DE69030306T2

DE69030306T2 - Verfahren zur ortsspezifischen integration von dna ins pflanzliche genom

Info

Publication number: DE69030306T2
Application number: DE69030306T
Authority: DE
Inventors: Groot Marcellus De; Paul Hooykaas; Remko Offringa; DEN ELZEN Petrus VAN
Original assignee: Universiteit Leiden; Mogen International NV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1990-07-26
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2010-07-27
Also published as: JP3412134B2; WO1991002070A1; EP0436007B1; JPH04502860A; ATE150792T1; ES2100173T3; DK0436007T3; NL8901931A; DE69030306D1; EP0436007A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinaten DNA. Insbesonders bezieht sie sich auf veränderte Pflanzen, auf Verfahren zur ortsspezifischen Abänderung des Genoms der Pflanzen und auf die darin verwendeten DNA-Konstrukte.

Hintergrund der Erfindung

Während der letzten Jahre sind Techniken zur genetischen Manipulation von Pflanzenzellen und zur Regeneration transgener Pflanzen aus diesen Pflanzenzellen entwickelt worden. Andererseits kann direkte DNA-Transformation von Planzenprotoplasten eingesetzt werden, um erwünschte DNA in Pflanzenzellen einzuführen. Dazu sind mehrere Verfahren verfügbar, z.B. Ca/PEG (Krens et al., 1982; Negrutiu et al., 1987), die Elektroporation und die Mikroinjektion (Crossway et al., 1986). Bei Verwendung des kürzlich entwickelten Mikroprojektil-Verfahrens (Klein et al., 1987) kann auch intaktes Pflanzengewebe mit "nackter DNA" transformiert werden. Andererseits kann die gewünschte DNA in die Pflanzenzelle eingeführt werden, indem das natürliche DNA-Transfersystem der Bakterien Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes verwendet wird (für einen Übersichtsartikel siehe Klee et al., 1987).
Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes sind, nachdem sie sich an die Wand der Pflanzenzelle angelagert haben, zur Übertragung eines DNA-Stücks auf die Pflanzenzelle befähigt. Ein solches Stück, die Transfer-DNA (T-DNA) ist als T-Gebiet Teil eines grossen Plasmids (190 bis 240 kbp) in dem Bakterium, das im Fall von A. tumefaciens als Ti-Plasmid und im Fall von A. rhizogenes als Ri-Plasmid bezeichnet wird. Die T-DNA wird in das nukleare Genom der Pflanzenzelle integriert (Tomashow et al., 1980; Chilton et al., 1982). Die auf der T-DNA sitzenden Gene werden in der Pflanzenzelle exprimiert und bringen sie dazu, sich wie eine Tumorzelle zu verhalten (Ooms et al., 1981; Willmitzer et al., 1982 a+b).
Zusätzlich zu den Genen, die für die Tumorinduktion verantwortlich sind, befinden sich auf der T-DNA auch Gene, die für die Bildung der sogenannten Opine zuständig sind. Die Opine, wie zum Beispiel Octopin und Nopalin, können dem Agrobacterium als Energie-, Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquelle dienen. Die für den Katabolismus dieser Opine benötigten Enzyme werden durch Gene codiert, die auf den Ti- (Ri-)Plasmiden sitzen (z.B. Bomhoff et al., 1976; Kerr und Roberts, 1976; Hooykas et al., 1977). Die Ti- und Ri- Plasmide werden in Abhängigkeit von der Opin-Produktion in Gruppen klassifiziert (zum Beispiel die Octopin- und Nopalin-Plasmide).
Die T-Region wird durch zwei unvollständige direkte Wiederholungen von 25 Basenpaaren, die auch "Ränder" genannt werden, begrenzt (Yadav et al., 1982; Zambryski et al., 1982; Gielen et al., 1984, Slightom et al., 1985). Die Anwesenheit dieser Ränder in cis ist eine Voraussetzung für einen korrekten Transfer der T-DNA (Wang et al., 1984; Peralta und Ream, 1985). Die Anwesenheit des rechten Randes ist für einen effizienten DNA-Transfer notwendig (Ooms et al., 1982; Shaw et al., 1984b; Wang et al., 1984). Je nach Testsystem wurde gefunaen, dass die Deletion des linken Randes bei einigen Versuchen zu einer niedrigeren Frequenz des T- DNA-Transfers auf die Pflanzenzelle führt (Bakkeren et al., 1989), während es bei anderen Versuchen nicht der Fall ist (Hille et al., 1983a; Joos et al., 1983). Anschliessend an den rechten Rand befindet sich eine Sequenz, die die Effizienz des T-DNA-Transfers wesentlich erhöht (Peralta et al., 1986; Van Haaren et al., 1986, 1987; Wang et al., 1987). Die Wirkung dieses "Verstärker"-Elements ist unabhängig von der Position oder Orientierung bezüglich dem rechten Rand (Van Haaren et al., 1986). Aus Versuchen mit synthetischen Rändern wurde ersichtlich, dass die Sequenzen des rechten und linken Randes vertauschbar sind und dass folglich der "Verstärker" bestimmt, welche Randsequenz der dominante rechte Rand wird (Peralta et al., 1986; Van Haaren et al., 1987).
Zusätzlich zur T-DNA sind Virulenzgene vorhanden, die einerseits auf dem Chromosom, andererseits auf dem Ti-Plasmid liegen (Vir-Region). Diese Gene spielen bei der Anlagerung des Bakteriums an die Pflanzenzelle und im Prozess der Übertragung der T-DNA auf die Pflanzenzelle eine Rolle (für einen Übersichtsartikel siehe Melchers und Hooykaas, 1987). Allen oben erwähnten Gentransfer-Systemen ist der Nachteil gemeinsam, dass der Ort der Integration der transformieren den DNA nicht vorausgesagt werden kann. Es scheint also so zu sein, dass die durch Agrobacterium eingeführte DNA wie bei den anderen oben erwähnten Transfertechniken an zufälligen Orten in das Genom integriert wird (Chyi et al., 1986; Wallroth et al., Spielman und Simpson, 1986). In gewissen Situationen ist es jedoch wünschenswert oder sogar notwendig, den Ort der Integration im voraus festzulegen. Es könnte also das einzuführende Gen an einen Ort gelenkt werden, wo die erwünschte Regulierung der Expression gewährleistet ist. Die neu eingeführte DNA könnte auch verwendet werden, um ein bestimmtes Pflanzengen zu mutieren oder zu inaktivieren.
Es sind mehrere Verfahren beschrieben worden, um DNA auf eine ortsspezifische Weise in das Pflanzengenom zu integrieren. Diese Verfahren basieren alle auf einem Mechanismus, der als homologe Rekombination bekannt ist.
Die homologe Rekombination ist ein Prozess, der in Bakterien und Hefen sehr effizient abläuft. Er wird bei solchen Organismen zur ortsspezifischen Integration neu eingeführter DNA eingesetzt (Ruvkun und Ausubel, 1981; Orr-Weaver et al., 1981). Bei Hefen wurde gefunden, dass DNA-Moleküle, die im homologen Gebiet mit im Genom integrierter DNA linearisiert sind, mit einer 10- bis 1000-fach höheren Häufigkeit rekombinieren. In neuerer Zeit wurde auch bei Säugerzellen gefunden, dass homologe Rekombination zwischen genomischer und neu eingeführter DNA stattfindet (Smithies et al., 1985; Thomas und Capecci, 1987; Song et al., 1987; Baker et al., 1988; für einen neuen Übersichtsartikel siehe Capecci, 1989). Es wurde bei solchen Systemen auch deutlich, dass bei der Ko-Transformation zweier defektiver Mutanten die Linearisierung einer der Mutanten im Homologiegebiet eine - durchschnittlich - 10-fach höhere Rekombinationshäufigkeit ergab (Kucherlapati et al., 1984).
Über die Rekombination zweier homologer DNA-Moleküle, nach ihrer gleichzeitigen Einführung in eine Pflanzenzelle, wurde von Wirtz et al., 1987, berichtet.
Die europaische Patentanmeldung EP-A-0317509 offenbart ein Verfahren zur Integration von DNA-Sequenzen in das Genom von Pflanzen über homologe Rekombination. Gemäss dieser Anmeldung kann die Einführung des DNA-Konstrukts in den Pflanzenwirt nach bekannten Verfahren, so durch das Transfersystem von Agrobacterium, erfolgen. In den Beispielen wurde jedoch ein direktes DNA-Transformationsverfahren (mit "nackter" DNA) verwendet, um die eintretende DNA in mit Polyethylenglykol (PEG) behandelte Tabakprotoplasten einzuführen.
Es wurde behauptet, dass Modifikationen an genau bestimmten Orten im Pflanzengenom erhalten werden konnten. Die Ergebnisse der Versuche, bei denen Resistenz gegen Kanamycin unter Verwendung verschiedener defektiver APHII-Gene verliehen wurde, waren jedoch hinsichtlich der Frage, ob die Wiederherstellung des Gens an dem gewünschten Locus ("in situ") erfolgte, nicht schlüssig. In einem von einem der Erfinder, Paszkowski et al., später veröffentlichten Artikel zu denselben Versuchen wurde lediglich angenommen, dass die Wiederherstellung des defektiven APHII-Gens aufgrund homologer Rekombination mit dem eintretenden defektiven APHII- Gen am Locus stattgefunden haben könnte, dass "aber weiteres Beweismaterial zu dessen Bestätigung nötig" sei.
Es besteht immer noch ein Bedarf an einem effizienten Verfahren zur In situ-Modifikation des Pflanzengenoms und zur Selektion der erwünschten Mutanten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einführung einer definierten Mutation in einen ausgewählten Ziel- Locus eines nuklearen Pflanzengenoms zur Verfügung, bei dem mindestens ein Teil einer rekombinanten DNA durch homologe Rekombination an dem Ziel-Locus in besagtes Genom integriert wird, wobei die rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur hat,
- in der die Kästen 1 und 7 und die verbindenden Linien DNA-Sequenzen darstellen, die zur Funktion als ein T-DNA- Rand in dem DNA-Transferprozess befähigt sind,
- in der der Kasten 1 oder 7, nicht jedoch beide abwesend sein können, in der der Kasten 3 eine DNA-Sequenz umfasst, die genügend homolog zu einer DNA-Sequenz innerhalb des Ziel-Locus und genügend lang zur Bewirkung der homologen Rekombination ist,
- in der der Kasten 4 eine DNA-Sequenz darstellt, die nicht homolog zu den in dem Ziel-Locus vorkommenden Sequenzen ist und in der die Linien, welche die Kästen verbinden, eine beliebige Zahl von Basenpaaren oder kein Basenpaar darstellen können,
und bei dem die Transformanten mit der definierten Mutation in dem besagten Ziel-Locus unter Verwendung bekannter Verfahren identifiziert werden.
Die Erfindung stellt auch rekombinante DNA zur Verfügung, die zur Integration eines Teils ihrer selbst in das Pflanzengenom über homologe Rekombination am Ziel-Locus befähigt ist, wobei diese rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur mit mindestens den folgenden Anforderungen aufweist:
in der die Kästen 1 und 7 DNA-Sequenzen darstellen, die zur Funktion als ein T-DNA-Rand in dem DNA-Transferprozess befähigt sind,
in der der Kasten 1 oder 7, nicht jedoch beide abwesend sein können,
in der die beiden Kästen 3 und 4 DNA-Sequenzen darstellen, die genügend homolog und genügend lang zur Bewirkung der homologen Rekombination mit dem Ziel-Locus sind,
in der die DNA-Sequenzen innerhalb der Kästen dieselbe 5' zu 3' -Orientierung wie beim Ziel-Locus haben, die Reihenfolge der Kästen selber jedoch gegenüber der Situation im Ziel-Locus geändert worden sind, so dass sich die Insertion des Kastens i in den Ziel-Locus nach der homologen Rekombination ergibt, und in der die Linien, welche die Kästen verbinden, eine beliebige Zahl von Basenpaaren oder kein Basenpaar darstellen können.
Die Erfindung stellt des weiteren DNA-Konstrukte zur Verfügung, die zusätzlich die Selektion derjenigen Pflanzen, die die definierten Mutationen an dem gewünschten genomischen Ort aufweisen, ermöglichen. Diese Konstrukte sind besonders nützlich, wenn die integrierte Mutation phänotypisch schwierig zu erkennen ist. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Integration von DNA-Sequenzen, die definierte Mutationen enthalten, in gewünschte Orte des Pflanzengenoms zur Verfügung, wobei diese T-DNA-Konstrukte unter Verwendnung des T-DNA-Transfersystems von Agrobacterium tumefaciens oder damit verwandter Arten in die Pflanzenzelle eingeführt werden. Es werden auch Vektoren zur Verfügung gestellt, die die besagten rekombinanten T-DNA-Konstrukte enthalten, sowie damit transformierte Bakterien.

