DE69426303T2

DE69426303T2 - Verfahren zur unterdrückung der immunantwort durch gentherapie

Info

Publication number: DE69426303T2
Application number: DE69426303T
Authority: DE
Inventors: R. Barber; W. Dubensky; E. Ibanez; J. Irwin; J. Jolly; F. Warner
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2014-09-03
Also published as: DE69426303D1; AU7830794A; CA2158934A1; ATE197609T1; EP0716710A1; WO1995006744A3; WO1995006744A2; EP0716710B1; JPH09504168A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Gentherapie, und besonders Verfahren, Lymphozyten daran zu hindern, Gewebe, das Fremdgene exprimiert, zu erkennen und dessen Zerstörung zu bewirken.

Hintergrund der Erfindung

Das Wesen der menschlichen Biologie und Erkrankung hängt von der Funktion oder Fehlfunktion spezifischer Gene ab. Gewisse Genprodukte sind daher für normales Wachstum, normale Entwicklung, Homöostase, Vermehrung, Immunität und normalen Stoffwechsel notwendig. Viele genetische Erkrankungen, die durch die Vererbung von defekten Genen bewirkt werden, resultieren in der fehlenden Fähigkeit, normale Genprodukte herzustellen, beispielsweise die Thalassaemie, die Phenylketonurie, das Lesch-Nyhan-Syndrom, die schwere kombinierte Immundefizienz (SCID), die Hämophilie A und B, die cystische Fibrose, Duchenne's muskuläre Dystrophie, vererbtes Emphysem und familiäre Hypercholesterinämie (Mulligan et al., Science 260: 926, 1993; Anderson et al., Science 256: 808, 1992; Friedman et al., Science 244: 1275, 1989). Obwohl genetische Erkrankungen in der Abwesenheit eines Genproduktes resultieren können, werden endokrine Erkrankungen, wie Diabetes und Hypopituitarismus, durch die Unfähigkeit des Gens bewirkt, geeignete Mengen an den jeweiligen Hormonen Insu- Im bzw. dem humanen Wachstumshormon zu produzieren.
Die somatische Gentherapie ist ein wirksames Verfahren, diese Arten von Erkrankungen zu behandeln. Die Therapie umfaßt das Einführen von normalen, rekombinanten Genen in somatische Zellen, so daß neue Proteine oder ein Fehlen von Proteinen in den Zelten eines Patienten produziert wird. Beispielsweise wird die Thallassaemie durch eine Veränderung der Gene bewirkt, die für die Produktion von Hämoglobin verantwortlich sind. Die Einführung eines normalen Hämoglobingens in die Vorläuferzellen der roten Blutzellen würde die Expression normaler Mengen Hämoglobin bewirken. Diese Wiederherstellung der normalen metabolischen Funktion stellt die Unfähigkeit des Individuums, ein wichtiges Genprodukt zu synthetisieren, ab, und es würde erwartet werden, daß der Erkrankungsprozeß aufgehoben wird. Zusätzlich kann dieses Gen auch verwendet werden, um den Verlauf von polygenen, multifaktoriellen und erworbenen Erkrankungen zu beeinflussen. Im eigentlichen wirkt die somatische Gentherapie als ein Arzneimittelbereitstellungssystem für Protein- und RNA-Moleküle.
Ein Verfahren zur Übertragung von rekombinanten Genen ist der DNA-vermittelte Gentransfer oder die Transfektion. Die Transfektion umfaßt es, kultivierte Zellen verschiedenen Arten von DNA auszusetzen, und es ihnen zu erlauben, diese Moleküle aufzunehmen und die Produkte zu exprimieren, für die diese codieren. Protokolle für physikalische und chemische Verfahren der Aufnahme umfassen Calciumphosphatpräzipitate, die direkte Mikroinjektion von DNA in intakte Zielzellen (Williams et al., PNAS 88: 2726, 1991), und die Elektroporation, wobei Zellen, die in einer leitenden Lösung suspendiert vorliegen, einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden, um die Membran vorübergehend zu polarisieren, wodurch der Eintritt von Makromolekülen in der Größe von Genen möglich wird. Andere Verfahren umfassen den DNA-Liganden-Gentransfer, wobei die DNA an ein Glykoprotein gebunden ist, das an einen Rezeptor einer spezifischen Zelle bindet, beispielsweise Binden von DNA an ein Asialoglykoprotein, welches an Asialoglykoproteinrezeptoren auf Hepatocyten bindet (Liang et al.,. lin. Invest. 91: 1241, 1993), DNA ligiert an ein inaktiviertes Adenovirusteilchen (Cotten et al., PNAS 89: 6094, 1992), Teilchenbombardierung mit an Teilchen gebundener DNA, Liposomen, die rekombinante Plasmide umschließen, die verschiedene interessierende Gene enthalten (Nabel et al., PNAS 89: 5157, 1992; WO 93/00051), und Spheroplastenfusion, wobei E. coli, die rekombinante Plasmide enthalten, von ihren äußeren Zellwänden befreit werden und mit Polyethylenglykol an Säugerzellen fusioniert werden (Cline et al., J. Pharmac. Ther. 29: 69, 1985, und Friedmann et al., cience 244: 1275, 1989). Die durch diese Verfahren erreichte rekominante Genexpression in kultivierten Zellen kann kurzzeitig sein, mit einer Effizienz von etwa 1% in geeigneten Empfängerzellen, und es kann eine stabile Integration in die Chromosomen ermöglicht werden.
Ein anderes Verfahren zur Übertragung von Nukleinsäuren auf tierische Zellen ist der Viren-vermittelte Gentransfer oder die Transduktion. Dies erhöht die Transfereffizienz bedeutend durch die Verwendung von viralen Vektoren, die fähig sind, praktisch jede Zelle in der Zielpopulation zu infizieren. Es wurde gezeigt, daß die virale Transduktion hocheffektiv ist, da die Viren ausgewählte und spezifische Methoden des Eintritts in die Zelle verwenden (Cline et al., Pharmac. Ther. 29: 69, 1985). Um Vektorkonstrukte zu verabreichen, können viele Viren verwendet werden, einschließlich beispielsweise des Poliovirus (Evans et al., Nature 33: 385, 1989; Sabin et al., J. of Biol. Standardization 1: 115, 1973), des Rhinovirus (Arnold et al., J. Cell. Biochem. L401, 1990); des Pockenvirus, wie des Kanarienpockenvirus oder des Kuhpokkenvirus (Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317, 1989, und Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86, 1989; Flexner et al., Vaccine 817, 1990); des SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108, 1979; Madzak et al., J. Gen. Vir. 73: 1533, 1992); des Grippevirus (Luytjes et al., ell 59: 1107, 1989; McMicheal et al., The New England Journal of Medicine 309: 13, 1983 und Yap et al., Nature 273: 238, 1978); des Adenovirus (Berkner et al., Biotechniques 6: 616, 1988, und Rosenfeld et al., cience 252: 431, 1991); des Adeno-assoziierten Virus (Samulski et al., Journal of Virology 633822 19, und Mendelson et al., Virolology 16: 154, 1988); des Herpesvirus (Kit et al., Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219, 1989); des HIV (Buchschacher et al., J. Vir. 66: 2731, 1992; EPO 386 882), des Masernvirus (EPO 440 219), der Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 234: 1188, 1989) und des Coronavirus (Hemre et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med 121: 190, 1966).
Viele DNA-Viren, die für die Transduktion verwendet werden, weisen eine Reihe von Problemen auf, einschließlich der Produktion von anderen viralen Proteinen, die zu einer Pathogenese oder zu der Unterdrückung des gewünschten Proteins führen können, der Fähigkeit des Vektors, sich im Wirt unkontrollierbar zu replizieren und die pathogene Kontrolle einer solchen unkontrollierten Replikation, der Anwesenheit von Wildtyp-Virus, die zu einer Virämie führen kann, und der transienten Art der Expression bei diesen Systemen. Bisher haben diese Schwierigkeiten die Verwendung von viralen Vektoren, die auf DNA-Viren basieren, bei der Behandlung von viralen, Krebs-, parasitären, genetischen und anderen nicht-bakteriellen Erkrankungen, begrenzt.
Im Vergleich dazu wurden mit RNA-enthaltenden Viren für die somatische Gentherapie hohe Erwartungen verknüpft. Einige dieser Vektoren (z. B. retrovirale Vektoren) wandeln das interessierende RNA-Gen in DNA um und integrieren diese Sequenz in das Wirtsgenom. Sie können in einfacher Weise so verändert werden, daß sie nicht replizieren können, wodurch ihnen die Fähigkeit genommen wird, neue kompetente virale Teilchen zu bilden. Im Gegensatz zu den physikalischen Methoden des rekombinanten Gentransfers bieten Viren einen hocheffizienten Eintritt in die Zielzellen, eine stabile Integration in das Wirtsgenom (wenn gewünscht), eine konservierte vorhersagbare Struktur für die eingeführten Gensequenzen, einen weiten Wirtsbereich und geringe Toxizität.
Der Hauptfokus der somatischen Gentherapie ist es, rekombinante Gene in unterschiedliche somatische Stellen einzuführen und eine stabile und geeignete Regulation der Genexpression zu erreichen. Viele solcher Stellen können als Ziele für somatische Gentherapie in Erwägung gezogen werden, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen, Keratinocyten, follikuläre Schilddrüsenzellen und hämatopoetische Vorläuferzellen und verschiedene Zelltypen, die in irgendeiner Weise sich in pathogenem Zustand befinden. Zur Zeit sind Knochenmarkszellen, Hepatocyten und T-Lymhocyten Gegenstand klinischer Versuche (Ledley et al., Growth Gen. and Hor. 8: 1, 1992). Beispielsweise wurden rekombinante retrovirale Vektoren, die das Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Gen enthalten, das verantwortlich für das Lesch-Nyhan-Syndrom ist, in Knochenmarkszellen transferiert. Die Wiederherstellung ausreichender HPRT-Aktivität hat gezeigt, daß in Kultur ein Gentransfer diesen spezifischen metabolischen Defekt korrigieren kann (Miller et al., Science 22: 630, 1984 und Gruber et al., Science 230: 1057, 1985). Eine Reihe anderer Erkrankungen wurde für die Behandlung mit Gentherapie vorgeschlagen, einschließlich der Adenindeaminasedefizienz, der cystischen Fibrose, der α&sub1;-Antitrypsindefizienz, dem Gaucher's-Syndrom, und auch nicht-genetische Erkrankungen. An Knochenmarkszellen werden hohe Erwartungen geknüpft, da sie einfach erreichbar sind und in vitro verändert werden können. Die Transformation einer bestimmten Population an Stammzellen würde daher die Hämatopoese unterstützen und theoretisch die gesamte Menge an aus Mark erhältlichen Elementen wieder auffüllen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch die resultierende Immunantwort gegenüber dem eingeführten Protein, welches als fremd angesehen wird.
Es besteht daher auf dem Gebiet ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Unterdrückung der dem Gentransfer folgenden Immunantwort, ohne die Nebenwirkungen oder Nachteile von früher beschriebenen Verfahren. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt weiterhin andere verwandte Vorteile bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, ausgewählte Zellen eines Tieres mit einem multivalenten rekombinanten Virus zu transformieren, der eine Sequenz, die für ein interessierendes therapeutisches Protein codiert, und eine Sequenz, die den Antigenpräsentierungsweg inhibiert, enthält. Unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, die Immunantwort in einem Tier zu unterdrücken, umfassend das Transformieren von Gewebezellen eines Tieres mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt, das ein therapeutisches Protein und ein zweites Protein oder einen aktiven Anteil des zweiten Proteins exprimiert, das bzw. der fähig ist, die MHC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, so daß eine Immunantwort gegen das therapeutische Protein supprimiert wird. Unter einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Unterdrückung einer Immunantwort in einem Tier, indem Gewebezellen aus diesem Tier entnommen werden; diese Gewebezellen mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt transformiert werden, das ein therapeutisches Protein und ein zweites Protein oder einen aktiven Anteil dieses zweiten Proteins exprimiert, das oder der fähig ist, die MHC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, und die transformierten Gewebezellen wieder in ein Tier eingeführt werden, so daß eine Immunantwort gegen die Gewebezellen unterdrückt wird. Als ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung steuert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt die Expression eines Proteins, welches fähig ist, β&sub2;-Mikroglobulin, wie das aus HCMV erhaltene Protein H301, zu binden. Als ein anderes Ausführungsbeispiel steuert das rekombinante Vektorkonstrukt die Expression eines Proteins, das fähig ist, das MHC Klasse I schwere Ketten-Molekül intrazellulär zu binden, wie E3/19K.
Als verwandter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung exprimiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und eine gegensinnige Boten-RNA, die fähig ist, die MHC-Antigenprästentation zu inhibieren. In verschiedenen Ausführungsbeispielen exprimiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und eine gegensinnige Boten-RNA, die eine konservierte Region der MHC Klasse I schwere Ketten-Transkripte, das β&sub2;-Mikroglobulin-Transpkript oder das PSF-1-Transporterprotein- Transkript bindet.
Als ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung exprimiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und transkipiert ein Ribozym, welches fähig ist, die MHC-Antigenprästentation zu inhibieren. In verschiedenen Ausführungsbeispielen ist das Ribozym fähig, eine konservierte Region der MHC Klasse I schwere Ketten- Transkripte, des β&sub2;-Mikroglobulin-Transkriptes oder des PSF-1-Transportprotein-Transkriptes zu spalten.
In bevorzugten Ausfihrungsbeispielen der vorliegenden Erfindung exprimiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt mindestens ein therapeutisches Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Faktor VIII, Faktor IX, Hämoglobin, Phenylalaninhydroxylase, Adenosindeaminase, Hypoxyanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, α&sub1;-Antitrypsin, Dystrophin, cystische Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator, Glucocerebrosidase und den LDL-Rezeptor aus Leber.
Unter den unterschiedlichen, oben beschriebenen Gesichtspunkten, kann das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt von einem rekombinanten Virus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Togaviridae-, Picornaviridae-, Poxviridae-, Adenoviridae-, Parvoviridae-, Herpesviridae-, Paramyxoviridae- und Coronaviridae-Viren, getragen werden. Unter bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein rekombinantes virales Vektorkonstrukt. Besonders bevorzugte Konstrukte umfassen rekombinante retrovirale Vektorkonstrukte.
Gewebezellen, die zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Fibroblastenzellen, Knochenmarkszellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Muskelzellen, neurale Zellen, Heptaocyten, follikuläre Zellen, hämatopoetische Vorläuferzellen und Lymphocyten. Unter allen oben beschriebenen allgemeinen Gesichtspunkten, kann das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt in vivo oder ex vivo verabreicht werden.
Unter einem weiteren verwandten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die Gewebezellen, die mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt transformiert wurden, und ein physiologisch annehmbarer Träger oder ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel umfassen.
Diese und andere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden mit Hinsicht auf die folgende detaillierte Beschreibung verständlich werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

