DE69733881T2

DE69733881T2 - Plastidtransformation in arabidopsis thaliana

Info

Publication number: DE69733881T2
Application number: DE69733881T
Authority: DE
Inventors: Pal Maliga; R. Samir SIKDAR; Vanga Siva Reddy
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: DE69733881D1; EP0885298A1; ATE301187T1; BR9707948A; CN1222934A; JP2000506019A; CN1114692C; EP0885298B1; AU732479B2; EP0885298A4; WO1997032977A1; US6376744B1; AU2068497A; CA2247980A1; CA2247980C

Description

Gemäß 35 U.S.C. § 202(c) wird hiermit bestätigt, dass die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika bestimmte Rechte an der hierin beschriebenen Erfindung besitzt, die teilweise mit finanzieller Unterstützung von der National Science Foundation, Förderungsnummer MCB 93-05037, ausgearbeitet wurde.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von transgenen Pflanzen. Genauer gesagt stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Transformation von Plastiden in Pflanzen der Familie der Cruciferae bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In dieser Anmeldung werden einige andere Veröffentlichungen erwähnt, um den Stand der Technik genauer zu beschreiben, auf den sich diese Erfindung bezieht. Genaue Literaturangaben finden sich am Ende der Beschreibung. Die Offenbarungen aller dieser Veröffentlichungen sind durch Verweis in der vorliegenden Beschreibung aufgenommen, als ob sie vollständig hierin ausgeführt wären.
Das Plastiden-Genom von höheren Pflanzen ist ein ringförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül mit 120–160 kb, das pro Blattzelle in 1.900–50.000 Kopien vorhanden sein kann (Palmer, 1991; Bendich, 1987). Sstabile Transformation des Tabakplastiden-Genoms (Plastom) wurde durch die folgenden Schritte erzielt: (i) Einführung von transformierender DNA, die für Antibiotikaresistenz kodiert, mithilfe des biolistischen Verfahrens (Svab et al., 1990a; Svab und Maliga, 1993) oder einer PEG-Behandlung (Golds et al., 1993; O'Neill et al., 1993), (ii) Integration der transformierenden DNA durch zwei homologe Rekombinationsvorgänge und (iii) selektive Eliminierung der Wildtyp-Genomkopien während wiederholter Zellteilungen auf einem selektiven Medium. Spectinomycinresistenz wurde als selektiver Marker verwendet und ist entweder in ribosomalen RNA-Genen des mutierten Plasmids 16S kodiert (Svab et al., 1990a; Staub und Maliga, 1992; Golds et al., 1993) oder wird durch die Expression eines gentechnisch veränderten bakteriellen aadA-Gens verliehen (Svab und Maliga, 1993). Vektoren, die aadA als selektierbares Markergen nutzen und zur Insertion von chimären Genen in die wiederholte Region eines Tabakplasmid-Genoms dienen, stehen zur Verfügung (Zoubenko et al., 1994). Die Selektion von Plastiden-Transformanten durch Kanamycinresistenz, die auf der Expression von Neomycinphosphotransferase (kan-Gen) basiert, ist schwieriger aber ebenfalls machbar (Carrer et al., 1993; Carrer und Maliga, 1995).
In Bezug auf stabile Plastiden-Transformation in höheren Pflanzen wurde bisher nur von Tabak berichtet (Zusammenfassung in Maliga, 1993; Maliga et al., 1993). Transplastomische Pflanzen anderer landwirtschaftlich und pharmazeutisch wichtiger Spezies wären aber sehr wünschenswert. Die Expression fremder Gene von Interesse in den Plastiden von höheren Pflanzen der Familie der Cruciferae weist mehrere Vorteile gegenüber der nuklearen Expression von fremden Genen auf. Dazu zählt, 1) dass die Expression von exogenen DNA-Sequenzen in Plastiden die Möglichkeit der Übertragung von transformierender DNA durch Pollen eliminiert; 2) dass hohe Werte an Proteinexpression erzielt werden können; 3) dass die gleichzeitige Expression von mehreren Genen als polycistronische Einheit möglich ist, und 4) dass Positionseffekte und das Verstummen eines Gens, die aus einer nuklearen Transformation resultieren können, eliminiert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren zur Erzeugung von stabil transformierten transplastomischen Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzen bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Keimblattzellen ausreichend lange in einem an Auxin reichen Flüssigmedium kultiviert, um eine gleichförmige Zellteilung zu stimulieren. Die Anfangskultur weist eine hohe Dichte auf (50–200 Keimblätter/20 ml). Die Keimblätter werden dann zur Zuführung von exogener transformierender DNA auf ein Agar-verfestigtes Medium übertragen. Nach der Zuführung von transformierender DNA werden die Keimblätter in geringerer Dichte (25–30/50 ml) auf ein Medium übertragen, das einen hohen Cytokiningehalt aufweist und das Selektionsmittel enthält, um die Selektion von Transformanten und die Pflanzenregeneration zu vereinfachen. Die Gegenwart von exogener DNA im Plastiden-Genom wird dann durch eine Southern-Blot-Analyse oder eine PCR bestätigt.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von transplastomischen Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzen bereit, umfassend:

a) das Kultivieren von Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen aus den Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzen in hoher Dichte in einem an Auxin reichen Flüssigmedium, das geringe Konzentrationen an Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) enthält,
b) das Übertragen der Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen auf Filterpapier auf Agar-verfestigtem Medium;
c) das Zuführen einer transformierenden DNA zu einem Plastiden-Genom innerhalb der Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen, wobei das transformierende DNA-Molekül Folgendes aufweist:
i) zahlreiche Targeting-Segmente, die aus Plastiden-DNA-Sequenzen aus dem zu transformierenden Plastiden-Genom bestehen, wobei die Targeting-Segmente homologe Rekombination der transformierenden DNA zum Plastiden-Genom erleichtern;
ii) 5'- und 3'-Regulationssequenzen, abgeleitet von Plastiden-DNA, die an ein selektierbares Markergen operabel gebunden sind, das innerhalb des Targeting-Segments angeordnet ist, wobei diese Regulationssequenzen Expression des selektierbaren Markergens und Stabilität von durch dieses kodierter mRNA erleichtern, wobei das selektierbare Markergen Resistenz gegenüber einem Selektionsmittel in den Pflanzenzellen verleiht;
iii) 5'- und 3'-Regulationssequenzen, abgeleitet von Plastiden-DNA, die operabel an Sequenzen gebunden sind, die für ein fremdes Gen von Interesse kodieren, wodurch Expression des fremden Gens von Interesse und Stabilität von durch dieses kodierter mRNA erleichtert werden; und
iv) zumindest eine Klonierstelle zur Insertion des fremden Gens von Interesse, das neben dem selektierbaren Markergen liegt, wobei die Insertion das Verleihen des selektierbaren Phänotyps und die Funktion von flankierenden Plastiden-Genen nicht stört;
d) das Übertragen von Zellen, die wie in Schritt (c) beschrieben transformiert sind, auf ein Kulturmedium mit hohem Cytokiningehalt in hoher Dichte für eine vorbestimmte Zeitdauer; wobei das Kulturmedium ein Mittel enthält, das kontinuierliche gleichförmige Zellteilung und Pflanzenregeneration fördert;
e) das Übertragen der in Schritt (d) behandelten Zellen auf ein Agar-verfestigtes Kulturmedium, das das Regenerations-fördernde Mittel und das Selektionsmittel enthält, wobei die transformierten Zellen gegenüber dem Selektionsmittel durch Expression des selektierbaren Markergens resistent gemacht werden; und
f) das Selektieren von Zellen, die transformierte Plastiden-Genome aufweisen, und das Induzieren von Pflanzenregeneration von diesen ausgehend.

