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Hintergrund der Erfindung
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Die
vorliegende Anmeldung basiert auf der provisorischen Anmeldung Nr.
60/096,159 mit dem Titel „Einding
Assays By Means Of Optical Resonance Of Colloidal Particles", eingereicht am
11. August 1998, und beansprucht die Priorität jener Anmeldung; die vorliegende
Anmeldung ist auch eine „continuation
in Part" der ebenfalls
anhängigen
Anmeldung 08/789,211 mit dem Titel „Homogeneous Einding Assay", eingereicht am
23. Januar 1996 und veröffentlicht
als
WO 98/33070 .
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Anmeldung betrifft das Gebiet der Messung der Ligandenbindung
und betrifft insbesondere Hochgeschwindigkeitsinstrumente zur automatischen
Abtastung einer großen
Anzahl von potenziell therapeutischen Verbindungen durch Messung
ihrer jeweiligen Bindungsaffinität
für verschiedene
biologische Rezeptoren.
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Beschreibung des Stands der
Technik
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Gentechnikverfahren
waren erfolgreich bei der Identifizierung der Gensequenz von krankheitsbezogenen
Zelloberflächenrezeptoren
und beim künstlichen
Wiedergeben dieser Rezeptoren in substantiellen Mengen und in purifizierter
Form. Solche Rezeptoren können
auch aus Zellzubereitungen isoliert werden. Kombinatorische chemische
Techniken sorgen für
einen schnelle Synthese von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht,
die potenzielle Bindungspartner für isolierte oder identifizierte
Rezeptoren sind. Wenn sie einmal erzeugt sind, müssen diese enormen Bibliotheken
von Verbindungen auf ihre relative Bindungsaffinität mit dem Zielrezeptor
untersucht werden. Hochgeschwindigkeitsmaschinen sind für die Art
des zu erzielenden Testens oder Untersuchens auf zeitnahe Weise
wesentlich geworden.
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Der
traditionelle Ansatz zur Untersuchung war es, jede Verbindung beispielsweise
mit einem radioaktiven Rest, einem fluoreszenten Etikett oder einem
lumineszenten Etikett zu kennzeichnen und dann die Bindung der gekennzeichneten
Verbindung mit dem interessierenden Rezeptor zu bestimmen. Zu diesem
Zweck wird der Rezeptor im Allgemeinen immobilisiert und man lässt die
gekennzeichnete Verbindung den Rezeptor berühren. Nach einer gewissen Zeitspanne
wird die nicht gebundene Verbindung weg gewaschen und die immobilisierten
Rezeptoren werden auf das Vorhandensein des gebundenen Etiketts
hin analysiert.
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Es
gibt mindestens zwei Probleme mit diesem Ansatz. Zuerst neigt das
Waschen dazu, schwache Bindungen, die für die Messung von Verbindungen
mit einer gewissen, jedoch nicht idealen Aktivität wichtig sein können, zu
brechen. Zweitens stellt die Aufgabe der Kennzeichnung einer vollständigen Bibliothek
von vielleicht von Hunderten von Tausenden von Verbindungen eine
praktische Grenze für
die Anzahl der Verbindungen dar, die untersucht werden können. Jede
Verbindung stellt ein für
die Kennzeichnung zu lösendes,
einzigartiges Problem dar und nicht alle können mit demselben Etikett
gekennzeichnet werden. Schließlich
kann das Vorhandensein des Etiketts die Affinität zwischen der Verbindung und
dem Rezeptor ändern.
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Daher
wäre es
sehr wünschenswert,
ein Instrument sowie ein Verfahren zu besitzen, das die Kennzeichnung
(Etikettierung) eliminiert und dennoch die quantitative Analyse
der Bindungsaffinität
zwischen einer Verbindung und einem Rezeptor erlaubt. Dies würde eine
fundamentale Einschränkung
für die
Hochgeschwindigkeitsuntersuchung von sehr großen Bibliotheken von Verbindungen
entfernen.
