DE69028925T2

DE69028925T2 - Verbesserungen in und betreffend lichtdurchleitungssystemen und verbesserungen in daraus entstammenden zellforschungsverfahren

Info

Publication number: DE69028925T2
Application number: DE69028925T
Authority: DE
Inventors: Richard Ansorge; Clare Hooper; William Neale; Philip Stanley
Original assignee: Cambridge Imaging Ltd
Current assignee: Cambridge Imaging Ltd
Priority date: 1989-12-08
Filing date: 1990-12-10
Publication date: 1997-02-13
Anticipated expiration: 2010-12-11
Also published as: JPH05505457A; DE69028925D1; WO1991009300A1; ATE144324T1; EP0504197A1; EP0504197B1; US5347122A; GB8927754D0; JP3452566B2; AU6879591A; AU651801B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Lichtübertragungssysteme, die auflichtempfindliche optische Detektoren abbilden, und auf biomedizinische Zelluntersuchungstechniken, die auf einer niedrigpegeligen Lichtanzeige und Übertragung basieren, die dadurch verstärkt werden kann. Die Erfindung ist insbesondere anwendbar auf Systeme, in denen ein Bildverstärker optisch mit einem Probenhalter gekoppelt ist, um das Detektieren von Photonen- Emissionen, die aus unterschiedlichen Stellen auf dem Probenhalter austreten, zu ermöglichen. Eine derartige Einrichtung ist insbesondere zweckmäßig für das Detektieren geringer Lichtpegel, insbesondere auf dem Gebiet der Biomedizin, Molekularbiologie und Gen-Technik.

Hintergrund der Erfindung

Viele biomedizinische Tests und Experimente stützen sich auf die visuelle Feststellung der Zell- und Molekular-Aktivität von Proben, die auf einem Halter angeordnet sind, z.B. einem Mikroskop-Objektträger, einer Petrischale und dergl. Ein Teil einer solchen Aktivität erzeugt eine Photonen-Emission als natürliche Folge der zu betrachtenden Aktivität; in anderen Studien können molekulare und zellulare Änderungen durch Hinzufügen von Material beobachtet werden, das eine Photonen-Emission erzeugt, wie sie unter Verwendung der sogenannten Lux-, Luc- und Phot-Gen-Technologie erhalten wird.
Auf den Gebieten der Gen-Manipulation und der Molekularbiologie hat das Studium des Gen-Expression, der Gen-Deletion und der Gen-Insertion das Hinzufügen von genetischem Material umfaßt, wodurch eine Photonen-Emission aus genetisch manipulierten Zellen unter Verwendung des sogenannen Lux-Gen-Expression erzeugt wird; solche Techniken sind auf den Gebieten der Virologie, Molekularbiologie, Immunologie, Mikrobiologie und Zellbiologie angewandt worden.
Benutzt man eine Einrichtung, wie sie in der PCT-Anmeldung WO 88/04045 beschrieben ist, sollte es möglich sein, eine Lux-Gen-Expression aus einer molekularen und Zell- Aktivität zu einem sehr viel früheren Zeitpunkt in der Reaktion zu beobachten als dies bisher möglich war, weil eine derartige Einrichtung eine wesentlich höhere Empfindlichkeit hat. Insbesondere sollte es möglich sein, die Position einer Photonen-Emission aufgrund der Lux-Gen-Expression aus Einzelzellenplätzen zu identifizieren, wodurch Tests an sehr kleinen Materialproben und in sehr viel kleineren Zeitperioden als bisher durchgeführt werden können. Wenn eine übliche Petrischale oder ein Mikroskop-Objektträger als Probenhalter verwendet wird, ist es nicht möglich, die perfekte optische Kopplung zu erzielen, die zwischen dem Photonen emittierenden Material der Probe und der Eingangsfläche des faseroptischen Eintrittsfensters des Bildverstärkers benötigt wird, da die Basis einer gewöhnlichen Petrischale und das Material eines gewöhnlichen Mikroskop-Objektträgers nicht die Form einer faseroptischen Frontplatte hat.
Um dieses Problem zu lösen, wurde in der vorerwähnten PCT-Anmeldung vorgeschlagen, die Basis der Petrischale oder des Mikroskop-Objektträgers aus faseroptischem Glas zu fertigen und die Unterseite dieses Materials in innigem Kontakt mit dem Eingangsfenster (ebenfalls aus faseroptischem Glas) des Bildverstärkers anzuordnen.
Während dadurch die Degradation der Auflösung bei der Übertragung von aus Photonen enuttierenden Stellen austretendem Licht auf den Bildverstärker reduziert wird, wurde in der Praxis festgestellt, daß ein perfekter Kontakt zwischen dem molekularen oder zellularen Material der Probe und der oberen Frontseite des Probenhalters nicht immer möglich ist, so daß selbst dann, wenn der Probenhalter aus faseroptischem Glas besteht, eine ziemlich starke Degradation der Auflösung erhalten wird, und zwar aufgrund der Streuung des Lichtes, wenn dieses Licht von dem Material in der Probe zum faseroptischen Glas des Probenhalters wandert. Dies wird besonders bemerkbar, wenn die Tiefe des Probenmaterials signifikant wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, dieses Problem zu lösen. Des weiteren ist Aufgabe der Erfindung, verbesserte Verfahren für die Zellen- und Molekular-Untersuchungen vorzuschlagen, die sich aus der Verwendung des verbesserten Lichtübertragungssystems nach der Erfindung ergeben.