Ausführliche Beschreibung

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass zwei T-DNA's, die homologe Gebiete enthalten, bei gleichzeitigem Einführen in eine Pflanzenzelle zur homologen Rekombination physisch befähigt sind. Des weiteren wurde auch gefunden, dass neu eingeführte T-DNA mit zum Pflanzengenom der Akzeptor- Pflanzenzelle homologen Gebieten, die hier im folgenden als "lenkendes Konstrukt" bezeichnet wird, zur Rekombination mit der genomischen DNA-Sequenz innerhalb der homologen Gebiete befähigt ist. In einigen Fällen wurde von dem wiederhergestellten Phänotypen, namentlich der Kanamycin- Resistenz, gezeigt, dass sie das Ergebnis der Wiederherstellung des mutierten Locus war, d.h. dass die Pflanze in situ am gewünschten Locus im Genom modifiziert worden war. Der gewünschte Locus wird hier im folgenden auch als "Ziel- Locus" bezeichnet.
Die rekombinierten Sequenzen im Pflanzengenom erwiesen sich als stabil und genetisch vererbbar.
Die von uns für das Agrobacterium-System gefundenen Rekombinationshäufigkeiten (im Vergleich zur Zahl der Transformanten) sind vergleichbar zu den von Wirtz et al. (1987) und von Paszkowski et al. (1988) für das direkte Transformationsverfahren mit nackter DNA gefundenen Häufigkeiten.
Die Möglichkeit, das Agrobacterium-System zur Erzwingung der homologen Rekombination in Pflanzenzellen einzusetzen, kam angesichts der strukturellen Eigenschaften der T-DNA und der Beteiligung von Proteinen im Transferprozess ziemlich unerwartet. Dies wird durch die folgenden Befunde veranschaulicht;
a)unter Verwendung des Agrobacterium-Transfersystems wird die transformierende DNA (T-DNA) aus dem transformierenden Plasmid an den T-DNA-Rändern ausgeschnitten und wird folglich nicht innerhalb eines Homologie-Gebiets mit dem Ziel-Locus linearisiert, wies der Fall bei aller nackten DNA ist,
b)anders als bei nackter DNA konnte, da das T-DNA-Molekül einzelsträngig ist, sowie als Folge der Assoziation mit Virulenzproteinen wie Vir E (Gietl et al., 1987; Das, 1988, Sen et al., 1989; Citovsky et al., 1988, 1989; Christie et al., 1988) und Vir D2 nicht vorhergesehen werden, dass es zur homologen Rekombination zur Verfügung stand. Von Vir D2 ist sogar bekannt, dass es kovalent an das 5'-Ende des sogenannten T-Strangs gebunden ist (Young und Nester, 1988; Herrera-Estrella et al., 1988; Ward und Barnes, 1988). Es wird ein Modell beschrieben, in dem die T-DNA als einzelsträngiges lineares Molekül auf die Pflanzenzelle übertragen wird (Stachel et al., 1987; Albright et al., 1987) und in dem Proteine, die einzelsträngige DNA binden, möglicherweise die DNA vor der Integration in das Genom vor Nuklease-Aktivität schützen (Gietl. et al., 1987; Citovsky et al., 1988, 1989; Das et al., 1988; Sen et al., 1989; Christie et al., 1988; Young und Nester, 1988); Herrera-Estrella et al., 1988; Ward und Barnes, 1988),
c)der sehr hohe Untergrund, der aufgrund der sehr effizienten Zufallsintegration von T-DNA zu erwarten ist; das erfordert einen rigorosen Selektionsmechanismus, um Pflanzenwirte mit der richtigen in situ-Integration (d.h. über homologe Rekombination) zu finden, während nichttransformierte Wirte und die überwiegende Mehrheit der Pflanzenwirte mit unerwünschten Zufallsintegrationen der gesamten T-DNA in ihrem Genom verworfen werden. Insbesonders ist es ein schwerwiegendes Problem, wenn sich die erwünschten, in das Pflanzengenom zu integrierenden Mutationen nur schwer direkt beobachten lassen (d.h. die einen Phänotypus aufweisen, der nicht einfach zu beobachten oder zu überprüfen ist). Tatsächlich sind viele in situ- Modifikationen schwierig aufzufinden.
Obwohl erwähnt wurde, dass Agrobacterium als DNA-Transfersystem zur direkten homologen Rekombination verwendet werden kann, ist bis jetzt über keine Ergebnisse berichtet worden, welche die oben erwähnten Fragen betreffend die Eignung des DNA-Transfersystems von Agrobacterium für die ortsspezifische Mutagenese des Pflanzengenoms klären würden.
Einige der Vorteile bei der Verwendung von Agrobacterium als DNA-Transfersystem zur Erzwingung der ortsspezifischen Mutagenese des Pflanzengenoms gegenüber der Verwendung der Transformation mit nackter DNA sind, unter anderem:
1.Protoplasten werden durch Agrobacterium mit erheblich höherer Häufigkeit transformiert, als es bei Verwendung der Transformation mit nackter DNA möglich wäre. Von den Kalli, die aus mit Agrobacterium während 72 Stunden ko-kultivierten Protoplasten von Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 regeneriert wurden, erwiesen sich 20 bis 50% als transformiert (Van den Elzen et al., 1985a; Depicker et al., 1985).
Sogar wenn die Rekombinationshäufigkeit mit T-DNA niedriger wäre als die Rekombinationshäufigkeit mit nackter DNA, könnte der Prozentsatz an Zellen, die durch homologe Rekombination transformiert werden, aufgrund einer höheren Transformationshäufigkeit bei Verwendung des DNA- Transfersystems von Agrobacterium höher sein.
2.Die Regeneration von Protoplasten zu Pflanzen ist immer noch bei vielen Pflanzenarten ein Problem. Das beschränkt den Gebrauch der vwnacktenll DNA-Transformation, bei der mit Protoplasten gearbeitet werden muss (mit Ausnahme der Teilchenbombardierungstechnik, die regenerable Pflanzenteile verwenden kann, diese Technik verursacht jedoch eine grosse Streuung und ist daher für diesen Zweck nicht sehr nützlich). Des weiteren erfolgt die Regeneration von Protoplasten zu Pflanzen über eine Kallus-Phase. Während einer solchen Phase wird oft somaklonale Variation beobachtet. Die somaklonale Variation schliesst alle chromosomalen Umlagerungen in sich mitotisch teilendem Gewebe ein und ergibt chimärisches Gewebe. Zum Erhalt von transformierten Pflanzen mittels Agrobacterium ist keine Regeneration von Protoplasten notwendig. Es können leicht regenerable Gewebe von Pflanzen wie z.B. Blattscheiben (Horsch et al., 1985) Kartoffelknollenscheiben (Sheerman und Bevan, 1988) oder Meristeme (Ulian et al., 1988) verwendet werden, um nach Ko-Kultivation mit Agrobacterium transformierte Pflanzen zu erhalten. Schösslinge können ebenfalls mit einer vernünftigen Häufigkeit aus Blattscheiben von Tabakpflanzen regeneriert werden, die mit A. rhizogenes angeimpft wurden. Leicht regenerables Pflanzengewebe, das leicht mit Agrobacterium transformiert werden kann, kann nun aus vielen anderen Pflanzenarten ebenfalls erhalten werden.
3.Im Gegensatz zur Integration nackter DNA ist die Integration der T-DNA genau. Damit ist gemeint, dass Kopien von T-DNA oft intakt integriert werden und dass eine "Streuung" kaum vorkommt (Hain et al. 1985; Czernilofsky et al. 1986; Deroles und Gardner, 1988). Wirtz et al. (1987) und Paszkowski et al. (1988) finden in ihren Versuchen, bei denen sie zur Untersuchung der homologen Rekombination Transformation durch nackte DNA einsetzen, eher komplexe Integrationsmuster im Pflanzengenom.
4.Einige Verfahren der Transformation mit nackter DNA erfordern eine sogenannte Carrier-DNA, um die Transformationshäufigkeit zu erhöhen. Diese Carrier-DNA könnte in das homologe Rekombinationsereignis eingreifen. Ausserdem wird diese Carrier-DNA mehr oder weniger zufällig in das Pflanzengenom integriert (Peerbolte et al., 1985) und bewirkt infolgedessen unerwünschte Mutationen in dem Wirtsgenom. Das Agrobacterium-System erfordert keine Carrier-DNA.
Die Beachtung des Agrobacterium-Systems nahm noch weiter zu, als es ersichtlich wurde, dass, zusätzlich zu den Dicotyledon-Pflanzen, auch monocote Pflanzen - darunter Knollenpflanzen, Spargel und Getreide - unter Verwendung von Agrobacterium transformiert werden können (Hooykaasvan Slogteren et al., 1984; Hernalsteens et al., 1984; Graves und Goldman, 1986, 1987; Grimsley et al., 1987). Im allgemeinen wurde gefunden, dass zwei T-DNA's zur homologen Rekombination innerhalb der Pflanzenzelle befähigt sind. Insbesonders wurde dies an einem Modell-Gen, namentlich dem NPTII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin (Kmr) verleiht, gezeigt. Das NPTII-Gen wird von dem bakteriellen Transposon Tns abgeleitet (Beck et al., 1982) und kodiert für das Enzym Neomycin-Phosphotransferase. Wird das NPTII-Gen unter Reguliersignale gestellt, die von Pflanzengenen abgeleitet sind (oder T-DNA-Gene von Agrobacterium), kann es nach der Einführung in die Pflanzenzelle exprimiert werden und ergibt Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin (Bevan et al. 1983; Herrera- Estrella et al. 1983). Pflanzenzellen sind auf Kanamycin empfindlich. Daher kann das Gen als Selektionsmarker für transformierte Zellen oder Gewebescheiben eingesetzt werden. Dieses Kmr-Gen wird als Modell-Gen zur Auffindung homologer Rekombination in Pflanzenzellen, namentlich in Protoplasten von Nicotiana tabacum cv. petit havana SR1, ausgewählt.
Bei der separaten Transformation von T-DNA's, die ein defektives NPTII-Gen enthalten, konnten keine Kmr-Protoplasten erhalten werden. Das gleichzeitige Einführen beider defektiver NPTII-Gene, indem Tabak-Protoplasten mit zwei verschiedenen Stämmen von Agrobacterium tumefaciens kokultiviert wurden, wobei jeder in einem binären Vektor ein verschiedenes, defektives NPTII-Gen enthielt, ergab Kmr- Tabakzellen. Diese Zellen konnten zu Kmr-Kalli und anschliessend zu Kmr-Pflanzen regeneriert werden. Die Analyse auf DNA-Stufe bestätigte, dass beide defektiven NPTII-Gene einander durch homologe Rekombination ergänzten. Die Analyse auf der Protein-Stufe zeigte auch, dass das Rekombinationsereignis genau am richtigen Ort innerhalb des kodierenden Gebiets des Gens stattgefunden hatte. Die Möglichkeit, dass das Rekombinationsereignis in Agrobacterium stattgefunden hatte, wurde durch Vergleichsversuche ausgeschlossen. Das zeigt zum ersten Mal, dass in einer Pflanzenzelle homologe Rekombination zwischen zwei T-DNA's, die ein Homologie-Gebiet zueinander aufweisen, möglich ist.
In einem anderen Versuch wurde eine transgene Tabakpflanze, die ein defektives NPTII-Gen in ihrem Genom enthielt, mit einem Reparier-Konstrukt transformiert, das unter Verwendung des Transfersystems von Agrobacterium in die Pflanzenzelle eingeführt wurde. Das Reparier-Konstrukt enthielt auch ein defektives NPTII-Gen, das an einem anderen Ort innerhalb des Gens mutiert war. Es wurde gezeigt, dass die Mutation aufgrund homologer Rekombination zwischen der neu eingeführten NPTII-Mutanten im Ziel-Konstrukt und der NPTII-Genmutanten, die im Pflanzengenom lag, wiederherge stellt werden konnte. Wiederum war die Rekombination korrekt erfolgt, wodurch ein wiederhergestelltes Gen erhalten wurde, das ein voll aktives NPTII-Enzym kodierte, das identisch zum Produkt des Wildtyp-NPTII war. Am allerwichtigsten war, dass die Analyse auf DNA-Stufe zeigte, dass die Rekombination am Ziel-Locus stattgefunden hatte, wodurch sich eine in situ-Wiederherstellung des Gens ergab.
In anderen Versuchen ist gezeigt worden, dass auch auf Sequenzen gelenkt werden kann, die natürlicherweise im Pflanzengenom vorkommen (endogene Sequenzen).
In diesen Versuchen wurde ein endogenes Gen, namentlich ein Mitglied der rbc-SSU-Multigenfamilie, als Ziel ausgesucht, um die Möglichkeit zu erkunden, endogene Sequenzen in situ über homologe Rekombination zu mutieren. Die Gene dieser Familie kodieren für die kleine Untereinheit der Ribulose- 1,5-bisphosphatcarboxylase/Oxygenase (rbcS), ein nuklear kodiertes, auf den Chloroplasten liegendes Protein, das mit der Photosynthese zu tun hat.
Daher wurden zwei Ziel-Konstrukte hergestellt, wobei jedes eine verschiedene Translationsfusion zwischen dem kodierenden Gebiet dieses rbcs-Gens beinhaltete, bestehend aus vier Exonen und dem kodierenden Bereich des NPTII-Gens (siehe Figur 10). Ein chimärisches Gen, eine Translationsfusion im zweiten Exon von rbcs, kodiert für ein Protein, in dem das Transportpeptid (das mit dem Führen des rbc-Genprodukts zum Chloroplasten zu tun hat) und die ersten 23 Aminosäuren des reifen SSU-Proteins N-terminal an NPTII fusioniert sind. Ein ähnliches Fusionsprotein zwischen dem Transportpeptid und den ersten 23 Aminosäuren des reifen Peptids vom rbcs- Gen aus Erbsen und NPTII wurde schon beschrieben und erwies sich als funktional (Schreier et al., 1985). Das andere Fusionsgen kodiert für ein Protein, in dem das Transportpeptid und 99 Aminosäuren des reifen SSU-Proteins des N- Terminus des NPTII-Enzyms fusioniert sind. Bis zu 0,01% der transformierten Kalli erwiesen sich als kmr, was in den meisten Fällen lichtreguliert schien, wodurch ein Teil des SSU-NPTII-Fusionsgens offenbar zum Chloroplasten transportiert wurde. Die Analyse des genomischen Locus auf DNA- Stufe, unter Verwendung von Southern Blotting und PCR- (Polymerase-Kettenreaktions-) Analyse, ergab, dass die lichtgesteuerte Kanamycinresistenz eines Teils der transformierten Kalli tatsächlich das Ergebnis einer in situ- Modifikation des Ziel-Locus, d.h. des ausgewählten rbcs Locus, war.
Die Ergebnisse dieses Versuchs beweisen, dass unter Verwendung von T-DNA-Konstrukten und über homologe Rekombination gezielte Mutationen bei gezielten Loci des Pflanzengenoms eingeführt werden können, unabhängig davon, ob der Ziel- Locus aus einer exogenen oder endogenen DNA-Sequenz besteht. Des weiteren zeigt sich deutlich, dass irgend ein funktionales Bruchstück eines Genes oder ein ganzes Gen, das in Kombination mit einem funktionalen, an einem ausgewählten Ziel-Locus des Genoms des Pflanzenwirts sitzenden Bruchstück irgend eines anderen Gens funktional ist, korrekt an dieses Bruchstück in situ, über homologe Rekombination zwischen dem lenkenden Konstrukt und dem Ziel-Locus, fusioniert werden kann, wodurch sich eine funktionale Fusion der beiden funktionalen Genteile ergibt. In ihrer breitesten Betrachtungsweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Manipulation eines prinzipiell beliebigen Teils des Pflanzengenons zur Verfügung, ohne den Sitz dieses Teils des Genoms zu verändern.
In den oben erwähnten Versuchen konnten die homologen Rekombinationsereignisse leicht aufgefunden werden, da die Genfragmente mit gemeinsamer Homologie sich gegenseitig ergänzen konnten, wodurch dem Wirt Kanamycin-Resistenz verliehen wurde. In manchen Fällen kann jedoch nach der Mutation, die man über homologe Rekombination in das Pflanzengenom einführen will, nicht direkt selektioniert werden. Mutationen wie zum Beispiel der Austausch von Aminosäuren oder das Abändern des Codon-Gebrauchs von Genen und Ähnliches können nicht leicht aufgefunden werden und müssen daher auf DNA-Stufe analysiert werden. Solche Analysen können die Restriktionskartierung der genomischen DNA, die PCR- Analyse und/oder die DNA-Sequenzanalyse involvieren.
Da es in diesen Fällen sehr mühsam und zeitraubend ist, alle koinkubierten Zellen der Reihe nach auf das gewünschte Rekombinationereignis auf DNA-Stufe zu untersuchen, ist es wünschenswert, dass man nach transformierten Wirten selektionieren kann, indem ein positiver Selektionsmarker wie zum Beispiel ein antibiotisches Gen oder ein Gen für Herbizidresistenz oder ähnliches verwendet wird, der eine hohe Wahrscheinlichkeit der Transformation über homologe Rekombination statt der zufälligen Integration an unerwünschten Orten des Genoms aufweist. Da man von der Häufigkeit der zufälligen Integration weiss, dass sie viel höher ist als die Häufigkeit der homologen Rekombination, ist ein starker Selektionsmechanismus nötig, um all diejenigen Zellen auszusondern, die durch zufällige Integration transformiert wurden. Daher ist es erfindungsgemäss bevorzugt, dass ein positives Selektionsgen zusammen mit einem negativen Selektionsgen verwendet wird, wahlweise zwei negative Selektionsgene, die auf dem lenkenden Konstrukt ausserhalb der in die homologe Rekombination involvierten Gebiete liegen. Die allgemeine Struktur eines solchen T-DNA-Konstrukts ist in Figur 13A dargestellt. Die Kästen 1 und 7 stellen je T-DNA- Ränder dar, die Kästen 2 und 6 sind Expressionskassetten, die ein negatives Selektionsgen enthalten, die Kästen 3 und 4 enthalten Sequenzen, die zur Rekombination und Mutation des Ziel-Locus verwendet werden, un der Kasten E enthält Sequenzen, die mit der Rekombination ausserhalb des Ziel- Locus zu tun haben. Die negativen Selektionsgene dienen dazu, denjenigen Zellen, die diese Gene in einer ausdrucksfähigen Weise (z.B. in einer Expressionskassette, die das strukturale Gen zwischen den regulierenden Gebieten enthält, die zur korrekten Expression im Pflanzenwirt benötigt werden) in ihr Genom integriert haben, einen Nachteil (bevorzugt die Nichtlebensfähigkeit) zu verleihen. Entsprechend werden alle Zellen, die die gesamte T-DNA zufällig in das Genom integriert haben, aufgrund der Anwesenheit der negativen Selektionsgene beschädigt oder abgetötet werden. Es werden nur die Zellen überleben, die das positive Selektionsgen in ihr Genom integriert haben, während die negativen Selektionsgene als Folge der Rekombination innerhalb der Gebiete mit Homologie ausgesondert wurden. Da man weiss, dass die Streuung von T-DNA mit einer deutlich geringeren Rate erfolgt als die Streuung von nackter DNA, erweist sich die Kombination eines positiven Selektionsgens innerhalb der Bereiche mit Homolgie mit einem oder wahlweise zwei negativen Selektionsgenen ausserhalb der Bereiche mit Homologie als besonders vorteilhaft, wenn sie in Kombination mit dem DNA-Transfersystem von Agrobacterium verwen det wird. Sie kann aber auch mit nackter DNA sehr gute Ergebnisse zeigen.