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Die
WO 98/37417 offenbart ein
Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung eines Zielobjekts
mit einer Vielzahl von Plasmon resonanten Partikeln (PREs), die
im Zielobjekt verteilt sind. Bei dem Verfahren gemäß der
WO 98/37417 wird ein das
Zielobjekt enthaltende Feld beleuchtet und eine oder mehrere spektrale Emissionscharakteristiken
der lichtstreuenden Partikel in dem Feld werden gemessen. Aus diesen
Daten wird ein Bild der Positionen und der spektralen charakteristischen
Werte im Feld aufgebaut, wodurch erlaubt wird, dass PREs mit einer
ausgewählten
spektralen Signatur von anderen lichtstreuenden Gebilden unterschieden werden,
um Informationen über
das Feld bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung erreicht dieses Ziel dadurch, dass ein Verfahren
bereitgestellt wird, welches eine Änderung in den optischen Eigenschaften
des festen Trägers
misst, mit dem sich der Rezeptor verbunden hat, wenn der Rezeptor
von einer nicht gekennzeichneten (nicht etikettierten) bindenden
Verbindung belegt ist. Der feste Träger ist eine spezifische Art
von Kolloidpartikel mit weniger als 100 nm Durchmesser. Kolloidale Silberpartikel
mit einem Durchmesser von weniger als ungefähr 70 nm sind eine Ausführungsform
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Diese
geringe Größe bedeutet,
dass die Bindungskinetik der Reaktion ähnlich der Kinetik in der gelösten Phase
ist. Das Instrument mischt automatisch die Verbindung und die kolloidale
Suspension der Rezeptoren, inkubiert die Mischung und liest dann
das Ergebnis mit einer Rate von Tausenden von Tests pro Stunde aus.
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In
der gleichzeitig anhängigen
Anmeldung, auf die oben Bezug genommen wurde, haben die vorliegenden
Erfinder entdeckt, dass optische Resonanz verwendet werden könnte, um
die Quervernetzung der Partikel zu messen. Die gegenwärtige Erfindung
ist nicht von der Quervernetzung der Partikel abhängig. Wie im
Folgenden dargelegt wird, misst die vorliegende Erfindung direkt
die Bindung eines nicht gekennzeichneten Liganden mit einem Partikel.
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Darstellung der Erfindung
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Die
Erfindung verwendet eine spezielle Art eines optisch empfindlichen
Sub-Mikron-Partikels, dessen Oberfläche mit einer Monoschicht eines
spezifischen molekularen Rezeptors vorbeschichtet ist, der die Liganden
in der gelösten
Phase binden kann (in dieser Erfindung bezieht sich „Rezeptor" auf ein auf dem
Partikel immobilisiertes Molekül,
das in der Lage ist, andere Moleküle anzubinden, die sich in
freier Lösung
befinden. Des Weitern werden in dieser Erfindung die Moleküle in freier
Lösung „Liganden" genannt). Das Partikel
selbst ist ein Wandler, der die Bindung der Liganden mit dem Rezeptor
direkt erfasst und ein optisches Signal erzeugt, das für diese
Bindung bezeichnend ist. Das Partikel selbst ist der Bindungssensor,
wodurch es nicht nötig
ist, den Liganden zu kennzeichnen (zu etikettieren).
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Die
Signalwandlereigenschaften des in der Erfindung verwendeten Partikels
hängen
davon ab, dass eine optische Lichtstreuungs- und Absorptionsresonanz
an einer spezifischen Resonanzwellenlänge λR vorhanden
ist. Solch eine Resonanz ist in kleinen Partikeln vorhanden, die
einen komplexen Brechungsindex besitzen, bei dem ein realer Teil
n(λ) des
Index sich 0 annähert,
während
ein imaginärer
Teil k(λ)
sich gleichzeitig an der spezifischen Wellenlänge λR dem
Wert √2
annähert.