Die transformierenden DNA-Moleküle der Erfindung weisen einige charakteristische Merkmale auf. Dazu gehören 1) Targeting-Segmente, die das fremde Gen von Interesse flankieren und aus Plastiden-DNA-Sequenzen von der zu transformierenden Pflanze bestehen, wodurch eine homologe Rekombination der transformierenden DNA zu einer vorbestimmten Region des Plastiden-Genoms erleichtert wird; 2) ein selektierbares Markergen, das innerhalb des Target-Segments angeordnet ist und Resistenz gegen ein Selektionsmittel verleiht; 3) 5'- und 3'-Regulationssequenzen von Plastiden-DNA, die operabel an Sequenzen gebunden sind, die für ein fremdes Gen von Interesse kodieren, wodurch die Expression der transformierenden DNA und die Stabilität der durch dieses kodierten mRNA erleichtert werden; und 4) zumindest eine Klonierstelle neben dem selektierbaren Markergen zur Insertion des fremden Gens von Interesse, das selbst nicht selektierbar ist. Da das selektierbare Markergen und das fremde Gen von Interesse einen heterologen Block aus fortlaufenden Sequenzen bilden, werden beide Gene in das Plasmiden-Genom eingebaut.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Blattzellen zuerst mit einem an Auxin reichen Medium behandelt, gefolgt von Transformation mit der transformierenden DNA und Kultivierung in Gegenwart eines hohen Cytokiningehalts und eines vorbestimmten Selektionsmittels. Zellen, die transformierte Plastiden enthalten, wer den in Gegenwart des Selektionsmittels gehalten, wodurch leichter homoplasmische Zellen erhalten werden können, aus denen dann transplastomische Pflanzen gebildet werden können.
Somit stellt die vorliegende Erfindung neue Verfahren und Zusammensetzungen zur Erzeugung von transplastomischen Pflanzen bereit. Die Gattung Arabidopsis gehört zur Familie des Senfs oder der Kreuzblütler (Brassicaceae oder Cruciferae), eine weit verbreitete Familie mit etwa 340 Gattungen und 3350 Spezies. Diese Familie ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung und umfasst Gemüsepflanzen, Ölsamen, Gewürze und einige wenige Zierpflanzen. Ein Großteil ihrer landwirtschaftlichen Bedeutung ist auf die Gattung Brassica zurückzuführen. Beispiele für Brassica spp. von wirtschaftlicher Bedeutung sind: Brassica napus (Ölsamen), Brassica juncea (Ölsamen), Brassica campestris (Ölsamen); Brassica juncea (Ölsamen), Brassica oleracea (Brokkoli, Karfiol, Kraut), Brassica nigra (schwarzer Senf) und Brassica hirta (weißer Senf).
Als Beispiel werden hierin Plastidtransformationen in Arabidopsis thaliana, einer Modellspezies für die Pflanzenforschung (Meyerowitz und Sommerville, 1994), und Brassica spp., einer wichtigen Feldfrucht, erläutert. Diese Verfahren sind auch für Transformationen von Plastiden in anderen Pflanzen der Familie der Cruciferae geeignet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der Intergation von aadA in das Arabidopsis-Plastiden-Genom (ptDNA) nach einer Transformation mit dem Plasmid pGS31A. 1A zeigt die Karte des Transformationsvektors pGS31A, die ptDNA-Region, die das eingebaute Spectinomycin-Resistenz-(aadA-) Gen (T-ptDNA) enthält, und die zugehörige Region der Wildtyp-ptDNA. 16SrDNA, rps12/7 und trnV sind Plastiden-Gene (Shinozaki et al., 1986). 1B zeigt die Regionen der ptDNA, die in den P1- und P2-Sonden enthalten sind. 1C ist ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse einer Southern-Blot-Hybridisierung zeigt, die den Einbau von aadA in das Plastiden-Genom bestätigen. Die P1-Targeting-Sequenz hybridisiert an ein 2,72-kb-Fragment in den Wildtyp-(At-) Pflanzen und an ein größeres, ein 3,82-bp-Fragment in der transplastomischen Linie (At-pGS31A-16). Man beachte die Abwesenheit des Wildtypfragments in der transplastomischen Linie. Die aadA-Sonde P2 hybridisiert nur an das größere, transplastomische Fragment.
2 ist eine schematische Darstellung der Plastiden-Transformationsvorschrift, die für Arabidopsis-Blätter verwendet wird.
3. ist eine schematische Darstellung unterschiedlicher Arbeitsvorschriften, die zur Gewinnung von fruchtbaren Arabidopsis-Pflanzen aus Keimblatt-Explantaten von Arabidopsis thaliana (RLD) mit transformierten Plastiden verwendet werden.
4 ist eine Karte der Plastiden-Targeting-Region von pGS7- und pGS85A-Plasmiden. Man beachte die einzigartige HincII-Klonierstelle im Plasmid PGS7 und die KpnI-Restriktionsstelle im Plasmid pGS85 sowie das chimäre kan-Kanamycin-Resistenzgen. Die Plastiden-Gene trnV, 16SrDNA und rps12/7 sind in Shinozaki et al., 1986 beschrieben. Der Ort und die Richtung des Transkriptionsbeginns ist durch waagrechte Pfeile angegeben.
5 ist die Sequenz der Targeting-Region des Plasmids pGS7. Die Gene, die Resistenz gegen Kanamycin oder Spectinomycin verleihen, werden in die markierte Hinc-II-Stelle insertiert.
6 ist die Sequenz der Plastiden-Targeting-Region des Plasmids pGS31A.
7 ist die Sequenz der Plastiden-Targeting-Region des Plasmids pGS85A.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Soweit bekannt ist, wurde Plastiden-Transformation bisher nur in Tabak nachgewiesen. Nun wurde eine Arbeitsvorschrift für die Transformation von Plastiden in Arabidopsis thaliana und Brassica napus entwickelt, und die Verfahren zur Schaffung dieser Transformanten sind nachstehend ausgeführt. Die Verwendung von Arabidopsis und Brassica in den folgenden Beispielen dient lediglich der Veranschaulichung der Verfahren der Erfindung. Die hierin geoffenbarten Verfahren können auch für andere Pflanzen der Familie der Cruciferae angepasst werden.
Die Plastiden von Arabidopsis thaliana wurden wie im nachstehenden Beispiel I beschrieben durch biolistische Einbringung von transformierender DNA in Blattzellen auf der Oberfläche von mikroskopischen (1 μm) Wolframpartikeln transformiert. Das transformierende Plasmid pGS31A, das für diese Versuche verwendet wird, trägt ein Spectinomycin-Resistenz-(aadA-) Gen, das von Plastiden-DNA-Sequenzen flankiert ist, um seine Insertion zwischen trnV und dem rps-12/7-Operon anzupeilen. Der Einbau von aadA durch zwei homologe Rekombinationsvorgänge mithilfe der flankierenden ptDNA-Sequenzen und selektive Amplifikation der Transplastome auf Spectinomycin-Medium ergab spectinomycinresistente Zelllinien. Regenerierte Pflanzen waren homoplasmisch in dem Sinne, dass die Plastiden-Genom-Kopien durch die transformierende DNA gleichförmig verändert worden waren. Die Effizienz der Plastiden-Transformation war mit nur 2 von 201 beschossenen Blattproben gering. Aber keine der aus den beiden Linien gebildeten 98 Pflanzen war fruchtbar.
Diese Fruchtbarkeitsprobleme waren wahrscheinlich auf die längeren Behandlungszeiträume mit 2,4-D, einem Auxin, zurückzuführen (Van der Graaff und Hooykas, 1996). Es ist möglich, dass die Fruchtbarkeitsprobleme überwunden werden können, wenn die Aussetzung gegenüber diesem Wirkstoff verkürzt wird. Aufgrund der relativ langen Wachstumsperiode von Arabidopsis thaliana, bis sie eine brauchbare Quelle für Blätter zur Transformation darstellt, sind außerdem Blätter als Gewebequelle schlechter geeignet.