Da die Eigenheit der intakten Integration (das Fehlen von Streuung) währscheinlich mit der Tatsache zusammenhängt, dass T-DNA mit Proteinen beladen ist, könnte diese System auch mit in vitro abgepackter T-DNA oder auch mit nackter DNA anderer Herkunft als aus Ti/Ri-Plasmiden funktionieren, die mit DNA-bindenden Proteinen beladen wurden.
Erfindungsgemäss ist es stark bevorzugt, wenn das T-DNA- Konstrukt zwei T-DNA-Ränder in ihrer aktivsten Orientierung enthält. Es ist jedoch in der Technik bekannt, dass ein T- DNA-Rand für den DNA-Transfer ausreicht, und es können auch Ränder verwendet werden, die synthetisch sind oder im Vergleich zur Wildtyp-Situation die umgekehrte Orientierung aufweisen.
Die Wahl des positiven Selektionsgens (enthalten in Kasten 5) ist für die Erfindung nicht kritisch, solange es im Wirt funktional ist und dem Pflanzenwirt in einer expressionsfähigen Art beigefügt wird. Das positive Selektionsgen kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die das NPTII-Gen (das die Kanamycin-Resistenz kodiert), das HPT-Gen (Hygromycin- Resistenz), das ALS-Gen (Chlorsulfuron-Resistenz) und das DHFR-Gen (Methothrexat-Resistenz) enthält, jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Um diese Gene zu exprimieren können starke konstitutive Promotoren verwendet werden, so der 35S- oder der vom Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) abgeleitete 19S-Promotor, T-DNA-Promotoren aus Agrobacterium, aber auch Pflanzenpromotoren, oder irgend ein im Wirt funktionaler Promotor. In der Regel ist es bevorzugt, dass die DNA- Sequenzen, die nicht für die homologe Rekombination vorgesehen sind, keine Homologie zu DNA-Sequenzen haben, die im Pflanzengenom liegen. In Fällen, wo dies notwendig ist, sollten die Gebiete mit Homologie, die am Rekombinationsereignis nicht teilnehmen sollen, so klein wie möglich gehalten werden, damit sie nicht in das erwünschte Rekombinationsereignis eingreifen.
Die Wahl des negativen Selektionsgens (enthalten in Kasten 2 und/oder Kasten 6) ist für die Erfindung nicht kritsch, solange es im Wirt funktional ist und dem Pflanzenwirt in einer expressionsfähigen Art beigefügt wird. Das negative Selektionsgen kann zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus dem aux-2-Gen des Ti-Plasmids von Agrobacterium, dem TK-Gen aus SV40, dem Cytochrom f450 aus Streptomyces griseolus, dem Adh-Gen aus Mais oder Arabidopsis besteht, es kann aber irgend ein Gen verwendet werden, das ein Protein kodiert, das harmlose Substanzen in schädliche Substanzen verwandelt.
Die Teile 3 und 4 des lenkenden Konstrukts sind für die Erfindung am meisten kritisch.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Mutationen an einem ausgewählten Locus (der hier im Folgenden als Ziel-Locus bezeichnet wird) eingeführt, wobei der Rest der Sequenz des Ziel-Locus (d.h. auf beiden Seiten der einzuführenden Mutation) intakt bleiben soll. Daher muss die unmittelbar an die Mutation angrenzende Sequenz ebenfalls im Kasten 4 des Konstrukts bereitgestellt werden. Es können so Mutationen innerhalb funktionaler Gene oder funktionaler Teile von Genen, so den regulierenden Gebieten, Signalsequenzen, Teile der das reife Protein kodierenden Sequenzen (wie die funktionalen Domänen) oder sogar Introne sowie anderer funktionaler, nicht notwendigerweise protein-kodierender Ziel-Loci eingeführt werden, ohne dass die an die Mutation angrenzende Sequenz des Ziel-Locus geändert wird. In dieser Situation haben sowohl Kasten 3 und Kasten 4 Homologie zum Ziel-Locus, wobei der Kasten 3 zur Förderung des homologen Rekombinationsereignisses dient und daher im Folgenden als Rekombinationskasten bezeichnet wird, während der Kasten 4, der im Folgenden als Ergänzungskasten bezeichnet wird, die Mutation sowie diejenigen Sequenzen des Ziel-Locus beinhaltet, die nicht verändert werden sollten. Da der Ergänzungskasten nur nach homologer Rekombination innnerhalb des Rekombinationskastens in den Ziel-Locus integriert werden kann, sollte die Wahrscheinlichkeit eines Rekombinationsereignisses innerhalb des letzteren Kastens begünstigt sein. Es ist altbekannt, dass die Wahrscheinlichkeit der Rekombination in einem Gebiet mit der Länge der Homologie in diesem Gebiet zunimmt. Es ist daher bevorzugt, dass der Rekombinationskasten genügend lang ist, um die homologe Rekombination zu bewirken, und dass er ausserdem deutlich länger als der Ergänzungskasten ist. Es sollte auch klar sein, dass wenn der Rekombinationskasten des Konstrukts die stromaufwärts liegende Region (5') darstellt, der Ergänzungskasten die stromabwärts liegende Region (3') des Ziel-Locus darstellt, und umgekehrt. Des weiteren sollten die Kästen 3, 4 und E die selbe 5' zu 3'-Orientierung aufweisen.
Am wichtigsten ist, dass die Reihenfolge der Kästen 3, 4, 5 und E bei dieser Ausführungsform der Erfindung nicht geändert werden kann, obwohl das gesamte Bruchstück mit bezüglich den T-DNA-Rändern umgekehrter Orientierung eingefügt werden kann. Es kann auch das gesamte Bruchstück einschliesslich der negativen Selektionsmarker bezüglich der T-DNA-Ränder invertiert sein.
In den Konstrukten kann der Ergänzungskasten drei Arten von Mutationen tragen, die definitionsgemäss unmittelbar neben dem Rekombinationskasten angeordnet sind. Diese Mutationen beinhalten Insertionen von Basenpaaren, die aus einem bis mehreren tausend Basenpaaren bestehen können, eine Ersetzung von Basenpaaren ohne Änderung der Zahl der Basenpaare am Ziel-Locus oder eine die Zahl der Basen verringernde Deletion von Basenpaaren, die eines bis mehrere tausend Basenpaare des Ziel-Locus betragen kann, oder Kombinationen aus diesen.
Es sollte klar sein, dass der Rekombinationskasten im Konstrukt nicht notwendigerweise exakt am Anfang des Ziel- Locus, wie er definiert ist, beginnen muss. Er könnte ebensogut vor oder hinter dem Anfang des Ziel-Locus beginnen. Er endet jedoch definitionsgemäss genau an dem Punkt, an dem die Mutation des Ziel-Locus beginnen soll. In den Fällen, in denen die Mutation eine Insertion oder eine Ersetzung ist, beginnt der Ergänzungskasten definitionsgemäss mit dem ersten Nucleotid der Mutation, muss jedoch nicht notwendigerweise beim letzten Nucleotid der Mutation enden, obwohl er definitionsgemäss das letzte Nucleotid der Mutation beinhaltet. In den Fällen, in denen die Mutation aus einer Deletion von Basenpaaren besteht, beginnt der Ergänzungskasten genau dort, wo die Deletion aufhört. Der Ergänzungskasten kann natürlich mehr als eine Mutation enthalten, sogar mehr als eine Art von Mutation. Wenn in dem Fall die Anzahl der Basen, welche die einzelnen Mutationen trennen, gross ist im Vergleich zu den Gebieten nicht unterbrochener Homologie, ist es bevorzugt, solche Mutationen der Reihe nach in das Pflanzengenom einzufügen, d.h. in verschiedenen Transformationsversuchen.
Es kann im Prinzip ein ganzes exprimierbares Gen in den Ziel-Locus eingefügt werden, wobei dieses Gen selber eine selektionierbare oder in Reihenuntersuchungen überprüfbare Eigenschaft mitbringt. In diesem Fall kann der Kasten 5, der ein exprimierbares positives Selektionsgen darstellt, im Konstrukt fehlen. Folglich entfällt auch der Bedarf an einem Gebiet mit Homologie ausserhalb des Ziel-Locus (Kasten E).
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Kasten 4 eine Sequenz darstellen, die im Vergleich zum Ziel-Locus vollkommen inhomolog ist. Es kann eine bezüglich dem Wirt exogene Sequenz sein, zum Beispiel eine aus einer anderen Varietät der selben Pflanzenart, aus einer anderen Pflanzenart oder aus einem nichtpflanzlichen Organismus abgeleitete Sequenz, eine synthetische Sequenz oder eine genetisch veränderte Sequenz, aber auch eine zum Pflanzenwirt endogene, von einem anderen Locus des Wirtsgenoms abgeleitete Sequenz sein. In letzterem Fall sollte die Währscheinlichkeit einer unerwünschten homologen Rekombination durch Verringern Länge des Kastens 4 relativ zum Kasten 3 gesenkt werden. Wie bei der oben erwähnten Situation kann der Kasten 5 fehlen, wenn nach der Rekombination eine selektionierbare oder in Reihenuntersuchungen überprüfbare Eigenschaft auftritt, wodurch der Bedarf an einem zusätzlichen Selektionsgen und an dem Kasten E entfällt.
In einer dritten Ausführungsform der Erfindung beabsichtigt die ortsspezifische Mutagenese lediglich eine völlige Inaktivierung funktionaler genomischer Gebiete. Diese funktionalen Gebiete schliessen Gebiete und Gene ein, die mit der Regulierung der Genexpression, der DNA-Replikation oder Ähnlichem zu tun haben. Die Inaktivierung kann erreicht werden, indem Deletionen innerhalb des Ziel-Locus, Ersetzungen (z.B. Einführung von Stopcodons), oder Insertionen (z.B. Bewirken von Leseraster-Verschiebungen oder Ähnliches) erzeugt werden, wobei irgend eines der oben erwähnten Konstrukte verwendet wird. Es wird für den Fachmann ersichtlich sein, dass in den Fällen, in denen aufgrund eines sich äussernden Phänotypus des Ziel-Locus direkt nach der Inaktivierung des Ziel-Locus selektioniert oder reihenuntersucht werden kann, das Bereitstellen von positiven oder negativen Selektionsgenen nicht notwendig ist. Das Konstrukt kann nur gerade Kasten 1, 3, 4 und 7 enthalten, wobei der Kasten 4 irgend eine zur Inaktivierung des Ziel- Locus geeignete Art von Mutation enthalten kann.
Ein etwas anderes lenkendes Konstrukt, als "Insertionsvektor" angegeben, ist in Figur 13b gezeigt. Dieses Konstrukt kann, zusätzlich zu dem in Figur 13A gezeigten Konstrukt, zur Einführung von Insertionen (Kasten I) in den Ziel-Locus verwendet werden. Hier stellen die Kästen 3 und 4 zum Ziel-Locus homologe Sequenzen dar, wobei die Basenpaar-Sequenzen der Kästen noch die selbe 5' zu 3'-Abfolge wie im Ziel-Locus haben, die gesamten Kästen im Verhältnis zur Situation im Ziel-Locus jedoch die Plätze getauscht haben. Eine funktionale Alternative des in Figur 13B gezeigten Konstrukts ist eine, bei der die beiden Kästen 3 und 4 auf die andere Seite zeigen.
Obwohl das Lenken von endogenen DNA-Sequenzen mit Beispielen belegt wird, in denen ein Ziel-Konstrukt verwendet wird, bei dem der Promotor und ein Teil der Leadersequenz der kleinen Untereinheit des Gens der Ribulosebisphosphat- Carboxylase (rbcs) durch den Rekombinationskasten umfasst sind, wird es für den Fachmann klar sein, dass man zur Bewirkung der homologen Rekombination im Prinzip irgend ein Teil, ob zu den regulierenden Elementen eines Gens oder den kodierenden Gebieten eines Gens gehörend, oder irgend eine andere Sequenz irgend eines Gens, ein Genbruchstück oder eine andere DNA-Sequenz in dem Rekombinationskasten im lenkenden Konstrukt verwenden kann. Anders gesagt kann unter Verwendung eines Konstrukts, wie es in Figur 13A gezeigt ist, irgend ein Teil irgend eines Gens oder irgend eine andere DNA-Sequenz in einer genau definierten Art mutiert werden, vorausgesetzt die DNA-Sequenz der Gebiete, die an den zu mutierenden Ort angrenzen, ist genügend bekannt. Die Erfindung beschränkt sich nicht auf Loci, deren Sequenz bekannt ist, da die Verfügbarkeit neuer DNA-Sequenzen nur eine Frage der Zeit ist.
Obwohl die Erfindung durch Beispiele mit Tabak-Protoplasten und -Pflanzen veranschaulicht wird, können auch Protoplasten anderer, einkeimblättriger oder zweikeimblättriger Arten sowie andere Teile von Pflanzen oder Geweben, z.B. Knollenscheiben, Blattscheiben, Embryonen, Pollen, Meristeme und Ähnliches unter Verwendung dieses Verfahrens transformiert werden, vorausgesetzt sie können mit dem DNA- Transfersystem von Agrobacterium transformiert werden. Angesichts dieser Erfindung besonders interessante Pflanzengruppen schliessen die Solanaceae, Leguminosae, Umbelliferae, Cruciferae, Compositae, Alliaceae, Vitaceae, Compositae, Asparagaceae, Chenopodiacea, Liliaceae, Orchideaceae, Theacea, Coffeae, Cucurbitaceae und Ähnliches ein.
Im Prinzip könnte das natürlich vorkommende DNA-Transfersystem von Agrobacterium verwendet werden, um die Erfindung auszuführen, die Grösse der Ti- und Ri-Plasmide als Wildtypen beeinträchtigt jedoch die Handhabung der T-DNA bei Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Daher werden bei der genetischen Abänderung von Pflanzen modifizierte Agrobacterium-Vektorsysteme verwendet. Die Plasmide, die der genetischen Manipulation unterzogen werden, wurden auf eine geeignetere Grösse gekürzt. Mit diesen sogenannten Cointegrationsvektoren kann die fremde DNA (nahe bei einem Rand oder nicht, oder zwischen zwei Rändern) über kleine Plasmide, die zur Replikation in E. coli befähigt sind, mittels homologer Rekombination auf das Ti- oder Ri-Plasmid gebracht werden (Hille et al., 1983b; Barton und Chilton, 1983; Zambryski et al., 1983; Deblaere et al., 1985; Fraley et al., 1985).
Erfindungsgemäss besonders bevorzugt ist das sogenannte binäre Vektorsystem, bei dem das T-Gebiet von dem binären Vektor, einem Plasmid, das zur Replikation sowohl in E. coli wie auch in A. tumefaciens befähigt ist, getragen wird, während das Vir-Gebiet auf einem Ti- oder Ri-Helferplasmid sitzt (De Framond et al., 1983; Hoekema et al., 1983; Hoekema et al., 1984a). Das T-Gebiet enthält nun Randsequenzen, zwischen denen die zu transformierenden Gene kloniert werden können. Hier ist das Verstärkerelement neben dem rechten Rand.
Die T-DNA kann auch auf die Pflanzenzelle übertragen werden, wenn sie auf dem Chromosom von Agrobacterium liegt, vorausgesetzt die Virulenzgene sind in trans im selben Bakterium vorhanden (Hoekema et al., 1984a).
Werden mit Ti- oder Ri-Plasmide in mit Agrobacterium verwandte Bakterien wie Rhizobium (Hooykas et al., 1977) oder Phyllobacterium (Van Veen et al., 1988) eingeführt, dann wird das T-Gebiet dieser Plasmide bei der Koinkubation offenbar auch auf die Pflanzenzelle übertragen.
Das durch Agrobacterium ermöglichte System der Genlenkung kann unter anderem zur in situ-Modifikation interessierender Gene auf dem Gebiet der menschlichen Ernährung, der Lebensmittelverarbeitung, der Tiernahrung, in industriellen Anwendungen ohne Bezug zu Lebensmitteln und bei Pflanzengenen mit Bedeutung für die Überlebensfähigkeit in freier Wildbahn verwendet werden.
Die in situ-Modifikationen von Genen kann irgend einen Aspekt des Funktionierens der Gene, der Regulierung der Genexpression oder des Funktionierens von Proteinen beeinflussen.
Die Beeinflussung des Funktionierens von Genen schliesst jeden Mechanismus der vollständigen Inaktivierung von Genen (einschliesslich der Mitglieder von Multigen-Familien oder anderer Sequenzen) ein, deren Expression nicht gewünscht wird. Solche Gene können Schlüsselenzyme aus metabolischen Wegen, so dem Fettsäure- und Kohlehydratabbau oder sekundäre Wege, kodieren. Die Inaktivierung solcher Gene kann gezielte Abänderungen solcher metabolischer Wege bewirken. Solche Abänderungen können erwünscht sein, um die Bildung gesundheitsschädlicher (wie spezielle Alkabide oder Ähnliches), schlecht schmeckender oder anderweitig unerwünschter Metaboliten zu unterdrücken. Es kann sehr vorteilhaft sein, Gene zu inaktivieren, die mit der Reifung von Früchten, dem Blühen, der Pollenbildung oder Ähnlichem zu tun haben. Es können auch Gene in Pflanzen inaktiviert werden, die als Rohstoffe für die Lebensmittelverarbeitung, der Herstellung von Lebensmittelzutaten, von Pharmazeutika, oder für industrielle Zwecke verwendet werden.
Die Erfindung ist auch sehr nützlich zur Unterdrückung der Bildung von Proteinen oder Polypeptiden, die ihrerseits unerwünscht sind, so zum Beispiel wenn sie für den Menschen, Haustiere oder Vieh giftig sind, oder Ähnliches.

