQ ID NO.202及SEQ ID NO.204。
  17. 一種融合蛋白質，其與以下序列中之任一者大約95%一致：SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.146、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.182、SEQ ID NO.184、SEQ ID NO.186、SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.190、SEQ ID NO.192、SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.196、SEQ ID NO.198、SEQ ID NO.200、SEQ ID NO.202或SEQ ID NO.204。
  18. 如請求項16或17之融合蛋白質，其中信號肽已經移除。
  19. 一種SEQ ID NO.148之融合蛋白質，其中信號肽已經移除，該融合蛋白質具有SEQ ID NO.177(QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ)。
  20. 一種SEQ ID NO.194之融合蛋白質，其中信號肽已經移除，該融合蛋白質具有SEQ ID NO.219(IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ)。
  21. 一種免疫原性組合物，其包含來自流感嗜血桿菌之蛋白質E及來自流感嗜血桿菌之PilA。
  22. 如請求項21之免疫原性組合物，其中蛋白質E係SEQ ID NO.4之多肽、包含在整個長度上與SEQ ID NO.4至少75%、77%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%一致之序列的多肽，或者係包含SEQ ID NO.4之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段的多肽。
  23. 如請求項22之免疫原性組合物，其中該免疫原性片段包含SEQ ID NO：4之B及/或T細胞表位。
  24. 如請求項21至23中任一項之免疫原性組合物，其中蛋白質E能夠引發識別SEQ ID NO.4之免疫反應。
  25. 如請求項21至23中任一項之免疫原性組合物，其中PilA 係SEQ ID NO.58之多肽、包含在整個長度上與SEQ ID NO.58至少80%、85%、90%、95%、97%或100%一致之序列的多肽，或者係包含SEQ ID NO.58之至少7個、10個、15個、20個、25個、30個或50個鄰接胺基酸之免疫原性片段的多肽。
  26. 如請求項25之免疫原性組合物，其中該免疫原性片段包含SEQ ID NO：58之B及/或T細胞表位。
  27. 如請求項21至23中任一項之免疫原性組合物，其中PilA能夠引發識別SEQ ID NO.58之免疫反應。
  28. 如請求項21至23中任一項之免疫原性組合物，其中包含該來自流感嗜血桿菌之蛋白質E及該來自流感嗜血桿菌之PilA作為如請求項1至20中任一項之融合蛋白質。
  29. 一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO.177之融合蛋白質(QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ)。
  30. 一種免疫原性組合物，其包含SEQ ID NO.219之融合蛋白質(IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ)。
  31. 一種疫苗，其包含如請求項1至20中任一項之融合蛋白質或如請求項21至30中任一項之免疫原性組合物。
  32. 一種如請求項21至30中任一項之免疫原性組合物或如請求項31之疫苗的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防中耳炎的藥劑。
  33. 一種如請求項29或30之免疫原性組合物的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防中耳炎的藥劑。
  34. 一種如請求項21至30中任一項之免疫原性組合物或如請求項31之疫苗的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)的藥劑。
  35. 一種如請求項29或30之免疫原性組合物的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)的藥劑。
  36. 一種如請求項21至30中任一項之免疫原性組合物或如請求項31之疫苗的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防肺炎的藥劑。
  37. 一種如請求項29或30之免疫原性組合物的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防肺炎的藥劑。
  38. 一種如請求項21至30中任一項之免疫原性組合物或如請 求項31之疫苗的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防流感嗜血桿菌感染或疾病的藥劑。
  39. 一種如請求項29或30之免疫原性組合物的用途，其係用於製造為有需要之個體治療或預防流感嗜血桿菌感染或疾病的藥劑。
  40. 如請求項38或39之用途，其中該流感嗜血桿菌感染或疾病係NTHi感染或疾病。
  41. 如請求項1、2、16、17、19及20中任一項之融合蛋白質、或如請求項21至23、29及30中任一項之免疫原性組合物或如請求項31之疫苗，其係用於治療或預防中耳炎。
  42. 如請求項1、2、16、17、19至23及29至31中任一項之融合蛋白質、免疫原性組合物或疫苗，其係用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
  43. 如請求項1、2、16、17、19至23及29至31中任一項之融合蛋白質、免疫原性組合物或疫苗，其係用於治療或預防肺炎。
  44. 如請求項1、2、16、17、19至23及29至31中任一項之融合蛋白質、免疫原性組合物或疫苗，其係用於治療或預防流感嗜血桿菌感染或疾病。
  45. 如請求項44之融合蛋白質、免疫原性組合物或疫苗，其係用於治療或預防NTHi感染或疾病。
  46. 一種產生融合蛋白質之周質表現的方法，其中該方法包括誘導含有信號肽之蛋白質的表現。
  47. 如請求項46之方法，其中該信號肽係來自FlgI。
  48. 如請求項46之方法，其中該信號肽係來自pelB。
  49. 如請求項46至48中任一項之方法，其中該融合蛋白質係式(I)之融合蛋白質或如請求項1至20中任一項之融合蛋白質。
  50. 一種製造疫苗之方法，其包括如請求項46至49中任一項之方法。
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