Keimblätter und Blätter enthalten jeweils eine große Anzahl an Plastiden-Genom-Kopien pro Zelle. Außerdem stellen Keimblätter eine leichter verfügbare Gewebequelle dar. Demgemäß wurden Keimblattzellen wie im nachstehenden Beispiel II erläutert als Rezipienten für transformierende DNA verwendet. Keimblattzellen sind aufgrund der relativ kurzen (7 Tage) Kultivierungsdauer bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung gegenüber Blattzellen zu bevorzugen, um die Zellen für den Beschuss mit transformierender DNA herzustellen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Keimblattzellen als Zielzellen ist die schon genannte Regeneration von fruchtbaren Arabidopsis-Pflanzen aus unreifen Keimblättern in Abwesenheit von 2,4-D (Patton und Meinke, 1988). Ferner wurden Arbeitsvorschriften für die Regeneration von fruchtbaren Arabidopsis-Pflanzen aus Blattexplantaten, ebenfalls in Abwesenheit von 2,4-D, entwickelt (Lloyd et al., 1986; Van der Graaff und Hooykas, 1996).
Wie in Beispiel III beschrieben gehören Arabidopsis thaliana und Brassica napus zur selben Familie, Cruciferae, weshalb ihre Plastiden-Genome einen hohen Grad an Homologie aufweisen und im Wesentlichen identisch sind (Palmer et al., 1994). Demgemäß können Plastiden-Transformationsvektoren und Expressionskassetten, die für Arabidopsis entwickelt wurden, ohne Modifikation auch zur Plastiden-Transformation und Expression von fremden Genen in Brassica-Spezies eingesetzt werden.
Die folgenden Definitionen dienen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung:
Heteroplasmisch: bezieht sich auf die Gegenwart einer Mischpopulation von verschiedenen Plastiden-Genomen innerhalb einer einzelnen Plastide oder in einer Population von Plastiden, die in Pflanzenzellen oder -gewebe enthalten sind.
Homopolasmisch: bezieht sich auf eine reine Population von Plastiden-Genomen, entweder innerhalb einer Plastide oder innerhalb einer Population, die in Pflanzenzellen oder -gewebe enthalten ist. Homoplasmische Plastide, Zellen oder Gewebe sind genetisch stabil, weil sie nur einen Plastiden-Genomtyp enthalten. Somit bleiben sie homoplasmisch, auch nachdem der Selektionsdruck entfernt wurde, und geselbstete Nachkommen sind ebenfalls homoplasmisch. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung können heteroplasmische Populationen von Genomen, die funktionell homoplasmisch sind (d.h. nur geringe Populationen von Wildtyp-DNA oder transformierten Genomen mit Sequenzvariationen enthalten) hierin als "funktionell homoplasmisch" oder "im Wesentlichen homoplasmisch" bezeichnet werden. Diese Zell- oder Gewebearten können durch fortgesetzte Selektion auf dem nichtletalen Selektionsmedium leicht bis zur Homoplasmie gereinigt werden. Der Großteil der Samennachkommenschaft ist in Abwesenheit von Selektionsdruck aufgrund der zufälligen Sortierung von Plastiden-Genomen homoplasmisch.
Plastome: das Genom eines Plastids.
Transplastome: ein transformiertes Plastiden-Genom. Transformation von Plastiden: stabiler Einbau von transformierender DNA in das Plastiden-Genom, der an die Samennachkommenschaft von Pflanzen weitergegeben wird, welche die transformierten Plastiden enthalten.
Selektierbarer Marker: der Begriff "selektierbarer Marker" bezeichnet einen Phänotyp, der erfolgreich transformierte Organellen, Zellen oder Gewebe identifiziert, wenn ein Gen oder Allel, das für den selektierbaren Marker kodiert, in der fremden DNA enthalten ist, die für die Transformation verwendet wird.
Transformierende DNA: bezieht sich auf homologe DNA oder heterologe DNA, die von homologer DNA flankiert ist, die bei Einführung in Plastiden einen Teil des Plastiden-Genoms durch homologe Rekombination ersetzt.
Targeting-Segment: bezieht sich auf jene homologen flankierenden Regionen, die eine homologe Rekombination zwischen fremder DNA und dem Plastiden-Genom erleichtern.
Translationsfusioniert: bezieht sich auf zwei kodierende DNA-Segmente innerhalb eines Konstrukts von unterschiedlichen Quellen, die in einem Konstrukt verspleißt werden, sodass ein chimäres Protein exprimiert wird.
An Auxin reiches Kulturmedium: Pflanzengewebe-Kulturmedium, das nur Auxin oder eine Kombination aus einer hohen Konzentration an Auxin und einer sehr niedrigen Konzentration an Cytokinin enthält. Die Reaktion einer Pflanzenzelle auf ein Auxin ist spezifisch für eine vorgegebene taxonomische Gruppe. Auch wenn unterschiedliche Auxine gemeinsam verwendet werden, muss das keine zusätzlichen Wirkungen bringen. Außerdem kann die Reaktion eines Gewebes auf Auxin durch Cytokinin verändert werden. Demgemäß sollten die Art und Konzentration von Auxin für die zu transformierende Spezies empirisch bestimmt werden. Ein bevorzugtes Beispiel für ein an Auxin reiches Medium, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein C1-Medium, das 1 mg/l Auxin-1-Naphthalinessigsäure (NAA) und eine niedrige Konzentration (0,2 mg/l) Cytokinin-6-benzylaminopurin (BAP) enthält. Andere Auxine, wie z.B. Indol-3-essigsäure (IAA) und Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) können ebenfalls verwendet werden, um eine gleichförmige Zellteilung zu stimulieren.
Kulturmedium mit hohem Cytokiningehalt: wie bei an Auxin reichen Medien ist die Reaktion von Pflanzenzellen auf Medien mit hohem Cytokiningehalt je nach taxonomischer Gruppe spezifisch. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Medium mit hohem Cytokiningehalt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein C-Medium, das 1 mg/l BAP, 2 mg/l 2iP, (6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purin oder IPA, N6-(Isopentyl)adenin) und eine niedrige Konzentration der Auxin-NAA (0,1 mg/l) enthält. Ein weiteres Cytokinin, das verwendet werden kann, ist 6-Furfurylaminopurin (KIN oder Kinetin).
Die in den folgenden Beispielen bereitgestellte detaillierte Beschreibung bezieht sich auf bevorzugte Verfahren zur Herstellung und Verwendung der DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung und zur Durchführung der Verfahren der Erfindung. Alle molekularen Klonierungs- und DNA-Rekombinationsverfahren, die nicht genauer beschrieben sind, werden gemäß Standardverfahren durchgeführt, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., DNA Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) oder Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1995) allgemein dargestellt sind.
Die folgenden Beispiele dienen der genaueren Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Sie sollen den Schutzumfang der Erfindung keineswegs einschränken.
BEISPIEL I
Plastiden-Transformation in Arabidopsis-Blättern durch Selektion nach Spectinomycinresistenz
Die folgenden Materialien und Arbeitsvorschriften ermöglichen die Durchführung der Verfahren aus Beispiel I. Eine schematische Darstellung der verwendeten Verfahren ist in 2 zu finden.
Pflanzenmaterial
Als Rezipient für die Transformation wurde der Arabidopsis-Ökotyp RLD verwendet. Wie berichtet wurde, regeneriert dieser Ökotyp leicht in Kultur (Marton und Browse, 1991).
Herstellung des Vektors pGS31A