Regulierung der Genexpression

In einer leicht anderen Ausführungsform der Erfindung können interessierende Gene nicht vollständig inaktiviert, sondern deren Regulierung der Expression abgeändert werden. Solche Modifikationen können die nichtmodulierte Stimulierung der Expression (Überexpression), die (teilweise) Inhibierung der Expression, das Ansprechen auf bestimmte innere (Hormone, Metaboliten) oder äussere (Hitze, Kälte, Dürre, Lichtintensität, Tageslänge, Berührungsreize, Chemikalien, Pathogene) Signale beinhalten. Im Hinblick auf Einfachheit schliesst die Regulierung der Genexpression auch die Verteilung der Proteine (Transport von Proteinen zu spezifischen Kompartimenten der Zelle oder in den extrazellulären Raum) ein. Es ist bekannt, dass gewisse DNA-Sequenzen mit der nicht spezifischen Stimulation oder Inhibierung und andere Sequenzen mit der responsiven Stimulation oder Inhibierung der Genexpression zu tun haben. Viele solcher Sequenzen, wie etwa regulierende Elemente (einschliesslich Promotoren, Transkriptions- und Translationsverstärker, lichtresponsive Elemente und Ähnliches), Signalpeptide kodierende Sequenzen, Organellen-Importdomänen, Transitpeptide und Ähnliches sind einigermassen bekannt, und viele weitere werden in naher Zukunft zugänglich sein. Es wurde festgestellt, dass viele dieser Sequenzen für sich selbst eine funktionale Domäne darstellen (d.h. sie funktionieren unabhängig von anderen funktionalen Domänen), was die Möglichkeit zur Kombination bisher unbekannter Kombinationen von Domänen schafft, wodurch die Regulation beilebig abgeändert wird. Es scheint jedoch so, dass die genomische Lokalisierung in der Regulierung neu eingeführter Genkonstrukte eine wichtige Rolle spielt und manchmal andere die Genregulierung beeinflussende Faktoren völlig verdrängt. Manchmal können Gene in einem bestimmten Pflanzenwirt überhaupt nicht exprimiert werden. Das ist eines der Hauptprobleme bei der genetischen Veränderung von Pflanzen. Die vorliegende Erfindung kann bei der Lösung dieses Problems helfen, indem die Möglichkeit geschaffen wird, neu eingeführte Genkonstrukte zu genomischen Loci zu lenken, die eine irgendwie voraussagbare Art der Expression aufweisen. Es können nun zum Beispiel Gene, die Überexpression benötigen, zu genomischen Loci gelenkt werden, die als sehr aktiv bekannt sind. Um dies zu erreichen können sehr aktive Loci, wie die Loci, auf denen einige der rbcs-Gene, der Gene des Chlorophyll a/b-bindenden Proteins und Ähnliches sitzen, ausgewählt werden. Die interessierenden DNA-Sequenzen können mit ihren eigenen regulierenden Elementen wie Promotoren, Verstärkern, Transkriptions-Terminatoren und Ähnlichem eingeführt werden, oder sie können an die in dem Ziel-Locus vorhandenen Regulierelementen fusioniert werden.
Das Problem der schlechten Expression spielt auch dann eine Rolle, wenn man zur Änderung der Proteinstruktur die Struktur endogener Gene oder mit der Verteilung involvierte Domänen verändern will, ohne den genomischen Ort zu ändern. Früher wurden solche Gene isoliert und in vitro abgeändert, anschliessend unter Verwendung von üblichen Transformationstechniken wieder in das Pflanzengenom eingeführt. Hierbei wird das veränderte Genkonstrukt zufällig in das Pflanzengenom integriert, wobei es oft seine spezifische Regulierung verliert. Unter Verwendung der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Verfahren kann nun das Gen in situ verändert werden, mit einem geringen Risiko, seine Expressionsart zu beeinträchtigen.
Es kann zum Beispiel der Aminosäuregehalt des kodierten Proteins durch Insertion, Deletion und/oder Ersetzung von Aminosäuren geändert werden, nachdem ein Teil oder die gesamte für das Protein kodierende Basenpaar-Sequenz ersetzt wurde. Besonders interessierende Gene sind die Gene, die für häufige Proteine wie die Vorratsproteine von Samen, so Zein, Napin, Phaseolin, Vorrats-Albumin und Ähnliches, kodieren, deren Nährwert durch Einführung von mehr essentiellen Aminosäuren wie Lysin oder Tryptophan erhöht werden kann.
Des Weiteren kann die Erfindung beträchtliche Vorteile zeigen, wenn sie zur in situ-Modifikation von Proteinen verwendet wird, die mit Umwelteinflüssen zu tun haben. Diese Gene weisen oft sehr komplizierte Arten der Genregulierung auf, die man nicht durch Änderung des genomischen Orts des Gens stören möchte, obwohl es vorteilhaft sein könnte, das Protein selber abzuändern. Es kann zum Beispiel der Wirkungsmechanismus, die Stabilität oder Bereich von Pathogenen eines bestimmten Proteins geändert werden. Andererseits können Mutationen in ein interessierendes Gen eingeführt werden, welche eine veränderte Genexpression auf der Proteinstufe bewirken. Das kann zum Beispiel erreicht werden, indem die Verwendung der Codons geändert wird. Diese Mutationen können mittels aus dem Stand der Technik sehr gut bekannter Verfahren eingeführt werden.
Die folgenden Figuren veranschaulichen die Erfindung.

Figur 1:

Konstruktion der Plasmide pSDM4 und pSDM7, welche das intakte Kmr-Gen enthalten, das in Pflanzenzellen funktional ist. Diese Plasmide dienten als Ausgangspunkt zur Konstruktion der verschiedenen defektiven Gene (Figuren 2, 3 und 5). Die folgenden Konierungsstufen sind hier gezeigt: 1) der Transfer des BglIII/HINDIII-Bruchstücks von pMOGEN24 auf pUC12 (× BamHI × HindIII), 2) die Ersetzung des Transkriptions-Terminators des Nopalin-Synthasegens (3'NOS) durch denjenigen des Octopin-Synthasegens (3'OCS), 3) die Einführung eines synthetischen DNA-Bruchstücks (Linker) von 8 bp, das einen Xhoi-Restriktionsort beim EcoRI-Restriktionsort enthält, und 4) der Transfer des supF-haltigen Bruchstücks vom Plasmid πVX auf den BamHI-Ort von pSDM4. Die Abkürzungen und Symbole werden in der Legende erklärt.

Figur 2:

Konstruktion der defektiven Kmr-Gene 5' I, 5 II und 3' I, ausgehend vom Plasmid pSDM7. Das intakte Kmr, wie es auf pSDM7 vorhanden ist, ist linear dargestellt. Unter diesem sind die defektiven Gene mit Linien dargestellt. Die Linien zeigen, welche DNA-Sequenzen des intakten Kmr-Gens von pSDM7 in den defektiven Genen noch vorhanden sind. Das 5' I wurde erhalten, indem nach Einfüllen mit Klenow- Polymerase das XmaIII/BclI-Bruchstück durch ein Oligonucleotid von 10 bp, auf dem ein EcoRI-Ort (EcoRI-Linker) liegt, ersetzt wurde. Ersetzung des TthIII.1/BclI-Bruchstücks durch einen EcoRI-Linker (10 Basen), nach Einfüllen mit Klenow-Polymerase, ergab 5' II. Bei 3' I wurde das 3'- Gebiet des Kmr-Gens bis zum RsrII-Ort entfernt. Das supF- Gen wurde distal von der Kmr-Genmutanten kloniert. Die Abkürzungen und Symbole sind in der Legende erklärt.

Figur 3:

Klonierung der defektiven Kmr-Gene (siehe Figur 2) als XhoI/HindIII-Bruchstück in den binären Vektor pSDM5 ( × XhoI × HindIII). Auf diese Weise wurden die defektiven Gene neben das Hmr-Gen zwischen die T-DNA-Randsequenzen gelegt (siehe Figur 4). Das Plasmid pSDM5 wurde von pMOGEN24 abgeleitet, indem das SphI-Bruchstück von pMOGEN24, nach Abstumpfen der Enden mit Klenow-Polymerase, durch einen XhoI- Linker (ein synthetisches DNA-Bruchstück von 10 bp, enthaltend einen XhoI-Restriktionsort) ersetzt wurde. Siehe auch die Legende.

Figur 4:

Übersicht des T-Gebiets von Plasmid pSDM100, auf dem das intakte Kmr-Gen liegt. Darunter wird mit schwarzen Linien gezeigt, welche DNA-Sequenzen des T-Gebiets von pSDM100 auch im T-Gebiet von pSDM102 und in dem von pSDM104 vorhanden sind. Siehe auch die Legende.

Figur 5:

Konstruktion der 3'-Deletionsmutanten des Kmr-Gens, ausgehend vom Plasmid pSDM4. Ein HindIII/BamHI-Bruchstück von 75 bp mit synthetischen linken Randsequenzen vom Octopin-Typ wurde hinter dem intakten Kmr-Gen in pSDM4 eingeführt, was pSDM8 ergab. Die Sequenz des den linken synthetischen Rand enthaltenden Bruchstücks ist in Figur 6 gezeigt. Die Plasmide pSDM8* bzw. 3' IIA wurden durch Deletion eines EcoRV/BamHI- bzw. EcoRV/RsrII-Bruchstücks erhalten. Auf diese Weise kommt das intakte oder defektive Kmr-Gen zwischen Randsequenzen zu liegen. Bei pSDM9 wurde das 110 bp lange HindIII/BglII-Bruchstück aus dem Plasmid pRAL3912 (Hoekema et al., 1985) hinter dem Kmr-Gen eingefügt. Dieses Fragment enthält den Wildtyp der linken Octopin-Randsequenz. Die Plasmide pSDM9* bzw. 3' IIb wurden aus pSDM9 durch Deletion des AccI/BstEII- bzw. AccI/RsrII-Bruchstücks erhalten. Die T-Gebiete der Plasmide pSDM8*, pSDM9*, 3' IIa und 3' IIb wurden als EcoRI/HindIII-Brüchstücke auf den binären Vektor pML997 (siehe Figur 7) transferiert, was die Vektoren pSDM200, pSDM210, pSDM201 und pSDM211 ergab.

Figur 6:

Die Sequenz des synthetischen HindIII/BamHI-Bruchstücks, auf dem der linke T-DNA-Rand des Octopin-Typus liegt. Die Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsenzyme sind ober- und unterhalb der Sequenz angegeben.

Figur 7:

Konstruktion des Plasmids pLM997. Plasmid pLM997 wurde von pMOGEN24 durch Deletion des BglII-Bruchstücks, das die T- DNA trägt, und anschliessender Einführung eines sogenannten Polyklonierungsortes (eines synthetischen DNA-Bruchstücks, das mehrere Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthält) in den verbleibenden BglII-Restriktionsort abgeleitet. Die EcoRI- und HindIII-Orte, bei denen die EcoRI/HindIII-Bruchstücke der Plasmide pSDM8*, pSDM9*, 3' IIa und 3' IIb eingefügt wurden, sind mit Pfeilen angegeben.

Figur 8:

Veranschaulichung der Auffindung von Rekombinationsereignissen über Southern-Analyse und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Genomische DNA von Kmr-Pflanzenlinien, die aus den Kotransformationsversuchen erhalten worden waren, wurde mit EcoRI/BclI und HindIII abgebaut. Es sind die nach Blotting und Hybridisierung mit der 3'OCS- oder NPTII- Testsequenz aufgefundenen Bruchstücke gezeigt. Ein Bruchstück von 2,1 kb ist ein Hinweis auf das Vorhandensein eines wiederhergestellten NPTII-Gens. Abbau mit HindIII alleine erzeugt Brückenfraumente (d.h. Bruchstücke, die die Bindungsstelle zwischen Pflanzen-DNA und der integrierten Kopie der T-DNA enthalten). Die Zahl der HindIII-Bruchstücke wurde als Mass für die Zahl der T-DNA-Einschübe in das Pflanzengenom genommen.
Die PCR-Analyse unter Verwendung der Primer 2 und 3 wurde an Pflanzen durchgeführt, bei denen das EcoRI/BclII- Bruchstück nicht aufgefunden wurde. Die Primer binden sich innerhalb der Gebiete ein, die in den defektiven NPTII- Genen deletiert sind. Nur wenn ein wiederhergestelltes NPTII-Gen vorhanden ist wird ein Bruchstück von 593 bp amplifiziert. Die Primer 2 und 3 sind in der Figur durch Pfeile angegeben, die vom 5'- zum 3'-Ende zeigen.
slB = Wiederholung des synthetischen linken T-DNA-Rands; B = BclII; E = EcoRI; H =HindIII.

Figur 9:

Auffindung von Rekombinanten nach durch Agrobacterium bewirkter Transformation von Protoplasten der Ziellinie mittels des T-DNA-Konstrukts aus pSDM101, unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Es ist der Ziel-Locus der Pflanzenlinie 104(.1.6) gezeigt, da hier T-DNA-Konstrukte von pSDM100 und pSDM101 vorhanden sind. Die 20 bp langen Oligonudeotide 1 und 2, die in der PCR verwendet wurden, sind mit Pfeilen angegeben, die vom 5'- zum 3'-Ende zeigen.