Kurzbeschreihung der Erfindung

Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein Lichtübertragungssystem vorgeschlagen, bei dem eine Photonen-Emission aus einem Material einer Stützfläche auf einen optischen Detektor ühertragen werden soll, und das sich dadurch auszeichnet, daß eine faseroptische Frontplatte zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Abstand zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist, und der Detektor ein Eintrittsfenster aufweist,das in Verbindung mit der faseroptischen Frontplatte ein fokussiertes Bild von diskreten, Photonen emittierenden Stellen auf der Oberfläche des Detektors bildet.
Der Detektor kann ein Bildverstärker oder eine verstärkte CCD-Kamera oder ein gekühlter CCD-Detektor sein.
Vorliegende Erfindung kann mit einer Einrichtung verwendet werden, wie sie z.B. in der PCT-Anmeldung WO 88/04045 beschrieben ist, in der der Probenhalter selbst aus faseroptischem Glas besteht, überraschenderweise aber auch herkömmliche Petrischalen und Mikroskop-Objektträger aus Kunststoff und gewöhnlichem Glas verwendet werden können. So wurde festgestellt, daß dann, wenn die Dicke der Probe relativ zum Luftspalt zwischen dem Probenhalter und der faseroptischen Frontplatte und dem Spalt zwischen der nach außen gerichteten Frontseite und dem Betrachtungsfenster des Bildverstärkers klein ist, die faseroptische Frontplatte im wesentlichen etwa in der Mitte zwischen dem Probenhalter und dem Betrachtungsfenster des Bildverstärkers angeordnet sein soll, um optimale Resultae zu erzielen.
Wenn die Dicke des Proben halters beachtlich ist, muß die Frontplatte so verschoben werden, daß sie im optischen Sinne mittig angeordnet ist, wobei der Brechungsindex des Materials, aus dem der Probenhalter hergestellt ist, zu berücksichtigen ist.
Obgleich der Gesamtkontrast des Bildes, das durch eine Anordnung nach der Erfindung erzeugt wird, kleiner ist als es erhalten würde, wenn eine herkömmliche Fokussierlinse anstelle der faseroptischen Stirnpatte verwendet würde, sind die Lichtsammeleigenschaften der Stirnplatte wesentlich größer als die einer herkömmlichen Linse, soweit dies kleine Punktquellen der Photonen-Emission betrifft und das jede Punktquelle der Photonen-Emission umgebende Material keine Photonen emittiert (d.h. dunkel ist), so daß die Herabsetzung des Kontrastes unbedeutend ist.
Der Fokussiereffekt der zwischengeschalteten faseroptischen Platte wird optimiert, wenn die verwendeten Abstände und Materialien der Beziehung
a/n&sub1; = b/n&sub2;
genügen,
wobei a die Dicke des Probenhalters,
b die Dicke des Spaltes zwischen der Zwischenplatte und dem Bildverstärker und s, n&sub1; und n&sub2; die Brechungsindizes der beiden Materialien sind.
Ein typisches Beispiel ist a = 0,8 mm, n&sub1; = 1,4
b = 0,6 mm, n&sub2; = 1,0
für eine Petrischale, die aus Kunststoffmaterial besteht und einen Luftspalt aufweist. Die dazwischengeschaltete Frontplatte nach der Erfindung würde typischerweise einen Durchmesser von einigen cm, eine Dicke von ca. 2 mm haben und aus zahlreichen miteinander verschmolzenen optischen Fasern mit einem Durchmesser von 6 µ bestehen, wobei die Achsen der Fasern parallel verlaufen und alle etwa senkrecht zu den Endflächen der Platte angeordnet sind.
Die Erfindung ist besonders zweckmäßig dort anwendbar, wo es wichtig ist, ein optisches Filter zwischen dem Probenhalter und einem Detektor, z.B. einem Bildverstärker einzusetzen. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bei einem Lichtübertragungssystem nach Anspruch 1 vorgeschlagen, einen Prüfobjekt- bzw. Probenhalter, der die Stützfläche enthält, eine Frontplatte und einen Detektor so beabstandet voneinander anzuordnen, daß zumindest ein Spalt zwischen den gegenüberliegenden Flächen der Frontplatte und dem Detektor ausgebildet wird, einen optischen Film in erforderlicher Weise lösbar im Spalt anzuordnen, und die relativen Positionen des Halters, der Frontplatte und des Detektors so zu wählen, daß der optische Pfad zwischen dem Halter und der Frontplatte im wesentlichen der gleiche wie der zwischen der Frontplatte und dem Detektor unter Berücksichtigung der Brechungsindizes der Materialien, aus denen der Prüfobjekthalter, der Filter und die Frontplatte hergestellt sind, ist.
Wenn ein spezieller Test das Einsetzen eines ersten Filters zwischen einen Teil eines Tests und einem anderen erforderlich macht, wird, um die Notwendigkeit zu vermeiden, die Position der Frontplatte und/oder des Betrachtungsfensters zu ändern, ein neutraler Dichtefilter aus einem Material mit dem gleichen Brechungsindex wie der im Test zu verwendende Filter in den Spalt eingesetzt, wenn der Filter nicht erforderlich ist, jedoch entfernt und durch den ersten Filter ersetzt, wenn der erste Filter an Ort und Stelle benötigt wird.