"Transformieren" von Gewebezellen bezieht sich auf die Transduktion oder Transfektion von Gewebezellen durch irgendeine Reihe von Möglichkeiten, die im Fachgebiet bewanderte Fachleute kennen, so daß die transformierte Gewebezelle zusätzliche Polynukleotide, verglichen mit einer Gewebezelle vor Transformation, exprimiert.
"Implantieren" bezieht sich auf die Insertion oder das Transplantieren von Gewebezellen in ein Empfängertier, so daß zumindest ein Teil dieser Gewebezellen nach der Implantation lebensfähig sind. Das implantierte Gewebe kann in Gewebe von gleicher Funktion oder von unterschiedlicher Funktion implantiert werden. Beispielsweise können Gewebezellen aus einem Tier entnommen werden und mit multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukten transformiert werden, bevor sie in einem anderen Tier "implantiert" werden.
"Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt" oder "Vektorkonstrukt" bezieht sich auf eine Zusammenstellung, welche fähig ist, interessierende Sequenzen oder Gene zu exprimieren. Im Fall der Proteinexpression muß das Vektorkonstrukt Promotorelemente umfassen und kann ein Signal umfassen, das die Polyadenylierung steuert. Zusätzlich beinhaltet das Vektorkonstrukt vorzugsweise eine Sequenz, die transkribiert funktionsfähig mit den interessierenden Sequenzen oder Genen verbunden vorliegt und als eine Translationsinitiationssequenz wirkt. Vorzugsweise beinhaltet das Vektorkonstrukt einen selektierbaren Marker, wie Neomycin, Thymidinkinase, Hygromycin, Phleomycin, Histidinol oder Dihydrofolatreduktase (DHFR), sowie auch eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen und eine Translationsterminationssequenz. Zusätzlich muß das Vektorkonstrukt, wenn das Vektorkonstrukt verwendet wird, um retrovirale Teilchen herzustellen, ein retrovirales Verpackungssignal und für den verwendeten Retrovirus geeignete LTRs beinhalten, falls diese nicht schon vorhanden sind. Das Vektorkonstrukt kann außerdem in Kombination mit anderen viralen Vektoren verwendet werden oder physikalisch in die Zellen oder Gewebe, wie weiter unten beschrieben, eingeführt werden. Wie unten ausgeführt, umfaßt das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt eine Sequenz, die mindestens ein interessierendes therapeutisches Protein codiert. Das Vektorkonstrukt umfaßt ebenso eine Sequenz, die ein Protein oder einen aktiven Teil eines Proteins, eine Antisinn-Boten-RNA oder ein Ribozym codiert. Diese Sequenzen sind dazu ausgestaltet, die MHC-Antigenprästentation zu inhibieren, um eine Immunantwort von Klasse I-restringierten T-Zellen gegen die transformierten Gewebezellen zu unterdrücken.
Im allgemeinen werden die hier beschriebenen multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukte durch Auswahl eines Plasmids mit einem starken Promotor und mit geeigneten Restriktionsschnittstellen zur Insertion der interessierenden DNA-Sequenzen stromabwärts von dem Promotor hergestellt. Wie oben ausgeführt, kann das Vektorkonstrukt ein Gen, welches eine antibiotische Resistenz codiert, zur Selektion und auch Terminations- und auch Polyadenylierungssignale aufweisen. Zusätzliche Elemente können Enhancer und Introns mit funktionsfähigen Spleiß-, Donor- und Akzeptorstellen umfassen.
Die Konstruktion von multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukten kann zwei Promotoren erforderlich machen, wenn zwei Proteine exprimiert werden, da ein Promotor möglicherweise eine ausreichende Genexpression des zweiten Gens nicht sicherstellt. Im besonderen kann ein zweiter Promotor nicht notwendig sein, wenn das Vektorkonstrukt eine Antisinn- Boten-RNA oder ein Ribozym exprimiert. In bestimmten Ausführungsbeispielen wird eine interne Ribosomen-Bindungsstelle (IRBS) oder der Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVTK)-Promotor in Verbindung mit dem zweiten interessierenden Gen plaziert, um die Genexpression des zweiten Gens zu verstärkten (siehe Beispiel 7). Kurz gesagt wurde gezeigt, daß hinsichtlich IRBS die stromaufwärtsgelegene, nichttranslatierte Region des Immunglobulin-schwere Ketten-bindenden Proteins das interne Engagement einer bicistronischen Boten- RNA unterstützt (Jacejak et al., Nature 153: 90; 1991). Diese Sequenz ist klein, etwa 300 Basenpaare, und kann vollständig in einen Vektor eingebaut werden, um vielfache Gene einer multicistronischen Boten-RNA, deren Cistrone mit dieser Sequenz beginnen, zu exprimieren.
Wird das rekombinante Vektorkonstrukt von einem Virus getragen, so werden solche Konstrukte durch Insertion von Virensequenzen, die einen Promotor, Spleiß- und Polyadenylierungssignale enthalten, in Plasmide, die das gewünschte interessierende Gen enthalten, hergestellt, wobei Methoden verwendet werden, die im Fachgebiet gut bekannt sind. Der das interessierende Gen enthaltende rekombinante virale Vektor kann sich nach Transduktion in die Zielgewebezellen in hoher Kopienzahl replizieren.
Nach der Herstellung des multivalenten rekombinanten Vektorkonstruktes kann es günstig sein, die Fähigkeit von mit dem Vektor transformierten Zellen zu untersuchen, das interessierende Gen zu exprimieren und/oder die negative Regulierung der MHC-Präsentation zu untersuchen. Im allgemeinen können solche Untersuchungen durch Westernbiot-Analyse, FACS-Analyse oder durch andere Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, durchgeführt werden.
Innerhalb bevorzugter Ausführungsbeispiele wird das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt von einem Retrovirus getragen. Retroviren sind RNA-Viren mit einem positiven Einzelstranggenorn, die im allgemeinen nonlytisch sind. Nach Infektion schreibt der Retrovirus seine RNA in DNA um, wodurch ein Provirus gebildet wird, der in das Wirtszellgenom insertiert wird. Die Herstellung von retroviralen Konstrukten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist detaillierter in einer Anmeldung mit dem Titel "Rekombinante Retroviren" (U.S. 07/586 603, angemeldet 21. September 1990) beschrieben, die als Stand der Technik angeführt wird. Das retrovirale Genom kann gedanklich in zwei Teile geteilt werden. Der "transwirkende" Anteil besteht aus der Region, die für die viralen Strukturproteine codiert, einschließlich des gruppenspezifischen Antigen (gag)-Gens zur Synthese der Kernhüllenproteine; des Polgens für die Synthese der reversen Transkriptase- und Integraseenzyme; und des Envelope-(env)-Gens für die Synthese der Hüllenglykoproteine. Der "cis-wirkende" Teil besteht aus Regionen des Genoms, die im Endeffekt in das virale Teilchen verpackt werden. Diese Regionen beinhalten das Verpackungssignal, die langen außenliegenden Wiederholungen ("long terminal repeats" (LTR)) mit Promotoren und Polyadenylierungsstellen und zwei Startstellen für die DNA-Replikation. Der interne oder "trans-wirkende" Teil des clonierten Provirus wird durch das interessierende Gen ersetzt, um ein "Vektorkonstrukt" herzustellen. Wird das Vektorkonstrukt in eine Zelle gebracht, in der virale Verpackungsproteine vorhanden sind (siehe U.S. 07/800 921), wird die transkribierte RNA als virales Teilchen verpackt werden, welches dann aus der Zelle austreten wird. Diese Teilchen werden benutzt, um Gewebezellen zu transduzieren, wodurch das Vektorkonstrukt in das Zellgenom integrieren kann. Obwohl das Vektorkonstrukt sein Genprodukt exprimiert, ist der Virus, der es trägt, unfähig zur Replikation, da der trans-wirkende Teil des viralen Genoms nicht vorhanden ist. Es können verschiedene Tests benützt werden, um die Anwesenheit irgendeines zur Replikation fähigen infektiösen Retrovirus nachzuweisen. Ein bevorzugter Test ist der in Beispiel 9 beschriebene, ausgedehnte S&spplus;L&supmin;-Test. Bevorzugte retrovirale Vektoren beinhalten amphotrope oder xenotrope Mäuseleukämie oder VsVg-Pseudotyp-Vektoren (siehe WO 92/14829).
Rekombinante Vektorkonstrukte können ebenso mit einer Reihe von viralen Trägern entwickelt und verwendet werden, einschließlich beispielsweise Poliovirus (Evans et al., Na ure 339: 385, 1989 und Sabin et al., J. of Biol. Standardization 115, 1973) (ATCC VR-58), Rhinovirus (Arnold et al., J. Cell. Biochem. L401, 1990) (ATCC VR-1110); Pockenviren, wie der Kanarienpockenvirus oder der Kuhpockenvirus (Fisher-Hoch et al., PNA 86: 317, 1989, und Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17, 1990, U.S. 4 603 112 und U.S. 4 769 330; WO 89/01973) (ATCC VR-111); (ATCC VR-2010); SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108, 1979) (ATCC VR-305); Madzak et al., J. Gen. Vir. 73: 1533, 1992); Grippevirus (Luytjes et al., Cell 59: 1107, 1989; McMicheal et al., The New England Journal of Medicine 309: 13, 1983 und Yap et al., Nature 273: 238, 1978) (ATCC VR-797); Adenovirus (Berkner et al., Biotechniques 6: 616, 1988, und Rosenfeld et al., cience 252: 431, 1991) (ATCC VR-1); Parvovirus, wie der Adeno-assoziierte Virus (Samulski et al., Journal of Virologv 63: 3822, 1989, und Mendelson et al., Virology 166: 154, 1988) (ATCC VR-645); Herpes simplex-Virus (Kit et al., Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219, 1989) (ATCC VR-977; ATCC VR-260); HIV (EPO 386 882, Buchschacher et al., J. Vir. 66: 2731, 1992); Masernvirus (EPO 440 219) (ATCC VR-24), Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 234: 1188, 1989) (ATCC VR-68) und Coronavirus (Hamre et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med 121: 190, 1966) (ATCC VR-740). Es ist den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich, daß die oben angeführten viralen Träger modifiziert werden müssen, um das therapeutische interessierende Gen und Proteine, Antisinn- Boten-RNA oder Ribozyme, die fähig sind, die MRC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, zu exprimieren.
Sobald ein multivalentes Vektorkonstrukt hergestellt worden ist, kann es einem warmblütigen Tier auf einer Reihe von Wegen verabreicht werden, einschließlich sowohl der ex vivo- als auch der in vivo-Verabreichung. Genauer gesagt, kann im in vivo-Zusammenhang nackte DNA oder ein multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt, das eine Sequenz, die ein therapeutisches Protein codiert, und eine Sequenz, die ein zweites Protein oder einen aktiven Anteil des Proteins, eine Antisinn-Boten-RNA oder eine Ribozymsequenz, die fähig ist, die MHC- Antigen-Präsentation zu inhibieren, codiert, enthält, in den interstitiellen Raum von Geweben, einschließlich Muskel, Hirn, Leber, Haut, Milz oder Blut (siehe WO 90/11092) injiziert werden. Die Verarbreichung kann ebenso durch intravenöse Injektion oder direkte Katheterinfusion in die Körperhöhlen bewerkstelligt werden (siehe WO 93/00051). Andere stellvertretende Beispiele für die in vivo-Verabreichung von Vektorkonstrukten umfassen die Transfektion durch verschiedene physikalische Methoden, wie Lipofektion (Felgner et al., PNAS 84: 7413, 1989); die Mikroprojektilbombardierung (Williams et al., PNAS 88 2726, 1991); Liposome (Wang et al., PNAS 84: 7851, 1987); Calciumphosphat (Dubensky et al., PNAS 81: 7529, 1984); DNA- Ligandenkomplexe (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264: 16985, 1989; Cotten et al., PNAS 89: 6094, 1992). Wie oben angeführt, kann das Vektorkonstrukt von einem Virus, wie Kuhpokkenvirus, Sindbis-Virus oder Coronavirus, getragen werden. Weiterhin sind Methoden zur Verabreichung eines Vektorkonstruktes mittels eines retroviralen Vektors durch direkte Injektion detaillierter in einer Anmeldung mit dem Titel "Rekombinante Retroviren" (U.S. 07/586 603) beschrieben, welche hiermit als Referenz aufgenommen wird.
Zusätzlich können ex vivo-Verfahren benutzt werden, bei denen Zellen aus einem Tier entnommen werden, mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt transformiert werden und in ein Tier überführt werden. Zellen, die transformiert werden können, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Fibroblasten, Endothelzellen, Heptocyten, Epithelzellen, Lymphocyten, Keratinocyten, follikuläre Schilddrüsenzellen und Knochenmarkszellen. Es wird offensichtlich sein, daß man irgendeinen der oben angeführten viralen Träger verwenden kann, um das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt in einem ex vivo-Zusammenhang in die Gewebezellen einzuführen. Protokolle für physikalische und chemische Methoden für die Aufnahme umfassen Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion der DNA in intakte Zielzellen und Elektroporation, bei der die Zellen, die in einer leitenden Lösung suspendiert sind, einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden, um die Membran vorübergehend zu polarisieren, wodurch der Eintritt von Makromolekülen möglich wird. Andere geeignete Verfahren umfassen die Verwendung von an einen Liganden gebundener DNA, von an einen inaktivierten Adenovirus gebundener DNA (Cotten et al., PNAS 89: 6094, 1992), Bombardierung mit an Teilchen gebundener DNA, rekombinante Vektorkonstrukte einschließende Liposomen und Spheroplastenfusion, wobei E. coli, die rekombinante virale Vektorkonstrukte enthalten, von ihrer äußeren Zellwand befreit werden und unter Verwendung von Polyethylenglykol mit tierischen Zellen fusioniert werden, und virale Transduktion (Cline et al., J. Pharmac. Ther. 29: 69, 1985, und Friedmann et al., Science 244: 1275, 1989).
Mit beiden in vivo- und ex vivo-Verfahren werden die Gewebezellen mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt transformiert, das eine Sequenz, die mindestens ein therapeutisches Protein codiert und eine Sequenz, die ein zweites Protein oder einen aktiven Teil dieses Proteins, eine Antisinn-Boten-RNA oder ein Ribozym codiert, die jeweils fähig sind, die MAC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, enthält. Wie unten genauer diskutiert, kann das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt mehr als ein Protein (oder eines aktiven Anteils davon), Antisinn-Boten-RNA oder Ribozym zusätzlich zu einem oder mehreren therapeutischen Proteinen codieren. In einem ex vivo-Kontext werden die transformierten Zellen in ein Testtier implantiert und auf Genexpression hin, wie in Beispiel 14 beschrieben, untersucht. Alternativ können die transformierten Zellen ex vivo getestet werden unter Verwendung eines in Beispiel 16 beschriebenen humanen Gewebekultursystems. Die Protokolle variieren, abhängig von den gewählten Gewebezellen. Kurz gesagt wird ein multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt, welches eine Sequenz trägt, dessen Expression die MRC Klasse I-Präsentation inhibiert, in Gewebezellen transformiert. Bevorzugt werden 10&sup5; bis 10&sup9; Gewebezellen transformiert. Die Zellen werden kultiviert, und transformierte Zellen können aufgrund der Antibiotikumresistenz ausgewählt werden. Die Zellen werden auf Genexpression hin durch Westernblot-Analyse und FACS-Analyse oder durch andere Mittel untersucht. Beispielsweise werden, wie unten genauer beschrieben, Knochenmarkszellen, die transformiert wurden, durch intravenöse Administration von 2 bis 3 · 10&sup7; Zellen in ein Tier implantiert. Die in vivo-Expression der transformierten Zellen kann durch Methoden, die für das verwendete therapeutische Protein geeignet sind, nachgewiesen werden. In dieser Hinsicht wird die erfolgreiche und ausreichende Unterdrückung der Immunantwort durch die andauernde Produktion des Proteins angezeigt werden.
Wie oben diskutiert, stellt die vorliegende Erfindung Methoden und Zusammensetzungen bereit, die geeignet sind zur Insertion einer Sequenz, die ein therapeutisches Protein und eine Sequenz, die fähig ist, die MHC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, um die Immunantwort von Klasse I-restringierten Zellen in einem Tier zu unterdrücken, codiert. Kurz gesagt werden CTL durch das Präsentieren prozessierter Peptide im Kontext mit eigenen MHC-Molekülen zusammen mit Hilfsmolkiilen, wie CDB, dem interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), ICAM-2, (Singer, cience 255: 1671, 1992; Rao, Crit. Rev. Immunol., 10: 495, 1991), dem funktionellen Leukocytenantigen-1 (LFA-1) (Altmann et al., ature 338: 521, 1989), dem B7/BB1-Molekül (Freeman et al., J. Immunol. 143: 2714, 1989), LFA-3 oder anderen Zelladhäsionsmolekülen, spezifisch aktiviert. Eine Präsentation antigener Peptide assoziiert mit MHC- Klasse I-Molekülen führt zur CTL-Aktivierung. Der Transfer und die stabile Integration von spezifischen Sequenzen, die fähig sind, ein therapeutisches Protein und Produkte, von denen erwartet wird, daß sie die MHC-Antigen-Präsentation inhibieren, zu exprimieren, blockieren die Aktivierung von T-Zellen, wie CD8&spplus;-CTL, und verhindern dadurch eine gegen Zellen, die das therapeutische Protein exprimieren, gerichtete Immunantwort. Wie genauer in Beispiel 13 beschrieben, wird ein Standard-CTL-Test verwendet, um diese Antwort nachzuweisen. Bestandteile des Antigenpräsentierungsweges, deren Funktion inhibiert werden kann, um eine effektive MHC-Antigen-Präsentation zu unterdrücken, beinhalten die 45Kd-MHC-Klasse I schwere Kette, β&sub2;-Mikroglobulin, prozessierende Enzyme, wie Proteasen, Hilfsmoleküle (wie oben diskutiert), Chaperone und Transportproteine, wie PSF1.
Unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein multivalentes Vektorkonstrukt bereitgestellt, welches die Expression eines interessierenden therapeutischen Proteins und eines Proteins oder aktiven Teils des Proteins, das fähig ist, die MHC-Klasse I-Antigen- Präsentation zu inhibieren, steuert. Innerhalb der vorliegenden Erfindung bedeutet ein "aktiver Teil" eines Proteins das Fragment des Proteins, das erhalten werden muß, um die biologische Aktivität zu gewährleisten. Solche Fragmente oder aktive Domänen können durch systematisches Entfernen von Nukleotidsequenzen aus der Proteinsequenz, Transformieren von Zielzellen mit dem resultierenden rekombinanten Vektorkonstrukt und Bestimmen der MHC-Klasse I- Präsentation auf der Oberfläche von Zellen unter Verwendung der FACS-Analyse oder anderer immunologischer Tests, wie dem CTL-Test, identifiziert werden. Diese Fragmente sind besonders nützlich, wenn die Größe der Sequenz, die für das vollständige Protein codiert, die Kapazität des viralen Trägers übersteigt. Alternativ kann die aktive Domäne des MHC-Antigen- Präsentations-Inhibitionsproteins enzymatisch gespalten werden und der aktive Teil durch biochemische Methoden gereinigt werden. Beispielsweise kann ein monoklonaler Antikörper, der den aktiven Teil des Proteins blockiert, verwendet werden, um den aktiven Teil des gespaltenen Proteins zu isolieren und zu reinigen (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, 1988).
In einem Ausführungsbeispiel steuert das rekombinante Vektorkonstrukt die Expression eines Proteins oder eines aktiven Teils eines Proteins, das intrazellulär an neu synthetisierte MHC-Klasse I-Moleküle bindet. Diese Bindung verhindert die Wanderung des MHC-Klasse I- Moleküls aus dem endoplasmatischen Retikulum, wodurch die terminale Glykosylierung inhibiert wird. Dies blockiert den Transport dieser Moleküle an die Zelloberfläche und verhindert die Zellerkennung und Lyse durch CTL. Beispielsweise kann eines der Produkte des E3-Gens verwendet werden, um den Transport von MHC-Klasse I-Molekülen an die Oberfläche transformierter Zellen zu inhibieren. Genauer gesagt, codiert E3 für ein 19kD-Transmembran- Glykoprotein, E3/19K, welches von der E3-Region des Adenovirus-2-Genoms transkribiert wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein multivalentes rekombinantes virales Vektorkonstrukt direkt oder indirekt verabreicht, und es enthält ein Gen, das für ein therapeutisches Protein und die E3/19K-Sequenz codiert, und welches bei Expression das therapeutische Protein und das E3/19K-Protein produziert. Das E3/19K-Protein inhibiert die Oberflächenexpression von MHC Klasse 1-Oberflächenmolekülen, einschließlich solcher MHC- Moleküle, die Peptide des therapeutischen Proteins gebunden haben. Daher entgehen Zellen, die durch den Vektor transformiert sind, einer gegen das von ihnen produzierte therapeutische Protein gerichteten Immunantwort. Die Konstruktion eines in dieser Hinsicht stellvertretenden multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukts wird in Beispiel 7 dargestellt.