Figur 10:

A. Die translationalen SSU-NPTII-Fusionskonstrukte (siehe Besipiel 9 und 11). Die Konstrukte wurden als HindIII- oder PstI/HindIII-Bruchstücke in die Polyklonierungsorte von pIC20R kloniert, was die Plasmide pNTSS1, pNTSS2, pNTSS3 und pNTSS4 ergab. pNTSS1 enthält das Fusionsgen, das aus aus der gesamten Sequenz des SSU-Klonen (HindIII-Bruchstück) besteht und hat das 1690 bp lange BamHI-NPTII-Modul aus pSDM53 beim 4. Exon eingefügt. Die kodierenden Sequenzen des SSU-Gens (Exons) sind mit Kästen angegeben, die von 1 bis 4 numeriert sind. Nichtkodierende Gebiete des Gens wie der Promotor, Introne und der Terminator sind mit einer einfachen Linie angegeben. Das Konstrukt pNTSS2 wurde von pNTSS1 abgeleitet, es fehlt ihm der Promotor und ein Teil des kodierenden Gebiets bis zum PstI-Ort (P1). Das Plasmid pNTSS3 enthält den gesamten SSU-Klonen, der das BglII/BamHI-NPTII-Modul beim 2. Exon eingefügt hat. pNTSS4 enthält das promotorlose Fusionsgen aus pNTSS3. Die Länge der Fusionsgene ist unter den Konstrukten in bp angegeben. Die Fusionskonstrukte wurden aus dem pIC-Plasmid als SalI/XhoI- Bruchstück ausgeschnitten und in die SalI/XhoI-Orte zwischen der Rändern des binären Vektors pSDM14 eingefügt, was pNTSS11A/B, pNTSS12A/B, pNTSS21A/B und pNTSS22A/B ergab. A/B gibt die Orientierung des Bruchstücks in pSDM14 an. Es ist hier nur die B-Orientierung gezeigt. Die Konstruktion von pSDM14 ist in Figur 11 gezeigt. Ü.S. = Übersteuerungssequenz.
Restriktionsorte: B1 = BamHI, B2 = BglII, E1 = EcoRI, H1 = HpaI, H3 = HindIII, K = KpnI, P1 = PstI, S1 = SalI, X1 = XhoI.
B. Das EcoRI/XmaIII-Bruchstück, das zur Konstruktion von pSDM53 verwendet wurde, war aus 2 komplementären Oligonudeotiden (I und II) zusammengesetzt. Die Sequenz des Bruchstücks ist gezeigt und die Restriktionsorte sind oberhalb der Sequenz angegeben. Die Aminosäuren des Translationsprodukts sind unter der Sequenz angegeben. Die Nummern 2 und 3 unter den Aminosäuren beziehen sich auf das zweite und dritte Codon der kodierenden Sequenz von NPTII. Am unteren Rand der Figur sind die DNA- und die Aminosäure- Sequenz der Fusionen zwischen den kodierenden Gebieten von SSU und NPTII gezeigt.

Figur 11:

Konstruktion des binären Vektors pSDM14. Siehe Beispiel 10 für die genaue Beschreibung. Siehe auch die Legende.

Figur 12:

Das Plasmid pNTSS512 enthält ein anderes T-DNA-Konstrukt, um den SSU-Locus in Tabakzellen anzusteuern. Die Konstruktion dieses Plasmids ist in Beispiel 12 beschrieben. Die Kästen 3' und 5' geben die stromabwärts und stromaufwärts liegenden nichtkodierenden Sequenzen des aux-2-Gens an. Die nichtkodierenden Sequenzen des SSU-Gens sind durch eine Linie und die kodierenden Gebiete (Exons) durch die Kästen 1 bis 4 dargestellt. Siehe auch die Legende. Restriktionsorte: B1 = BamHI, B2 = BglII, E1 = EcoRI, H1 = HpaI, H3 = HindIII, K = KpnI, P1 = PstI, S1 = SalI, X1 = XhoI.

Figur 13:

Eine allgemeine Darstellung von T-DNA-Konstrukten, die zur Lenkung von Genen verwendet werden kann. Siehe das Kapitel "Genaue Beschreibung" für die Erklärung der numerierten Kästen.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung der Erfindung, sie sind nicht zur Abgrenzung des Schutzbereichs ihrer Anwendungen gedacht.

Beispiel 1

Transformation von Tabakprotoplasten durch Kokultivierung mit Agrobacterium tumefaciens

Die Kokultivierung ist das Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, bei dem Pflanzenprotoplasten und Agrobactenum zusammen inkubiert werden und bei dem während der anschliessenden Regenerierung von Protoplast zu Kallus die Selektion auf dem T-DNA-Transfer stattfindet (Marton et al., 1979; Fraley et al., 1984).
Für die unten beschriebenen Versuche wurde das folgende Protokoll zur Kokultivierung von Tabakprotoplasten mit A. tumefaciens verwendet. Pflanzen von Nicotiana tabacum cv. petit havana SR1 wurden axenisch in Magenta-Kästen gezüchtet, die mit 50 bis 60 ml durch Daichin-Agar (0,6%) verfestigtem MS30-Medium (Murashige und Skoog, 1962; enthält 30 g Saccharose pro l) gefüllt waren. Apikale Mezisteme der Pflanzen wurden alle 5 bis 8 Wochen in frisches Medium transferiert. Protoplasten wurden aus Blättern von 5 bis 8 Wochen alten, axenisch gezüchteten Tabakpflanzen hergestellt, indem sie über Nacht bei 26ºC in 0,4 M Saccharose- Medium K3 (Nagy und Maliga, 1976), 1 % Cellulase R10, 0,1% Macerozym R10 und 0,1% MES inkubiert wurden. Die Protoplasten wurden einmal in Saccharose-Medium K3 gewaschen, mit K3-Medium, enthaltend 0,4 M Glucose (K&sub3;G), auf 1 × 10&sup5; Zellen pro ml verdünnt und in Portionen von 7 ml auf 9 cm- Petrischalen verteilt. Sie wurden vor der Kokultivierung mit den Bakterien über Nacht im Dunkeln inkubiert. Die Agrobacterium-Stämme wurden bei 29ºC in LB-Medium, enthaltend 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin, gezüchtet. Am Ende der Logphase wurden die Kulturen mit K&sub3;G-Medium verdünnt und die Bakterien wurden den Protoplasten in einem Verhältnis von ungefähr 100 Bakterien pro Protoplast zugegeben. Nach drei Tagen Kokultivation wurden die Protoplasten in Agarose-Scheiben eingebettet, indem 5 ml Protoplasten mit 5 ml 0,8% iger, Agarose vom tiefschmelzenden Typ (Sigma) in SII-Medium (Muller et al., 1983), enthaltend 0,1 M Saccharose und 0,2 M Mannit, gemischt wurden. Das Bakterienwachstum wurde durch Zugabe von Cefotaxim bzw. Vancomycin in Endkonzentrationen von 200 mg/l bzw. 100 mg/l gestoppt. Nach 10 Tagen wurde 15 ml SII-Medium, enthaltend entweder 50 mg/l Kanamycin oder 10 mg/l Hygromycin, zu den Scheiben gegeben. Von dem Moment an wurde das Medium wöchentlich wiederaufgefrischt, indem 15 ml altes Medium durch 15 ml frisches SIII-Medium (100 bis 150 mg/l Kanamycin, 20 bis 30 mg/l Hygromycin) ersetzt wurden. Dieses Medium ist mit dem SII-Medium identisch, ausser dass die Mannitkonzentration 0,1 M statt 0,2 M beträgt. Die Plattierungseffizienz wurde bestimmt, indem ein achtel Teil auf einer Agarosescheibe in flüssigem Medium ohne Selektion inkubiert wurde. Die Hormonzusammensetzung in dem K3- und SII-Medium war 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l BAP und 0,1 mg/l 2.4D. Im SIII-Medium wurde 2.4D weggelassen. Cefotaxim bzw. Vancomycin wurden bis auf Endkonzentrationen von 200 mg/l bzw. 100 mg/l zugegeben. Die Mikrokalli wurden aus den selektiven oder nichtselektiven Medium 4 bis 5 Wochen nach dem Einbetten der Protoplasten entnommen und wurden in MS30- Medium (Murashige und Skoog, 1962), enthaltend 3% Saccharose, 1,0 mg/l NAA und 0,2 mg/l BAP, transferiert und mit 0,6%igem Agar (Daichin) verfestigt. Es wurden Schösslinge auf festem MS15-Medium, enthaltend 1,5% Saccharose, 1,0 mg/l BAP und 0,1 mg/l NAA, erzeugt. Das feste Medium enthielt auch 100 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Vancomycin und zur Selektion wurde 100 mg/l Kanamycin oder 20 mg/1 Hygromycin zugegeben. Die Schösslinge wurden auf Kmr oder Hmr getestet, indem man sie auf MiS-Medium Wurzeln schlagen liess, dem 20 mg/l Hygromycin oder 100 mg/l Kanamycin zugegeben worden war.

Beispiel 2

Konstruktion defektiver NPTII-Gene

Die Konstruktion der Vektoren mit verschiedenen defektiven NPTII-Genen ging von dem binären Vektor pMOGEN24 aus (siehe Figur 1). Dieses Plasmid wurde von dem Vektor pROK1 (Baulcome et al., 1986) und enthält zwischen den Rändern des Nopalin-Ti-Plasmids pTiT37 die in Pflanzen funktionalen Gene für Kanamycin- (Kmr-) und Hygromycin- (Hmr-) Resistenz in entgegengesetzter Ausrichtung. Der Vektor pMOGEN24 wird durch übliche DNA-Rekombinationstechniken (Maniatis et al., 1982) aus pROK1 erhalten, indem das kodierende Gebiet des Hygromycin-Phosphotransferase- (Hpt-)Gens aus E. coli (Gritz et al., 1983) als BamHI-Bruchstück in den BamHI- Restriktionsort in pROK1 kloniert wird. Als Folge davon kommt die kodierende Sequenz des HPT-Gens, von 19 bp vor dem Translations-Intitiationscodon bis 20 bp hinter dem Translations-Stopcodon, zwischen dem 355 CamV-Promotor und dem Transkriptionsterminator des Nopalinsynthase-Gens zu liegen. Unmittelbar vor dem tatsächlichen Translations- Startcodon (ATG) ist ein anderes ATG-Codon vorhanden. Da dieses erste Codon die Translation von dem tatsächlichen Codon stören könnte, wurde die Sequenz dieses Codons über Oligonucleotid-Mutagenese, eine übliche DNA-Rekombinationstechnik, zu ATA geändert. Entsprechend wurden die BamHI- Orte auf beiden Seiten des HPT-Bruchstücks deletiert, indem unter Verwendung von Klenow-Polymerase eingefüllt wurde (Maniatis et al., 1982).
Das BglII/HindIII-Bruchstück aus pMOGEN24, den rechten Rand und das Kmr-Gen enthaltend, wurde auf das Plasmid pUC12 transferiert (Messing, 1983; siehe Figur 1), nachdem es mit BamHI und HindIII abgebaut worden war (Maniatis et al., 1982). Anschliessend wurde das Transkriptions-Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens durch das Terminationssignal des Octopinsynthase-Gens ersetzt. Das ergab das Plasmid pSDM2 (Figur 1) auf dem der Reihe nach angeordnet sind: 1) der rechte Rand von pTiT37 (RR), 2) das Promotor- Gebiet des Nopalinsynthase-Gens bis zu der vor dem ATG- Startcodon liegenden Base (5' NOS, Bevan et al., 1983), 3) das kodierende Gebiet des aus Tns abgeleiteten NPTII-Gens, von dem SauIIIa-Ort ±10 Basenpaare (bp) vor dem ATG-Startcodon bis zum PstI-Ort, der ±370 bp hinter dem TGA-Stopcodon (Beck et al., 1982) liegt, und 4) ein PvuII-Bruchstück von 700 bp, das das Transkription-Terminationssignal des Octopinsynthase-Gens (3'OCS, Gielen et al., 1984) enthält.
Um die Wiedereinführung des Kmr-Gens von pSDM2 oder davon abgeleiteter Mutanten in den binären Vektor zu vereinfachen wurde ein Xhoi-Linker bei dem EcoRI-Ort eingeführt (Figur 1). Das ergibt Plasmid pSDM4. Ein XhoI-Ort wurde ebenfalls in den binären Vektor pMOGEN24 eingeführt, indem ein SphI- Bruchstück durch einen Xhoi-Linker ersetzt wurde. SphI schneidet pMOGEN24 unmittelbar vor dem rechten Rand und innerhalb des kodierenden Gebiets des Kmr-Gens. Auf diese Weise wurde das Plasmid pSDM5 erhalten (Figur 3). Schlussendlich wurde, um die Isolierung der mittels Rekombination in das Pflanzengenorn integrierten T-DNA-Konstrukte über eine Lambda-Vektorbibliothek (Maniatis et al., 1982) zu ermöglichen, das sogenannte supf-Gen, das auf einem vom Plasmid πVX (Seed, 1983) abgeleiteten EcoRI-Bruchstück liegt, neben das Kmr-Gen kloniert. Unter Verwendung des sogenannten Amber/Suppressorsystems, das auch von Smithies et al. (1985) verwendet und beschrieben wurde, kann die Lambdaphagen-Bibliothek um die Bruchstücke bereichert werden, die dieses supF-Gen enthalten. Die EcoRI-Restriktionsorte auf dem supF-Bruchstück wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und anschliessend an die Ligasierung der BamHI-Linker an das Bruchstück wurde mit BamHI abgebaut. Das BamHI Bruchstück wurde in den BamHI-Ort von pSDM4 ligasiert, was das Plasmid pSDM7 ergab (Figur 1).
Die defektiven Kmr-Gene wurden von pSDM7 abgeleitet (siehe Figur 2). Als Veranschaulichung ist die Konstruktion eines der defektiven Gene, namentlich von 5' II, ausführlich unten beschrieben. Die Konstruktion anderer defektiver Kmr- Gene ist in Umrissen in Figur 2 gezeigt.
Zur Konstruktion von 5' II wurde pSDM7 mit den Restriktionsenzymen TthIII.1 und XmaIII zerschnitten, die Enden wurden durch Einfüllen mit Klenow-Polymerase stumpf gemacht und am Deletionsort wurde ein EcoRI-Linker (10 bp) eingefügt. Aufgrund dieser Modifikation wurde eine Sequenz, die für ein aktives Gebiet des NPTII-Enzyms kodiert, deletiert (Beck et al., 1982). Die Sequenz am Mutationsort wurde unter Verwendung der Dideoxy-Sequenzierungsmethode (Sanger et al., 1977) überprüft. 5' II wurde wie die anderen defektiven Kmr-Gene als XhoI/HindIII-Bruchstück in den Vektor pSDM5, der vorgängig mit XhoI und HindIII zerschnitten wor den war, kloniert. Das sich ergebende Plasmid wurde pSDM102 genannt (Figur 3, 4 und 8).
Die 3' -Mutanten, die im in Beispiel 3 beschriebenen Versuch verwendet wurden, sind in Figur 5 gezeigt. Ausgehend von dem auf Plasmid pSDM4 liegenden intakten Kmr-Gen wurden zwei Arten von Konstrukten hergestellt. Eine Art wurde erhalten, indem ein HindIII/BamHI-Bruchstück von 75 bp, das die synthetische linke Octopin-Randsequenz enthielt (Figur 6), hinter dem intakten Kmr-Gen auf pSDM4 eingefügt wurde. Das ergab Plasmid pSDM8. Die Plasmide pSDM8* bzw. 3' IIa wurden durch Deletion eines EcoRV/BamHI- bzw. EcoRV/RsrII- Bruchstücks erhalten. Dem defektiven Gen (3' IIa) fehlt ein Teil des kodierenden Gebiets des NPTII-Gens und das Transkriptions-Terminationssignal. Für die andere Art von Konstrukt wurde ein HindIII/BglII-Bruchstück, enthaltend den von dem Plasmid pRAL3912 (Hoekema et al., 1985) abgeleiteten Wildtyp der linken Octopin-Randsequenz, auf pSDM4 transferiert, das mit HindIII und BamHI abgebaut worden war. Von dem erhaltenen Plasmid pSDM9 wird das AccI/RsrII- Bruchstück, auf dem ein Teil des kodierenden Gebiets des NPTII-Gens, das Transkriptions-Terminationssignal (3'OCS) und ein Teil des HindIII/BglII-Bruchstücks aus pRAL3912 liegen, deletiert. Das ergibt 3' IIb. Ein intaktes Kmr-Gen mit der selben Randsequenz hinter dem 3'OCS wurde durch Deletion des AccI/BstEII-Bruchstücks erhalten (pSDM9*). Der Restriktionsort für BstEII liegt hinter dem Transkriptions- Terminationssignal am Ende des 3'OCS-Teils. Die Konstrukte mit einem intakten bzw. defektiven Kmr-Gen zwischen dem rechten bzw. linken Rand (pSDM8*, pSDM9*, 3' IIA bzw. 3' IIb) wurden als EcoRI/HindIII-Bruchstück auf Plasmid pLM997 (siehe Figur 7) transferiert, das vorgängig mit Eco-RI und HindIII zerschnitten worden war. Das ergab die binären Vektoren pSDM200, pSDM210, pSDM201 bzw. pSDM211. Die binären Plasmide wurden durch eine Drei-Eltern-Verschmelzung (Ditta et al., 1980) auf einen Rifampicin-resistenten (rifr) Agrobacterium-Starnm übertragen, der bereits ein Helfer-Ti-Plasmid ohne T-DNA enthielt (z.B. Hoekema et al., 1983; Deblaere et al., 1985). Die Konjuganten wurden auf LB-Agar-Medium (Maniatis et al., 1989), enthaltend 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin, selektioniert. Die Agrobacterium-Stämme wurden nach dem Plasmid, das sie enthalten, benannt.