Der Arabidopsis-Plastiden-Transformationsvektor pGS31A ist in 1 dargestellt. Der direkte Vorfahre von pGS31A ist das Plasmid pGS7, ein Derivat des pBluescript- KS(+)-Phagemidvektors (Strategene). Das Plasmid pGS7 trägt ein 2 kb großes HindIII-EcoRI-Arabidopsis-ptDNA-Fragment, welches das 5'-Ende des 16S-rRNA-Gens, trnV und einen Teil des rps12/7-Operons enthält. Während der Herstellung des pGS7-Plasmids wurde die HindIII-Stelle durch Verdau mit HindIII (Stelle in 16SrDNA) und KpnI (im Vektor, mit der T4-DNA-Polymerase behandelt, um die einsträngigen Überhänge zu entfernen) und Ligation der stumpfen Enden entfernt. Der Vektor pGS31A trägt das selektierbare Spectinomycinresistenzgen (Prrn::aadA::TpsbA), das im Plasmid pZS197 vorhanden ist (Svab und Maliga, 1993). Die für aadA kodierende Region wird von einem synthetischen Promotor transkribiert, der aus dem Promotor des Tabak-rRNA-Operons besteht, das mit einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle (Prrn) fusioniert ist. Die aadA-mRNA wird durch Transkriptionsfusion von Sequenzen stromab von der kodierenden Region mit der untranslatierten 3'-Region des Tabak-Plastiden-psbA-Gens (TpsbA) stabilisiert. Das Gen in pGS31A stammt von einem modifizierten Vorfahren von pZS197, worin die Xbal-Stelle zwischen aadA und TpsbA durch Abstumpfung entfernt wurde. Das Plasmid pGS31A wurde erhalten, indem das chimäre aadA-Gen mit ECI136II (einem Isochisomer von SacI, ergibt stumpfe Enden) und BspHI (einsträngiger Überhang, der zum Erhalt von stumpfen Enden eingebracht wird) herausgeschnitten wird, und zwar zur Ligation in die einzigartige HincII-Stelle des Plasmids pGS7 zwischen trnV und dem rps12/7-Operon.
Gewebekulturmedium
Die Gewebekulturvorschriften von Marton und Browse (1991) und Czako et al. (1993) wurden angepasst. Das Arabidopsis-Gewebekulturmedium (ARM) besteht aus Derivaten des MS-Mediums von Murashige & Skoog (1962). ARM-Medium: MS-Salze, 3 % Saccharose, 0,8 % TC-Agar, 2 ml/l Vitaminlösung (100 mg myo-Inositol, 5 mg Vitamin B1, 0,5 mg Vitamin B6, 0,5 mg Nicotinsäure, 1 mg Glycin und 0,05 mg Biotin pro ml). ARMI-Medium: ARM-Medium mit 3 mg Indolylessigsäure (IAA), 0,15 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 0,6 mg Benzyladenin (BA) und 0,3 mg Isopentenyladenin (IPA) pro Liter. ARMIIr-Medium: ARM-Medium, ergänzt mit 0,2 mg/l Naphthalinessigsäure (NAA) und 0,4 mg/l IPA. Arabidopsis-Sprosseninduktions- (ASI-N1B1-) Medium: ARM-Medium, ergänzt mit 1 mg/l NAA und 1 mg/l BAP. Die Arabidopsis-Sprosse wurden auf einem ARM-Medium eingewurzelt. Arabidopsis-Einsaatkultur-(ARM5-) Medium: ARM-Medium, ergänzt mit 5 % Saccharose. Der Bestand an Pflanzenhormonen wurde sterilfiltriert und nach Autoklavierung zu dem auf 45 °C abgekühlten Medium zugesetzt.
Selektivmedien enthielten 500 mg/l Spectinomycin-HCl und/oder Streptomycinsulfat. Die Antibiotika (sterilfiltriert) wurden nach Autoklavierung zu auf 45 °C abgekühltem Medium zugesetzt.
Kultivierung von Arabidopsis-Pflanzen in einer sterilen Kultur
Zur Oberflächensterilisierung wurden Samen (25 mg) 5–7 Minuten lang in einem Eppendorf-Röhrchen unter gelegentlichem Verwirbeln mit 1 ml handelsüblichem Bleichmittel (5,25 % Natriumhypochlorit) behandelt. Die Samen wurden zusammen mit dem Bleichmittel in eine 15 ml fassende konisches Zentrifugenglas gegeben, das 10 ml 90 % Ethanol enthielt, und 5–7 Minuten lang inkubiert. Das Ethanol-Bleichmittel-Gemisch wurde abgegossen, und die Samen wurden 4-mal mit 10 ml autoklaviertem deionisiertem Wasser gewaschen und schließlich in sterilem Wasser resuspendiert (etwa 150 Samen/ml). Die resultierende Samensuspension (2 ml) wurde in 10 cm tiefe (10 mm hoch) Petrischalen gegossen, die 50 ml ARM5-Medium enthielten. Diese Samen wurden gleichmäßig verteilt, indem die Suspension gewirbelt wurde. Das Wasser wurde dann durch Pipettierung aus den Schalen entfernt. Die Samen keimten nach 10–15 Tagen Inkubation bei 24 °C, wobei die Schalen 8 Stunden lang mit kaltweißen Leuchtstoffröhren (2000 Lux) beleuchtet wurden.
Um Pflanzen mit größeren Blättern zu züchten, wurden Setzlinge einzeln auf ARM5-Schalen übertragen (10 Pflanzen pro 10 cm Petrischale) und 8 Stunden lang mit kaltweißen Leuchtstofflampen beleuchtet (Lux; 21 °C bei Tag und 18 °C bei Nacht). Die dicken, dunkelgrünen Blätter mit einer Größe von 1 cm bis 2 cm wurden nach 5–6 Wochen zum Beschießen geerntet.
Transformation und Selektion von spectinomycinresistenten Linien
Blätter (etwa 1,5 bis 30 mm lang) für die Plastiden-Transformation wurden von aseptisch gezüchteten Pflanzen geerntet. Um einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 4 bis 5 cm zu bedecken, wurden 12 bis 18 Blätter auf ein Agar-verfestigtes ARMI-Medium gegeben. Die pGS31A-Vektor-DNA wurde mithilfe des biolistischen Verfahrens auf der Oberfläche von mikroskopischen (1 μm) Wolframteilchen unter Verwendung einer heliumbetriebenen PDS1000-Partikelkanone in Blattchloroplasten eingeführt. Frische Blätter wurden mit 450 psi beschossen (Ziel 9 cm von der Berstscheibe entfernt; Position Nr. 3 von oben in der Partikelkanone). Blätter, die 4 Tage lang auf einem ARMI-Medium kultiviert worden waren, wurden mit 1100 psi beschossen (Ziel 12 cm von der Berstscheibe entfernt; Position Nr. 4 von oben in der Partikelkanone).
Das Beschießen von Blättern wurde in einem ARMI-Medium durchgeführt. Nach dem Beschießen wurden die Blätter zwei weitere Tage im ARMI-Medium inkubiert. Nach diesem Zeitraum werden die Blätter mit einem Rasierklingenblock gestanzt, um eine Reihe von parallelen Einschnitten mit einem Abstand von 1 mm zu erhalten. Schon vorher war gezeigt worden, dass mechanische Verletzungen entscheidend dafür sind, eine gleichförmige Kallusbildung in der Blattspreite zu induzieren. Die gestanzten Blätter wurden auf das gleiche Medium (ARMI) mit Spectinomycin (500 mg/ml transferiert, um eine präferenzielle Replikation von Plastiden, die transformierte ptDNA-Kopien enthalten, zu erleichtern. Das ARMI-Medium induziert eine Teilung der Blattzellen und die Bildung von farblosen, Ebryiode bildenden Kallussen. Nach 7-10 Tagen Selektion auf dem ARMI-Medium wurde die Spectinomycin-Selektion auf dem ARMIIr-Medium fortgesetzt, das normalerweise eine Ergrünung induziert. Das Spectinomycin verhindert das Ergrünen von Wildtypzellen, und nur spectinomycinresistente Zellen bildeten grüne Kallusse. Sichtbare grüne Zellcluster auf dem selektiven ARMIIr-Medium traten nach 21 bis 70 Tagen auf.
Bei 201 beschossenen Proben wurden 19 spectinomycinresistente Linien erhalten. Eine Pflanzenregeneration wurde in 14 spectinomycinresistenten Linien versucht, und 10 davon waren erfolgreich. Sprosse von den grünen Kallussen regenerierten auf dem ASI-N1B1-Medium und wurden auf einem ARM-Medium eingewurzelt.
In Tabelle 1 ist die Gewinnung von spectinomycinresistenten Zelllinien nach einer biolistischen Anlieferung des Plasmids pGS31A zusammengefasst.
Tabelle 1: Gewinnung von spectinomycinresistenten Linien nach dem Beschuss von A. thaliana mit dem Plasmid pGS31A