Die Erfindung sieht ferner ein Lichtübertragungssystem der vorbeschriebenen Art vor, bei dem ein Luftspalt vorgesehen ist, in den ein optischer Filter einsetzbar ist, der normalerweise einen neutralen Dichtefilter aus einem Material mit dem gleichen Brechungsindex wie das Material des optischen Filters besitzt, und bei dem eine Vorrichtung vorgesehen ist, mit deren Hilfe der neutrale Dichtefilter durch den optischen Filter und umgekehrt ersetzt werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Detektieren von Lichtemissionen einer bestimmten Wellenlänge und/oder Polarisation aus diskreten Bereichen auf einer Stützfläche miut Hilfe eines auf ein breites Spektrum ansprechenden Detektors, der durch eine faseroptische Frontplatte angekoppelt ist, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist, bei dem ein neutraler Dichtefilter während des Einrichtens eingesetzt wird, so daß Licht aller Wellenlängen und/oder Polarisationen von dem Material auf der Stützfläche zum Detektor gelangen kann, damit das Einrichten ermöglicht, der neutrale Dichtefilter entfernt und durch einen Wellenlängen selektierenden und/oder polarisierenden Filter ersetzt und detektiert wird, ob Licht der ausgewählten Wellenlänge und/oder Polarisation von dem Detektor aufgenommen wird, indem der Signalausgang des Detektors überwacht wird.
Dieser Aspekt der Erfindung ist nicht auf die Positionierung von Wellenlängen selektierenden Filtern im Spalt beschränkt, sondern es können, wie vorerwähnt, neutrale Dichtefilter mit unterschiedlicher Dämpfung eingesetzt werden, um den dynamischen Bereich eines gegebenen Systems am oberen Ende zu erhöhen (d.h., ein gegebenes System in die Lage versetzen, Licht emittierende Materialien zu handhaben, die erhebliche Mengen an Licht emittieren), ohne daß der Bildverstärker beschädigt oder überlastet wird.
Entsprechend ist der Aspekt der Erfindung nicht auf die Positionierung jeweils eines Filters auf einmal beschränkt, sondern sieht die Verwendung eines rotierenden oder verschiebbaren Trägers vor, der zwei oder mehr unterschiedliche Wellenlängen selektierende Filter (z.B zusammen mit einem neutralen Dichtefilter) enthält, wobei der Träger zwischen der das Photonen emittierende Material enthaltenden Stütze und der dazwischen liegenden Frontplatte der Erfindung (oder zwischen der Frontplatte und dem Detektor) angeordnet ist, und der Träger von Hand oder mit Hilfe eines Antriebes durch ein Solenoid oder einen Motor bewegbar ist, um unterschiedliche Filter in den Lichtpfad einzuführen.
Ferner wird mit der Erfindung vorgeschlagen, einen Verschluß zwischen dem Licht emittierenden Material und dem Detektor anzuordnen, indem ein Verschlußmechanismus, z.B. eine Irisbende oder ein Rolladenverschluß im Spalt zwischen der Materialstütze und der dazwischen geschalteten faseroptischen Frontplatte oder zwischen dieser Frontplatte und deni Detektor angeordnet ist.
Ein Verschluß dieser Art kann mit einem oder mehreren Filtern kombiniert werden.
Zusätzlich hierzu oder anstelle davon kann eine elektrisch, z.B. durch Computergesteuerte LCD-Matrix im Spalt angeordnet werden, und zwar mit oder ohne Verschluß und/oder einen oder mehrere Filter, damit eine selektive Flächenabdeckung erreicht wird. Dies kann beispielsweise dazu führen, daß bestimmte Bereiche des Betrachtungsfeldes mit einer Abdeckung versehen werden, um das auf den Detektor auftreffende, daraus entstehende Licht zu reduzieren, so daß niedrige Lichtwerte in einem Feld geprüft werden können, ohne daß von anderen "helleren" Bereichen Licht übertritt.
Das Ausbilden eines Spaltes ermöglicht ferner, daß ein Detektor, z.B. ein Bildverstärker, verwendet werden kann, der (wie dies üblich ist) eine Fotokathode aufweist, die mit z.B. 10 000 Volt arbeitet, ohne daß spezielle Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, um die Fotokathode gegenüber anderen Vorrichtungen, insbesondere dem Prüfobjekthalter, zu isolieren. Dieser Vorteil kann ausgenutzt werden, um weiter zu erreichen, daß der Spalt Corona-Entladungseffekte reduziert.
Während es mit der Erfindung möglich ist, Gewebeschnitte, Biopsie-Material, Zellen- Monoschichten und Zellen-Suspensionen (in Medien oder in Lösung) zu untersuchen, wenn mit Genen-DNA oder Antikörper (monoklonal) medizinisch behandelte Sonden mit lumineszierenden oder fluoreszierenden Labels verwendet werden, ermöglicht die weitere Entwicklung unter Verwendung von Filtern im Spalt nach der Erfindung die Bestimmung von spektralen Eigenschaften, die sich auf die obigen Vorgänge beziehen, beispielsweise eine Doppewellenlängen-Fluoreszenz oder sowohl Fluoreszenz- als auch Licht-Messungen des gleichen Gewebeabschnittes oder der gleichen zellularen Monoschicht.
Die Erfindung schließt somit Untersuchungsmethoden ein, in denen ein zu untersuchendes Medium auf einer Oberfläche eines Prüfobjektträgers aufgenommen wird, die dadurch gekennzeichnet sind, daß davon ausgehendes Licht auf einen Detektor durch eine faseroptische Frontplatte hindurch übertragen wird, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist.
Die Freigabe von Adnosine-TriPhosphat (ATP) kann, wenn Zellen zur Auflösung gebracht werden, dadurch sichtbar gemacht werden, daß ein geeignetes Reagens verwendet wird, das eine Photonen-Emission ergibt, wenn ATP freigesetzt wird.