Beispiel 3

Homologe Rekombination in Tabakprotoplasten zwischen zwei gleichzeitig eingeführten T-DNA's

Die Möglichkeit homologer Rekombination zwischen zwei T- DNAs in einer Pflanzenzelle wurde überprüft, indem Tabakprotoplasten durch gleichzeitige Kokultivierung der Tabakprotoplasten mit zwei verschiedenen Agrobacterium-Stämmen mit zwei T-DNAs transformiert wurden. Beide Stämme wurden von dem selben nicht-onkogenen Helferstamm abgeleitet, enthalten aber verschiedene binäre Vektoren. Die T-DNA jedes binären Vektors enthielt ein anderes defektives NPTII-Gen, eines mit einer Deletion im 5'-Teil des kodierenden Gebiets des Gens (pSDM102, Figur 4 und 8) und das andere mit einer Deletion im 3'-Teil des Gens (pSDM201, Figur 5 und 8). In Beispiel 2 wird die Konstruktion der verschiedenen defektiven NPTII-Gene in extenso beschrieben.
Die Tabakprotoplasten wurden gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Vefahren mit den folgenden Stämmen kokultiviert: 1) 1,5 × 10&sup6; Protoplasten mit SDM102 allein als negatives Vergleichsexperiment, 2) 1,5 × 10&sup6; Protoplasten mit SDM201 allein oder SDM211 allein als negatives Vegleichsexperiment, und 3) 1,5 × 10&sup6; Protoplasten mit sowohl SDM102 als auch SDM201 oder sowohl SDM102 als auch SDM211.
Die (Ko-)transformationshäufigkeiten der verschiedenen Konstrukte wurden in einem kleineren Vesuch bestimmt. Hier wurden 1,5 × 10&sup6; Protoplasten mit sowohl SDM102 als auch SDM200 oder sowohl SDM102 als auch SDM210 kokultiviert. Für den Stamm SDM102 wurde die Transformationshäufigkeit unter Verwendung des auf der T-DNA von Plasmid pSDM102 vorhandenen Hygromycin-Resistenzgens bestimmt. Die Stämme SDM200 bzw. SDM210 wurden verwendet, um die Häufigkeit abzuschätzen, mit der die T-DNA der Stämme SDM201 bzw. SDM211 auf Tabakzellen übertragen wurde. Die T-DNA des binären Vektors von Stamm SDM200/SDM210 ähnelt derjenigen von SDM201/SDM211, ausser dass sie zwischen der linken und rechten Rand-T-DNA ein intaktes NPTII-Genkonstrukt statt des 3'- deletierten Gens enthält. Ungefähr 5 bis 7% der Protoplasten regenerierten zu einem Kallus. Von diesen überlebenden Kalli erwiesen sich 120% als mit dem 102-Konstrukt transformiert, während für sowohl das Konstrukt 200 (= 201) als auch das Konstrukt 210 (= 211) Transformationsanteile von ±15% beobachtet wurden. Von den Kalli, die vorher schon mit einem Konstrukt (Hmr oder Kmr) transformiert worden waren, erwiesen sich ungefähr 30% als mit dem anderen Konstrukt transformiert (Hmr oder Kmr).
Bei dem Kokultivierungsversuch, bei dem Protoplasten mit einem 5' -Konstrukt (102) und einem 3' -Konstrukt (201 oder 211) kotransformiert wurden, wurde Wiederherstellung bei 1 bis 4% der kotransformierten Kalli festgestellt. Bei den negativen Vergleichsversuchen wurde nur ein Kmr-Kallus erhalten. Dieser Kallus enthielt kein wiederhergestelltes Kmr-Gen und die Nachkommenschaft dieses Kallus zeigte keine Kanamycin-Resistenz mehr. Es wurde kein deutlicher Unterschied zwischen dem 201-Konstrukt (3' mit synthetischem LR) und dem 211-Konstrukt (3' mit Wildtyp-LR) beobachtet. Die erhaltenen Kmr-Kalli wurden wie in Beispiel 1 beschrieben zu Pflanzen regeneriert. In Blattextrakten aus diesen Pflanzen konnte unter Verwendung nichtdenaturierender Gele (Platt und Yang, 1987) NPTII-Aktivität an der korrekten Stelle im Gel aufgefunden werden. Die Pflanzen wurden auch auf DNA-Stufe untersucht. Entsprechend konnte der Beweis für das Vorhandensein eines wiederhergestellten Kmr erbracht werden.
Theoretisch könnte das NPTII&sub7;gen über homologe Rekombination im bakteriellen Untergrund wiederhergestellt worden sein. Das könnte nur möglich sein, wenn der Transfer der binären Vektoren zwischen den beiden bakteriellen Stämmen stattfände. Kreuzungsversuche, die im folgenden Beispiel 4 beschrieben werden, haben diese Möglichkeit ausgeschlossen.

Beispiel 4

Der Vergleichs-Kreuzungsversuch

Um zu überprüfen, ob der Transfer der binären Vektoren zwischen Agrobacterium-Stämmen stattfindet, wurde ein Donor- und ein Empfänger-Stamm während 3 Tagen bei 28ºC koninkubiert. Insgesamt 10&sup9; Bakterien jedes Stamms wurden gemischt und auf einen Nitrocellulose-Filter getupft, der entweder auf festem LB-Medium oder auf einer Schicht von suspendierten Tabakzellen, die auffestes MS30-Medium, das 0,5 mg des Pflanzenhormons 2,4D enthielt, plattiert worden waren. Ausserdem wurden ähnliche Koinkubationen in Gegenwart des E. coli-Helferstamms RK2013 durchgeführt, der für Drei-Eltern- Verschmelzungen (Ditta et al., 1980) verwendet wird. Der Donorstamm SDM201 ist rifr und enthält den binären Vektor pSDM201, der ein bakterielles Gen für Kanamycin-Resistenz (Kmr) trägt. Der Empfängerstamm LBA285 ist ein spontaner, spectinomycin-resistenter (spcr) Abkömmling des Stamms LBA202 und enthält keine Plasmide. LBA285 verhält sich bei Konjugationsversuchen wie ein Wildtyp-Empfänger für Ti- Plasmide (Hooykaas et al., 1980). Wenn der Transfer des binären Vektors pSDM201 von SDM201 auf LBA285 stattfinden sollte, würde man spcrKmr-Kolonien auf selektiven Platten finden. Die Bakterien wurden nach der Koninkubation auf LB- Medium, das 250 mg/l Spectinomycin und 50 mg/l Kanamycin enthielt, plattiert. Resistente Kolonien wurden mit einer niedrigen Häufigkeit (0,8 × 10&supmin;&sup8;) gefunden. Diese waren keine echten Transkonjuganten, weil sie alle rifr waren. Tatsächlich ergab die Inkubation des Stamms SDM201 allein spcrrifrKmr-Kolonien mit einer vergleichbaren Häufigkeit. Daraus haben wir geschlossen, dass diese Kolonien spontane spcr-Abkömmlinge des Stamms SDM201 darstellen. Der Transfer des binären Vektors fand statt, wenn der Donor- und der Empfängerstamm zusammen mit dem E. coli-Helferstamm RK2013 (Ditta et al., 1980) koinkubiert wurden. Das bestätigte, dass die für den effizienten Transfer der binären Vektoren essentiellen Gene in den bei unseren Transformationsversuchen verwendeten Stämmen nicht vorhanden sind, sondern in trans zur Verfügung gestellt werden müssen, um die Konjugation zu erzielen. Wurde der Helferstamm RK2013 als Helfer eingesetzt, war die Transferhäufigkeit nach Koinkubation auf MS-Medium in Gegenwart von Pflanzenzellen (8 × 10&supmin;7 pro Empfänger) noch niedriger als wenn die Koinkubation auf bakteriellem (LB) Medium durchgeführt wurde (1 × 10&supmin;³ pro Empfänger).
Folglich können wir schliessen, dass die homologe Rekombination zwischen den T-DNAs tatsächlich nach der Ko-Einführung in der Pflanzenzelle stattgefunden hatte.

Beispiel 5

Southern Blot-Analyse der aus Kmr-Kalli abgeleiteten Pflanzen

Pflanzen-DNA wurde wie beschrieben (Mettler, 1987) aus noch nicht voll entfalteten Blättern im Wachstumsbereich isoliert und in einem CsCl-Gradienten gereinigt. Die Konzentration der erhaltenen DNA-Suspension wurde durch Messen der OD&sub2;&sub6;&sub0; bestimmt. Ungefähr 10 µg genomischer DNA wurde für den Abbau mit Restriktionsenzymen verwendet. Nach der Auftrennung auf einem 0,7% TBE-Agarosegel (Maniatis et al., 1989) wurde die DNA durch Kapillar-Blotting auf eine Hybond N-Membran (Amersham; Kat.-Nr. RPN.303N) übertragen und die Membran wurde gemäss dem Hybond N-Protokoll (vor-)hybridisiert. Das letzte Waschen wurde in 0,3XSSC, 0,1% SDS bei 65ºC durchgeführt. Mit [α³²P]-dCTP (spezifische Aktivität: 0,5 bis 1 × 10&sup9; dpm/µg DNA) markierte Test-DNA wurde unter Verwendung des Verfahrens mit gemischten Primern (Reagenziensatz der Boehringer Mannheim; Kat.-Nr. 10044 760) erhalten. Die chromosomale DNA, die aus den Pflanzen isoliert wurde, die aus kanamycin-resistenten Kalli regeneriert worden waren, wurde gemäss dem oben beschriebenen Verfahren analysiert.
Zur Rekonstruktion wurde chromosomale DNA, die aus zwei transgenen Pflanzen mit je einer einzelnen Kopie des 102- Konstrukts, aus einer Pflanze mit dem 100-Konstrukt und aus einer nichttransformierten N.Tabacum cv. Petit Havana SR1 isoliert worden war, verwendet.
In Figur 8 ist gezeigt, welche internen Bänder nach dem Abbau mit EcoRI und BclI zu erwarten sind. Das Konstrukt mit der 5'-Deletion (102) ergibt ein internes Band von 1,6 Kilobasenpaaren (Kb), während das intakte (korrekt wiederhergestellte) Kmr-Gen ein Band von 2,1 Kb geben sollte. Der Abbau mit Hindill gibt nur sogenannte Brückenfragmente. Enthielt die Testsequenz nur den 3'-Teil des Kmr-Gens (z.B. das PvuII-Bruchstück von 0,7 Kb mit dem 3'OCS, Gielen et al., 1983) wurden keine integrierten Kopien der 3'-Deletionsmutanten auf dem Blot beobachtet, was die Interpretation erleichterte.
Das erwartete Bruchstück von 2,1 Kb, das zu einem wiederhergestellten NPTII-Gen gehört, war in fast allen untersuchten Kmr-Pflanzen vorhanden (Figur 8). In Fällen, bei denen das Bruchstück von 2,1 Kb nicht aufgefunden wurde, konnte unter Anwendung der PCR-Analyse mittels der Primer 2 und 3 die Anwesenheit eines wiederhergestellten Gens gezeigt werden.

Beispiel 6

Konstruktion transgener Tabakpflanzen, die ein defektives NPTII-Gen als Ziel-Locus für die homologe Rekombination enthalten

Transgene Tabakpflanzen wurden erhalten, indem Blattscheiben axenisch gezüchteter Tabakpflanzen (Horsch et al., 1985) mit dem Bakterienstamm SDM104 kokultiviert wurden. Nach der Kokultivation wurden die Blattscheiben auf festes MS30-Medium, das kallusinduzierende Hormone (1,0 mg/l NAA und 0,2 mg/l BAP) und die Antibiotika Cefotaxim (200 mg/l) und Vancomycin (100 mg/l) enthielt, gegeben. Nach einer Woche wurden die Blattscheiben auf ein kallusinduzierendes Medium mit 20 mg/l Hygromycin gegeben. Resistente Kalli wurden ausgeschnitten und auf ein schösslinginduzierendes Medium (MS15, 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA, 100 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Vancomycin) gegeben. Die Schösslinge wurden ausgeschnitten und auf Hmr getestet, indem man sie auf hormonfreiem MS30-Medium mit 20 mg/l Hygromycin Wurzeln schlagen liess.
Die transgenen Pflanzen, die mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wurden auf DNA-Stufe untersucht (siehe Beispiel 5). Anschliessend wurden Pflanzenlinien ausgewählt, die ein einfaches T-DNA-Integrationsmuster aufwiesen. Die Pflanzenlinie 104(.1.6), die mit dem 104- Konstrukt transformiert ist, wurde als Azeptorpflanze für die Zielexperimente verwendet. Von dieser Linie zeigte es sich, dass sie zwei T-DNA-Kopien in invertierter Orientierung an der selben Stelle in Pflanzengenom integriert hatten (Figur 9).

Beispiel 7

Wiederherstellung eines defektiven NPTII-Gens in einer transgenen Tabakpflanze über homologe Rekombination unter Verwendung des Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers

Protoplasten der transgenen Pflanze 104.1.6 wurden mit dem Agrobacterium-Stamm SDM101 kokultiviert. Die Kokultivierungen wurden mit ungefähr 2 × 10&sup7; Protoplasten durchgeführt. Um die Transformationshäufigkeit zu bestimmen wurden 1 × 10&sup6; Protoplasten mit dem Agrobacterium-Stamm SDM100 kokultiviert. Die Kokultivierungsversuche wurden gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. In zwei unabhangigen Versuchen wurden Protoplasten der Pflanzenlinie 104 mit einem Agrobacterium-Stamm kokultiviert, der den binären Vektor pSDM101 enthielt. Das Plasmid pSDM101 enthält ein NPTII-Gen mit einer 5'-Deletion neben dem Hygromycin-Resistenzmarker (Figur 9). Die Transformationsversuche ergaben 285 bzw. 281 kanamycinresistente Kalli. Bei den meisten dieser Kalli hatte keine gezielte Genanlagerung stattgefunden. Hier nicht gezeigte Resultate legten nahe, dass das 5'-deletierte NPTII-Gen bei der Wiederherstellungs-T-DNA an ein endogenes Pflanzengen fusioniert worden war.
In neuen Veröffentlichungen über homologe Rekombination in tierischen Zellen wird die Polymerase-Kettenreaktions(PCR-)Technik verwendet, um schnell ein homologes Rekombinationsereignis aufzufinden (Kim & Smithies, 1988; Zimmer und Gruss, 1989). Wir verwendeten auch bei unseren Versuchen das PCR-Verfahren, um die Kalli der Reihe nach auf Kanamycin-Resistenz zu untersuchen; bei solchen hatte sich über homologe Rekombination ein intaktes NPTII-Gen gebildet (Figur 9). Eine PCR mit zwei Primern, die innnerhalb der entweder im Ziel-NPTII-Gen deletierten Gebiete oder im Wiederherstellungskostrukt verschmelzen, sollte nur dann eine Verstärkung (eines Bruchstücks von 979 bp Grösse) bewirken, wenn ein intaktes NPTII-Gen vorhanden ist. Auf diese Weise wurden der Reihe nach eine Gesamtzahl von 213 Kalli untersucht. Von drei Kalli zeigte es sich, dass sie PCR-positiv waren, und es wurden von diesen Kalli Pflanzen regeneriert, woraus sich die Pflanzenlinien 1, 2 bzw 3 ergaben.