¹ Die Kontrollschalen wurden nicht beschossen.
² psi = Pfund pro Quadratzoll, der Wert der Berstscheibe.

Southern-Hybridisierungsanalyse der gesamten zellulären DNA zur Verifizierung der Plastiden-Transformation
Spectinomycinrsesistenz kann auf die Expression von aadA in Plastiden (Svab und Maliga, 1993), die Expression von aadA im Kern (Svab et al., 1990b) oder auf eine spontane Mutation (Fromm et al., 1987; Svab und Maliga, 1991) zurückzuführen sein. Eine Southern-Hybridisierung wurde durchgeführt, um Plasten-Transformanten in spectinomycinresistenten Linien isoliert zu identifizieren. Die gesamten zelluläre DNA wurde gemäß Mettler (1987) isoliert: Mit Restriktionsenzymen verdaute DNA wurde einer Elektrophorese in 0,7 % Agarosegelen unterzogen und auf eine Nylonmembran (Strategene) transferiert. Blots wurden unter Verwendung eines Schnellhybridisierungspuffers (Amersham) mit ³²P-markierten Sonden sondiert, die durch Polypriming erhalten werden (Boehringer-Mannheim). Als die Targeting-ptDNA als Sonde verwendet wurde, war in den Linien AT-pGS31A-2 und AT-pGS31A-16 das 3,82 bp umfassende transgene Fragment das einzige detektierte Fragment, das da rauf hinwies, dass die Wildtyp-DNA-Kopien während der Zellteilungen auf dem selektiven Medium selektiv ausverdünnt worden waren. Das gleiche transgene Fragment hybridisierte auch mit der aadA-Sonde (1C).
Von den 19 spectinomycinresistenten Linien wurden 17 Kerntransformanten durch ein Wildtypfragment auf Southern-Blots identifiziert, wenn sie mit der Targeting-ptDNA-Sonde hybridisiert wurden. Es gilt anzumerken, dass die verwendeten Southern-Blots für die Blatt-ptDNA mit hoher Kopienzahl (10.000 pro Zelle) optimiert wurden und bei wenigen nuklearen aadA-Kopien kein Signal ergeben würden.
Bei spontanen Mutanten wird ein Wildtyp-ptDNA-Targeting-Fragment auf Southern-Blots und kein PCR-amplifizierbares aadA-Gen erwartet. In der Probe mit 19 spectinomycinresistenten Linien traten keine solchen spontanen Mutanten auf.
PCR-Amplifizierung von insertierten aadA-Sequenzen
DNA wurde gemäß herkömmlichen Arbeitsvorschriften amplifiziert (1 min bei 92 °C, 1,5 min bei 58 °C, 1,5 min bei 72 °C, 30 Zyklen). Spectinomycinresistenz als Ergebnisse von aadA-Expression kann durch eine PCR-Amplifikation eines 407 Nucleotide umfassenden internen Segments unter Verwendung der folgenden Primer verifiziert werden:
5'-GGCTTGATGAAACAACGCGG-3'
5'-CCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAG-3'
Transplastomische Arabidopsis-Pflanzen
Während die transplastomischen Arabidopsis-Pflanzen alle blühten, produzierte keine nach einer Selbstung oder nach einer Befruchtung mit Pollen von Wildtyp-Pflanzen Samen. Dazu gehörten 98 Pflanzen, die aus den beiden Linien regeneriert wurden, worin die Spectinomycinresistenz auf eine Plastiden-Transformation zurückzuführen war, und 66 Pflanzen, die aus 12 Linien regeneriert wurden, worin die Spectinomycinresistenz auf die Expression von aadA im Kerngenom zurückzuführen war.
Schlussfolgerungen und Ausblick
In der vorliegenden Erfindung wird eine Plastiden-Transformation in der Modellspezies Arabidopsis thaliana beschrieben, die einen wichtigen landwirtschaftlichen Durchbruch darstellt. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse zeigte sich, dass ein chimäres aadA-Gen, wenn es in die Arabidopsis-ptDNA-Targetin-Kassette insertiert wird, nach einer biolistischen Anlieferung der transformierenden DNA zur Gewinnung von Plastiden-Transformanten geeignet waren. Die Anzahl an Arabidopsis-Plastiden-Transformanten war mit etwa 1 von 100 jedoch deutlich geringer, als aufgrund der Transformation von Tabak-Plastiden erwartet worden war, die im Durchschnitt einen Transformanten pro beschossener Probe ergibt (Svab und Maliga, 1993; Zoubenko et al., 1994). Es könnte mehrere Gründe für die relativ geringe Transformationseffizienz geben. Inhärente, Speziesspezifischen Unterschiede, wie etwa ein relativ ineffizientes homologes Rekombinationssystem in Arabidopsis-Chloroplasten, könnten einen offensichtlichen Grund darstellen.
Im Tabakvektor pZS197 ist aadA von 1,56- und 1,29-kb-ptDNA flankiert und ergibt 1 Transformanten pro Beschuss (Svab et al., 1993). Im Plasmid pRB15, auch ein Tabakvektor, ist aadA von größeren Targeting-Segmenten, 1,56-kb- und 3,6-kb-ptDNA, flankiert und ergibt etwa 5 Plastiden-Transformanten pro Beschuss (Bock und Maliga, 1995). Im Arabidopsis-Vektor pGS31A ist aadA auf beiden Seiten von einer Plastiden-Targeting-Sequenz mit nur etwa 1 kb flankiert. Folglich könnte die Effizienz der Plastiden-Transformation in Arabidopsis deutlich verbessert werden, indem die Größe des Targeting-ptDNA-Fragments gesteigert wird.
Im Gegensatz zu Tabak, bei dem die meisten aus Blättern regenerierten Pflanzen fruchtbar sind, zeigte sich überraschenderweise, dass keine der 164 regenerierten Arabidopsis-Pflanzen Samen produzierte. Der Mangel an Fruchtbarkeit könnte teilweise auf die extensive Polyploidie von Blattgewebe zurückzuführen sein, wie von Galbright et al. (1991) und Mearagno et al. (1993) berichtet wurde. Ein weiterer Grund für die fehlende Fruchtbarkeit könnte die längere Aussetzung der Kulturen gegenüber 2,4-D sein (Van der Graaff und Hooykaas, 1996).
BEISPIEL II
Plastiden-Transformation in Arabidopsis-Keimblättern durch Selektion auf Kanamycinresistenz
Eine Plastiden-Transformation in Arabidopsis thaliana wurde wie in Beispiel I beschrieben durch Selektion auf Spectinomycinresistenz in Blattkulturen nach dem Beschuss mit DNA-beschichteten Wolframteilchen durchgeführt. Die Plastiden-Transformation war zwar erfolgreich, aber die regenerierten Pflanzen waren nicht fruchtbar. Diese Hindernisse wurden überwunden, indem bestimmte Parameter der Transformationsvorschrift geändert wurden.
Die entwickelte und in diesem Beispiel dargelegte Arbeitsvorschrift wies die folgenden Hauptmerkmale auf: (1) Keimblätter, die durch Keimen von reifen Samen erhalten wurden, sind aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und der Einfachheit, mit der große Mengen steriler Keimblätter aus oberflächensterilisierten Samen erhalten werden können, von Vorteil. (2) Die Arbeitsvorschrift umfasst zwei separate Schritte. Der erste Schritt umfasst die Verwendung eines an Auxin reichen Mediums, um eine gleichförmige Zellteilung im gesamten Keimblatt zu induzieren (Stufe I), und der zweite Schritt umfasst die Verwendung eines Mediums mit hohem Cytokiningehalt, um die Pflanzenregeneration zu induzieren (Stufen II und III). Die Arbeitsvorschrift wurde entwickelt, um die Exposition gegenüber 2,4-D während der Gewebekultivierung zu minimieren, oder vorzugsweise diese Exposition vollständig zu eliminieren. (3) Eine anfängliche Kultivierung der Keimblattzellen in hoher Dichte, d.h. 50–200 Keimblätter/20 ml in einem flüssigen Kulturmedium während der ersten 8 Tage (Stufe I, II), erwies sich als wesentlich für eine spätere starke Pflanzenregeneration.
Die Arbeitsvorschrift für die Plastiden-Transformation in Arabidopsis unter Verwendung von Keimblättern als Zielgewebe und Kanamycinresistenz als selektiver Marker wurde wie folgt umgesetzt. Das chimäre kan-Gen stammt vom Plasmid pTNH7, einem pUC118-Derivat, das für Neomycinphosphotransferase (NPTII), ein Enzym, welches das Kanamycinantibiotikum enzymatisch inaktiviert, kodiert. Das gleiche chi märe kan-Gen wurde in einem Tabak-Targeting-Plasmid (Plasmid pTNH32) für eine direkte Selektion von Plastiden-Transformanten in Tabak verwendet (Carrer et al., 1993). Die Herstellung des kan-Gens wurde an derselben Stelle genauer beschrieben. Das Plasmid pGS85A wurde erhalten, indem kan aus pTNH7 als SacI/PstI-Fragment herausgeschnitten, abgestumpft und das Fragment in die HincII-Stelle des Plasmids pGS7 kloniert wurde (4). Das kan-Gen in pGS85A, als aadA im Plasmid pGS31A, wird in einer PrrnTTpsbA-Kassette exprimiert. Die fünf N-terminalen Aminosäuren der stark exprimierten rbcL-Kodierregion wurden mit dem Neomycinphosphotransferase-N-Terminus translationsfusioniert. Diese Translationsfusion in Tabak führt zur Anhäufung von NPTII in einer 10-mal höheren Konzentration als bei identischen Konstrukten ohne das N-terminate rbcL-Segment. Die DNA-Sequenz von pGS85A, einschließlich jener des chimären kan-Gens, ist hierin dargelegt.
Zuerst wurde die Samenproduktion in Pflanzen getestet, die mithilfe der Gewebekulturvorschrift regeneriert wurden. Die Selektion von kanamycinresistenten Klonen nach dem Beschuss mit DNA-beschichtetem Wolfram wurde danach beurteilt. Diese Verbesserungen des Verfahrens eigenen sich für die Gewinnung von fruchtbaren, transformierten Arabidopsis-Pflanzen. Die folgenden Materialien und Arbeitsvorschriften wurden bei der Umsetzung der Verfahren des Beispiels II verwendet.
Samenkeimung
Arabidopsis-thaliana-Samen des Ökotyps RLD wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Bleichmittels (5 % Natriumhypochlorit) 5 Minuten lang oberflächensterilisiert, gefolgt von einer 5-minütigen Behandlung mit 95 % Ethanol. Ein Tropfen Triton X-100 wurde zum Bleichmittel zugesetzt, um die Oberfläche der Samen während des Sterilisationsvorgangs zu benetzen. Nach der Sterilisation wurden die Samen 5–6 Mal mit sterilem deionisiertem Wasser gewaschen. Die Samen wurden auf einem GM-Medium in 10 cm hohen Petrischalen zum Keimen gebracht. Siehe Tabelle 2. Die Petrischalen wurden 8 bis 9 Tage lang in einer Percival-Wachstumskammer bei 23 °C und Dauerlicht inkubiert. Tabelle 2: Zusammensetzung des Samenkeimungs-(GM-) Mediums