Innerhalb eines anderen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung steuert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt die Expression eines therapeutischen Proteins und eines Proteins oder eines aktiven Teils eines Proteins, welches fähig ist, β&sub2;-Mikroglobulin zu binden. Der Transport von MHC Klasse I-Molekülen zur Zelloberfläche für die Antigen- Präsentation erfordert die Assoziation mit β&sub2;-Mikroglobulin. Daher inhibieren Proteine, die β&sub2;- Mikroglobulin binden und dessen Assoziation mit MHC Klasse I inhibieren, indirekt die MHC- Klasse I-Antigen-Präsentation. Geeignete Proteine umfassen das H301-Genprodukt. Kurz gesagt codiert das H301-Gen, erhalten von dem humanen Cytomegalovirus (CMV) ein Glykoprotein mit Sequenzhomologie zu der β&sub2;-Mikroglobulin-Bindestelle der schweren Kette des MHC- Klasse I-Moleküls (Browne et al., Nature 3472770, 1990). H301 bindet β&sub2;-Mikroglobulin, wodurch die Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen verhindert wird, und macht transformierte Zellen für cytotoxische T-Zellen nicht erkennbar, wodurch diese der MiiC-Klasse I- restringierten Immunüberwachung entgehen.
Andere, oben nicht diskutierte Proteine, deren Funktion in der Inhibition oder Abwärtsregulierung der MHC-Klasse I-Antigen-Präsentation besteht, können ebenso identifiziert und im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Um solche Proteine zu identifizieren, besonders solche, die von Säugerpathogenen abstammen (und dann wieder aktive Teile hiervon), wird ein rekombinantes Vektorkonstrukt, das ein Protein oder einen aktiven Teil hiervon, exprimiert, von dem angenommen wird, das es fähig ist, die MHC-Klasse I-Antigen- Präsentation zu inhibieren, in eine Testzellinie, wie BC, transformiert. Die Testzellinien werden mit und ohne der Sequenz, die das Kandidatenprotein codiert, mit Stimulatoren und/oder Zielen in dem CTL-Test verglichen. Eine mit der transformierten Testzelle verknüpfte Abnahme der Zellyse weist darauf hin, daß das Kandidatenprotein fähig ist, die MHC-Päsentation zu inhibieren.
Eine alternative Methode, die Abwärtsregulation der MHC-Klasse I-Oberflächenexpression zu bestimmen, ist die FACS-Analyse. Genauer gesagt, werden Zellinien mit einem rekombinanten Vektorkonstrukt, das das Kandidatenprotein codiert, transformiert. Nach Wirkstoffselektion und Vermehrung werden die Zellen durch FACS-Analyse auf die MHC-Klasse I- Expression hin analysiert und mit nicht-transformierten Zellen verglichen. Eine Abnahme in der Zelloberflächenexpression von MHC-Klasse I weist darauf hin, daß das Kandidatenprotein fähig ist, die MHC-Präsentation zu inhibieren (siehe beispielsweise Beispiel 12).
Unter einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein multivalentes Vektorkonstrukt bereitgestellt, welches die Expression von mindestens einem therapeutischen Protein steuert und welches ebenso eine Antisinn-mRNA transkribiert, die fähig ist, die MHC- Klasse I-Antigen-Präsentation zu inhibieren. Kurz gesagt werden Oligonukleotide mit Nukleotidsequenzen, die zu der Protein-codierenden oder "Sinn"-Sequenz komplementär sind, "Antisinn" genannt. Antisinn-RNA-Sequenzen wirken als Regulatoren der Genexpression durch Hybridisierung an komplementäre Boten-RNA-Sequenzen und Verhindern der Translation (Mizuno et al., PNAS 81: 1966, 1984; Heywood et al., Nucleic Acids Res. 14: 6771, 1986). Es können Antigenmoleküle, die die vollständige Sequenz des Zieltranskripts oder irgendeines Teils hiervon umfassen, synthetisiert werden (Ferretti et al., PNAS 83: 599, 1986), in Vektorkonstrukte gebracht werden und effektiv in Zellen eingeführt werden, um die Genexpression zu inhibieren (Izant et al., Cell 36: 1007, 1984). Zusätzlich bietet die Synthese von Antisinn-RNA (asRNA), ausgehend von in umgekehrter Orientierung clonierter DNA, eine zeitliche Stabilität, während die konstitutive asRNA-Expression die normale Zellfunktion nicht berührt.
Innerhalb eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung transkribiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein interessierendes therapeutisches Gen und eine Antisinn-Boten-RNA, die an eine konservierte Region des MHC-Klasse I-Transkripts bindet, wodurch die Zelloberflächenexpression und die MHC-Klasse I-Antigen-Präsentation inhibiert wird. Man kann solche konservierten Regionen durch Computer-unterstützten V ergleich von Sequenzen identifizieren, die verschiedene Klassen von MHC-Genen repräsentieren (beispielsweise HLA A, B und C), die aus DNA-Sequenz-Datenbanken (z. B. Genbank) erhältlich sind. Konservierte Sequenzen werden dann durch Computer-unterstützten Homologieabgleich der Nukleotidsequenzen identifziert. Eine konservierte Region ist eine Sequenz mit weniger als 50% Basenfehlpaarungen, vorzugsweise weniger als 20% Basenfehlpaarung pro 100 Basenpaaren innerhalb von MHC-Klasse I-Genotypen.
Innerhalb eines anderen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung exprimiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und eine Antisinn- Boten-RNA, die für die Bindung an das β&sub2;-Mikroglobulin-Transkript verantwortlich ist. Diese Bindung verhindert die Translation des β&sub2;-Mikroglobulin-Proteins und verhindert dadurch die korrekte Zusammensetzung des MHC-Klasse I-Molekülkomplexes, der zur Zelloberflächenexpression notwendig ist. Innerhalb eines bevorzugten Ausführungsbeispiels wird die Nukleotidsequenz für β&sub2;-Mikroglobulin in ein Vektorkonstrukt in umgekehrter Orientierung cloniert. Die korrekte Antisinnorientierung wird durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt.
Innerhalb eines weiteren Ausfübrungsbeispiels der vorliegenden Erfindung transkribiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und eine Antisinn- Boten-RNA, die für die Bindung des PSF1-Transkripts, eines Peptid-Transporterproteins, verantwortlich ist. Da dieses Protein für die effiziente Zusammenfilgung von MHC-Klasse I- Molekülen notwendig ist, blockiert eine Antisinn-Boten-RNA gegen das PSF1-Transkript den Transport prozessierter antigener Peptidfragmente zu dem endoplasmatischen Retikulum (ER) vor der Assoziation mit dem β&sub2;-Mikroglobulin und dem MHC-Klasse I-Molekülkomplex. Innerhalb eines bevorzugten Ausführungsbeispiels wird die Nukleotidsequenz von PSF1 hergestellt und in umgekehrter Orientierung in das Vektorkonstrukt insertiert und durch Restriktions- Enzymanalyse bestimmt.
Wie oben diskutiert, können die Sequenzen anderer Proteine, die an der Antigen- Präsentation beteiligt sind, ebenso identifiziert werden und zum Ausarbeiten eines multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukts verwendet werden, das fähig ist, eine Antisinn-Boten- RNA zu transkribieren, die den Antigen-Präsentationsweg inhibiert. Genauer gesagt wird die Nukleotidsequenz des Gens, welches das Protein codiert, untersucht, und die identifizierte Sequenz wird verwendet, um eine geeignete Antisinn-Boten-RNA zu synthetisieren. Es wird bevorzugt, eine Sequenz zu verwenden, die komplementär ist zu einem Teil stromaufwärts oder nahe der Startsequenz der Ziel-Boten-RNA. Dies erlaubt der Antisinn-Sequenz, an die Boten- RNA unter Verhinderung der Translation eines signifikanten Teils des Proteins zu binden. Beispiele für solche Moleküle sind ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3 und B7/BB1. Eine Abwärtsregulierung der MHC-Klasse I-Expression oder der Antigen-Präsentation kann durch FACS- Analyse bzw. den CTL-Test, wie in den Beispielen 13 und 15 beschrieben, oder durch andere Mittel, wie oben für Proteine beschrieben, die fähig sind, die MHC-Klasse I-Präsentation zu inhibieren, untersucht werden.
Unter einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, die Immunantwort in einem Tier durch Transformation ausgewählter Zellen des Tieres mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt, welches mindestens ein therapeutisches Protein und ein Ribozym, welches für die enzymatische Spaltung eines Bestandteiles des MHC-Antigen-Präsentationsweges verantwortlich ist, transkribiert, zu unterdrücken. Kurz gesagt sind Ribozyme RNA-Moleküle mit enzymatischer Aktivität, die verwendet werden, um andere RNA-Moleküle zu spalten. Sie bestehen aus kurzen RNA-Molekülen, die hochkonservierte Sequenz-spezifische Spaltdomänen besitzen, die von Regionen flankiert werden, welche ein genaues Positionieren des Enzyms, bezüglich der potentiellen Spaltstelle in dem gewünschten Zielmolekül, erlauben. Sie stellen hochgradig flexible Werkzeuge zum Inhibieren der Expression und zur Aktivierung von spezifischen Genen dar (Haseloff et al., Nature 334: 585, 1988). Es können angepaßte Ribozyme hergestellt werden, vorausgesetzt, daß die transkribierten Sequenzen des Gens bekannt sind. Genauer gesagt, kann ein Ribozym hergestellt werden, indem zuerst die besondere Ziel-RNA-Sequenz gewählt wird und dann komplementäre Sequenzen an den Anfang und das Ende der Ribozym-codierenden Sequenz angeheftet werden. Diese Ribozym-produzierende Gen-Einheit kann dann in ein rekombinantes Vektorkonstrukt insertiert werden und verwendet werden, um Gewebezellen zu transformieren. Nach Expression wird das Ziel-Gen durch komplementäres Binden und Spalten neutralisiert, was eine permanente Inaktivierung garantiert. Zusätzlich sind Ribozyrne wegen ihrer enzymatischen Antivität fähig, mehr als ein Ziel zu zerstören.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden multivalente rekombinante Vektorkonstrukte, die spezifische Ribozyme enthalten, verwendet, um das Transkript der konservierten Region des MHC-Klasse I-Moleküls zu spalten, um die Antigen-Präsentation zu inhibieren. In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung codiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und ein Ribozym, das für die enzymatische Spaltung des β&sub2;-Mikroglobulin-Transkriptes verantwortlich ist. Genauer gesagt, spaltet ein Riobzym mit flankierenden Regionen, die komplementär sind zu der Sequenz der β&sub2;-Mikroglobulin-Boten-RNA, das Transkript, wodurch die Proteintranslation und die korrekte Zusammensetzung des MHC-Klasse I-Molekülkomplexes verhindert wird. Dieses inhibiert den Transport des MHC-Klasse I-Komplexes zur Zelloberfläche, wodurch die Antigen- Präsentation verhindert wird.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung codiert das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt ein therapeutisches Protein und ein Ribozym, welches für die enzymatische Spaltung des PSF1-Transkriptes verantwortlich ist, wodurch die Zelloberflächenexpression des MHC-Klasse I-Moleküls unterdrückt und die Antigen-Präsentation verhindert wird. Genauer gesagt, spaltet ein Ribozym, welches mit flankierenden Regionen, die komplementär sind zu einer Sequenz der PSFI-Boten-RNA, ausgestaltet ist, die Transkripte und inhibiert den Transport der Peptide zu dem ER, wodurch die Zusammensetzung des MHC- Klasse I-Komplexes und die Antigen-Präsentation verhindert wird.
Wie oben diskutiert, wird es dem Fachmann klar sein, daß die Sequenzen anderer Proteine, die bei der Antigen-Präsentation eine Rolle spielen, identifiziert und verwendet werden können, um ein rekombinantes Vektorkonstrukt zu entwickeln, das fähig ist, ein Ribozym zu transkribieren, das die MHC-Antigen-Präsentation inhibiert. Die Abwärtsregulation der MHC- Klasse I-Expression oder der Antigen-Präsentation kann durch FACS-Analyse bzw. den CTL- Test, wie in den Beispielen 13 und 15 beschrieben, oder durch andere Mittel, wie oben für Proteine, die fähig sind, die MHC-Klasse I-Präsentation zu inhibieren, beschrieben, untersucht werden.
Wie oben ausgeführt, kann das multivalente rekombinante Vektorkonstrukt mehr als ein Protein, eine Antisinn-Boten-RNA oder ein Ribozym, das fähig ist, die MHC-Antigen- Präsentation zu inhibieren, exprimieren oder transkribieren, um die Effizienz der Suppression der Immunantwort zu verstärken. Nach der Expression verstärken die Genprodukte den Grad der Störung der MHC-Antigen-Präsentation, indem sie einen einzelnen Bestandteil auf zwei verschiedenen Wegen oder zwei verschiedene Bestandteile über den gleichen oder unterschiedliche Wege angreifen. Die Konstruktion von multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukten kann zwei Promotoren erfordern, da ein Promotor unter Umständen nicht den geeigneten Grad der Genexpression des zweiten Gens sicherstellen kann. Ein zweiter Promotor, wie ein interner Ribozym-Bindestelle (IRBS)-Promotor oder der Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVTK)-Promotor, steigert den Grad der Genexpression des zweiten Gens, wenn er in Verbindung mit dem zweiten interessierenden Gen angeordnet wird.
Unter den bevorzugten Ausführungsbeispielen exprimiert oder transkribiert das multivalente Vektorkonstrukt, zusätzlich zu mindestens einem therapeutischen Protein, mindestens zwei der folgenden Bestandteile in jedweder Kombination: (a) ein Protein oder ein aktiver Teil des Proteins E3/19K oder H301; (b) eine Antisinn-Boten-RNA, die das Transkript einer konservierten Region der MHC-Klasse I schwere Kette, β&sub2;-Mikroglobulin oder PSF 1- Transportprotein bindet; und (c) ein Ribozym, das die Transkripte der unter (b) oben angeführten Proteine spaltet. Zusätzlich werden multivalente rekombinante Vektorkonstrukte bereitgestellt, die zwei der hier beschriebenen Proteine oder aktiven Teile der Proteine, zwei Antisinn- Boten-RNAs oder zwei Ribozyme exprimieren. In verwandten Ausführungsbeispielen können eine Reihe von spezifischen Kombinationen, in Verbindung mit Sequenzen, die für mindestens ein therapeutisches Protein codieren, verwendet werden, um ein multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt zu bilden. Beispielsweise kann ein multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt aus einem Gen, das E3/19K oder H301 in Kombination mit der Antisinn- oder Ribozym- Boten-RNA für eine konservierte Region der MHC-Klasse I schwere Kette, β&sub2;-Mikroglobulin oder des PSF1-Transporterproteins exprimiert, bestehen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen interessierende Sequenzen diese ein, die für die folgenden Krankheiten verantwortlich sind, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Thalassaemie, Phenylketonurie, Lesch-Nyhan-Syndrom, schwere kombinierte Immunschwäche (SCID), Hämophilie A und B, cystische Fibrose, Duchenne's muskuläre Dystrophie, vererbtes Emphysem, familiäre Hypercholesterinämie, Gaucher's-Syndrom und verschiedene erworbene Krankheiten, wie Krebs und virale Erkrankungen. Diese Gene codieren für Hämoglobinbestandteile, Phenylalaninhydroxylase, Hypoxanthin-Guanin-Phosphorribosyltransferase, Adenosindeaminase, Faktor VIII und Faktor IX, cystischen Fibrose-Transmembran- Leitfähigkeitsregulator, Dystrophien, α&sub1;-Antitrypsin, den Leberrezeptor für Lipoprotein geringer Dichte (LDL) bzw. Glucocerebrosidase. Sequenzen, die transdominante mutierte virale Proteine codieren, die die virale Replikation inhibieren, mutante, nicht-menschliche oder synthetische Liganden, die an ein geeignetes Protein oder Molekül binden, um den Krankheitsverlauf zu hemmen, und Prodrug-aktivierende Enzyme (wie HSVTK), die die Eliminierung von Zellen durch Prodrugaktivierung erlauben, können ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Im Grunde kann jedes therapeutische Protein, das, wenn es über auf einem Vektor basierende Technologie verabreicht wird, von dem Immunsystem des Patienten/des Tieres als fremd erkannt wird, mit den multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukten, die hier beschrieben werden, in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Unter einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die eines der oben beschriebenen multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukte oder einen rekombinanten Virus, der das Vektorkonstrukt trägt, umfassen, wie Retrovirus, Poliovirus, Rhinovirus, Kuhpockenvirus, Influenzavirus, Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Herpes simplex-Virus, Masernvirus, Coronavirus und Sindbis- Virus, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, umfassen. Die Zusammensetzung kann entweder als flüssige Lösung oder als Festform (z. B. lyophilisiert), die vor Verabreichung in einer Lösung resuspendiert wird, hergestellt werden. Zusätzlich kann die Zusammensetzung mit geeigneten Trägern oder Lösungsmitteln entweder für die Injektion, die orale, nasale oder rektale Verabreichung oder anderen Mitteln, die für den Träger geeignet sind, hergestellt werden. Das Vektorkonstrukt tragend wird es auf eine Konzentration im Bereich von 0,25% bis 25%, und bevorzugt etwa 5% bis 20% vor Formulierung, gereinigt. Nachfolgend wird nach Herstellung der Zusammensetzung das rekombinante Virus, das das Vektorkonstrukt trägt, etwa 10 ng bis 1 ug des Materials pro Dosierung ausmachen, wobei etwa die 10fache Menge des Materials als mitgereinigte Verunreinigungen vorhanden ist. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in 0,1-1,0 ml einer wie unten beschrieben formulierten wäßrigen Lösung hergestellt.
Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Lösungsmittel sind solche, die für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch sind. Stellvertretende Beispiele von Trägern oder Lösungsmitteln für injizierbare Lösungen umfassen Wasser, isotonische Lösungen, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert sind (wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder Tris-gepufferte Kochsalzlösung), und die einen oder mehrere aus Mannit, Trehalose, Lactose, Dextrose, Glycerin und Ethanol, wie auch Polypeptide oder Proteine, wie humanes Serumalbumin (HSA), enthalten. Eine geeignete Zusammensetzung umfaßt rekombinanten Virus, der ein Vektorkonstrukt trägt, in 10 mg/ml Mannit, 1 mg/ml HSA, 20mM Tris pH = 7,2 und 150mM NaCl. Da das rekombinante Virus, das das Vektorkonstrukt trägt, annähernd 10 ng bis 1 ug Material darstellt, kann es in diesem Falle weniger als 1% des gesamten Materials hohen Molekulargewichts, und weniger als 1/100.000 des Gesamtmaterials (einschließlich Wasser) sein. Diese Zusammensetzung ist im allgemeinen bei -70ºC mindestens sechs Monate stabil. Es wird offensichtlich sein, daß grundsätzlich äquivalente Dosierungen des multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukts hergestellt werden können. Unter diesem Gesichtspunkt wird das Vektorkonstrukt 100 ng bis 100 ug des Materials pro Dosis darstellen, wobei etwa die 10fache Menge als mitgereinigte Verunreinigungen vorhanden ist. In ähnlicher Weise werden die transformierten Zellen für die Implantation etwa 10&sup6; bis 10¹¹ Zellen pro Dosis darstellen.
Die Zusammensetzung kann über eine Reihe von Wegen (wie oben diskutiert) verabreicht werden, einschließlich intravenöser (i. v.), subcutaner (s. c.) oder intramuskulärer (i. m.) Injektion. In dieser Hinsicht wird es klar sein, daß die Art der Verabreichung von der verwendeten spezifischen therapeutischen Anwendung und den verwendeten ex vivo-transformierten Zellen (falls solche verwendet werden) beeinflußt wird. Bei rekombinanten Virenn, die das Vektorkonstrukt tragen, liegt die individuelle, normalerweise verwendete Dosis bei 10&sup6; bis 10¹&sup0; c.f.u. (z. B. kolonienbildende Einheiten Neomycinresistenz, bestimmt an HT1080-Zellen). Diese Zusammensetzungen werden in Ein- bis Vierwochen-Intervallen verabreicht, in drei oder vier Dosen (zumindest anfänglich). Nachfolgende Verstärkungsimpfungen können als eine oder zwei Dosen nach 6 bis 12 Monaten und danach jährlich gegeben werden.
Es wird den Fachleuten offensichtlich sein, daß die verwendete Dosierung von einer Reihe von Faktoren beeinflußt werden wird, einschließlich der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Wirkungsmechanismus des therapeutischen Proteins, dem Körpergewicht des Individuums und des Verabreichungsweges.
Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung, und nicht zur Eingrenzung angeboten.