Die durch die Freigabe von ATP aus der Auflösung einer einzelnen Zelle erzeugte Photonen-Emission ist sehr gering, kann jedoch trotzdem unter Verwendung einer Einrichtung, wie sie in PCT/WO 88/04045 beschrieben ist, in Verbindung mit vorliegender Erfindung detektiert werden.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins bestimmter Zellen in einem Prüfobjekt vorgeschlagen, das folgende Schritte umfaßt:
a) Das Prüfobjekt wird auf einem Prüfobjekthalter zusammen mit Luciferase und Luciferin angeordnet,
b) letzteres wird in der vorbezeichneten Einrichtung so positioniert, daß eine Photonen-Emission aus diskreten Bereichen des Prüfobjektes über die Frontplatte auf den Detektor übertragen wird,
c) der Ausgangs-Signalpegel des Detektors wird festgestellt, und
d) ein auflösendes Mittel wird dem Prüfobjekt hinzugefügt und es wird jedes plötzliche Ansteigen der Lichtemission aus einem bestimmten Bereich des Prüfobjektes festgestellt, wie sich durch ein plötzliches Ansteigen im Detektor-Ausgangssignal für einen solchen Bereich ergibt.
Wenn keine solche lokale Erhöhung im Lichtpegel festgestellt wird, kann davon ausgegangen werden, daß das Prüfobjekt keine Zelle der erwarteten Art enthält und umgekehrt.
Es ist festzustellen, daß eine sehr empfindliche Abbildungsmethode entscheidend für den Erfolg dieser Technik ist, da die lokale Lichtmenge, die durch das Auflösen einer einzigen Zelle emittiert wird, nicht ausreichend dazu beiträgt, daß sie als entscheidende Fluktuation des Gesamtlichtpegels gesehen wird (wie dies durch eine Fotovervielfacherröhre (PMT) gesehen wird, die das aus dem gesamten Prüfobjekt emittierte Licht integriert). Das Signal/Rausch-Verhältnis einer Photovervielfacher-Röhre (PMT) würde so gut wie sicher verhindern, daß die Auflösung einer einzelnen Zelle detektiert wird. Vorliegende Erfindung ergibt jedoch eine ausreichend empfindliche Detektionstechnik, damit ermöglicht wird, daß das Auflösen einer einzelnen Zelle detektiert wird.
Die Erfindung liegt somit auch in einem Verfahren zum Detektieren des Auflösens einer einzigen Zelle in einer Probe, sowie in einer Einrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Demzufolge kann die Toxizität eines Materials gegen Zellen eines anderen Materials dadurch gemessen werden, daß das toxische Material in bekannten Konzentrationen einer Probe zugefügt wird, die eine oder mehrere Zellen bekannten Materials enthält, und zwar zusammen mit Luciferase und Luciferin und in der vorbeschriebenen Weise, wobei beobachtet wird, ob eine lokale Photonenemissionsaktivität aufgrund einer Auflösung individueller Zellen, wenn sie durch das toxische Material angegriffen werden, vorhanden ist.
Die Erfindung ist von besonderem Vorteil, wenn die Infektion einer Monoschicht von Zellen auf einer Petrischale mit einem genetisch manipulierten Virus untersucht wird, das Lux- (und andere) Gene in den genetischen Code der Zellen überträgt. Bei solchen Untersuchungen wird die Kultur über eine Zeitperiode inkubiert, und wenn die Zellen infiziert werden, wird das Luciferase-Enzym durch einzelne infizierte Zellen erzeugt, die im allgemeinen als Gen-Expression bezeichnet werden. Nach einer gewissen Zeit werden Luciferin und ATP hinzuaddiert, und Licht wird aus bestimmten Stellen der Infektion emittiert.
Früher sind die Lichtemissionen durch Verwendung von fotografischen Filmen in Kontakt mit der Petrischale detektiert worden; ein solcher Film ist jedoch relativ unempfindlich und erfordert lange Belichtungszeiten sowie relativ hohe Pegel der Photonen- Emission. In der Praxis hat dies bedeutet, daß Inkubationszeiten ausreichend lang sein mußten, damit die Infektion einer einzigen Zelle sich auf benachbarte Zellen übertragen kann, die miteinander genügend Licht erzeugen können, wenn das Luciferin und ATP hinzugefügt werden, um den Film zu belichten. Stellen von infizierten Zellen können dann durch Betrachtung des Filmes durch die Schale hindurch gesehen werden, und infizierte Zellen können unter Verwendung von Mikropipetten-Techniken und dergl. inkubiert werden.
Durch Anwendung vorliegender Erfindung können infizierte Zellen rascher aufgefunden werden (da es nur erforderlich ist, ausreichend lang zu inkubieren, damit einzelne Zellen infiziert werden). Diese können dann in einer früheren Stufe als bisher gesammelt werden.
Ein frühes Sammeln hat den weiteren Vorteil, daß ein reineres Ergebnis eines geklonten Virus erhalten wird. Dies ist deshalb der Fall, weil die Viruspopulation an einer Kulturschale natürlicherweise dazu tendiert, mit der Zeit über den Probenhalter zu diffundieren.