Medium Konzentration (mq/l)

MS-Basissalze 0,5 ×

myo-Inositol 100

Thiamin 0,1

Pyridoxin 0,5

Nicotinsäure 2,0,5

Glycin 2,0

Saccharose 30 g/l

pH 5,8

Literaturverweis: van der Graaff und Hooykaas, 1996.
Gewebekulturmedium und Kultivierungsbedingungen
Die Zusammensetzungen der Gewebekulturmedien, die für die Stufen I, II und III der Selektionsvorschrift verwendet wurden, sind in Tabelle 2 und 3 zusammengefasst. Flüssigkulturen für die Stufe I und Stufe II wurden hergestellt, indem zumindest 50 bis 2000 Keimblätter aseptisch in einer Petrischal (100 mm × 20 mm) transferiert wurden, wobei jede Schale etwa 20 ml Medium enthielt. Die Petrischalen wurden bei 23 °C und 60 U/min auf einem Rotationsschüttler G10 von New Brunswick inkubiert und 16 Stunden lang mit kaltem fluoreszierendem Licht bestrahlt. In Stufe III wurden die Keimblätter auf einem Agar-verfestigten (0,8 % DC-Agar, JRH Bioschiences) Medium mit etwa 25–30 Keimblättern pro Petrischale (100 mm × 20 mm) in 50 ml Medium inkubiert. Die Kulturen wurden wie für Stufe I und II beschrieben beleuchtet.
Regenerierte Pflanzen wurden direkt auf ein GM-Medium in Magenta Boxen mit Belüftungsöffnungen für den Gasaustausch transferiert. Die Pflanzen in den Magenta Boxen wurden bei 23 °C im Kulturraum inkubiert, und 16 Stunden lang mit kaltem fluoreszierendem Licht beleuchtet. Die Pflanzen blühten und produzierten Samen in den Boxen.
Die für Beispiel I beschriebenen Verfahren wurden modifiziert, um fruchtbare Arabidopsis-Pflanzen mit transformierten Plastiden-Genomen zu erzeugen. Drei unterschiedliche Gewebekulturstufen wurden verwendet, um Plastiden-Transformation zu erreichen. Stufe I: Flüssigkultur, in einem an Auxin reichen Kulturmedium, um eine gleichförmige Zellteilung zu stimulieren. Stufe II: Flüssigkultur, in einem an Cytokinin reichen Medium, um Pflanzenregeneration aus den transformierten Zellen zu induzieren. Stufe III: Kultur auf einem Agar-verfestigten Medium, das hohe Konzentrationen an Cytokinin enthielt, ebenfalls um Pflanzenregeneration zu induzieren.
Eine schematische Darstellung der zur Identifikation der besten Arbeitsvorschriften zur Gewinnung von fruchtbaren Plastiden-Transformanten ist in 3 zu sehen. Um eine gleichförmige Zellteilung in einer Flüssigkultur zu induzieren, wurden vier Medien, C1 (van der Graaff und Hooykaas, 1996), ARM I (Marton und Browse, 1991), R3 und PG1 (Feldmann und Marks, 1986; berichtet über die Induktion von Kallus- und/oder somatischer Keimlingsentwicklung in Arabidopsis) verwendet. Die Behandlung der Stufe I wurde kurz gehalten (2 Tage), um den üblichen Zeitpunkt der Übertragung der Explantate auf ein selektives Medium nach dem Beschuss anzupassen und die Nebenerscheinungen von 2,4-D, wenn überhaupt eingesetzt, zu minimieren. Die Zusammensetzung des in Stufe I verwendeten Gewebekulturmediums ist in der nachstehenden Tabelle 3 zu sehen.
Tabelle 3: Zusammensetzung des Gewebekulturmediums der Stufe I*

* Alle Komponenten sind in mg/l angegeben. Literaturverweise: ARM1, Marton und Browse, 1991; C1, van der Graaff und Hooykaas, 1996; R3 und PG1, Feldmann und Marks (1986).