BEISPIELE

Beispiel 1

PRÄPARATION RETROVIRALER PROVEKTOR-DNA AUS MAUS

A. PRÄPARATION DES RETROVIRALEN RÜCKGRATS KT-3B

Das 5' lange, außenliegende Wiederholungs (long terminal repeat, LTR)-EcoR I-EcoR I- Fragment aus dem Moloney-Maus-Leukämievirus (Moloney murine leukemia virus, MoMLV), einschließlich der gag-Sequenzen aus dem N2-Vektor (Armentano et al., J. Vir. 61: 1647, 1987; Eglitas et al., Science 230: 1395, 1985) in dem pUC31-Plasmid wird in das Plasmid SK&spplus; (Stratagene, San Diegeo, CA) ligiert. Das resultierende Konstrukt wird N2R5 genannt. Das N2R5-Konstrukt wird durch Sequenz-spezifische in vitro-Mutagenese mutiert, so daß das ATG- Startcodon in ATT geändert wird, wodurch die gag-Expression verhindert wird. Dieses mutagenisierte Fragment ist 200 Basenpaare (bp) lang und wird von PST1-Restriktionsschnittstellen flankiert. Das Pst I-Pst I-mutierte Fragment wird aus dem SK&spplus;-Plasmid gereinigt und in die Pst I-Stelle des N2-MoMLV-5'-LTR im Plasmid pUC31 insertiert, um das nichtmutierte 200 bp- Fragment zu ersetzen. Das Plasmid pUC31 ist abgeleitet aus pUC19 (Stratgene, San Diego, CA), wobei zusätzliche Restriktionsschnittstellen Xho I, Bgl II, BssH II und Nco I zwischen die EcoR I- und Sac I-Schnittstellen des Polylinkers insertiert sind. Dieses Konstrukt wird pUC31/N2R5gM genannt.
Das 1,0 Kilobasen (Kb) MoMLV-3'-LTR-EcoR I-EcoR I-Fragment aus N2 wurde in das Plasmid SK&spplus; cloniert, woraus ein Konstrukt resultierte, das N2R3&supmin; genannt wird. Ein 1,0 Kb Cla I-Hind III-Fragment wird aus diesem Konstrukt gereinigt.
Das Cla I-Cla I-dominante, selektierbare Markergenfragment aus dem retroviralen Vektor pAFVXM (Kriegler et al., Cell 38: 483, 1984; St. Louis et al., PNAS 85: 3150, 1988), welches den frühen Promotor aus SV40 umfaßt, der die Expression des Neomycin- Phosphotransferasegens steuert, wird in das Plasmid SK&spplus; cloniert. Aus dem SK&spplus;-Plasmid wird ein 1,3 Kb Cla I-BstB I-Genfragment gereinigt.
Ein alternativer selektierbarer Marker, die Phleomycinresistenz (Mulsant et al., Som. Cell and Mol. Gen. 14: 243, 1988, erhältlich von Cayla, Cedex, FR), kann zur Herstellung des retroviralen Rückgrats KT-3C verwendet werden, zur Verwendung bei der Transformation von Genen auf Zellen, die bereits Neomycin-resistent sind. Das Plasmid pUT507 (Mulsant et al., Som. Cell and Mol. Gen. 14: 243, 1988) wird mit Nde I gespalten, und die Enden werden mit der Klenow-Polymerase I geglättet. Die Probe wird dann weiter mit Hpa I gespalten, Cla I- Linker werden an die Fragmentmischung ligiert, und die Probe weiter mit Cla I gespalten. Die überschüssigen Cla I-Linker werden durch Spaltung mit Cla I entfernt, und das 1,2 Kb Cla I- Fragment, das die RSV LTR und das Phleomycin-Resistenzgen trägt, wird durch Agarose- Gelelektrophorese, gefolgt von einer Reinigung unter Verwendung von "Gene Clean" (Bio101, San Diego, CA), isoliert. Dieses Fragment wird anstelle des 1,3 Kb Cla I-BstB I-Neomycin- Resistenzfragments verwendet, um das Rückgrat KT-3C zu erhalten.
Der Expressionsvektor wird durch eine Drei-Teile-Ligation konstruiert, bei der das Xho I-Cla I-Fragment, welches das interessierende Gen enthält, und das 1,0 Kb MoMLV-3'-LTR- Cla I-Hind III-Fragment in die Xho-I-Hind III-Restriktionsschnittstelle des pUC31/N2R5gM- Plasmids insertiert wird. Das 1,3 Kb Cla I-BstB I-Neogen oder das 1,2 Kb Cla I- Phleomycinfragment wird dann in die Cla I-Restriktionsschnittstelle des Plasmids in Sinn- Orientierung insertiert.

Beispiel 2

A. CLONIEREN DES E3/19K-Gens in KT-3B

i. ISOLIEREN UND REINIGUNG VON ADENOVIRUS

Die Isolierung und die Reinigung des Adenovirus wird von Green et al., Methods in Enzymology 58: 425, 1979, beschrieben. Genauer gesagt, werden 5 Liter Helazellen (3-6 · 10&sup5; Zellen/ml) mit 100-500 Plaque-bildenden Einheiten (plaque forming units, pfu) pro ml Adenovirus Typ 2 (Ad2)-Virione (ATCC VR-846) infiziert. Nach einer Inkubation bei 37ºC für 30-40 Stunden, werden die Zellen auf Eis gestellt, durch 20minütige Zentrifugation bei 230g und 4ºC geerntet, und in Tris-HCl-Puffer, pH 8,1, resuspendiert. Die Pellets werden in Trichlortrifluorethan vor einer 10minütigen Zentrifugation bei 1.000 g mechanisch durch Ultrabeschallung zerstört und homogenisiert. Die obere wäßrige Schicht wird entfernt und über 10 ml CsCl (1,43 g/cm³) geschichtet, und in einem SW27-Rotor 1 Stunde bei 20.000 UpM zentrifugiert. Die opaleszierende Adenovirusbande wird entfernt und mit CsCl auf 1,34 g/cm³ eingestellt und dann in einem Ti 50-Rotor für 16-20 Stunden bei 30.000 UpM weiter zentrifugiert. Die sichtbare virale Bande in der Mitte des Gradienten wird entfernt und bei 4ºC bis zur Reinigung der adenoviralen DNA gelagert.

ii. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON ADENOVIRUS-DNA

Die Adenovirusbande wird mit Protease eine Stunde bei 37ºC inkubiert, um Proteine zu spalten. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 7.800 g bei 4ºC werden die Teilchen in 5%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) bei Raumtemperatur 30 Minuten solubilisiert, bevor sie mit gleichem Volumen Phenol extrahiert werden. Die obere wäßrige Phase wird entfernt, mit Phenol reextrahiert, dreimal mit Ether extrahiert und gegen Tris-Puffer 24 Stunden dialysiert. Die virale Ad2-DNA wird in Ethanol niedergeschlagen, in Ethanol gewaschen und in Tris-EDTA-Puffer, pH 8,1, resuspendiert. Es werden etwa 0,5 mg viraler Ad2-DNA aus Virus isoliert, der in 1,0 Liter Zellen hergestellt wird.

iii. ISOLIERUNG DES E3/19K-GENS

Die virale Ad2-DNA wird mit EcoR I (New England Biolabs, Beverly, MA) gespalten und durch Elektrophorese in einem 1% Agarosegel getrennt. Die resultierenden 2,7 Kb Ad2 EcoR I-D-Fragmente, die in der Ad2-Koordinatenregion 75,9-83,4 lokalisiert sind, enthalten das E3/19K-Gen (Herisse et al., Nucleic Acids Research 8: 2173, 1980, Cladaras et al., Virology 140: 28, 1985) und werden durch Elektrophorese eluiert, Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in Tris-EDTA (pH 8,1) gelöst.

iv. CLONIEREN DES E3/19K-GENS IN KT-3B

Das E3/19K-Gen wird in die EcoR I-Schnittstelle von PUC1813 cloniert. PUC1813 wird wie im wesentlichen durch Kay et al., Nucleic Acids Research 15: 2778, 1987, und Gray et al., PNAS 80: 5842, 1983, beschrieben, hergestellt. Das E3/19K wird durch EcoR I-Spaltung erhalten, und das isolierte Fragment wird in die EcoR I-Stelle des Phosphatase-behandelten pSP73-Plasmids (Promega, Madison, WI) cloniert. Dieses Konstrukt wird SP-E3/19K genannt.
Die Orientierung der SP-E3/19KcDNA wird unter Verwendung einer Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym und der DNA-Sequenzanalyse bestätigt. In der Sinn-Orientierung ist das 5'-Ende der cDNA benachbart zu der Xho I-Schnittstelle des pSP73-Polylinkers und das 3'-Ende ist der Cla I-Schnittstelle benachbart. Das Xho I-Cla I-Fragment, welches die E3/19K- cDNA entweder in Sinn- oder Antisinn-Orientierung enthält, wird aus dem SP-E3/19K- Konstrukt erhalten und in die Xho I-Cla I-Stelle des KT-3B-retroviralen Rückgrats cloniert. Dieses Konstrukt wird KT/3BE3/19K genannt.

B. CLONIEREN VON PCR-AMPLIFIZIERTEM E3/19K-GEN IN KT-3B

i. PCR-AMPLIFIKATION DES E3/19K-GENS

Das Ad2-DNA-E3/19K-Gen, einschließlich der aminoterminalen Signalsequnez, gefolgt von der intraluminalen Domäne und dem carboxyterminalen cytoplasmatischen Schwanz, der es dem E3/19K-Protein erlaubt, sich in das endoplasmatische Retikulum (ER) einzulagern, ist zwischen den viralen Nukleotiden 28.812 und 29.288 lokalisiert. Die Isolierung des Ad2-E3/19K- Gens aus der genomischen viralen DNA wird durch PCR-Amplifikation mit dem unten gezeigten Primerpaar durchgeführt:
Der Vorwärtsprimer entspricht der Ad2-Nukleotidsequenz 28.812 bis 28.835. (Sequenz ID-Nr._____)
S'-3': TATATCTCCAGATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG
Der Rückwärtsprimer entspricht der Ad2-Nukleotidsequenz 29.241 bis 29.213. (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATATCGATTCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC
Zusätzlich zu den zu Ad2 komplementären Sequenzen enthalten beide Primer eine fünf Nukleotid lange "Puffersequenz" an ihren 5'-Enden für eine effiziente Enzymspaltung der PCT- Amplicon-Produkte. Diese Sequenz geht bei dem Vorwärtsprimer der Xho I-Erkennungsstelle und der Cla I-Erkennungsstelle bei dem Rückwärtsprimer voraus. In 5'-3'-Richtung wird also das E3/19K-Gen flankiert von Xho I- und Cla I-Erkennungsstellen. Die Amplifikation des E3/19K-Gens aus Ad2-DNA wird unter Zuhilfenahme des folgenden PCR-Zyklusprotokolls durchgeführt:

ii. LIGATION DES PCR-AMPLIFIZIERTEN E3/19K-GENS IN KT-3B

Das etwa 780 bp lange E3/19K-Gen aus dem SK-E3/19K-Konstrukt wird entfernt und durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese, wie in Beispiel 2Bi beschrieben, isoliert. Das Xho I-Cla I-E3/19K-Fragment wird dann in das KT-3B-retrovirale Rückgrat ligiert. Dieses Konstrukt wird als KT-3B/E3/19K bezeichnet. Es wird durch Transformation des Bakterienstammes DHSa mit dem KT-3B/E3/19K-Konstrukt amplifiziert. Genauer gesagt wird das Bakterium mit 1-100 ng der DNA aus der Ligationsreaktionsmischung transformiert. Die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Platten, die Ampicillin enthalten, ausplattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert, bakterielle Kolonien werden ausgewählt, und DNA wird von diesen präpariert. Die DNA wird mit Xho I und Cla I gespalten. Die erwarteten Größen der Endonuklease-Restriktionsspaltungsfragmente für Plasmide, die das E3/19K-Gen enthalten, sind 780 und 1300 bp.

C. CLONIEREN DES SYNTHETISIERTEN E3/19K-GENS IN KT-3B

i. SYNTHESE VON E3/19K-GEN-DNA

Die chemische Synthese synthetischer DNA wurde bereits beschrieben (Caruthers et al., Methods in Enzymology 211: 3, 1992). Sequenzen, die das E3/19K-Gen codieren, werden durch die Phosphotriester-Methode mit Hilfe einer Applied Biosystems Inc. -DNA- Synthetisiervorrich-tung, Modell 392 (Foster City, CA) unter Verwendung der PCR-Primer als 5'- und 3'-Grenzen synthetisiert, wobei dieselben Xho I- und Cla I-Linker an den Enden beibehalten werden. Kurze Oligonukleotide von etwa 14-40 Nukleotiden Länge werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und aneinander ligiert, um das einzelsträngige DNA- Molekül zu bilden (Ferretti et al., PNAS 83: 599, 1986).

ii. SEQUENZIEREN DER E3/19K-GEN-DNA

Fragmente werden in die Bakteriophagenvektoren M13mp18 und M13mp19 (GIBCO, Gaithersburg, MD) zur Amplifikation der DNA cloniert. Die Nukleotidsequenz eines jeden Fragmentes wird durch die Dideoxy-Methode unter Verwendung von einzelsträngiger M13mp18- und M13mp19-rekombinanter Phagen-DNA als Matrize und ausgewählten synthetischen Oligonukleotiden als Primer bestimmt. Dies bestätigt die Identität und die strukturelle Integrität des Gens.

iii. LIGATION DES SYNTHETISIERTEN E3/19K-GENS IN KT-3B

Das E3/19K-Gen wird in den KT-3B oder den KT-3C, wie oben in Beispiel 2Bii beschrieben, ligiert.