(In dieser Erfindung ist ein kleines Partikel eines, das kleiner
als ungefähr
ein Zehntel der Wellenlänge
des einfallenden Lichts ist.) Es ist aus den detaillierten Theorien
der Lichtstreuung bekannt, dass bei Erfüllung der oben genannten Resonanzbedingung
sowohl die Lichtstreuung als auch die Absorption wesentlich größer sind
als von der Rayleigh-Theorie der einfachen Lichtstreuung vorhergesagt,
bei der angenommen wird, dass n und k konstant sind und keine Funktion
der λ sind (Bohrens
und Huffman). Die vorliegende Erfindung demonstriert das zusätzliche überraschende
Ergebnis, das die Intensität
der Lichtstreuung und Absorption kleiner Partikel an der Resonanzwellenlänge sich ändert, wenn die
Liganden sich mit Rezeptoren verbinden, die auf solchen resonanten
Partikeln immoblisiert sind. Je näher die beiden Bedingungen
für n und
k erfüllt
sind, desto stärker
ist die Resonanz und desto empfindlicher sind die Rezeptor beschichteten
Partikel für
die Ligandenbindung.
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Normalerweise
sind die Ausdrücke
für die
Lichtstreuung und die Absorption von kleinen Partikeln mit konstanten
Brechungsindizes einfache Funktionen der Wellenlänge. Allgemein gesagt sind
sowohl die Lichtstreuung als auch die Absorption am höchsten für kurze
Wellenlängen
(z. B. für
ultraviolettes Licht) und am geringsten für lange Wellenlängen (z.
B. rotes oder infrarotes Licht). Diese Wellenlängenabhängigkeit ist monoton, was bedeutet,
dass ein stetiger Verlauf von intensiver Absorption und Streuung
bei kurzen Wellenlängen
zur weniger intensiven Absorption und Streuung bei langen Wellenlängen vorhanden
ist. Ausnahmen zu diesem Verhalten treten für Partikel mit einem komplexen
Brechungsindex auf, welcher eine starke Wellenlängenabhängigkeit besitzt.
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Wenn
der Brechungsindex des Partikels auf solche Weise mit der Wellenlänge variiert,
dass die beiden Bedingungen: 1) n(λ) nähert sich 0 an und 2) k(λ) nähert sich √2 an, gleichzeitig
an einer spezifischen Wellenlänge λR erfüllt sind,
dann nimmt die Lichtstreuung und die Absorption in einem engen Wellenlängenband
um λR dramatisch zu. Diese Abweichung wird Resonanz
genannt. Die Resonanz ist empfindlich und kann durch die Ablagerung
von chemischen Mitteln auf der Oberfläche des Partikels gestört werden.
Wenn das Partikel mit einer Rezeptorschicht beschichtet wird, wird
die Resonanz verändert;
jedoch ist es ein überraschender
und wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass wenn sich
dann Liganden mit der Rezeptorschicht verbinden, eine weitere Störung der
Resonanz auftritt, die leicht optisch gemessen werden kann.
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Das
zu dieser Erfindung gehörige
optische Signal wird entweder durch Absorptions- oder Lichtstreuungsfotometrie
gemessen. Die optische Resonanz erhöht den Pegel der Lichtstreuung
und der Absorption um mindestens einen Faktor von 10 über den
normalen Pegel der Lichtstreuung an der Resonanzwellenlänge λR. Dies
ermöglicht
die optische Messung von Partikeln, die eine Größe bis hinab zur Größenordnung
von 100 Ångstroms
(10 nm) besitzen und zwar bei niedrigen Konzentrationen. Solche
kleinen Partikel diffundieren vorteilhafterweise praktisch so schnell
wie Makromoleküle
in Lösung.