Die Erfindung kam mit einem beliebigen Detektor verwendet werden. So kann ein Bildverstärker Anwendung finden, die beschriebenen Techniken können jedoch vorteilhafterweise angewendet werden, damit Lichtdetektoren eingesetzt werden können, die sonst für biomedizinische Untersuchungen nicht geeignet sind. Wenn ein Luftspalt zwischen der Probe und dem Detektor vorgesehen werden kann, wie dies unter Verwendung vorliegender Erfindung möglich ist, kann ein kryogenisch gekühlter CCD-Detektor (der beispielsweise bei -20º C betrieben wird) Verwendung finden. Früher hatte die Anwendung solcher Detektoren in Verbindung mit Linsen zu erfolgen, die die auf den Detektor übertragene Lichtmenge begrenzt haben. Bei Einsatz vorliegender Erfindung werden solche Lichtverluste nicht festgestellt, so daß eine kryogenische CCD-Kamera als Detektor verwendet werden kann.
Die CCD-Kamera kann ein Eintrittsfenster mit faseroptischer Platte verwenden.
So kann beispielsweise der Begriff "Detektor" umfassen:
a) einen Bildverstärker, wie er in der PCT/W O88/04045 beschrieben ist, oder
b) einen CCD-Detektor, der kryogenisch gekühlt sein kann.
Der Ausdruck "faseroptische Stirnplatte", wie er hier verwendet wird, soll sich auf eine Glasplatte beziehen, die aus einem gleichförmigen Bündel optischer Fasern mit kreisförmigem Querschnitt besteht, wobei der Querschnittsdurchmesser beispielsweise 50 mm und die Länge der das Bündel bildenden Fasern z.B. 3 mm beträgt, und die beiden Stirnseiten der Platte parallel zueinander und im Abstand um die Länge der Fasern, d.h. um z.B. 3 mm versetzt sind. Typischerweise haben die Fasern, aus denen die Platte besteht, einen Durchmesser von etwa 6 Mikron.
Wie bereits erwähnt, kann die Erfindung zum Detektieren von Licht bei vielen Vorgängen angewendet werden. Zwei Beispiele werden nachstehend beschrieben.
Im ersten Beispiel geht es darum, festzustellen, ob infizierte Zeilen auf einer Petrischale vorhanden sind, was aufgrund de Expression eines lumineszierenden Luciferase-Gens detektierbar ist.
Eine Luciferase-Gen-Expression kann beobachtet werden, wenn eine Petrischale mit 50 mm Durchmesser, die eine zellulare Monoschicht (etwa eine Million Zellen) enthält, mit einemi Luciferase-Virus-Rekombinant (der das luminszente Luciferase-Gen ausdrückt) infiziert wird. Infizierte Zellen werden als Lichtpunkte im Betrachtungsfeld gesehen, die Zellen darstellen, welche das Luciferase-Gen ausdrücken. Wenn die Zellen direkt durch die Basis der Petrischale hindurch betrachtet werden, erscheinen sie als defokussierte (und damit große) Bereiche der Lichtemission im Bild. Die Verwendung einer faseroptischen Platte und eines in geeigneter Weise eingestellten Spaltes nach der Erfindung ergibt ein wesentlich schärferes Bild der Licht emittierenden Zellen..
Bei einem zweiten Beispiel kann das Auflösen von individuellen Mikroorganismen beobachtet werden. In diesem Fall wird eine Petrischale mit 50 mm Durchmesser, die 1 ml des Proben-Reagens-Puffers (d.h. Luciferase, Luciferin und Puffer) enthält, durch Direktkontakt-Abbildung betrachtet. Es wird wenig oder kein Licht festgestellt. Wenn dieser "Hintergrund"-Pegel der Lichtemission als Bezugswert aufgezeichnet worden ist, wird ein kleines Volumen (0,1 ml) eines auflösenden Mittels hinzugefügt und die Bakterien werden selektiv aufgelöst. Die selektive (gesteuerte) Freigabe von Zellinhalten erzeugt zel lenspezifisches ATP, das durch Vorhandensein eines Reagenspuffers gemessen wird, was zu einer Lichtemission aus den Bereichen der Zeilen führt.
Nachstehend wird die Erfindung in Verbindung mit der Zeichnung anhand eines Ausführungsbeispieles erläuert. Es zeigt:
Fig. 1 eine Aufsicht auf eine Petrischale, die zu Abbildungszwecken von der Unterseite her betrachtet wird,
Fig. 2 eine bekannte Anordnung zur Betrachtung einer Petrischale,
Fig. 3 eine verbesserte Anordnung nach der Erfindung,
Fig. 4 eine schematische Darstellung, wie die Erfindung arbeitet,
Fig. 5 eine Ausführungsform der Erfindung, bei der eine großflächige Petrischale durch einen kleinflächigen Detektor betrachtet werden kann,
Fig. 6 eine Möglichkeit der Anordnung von Filtern zwischen der Schale und der Frontplatte nach der Erfindung, und
Fig. 7 eine Seitenansicht, aus der die relativen Positionen der unterschiedlichen Elemente nach Fig. 6 deutlicher hervorgehen.
In Fig 1 ist eine Petrischale 10 dargestellt, die eine bestimmte Menge von im Abstand voneinander angeordneten kleinen Licht emittierenden Zeilen (oder Bereichen) 12 enthält. Die Größe einer jeden Zelle 12 beträgt 30 Mikron, und es können z.B. vierzehn solcher Zellen in einer zellularen Monoschicht vorgesehen sein, die eine Viertel Million Zellen enthalten - die übrigen von ihnen sind nicht Licht emittierend.
Bisher wurde die Betrachtung der Licht emittierenden Zeilen dadurch erreicht, daß die Unterseite der Petrischale 10 einem Betrachtungsfenster 14 einer Kamera 16, z.B. einer unterbrochenen CCD-Kamera oder einem Bildverstärker angepaßt wurde. Die Streuung des Lichtes aus jeder der punktförmigen Lichtquellen, z.B. 12, hat verhältnismäßig große Lichtflächen aut dem Betrachtungsfenster der Kamera, z.B. 18 in Fig. 2 erzeugt. Diese Flächen sind um ein Mehrfaches größer als die Fläche der Licht emittierenden Zellen, und wegen der Streuung des Lichtes erheblich heller, so daß es schwieriger ist, sie gegenüber dem Hintergrund zu unterscheiden.