Für die Kultur der Stufe II wurde nur ein Medium (A, Tabelle 4) verwendet. Dieses Medium war effizient zur Induktion von Pflanzenregeneration aus unreifen Keimblättern (Patton und Meinke, 1988). Die Keimblätter der Stufe II wurden insgesamt 6 weitere Tage in hoher Dichte in einer Flüssigkultur gehalten.
Für die Kultur der Stufe III wurden die Keimblätter in vier Arten von Agar-verfestigten Regenerationsmedium transferiert. Dazu gehören das A-Medium, das für die Pflanzenregeneration aus unreifen Keimen entwickelt wurde (Patton und Meinke, 1988); das B-Medium, das für die Pflanzenregeneration aus Wurzelexplantaten entwickelt wurde (ARMII; Marton und Browse, 1991); das C-Medium, das hierin entwickelt wurde; und das D-Medium, bei dem es sich um ein Keiminduktionsmedium für Wurzeln (ARMI; Marton und Browse, 1991) und Blattexplantante (Beispiel I) handelt.
Tabelle 4: Pflanzenregenerationsmedien der Stufe II und Stufe III
Alle Komponenten sind in mg/l angegeben. Das A-Medium basiert auf Patton und Meinke, 1988; das B-Medium ist das gleiche wie ARMII in Marton und Browse, 1991; das hierin entwickelte C-Medium basiert auf dem A- und D-Medium; das D-Medium ist das gleiche wie das ARMI-Keiminduktionsmedium in Marton und Browse, 1991.
Pflanzenregeneration und Prüfung der Fruchtbarkeit
Während der ersten 2 Tage der Kultivierung der Stufe I blieben die Keimblätter in allen vier Medien grün und wurden etwas größer. Nach 2 Tagen im Kallus-/Keiminduktionsmedium wurden die Keimblätter für die Stufe II von allen vier Medien in das flüssige A-Regenerationsmedium transferiert. Nach 3 Tagen Kultivierung im A-Medium traten erste grüne Kallusse auf, und am 7. Tag waren auf den gesamten Keimblättern Kallusse vorhanden. An diesem Punkt wurden die Kulturen in das halbfeste Medium der Stufe III transferiert, das Keimlings-/Sprossenwachstum fördert. Kallusse vom Medium 1 (ARMII) und 2 (C1) waren grün. Die Entwicklung von Jungpflanzen aus diesen Explantaten wurde am 21. Tag der Kultivierung beobachtet. Kallusse von Medium 3 (R3) und 4 (PG1) waren ebenfalls grün, aber sehr kompakt. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die hohe Konzentration von 2,4-D im Medium der Stufe I. Erst nach 30 Tagen tauchten einige wenige Jungpflanzen in diesen Kulturen auf. Die Pflanzen aller Kulturen wurden in ein hormonfreies GM-Medium transferiert, sobald sie 5–10 mm groß waren.
Die in 3 skizzierten Arbeitsvorschriften wurden auf zwei Ebenen bewertet: gleichförmige Induktion von Zellteilung und Sprossenregeneration aus den Keimblättern; und Produktion von lebensfähigen Samen auf den regenerierten Pflanzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. In Bezug auf das erste Kriterium war die beste Kombination 2AC, d.h. ein C1-Medium in Stufe I und ein C-Medium in Stufe III, wobei diese Behandlungen in einer starken Sprossenregeneration resultierend, die auf allen Explantaten zu beobachten war. Die zweitbeste Kombination war 1AC (35 von 40 Explantaten bildeten Sprosse), mit ARM1 in Stufe 1 und Medium C in Stufe III. Kombinationen mit Medium 3 und 4 in Stufe I führten zu sehr schlechten Ergebnissen, wobei nur ein sehr geringer Teil der Keimblätter Sprosse bildete.
In Bezug auf die Bildung von lebensfähigen Samen produzierten alle außer einer der regenerierten Pflanzen lebensfähige Samen. Siehe Tabelle 5. Am wichtigsten ist, dass in den beiden Kombinationen (2AC und 1AC), bei denen eine starke Sprossen regeneration zu beobachten war, keine Nebenwirkungen auf die Fruchtbarkeit auftraten.
Tabelle 5 Samenproduktion in Magenta Boxes auf Arabidopsis-thaliana-RLD-Pflanzen, die durch die in Fig. 3 schematisch dargestellten Plastiden-Transformationsvorschriften regeneriert wurden
Selektion von Plastiden-Transformanten durch Kanamycinresistenz
Die Expression von für kan kodierender Neomycinphosphotransferase (NPTII) verleiht Resistenz gegen Kanamycin, wenn sie in den Arabidopsis-Kern eingebracht wird. Gentechnisch hergestellte Formen von kan wurden extensiv erwendet, um nukleare Transformanten in Arabidopsis zu erhalten, siehe Valvekens et al., 1988, und Brassica, siehe Radhe et al. 1992. Das kan-Gen wurde in einen Plastiden-Marker für die Selektion von Plastiden-Transformanten in Tabak umgewandelt (Carrer et al., 1993). Wie in Beispiel I dargelegt wurden Arabidopsis-Plastiden-Transformanten durch Selektion auf Spectinomycinresistenz selektiert, die durch aadA in der Tabak-Prrn/TpsbA-Kassette verliehen wird. Prrn ist ein Promotor vom Plasmiden-rRNA-Operon und TpsbA enthält die 3'-untranslatierte Plastiden-psbA-Gen-Region, die zur Stabilisierung von chimären Plastiden-mRNAs erforderlich ist (Svab und Maliga, 1993). Ein Kanamycinresistenz-Markergen kann durch die Expression von kan in der Prrn/Tpsba-Kassette erhalten werden. Ein geeigneter Kanamycinresistenz-Plastiden-Transformationsvektor von Arabidopsis und Brassica ist der pGS85A-Vektor, der das chimäre Kanamycingen vom Plasmid pTNH32 trägt (Carrer et al, 1993). Die Insertionsstelle in pGS85A ist die Hinc-II-Stelle in der intergenischen trnV/rps12/7-Region. Aber auch andere intergenische Regionen im Plastiden-Genom können als Ziel dienen, wenn beispielsweise sichergestellt werden soll, dass das eingeführte Transgen die Expression der flankierenden Plastiden-Gene nicht stört.
Die Plastiden-Transformation kann gemäß der oben dargelegten 1AC- oder 2AC-Gewebekulturvorschrift durchgeführt werden. Um ein geeignetes Zielgewebe für die Transformation herzustellen, werden Keimblätter von 8–9 Tage alten Setzlingen in einem flüssigen ARM1- und C1-Medium von den Setzlingen abgeschnitten und zwei Tage lang wie in der 1AC- und 2AC-Vorschrift vorgegeben kultiviert (3). Nach zwei Tagen werden die Keimblätter auf Filterpapier (Whatman Nr. 4) auf Agar-verfestigtes nichtselektives Medium mit identischer Zusammensetzung transferiert. Etwa 50 bis 70 Keimblätter sind erforderlich, um eine 3 cm² große Fläche zu bedecken. Die Keimblätter werden dann mit dem Plasmid pGS85A, einem transformierenden Arabidopsis-Kanamycinresistenz-Vektor, beschossen. Die Plasmidherstellung, die Beschichtung von Wolframteilchen und das Beschießen sollten wie für Tabak beschrieben durchgeführt werden (Maliga, 1995). Für die Phänotypausprägung können die Keimblätter zwei Tage lang in den gleichen Schalen gelassen werden. Danach können die Keimblätter in ein selektives flüssiges A-Medium transferiert werden, das 50 mg/l Kanamycinsulfat enthält, und weitere sieben Tage kultiviert werden. Nach 7 Tagen werden die Keimblätter in ein selektives, Agar-verfestigtes C-Medium mit 50 mg/l Kanamycin transferiert. In einer alternativen Ausführungsform kann die Selektion anfangs unter Verwendung von 25 mg/ml Kanamycin durchgeführt werden. In späteren Kultivierungsstufen wird die Kanamycinkonzentration auf 50 mg/ml erhöht. Das Kalluswachstum der transformierten Zellen auf dem selektiven Medium kann schon nach einer Woche beobachtet werden. Es können jedoch mehrere Wochen lang zusätzliche kanamycinresistente Klone auftreten. Einige davon sind Plastiden-Transformanten, während andere aufgrund der Expression des Plastiden-kan-Gens im Kern Resistenz gegen Kanamycin erwerben (Carrer et al., 1993). Die beiden Klassen von kanamycinresistenten Klonen können leicht mittels DNA-Gel-Blot-Analyse und PCR-Analyse unterschieden werden (wie in Beispiel I beschrieben). DNA wurde gemäß herkömmlichen Arbeitsvorschriften amplifiziert (1 min bei 92 °C, 1,5 min bei 58 °C, 1,5 min bei 72 °C, 30 Zyklen). Kanamycinresistenz tritt als Ergebnis der Expression des Neomycinphosphotransferase-Gens auf, die durch PCR-Amplifikation eines 548 Nucleotide umfassenden internen Segments unter Verwendung der folgenden Primer verifiziert werden kann:
5'-CCGACCTGTCCGGTGCCC-3'
5'-CACGACGAGATCCTCGCCG-3'.
BEISPIEL III
Plastiden-Transformation in Brassica-napus-Blättern durch Selektion auf Resistenz gegen Spectinomycin und Kanamycin
Aufgrund ihrer im Wesentlichen identischen Genome können Plastiden-Transformationsvektoren und Expressionskassetten, die für Arabidopsis entwickelt wurden, auch ohne Modifikation gut zur Plastiden-Transformation und Expression von fremden Genen in Brassica-Spezies eingesetzt werden.
Bestimmte Plastiden-Expressionsignale von evolutionär entfernten Spezies funktionieren auch in Arabidopsis- und Brassica-Plastiden. Diese Beobachtung wird durch die in Beispiel 1 beschriebenen Ergebnisse unterstützt, die zeigen, dass die Tabak-Prrn/TpsbA-Kassette zur Expression des selektierbaren Spectinomycin-Resistenzgens (aadA) in Arabidopsis-Plastiden verwendet werden können. Aber nicht jedes Tabak-Expressionssignal funktioniert in Arabidopsis richtig. Untersuchungen mit einem Vektor, der mit PSGS31A identisch war, mit der Ausnahme, dass das Terminationssignal TpsbA durch das Signal Trps16 ersetzt worden war, zeigten dramatische Auswirkungen auf die Gewinnung von Plastiden-Transformanten. Dieses Plasmid-Gen wurde durch Insertion der Prrn/Trps16-Kassette in eine Targeting-Stelle im pGS7-Vektor erhalten. Siehe 4. In 416 Proben, die mit diesem Plasmid beschossen wurden, wurde kein Transformant erhalten. Wie oben erwähnt wurden, wenn eine PrrnTTpsbA-Kassette (die Kassetten sind in Staub und Maliga, Plant Journal 6, 547–553 (1994) und Svab und Maliga, 1993, dessen Inhalt durch Verweis hierin aufgenommen ist) zur Transformation von Arabidopsis-Blättern verwendet wurde, in 2 von 210 beschossenen Proben Plastiden-Transformanten erhalten.
Aufgrund ihrer taxonomischen Verwandtschaft reagieren Arabidopsis- und Brassica-Spezies in Gewebekulturen ähnlich auf Pflanzenhormone oder Antibiotika. Folglich können Pflanzenregeneration aus kultivierten Zellen und Selektion von transgenen Linien durch Antibiotikaresistenz durch im Wesentlichen die gleiche Arbeitsvorschrift erreicht werden. Sowohl Arabidopsis- als auch Brassica-Blätter und -Keimblattexplantate reagieren auf 500 mg/l Spectinomcyin mit starkem Kalluswachstum in nichttransformiertem Wildtyp-Gewebe auf einem Sprossenregenerationsmedium, wie z.B. dem Medium C aus Tabelle 6. Diese Reaktion unterscheidet sich deutlich von der in Tabak-Blattgewebe, worin das Aussetzen gegenüber 500 mg/ml Spectinomycin zu einer deutlichen Hemmung der Kallusproliferation auf einem Sprosseninduktionsmedium führt. Somit könne Tabak-Plastiden-(und Kerngen-) Transformanten leicht auf einem Sprosseninduktionsmedium regeneriert werden, das 500 mg/l Spectinomycin enthält (Svab und Maligam, 1993). Unglücklicherweise verhindert eine rasche Kallusproliferation auf einem spectinomycinhältigen C-Sprossen/Keimregenerationsmedium (siehe Tabelle 6) die Gewinnung von Arabidopsis- und Brassica-Plastiden-Transformanten. Die Kultivierungsbedingungen müssen verbessert werden, um rasches Kalluswachstum zu unterdrücken und die Gewinnung von Plastiden-Transformanten zu vereinfachen. Diese Bedingungen sind in Beispiel I erläutert. Zwar war die Selektion machbar und Plastiden-Transformanten wurden unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel I erhalten, aber die erhaltenen transplastomischen Pflanzen waren nicht fruchtbar. Angesichts der höheren Toleranz von Brassica gegenüber 2,4-D (Radke et al., 1992) könnte die in Beispiel I beschriebene Arbeitsvorschrift aber zur Verwendung in Brassica angepasst werden.
Die Daten aus Beispiel II zeigen, dass die Kanamycinselektion mit den beschriebenen Regenerationsvorschriften kompatibel ist. Demgemäß ist Kanamycin das bevorzugte Antibiotikum für die Selektion von Plastiden-Transformanten in der taxonomischen Cruciferae-Gruppe.
Beispiel I und II offenbaren Arbeitsvorschriften für die Regeneration von transgenen Pflanzen aus Arabidopsis-Blättern und -Keimblättern. Eine Arbeitsvorschrift für die Regeneration von transgenen Pflanzen in Brassica würde eine zweistufige Arbeitsvorschrift (Anwendung von zwei unterschiedlichen Medien) für Blätter und eine dreistufige Arbeitsvorschrift (Anwendung von drei unterschiedlichen Medien) für Keimblätter umfassen. Die dreistufige Arbeitsvorschrift, die in Beispiel II zur Verwendung bei der Plastiden-Transformation von Arabidopsis-Keimblättern beschrieben ist, ist auch zur Verwendung in Brassica geeignet. Demgemäß werden nachstehend nur die Verfahren zur Transformation von Brassica-Blatt-Plastiden in einem zweistufigen Verfahren beschrieben.
Plastiden-Transformation in Brassica unter Verwendung von Blättern als Zielgewebe und Kanamycinresistenz als selektierbarer Marker
Brassica-Kulturen I führen in Stufe I zu einer gleichförmigen Zellteilung in Blättern oder Keimblättern. Das Ziel von Stufe II ist die Regeneration von transgenen Pflanzen. Ein geeignetes Medium für Stufe I zur Induktion einer Zellteilung wäre das in Beispiel I und II erläuterte ARMI-Medium. Ein geeignetes Regenerationsmedium für Stufe II wäre das B-Medium (ARMII in Marton und Browse, 1991), C-Medium (diese Studie) und E-Medium (Pelletier et al., 1983), die in Tabelle 6 aufgelistet sind.
Tabelle 6: Stufe-II-Brassica-Pflanzen-Regenerationsmedium*