Eine solche schnelle Partikelbewegung gekoppelt mit einem Abstand
zwischen den Partikeln, der in der Größenordnung von Mikrometern
(μm) liegt,
bedeutet, dass die Bindungsreaktion zwischen Ligand und Rezeptoroberfläche mit
fast maximalen Raten auftritt. Solche Partikel-basierten Reaktionen
sollten im Gegensatz zu Bindungsreaktionen gesehen werden, die auf flachen
Oberflächen
auftreten, wie z. B. wenn Rezeptoren auf der Oberfläche von
Mikrovertiefungen immoblisiert werden. Dort muss der Ligand über Abstände von
ungefähr
1 mm (1000 μm)
oder mehr diffundieren, um den Rezeptor zu erreichen. Diese letzteren
Reaktionen sind langsam und verhindern den erwünschten hohen Durchsatz eines
automatisierten Systems zur Untersuchung von Bindungsreaktionen.
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Die
Bindungsreaktionen und die Signalwandlung in der vorliegenden Erfindung
treten in einem einzigen schnellen Schritt auf. Dies ermöglicht es,
Bindungsassays auf einfache Weise zu automatisieren und mit solchen
Systemdurchsatzraten durchzuführen,
das große
Sammlungen von Liganden und Rezeptoren in relativ kurzen Zeiträumen von
Maschinen, die durchgehend laufen und Fluid-Handhabungsmechanismen
mit geringer Komplexität
nutzen, auf eine Bindungsaffinität
ausgewertet werden können.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 stellt
eine schematische Ansicht der Lichtstreuungs- und Lichtabsorptionsmessung dar.
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2 zeigt
ein schematisches Diagramm der Lichtquellenstabilisierung, die in
der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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3 veranschaulicht
die Verwendung von optischer Bildgebung, um gestreutes Hintergrundlicht
zu minimieren.
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4 ist
parametrischer Graph von k gegen n für Silber, der den Effekt der
Resonanz auf das Lichtabsorptionsmaß zeigt.
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5 ist
ein Graph, der den Effekt des Partikeldurchmessers auf die optische
Resonanz zeigt.
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6 ist
ein Graph, der den Effekt der Beschichtung der resonanten Partikel
mit Protein auf die optische Resonanz zeigt.
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7 ist
ein Graph, der den Effekt der Bindung des nicht etikettierten Liganden
mit den resonanten Partikeln auf die optische Resonanz zeigt.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
folgende Beschreibung wird bereitgestellt, um jeden Fachmann in
die Lage zu versetzen, die Erfindung herzustellen und zu verwenden,
und stellt die besten Wege dar, die vom Erfinder in Betracht gezogen wurden,
um seine Erfindung durchzuführen.
Verschiedene Abwandlungen werden jedoch dem Fachmann leicht offensichtlich
bleiben, da die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung
hier spezifisch definiert wurden, um ein Verfahren zur Messung der
Bindung von nicht etikettierten Liganden mit optisch resonanten Kolloidpartikeln
bereitzustellen.
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Mit
Bezug auf 1 ist ein Behälter 10 für die flüssigen Elemente
der Reaktionsmischung vorhanden und umfasst ein Fenster 12 für den Eintritt
von Licht von einer Lichtquelle 14 und einen zweiten Satz
von Fenstern 16, 18, durch welche transmittieres
bzw. gestreutes Licht zu einem Detektor oder einem Satz von Detektoren 22, 24 durchtreten
kann. In einem Beispiel ist der Behälter eine Mulde in einer Mehrfachmulden-Titerwanne und in
einem alternativen Beispiel ist der Behälter eine Küvette, wie sie in optischen
Spektrofotometern eingesetzt wird. Ein Beispiel der Vorrichtung
verwendet eine Integrationskugel (Ulbrichtkugel) 26, um
das gestreute Licht zu integrieren, von dem durch einen Öffnung in
der Kugel 26 eine Probe genommen wird. Andere Öffnung erlauben
die Beleuchtung des Probenbehälters 10 und
die Messung des transmittierten Lichts durch den Transmissionsdetektor 22.