Wenn nach der Erfindung eine faseroptische Platte 20 zwischen der Unterseite der Petrischale 10 und dem Betrachtungsfenster 14 der Kamera 16 eingesetzt wird und ein kleiner Luftspalt zwischen Platte 20 und Fenster 14 belassen wird, wird eine entscheidende Verbesserung erzielt und die Stellen des Lichtes, z.B. 22, die den Zellen entsprechen, erscheinen kleiner und heller (wie in Fig. 3 dargestellt) als die entsprechenden Lichtflächen, z.B. 18 in Fig. 2.
Es wurde festgestellt, daß zur Erzielung der besten Resultate die Breite des Luftspaltes auf die Dicke der Basis der Petrischale bezogen wird. Wenn, wie in Fig. 3 dargestellt, die Dicke der Petrischale mit a und der Spalt mit b bezeichnet wird, gilt, wenn der Brechungsindex des die Petrischale bildenden Materials n&sub1;, und der des Spaltes (typischerweise Luft) n&sub2; ist,
a/n&sub1; = b/n&sub2;
Da n&sub2; = 1,0 für Licht, und die Dicke der Basis einer Petrischalenbasis üblicherweise 0,8 mm beträgt, kann der Spalt durch a/n ausgedrückt werden, wobei n der Brechungsindex des Materials (entweder Kunststoff oder Glas) ist, aus dem die Petrischale hergestellt ist.
Die Art und Weise, in der die Verbesserung erzielt wird, wird am besten in Verbindung mit Fig. 4 verständlich. Hier ist eine punktförmige Lichtquelle 24 auf der Oberseite der Basis einer Petrischale angeordnet dargestellt. Licht wird aus der Quelle 24 in allen Richtungen emittiert, der interessierende Teil des Lichts ist jedoch der, der im Kegel 28 enthalten ist. Dieses Licht tritt in die laseroptische Platte 30 ein, und das obere Ende einer jeden optischen Faser 32, 34 usw. kann nunmehr als eine kleine punktförmige Lichtquelle angesehen werden, wobei der größte Teil des Lichtes nach abwärts durch die opitsche Faser verläuft und aus dem unteren Ende austritt. Das aus jeder Faser austretende Licht kann als kleine punktförmige Lichtquelle ähnlich der Quelle 24 angesehen werden, die räumlich gegen das Betrachtungsfenster der Kamera (nicht dargestellt) versetzt ist. Jedes der Faserenden erzeugt den eigenen Lichtkegel, und wegen der unmittelbareii Nähe der Fasern überlappen sich einige der Kegel und ergeben eine intensiver beleuchtete Fläche 36 mit der Mitte, wie dies dargestellt ist.
Während die intensiver beleuchtete Fläche 36 nicht so hell ist wie der Punkt 24, und ihr Flächeninhalt etwas größer ist, ist er erheblich heller und wesentlich kleiner als die Fläche an der Basis des Kegels 28.
Die Ebene, in der eine optimale Intensivierung auftritt, ist nicht notwendigerweise genau definiert, das Experiment zeigt jedoch, daß dann, wenn die Petrischale eine dicke Basis hat, der Spalt zwischen der unteren Stirnseite der Platte 30 und der Ebene, an der eine Intensivierung erhalten wird, größer sein muß als in dem Fall, in dem die Dicke der Basis der Petrischale dünner ist. Es wurde auch festgestellt, daß der Spalt umgekehrt proportional dem Brechungsindex des Materials ist, aus dem die Basis der Petrischale hergestellt ist.
Wenn der Flächeninhalt der Basis der Petrischale größer ist als der des Betrachtungsfensters der Kamera, wie in Fig. 5 gezeigt, kann mehr von der Schalenfläche durch die Kamera erfaßt werden, falls eine verjüngte faseroptische Kopplungsplatte 37 zwischen der Schale und der Kamera angeordnet wird. In Fig. 5 ist der Durchmesser der Petrischale 38 mit d&sub1; und der Durchmesser des Betrachtungsfensters 40 (der Kamera 46) mit d&sub2; bezeichnet. Durch Auswahl der Verjüngung in der Weise, daß der Durchmesser des kleineren Endes der verjüngten faseroptischen Kopplung 37 ebenfalls d&sub2; ist, stellt man fest, daß nunmehr die gesamte Fläche der Petrischale 38 betrachtet werden kann, jedoch mit stärkerer Verkleinerung. Während bisher nur die Zellen in der Fläche 44 durch die Kamera gesehen werden konnten, können nunmehr die Zellen der gesamten Fläche 46 betrachtet werden.
Zur Verdeutlichung sind die beiden Betrachtungsfelder in fest ausgezogenen und gestrichelten Umrißlinien in Fig. 1 dargestellt.
Die Figuren 6 und 7 zeigen, wie die Erfindung ermöglicht, daß Filter zwischen die Petrischale 48 und das Betrachtungsfenster 50 einer Kamera 52 eingesetzt werden. Hierzu wird der Luftspalt im Umriß verwendet und wird teilweise von einer dünnen Scheibe 54, die Ausnehmungen 56, 58 usw. enthält, aufgenommen. Eine dieser Ausnehmungen kann einfach eine Öffnung darstellen, so daß, wenn sie mit der Kamera und der Schale ausgerichtet ist, die Anordnung wie in Verbindung mit Fig. 3 beschrieben ist, während die anderen Ausnehmungen Filter enthalten. Alternativ können alle Ausnehmungen Filter, z.B. Polarisationsfilter, für Wellenlängen selektive Filter und neutrale Dichtefilter enthalten. Durch Bewegen der Scheibe 54 um eine vertikale Achse 60 und durch Verwendung eines Motors 62 kann die Scheibe in Drehung versetzt werden, so daß entsprechende Ausnehmungen aufeinander ausgerichtet werden, z.B. durch Steuerung aus einer Steuereinheit 64, die einen Computer aufweisen kann.
Fig. 7 zeigt die relativen Positionen von Kamerafilterscheibe und Schale.