Beispiel 3

CLONIEREN EINER ANTISINN-SEQUENZ EiNER KONSERVIERTEN REGION DES MHC IN KT-3C

A. KONSTRUKTION VON KT-3CneoαMHC

Der cDNA-Clon des MHC-Klasse I-Allels CW3 (Zemmour et al., Tissue Antigens 39: 249, 1992) wird als Matrize in einer PCR-Reaktion zur Amplifikation von spezifischen Sequenzen verwendet, die über verschiedene humane MHC (HLA)-Haplotypen hinweg konserviert sind, um in die nichttranslatierte Region des Neomycin-Resistenzgens des KT-3B- Rückgratvektors insertiert zu werden.
Die MHC-Klasse I-Allel CW3-cDNA wird zwischen der Nukleotidsequenz 147 bis 1.075 unter Verwendung der folgenden Primperpaare amplifiziert:
Der Vorwärtsprimer entspricht der MHC-CW3-cDNA-Nukleotidsequenz 147 bis 166: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATGTCGACGGGCTACGTGGACGACACGC
Der Rückwärtsprimer entspricht der MHC-CW3-cDNA-Nukleotidsequenz 1.075 bis 1.056:
(Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATGTCGACCATCAGAGCCCTGGGCACTG
Zusätzlich zu den MHC-Klasse I-Allel-CW3-komplementären Sequenzen enthalten beide Primer eine fünf Nukleotide lange "Puffersequenz" an ihrem 5'-Ende zur effizienten Enzymspaltung der PCR-Ampliconprodukte. Die Puffersequenz wird bei beiden Primern von der Hinc II-Erkennungssequenz gefolgt. Die Herstellung des MHC-Amplicons mit den oben gezeigten Primern wird unter Verwendung des in Abschnitt 2Bi beschriebenen PCR-Protokolls durchgeführt. Dieses Protokoll wird durch Verwendung der Vent-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) und weiterhin durch Aufnehmen einer 1minütigen Verlängerungszeit anstelle von 3,5 Minuten modifiziert. Die Vent-Polymerase generiert Amplicons mit glatten Enden. Alternativ können die Vorwärts- und Rückwärtsprimer nur die zu MHC-CW3-komplementären Sequenzen enthalten.
Das 950 bp lange MHC-CW3-cDNA-Ampliconprodukt wird mit Gene Clean (Bio101, San Diego, CA) gereinigt und mit Hinc II-gespalten. Das gespaltene Fragment mit einer Länge von 938 bp wird durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese isoliert und mit Gene Clean gereinigt.
Das 938 bp lange MHC-CW3-cDNA-Fragment wird in die 3'-nichttranslatierte Region des Neomycin-Resistenzgens in Antisinn-Orientierung insertiert. Genauer gesagt wird die Hinc II-Erkennungssequenz bei dem Nukleotid mit der Nummer 676 des pBluescript II-SK&spplus;(pSK&spplus;) (Stratagene, San Diegeo, CA)-Plasmids durch Spaltung mit Hinc II und Kpn I entfernt. Das Kpn I-3'-Ende wird mit T4-DNA-Polymerase geglättet, und die glatten Enden werden ligiert. Das Plasmid wird pSKd1HII genannt. Wie in Beispiel 1A beschrieben, wird das 1,3 Kb lange Cla I-Cla I-dominante selektierbare Markergenfragment aus pAFVXM oder dem retrovialen Vektor PUC507 in die Cla I-Schnittstelle von pSKdIHII cloniert. Dieses Plasmid wird pSKdIHII/SVneo genannt. Das 938 bp lange MAC-CW3-cDNA-Fragment wird in einer Antisinn-Orientierung in die Hinc II-Schnittstelle von pSKdIHII/SVneo insertiert, die in der 3'- nichttranslatierten Region des Neomycin-Resistenzgens liegt. Die Bestätigung, daß das 938 bp lange MHC-CWI-cDNA-Fragment in einer Antisinn-Orientierung in dem Neomycingen vorliegt, wird durch Restriktionsendonukleasespaltung und Sequenzanalyse bestimmt. Dieser Clon wird pSKd1HII/SVneo/αMHC genannt.
Die Konstruktion von KT3B/SVneo/αMHC wird über eine Drei-Stufen-Ligation durchgeführt, bei der das Cla I-2,2 Kb-SVneo/αMHC-Fragment und das 1,0 Kb-MoMLV-3'-LTR- Cla I-Hind III-Fragment aus N2R3&supmin; zwischen die Cla I- und Hind III-Schnittstellen des pUC31/N2R5gM-Plasmids, wie in Beispiel I beschrieben, insertiert werden.

B. KONSTRUKTION VON KT3C/SVneo/VARNA/αMHC

Die hochgradige Expression der MHC-CW3-Antisinn-RNA wird durch Insertion dieser Sequenz stromabwärts von dem Ad2-VARNA1-Promotor erreicht. Die Ad2-VARNA- Promotor-MHC-Antisinn-cDNA wird als RNA-Polymerase III (pol III)-Expressionskassette zusammengesetzt und dann in das KT-3B- oder -C-Rückgrat eingefügt. In dieser pol III- Expressionskassette folgt auf den Ad2-VARNA1-Promotor die Antisinn-αMHC-cDNA, auf welche wiederum das pol III-Konsensusterminationssignal folgt.
Der doppelsträngige -30/+70-Ad2-VARNA1-Promotor wird chemisch synthetisiert (Railey et al., Mol. Cell. Biol. 8: 1147, 1988) und umfaßt Xho I bzw. Bgl II an den 5'- bzw. 3'- Enden.
Der VARNA1-Promotor-Vorwärtsstrang: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TCGAGTCTAGACCGTGCAAAAGGAGAGCCTGTAAGCGGGCACTCTTCC GTGGTCTGGTGGATAAATTCGCAAGGGTATCATGGCGGACGACCGG GGTTCGAACCCCGGA
Der VARNA1-Promotor-Rückwärtsstrang: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': GATCTCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAA TTTATCCACCAGACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTT TGCACGGTCTAGAC
Um den doppelsträngigen VARNA1-Promotor mit kohesiven Xho I- und Bgl II-Enden zu bilden, werden gleiche Mengen der Einzelstränge in 10mM MgCl&sub2; gemischt, bei 95ºC 5 Minuten erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur gekühlt, wodurch es den Strängen gestattet wird, zu hybridisieren.
Das MHC-Klasse I-Allel-CW3-Fragment mit der Nukleotidsequenz von 653 bis 854 aus dem Plasmid pSKd1HII/SVneo/αMHC wird unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert.
Der Vorwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 653 bis 680:
5'-3': TATATCCTAGGTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG
Der Rückwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 854 bis 827:
5'-3': TATATAGATCTACATGGCACGTGTATCTCTGCTCTTCTC
Zusätzlich zu den MHC-Klasse I-Allel-CW3-komplementären Sequenzen enthalten beide Primer eine fünf Nukleotide lange "Puffesequenz" an ihrem 5'-Ende zur effizienten enzymatischen Spaltung der PCR-Ampliconprodukte. Die Puffersequenz wird von der Avr II- Erkennungssequenz im Vorwärtsprimer und von der Bgl II-Erkennungssequenz im Rückwärtsprimer gefolgt, was die Insertion, bezüglich des Ad2-VARNA1-Promotors in der pol III- Expressionskassette in Antisinn-Orientierung erlaubt. Die Bildung des MHC-Amplicons mit den oben diskutierten Primern wird unter Verwendung des in Beispiel 2Bi beschriebenen PCR- Protokolls durchgeführt, welches so modifiziert wurde, daß 0,5minütige Verlängerungszeiten anstelle von 3,5minütigen eingeschlossen wurden.
Das 223 bp MHC-CW3-cDNA-Ampliconprodukt wird mit Gene Clean (Bio101, San Diego, CA) gereinigt und dann mit Avr II und Bgl II gespalten und durch 2% NuSeive-1%- Agarose/TBE-Gelelektrophorese isoliert. Die 211 bp-Bande wird dann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mit Gene Clean gereinigt.
Die doppelsträngige pol III-Konsensusterminationssequenz wird chemisch synthetisiert (Geiduschek et al., Annu. Rev. Biochem. 57: 873, 1988) und umfaßt Avr II- bzw. Cla I- Erkennungsstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden.
Die pol III-Terminationssequenz, Vorwärtsprimer: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': CTAGGGCGCTTTTTGCGCAT
Die pol III-Terminationssequenz, Rückwärtsprimer: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': CGATGCGCAAAAAGCGCC
Um die doppelsträngige pol III-Transkriptionsterminationssequenz mit den kohesiven Avr II- und Cla I-Enden zu bilden, werden gleiche Mengen der Einzelstränge in 10 mM MgCl&sub2; gemischt, für 5 Minuten auf 95ºC erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, wodurch den Strängen gestattet wird, zu hybridisieren.
Die pol III-Expressionskassette für das Antisinn-αMHC-Klasse I-Allel-CW3 wird in einer Vier-Stufen-Ligation zusammengefügt, bei der das Xho I-Bgl II-Ad2-VARNA1- Promotor-fragment, das Bgl II-Avr II-αMHC-CW3-Fragment und das Avr II-Cla I- Transkriptionstermina-tionsfragment in pSKII&spplus; zwischen die Xho I- und Cla I- Erkennungsstellung cloniert werden. Dieses Konstrukt wird pSK/VARNA/αMHC genannt.
Die Konstruktion von KT-3B/SVneo/VARNA/αMHC wird in einer Zwei-Stufen- Ligation durchgeführt. Die erste Stufe ist eine Drei-Stufen-Ligation, bei der das Xho I-Cla I- VARNA-αMHC-Fragment und das 1,0 Kb MoMLV-3-LTR-Cla I-Hind III-Fragment von N2R3&supmin; zwischen die Xho I- und Hind III-Erkennungsstellen des pUC31/N2R5gM-Plasmids, wie in Beispiel 1 beschrieben, insertiert werden. Dieses Konstrukt wird KT3B/VARNA/αMHC genannt. In der zweiten Ligationsstufe wird das 1,3 Kb Cla I-BstB I-SVneo-Fragment in die Cla I-Schnittstelle des KT3B/VARNA/αMHC insertiert. Dieses Konstrukt wird KT3B/SVneo/VARNA/αMHC genannt.

Beispiel 4

CLONIEREN EINES RIBOZYMS, DAS EINE KONSERVIERTE REGION DER MHC-KLASSE 1 SCHWERE KETTEN SPALTEN WIRD, IN KT-3B

A. KONSTRUKTION VON pSK/VARNA/MHCHRBZ

Um die Expression von MHC-Klasse I in transduzierten Zellen effizient zu inhibieren, wird ein Haarnadel-Ribozym mit Zielspezifität für das MHC-Klasse I-Allel in den KT3B/SVneo-Vektor insertiert. Das Ribozym wird von dem Ad2-VARNA1-Promotor hochgradig exprimiert. Das MHC-Haarnadel-Ribozym (HRBZ) wird in die pol IIIpSK/VARNA/αMHC-Expressionskassette, die in Beispiel 3 beschrieben wurde, insertiert.
HRBZ und das MHC Klasse 1-Allel-CW3 haben die unten gezeigte homologe Sequenz: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': GATGAGTCTCTCATCG
HRBZ ist so ausgestaltet, daß es nach der Base A in dem AGTC- Haarnadelsubstratmotiv, das in der Zielsequenz enthalten ist, spaltet. Nach Spaltung wird HRBZ rezyklisiert und ist fähig, mit anderen MHC-Klasse 1-RNA-Molekülen zu hybridisieren und sie zu spalten.
Doppelsträngiges HRBZ, wie es früher definiert wurde, (Hampel et al., Nucleic Acids Research 18: 299, 1990), das einen Vier-Basen-"Tetraloop" 3 und eine verlängerte Helix 4 enthält, und Spezifität für die oben gezeigten MHC-Klasse 1-serologen Sequenzen besitzt, wird chemisch synthetisiert und beinhaltet Bgl II- und Avr II-Schnittstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden.
Der MHC-HRBZ, Sinnstrang:
(Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': GATCTCGATGAGAAGAACATCACCAGAGAAACACACGGACTTC GGTCCGTGGTATATTACCTGGTAC
Der MHC-HRBZ, Antisinnstrang:
(Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTC TCTGGTGATGTTCTTCTCATCGA
Um das doppelsträngige, für MHC-Klasse 1 spezifische HRBZ mit kohesiven Bgl II- und Avr II-Enden zu bilden, werden gleiche Mengen der Einzelstränge in 10mM MgCl&sub2; zusammengemischt, auf 95ºC für 5 Minuten erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um es den Strängen zu gestatten, zu hybridisieren.
Die pol III-Expressionskassette für das MHC-HRBZ wird durch Ligation des chemisch synthetisierten doppelsträngigen MHC-Klasse I-spezifischen HRBZ, welches kohesive Bgl II- und Avr II-Enden besitzt, in einen Bgl II- und Avr II-gespaltenen und CIAP-behandelten pSKJVARNA/αMHC, bei dem die αMHC-Sequenz aus dem Expressionsvektor entfernt worden ist, zusammengefügt. Dieses Plasmid wird pSK/VARNA/MHCHRBZ genannt und enthält den Ad2-VARNA1-Promotor, gefolgt von dem MHC-HRBZ, welches wiederum von der pol III-Konsensusterminationssequenz gefolgt wird. Die pol III-Expressionsbestandteile werden von Xho I- und Cla I-Erkennungsstellen flankiert.

B. KONSTRUKTION VON KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZ

Die Konstruktion von KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZ wird in einer Zwei-Stufen- Ligation bewerkstelligt. Die erste Stufe ist eine Drei-Schritt-Ligation, bei der das Xho I-Cla I- VARNA/MHCHRBZ-Fragment und das aus N2R3&supmin; stammende 1,0 Kb MoMLV-3-LTR-Cla I- Hind III-Fragment zwischen die Xho I- und Hind III-Schnittstellen des in Beispiel 1 beschriebenen pUC31/N2R5gM-Plasmids insertiert werden. Dieses Konstrukt wird KT3B/VARNA/MHCHRBZ genannt. In der zweiten Stufe wird das 1,3 Kb Cla I-BstB I-SVneo-Fragment in die Cla I-Schnittstelle von KT3B/VARNA/MHCHRBZ ligiert. Dieses Konstrukt wird KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZ genannt.

Beispiel 5

CLONIEREN DER PSF1-ANTISINN-cDNA

A. KONSTRUKTION VON KT3B/SVneo/αPSFI

Der cDNA-Clon von PSF1 (Spies et al., Nature 351: 323, 1991; Spies et al., Nature 348: 744, 1990) wird als Matrize in einer PCR-Reaktion zur Amplifikation von spezifischen Sequenzen, die in die untranslatierte Region des Neomycin-Resistenzgens in den KT-3B- Rückgratvektor insertiert werden sollen, verwendet. Die PSF1-cDNA wird zwischen der Nukleotidsequenz 91 bis 1.124 unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert:
Der Vorwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 91 bis 111: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATGTCGACGAGCCATGCGGCTCCCTGAC
Der Rückwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 1.124 bis 1.105: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATGTCGACCGAACGGTCTGCAGCCCTCC
Zusätzlich zu den zu PSF1 komplementären Sequenzen enthalten beide Primer eine fünf Nukleotide lange "Puffersequenz" an ihren 5'-Enden zur effizienten Enzymspaltung der PCR- Ampliconprodukte. Die Puffersequenz wird bei beiden Primern von der Hinc II- Erkennungssequenz gefolgt. Die Bildung des PSF1-Amplicons mit den oben diskutierten Primem wird unter Anwendung des in Beispiel 2Bi beschriebenen PCR-Protokolls bewerkstelligt. Dieses Protokoll wird so modifiziert, daß Vent-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) verwendet wird, und es wird weiter so modifiziert, daß 1minütige Verlängerungszeiten anstelle von 3,5 Minuten verwendet werden. Die Verwendung der Vent-Polymerase führt zur Bildung von Amplicons mit glatten Enden.