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Die
Messung der Lichttransmission kann durchgeführt werden, indem ein Probensignal
mit einem Bezugssignal verglichen wird. Das Probensignal wird erhalten,
indem das durch die Probe an oder in der Nähe des Resonanzwellenlänge λR transmittierte
Licht gemessen wird. Das Bezugssignal wird auf eine von zwei Weisen
abgeleitet. Entweder es kommt von Licht, das an Wellenlängen ausreichend
außerhalb
des resonanten Bands bei λR durch die Probe transmittiert wurde, oder
es kommt von Licht, das durch eine andere Mulde transmittiert wurde,
die Partikel mit derselben Konzentration wie die Reaktionsmischung
enthält,
wobei jedoch der Ligand fehlt (z. B. eine Kontrollmischung). Am
häufigsten
wird irgendeine Art von optischen Chopper oder alternativ ein optischer
Strahlenteiler verwendet, um die Proben- und Bezugsstrahlen aus
einer einzigen Lichtquelle abzuleiten. Diese Ansätze sind wichtig, wenn die
Reaktionsmischung farbige Komponenten enthält, die es schwierig machen
könnten,
das relativ kleine Resonanzsignal ohne einen solchen Doppelstrahlansatz
zu messen. Wie in 2 gezeigt ist, wird die für diese
Messungen verwendete Lichtquelle 14 am besten stabilisiert.
Eine besonders nützliche
Lichtquelle wird von einer lichtemittierenden Diode (LED) 14' bereitgestellt,
die direkt von einem Lichtquellenstromversorgungsmodul 42 elektrisch
moduliert werden kann und zwar als Reaktion auf ein Rückkopplungssignal
von einem Detektor 44, der Licht bei λR überwacht,
welches nicht durch die Reaktionsmulde durchgetreten ist.
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3 zeigt
eine nützliche
optische Anordnung, um unerwünschte
Hintergrundsignale zu vermeiden. Eine Linse 32 bildet das
flüssige
Innere 52 der Reaktionskammer 10 auf die Oberfläche eines
optischen Detektors 22 ab. Auf diese Weise sind die Wände 54 des
Behälters 10,
welche dazu neigen, Licht zu streuen und unerwünschten Hintergrund zu erzeugen,
außer
Fokus und das von den Wänden
kommende Hintergrundlicht kann mit Feldblenden und/oder einer Apertur 34 verringert
werden.
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In
diesem Beispiel wurden die resonanten Partikel aus Silberkolloiden
zubereitet, wie sie von British Biocell International, Cardiff,
U. K., erworben werden können.
Kleine Silberpartikel weisen eine optische Resonanz im violetten
Bereich des Spektrums auf. 4A zeigt
einen Graph von n(λ)
und k(λ),
der darstellt, dass bei λR = 390 nm (4B)
n(λ) sich
0 annähert
und k(λ)
sich √2
annähert,
wenn sich die Partikel im Vakuum befinden. Wenn die Partikel in
Wasser getaucht sind, wird die Resonanz gestört und zu einer längeren Wellenlänge in der
Nähe von
400 nm verschoben. Ein solches Resonanzverhalten wird bei makroskopischem
Silbermaterial nicht beobachtet, es wird lediglich bei kleinen Silberpartikeln
beobachtet, wo die Partikelumgrenzungen von Abständen getrennt sind, die klein
sind im Vergleich mit der Wellenlänge des einfallenden Lichts.
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Die
Resonanzwellenlänge
ist auch eine Funktion des Partikeldurchmessers. 5 zeigt
eine Reihe von Lichttransmissionsspektren von Suspensionen von Silberpartikeln
verschiedener Durchmesser, die in der Nähe der Resonanzwellenlänge genommen
wurden. Es ist ersichtlich, dass für Partikel mit einem Durchmesser
von 20,1 nm die Absorption der Probe über ein enges Band in der Nähe von 400
nm dramatisch zunimmt. Die Resonanz wird zu längeren Wellenlängen verschoben,
wenn der Partikeldurchmesser zunimmt, und die Resonanz wird zu einer
weniger scharf ausgeprägten
Spitze und wird über
ein breiteres Wellenlängenband verteilt.