Claims

1. Lichtübertragungssystem, bei dem eine Photonen-Emission aus einem Material auf einer Stützfläche (10, 26) auf einen optischen Detektor (14, 16) übertragen werden soll, mit einer faseroptischen Frontplatte (20), die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt (b) zwischen der Frontplatte und dem Detektor angeordnet ist, wobei der Detektor ein Eintrittsfenster (14) aufweist, das in Kombination mit der faseroptischen Frontplatte ein fokussiertes Bild von diskreten, Photonen emittierenden Stellen (22) auf der Oberfläche des Detektors ausbildet.

2. System nach Anspruch 1, bei dem der Detektor ein Bildverstärker oder eine Verstärkungs-CCD-Kamera (16) oder ein CCD-Detektor ist, der kryogenisch gekühlt sein kann.

3. System nach Anspruch 1, bei dem die Stützfläche eine Petrischale (10) oder ein Mikroskop-Objektträger aus Kunststoff oder Glas ist.

4. System nach Anspruch 1, bei dem ein Luftspalt zwischen der Stützfläche und der faseroptischen Frontplatte und ein weiterer Luftspalt (b) zwischen der Frontplatte und dem Fenster des Detektors vorgesehen ist.

5. System nach Anspruch 1, bei dem die Frontplatte im optischen Sinn in der Mitte zwischen dem Material auf der Stützfläche und dem Detektor (14, 16) positioniert ist, wobei der Brechungsindex eines jeden den Lichtpfad bildenden Materials berücksichtigt wird.

6. System nach Anspruch 2, bei dem der Fokussier-Effekt der zwischengeschalteten faseroptischen Platte optimiert wird, wenn die verwendeten Abstände und Materialien die Beziehung erfüllen

a/n&sub1; = b/n&sub2;

wobei a die Dicke eines Prüfobjekthalters,

b die Dicke des Spaltes zwischen der Zwischenpatte und dem Bildverstärker,

n&sub1;, n&sub2; die Brechungsindizes der beiden Materialien sind.

7. System nach Anspruch 1, bei dem ein optisches Filter zwischen einen Prüfobjekthalter (48) und den Detektor (52) eingesetzt ist.

8. System nach Anspruch 1, bei dem ein Prüfobjekthalter (48), der die Stützfläche enthält, eine Frontplatte und ein Detektor (52) so beabstandet voneinander angeordnet sind, daß sie mindestens einen Spalt (56) zwischen den gegenüberliegenden Flächen der Frontplatte und des Detektors definieren, ein optischer Filter (58) in erforderlicher Weise lösbar im Spalt angeordnet ist, und die relativen Positionen des Halters, der Frontplatte und des Detektors so gewählt sind, daß der optische Pfad zwischen dem Halter (48) und der Frontplatte im wesentlichen der gleiche wie der zwischen der Frontplatte und dem Detektor (52) unter Berücksichtigung der Brechungsindizes der Materialien, aus denen der Prüfobjekthalter, der Filter und die Frontplatte hergestellt sind, ist.

9. System nach Anspruch 8, bei dem der Filter (58) ein die Wellenlänge selektierender Filter oder ein polarisierender Filter oder ein neutraler Dichtefilter ist.

10. System nach Anspruch 9, bei dem ein erster Filter zwischen einen Teil eines Tests und einen anderen Teil eingesetzt ist, und ein neutraler Dichtefilter aus einem Material mit dem gleichen Brechungsindex wie der im Test zu verwendende Filter in den Spalt eingesetzt ist, wenn der erste Filter nicht erforderlich ist, jedoch ent-fernt und durch den ersten Filter ersetzt wird, wenn der erste Filer an Ort und Stelle benötigt wird.

11. System nach Anspruch 1, bei dem ein Luftspalt vorgesehen ist, in den ein optischer Filter einsetzbar ist, der normalerweise einen neutralen Dichtefilter aus einem Material mit dem gleichen Brechungsindex wie das Material des optischen Filters besitzt, und das eine Vorrichtung (54, 62) aufweist, mit deren Hilfe der neutrale Dichtefilter durch den optischen Filter und umgekehrt ersetzt werden kann.

12. Verfahren zum Detektieren von Lichtemissionen einer bestimmten Wellenlänge und/oder Polarisation aus diskreten Bereichen auf einer Stützfläche (48) mit Hilfe eines auf ein breites Spektrum ansprechenden Detektors (50), der durch eine faseroptische Frontplatte (20) damit gekoppelt ist, die zwischen der Stützfläche (10) und dem Detektor mit einem Spalt zwischen der Frontplatte und dem Detektor angeordnet ist, bei dem ein neutraler Dichtefilter während des Einrichtens eingesetzt wird, so daß Licht aller Wellenlängen und/oder Polarisationen von dem Material auf der Stützfläche zum Detektor gelangen kann, damit das Einrichten ermöglicht, der neutrale Dichtefilter entfernt und durch einen Wellenlängen selektierenden und/oder polarisierenden Filter ersetzt wird, und detektiert wird, ob Licht der ausgewählten Wellenlänge und/oder Polarisation von dem Detektor aufgenommen wird, indem der Signalausgang des Detektors überwacht wird.