Beispiel 8

Molekulare Analyse zur Auffindung von gelenkten Anlagerungsereignissen

Die chromosomale DNA der Pflanzenlinien wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Southern Blot-Verfahrens analysiert. Die DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI/BclI und Hindill zerschnitten, die Bruchstücke wurden auf Gel getrennt und anschliessend auf eine Hybond-N-Membran übertragen. Die Hybridisierung wurde mit einer internen NPTII-Testsequenz (dem XmaIII/RsrII-Bruchstück, siehe Figur 8) durchgeführt.
In der Pflanzenlinie 1 war eine der Kopien der 3'-Deletionsmutanten, die am Ziel-Locus vorhanden sind, durch die eintretende T-DNA über homologe Rekombination wiederhergestellt. Der Wildtyp der NPTII-Aktivität konnte in Blättern dieser Pflanzenlinie (Platt und Yang, 1987) aufgefunden werden, wodurch die Anwesenheit eines intakten NPTII-Gens bestätigt wurde.

Beispiel 9

Konstruktion der SSU-Fusionsgene

Um ein aktives Mitglied der SSU-Multigenfamilie zu isolieren wurde eine subgenomische Bibliothek von N. Tabacum SR1 im lambda-Phagen PDJII (Maniatis et al., 1982) konstruiert. Unter Verwendung einer Testsequenz, die spezifisch für einen SSU-cDNA-Klonen von N. Tabacum cv. petit havana SR1 ist, wurde ein Klone, der ein SSU-Gen mit drei Intronen (Mazur et al., 1985) enthält, aus dieser Bibliothek isoliert. Das aktive Gen liegt auf einem HindIII-Bruchstück von 2,4 Kb Basenpaaren. Sowohl die Restriktionskarte wie auch die DNA-Sequenz der von uns isolierten Klonen entspricht den veröffentlichten Angaben (Mazur et al., 1985). Das HindIII-Bruchstück wurde in pIC19H (Marsh et al., 1984) kloniert, was das Plasmid pSIC1 ergab. Dieses Gen wurde zur Konstruktion chimärischer SSU-NPTII-Gene verwendet (Figur 10). Dazu wurde ein NPTII-Insertionsmodul konstruiert (Klone pSDM53), indem:
a) das EcoRI/XmaII-Bruchstück von pSDM4 (siehe Figur 1), das den Promotor der Nopalinsynthase und den Anfang des kodierenden Gebiets enthält, durch ein synthetisches Eco-RI/XmaIII-Bruchstück von 51 bp (siehe Figur 10B), auf dem ein eindeutiger BamHI- und ein eindeutiger BglII-Restriktionsort liegen, ersetzt wurde.
b) beide PstI-Restriktionsorte aus der NPTII-Sequenz (Beck et al., 1982) entfernt wurden. Der PstI-Ort in dem kodierenden Gebiet wurde entfernt, indem ein G bei Position 1733 in der Tn5-Sequenz (Beck et al., 1982) durch ein A ersetzt wurde, wobei die M13/Oligonucleotid-Mutagenese (Reagenziensatz zur Mutagenese von Biorad) verwendet wurde. Entsprechend wurden keine Änderungen in der Aminosäuresequenz des NPTII-Proteins eingeführt. Der andere Psti-Ort liegt ausserhalb des kodierenden Gebiets und wurde durch Ausschneiden mit PstI, Stumpfmachen der Enden mit Klenow in Gegenwart von DCTP, anschliessendem Zerschneiden mit SmaI und Schliessen durch Ligasierung entfernt. Dadurch wurde das Bruchstück, das sich von Base 2519 bis Base 2656 in der Tns-Sequenz (Beck et al., 1982) des 3'-nichtkodierenden Gebiets deletiert.
Zur Konstruktion eines Fusionsgens wurde das BamHI-Bruchstück von 1,7 Kb des promotorlosen NPTII und der 3'-OCS- Terminator bei einem BamHI-Ort des rbcs-Gens in pSIC1 eingefügt. Das erhaltene Plasmid pnsl enthält eine translationale Fusion zwischen dem rbcs und dem NPTII im vierten Exon des rbsS-Gens.
Zur Konstruktion der anderen SSU-NPTII-Fusion im zweiten Exon wurde in pSIC1 der BamHI-Ort vom vierten Exon entfernt, indem mit Klenow-Polymerase eingefüllt wurde. Das ergab Plamsid pSIC2.
Anschliessend wurde im zweiten Exon von pSIC2 ein neuer BamHI-Ort eingeführt, wobei die M13/Oligonucleotid-Mutagenese (Reagenziensatz zur Mutagenese von Biorad) verwendet wurde. Aufgrund dessen wurde in der Sequenz von Mazur et al. (1984) bei den Positionen 1383 bzw. 1385 ein G zu einem T geändert bzw. ein A in ein C. Im erhaltenen Plasmid pSIC3 wurde das BglII/BamHI-Bruchstück von 1,7 Kb aus pSDM53 in den neuen BAMHI-Restriktionsort kloniert. Der so erhaltene Klone pNS2 enthält eine translationale Fusion zwischen dem rbcS und dem NPTII im zweiten Exon des rbcS-Gens.

Beispiel 10

Konstruktion des binären Vektors pSDM14

Das Plasmid pSDM10 (siehe Figur 7) diente als Ausgangspunkt zur Konstruktion des binären Vektors pSDM14. Es wurden synthetische Ränder und ein Bruchstück, das die Übersteuerungssequenzen enthielt, gemäss dem folgenden Verfahren auf pSDM10 übertragen. Die Übersteuerungssequenz von pTiAch5 liegt auf einem BclI/SacI-Bruchstück (14087 bis 14710, Barker et al., 1983). Dieses Bruchstück wurde in pIC20R (Marsh et al., 1984) kloniert, das mit SacI und BamHI zerschnitten worden war. Aus PIC20R wurde die "Übersteuerung" als SacI/EcoRI-Bruchstück auf pUC19 (x SacI x EcoRI) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit SacI und KpnI abgebaut und es wurde ein synthetisches Kpni/Saci-Bruchstück, das den rechten T-DNA-Rand enthält, an dieses ligasiert. Indem das erhaltene Plasmid mit HindIII und KpnI zerschnitten wurde, konnte ein HindIII/KpnI-Bruchstück, das den linken T-DNA- Rand enthielt, kloniert werden. Aus diesem Plasmid pBINSB2 wurde das EcoRI/HindIII-Bruchstück ausgeschnitten. Die Enden dieses Bruchstücks wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt, BglII-Linker wurden daran ligasiert und das Bruch stück wurde, nach Abbau mit BglII, in pSDM10 ligasiert. Auf diese Weise wurde pSDM14 erhalten.

Beispiel 11

Klonierung der rbcS-NPTII-Fusionsgene in pSDM14

Es wurden die HindIII-Bruchstücke mit den intakten Fusions genen und die PstI/ HindIII-Bruchstücke mit den promotorlosen rbcS-NPTII-Fusionen aus pnsl und pNS2 in pIC20R (Marsh et al., 1984) kloniert, wodurch die Plasmide pNTSS1, 2, 3 bzw. 4 (siehe Figur 10) erhalten wurden. Von dort wurden die Fusionsgene als Sali/Xhoi-Bruchstücke in den binären Vektor pSDM14 (Figur 11) ligasiert, der mit SalI/XhoI zerschnitten worden war.
Die erhaltenen Plasmide pNTSS11 (A/B), pNTSS12 (A/B), pNTSS21 (A/B) bzw. pNTSS22 (A/B) enthalten zwischen einem synthetischen rechten und linken Rand des Octopin-Ti-Plasmids das intakte Fusionsgen des 4. Exons, das promotorlose Fusionsgen des 4. Exons, das intakte Fusionsgen des 2. Exons bzw. das intakte Fusionsgen des 2. Exons. A und B beziehen sich auf die Orientierung des XhoI/SalI-Bruchstücks in pIC20R. In Figur 10 ist nur die B-Orientierung gezeigt. Die binären Plasmide wurden auf einen Agrobacterium-Helferstamm, der das Vir-Gebiet auf einem Helfer-Ti-Plasmid (Beispiel 2) enthält, übertragen, was entsprechend die Stämme NTSS11, NTSS12, NTSS21 und NTSS22 ergab.

Beispiel 12

Ortsspezifische Mutagenese eines der rbcS-Gene über Kokultivation der Protoplasten von Nicotiana tabacum cv. petit havana SRL mit Agrobacterium

In getrennten Transformationsversuchen wurden 10&sup7; Tabak- Protoplasten mit dem Agrobacterium-Stamm NTSS12 und dem Stamm NTSS22 kokultiviert. Diese Stämme enthalten das promotorlose rbcS-NPTII-Fusionsgen des 4. Exons bzw. das promotorlose rbcS-NPTII-Fusionsgen des 2. Exons zwischen den Rändern der auf dem binären Vektor liegenden T-DNA. As positive Vergleichsversuche wurden die Stämme NTSS11 und NTSS21 mit 10&sup6; Tabak-Protoplasten kokultiviert. Das verwendete Kokultivierungsverfahren wird in Beispiel 1 genau beschrieben. Fünf Prozent der Protoplasten regenerierten zu Kalli und aus den positiven Vergleichsversuchen wurde ersichtlich, dass 15% der Kalli transformiert worden waren. In den Kokultivierungsversuchen mit NTSS12 und NTSS22 wurden Kmr-Kalli erhalten. Die PCR-Analyse wurde auf chromosomale DNA aus den zusammengegebenen Geweben von 10 Kalli angewendet (hinsichtlich des Verfahrens siehe Lassner et al., 1989). Bei einigen Kalli hatte die transformierte DNA, welche das promotorlose Fusionskonstrukt trägt, innerhalb des Ziel-Locus rekombiniert, wodurch eine funktionale Fusion zwischen dem rbcs-Promotor und dem strukturalen Teil des NPTII-Gens entstand. Aus diesen Kalli wurden Pflanzen regeneriert und es wurde die Southern-Analyse auf DNA angewendet, die aus diesen Pflanzen isoliert worden war. Bei einigen dieser Pflanzen wurde gefunden, dass der rbcS-NPTII- Teil der T-DNA über homologe Rekombination korrekt am Ziel- Locus integriert worden war.

Beispiel 13

Ein anderes DNA-Konstrukt zum Erreichen der gelenkten Genanlagerung an den SSU-Locus

In diesem Teil wird ein anderes T-DNA-Konstrukt zum Ansteuern des SSU-Locus beschrieben (Figur 12). Im Gegensatz zu den SSU-NPTII-Fusionskonstrukten beinhaltet dieses neue Konstrukt keine translationale Fusion zwischen dem SSU-Gen und dem kodierenden Gebiet des NPTII-Gens, hat aber das kodierende Gebiet von NPTII unter dem Promotor der Nopalinsynthase beim 4. Exon des SSU-Gens eingefügt. Ein kleiner Teil des SSU-Promotors (±365 bp) ist deletiert, um die Reihenuntersuchung nach Rekombinanten über PCR zu ermöglichen. Zusätzlich ist das aux-2-Gen der T-DNA als negativer Selektionsmarker in das Konstrukt eingefügt, um rekombinante Kalli zu begünstigen. Das Produkt des aux-2-Gens verwandelt α-Naphthylacetamid (NAM) in das Auxin (NAA). Bei hoher Konzentration (10 bis 20 mg/l) ist NAM zur Anregung des Wachstums von Tabakzellen in auxinfreiem Medium befähigt. Zellen, die das aux-2-Gen enthalten, werden jedoch das NAM in das stärkere Auxin NAA, das bei höheren Konzentrationen giftig für Pflanzenzellen ist (Depicker et al., 1988), um wandeln. Es ist also möglich, nach Zellen zu selektionieren, die das aux-2-Gen nicht exprimieren, indem ein auxinfreies Medium mit einer hohen Konzentration von NAM verwendet wird.
Ein HindIII-Bruchstück der T-DNA von 2,5 Kb aus pTiAch5 (3390 bis 5933, Barker et al., 1983; Gielen et al., 1984), das das aux-2-Gen enthält, wurde in den HindIII-Ort von pIC20R (Marsch et al., 1984) kloniert. Die stromaufwärts des aux-2-Gens liegenden Sequenzen, beinhaltend den Promotor und Teile des kodierenden Gebiets des aux-1-Gens, wurden deletiert. Das wurde erreicht, indem mit PstI (im Polylinker von pIC) abgebaut wurde, durch Verwenden der Exonudeaseaktivität der "Klenow"-Polymerase stumpfe Enden gebildet wurden, mit HincII abgebaut (5721, Barker et al., 1983; Gielen et al., 1984) und das Plasmid religasiert wurde. Auf diese Weise wurden die Promotorsequenzen des aux-2- Gens intakt belassen. Anschliessend wurde das aux-2-Gen als SalI/XhoI-Bruchstück in den eindeutigen SalI-Ort von pNTSS11B kloniert. Im erhaltenen Plasmid pNTSS112 verläuft die Transkription des aux-2-Gens in Richtung des linken T- DNA-Rands.
Das Plasmid pNTSS1 wurde mit XhoI abgebaut, gefolgt von einem teilweisen Abbau mit BglII, und es wurde ein XhoI/ BglII-Bruchstück von 3,9 Kb erhalten, das den grössten Teil des SSU/NPTII-Fusionsgens abzüglich 365 bp, die von dem 5'- Ende des SSU-Promotorgebiets deletiert waren, enthielt. Dieses Bruchstück wurde in den pUC-Abkömmling pIC19H (Marsch et al., 1984) kloniert, der mit XhoI und BamHI zerschnitten worden war. Das BamHI-Insertionsmodul, das das kodierende Gebiet des NPTII und den OCS-Terminator enthält, wurde durch ein BglII/BamHI-Bruchstück ersetzt, das aus dem kodierenden Gebiet des NPTII hinter dem NOS-Promotorgebiet ohne der rechten T-DNA-Randsequenz bestand. Die Konstruktion dieses neuen Insertionsmoduls ist unten beschrieben. Im erhaltenen Plasmid pNTSS5 verläuft die Transkription des NPTII-Gens ausgehend vom NOS-Promotor in Richtung des 3'- Endes des SSU-Gens, das als Transkriptionsterminator dienen kann. Auf diese Weise kann der OCS-Terminator weggelassen werden, was eine Verringerung der Grösse des Insertionsmoduls bewirkt. Das Salilbamhi-Bruchstück aus pNTSS5 wurde isoliert und in den Vektorteil von pNTSS11I2 ligasiert, das mit SalI und BamHI zerschnitten worden war. Auf diese Weise wurde der binäre Vektor pNTSS512 erhalten, der das andere lenkende Konstrukt enthielt (siehe Figur 12).
Zur Konstruktion des neuen NPTII-Insertionsmoduls wurde das BclI/SmaI-Bruchstück von pSDM4, das den NOS-Promotor und das wiederhergestellte kodierende Gebiet des NPTII enthielt, in pIC20H (Marsch et al., 1984) kloniert, das mit SmaI und BglII zerschnitten worden war. Aus dem erhaltenen Plasmid wurde das Bruchstück mit XhoI und BamHI ausgeschnitten und wurde in pIC19R (Marsch et al., 1984) rekloniert, das mit XhoI und BamHI zerschnitten worden war. Schlussendlich wurde das neue NPTII-Insertionsmodul als BglII/BamHI-Bruchstück in pNTSS5 eingefügt.
Der binäre Vektor pNTSS512 (Figur 12) wurde über Drei- Eltern-Verschmelzung auf einen Agrobacterium-Stamm übertragen, der das Vir-Gebiet auf einem nicht-onkogenen Ti- Helferplasmid enthält (Beispiel 2).