B. KONSTRUKTION VON KT3B/SVneo/VARNA/αPSF1

Eine hochgradige PSF1-Antisinn-Expression wird durch Insertion dieser Sequenz stromabwärts von dem Ad2-VARNA1-Promotor bewerkstelligt. Die Ad2-VARNA-Promotor- PSF1-Antisinn-DNA wird in einem ersten Schritt als eine pol III-Expressionskassette zusammengefügt, und dann in das KT-3B-Rückgrat insertiert. In dieser pol III-Expressionskassette wird der Ad2-VARNA1-Promotor von der Antisinn-PSF1-cDNA gefolgt, welche wiederum von dem pol III-Konsensusterminationssignal gefolgt wird.
Die Nukleotidsequenz 91 bis 309 der PSF1-cDNA wird in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
Der Vorwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 91 bis 111: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATCCTAGGGAGCCATGCGGCTCCCTGAC
Der Rückwärtsprimer entspricht der Nukleotidsequenz 309 bis 288: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATAGATCTCAGACAGAGCGGGAGCAGCAG
Zusätzlich zu den zu PSF1 komplementären Sequenzen enthalten beide Primer eine fünf Nukleotide lange "Puffersequenz" an ihren 5'-Enden zur effizienten Enzymspaltung der PCR- Ampliconprodukte. Die Puffersequenz wird bei dem Vorwärtsprimer von der Avr II- Erkennungssequenz und bei dem Rückwärtsprimer von der Bgl II-Erkennungssequenz gefolgt, was die Insertion in Antisinn-Orientierung bezüglich des Ad2-VARNA1-Promotors in der RNA-Polymerase III-Expressionskassette erlaubt. Die Bildung des PSF1-Amplicons mit den oben beschriebenen Primern wird mit dem in Beispiel 2Bi beschriebenen PCR-Protokoll bewerkstelligt, welches so modifiziert wird, daß es 0,5minütige Verlängerungszeiten anstelle von 3,5minütigen beinhaltet.
Das 240 bp MHC-CW3-cDNA-Ampliconprodukt wird mit Gene Clean (Bio101, San Diego, CA) gereinigt und dann mit Avr II und Bgl II gespalten und durch 2% NuSeive-1%- Agarose/TBE-Gelelektrophorese isoliert. Die 211 bp-Bande wird dann aus dem Gel ausgeschnitten und mit Gene Clean gereinigt.
Die Konstruktion von KT3B/SVneo/VARNA/αPSF1 wird in einer Zwei-Stufen- Ligation durchgeführt. Die erste Stufe ist eine Drei-Stufen-Ligation, bei der das Xho I-Cla I- VARNA/αPSF1-Fragment und das 1,0 Kb MoMLV-3-LTR-Cla I-Hind III-Fragment von N2RY zwischen die Xho I- und Hind III-Erkennungsstellen des pUC31/N2R5gM-Plasmids, wie in Beispiel 1 beschrieben, insertiert werden. Dieses Konstrukt wird KT3B/VARNA/αPSF1 genannt. In der zweiten Ligationsstufe wird das 1,3 Kb Cla I-BstB I-SVneo-Fragment in die Cla I- Schnittstelle des KT3B/VARNA/αMHC ligiert. Dieses Konstrukt wird KT3B/SVneo/VARNA/αPSF1 genannt.

Beispiel 6

CLONIEREN EINES RIBOZYMS, DAS EINE KONSERVIERTE REGION VON PSF1 SPALTET IN KT-3B

A. KONSTRUKTION VON pSK/VARNA/PSF1HRBZ

Um die Expression von PSF1-Klasse I in transduzierten Zellen effizient zu inhibieren, wird ein Haarnadel-Ribozym mit Zielspezifität für die PSF1-RNA in den KT3B/SVneo-Vektor insertiert. Das Ribozym wird unter der Kontrolle von dem Ad2-VARNA1-Promotors hochgradig exprimiert. Das PSF1-Haarnadel-Ribozym (HRBZ) wird in die in Beispiel 3 beschriebene pol IIIpSK/VARNA/αMHC-Expressionskassette, insertiert. Die PSF1-HRBZ-pol III- Expressionskassette wird dann in den KT3B/SVneo-Rückgratvektor insertiert.
Das HRBZ und die PSF1-RNA haben die unten gezeigte homologe Sequenz: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': GCTCTGTCTGGCCAC
Das HRBZ ist so ausgestaltet, daß es nach der Base T in dem TGTC-Haarnadelsubstratmotiv, das in der Zielsequenz enthalten ist, spaltet. Nach Spaltung wird HRBZ rezyklisiert und ist fähig, an ein anderes PSF1-RNA-Molekül zu hybridisieren und dieses zu spalten.
Früher definiertes doppelsträngiges HRBZ (Hampel et al., Nucleic Acids Research 18: 299, 1990), das einen Vier-Basen-"Tetralvop" 3 und eine verlängerte Helix 4 enthält, und Spezifität für die oben gezeigte homologe PSF1-Sequenz besitzt, wird chemisch synthetisiert und beinhaltet Bgl II- und Avr II-Schnittstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden.
Das PSF 1-HRBZ, Sinnstrang: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': GATCTGTGGCCAGACAGAGCACCAGAGAAACACACGGACTTCG GTCCGTGGTATATTACCTGGTAC
Das PSF1-HRBZ, Antisinnstrang: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTC TCTGGTGCTCTGTCTGGCCACA
Um das doppelsträngige, PSF1-spezifische HRBZ mit kohesiven Bgl II- und Avr II- Enden zu bilden, werden gleiche Mengen der Einzelstränge in 10mM MgCl&sub2; zusammengemischt, auf 95ºC für 5 Minuten erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um es den Strängen zu gestatten, zu hybridisieren.
Die pol III-Expressionskassette für das PSF1-HRBZ wird durch Ligation des chemisch synthetisierten doppelsträngigen PSF1-spezifischen HRBZ, welches kohesive Bgl II- und Avr II-Enden besitzt, in einen Bgl II- und Avr II-gespaltenen und CIAP-behandelten pSK/VARNA/αMHC, bei dem die MHC-Sequenz durch Gelreinigung aus dem pol III-Expressionsvektor entfernt worden ist, zusammengefügt. Dieses Plasmid wird pSK/VARNA/PSF1HRBZ genannt und enthält den Ad2-VARNA1-Promotor, gefolgt von dem PSF1-HRBZ, welches wiederum von der pol III-Konsensusterminationssequenz gefolgt wird. Der pol III-Expressionsbestandteil wird von Xho I- und Cla I-Erkennungsstellen flankiert.

B. KONSTRUKTION VON KT3B/SVneo/VARNA/PSF1HRBZ

Die Konstruktion von KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZ wird in einer Zwei-Stufen- Ligation bewerkstelligt. Die erste Stufe ist eine Drei-Schritt-Ligation, bei der das Xho I-Cla I- VARNA/PSF1HRBZ-Fragment und das aus N2R3&supmin; stammende 1,0 Kb MoMLV-3-LTR-Cla I- Hind III-Fragment zwischen die Xho I- und Hind III-Schnittstellen des in Beispiel 1 beschriebenen pUC31/N2R5gM-Plasmids insertiert werden. Dieses Konstrukt wird KT3B/VARNA/PSFIHRBZ genannt. In der zweiten Ligationsstufe wird das 1,3 Kb Cla I-BstB I-SVneo- Fragment in die Cla I-Schnittstelle von KT3B/VARNA/PSFIHRBZ ligiert. Dieses Konstrukt wird KT3B/SVneo/VARNA/PSF1HRBZ genannt.

Beispiel 7

KONSTRUKTION DES MULTIVALENTEN REKOMBINANTEN RETROVIRALEN KT3B-GC/E3/19K-VEKTORS

Das Gaucher-Syndrom ist eine genetische Erkrankung, die durch das Fehlen des Enzyms Glucocerebrosidase gekennzeichnet ist. Diese Enzymdefizienz führt zur Anhäufung von Glucocerebrosiden in den Lysosomen aller Körperzellen. Der Phenotyp der Erkrankung manifestiert sich jedoch nur in Makrophagen, außer in den sehr seltenen neuropathischen Formen der Erkrankung. Die Erkrankung führt normalerweise zu einer Vergrößerung der Leber und der Milz und kann ebenso Schädigungen der Knochen verursachen (Beutler et al., cience 256: 794, 1992; und Scriver et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6. Auflage, 2: 1677). Diese Art der Therapie ist ein Beispiel für eine Einzel-Gen-Ersetzungs-Therapie, die ein defizientes zelluläres Enzym bereitstellen würde.

i. Konstruktion von KT3B-GC

Ein Glucocerebrosidase (GC)-cDNA-Clon, der eine 5' der codierenden cDNA-Sequenz gelegene Xho I-Restriktionsenzymsschnittstelle und eine 3' der codierenden cDNA-Sequenz gelegene Cla I-Restriktionsenzymsschnittstelle enthält, wird zuerst hergestellt. Der Clon wird durch Spalten von pMFG-GC (Ohashi et al., PNAS 89: 11332, 1992, Nolta et al., Blood, 75: 787, 1991) mit Nco I (New England Biolabs, Beverly, MA) gespalten, die Enden werden mit Vent- DNA-Polymerase geglättet (New England Biolabs, Beverly, MA) und dann mit Xho I- Linkermolekülen ligiert. Das Plasmid wird dann mit Bam HI (New England Biolabs, Beverly, MA) gespalten, die Enden werden mit Vent-DNA-Polymerase geglättet und dann an Cla I- Linker ligiert. Das Fragment wird dann mit Xho I und Cla I gespalten und in einer Drei-Wege- Ligation ligiert, bei der das Xho I-Cla I-GC-Fragment und das 1,0 Kb MoMLV-3-LTR-Cla I- Hind III-Fragment in die Xho I-Hind III-Schnittstelle des pUC31/N2R5gM-Plasmids, Beispiel 1, insertiert werden. Dieses Konstrukt wird KT3B-GC genannt.

ii. Konstruktion von KT3-GC/E3/19K

Das Plasmid pBS-ECAT (Kräusslich et al., J. Vir. 61: 2711, 1987, Gorman et al., Mol. Cell. Bio. 2: 1044, 1982, Jang et al., J. Virol. 63: 1651, 1989) beinhaltet die 5'-nichttranslatierte Region des Encephalomyocarditis-Virus, EMCV (ATTC Nr. VR-129B), der Nukleotide 260- 848 des viralen Genoms, welches das IRES enthält. Die EMCV-Nukleotide 260-827 werden aus pBS-ECAT mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:
Der Vorwärtsprimer enthält das IRBS und eine Bst BI-Endonuklease-Schnittstelle. (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATTTCGAACCCCCCCCCCCCCCCAACG
Der Rückwärtsprimer enthält das IRBS und eine Sal I-Endonuklease-Schnittstelle. (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TATATGTCGACCTTACAATCGTGGTTTTCAAAGG
Das aus der Amplifikation mit dem Vorwärtsprimer und dem Rückwärtsprimer resultierende Amplicon wird von Bst BI- und Sal I-Erkennungsstellen flankiert, innenliegend eine fünf Basenpaar lange "Puffersequenz". Nach PCR-Amplifikation wird das Amplicon mit Sal I gespalten und mit dem Plasmid KT3B-E3/19K, Beispiel 2, welches vorher mit Xho I gespalten wurde, ligiert. Nach Ligation wird das linearisierte Plasmid mit Bst BI und Cla I gespalten, wodurch ein Bst BI- und Cla I-Fragment, das die mit den E3/19K-Sequenzen verbundenen IRBS- Sequenzen enthält, freigesetzt wird. Dieses Bst BI-Cla I-Fragment wird dann in das KT3B-GC- Konstrukt ligiert, welches davor mit Cla I gespalten wurde. Dieses Plasmid ist als KT3B- GC/E3/19K bekannt.

iii. Konstruktion von KT3B-GC/E3/19K/αMHC

Es kann ebenso eine Variation des retroviralen Vektors KT3B-GC/E3/19K konstruiert werden, welcher sowohl GC- als auch E3/19K-Sequenzen enthält, aber zusätzlich Antisinn- Sequenzen enthält, die spezifisch sind für eine konservierte Region der drei Klasse I-MHC- Allele A2, CW3 und B27 der Beispiele 2 und 3. Dieser Vektor, bekannt als KT3B- GC/E3/19K/αMHC ist so ausgestaltet, daß er die MHC-Klasse I-Antisinn-Sequenzen an dem 3'-Ende der E3/19K-Sequenz beinhaltet, welcher dann als chimeres Molekül exprimiert würde. Der retrovirale Vektor KT3B-GC/E3/19K/αMHC kann durch Ligieren eines PCRamplifizierten Produktes, das mit Cla I gespalten wurde und die MHC-Antisinn-Sequenzen enthält, in die Cla I-Schnittstelle des KT3B-GC/E3/19K-Vektors konstruiert werden. Genauer gesagt wird der cDNA-Clon des MHC-Klasse I-Allels CW3 (Zemmour et al., Tissue Antigens 39: 249, 1992) mittels einer PCR zwischen den Nukleotiden 653 und 854 unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:
Der Vorwärtsprimer des αMHC ist: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': ATTATCGATTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG
Der Rückwärtsprimer des αMHC ist: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': ATTAATCGATACATGGCACGTGTATCTCTGCTCTTCTC
Die Primerpaare werden von Cla I-Restriktionsenzymschnittstellen flankiert, um ein amplifiziertes und mit Cla I gespaltenes Produkt in den partiell vorgespaltenen KT3B- GC/E3/19K-Vektor in Antisinn-Orientierung zu insertieren. Indem das Cla I-Fragment in Rückwärts-Orientierung plaziert wird, wird der Vektor den negativen Antisinn-Strang nach Transkription exprimieren.

iv. Konstruktion von KT3B-GC/αMHC

Ein weiteres Beispiel für einen retroviralen GC-Vektor mit Fähigkeiten, MHC-Klasse I herunterzuregulieren, ist das KT3B-GC/αMHC-Konstrukt, welches die gleichen Antisinn- Sequenzen, die für konservierte Regionen bei den drei oben beschriebenen MHC-Klasse I- Allelen spezifisch sind, enthält. Bei diesem Beispiel ist die MHC-Antisinn-Sequenz so ausgestaltet, daß sie am 3'-Ende des therapeutischen Gens im Kontext mit dem vollständigen KT-3B- Rückgrat, welches den mit Neomycin selektierbaren Marker umfaßt, eingebaut wird. Genauer gesagt wird das in Beispiel 1 beschriebene Cla I-Bst BI-Neomycin-Genfragment in Sinn- Orientierung in das oben beschriebene KT3B-GC-Konstrukt insertiert, welches vorgespalten ist und mit Cla I und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt wurde. Sobald ein Clon durch Restriktionsenzymanalyse ausgewählt wird, wird das gleiche Cla I-gespaltene PCRamplifizierte Produkt, das konservierte MHC Klasse 1-Sequenzen enthält und bei der Konstruktion von KT3B-GC-E3/19K/αMHC beschrieben wurde, in den KT3B-GC-Neo-Vektor, der vorgespalten und mit Cla I und alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) behandelt wurde, ligiert, wodurch der KT3B-GC/αMHC-Expressionsvektor gebildet wird.

Beispiel 8

TRANSDUKTION VON VERPACKUNGSZELLINIEN DA MIT DEM MULTIVALENTEN REKOMBINANTEN RETROVIRALEN VEKTOR KT3B-GC/E3/19K

A. PLASMID-DNA-TRANSFEKTION

5 · 10&sup5; Zellen der 293 2-3-Zellen (eine aus 293 Zellen ATCC Nr. CRL 1573, WO 92/05266) erhaltene Zellinie) werden mit annähernd 50%iger Konfluenz in einer 6 cm Gewebekulturschale ausgesät. Am folgenden Tag wird das Medium 4 Stunden vor der Transfektion durch 4 ml frisches Medium ausgetauscht. Einer Standard-Calciumphosphat-DNA- Kopräzipitation wird durch Mischen von 10,0 ug KT3B-GG/E3/19K-Plasmid und 10,0 ug MLP-G-Plasmid mit einer 2M CaCl&sub2;-Lösung, Hinzufügen einer 1-fach Hepes-gepufferten Kochsalzlösung, pH 6,9, und Inkubation für IS Minuten bei Raumtemperatur, durchgeführt. Das Calciumphosphat-DNA-Kopräzipitat wird zu den 293 2-3-Zellen überführt, welche dann über Nacht bei 37ºC, 5% CO&sub2; inkubiert werden. Am folgenden Morgen werden die Zellen dreimal in 1 · PBS, pH 7,0, gewaschen. Frisches Medium wird zu den Zellen gegeben und über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert. Am folgenden Tag wird das Medium von den Zellen gesammelt und durch einen 0,45 u-Filter geführt. Dieser Überstand wird verwendet, um Verpackungs- und Tumorzellinien zu transduzieren. Ein transienter Vektorüberstand für andere Vektoren wird auf gleiche Art hergestellt.