* Alle Komponenten sind in mg/l angegeben. Das B-Medium ist das gleiche wie ARMII in Marton und Browse, 1991; das C-Medium wurde in dieser Studie entwickelt; das E-Medium ist das Cruciferae-Regenerationsmedium von Pelletier et al., 1983.

Zur Selektion von Plastiden-Transformanten sollten Westar-Samen von Brassica napus cv. oberflächensterilisiert und aseptisch in Magenta Boxen zum Keimen gebracht werden, wie in Beispiel II beschrieben ist. Nach drei bis vier Wochen werden die Blätter geerntet und direkt auf ein Whatman-Filterpapier gegeben, das auf ein Agar-verfestigtes nichtselektives Stufe-I-Medium gegeben wird. Nach Beschuss des geeigneten Plastiden-Transformationsvektors, der einen selektierbaren Kanamycinresistenzmarker trägt, mit DNA, wie es in Beispiel II beschrieben ist, werden die Schalen zwei Tage lang bei Licht (16 Stunden) und 25 °C inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blätter mit eine Rasierklingenblock geschnitten und auf das gleiche Stufe-I-Medium transferiert, das mit 50 mg/l Kanamycinsulfat ergänzt wurde. In einer alternativen Ausführungsform kann die Selektion anfangs unter Verwendung von 25 mg/ml Kanamycin durchgeführt werden. In späteren Kultivierungsstufen wird die Kanamycinkonzentration auf 50 mg/ml erhöht. Nach zwei Wochen auf dem selektiven Medium der Stufe I werden die Blätter auf ein Stufe-II-Medium zur Pflanzenregeneration transferiert. Kanamycinresistente Klone werden durch ihr rasches Wachstum und ihre Sprossenregeneration auf dem Selektionsmedium identifiziert. Die Kanamycinresistenz kann auf die Plastiden-Transformation oder die Integration des Kanamycin-Markergens in das Kerngenom zurückzuführen sein. Die Plastiden-Transformation wird durch PCR- und DNA-Gel-Blot-Analyse an Gewebeprobe von kanamycinresistenten Kallussen und regenerierenden Sprossen verifiziert. Die regenerierten Sprossen werden dann eingewurzelt und gemäß herkömmlichen Arbeitsvorschriften in den Boden eines Gewächshauses transferiert.
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Claims

Verfahren zur Gewinnung von transplastomischen Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzen, umfassend: a) das Kultivieren von Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen aus den Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzen bei hoher Dichte in einem an Auxin reichen Flüssigmedium, das geringe Konzentrationen an Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) enthält, b) das Übertragen der Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen auf Filterpapier auf Agar-verfestigtem Medium; c) das Zuführen einer transformierenden DNA zu einem Plastiden-Genom innerhalb der Arabidopsis- oder Brassica-Pflanzenzellen, wobei das transformierende DNA-Molekül Folgendes aufweist: i) zahlreiche Targeting-Segmente, die aus Plastiden-DNA-Sequenzen aus dem zu transformierenden Plastiden-Genom bestehen, wobei die Targeting-Segmente homologe Rekombination der transformierenden DNA zum Plastiden-Genom erleichtern; ii) 5'- und 3'-Regulationssequenzen, abgeleitet von Plastiden-DNA, die an ein selektierbares Markergen operabel gebunden sind, das innerhalb des Targeting-Segments angeordnet ist, wobei diese Regulationssequenzen Expression des selektierbaren Markergens und Stabilität von durch dieses kodierter mRNA erleichtern, wobei das selektierbare Markergen Resistenz gegenüber einem Selektionsmittel in den Pflanzenzellen verleiht; iii) 5'- und 3'-Regulationssequenzen, abgeleitet von Plastiden-DNA, die operabel an Sequenzen gebunden sind, die für ein fremdes Gen von Interesse kodieren, wodurch Expression des fremden Gens von Interesse und Stabilität von durch dieses kodierter mRNA erleichtert werden; und iv) zumindest eine Klonierstelle zur Insertion des fremden Gens von Interesse, das neben dem selektierbaren Markergen liegt, wobei die Insertion das Verleihen des selektierbaren Phänotyps und die Funktion von flankierenden Plastiden-Genen nicht stört; d) das Übertragen von Zellen, die wie in Schritt (c) beschrieben transformiert sind, auf ein Kulturmedium mit hohem Cytokiningehalt bei hoher Dichte für eine vor bestimmte Zeitdauer; wobei das Kulturmedium ein Mittel enthält, das kontinuierliche gleichförmige Zellteilung und Pflanzenregeneration fördert; e) das Übertragen der wie in Schritt (d) behandelten Zellen auf ein Agar-verfestigtes Kulturmedium, das das Regenerations-fördernde Mittel und das Selektionsmittel enthält, wobei die transformierten Zellen gegenüber dem Selektionsmittel durch Expression des selektierbaren Markergens resistent gemacht werden; und f) das Selektieren von Zellen, die transformierte Plastiden-Genome aufweisen, und das Induzieren von Pflanzenregeneration von diesen ausgehend.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die transformierende DNA durch ein Verfahren bereitgestellt wird, das aus der aus biolistischem Beschuss der Zellen durch DNA-beschichtete Partikel, CaPO₄-vermittelter Transfektion, Elektroporation und Polyethylenglykol-vermittelter DNA-Aufnahme bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanzenzellen aus der aus Keimblattzellen, Blattzellen, Hypokotylen und Wurzelzellen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Markergen und das fremde Gen von Interesse eine monocistronische Expressionseinheit darstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Markergen und das fremde Gen von Interesse eine polycistronische Expressionseinheit darstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Plastiden Chloroplasten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Selektionsmittel ein Antibiotikum ist und aus der aus Kanamycin, Spectinomycin und Streptomycin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das gleichförmige Zellteilung fördernde Mittel aus der aus 1-Naphthalinessigsäure (NAA), Indol-3-essigsäure (IAA) und Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Regenerations-fördernde Mittel aus der aus 6-Benzylaminopurin (BAP), 6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purin (2iP), N6-(Isopentenyl)adenin (IPA) und 6-Furfurylaminopurin (KIN) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die transformierende DNA innerhalb von Vektor pGS31A kloniert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die transformierende DNA innerhalb von Vektor pGS85A kloniert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die transformierende DNA innerhalb von Vektor PGS7 kloniert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze Arabidopsis thaliana ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze Brassica napus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanzenzellen Keimblattzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das an Auxin reiche Flüssigmedium keine Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) enthält.