Mit Partikeln mit einem Durchmesser von 76,8 nm hat sich beispielsweise
die Resonanzwellenlänge zu
ungefähr
460 nm nach außen
bewegt und die Resonanz ist ungefähr ein Drittel schwächer als
für 20,1 nm-Partikel.
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Die
Silberpartikel wurden dann mit dem bindenden Protein Streptavidin
(MW 65.000) beschichtet. Die Beschichtung wurde durch passive Adsorption
bei Raumtemperatur durchgeführt.
Zum Zwecke der Proteinbeschichtung wurde zuerst eine wässrige Lösung der
kolloidalen Silberpartikel mit Tris/HCl-Puffer, pH 9,0 auf ein optisches
Absorptionsvermögen
bei der Resonanzwellenlängenspitze
von 1,1 Einheiten optischer Dichte verdünnt, wodurch eine abschließende Pufferkonzentration
von 200 mM Tris/HCl erzielt wurde. Streptavidin wurde bis zu einer
Konzentration von 0,1 μg/ml
hinzugefügt
und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bebrütet. Spektrofotometrische Messungen
wurden vor dem Hinzufügen
des Proteins und 20 Minuten nach dem Hinzufügen des Proteins genommen.
Zu Zwecken des Ablesens der Absorption wurden beide Proben im Verhältnis 1:10
mit 200 nM Tris/HCl-Puffer, pH 9,0 verdünnt. 6 zeigt
die Partikelabsorptionsresonanz vor 62 und nach 64 Proteinbeschichtung.
Das Streptavidin stört
die Resonanz, indem es die Absorptionsspitze sehr geringfügig zu einer
längeren
Wellenlänge
verschiebt und das Absorptionsmaximum verringert.
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Wenn
die Streptavidin-beschichteten Partikel später mit einer Lösung aus
Biotin in Kontakt gebracht wurden, wurde beobachtet, dass die Resonanzspitze
mit der Zeit abnimmt. 7 ist ein Absorptionsspektrum 68,
das aufgenommen wurde 5 Minuten nachdem die Streptavidin-beschichteten
Partikel mit einer Teilprobe (Aliquot) einer Lösung in Kontakt gebracht wurden,
die 10 ng/ml Biotin enthält
(MW 100). Die Bindungsreaktion war im Wesentlichen innerhalb von
5 Minuten vollendet. Der Zeitverlauf der Biotinbindung kann direkt
in der Reaktionsmischung gemessen werden. Dies wird mit einem Absorptionsspektrum 66 der
Partikel vor dem Hinzufügen
von Biotin verglichen (diese Probe wurde mit einer Teilprobe (Aliquot)
aus Puffer vorverdünnt,
die dem später
hinzugefügten
Biotin äquivalent
war, um Lösungseffekte
zu korrigieren).
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Die
Abnahme der resonanten Absorptionsspitze nach 5 Minuten der Bindung
ist eine Funktion der Biotinkonzentration, wie in der folgenden
Tabelle gezeigt ist.
| Biotinkonzentration | Abnahme
des Absorptionsgrads |
| 1
ng/ml | Abnahme
von 0,002 Absorptionseinheiten |
| 3
ng/ml | Abnahme
von 0,010 Absorptionseinheiten |
| 10
ng/ml | Abnahme
von 0,015 Absorptionseinheiten |
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Diese
Streptavidin-beschichteten Partikel wurden auf ihre spezifische
Wirksamkeit (Spezifizität)
getestet, indem sie mit anderen kleinen Molekülen in Kontakt gebracht wurden,
die sich nicht an Streptavidin binden. In allen Fällen betrug
die Änderung
des Absorptionsgrads weniger als 0,001 Absorptionseinheiten bis
zu Konzentrationen von μg/ml.