B. TRANSDUKTION DER VERPACKUNGSZELLENIE

DA-Zellen (eine amphotrope Zellinie, erhalten aus D-17-Zellen ATCC Nr. 183, WO 92/05266) werden in einer Konzentration von 5 · 10&sup5; Zellen/10 cm-Schale ausgesät. Etwa 0,5 ml des frisch gesammelten 293 2-3-Überstands (oder bei -70ºC gelagerten Überstands) wird zu den DA-Zellen gegeben. Am folgenden Tag wird Phleomycin zu diesen Zellen hinzugefügt und im Zeitraum einer Woche wird ein Arzneimittel-resistenter Zell-Pool gebilder. Dieser Zell-Pool wird verdünnungscloniert, um eine einzelne Zelle pro Vertiefung von Platten mit 96 Vertiefungen zu erhalten. 24 Clone werden auf Platten mit 24 Vertiefungen übertragen, dann auf Platten mit 6 Vertiefungen, und zu diesem Zeitpunkt werden die Zellüberstände zur Titerbestimmung zusammengefaßt. DA-Clone werden zur Vektorproduktion ausgewählt und DA-GC/E3/19K genannt. Vektorüberstände werden aus konfluenten 10 cm-Kulturschalen von DA-GC/E3/19K- Clonen zusammengefaßt, die in normalem Medium kultiviert werden, das Polybrene oder Protaminsulfat enthält. Alternativ kann der Vektorüberstand aus Bioreaktoren oder Rollerflaschen geerntet werden, weiterverarbeitet und vor Verwendung gereinigt werden.
Für Vektoren, die keinen Arzneimittel-Resistenzmarker tragen oder falls ein Marker schon in der Verpackungszellinie vorhanden ist, muß die Auswahl von stabil transduzierten Clonen durch Verdünnungsclonierung der transduzierten DA-Zellen einen oder zwei Tage nach dem Transduzieren der Zellen mit von 293 2-3-gebildetem Überstand durchgeführt werden. Die Verdünnungsclone werden dann auf Gegenwart von sowohl Glucocerebrosidase als auch E3/19K-Expression durch reverse Transkription der Boten-RNA, gefolgt von der Amplifikation der cDNA durch die Polymerasekettenreaktion, ein Verfahren, das als RT-PCR bekannt ist, untersucht. Ein kommerzieller Kit für die RT-PCR ist bei Invitrogen Corp. (San Diego, CA) erhältlich. Die RT-PCR sollte mit Clonen durchgeführt werden, die mindestens 10 Tage vermehrt worden sind, und es werden etwa 50 bis 100 Clone untersucht werden müssen, um eine vernünftige Anzahl von stabil transformierten Clonen zu finden. Um eine RT-PCR durchzuführen, sind spezifische Primer für jede zu amplifizierende cDNA nötig. Primer für die Amplifikation eines 521 bp-Produktes der Glucocerebrosidase und eines 401 bp-Produktes der E3/19K- Boten-RNA sind wie folgt ausgestaltet:
Durchmusterungsprimer für Glucocerebrosidase: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TTTCTGGCTCCAGCCAAAGCCACCCTAGGGGAG (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': AATGGAGTAGCCAGGTGAGATTGTCTCCAGGAA
Durchmusterungsprimer für E3/19K sind: (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': ATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG (Sequenz ID-Nr._____)
5'-3': TCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC

Beispiel 9

NACHWEIS VON REPLIKATIONSKOMPETENTEN RETROVIREN

Der verlängerte S&spplus;L&supmin;-Test bestimmt, ob replikationskompetente infektiöse Viren in dem Überstand der interessierenden Zellinie vorhanden sind. Der Test basiert auf der empirischen Beobachtung, daß infektiöse Retroviren in der Indikatorzellinie MiCl&sub1; (ATCC CCL 64.1) Foci bilden. Die MiCl&sub1;-Zellinie ist aus der Mv1Lu-Zellinie (ATTC CCL 64) aus Mink durch Transduktion mit dem Mäuse-Sarcoma-Virus (MSV) abgeleitet. Es ist ein nichtproduzierender, nichttransformierter revertanter Clon, der ein Maus-Sarcoma-Provirus enthält, das zur Bildung von Sacrom (S&spplus;) führt, wodurch die Anwesenheit des MSV-Genoms angezeigt wird, das aber nicht Leukämie (L&supmin;) bewirkt, wodurch die Abwesenheit eines replikationskompetenten Virus angezeigt wird. Die Infektion von MiCl&sub1;-Zellen mit replikationskompetenten Retroviren "aktiviert" das MSV-Genom, wodurch eine "Transformation" ausgelöst wird, die in einer FociBildung resultiert.
Der Überstand wird von der Zellinie, die auf Gegenwart von replikationskompetentem Retrovirus untersucht werden soll, entfernt und durch einen 0,45 u-Filter geführt, um alle Zellen zu entfernen. Am Tag 1 werden Mv1Lu-Zellen bei 1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung (eine Vertiefung pro zu untersuchender Probe) in einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2 ml DMEM, 10% FPS und 8 ug/ml Polypren ausgesät. Mv1Lu-Zellen werden auf gleiche Weise für die Positiv- und Negativkontrollen auf getrennten Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert. Am Tag 2 wird 1,0 ml Testüberstand zu den Mv1Lu- Zellen hinzugegeben. Die Negativkontrollplatten werden mit 1,0 ml Medium inkubiert. Die Positivkontrolle besteht aus drei Verdünnungen (200 Fokus-bildende Einheiten (ffu), 20 ffu und 2 fit in jeweils 1,0 ml Medium) MA-Virus (Miller et al., Molec. and Cell Biol. 5: 431, 1985), welcher zu den Zellen in den Positivkontrollvertiefungen hinzugefügt wird. Die Zellen werden über Nacht inkubiert. Am Tag 3 wird das Medium abgesaugt und 3,0 ml frisches DMEM und 10% FPS werden zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen werden bis zum Erreichen der Konfluenz wachsen gelassen und am Tag 6 und Tag 10 1 : 10 ausgetauscht, wodurch jeder replikationskompetente Retrovirus amplifiziert wird. Am Tag 13 wird das Medium von den Mv1Lu-Zellen abgesaugt und 2,0 ml DMEM und 10% FPS wird zu den Zellen hinzugefügt. Zusätzlich werden die MiCl&sub1;-Zellen bei 1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in 2,0 ml DMEM, 10% FPS und 8 ug/ml Polypren ausgesät. Am Tag 14 wird der Überstand von den Mv1Lu-Zellen zu der entsprechenden Vertiefung der MiCl&sub1;-Zellen überführt und über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert. Am Tag 15 wird das Medium abgesaugt und 3,0 ml frisches DMEM und 10% FPS wird zu den Zellen hinzugefügt. Am Tag 21 werden die Zellen auf Fokusbildung auf der Zellmonolayer hin untersucht (erscheinend als gebündelte, refraktile Zellen, die den Monolayer überwachsen und mit ihm verbunden bleiben). Falls Foci auf den MiCl&sub1;-Zellen auftreten, wird bestimmt, daß die Probe mit einem replikationskompetenten Retrovirus kontaminiert ist.

Beispiel 10

TRANSDUKTION VON ZELLINIEN MIT RETROVIRALEM E3/19K-VEKTOR

Die folgenden adhärenten humanen und murinen Zellinien werden bei 5 · 10&sup5; Zellen/10 cm-Zellkulturplatte mit 4 ug/ml Polypren ausgesät: HT 1080 (ATCC Nr. CCL 121), Hela (ATCC Nr. CCL 2), BC10ME (Patek et al., Cell. Immuno. 72: 113, 1982, ATCC Nr. TIB 85), BCenv, BC10ME, exprimierend HIV-1-IIIBenv (Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645, 1991), L33, erhalten von Gunther Dennert, Universität von Süd-Californien, und L33env. Am folgenden Tag wird 1,0 ml gefilterter Überstand von dem DA-E3/19K-Pool zu jeder der Zellkulturplatten hinzugefügt. Am folgenden Tag wird Phleomycin zu den Medien aller Zellkulturen hinzugefügt. Bei Zellinien, die schon Neomycin-resistent sind, wird das E3/19K in dem KT-3C-Rückgrat (Phleomycin-resistent) verwendet. Transiente Überstände für 293 2-3 oder aus DA abgeleiteten Linien können verwendet werden. Die Kulturen werden aufbewahrt bis die Selektion vollständig ist, und genügend große Zellzahlen gebildet werden, um auf Genexpression zu testen. Die transduzierten Zellinien werden als HT 1080-E3/19K, Hela- E3/19K, BC10ME-E3/19K, L33-E3/19K bzw. L33env-E3/19K bezeichnet.
EBV-transformierte Zellinien (BLCL) und andere Suspensionszellinien werden durch Co-Kultivierung mit der bestrahlten produzierenden Zellinie DA-E3/19K transduziert. Genauer gesagt werden bestrahlte (10.000 rad) Zellen aus einer produzierenden Zellinie bei 5 · 10&sup5; Zellen/6 cm-Zellkulturplatte in Wachstumsmedium, enthaltend 4 ug/ml Polypren, ausgesät. Nachdem den Zellen für 2-24 Stunden erlaubt wurde, sich anzuheften, werden 106 Supsensionszellen hinzugefügt. Nach 2-3 Tagen werden die Suspensionszellen entfernt, durch Zentrifugation pelletiert und in Wachstumsmedium mit 1 mg/ml Phleomycin resuspendiert und in 10 Vertiefungen einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Kulturen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen und dann auf T-25-Flaschen übertragen.

Beispiel 11

EXPRESSION VON E3/19K IN DEM MULTIVALENTEN REKOMBINANTEN RETROVIRALEN VEKTORKONSTRUKT KT3B-GC/E3/19K

A. WESTERNBLOT-ANALYSE VON E3/19K

Radio-Immuno-Präzipitationstest-(RIPA)-Lysate werden, ausgehend von ausgewählten Kulturen zur Analyse der E3/19K-Expression, hergestellt. Die RIPA-Lysate werden, ausgehend von konfluenten Zellkulturplatten, hergestellt. Genauer gesagt wird zunächst das Medium von den Zellen abgesaugt. Abhängig von der Größe der die Zellen enthaltenden Zellkulturplatte wird ein Volumen von 100 bis 500 ul eiskaltem RIPA-Lyse-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1% Nonidet P40 (Calbiochem, San Diego, CA); 0,1% SDS; 150 mM NaCl) zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen werden unter Verwendung einer Mikropipette von den Platten entfernt, und die Mischung wird in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Das Röhrchen wird 5 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer zu präzipitieren, und der Überstand wird in ein anderes Röhrchen überführt. Die Überstände werden in einem 10% SDS-PAGE-Gel einer Elektrophorese unterzogen, und die Proteinbanden werden auf eine Immobilon-Membran in CAPS-Puffer (Aldrich, Milwaukee, WI) (10 mM CAPS, pH 11,0; 10% Methanol) bei 10 bis 60 Volt für 2 bis 18 Stunden übertragen. Die Membran wird aus dem CAPS-Puffer in 5% Blotto überführt (5% entfettete Trockenmilch; 50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,02% Natriumazid und 0,05% Tween 20) und mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen E3/19K (Severinsson et al., J. Cell Biol. 101: 540, 1985) untersucht. Die Bindung des Antikörpers an die Membran wird durch Verwendung von ¹²&sup5;I-Protein A nachgewiesen.

Beispiel 12

FACS-ANALYSE VON E3/19K-VEKTOR-TRANSDUZIERTEN ZELLEN, UM VERRINGERTE GRADE DER KLASSE I-EXPRESSION, VERGLICHEN MIT NICHT-TRANSDUZIERTEN ZELLEN, ZU DEMONSTRIEREN

Zellinien, die mit dem E3/19K-Vektor tranduziert sind, werden auf MHC Klasse 1- Molekül-Expression durch FACS-Analyse untersucht. Nicht-transduzierte Zellen werden ebenso hinsichtlich der MHC Klasse 1-Molekül-Expression analysiert und mit E3/19K transduzierten Zellen verglichen, um den Effekt der Transduktion auf die MHC Klasse 1-Molekül- Expression zu bestimmen.
Die murinen Zellinien, L33-E3/19K, L33env-E3/19K, L33, L33env, BC10ME, BCenv, BCenv-E3/19K, werden bezüglich der Expression des H-2Dd-Moleküls auf der Zelloberfläche getestet. Zur subkonfluenten Dichte angewachsene Zellen werden aus Kulturschalen durch Behandlung mit Versen entfernt und zweimal mit kaltem (4ºC) PBS plus 1% BSA und 0,02% Na- Azid (Waschpuffer) durch Zentrifugation bei 200g gewaschen. Zwei · 10&sup6; Zellen werden in Mikrofugenröhrchen überführt und durch Zentrifugation bei 200g pelletiert, und der Überstand wird entfernt. Die Zellen werden mit dem H-2Dd-spezifischen Mab 34-2-125 (50 ul einer 1 : 100- Verdünnung des gereinigten Antikörpers, ATCC Nr. HB87) resuspendiert und 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Antikörper-markierte Zellen werden zweimal mit 1 ml Waschpuffer (4ºC) gewaschen, zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die Zellen werden mit einem biotinylierten Anti-Mäuse-Kappaleichte Ketten-Mab aus Ziege (Amersham, Arlington Heights, IL) (50 ul einer 1 : 100-Verdünnung des gereinigten Antikörpers) resuspendiert und 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden gewaschen, mit 50 ul Avidin konjugiertem FITC (Pierce, Rockford, IL) resuspendiert und 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden ein weiteres Mal gewaschen, in 1 ml Waschpuffer resuspendiert und vor der Analyse in einer FACStar-Analysevorrichtung (Becton Dickinson, Los Angeles, CA) auf Eis aufbewahrt. Die mittlere Fluoreszenzintensität von transduzierten Zellen wird mit der von nichttransduzierten Zellen verglichen, um den Effekt, den das E3/19K-Protein auf die Expression von MHC Klasse 1-Molekülen auf der Oberfläche hat, zu bestimmen.

Beispiel 13

CTL-ASSAY BEI MÄUSEN

Balb/c-Mäusen werden 10&sup7; bestrahlte (10.000 rad) BCenv-Zellen injiziert. Nach 7 Tagen wird die Milz entnommen, in eine Einzelzellsuspension dispergiert und 3 · 10&sup6; Splenocyten/ml werden in vitro mit 6 · 10&sup4; Zellen bestrahlten BCenv- oder BCenv-E3/19K-Zellen fur 7 Tage bei 37ºC in T-25-Flaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640; 5% fetales Hitze-inaktiviertes Rinderserum (FPS); 1 mM Pyruvat; 50 ug/ml Gentamicin und 10&supmin;&sup5; M2- Mercaptoethanol. Effektorzellen werden 7 Tage später geerntet und unter Verwendung unterschiedlicher Effektor : Zielzellen-Verhältnisse in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Standard-4-6-Stunden-Test untersucht. Der Test verwendet Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4;-markierte, 100 uCi, 1 Stunde bei 37ºC, (Amersham, Arlington Heights, Illinois)-Zielzellen (BC, Bcenv, Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645, 1991, oder BCenv-E3/19K), 1,0 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung und einem Endtotalvolumen pro Vertiefung von 200 ul. Nach der Inkubation werden 100 ul des Kulturmediums entnommen und in einem WALLAC-Gamma-Spektrometer (Gaithersburg, MD.) analysiert. Die spontane Freisetzung (SR) wird als Signale pro Minute (CPM) von CPM-Zielen plus Medium bestimmt, und die maximale Freisetzung (MR) wird wie von den Zielen plus 1M HCl bestimmt. Der Prozentsatz der Zielzell-Lyse wird berechnet wie: [(Effektorzelle + Ziel-CPM) - (SR)]/[(MR) - (SR)] · 100. Die spontanen Freisetzungswerte von Zielen sind typischerweise 10%-30% des MR. Mit dem interessierenden Gen (Ribozym, E3/19K, Antisinn etc.) transduzierte Tumorzellen werden als Stimulator und/oder Zielzellen in diesem Test eingesetzt, um die Reduktion von HP/-spezifischer CTL-Induktion und -Detektion, verglichen mit der nicht-transduzierten Zellinie als Positivkontrolle, zu demonstrieren.

Beispiel 14

DIE TUMORABSTOSSUNG VON L33ENV-ZELLEN DURCH BALB/C-MÄUSE WIRD AUFGEHOBEN, WENN DIE KLASSE I-MOLEKÜLOBERFLÄCHEN- EXPRESSION DURCH DIE E3-VEKTORTRANSDUKTION VERRINGERT WIRD.

Die L33env-Zelle wird als Modell für gentherapeutisch behandelte transformierte Zellen verwendet. Gentherapeutisch behandelte Zellen stellen ein Fremdprotein her, welches sie zu potentiellen Zielen für eine Entfernung durch CTL macht. Es wurde gezeigt, daß Balb/c-Mäuse nach Injektion lebender L33-Tumorzellen einen festen Tumor entwickeln werden, der durch Tastmessung innerhalb von drei Wochen nach Behandlung identifizierbar ist. Balb/c-Mäuse, denen lebende transformierte L33env-Tumorzellen (L33-Zellen, die transduziert sind und hinsichtlich von Expression des HIV-1IIIB-Hüllproteins ausgewählt worden sind) injiziert wurden, erkennen jedoch HIVenv in Verbindung mit H-2Dd und stoßen die Tumorzellen ab, und es erscheint bis zu 15 Wochen später kein Tumor (Warner et al., AaS Res. and Human Retroviruses 7: 645, 1991). Die Transformation von L33env-Zellen mit dem E3/19K-Vektor verringert die Zelloberflächenexpression von MHC Klasse 1-Molekülen, wodurch diese Zellen der Immunüberwachung entgehen können und dadurch einen Tumor etablieren. Die Entwicklung eines L33env-Tumors zeigt, daß die Zelloberflächenexpression von MHC Klasse 1-Molekülen verringert wurde, indem Zellen mit dem E19-Gen co-transduziert wurden. Dieses behindert die optimalen Beseitigungsmechanismen des Immunsystems.
Die drei Tumorzellinien L33, L33env und L33env-E3/19K werden in DMEM mit 10% FPS gezüchtet. Die Tumorzellen werden vorsichtig mit kaltem (4ºC) PBS gespült und mit Versen behandelt, um sie von der Zellkulturschale zu entfernen. Nach Absaugen der Zellen aus der Schale werden Einzelzellsuspensionen in sterile Plastikröhrchen überführt. Die Zellsuspensionen werden zweimal in sterilem PBS (4ºC) gewaschen, gezählt und in PBS bei 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert. Balb/c-Mäuse (4-6 Wochen alt) werden 10&sup6; lebende Tumorzellen (0,1 ml) subkutan injiziert, und sie werden hinsichtlich Tumorbildung und Tumorbeseitigung bewertet. Unterschiedlichen Mäusen werden unterschiedliche Tumorzellinien injiziert. Mäuse, denen L33- Zellen injiziert werden, sind Positivkontroll-Tiere für die Tumorbildung, während Mäuse, denen L33env injiziert werden, Negativkontrollen sind und die Tumorzellen wegen der envspezifischen CTL-Antwort abstoßen sollten. Die Gruppe der Mäuse, denen E3/19K- transformierte L33env-Zellen injiziert wurden, werden überwacht, um den Effekt zu zeigen, den die E3/19K-Expression in den L33env-Zellen auf die Immunantwort der Mäuse auf diese Tumorzellen hat.

