DE69922225T2

DE69922225T2 - Cobalamintest

Info

Publication number: DE69922225T2
Application number: DE69922225T
Authority: DE
Inventors: Erling Sundrehagen; Lars Orning
Original assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Current assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2019-09-21
Also published as: GB9820473D0; NO20011353D0; KR20010079854A; NO20083610L; EP1443328A3; PL198095B1; MXPA01002591A; DE69922225D1; ES2234299T3; NO327771B1; CZ298310B6; PT1443328E; PT1114323E; ATE283490T1; ATE363076T1; NZ510766A; EP1443328B1; DE69936154T2; KR100646305B1; NO20011353L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Bestimmung von Cobalamin oder Vitamin B₁₂ in einer Körperflüssigkeit und insbesondere ein Testverfahren für den metabolisch aktiven Anteil von Cobalamin.
Cobalamin oder Vitamin B₁₂ ist ein wasserlösliches Vitamin, das einen Teil des Vitamin-B-Komplexes, der in Nahrungsmitteln zu finden ist, darstellt. Das Kernmolekül besteht aus einem Corrinring aus vier Pyroleinheiten, die ein essentielles Kobaltatom umgeben. Cobalamin ist das einzige Vitamin, das nicht von Tieren oder Pflanzen synthetisiert werden kann und das aus Nahrungsmitteln im Darm absorbiert werden muss. Es kann jedoch in der Leber gelagert werden. Es wird von Mikroorganismen synthetisiert, insbesondere von anaeroben Bakterien und Hefen.
Cobalamin dient in vivo als Coenzym und Cobalamin-Enzyme katalysieren drei Typen von Reaktionen; (i) intramolekulare Rearrangements, z. B. die Formation von Succinyl CoA aus L-methylmalonyl CoA, (ii) Methylierungen, z. B. die Bildung von Methionin durch Methylierung von Homocystein und (iii) Reduktion von Ribonucleotiden zu Desoxyribonucleotiden in einigen Mikroorganismen. In Säugern sind nur zwei enzymatische Reaktionen bekannt, die Cobalamin als Coenyzm benötigen, nämlich die zuvor unter (i) und (ii) genannten. Bei dem Prozess der Verdauung bindet ein Speichelprotein, das Haptocorrin genannt wird, und nachfolgend als HC bezeichnet wird (es wird im Stand der Technik auch als R-binder oder Transcobalamin I und III kollektiv bezeichnet), Cobalamin im oberen Gastrointestinaltrakt, um einen Komplex zu bilden, der den Magen passiert. Pankreatische Enzyme verdauen den Cobalamin-Haptocorrin (holo-HC) Komplex im Ileum, setzen Cobalamin frei, das sodann an ein Protein, das intrinsischer Faktor genannt wird, bindet, das von der Schleimhaut des Verdauungstrakts sezerniert wird, um einen weiteren Komplex zu bilden. Der Cobalamin-intrinsische Faktorkomplex bindet an einen spezifischen Rezeptor in der Wand des endständigen Ileums, wonach es dissoziiert wird durch einen Freisetzungsfaktor und das Cobalamin aktiv durch die Membran des Ileums in den Blutstrom transportiert wird.
Cobalamin zirkuliert im Körper nicht in nennenswerter Menge in freier Form. Etwa 99% des Cobalamins ist gebunden durch Transcobalamin Proteine (TC I-III) oder Albumin.
Das Protein, von dem man annimmt, das es verantwortlich ist für den Transport von Cobalamin zu Zielgeweben ist Transcobalamin II (TC II), ein kritisches Spurenprotein, ohne das Cobalamin nicht durch die Zellmembran transportiert werden kann. Trotz der bedeutenden metabolischen Funktion ist nur etwa 6–25% des Cobalamins im Serum an TC II gebunden und das meiste Cobalamin wird durch HC transportiert. TC II ist ein einzelkettiges Polypeptid von 45 kDA, das hauptsächlich im Serum, der Samenflüssigkeit und der Cerebro-Spinal-Flüssigkeit gefunden wird. An TC II gebundenes Cobalamin oder Holo-TC II bindet an einen spezifischen Rezeptor einer Zellmembran. Einmal gebunden wird der Holo-TC II Komplex durch Pinocytose in die Zelle aufgenommen.