Beispiel 14

Transformation mit dem T-DNA-Konstrukt des Plasmids pNTSS512

Tabakprotoplasten wurden mit dem Agrobacterium-Stamm NTSS512 kokultiviert. Zur Bestimmung der Regenerations- und Transformationshäufigkeiten wurden Protoplasten mit oder ohne Kanamycin wie in Beispiel 1 beschrieben regeneriert. Nichttransformierte Tabakzellen wurden auf NAM-haltigem Medium kultiviert, um die Regenerationshäufigkeit in diesem Medium zu bestimmen. In einem grosseren Versuch wurden Protoplasten mit dem Stamm NTSS512 kokultiviert und auf auxinfreiem, kanamycinhaltigem Medium, das 10 bis 20 mg/l NAM enthielt, gezüchtet. Die Integration des T-DNA-Konstruktes in das Genom der Pflanzenzellen über illegitime Rekombination ergab kanmycinresistente aux-2&spplus;-Zellen. Einige dieser Zellen waren zum Wachstum auf NAM-Medium befähigt, weil das aux-2-Gen aufgrund unvollständiger Integration der T-DNA oder Inaktivierung des Gens durch Methylierung nicht exprimiert wurde. In den Fällen, in denen der NPTII-Marker korrekt beim Ziel-Locus über homologe Integration eingefügt war, ging das aux-2-Gen verloren. Die erhaltenen Zellen waren resistent gegen Kanamycin, und das Fehlen des aux-2- Gens ermöglichte ihnen das Wachstum auf auxinfreiem Medium mit einer hohen Konzentration an NAM.
Für die kleineren Vergleichsversuche wrude geschätzt, dass 5% der ursprünglichen Protoplasten überlebten (gleichermassen für NAA- und NAM-haltiges Medium) und dass 15% der regenerierten Kalli resistent gegen Kanamycin waren. Beim grossen Anlagerungsversuch ergab die Regeneration von Protoplasten auf NAM-haltigem Medium eine 10- bis 100-fache Anreicherung an Zellen, die das aux-2-Gen nicht exprimierten. Es wurde die PCR-Technik angewendet, um die Kalli zu identifizieren, die über das erwünschte Rekombinationsereignis erhalten worden waren. Es wurde genomische DNA aus den vereinigten Geweben von 10 Kalli (Lassner et al., 1989) extrahiert und in einer PCR überprüft. Die in der Reaktion verwendeten Primer verschmolzen im kodierenden Gebiet des NPTII bzw. im stromaufwärts liegenden Gebiet des SSU- Promotors, der im T-DNA-Konstrukt pNTSS512 deletiert war. Die PCR ergibt nur dann eine Verstärkung eines Bruchstücks mit erwarteter Länge, wenn eine Rekombination zwischen eintretender T-DNA und dem Ziel-Locus stattgefunden hat. Tatsächlich wurde bei mehreren Kalli ein Rekombinationsereignis aufgefunden. Es wurden aus diesen Kalli wie beschrieben Pflanzen regeneriert und eine Southern-Analyse an diesen Pflanzen und an der Nachkommenschaft dieser Pflanzen durchgeführt. Bei einigen Pflanzenlinien wurde festgestellt, dass das NPTII-Modul korrekt über homologe Rekombination am Ziel-Locus eingefügt war. Es wurde geschätzt, dass die Genanlagerungshäufigkeit im Bereich zwischen 10&supmin;&sup4; und 10&supmin;&sup5; lag.

Hinterlegung

Zum Zwecke der Durchführbarkeit wurden die folgenden E. coli-Stämme beim "Centraal Bureau voor Schimmelcultures" in Baarn, Die Niederlande, hinterlegt: (Stamm Dh5α; Genotyp: F&supmin;, endA1, hsdR17 (r&supmin;k m&spplus;k) supE44, thi-1, lambda&supmin;, recA1, gyrA96, relA1, /\ (argF-laczya) U169, phi80dlaczl\M15).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der ein guter Empfängerstamm für alle binären Pflanzentransformations-Vektoren ist, wurde schon früher hinterlegt (24. Februar 1983) und ist unter Nummer CBS 191.83 von dem "Centraal Bureau voor Schimmelcultures" (CBS) in Baarn, Die Niederlande, erhältlich.

Legende

Liste der in den Figuren verwendeten Symbole und Abkürzungen
:Ein Kasten aus doppelten Linien bezeichnet das kodierende Gebiet des Kmr- und des Hmr-Gens (NPTII und HPT). Das nichtkodierende Gebiet ist durch einen Kasten aus einfachen Linien angegeben.
:Ein Bruchstück, das das Promotorgebiet des Nopalinsynthase-Gens (5'NOS) und die Wiederholung des rechten T-DNA-Rands des Nopalin-Ti-Plasmids beinhaltet.
:Das 3'-Gebiet des Nopalinsynthase-Gens, das das Signal für die Transkriptions-Termination (3'NOS) enthält.
:Das 3'-Gebiet des Octopinsynthase-Gens, das den Transkriptions-Terminator (3'OCS) enthält.
:Promotorgebiet des 35S-Transkripts von CaMV.
:EcoRI-Bruchstück von 210 bp, das das supf von E.coli enthält.
RR :Wiederholung des rechten T-DNA-Rands.
LR :Wiederholung des linken T-DNA-Rands.
Hmr (Gen): (Ein Gen, das) Hygromycin-Resistenz (auf Pflanzenzellen überträgt).
Kmr (Gen): (Ein Gen, das) Kanamycin-Resistenz (auf Pflanzenzellen überträgt).
KanIII: Bakterielles Kanamycin-Resistenzgen, das von Streptococcus Faecalis abgeleitet ist.
Ampr: Bakterielles Ampillicin-Resistenz-Gen
NPTII: DNA-Sequenz, die für die Neomycin- Phosphotransferase II kodiert.
HPT: DNA-Sequenz, die für die Hygromycin- Phosphotransferase kodiert.

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Claims

1. Verfahren zur Einführung einer definierten Mutation in einen ausgewählten Ziel-Locus eines nuklearen Pflanzengenoms,

bei dem mindestens ein Teil einer rekombinanten DNA durch homologe Rekombination an dem Ziel-Locus in besagtes Genom integriert wird, wobei die rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur hat,

- in der die Kästen 1 und 7 und die verbindenden Linien DNA-Sequenzen darstellen, die zur Funktion als ein T-DNA- Rand in dem DNA-Transferprozess befähigt sind,

- in der der Kasten 1 oder 7, nicht jedoch beide abwesend sein können, in der der Kasten 3 eine DNA-Sequenz umfasst, die genügend homolog zu einer DNA-Sequenz innerhalb des Ziel-Locus und genügend lang zur Bewirkung der homologen Rekombination ist,

- in der der Kasten 4 eine DNA-Sequenz darstellt, die nicht homolog zu den in dem Ziel-Locus vorkommenden Sequenzen ist und in der die Linien, welche die Kästen verbinden, eine beliebige Zahl von Basenpaaren oder kein Basenpaar darstellen können,

und bei dem die Transformanten mit der definierten Mutation in dem besagten Ziel-Locus unter Verwendung bekannter Verfahren identifiziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kästen 1, 3 und 7 sowie die Verbindungslinien wie in Anspruch 1 definiert sind,

bei dem der Kasten 4 eine DNA-Sequenz umfasst, die ebenfalls genügend homolog ist, um eine homologe Rekombination mit der entsprechenden Sequenz im Ziel-Locus zu bewirken, wodurch sie ein Teil ihrer selbst mit einer oder mehreren Mutationen integriert,

und bei dem die Linien, welche die Kästen verbinden, eine beliebige Zahl von Basenpaaren oder kein Basenpaar darstellen können.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die rekombinante Struktur die folgende allgemeine Struktur hat,

- in der die Kästen 1, 3 und 7 und die Verbindungslinien wie in den obigen Ansprüchen definiert sind,

- in der der Kasten 4 eine DNA-Sequenz darstellt, die zu den im Ziel-Locus vorkommenden Sequenzen nicht homolog ist,

- in der der Kasten 5 eine Expressionskassette darstellt, die im Wirt funktional ist und ein positives Selektionsgen enthält,

- in der der Kasten E DNA-Sequenzen umfasst, die zu den neben dem Ziel-Locus oder nahe dem Ziel-Locus im Pflanzengenom liegenden Sequenzen homolog und zur Bewirkung der homologen Rekombination genügend lang sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur hat,

- in der die Kästen 1, 3 und 7 wie in Anspruch 1 definiert sind,

- in der die Kästen 2 oder 6 eine Expressionskassette darstellen, die im Wirt funktional ist und ein negatives Selektionsgen enthält,

- in derder Kasten 2 oder 6, nicht jedoch beide abwesend sein können.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur hat,

- in der die Kästen 1 bis 7 und E sowie die Verbindungslinien wie in den obigen Ansprüchen definiert sind,

- in der der Kasten E eine DNA-Sequenz umfasst, die genügend homolog und genügend lang zur Bewirkung einer homologen Rekombination ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die rekombinante DNA die folgende allgemeine Struktur hat,

in der die Kästen 1 bis 7 und E sowie die Verbindungslinien wie in einem der obigen Ansprüche definiert sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6,

- bei Kasten 2 und Kasten 6 DNA-Sequenzen darstellen, die zum Ziel-Locus nicht homolog sind und als Füllsequenz dienen, welche die Expression der Kästen 3 und 4 nach unerwünschter Rekombination unterdrückt,

- bei dem entweder Kasten 2 oder 6, nicht aber beide abwesend sein können, und bei dem Kasten 5 fehlen kann.

8. Rekombinante DNA, die zur Intergration eines Teils ihrer selbst in das Pflanzen-Genom mittels homologer Rekombination beim Ziel-Locus befähigt ist,

in der die Kästen 1 und 7 DNA-Sequenzen darstellen, die zur Funktion als ein T-DNA-Rand in dem DNA-Transferprozess befähigt sind,

in der der Kasten 1 oder 7, nicht jedoch beide abwesend sein können,

in der die beiden Kästen 3 und 4 eine DNA-Sequenz darstellen, die genügend homolog und genügend lang zur Bewirkung der homologen Rekombination mit dem Ziel-Locus sind,

in der die DNA-Sequenzen innerhalb der Kästen dieselbe 5' zu 3'-Orientierung wie beim Ziel-Locus haben, die Reihenfolge der Kästen selber jedoch gegenüber der Situation im Ziel-Locus geändert worden sind, so dass sich die Insertion des Kastens i in den Ziel-Locus nach der homologen Rekombination ergibt, und in der die Linien, welche die Kästen verbinden, eine beliebige Zahl von Basenpaaren oder kein Basenpaar darstellen können.

9. Rekombinante DNA nach Anspruch 8, mit der folgenden allgemeinen Struktur,

in der die Kästen 1, 3, 4, 7 und i, sowie die Verbindungslinien wie in Anspruch 7 definiert sind,

in der die Kästen 2 oder 6 eine Expressionskassette darstellen, die im Wirt funktional ist und ein negatives Selektionsgen enthält,

in der der Kasten 2 oder 6, nicht aber beide abwesend sein können.

10. Rekombinante DNA nach Anspruch 9, in der das negative Selektionsgen aus der Gruppe bestehend aus dem aux-2-Gen, dem Cytochrom p450-Gen, dem Adh-Gen und dem TK-Gen ausgewählt ist.

11. Rekombinante DNA gemäss einem der Ansprüche 8 bis 10, in der das positive Selektionsgen aus der Gruppe bestehend aus dem NPTII-Gen, dem HPT-Gen und dem ALS-Gen ausgewählt ist.

12. Zur Klonierung in Bakterien geeigneter Vektor, beinhaltend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 11.

13. Vektor nach Anspruch 12, beinhaltend des weiteren

- einen Replikationsursprung, der dem Vektor die Replikation in seinen Wirten ermöglicht,

- ein funktionales Markergen, um die Selektion nach transformierten Wirten zu ermöglichen,

- einen Polylinker-Ort zur leichten Handhabung des Vektors.

14. Bakterien enthaltend einen Vektor nach Anspruch 12 oder 13.

15. Pflanzentransformations-Vektor, enthaltend ein T-DNA- Konstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 11.

16. Pflanzentransformations-Vektor nach Anspruch 15, in dem dieser Vektor ein binärer Vektor ist.

17. Agrobakterien oder damit verwandte Bakterien, enthaltend einen Pflanzentransformations-Vektor nach Anspruch 15 oder 16.

18. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen, die eine definierte Mutation oder Mutationen bei einem ausgewählten Ziel-Locus des Genoms enthalten, über homologe Rekombination, beinhaltend die Schritte

a)Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, mit Agrobacteria oder damit verwandten Arten, die einen Pflanzentransformations-Vektor enthalten, der ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 11 beinhaltet, oder

Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, wobei eine definierte Mutation gemäss der Methode eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 eingeführt wird,

b)Identifizieren der erwünschten Zellen, indem die transformierten Zellen auf DNA-Stufe unter Verwendung bekannter Verfahren auf das erwünschte Rekombinationsereignis überprüft werden.

19. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen, die eine definierte Mutation oder Mutationen bei einem ausgewählten Ziel-Locus des Genoms enthalten, über homologe Rekombination, beinhaltend die Schritte

a)Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, mit Aqrobacteria oder damit verwandten Arten, die einen Pflanzentransformations-Vektor enthalten, der ein Konstrukt nach Anspruch 9 beinhaltet, oder

Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, wobei eine definierte Mutation gemäss der Methode eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 6 eingeführt wird,

b)Selektion nach oder Anreicherung von Zellen, die unter Bedingungen, die die Selektion ermöglichen, keines der negativen Markergene exprimieren,

c)Identifizieren der erwünschten Zellen, indem die transformierten Zellen auf DNA-Stufe unter Verwendung bekannter Verfahren auf das erwünschte Rekombinationsereignis überprüft werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, beinhaltend,

- Schritt a), bei dem das Verfahren jenes von Anspruch 6 ist und eine rekombinante DNA mit einem positiven Selektionsgen verwendet wird,

- Schritt b) Selektion nach oder Anreicherung von Zellen, die unter Bedingungen, die die Selektion ermöglichen, keines der im Konstrukt vorhandenen negativen Markergene, aber das positive Selektionsgen exprimieren.

21. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen, welche eine definierte Mutation oder Mutationen bei einem ausgewählten Ziel-Locus des Genoms enthalten, über homologe Rekombination, beinhaltend die Schritte

a)Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, mit Aqrobacteria oder damit verwandten Arten, die einen Pflanzentransformations-Vektor enthalten, der ein Konstrukt nach Anspruch 8 beinhaltet, oder

Ko-Inkubieren von Pflanzenprotoplasten oder Pflanzenteilen unter transformierenden Bedingungen, wobei eine definierte Mutation gemäss der Methode des Verfahrens nach Anspruch 7 eingeführt wird, in dem die Kästen 3 und 4 eine DNA-Sequenz beinhalten, nach der, nach ordnungsgemässer homologer Rekombination, selektioniert oder überprüft werden kann,

b) Selektion nach oder Anreicherung von Zellen, die unter Bedingungen, welche diese Selektionen ermöglichen, die Kästen 3 und 4, nicht aber das negative Selektionsgen exprimieren,

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, beinhaltend anstelle des Schritts a) die folgenden Schritte,

a)Transformieren von Bakterien mit einem Vektor, der zur Replikation in den besagten Bakterien befähigt ist, wobei der besagte Vektor eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 11, oder eine rekombinante DNA wie sie in den Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wurde, einschliesst,

b)Kultivieren der besagten Bakterien in einem Medium, das das Wachstum der Bakterien und die Replikation des besagten Vektors ermöglicht,

c)Isolierung des besagten Vektors aus der Bakteriensuspension,

d)Transformieren von Pflanzen mit diesem Vektor oder einem Teil dieses Vektors unter Verwendung von Methoden der direkten DNA-Transformation,

e) dann Schritt b).

23. Verfahren nach Anspruch 19, in dem der besagte Vektor nach der Isolation von den Bakterien unter Bedingungen, die die Bindung ermöglichen, mit DNA-bindenden Proteinen inkubiert wird.