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In
einem zweiten Test wurde in Lösungsphase
befindliches Hapten-Rhodamin mit einem Murin-Anti-Rhodamin-Antikörper verwendet,
der auf den Silberpartikeln immobilisiert wurde. Die Beobachtungen
einer ähnlichen
Abnahme des optischen Absorptionsgrads über einen ähnlichen Zeitraum wurden wiederholt
und zeigten an, dass die Unterschiede im Molekulargewicht und der
Größe zwischen
Streptavidin und Mäuseimmunoglobulin
den Ausgang des Experiments nicht wesentlich beeinflussen.
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Andere
Verfahren zur Immoblisierung von Biomolekülen auf der Oberfläche des
Silbers oder anderer resonanter Kolloidpartikel sind möglich. Große Zahlen
von bifunktionellen oder polyfunktionellen organischen Molekülen mit
reaktiven Gruppen zum Anbringen von Biomolekülen an festen Oberflächen sind
dem Fachmann wohl bekannt. Diese reaktiven Gruppen umfassen unter
anderem Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate und Succinimidylester.
Neben der einfachen Absorption können
auch selbstordnende Monoschichten verwendet werden, um funktionelle
Gruppen an einer Metalloberfläche
bereitzustellen, die bei der Immobilisierung von Rezeptoren nützlich sind.
Rezepetoren, die aus Zellen isoliert werden, können ebenfalls mit Fragmenten
von Zellmembranen immobilisiert werden, in welchen die Rezeptoren
eingebettet sind.
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Ein
auf den hier beschriebenen Prinzipien basierendes tatsächliches
Experiment würde
irgendeine Art eines Probenhandhabenden Fluid- und Datenverarbeitungssystems
(Computer) sowie die oben beschriebenen Spektrofotometer umfassen.
Z. B. könnte
bei der Untersuchung einer chemischen Bibliothek, bei der nach einem
neuen therapeutischen Medikament gesucht wird, eine Teilprobe (Aliquot)
jeder zu untersuchenden Probe in eine Mulde einer mehrmuldigen Titerplatte
platziert werden. Ein automatisches Indexsystem würde die Platte
bewegen, um jede Mulde in den Analysestrahl eines wie oben gebildeten
Spektrofotometers vorzurücken.
Während
die Mulde in die Analyseposition vorrückt, gibt ein automatisches
Pipettierungssystem eine Teilprobe (Aliquot) von Kolloidpartikeln
in die Mulde ab. Die Partikel besitzen auf ihren Oberflächen den
Rezeptor, mit dem der Medikamentenkandidat in Wechselwirkung treten
soll. Das Pipettierungssystem oder irgendeine andere automatische
Vorrichtung stellt sicher, dass die Partikel und die Testverbindung
eingehend gemischt werden. Das Spektrofotometer misst dann jede
Veränderung
an der Resonanzspitze als Indikator einer Bindung. Bevorzugt finden
diese Messungen in einem Zeitraum von wenigen Minuten statt, so
dass ein Zeitverlauf für
die Bindung bestimmt werden kann. Der Computer empfängt diese
Daten und berechnet die Ergebnisse für jeden Verbindungskandidat.
Die Vorrichtung bewegt sich dann weiter zur nächsten Mulde. Wenn die Bindung über einen
Zeitraum von 5 Minuten gemessen wird, können 12 Probenverbindungen
pro Stunde analysiert werden. Wenn der Testzeitraum kürzer ist,
kann eine große
Anzahl untersucht werden. Ein Instrument kann mit Dutzenden von
Platten vorgeladen werden, so dass die Analyse Tag und Nacht ohne
menschliches Eingreifen voranschreiten kann. Die Instrumente sind
klein und ziemlich kostengünstig,
so dass eine Vielzahl von Instrumenten parallel arbeiten kann, um
Tausende von Verbindungskandidaten in einem Zeitraum von 24 Stunden
zu untersuchen. Natürlich
sind viele Variationen der Tests möglich. Indem ein bekannter
Ligand für
den Rezeptor eingeschlossen wird, kann man die Konkurrenz oder die
Inhibition durch die Testverbindung untersuchen.