TC II wird von der Leber, dem vaskulären Endothel, den Enterocyten, Macrophagen und Fibroblasten synthetisiert und zirkuliert hauptsächlich als Apo-TC II, d. h. ohne gebunde nes Cobalamin. Es hat eine kurze Halbwertszeit von etwa 90 Minuten.
Weniger als die Hälfte des Gesamtplasma-Cobalamin ist an TC II gebunden. Der Rest ist gebunden an andere Transcobalamine oder Albumin, wie bereits erwähnt. Weil Cobalamin aus Nahrungsmitteln absorbiert werden muss, kann jeder Zustand, der von einer gestörten gastrischen Funktion her resultiert, z. B. Gastroenteritis oder Zustände, die von gastrischer Atrophy resultieren oder der Unfähigkeit, funktionelles Haptocorrin, intrinsischen Faktor oder Freisetzungsfaktor oder TC II oder TC II Rezeptoren herzustellen, in einer gestörten Aufnahme von Cobalamin und einem daraus resultierenden Mangel resultieren.
Gewisse Untergruppen der Population, z. B. ältere schwangere Frauen, Patienten mit chronischen oder akuten gastrointestinalen Erkrankungen, solche, die an gewissen Autoimmunerkrankungen leiden, solche mit perniciöser Anämie in der Familiengeschichte und an AIDS Leidende sind besonders anfällig für Cobalamin-Mangel.
Die klinischen Manifestationen von Cobalamin-Mangel sind vielfältig und zahlreich, aber beinhalten hauptsächlich Anämie, megaloblastische Haematopoese und funktionelle oder strukturelle Störungen des Nervensystems. Etwa 60% der Individuen, bei denen Cobalamin-Mangel diagnostiziert wird, sind anämisch, bei vielen sind neurologische Symptome die einzigen zu beobachtenden klinischen Zeichen. Etwa 10% der Patienten haben psychiatrische Symptome und etwa 40% haben beides, neurologische und psychiatrische Symptome.
Eine Früherkennung von Cobalamin-Mangel ist wichtig, um eine gute Prognose für die Patienten zu gewährleisten, da einige der Manifestationen von Cobalamin-Mangel, insbesondere die neuropsychiatrischen Effekte irreversibel sind, wenn sie nicht festgestellt und sofort durch Cobalamin-Therapie gelindert werden. Es ist daher wünschenswert, den Cobalamin-Spiegel bei Individuen in einer zweckdienlichen und effizienten Form akkurat zu bestimmen mit Blick auf die Feststellung, ob ein Individuum an Cobalamin-Mangel leidet oder nicht.
Die Messung von dem Gesamtplasma-Cobalamin, d. h. Cobalamin (und cobalaminartige Sustanzen), die an entweder Transcobalamin (TC) Proteine I, II oder III gebunden sind, wurde in Versuchen verwendet, um Cobalamin-Mangel festzustellen. Diese Technik resultiert in einer breitbasierten Konzentrationsverteilung innerhalb der Population, die als normal betrachtet wird und somit einen breiten Referenzbereich produziert. Innerhalb von Individuen ist der Bereich von vorliegendem Cobalamin, der für das Individuum als normal angesehen wird, jedoch sehr eng. Es wurde beobachtet, dass ein Individuum zwar metabolisch aktive Cobalamin-Konzentrationen besitzt, die außerhalb des eigenen Referenzbereiches lagen, der Gesamt-Cobalamin-Gehalt aber innerhalb des Bereichs, der als normal für die Population angesehen wird, lag. Unter diesen Umständen kann ein Cobalamin-Mangel unentdeckt bleiben. Solch eine unzuverlässige Methode ist klar nicht wünschenswert und es ist wohl anerkannt, dass solche Serum- und Plasma-Cobalamin-Messungen eine geringe diagnostische Sensibilität und Spezifität besitzen.