Beispiel 15

FACS-ANALYSE VON E3/19K-VEKTOR-TRANSDUZIERTEN HUMANEN ZELLEN, UM VERRINGERTE GRADE DER MHC-KLASSE I-EXPRESSION, VERGLICHEN MIT NICHT-TRANSDUZIERTEN ZELLEN, ZU DEMONSTRIEREN

Mit dem E3/19K-Vektor transduzierte Zellinien werden durch FACS-Analyse auf Expression von Klasse I-Molekülen untersucht. Nicht-transduzierte Zellen werden auf Expression von Klasse I-Molekülen analysiert, um sie mit E3/19K-transduzierten Zellen zu vergleichen, und den Effekt zu bestimmen, den die Transduktion auf die Expression von Klasse I-Molekülen hat.
Zwei humane Zellinien, JY-E3/19K und JY&supmin;, werden auf Expression des HLA-A2- Moleküls auf der Zelloberfläche untersucht. Auf 10&sup6; Zellen/ml gezüchteter Suspensionszellen werden mit einer Pipette aus den Kulturflaschen entfernt und zweimal mit kaltem (4ºC) PBS plus 1% BSA und 0,02% Na-Azid (Waschpuffer) mittels Zentrifugation bei 200 g gewaschen. Zwei Millionen (2 · 10&sup6;) Zellen werden in Mikrofugenröhrchen überführt, bei 200 g pelletiert, und der Überstand wird entfernt. Die Zellpellets werden mit dem HLA-A2-spezifischen Mab- BB7.2 (50 ul einer 1 : 100-Verdünnung des gereinigten Antikörpers, ATCC Nr. HB82) resuspendiert und mit dem Antikörper 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Antikörper-markierte Zellen werden zweimal mit 1 ml Waschpuffer (4ºC) gewaschen. Bevor der Überstand entfernt wird, werden die Zellen mit einem biotinylierten Anti-Maus-Kappaleichte Kette-Mab aus Ratten (50 ul einer 1 : 100-Verdünnung des gereinigten Antikörpers) resuspendiert und 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden gewaschen, mit 50 ul Avidinkonjugiertem FITC resuspendiert und 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden ein weiteres Mal gewaschen und in 1 ml Waschpuffer resuspendiert und vor der Analyse mittels einer FACStar-Analysevorrichtung auf Eis aufbewahrt. Die mittlere Fluoreszenzintensität der transduzierten Zellen wird mit der von nicht-transduzierten Zellen verglichen, um den Effekt, den das E3/19K-Protein auf die Oberflächen-MHC-Klasse I-Molekül-Expression hat, zu bestimmen.

Beispiel 16

MESSUNG DER IMMUNANTWORT GEGENÜBER E3/19K-TRANSDUZIERTEN UND NICHT-TRANSDUZIERTEN EBV-TRANSFORMIERTEN HUMANEN JY-ZELLEN DURCH HLA-A2-RESTRINGIERTE, EBV-SPEZIFISCHE HUMANE CTL-LINIEN.

Bei humanen CTL-Linien, die unter Verwendung mit autologem EBV transformierten Zellen als Stimulatoren aus Spenderblutproben entwickelt wurden, wurde gezeigt, daß sie HLA- A2-restringiert und spezifisch für EBV-Proteine sind. Diese CTL-Linien werden mit Zellen, die mit autologem EBV transformiert sind, entwickelt und können JY-Zielzellen (HLA-A2&spplus; und EBV-transformiert) lysieren. Mit diesen CTL-Linien und JY-Zielzellen, die mit dem E3/19K- Gen transformiert wurden oder nicht-transduziert sind, kann ein Chromfreisetzungstest durchgeführt werden. Die E3/19K-transformierten JY-Zielzellen werden verwendet, um die verringerte Erkennung und Lyse dieser Zelle, verglichen mit nicht-transformierten JY-Zielzellen, zu demonstrieren. Diese Resultate zeigen, daß die Zelltransformation mit Mitteln, die die MAC- Klasse I-Oberflächen-Expression verringert, ebenso die durch eine MHC Klasse 1-restringierte Zelle vermittelten Immunantworten in einem in vitro-humanen Zellmodell-System verringert.
Etwa 1 · 10&sup6; bestrahlte (10.000 rad) JY-Zellen werden mit 1 · 10&sup7; PBMC aus einer Person, die HLA-A2 aufweist, und von der gezeigt wurde, daß sie eine EBV-Antwort zeigt, in 10 ml Kulturmedium bei 37ºC, 5% CO&sub2; für 7-10 Tage kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640, supplementiert mit 5% Hitze-inaktiviertem fetalen Rinderserum, das für das CTL- Wachstum vorausgewählt ist, 1 mM Natriumpyruvat und nicht-essentiellen Aminosäuren. Nach der 7-10 Tage-Inkubation werden die Effektorzellen geerntet und in einem 4-6 Stunden dauernden Standard-Chromfreisetzungstest unter Verwendung von &sup5;¹Cr-markierten JY-Zellen als Positivkontrolle und &sup5;¹Cr-markierten JY-E3/19K-Zellen untersucht. JY- und JY-E3/19K-Zellen werden mit 300 uCl Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; eine Stunde bei 37ºC markiert, dann gewaschen, gezählt und in dem Test bei 4 · 10³ Zellen/Vertiefung mit einem Gesamtendvolumen von 200 ul pro Vertiefung verwendet. Nach Inkubation werden 100 ul Kulturmedium entfernt und in einem WAL- LAC-Gaxnma-Spektrometer analysiert. Die spontane Freisetzung (SR) wird als Signale pro Minute (CPM), CPM-Zielen plus Medium bestimmt, und die maximale Freisetzung (MR) wird wie von den Zielen plus 1M HCl bestimmt. Der Prozentsatz der Zielzell-Lyse wird berechnet wie folgt: [(Effektorzelle + Ziel-CPM) - (SR)]/[(MR) - (SR)] · 100. Die spontanen Freisetzungswerte von Zielen sind typischerweise 10%-30% des MR. Mit dem interessierenden Gen (Ribozym, E3/19K, Antisinn etc.) transduzierte BLCL-Zellen werden als Stimulator und/oder Zielzellen in diesem Test eingesetzt, um die Reduktion von EBV-spezifischer CTL-Induktion und -Detektion, verglichen mit den nicht-transduzierten Zellinien, welche als Positivkontrolle dienen, zu demonstrieren.

Beispiel 17

EX-VIVO-VERABREICHUNG EINES MULTIVALENTEN RETROVIRALEN GLUCOCEREBROSIDASE-VEKTORS.

Pluripotente hämatopetische Stammzellen, CD34&spplus;-Zellen, werden aus dem Knochenmark eines Patienten mittels Spritzenentnahme, durchgeführt unter Anwendung bekannter Techniken, entnommen. Alternativ können CD34&spplus;-Zellen auch aus dem Nabelschnurblut eines Neugeborenen erhalten werden, falls der Patient vor der Geburt diagnostiziert wird. Im allgemeinen werden 20 Knochenmarkspunktionen durch Punktur der Femurschäfte oder von der hinteren Darmbeincrista unter lokaler oder vollständiger Anästhesie erhalten. Die Knochenmarkspunktionen werden dann zusammengefaßt und dann in Hepes-gepufferter Hank's ausgewogener Salzlösung, die Heparinsulfat bei 100 U/ml und 100 ug/ml Desoxyribonuklease I enthält, suspendiert und dann einer Ficoll-Gradiententrennung unterzogen. Die Buffycoat- Markzellen werden dann zusammengefaßt und entsprechend dem CEPRATETM LC (CD34)- Trennungssystem (Cellpro, Bothell, WA) gewaschen. Die gewaschenen Buffycoat-Zellen werden dann nachfolgend mit monoklonalem Anti-CD34&spplus;- Antikörper gefärbt, gewaschen und dann mit biotinyliertem Zweitantikörper, der mit dem CEPRATETM-System geliefert wird, gefärbt. Das Zellgemisch wird dann auf die CEPRATETM-Avidinsäule geladen. Die Biotinmarkierten Zellen werden an die Säule adsorbiert, während unmarkierte Zellen hindurchpassieren. Die Säule wird dann entsprechend der Anweisungen des CEPRATETM-Systems gespült, und die CD34-Zellen werden dann durch Schütteln der Säule durch manuelles Pressen des Gelbetts eluiert. Sobald die CD34&spplus;-Zellen gereinigt sind, werden die gereinigten Stammzellen gezählt und in einer Konzentration von 1 · 10&sup5;-Zellen/ml in Iscove's modifiziertem Dulbecco'- Medium, IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), welches 20% gesammeltes nicht-Hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum (hAB-Serum) enthält, ausplattiert.
Nach Reinigung der CD34&spplus;-Zellen können verschiedene Methoden der Transformation der gereinigten Stammzellen durchgeführt werden. Ein Ansatz beinhaltet die Transduktion der gereinigten Stammzellpopulation mit aus Vektor-produzierenden Zellen, Beispiel 10, erhaltenen Vektor-enthaltenden Überstandkulturen. Ein zweiter Ansatz beinhaltet die Co-Kultivierung einer bestrahlten Monolayer aus Vektor-produzierenden Zellen mit der gereinigten Population nichtadhärenter CD34&spplus;-Zellen. Ein dritter und bevorzugter Ansatz beinhaltet einen gleichartigen Co-Kultivierungsansatz, die gereinigten CD34&spplus;-Zellen werden jedoch mit verschiedenen Cytokinen vorstimuliert und 48 Stunden vor der Co-Kultivierung mit den bestrahlten Vektorproduzierenden Zellen kultiviert. Die Vorstimulierung vor der Transduktion erhöht den effektiven Gentransfer (Nolta et al., Exp. Hematol. 20: 1065, 1992). Der erhöhte Grad der Transduktion wird der erhöhten Proliferation der Stammzellen zugeschrieben, die für eine effiziente retrovirale Transduktion notwendig ist. Die Stimulation dieser Kulturen zu proliferieren stellt außerdem erhöhte Zellpoplulationen zur Re-Infusion in den Patienten bereit.
Die Prä-Stimulation der CD34-Zellen wird durch Inkubation der Zellen mit einer Kombination von Cytokinen und Wachstumsfaktoren durchgeführt, welche IL-1, IL-3, IL-6 und den Mastzellwachstumsfaktor (MGF) umfassen. Die Prä-Stimulierung wird durchgeführt, indem 1-2 · 10&sup5; CD34&spplus;-Zellen/ml Medium in T25-Gewebekulturflaschen, die Knochenmark-Stimulationsmedium enthalten, 48 Stunden kultiviert werden. Das Knochenmarks-Stimulationsmedium besteht aus IMDM, welches 30% nicht-Hitze-inaktiviertes hAB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 1 um Hydrocortison und 1% deionisiertes Rinderserumalbumin enthält. Alle in den Knochenmarkkulturen verwendeten Reagenzien sollten auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, maximale Anzahlen von Granulocyten-, Erythrocyten-, Makrophagen-, Megakaryocyten-Kolonie-bildende Einheiten aus normalem Knochenmark zu fördern. Gereinigte rekombinante humane Cytokine und Wachstumsfaktoren (Immunex Corp., Seattle, WA) zur Vor-Stimulierung sollten in den folgenden Konzentrationen verwendet werden: Aus E. coli erhaltenes IL-1α (100 U/ml), aus Hefe erhaltenes IL-3 (5 ng/ml), IL-6 (50 U/ml) und MGF (50 ng/ml) (Anderson et al., Cell Growth Differ. 2173, 1991).
Nach Prä-Stimulierung der CD34&spplus;-Zellen werden die Zellen dann durch Co- Kultivierung auf der bestrahlten, auf DA-basierenden Produktionszellinie, die den therapeutischen multivalenten GC-Vektor exprimiert, in fortlaufender Gegenwart des Stimulationsmediums transduziert. Die DA-Vektor-prodizierende Zellinie wird zuerst mit Trypsin behandelt, mit 10.000 rad bestrahlt und bei 1-2 · 10&sup5;/ml Knochenmark-Stimulationsmedium wieder ausplattiert. Am folgenden Tag wurden 1-2 · 10&sup5; vorstimulierte CD34&spplus;-Zellen/ml zu der DA-Vektor- produzierenden Zellinien-Monolayer, gefolgt von Polypren (Sigma, St. Louis, MO), in einer Endkonzentration von 4 ug/ml hinzugefügt. Die Co-Kultivierung der Zellen sollte für 48 Stunden durchgeführt werden. Nach Co-Kultivierung werden die CD34&spplus;-Zellen von der adhärenten DA-Vektor-produzierenden Zellmonolayer durch heftiges Spülen mit Medium entnommen und 2 Stunden ausplattiert, um eine Anheftung von verschleppten Vektor-produzierenden Zellen zu ermöglichen. Diese Zellen werden dann zusammengefaßt und zusätzlich 72 Stunden vermehrt. Die Zellen werden zusammengefaßt und in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Kälteschutzmittels in Aliquoten von 1 · 10&sup7; Zellen pro Gefäß eingefroren. Nachdem die transformierten CD34&spplus;-Zellen auf Anwesenheit zusätzlicher Mittel hin untersucht wurden, können eingefrorene transformierte CD34&spplus;-Zellen aufgetaut werden, in einer Konzentration von 1 · 10&sup5; Zellen/ml ausplattiert werden und zusätzlich 48 Stunden in Knochenmark-Stimulationsmedium kultiviert werden. Die transformierten Zellen werden dann zusammengefaßt, zweimal gewaschen und in normaler Kochsalzlösung resuspendiert. Es ist vorgesehen, daß die Anzahl transformierter Zellen, die verwendet werden, um sie in den Patienten zurück zu infundieren, minimal 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen pro Patient pro Injektion ist. Der Ort der Infusion kann direkt in das Knochenmark des Patienten sein oder i.v. in den peripheren Blutstrom. Patienten, die autologe transduzierte Knochenmarkzellen erhalten, können entweder teilweise oder vollständig körperbestrahlt sein, um bestehende Knochenmarkspopulationen zu eliminieren. Eine Bewertung der Behandlung kann zu verschiedenen Zeitpunkten, nach Infusion durch Überwachen der Glucocerebrosidase-Aktivität in differenzierten Zelltypen und hinsichtlich der Länge der Expression, durchgeführt werden. An dem Punkt, an dem die Expression abnimmt oder nicht mehr stattfindet, kann eine Verabreichung von transformierten autologen Zellen in den Patienten reinjiziert werden.
Aus dem vorstehenden wird klar werden, daß, obwohl spezifische Ausführungsbeispiele der Erfindung hier zum Zwecke der Illustration beschrieben worden sind, unterschiedliche Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Umfang der Erfindung zu überschreiten. Dementsprechend ist die Erfindung nicht begrenzt, außer wie mittels der angefügten Ansprüche.

Claims

1. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt, welches die Expression eines therapeutischen Proteins und eines zweiten Proteins oder eines aktiven Teils des zweiten Proteins, welches fähig ist, die MHC-Antigen-Präsentation zu inhibieren, steuert.

2. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach Anspruch 1, welches die Expression eines therapeutischen Proteins und eines zweiten Proteins oder eines aktiven Teils des zweiten Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E3/19K und H301, steuert.

3. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt, welches die Expression eines therapeutischen Proteins und einer anti- Sinn-Message, die an eine konservierte Region der MHC-Klasse I schwere Ketten-Transkripte oder das Transkript eines Proteins, ausgewählt aus β&sub2;-Mikroglobulin und PSF1, bindet, steuert.

4. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt, welches die Expression eines therapeutischen Proteins und eines Ribozyms, das eine konservierte Region von MHC-Klasse I-schwere Ketten- Transkripten oder des Transkripts eines Proteins, ausgewählt aus β&sub2;-Mikroglobulin und PSF1, spaltet, steuert.

5. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches die Expression eines therapeutischen Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Faktor IX, Hämoglobulin, Phenylalaninhydroxylase, Adenosindeaminase, Hypoxyanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Dystrophin, dem cystische Fibrosetransmembran-Leitfähigkeitsregulator und dem LDL-Rezeptor aus Leber, steuert.

6. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches die Expression von Faktor VIII steuert.

7. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches die Expression des α&sub1;- Antitrypsins steuert.

8. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches die Expression von Glucocerebrosidase steuert.

9. Multivaltentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches ein virales Vektorkonstrukt ist.

10. Multivalentes rekombinantes Vektorkonstrukt nach Anspruch 9, welches ein retrovirales Vektorkonstrukt ist.

11. Virus, der ein Vektorkonstrukt nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 trägt.

12. Virus nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poliovirus, Rhinovirus, Vacciniavirus, Influenzavirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpes simplex- Virus und Masernvirus.

13. Virus nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Togaviridae-, Picornaviridae-, Poxyviridae-, Adenoviridae-, Parvoviridae-, Herpesviridae-, Coronaviridae- und Paramyxoviridae-Viren.

14. Virus nach Anspruch 11, welcher ein rekombinanter Coronavirus ist.

15. Virus nach Anspruch 11, welcher ein rekombinanter Sindbis-Virus ist.

16. Virus nach Anspruch 11, welcher ein rekombinanter Retrovirus ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein Virus nach einem der Ansprüche 11 bis 16 und einen physiologisch annehmbaren Träger oder ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel.

18. Ex vivo-Gewebezellen eines Tieres, die mit einem multivalenten rekombinanten Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transformiert sind, wobei das therapeutische Protein exprimiert wird und eine Immunantwort gegen diese Zellen in vivo bei Expression dieses therapeutischen Proteins unterdrückt ist.

19. Zellen nach Anspruch 18, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblastenzellen, Knochenmarkszellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Leberzellen, follekularen Schilddrüsenzellen, hematopoetischen Vorläuferzellen und Lymphocyten.