13. Verfahren zum Einstellen des dynamischen Bereiches eines Systems nach Anspruch 1 bei dem neutrale Dichtefilter mit unterschiedlicher Dämpfung in den Spalt eingesetzt werden, damit das System Materialien verwenden kann, die erheblich unterschiedliche Mengen an Licht emittieren, ohne daß der Detektor beschädigt oder überlastet wird.

14. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12 oder 13, mit einem rotierenden oder verschiebbaren Träger (54), der eine Vielzahl von unterschiedlichen Filtern enthält, der zwischen der Stütze (48), die das Photonen emittierende Material enthält, und der dazwischenliegenden Frontplatte oder zwischen der Frontplatte und dem Detektor angeordnet ist, und der so bewegbar ist, daß unterschiedliche Filter in den Lichtpfad eingeschaltet werden.

15. System nach Anspruch 1, bei dem ein Verschluß zwischen dem Licht emittierenden Material und dem Detektor angeordnet ist, indem ein Verschlußmechanismus, z.B. eine Irismembran oder ein Rolladenverschluß, im Spalt zwischen der Materialstütze und der dazwischengeschalteten faseroptischen Frontplatte oder zwischen dieser Frontplatte und dem Detektor angeordnet ist.

16. System nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß mit einem oder mehreren Filtern kombiniert ist.

17. System nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine LCD-Matrix unter elektrischer Steuerung, beispielsweise durch einen Computer, der im Spalt angeordnet ist, um eine selektive Flächenabdeckung zu erreichen.

18. Untersuchungsverfahren, bei dem ein zu untersuchendes Medium auf einer Prüfobjektstützfläche (10) aufgenommen ist, dadurch gekennzeichnet, daß davon ausgehendes Licht auf einen Detektor (14, 16) durch eine faseroptische Frontplatte (20) hindurch übertragen wird, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit eineni Spalt zwischen der Frontplatte und dem Detektor angeordnet ist.

19. Einrichtung zur Durchführung von Untersuchungsverfahren nach Anspruch 18.

20. Verfahren zum Detektieren von Photonenemissionen, wenn Adnosine-TriPhosphat (ATP) aus Zellen auf einer Stützfläche freigegeben wird, die zur Auflösung gebracht worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß Licht aus den sich auflösenden Zellen auf einen Detektor durch eine faseroptische Frontplatte hindurch übertragen wird, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist.

21. Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins bestimmter Zellen in einem Prüfobjekt, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das Prüfobjekt auf einem Prüfobjekthalter (10, 26) zusammen mit Luciferase und Luciferin angeordnet wird,

b) letzteres in der Einrichtung nach Anspruch 1 so positioniert wird, daß eine Photonen-Emission aus diskreten Bereichen des Prüfobjektes über die Frontplatte (20) auf einen Detektor (14, 16) übertragen wird,

c) der Ausgangssignalpegel des Detektors festgestellt wird, und

d) ein auflösendes Mittel dem Prüfobjekt hinzugefügt und jedes plötzliche Ansteigen der Lichtemission aus einem bestimmten Bereich des Prüfobjektes festgestellt wird, wie sich durch ein plötzliches Ansteigen im Ausgangssignal für einen solchen Bereich ergibt.

22. Verfahren zum Messen der Toxizität eines Materials gegenüber Zellen eines anderen Materials, dadurch gekennzeichnet, daß das toxische Material in bekannten Konzentrationen einem eine oder mehrere Zellen (12) bekannten Materials enthaltenden Prüfobjekt zusammen mit Luciferase und Luciferin auf einer Stützfläche (10, 26) beigegeben wird, und daß Licht aus einer lokalen Photonen-Emissionsaktivität aufgrund der Auflösunng individueller Zellen, wenn sie von dem toxischen Material angegriffen werden, auf einen Detektor (14, 16) durch eine faseroptische Stirnplatte (20) hindurch übertragen wird, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist.

23. Verfahren zum Untersuchen der Infektion einer Monoschicht von Zellen (12) auf einer Petri-Schalen-Stützfläche (10, 26) mit einem genetisch veränderten Virus, der Lux (und andere) Gene in den genetischen Code der Zellen überträgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur über eine Zeitperiode inkubiert wird, und wenn die Zellen infiziert werden, das Luciferase-Enzym durch einzelne infizierte Zellen erzeugt wird, die üblicherweise als Gene-Ausdruck bezeichnet werden, daß nach eine bestimmen Zeitperiode Luciferin und ATP hinzugefügt werden, damit Licht aus irgendwelchen Infektionsstellen emittiert wird, und auf diese Weise emittiertes Licht auf einen Detektor (14, 16) durch eine faseroptische Frontplatte (20) hindurch übertragen wird, die zwischen der Stützfläche und dem Detektor mit einem Spalt zwischen Frontplatte und Detektor angeordnet ist.

24. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die faseroptische Frontplatte (20) eine Glasplatte aufweist, die aus einem gleichförmigen Bündel optischer Fasern (32, 34) mit kreisförmigem Querschnitt hergestellt ist, wobei der Querschnittsdurchmesser 50 mm und die Länge der das Bündel ausbildenden Fasern 3 mm beträgt, die beiden Stirnseiten der Platte parallel und um die Länge der Fasern beabstandet angeordnet sind, und die die Platte ausbildenden Fasern einen Durchmesser von etwa 6 Mikron haben.