Mikrobielle Tests, die Mikroorganismen, deren Wachstum von Cobalamin abhängt, beinhalten, wurden entwickelt und verwendet bei der Messung von Plasma-Cobalamin-Konzentrationen. Aber, zusätzlich zu der Schwierigkeit des Einschätzens des geeigneten Referenzbereichs, benötigen diese Verfahren Extraktion und Umwandlung von Cobalaminen, was sehr zeitaufwendig, fehlerbehaftet und völlig ungeeignet ist für ein schnelles Durchsuchen im Labor.
Alternative Verfahren zur Feststellung von Cobalamin-Mängeln beinhalten das Messen der Akkumulation von Metaboliten im Plasma, die Cobalamin für ihre Umwandlung benötigen. Plasma-Methylmalonat- und Plasma-Homocystein-Spiegel steigen in Cobalamin-Mangel-Individuen an (Chanarin, The megaloblastic anaemia; London, Blackwell Scientic Publications, 1991). Sie stellen gute Kandidatenmoleküle für eine Korrelation mit Vitamin B₁₂-Mangel dar. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Verfahren, die auf Homocysteinbestimmung basieren, kompliziert und unpraktisch sind und eine mäßige Spezifität und Sensitivität zeigen. Methoden, die auf Methylmalonatmessung basieren, sind zwar genau und zuverlässig, sie sind jedoch mühsam und benötigen eine kombinierte Gas-Chromatographie/Massenspektrometrieanalyse und sind somit teuer und ebenso ungeeignet für Routinedurchsuchungen in der Klinik (Nexo et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61–76).
Es wurde auch vorgeschlagen, dass Messungen von an TC II gebundenem Cobalamin im Gegensatz zu Gesamtplasma-Cobalamin einen zuverlässigen klinischen Indikator für die Wahrscheinlichkeit eines Cobalamin-Mangels bereitstellen würden (Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34: 132–139; Wickramasinghe and Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539; US Patent 4680273). Bemühungen, um Holo-TC II Konzentrationen zu bestimmen, waren jedoch bis heute meistens indirekt, wobei die Holo-TC II-Konzentration abgeschätzt wurde als Differenz zwischen Gesamtplasma-Cobalamin und Cobalaminkonzentrationen des TC II abgereicherten Plasmas.
Solche TC II Abreicherungen können erreicht werden durch Absorption an Amoniumsulfat (Carmel (1974) Am. J. Clin. Pa thol. 62: 367–372), Microsilica (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332–337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539), mikrofeines Glas (Vu et al. (1993) Am J. Hematol. 42: 202–211) oder immobilisierte Anti-TC II polyclonale Antikörper (Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 53–51). Die Konzentration von Cobalamin im Gesamtplasma und der abgereicherten Fraktion wird durch Verfahren bestimmt, die im Stand der Technik gut bekannt sind wie Radio- oder Enzym-Immunoassay-Techniken. Diese Verfahren sind ungeeignet für das automatisierte oder nicht-automatisierte Routinedurchsuchen, weil sie komplex und zeitaufwendig sind und weil der geringe Grad an Spezifität des absorbierten verwendeten Materials in einer ungenügenden Trennung von Holo-TC II und Holo-HC resultiert, was zu einer übermäßigen Einschätzung von Holo-TC II führt. Variationen von Probe zu Probe des absorbierten Materials führen weitere Fehler ein und, am wichtigsten, die Subtraktion von einem großen Volumen von einem anderen großen Volumen führt zu nicht akzeptabler Unzuverlässigkeit und Ungenauigkeit.
Die anderen Versuche, TC II zu bestimmen, beinhalten das Separieren von TC II von anderen Serumkomponenten einschließlich des TC I und TC III unter Verwendung von Lipophilizität. Dementsprechend offenbaren Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172: 297–310, Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195–199 und Toft et al. (1994) Stand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 Verfahren zum Separieren von TC II von anderen Transcobalaminen unter Verwendung von Heparin Sepharose, Silica Gel oder Zellulose. Diese Verfahren haben jedoch die gleichen Nachteile wie die indirekten Verfahren, weil sie von demselben absorbierten Material abhängen. Die geringe Plasmakonzentration von Holo-TC II führt ebenfalls dazu, dass die Verfahren nicht geeignet sind zur Kombination mit bestehenden Verfahren zur Cobala min-Quantifizierung. Der normale Bereich von Holo-TC II ist 35–160 pM und Werte unterhalb von 35 pM würden grundsätzlich als Anzeichen für Cobalamin-Mangel angesehen. Die berichtete analytische Sensitivität der meisten Routineverfahren für Plasma-Cobalamin liegt bei etwa 40 pM, ist aber in der Praxis oft viel höher, typischerweise bei etwa 90 pM. Dementsprechend sind normale Plasmaspiegel von Holo-TC II unterhalb oder nahe bei der Sensitivitätsgrenze der Routineverfahren zur Cobalamin-Quantifizierung.
Die möglicherweise genaueste Methode, die derzeit bekannt ist zur Bestimmung von TC II gebundenem Cobalamin, beinhaltet das Absobieren von TC II an Silica und dann den Nachweis der gebundenen Fraktion nach Cobalamin-Gehalt unter Verwendung von entweder einem Immunoassay wie beschrieben, z. B. in Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073–2077, oder einem mikrobiologischen Test, wobei der zuletzt genannte anscheinende die besten Ergebnisse liefert. Dieses Verfahren benötigt einen kompletten Arbeitstag, wobei nur 20 Tests durchgeführt werden. Es ist sehr teuer und unpraktisch und wenig geeignet für klinische Routinelaboruntersuchungen. Daher besteht ein großer Bedarf an verbesserten Verfahren zum Nachweis des Spiegels von metabolisch aktivem Cobalamin in einer Körperflüssigkeit im Hinblick auf das Korrelieren des Cobalamin-Spiegels mit der Wahrscheinlichkeit für Cobalamin-Mangel, wobei die Tests der klinischen diagnostischen Routineanwendung zugänglich sein sollten.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer ersten Ausführungsform ein Nachweisverfahren bereit zur Bestimmung von an Transcobalamin II (TC II) -gebundenem Cobalamin in einer Probe aus dem Körper, umfassend In-Kontakt-Bringen einer zellfreien Probe einer Körperflüssigkeit mit immobilisiertem Cobalamin oder einem Analogon oder Fragment davon, das selektiv die Apoformen von TC II und Haptocorrin bindet und anschließendes In-Kontakt-Bringen dieser Probe mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren spezifischen Bindungsliganden für TC II- oder Cobalamin-gebundenes TC II (Holo-TC II), Separieren einer ligandgebundenen Fraktion von einer nicht-ligandgebundenen Fraktion und Messen des Holo-TC II- oder TC II- gebundenen Cobalamingehalts darin.
Unter einem spezifischen Bindungsliganden ist ein solcher zu verstehen, der TC II (d. h. apo-TC und Holo-TC II) oder Holo-TC II aufgrund seiner spezifischen chemischen Struktur oder Konfirmation bindet und nicht einfach aufgrund der allgemeinen physik-chemischen Eigenschaften (die Lipophilizität), die auch anderen Komponenten der Körperflüssigkeitsprobe gemein sein kann. Die Bindungsaffinität und Spezifität der Liganden, die geeignet sind zur Verwendung in dem Verfahren, erlauben vorzugsweise eine dreifache, besonders bevorzugt eine fünffache und ganz besonders bevorzugt eine zehnfache und am meisten bevorzugt eine mehr als zehnfache Konzentration von TC II oder Holo-TC II in der Probe. Somit ist ein solches Verfahren in der Lage, genaue und zuverlässige Werte für Holo-TC II im unteren Normalbereich für Holo-TC II und auch im Subnormalbereich anzugeben. Solch eine Trennung und Konzentration von Zielmolekülen ist mit den derzeit existierenden Verfahren, die nicht in der Lage sind, effizient zwischen TC II und Holo-TC II und HC oder Holo-HC zu trennen, nicht möglich. Die Möglichkeit, TC II oder Holo-TC II zumindest dreifach anzukonzentrieren, ermöglicht die Verwendung von einem automatisierten Analysegeräte bei der Durchführung des Tests. Ohne einen solchen Konzentrationsschritt ist die Menge an Analyt, die in der Probe vorhanden ist, wahrscheinlich unterhalb der unteren Nachweisgrenze. Ein solches automatisiertes Analysegerät benötigt üblicherweise zwischen 40 und 100 μl Probe in ei nem Gesamtvolumen von typischerweise 150 μl oder mehr für den Betrieb. Daher wird eine geringe Konzentration an Analyt sogar noch weiter verdünnt für die Analyse. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Tests wird der Analyt jedoch zumindest dreifach konzentriert. Weil die Verwendung von automatisiertem analytischen Gerät typischerweise einen Kontrollbereich von 100 bis 700 pM mit einer unteren Sensitivitätsgrenze von etwa 40 pM, aber einer praktischen unteren Grenze von etwa 90 pM beinhaltet, ermöglicht eine fünffache Konzentration die Messung von Holo-TC II runter bis 18 pM und eine zehnfache Konzentration ermöglicht Messungen runter bis 9 pM Holo-TC II. Weil die vorliegende Erfindung eine Konzentrierung von mehr als zehnfach ermöglicht, ergibt sich das Ausmaß der Verstärkung der Sensitivität für den Fachmann leicht und macht das Verfahren tatsächlich zu einer sehr wirkungsvollen Technik.
Die Möglichkeit des Konzentrierens des Analyts, so dass er geeignet ist für die Analyse durch solche automatisierten Prozesse, ist ein wichtiger Vorteil des Erfindungsgemäßen Testverfahrens. Vorzugsweise wird von einer Ausgangsprobe von 600 μl einer Körperflüssigkeit ein Volumen von bis zu 150 μl, besonders bevorzugt bis zu 100 μl, und ganz besonders bevorzugt weniger als 60 μl generiert, das dann analysiert wird, optional unter Verwendung automatisierter Verfahren.
Jeder TC-II-spezifische Bindungsligand kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, entweder als Einfang, Konzentrations- und Separationsligand oder als Nachweisligand und kann abhängig von der speziellen Ausführungsform der Erfindung an TC II in sowohl der Apo- als auch Holo-Form binden oder er kann spezifisch oder vorzugsweise an die Holo-Form binden. Der TC II Bindungsligand soll vorzugsweise einen hohen Grad an Selektivität für TC II aufweisen und soll geringe oder, besonders bevorzugt, im wesentlichen keine Affinität für andere TC-Proteine, d. h. TC I oder III, in entweder Apo- oder Holo-Form aufweisen oder irgendein anderes Cobalamin-Bindungsprotein. Wenn der TC II Bindungsligand ein Holo-TC-II-spezifischer Bindungsligand ist, hat er dieselben Eigenschaften mit der zusätzlichen Anforderung, dass wenig oder vorzugsweise keine Affinität für Apo-TC II vorhanden ist.
Der TC II oder Holo-TC II Bindungsligand ist grundsätzlich entweder ein Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Stoff mit Affinität für TC II oder Holo-TC II wie ein Zelloberflächenrezeptor, ein Polypeptid, ein Oligopeptid, eine niedermolekulare organische Chemikale etc.. Andere Bindungsliganden können spezifische Bindepartner sein, ausgewählt aus einer kombinatorischen chemischen oder Phage Display Bibliothek oder eine spezifische Bindungssequenz aus DNA oder RNA.
Falls der Bindungsligand ein Antikörper ist, kann er polyclonal sein, wird aber vorzugsweise monoclonal sein. Monoclonale Antikörper können mit viel größerer Spezifität und Einheitlichkeit hergestellt werden als polyclonale Antikörper, und dies reduziert die Kreuzreaktivität mit anderen Bestandteilen der Körperflüssigkeit, insbesondere anderen Transcobalaminen und, falls notwenig, die unterschiedlichen Konfirmationen, d. h. die apo-Form des Zielanalyts. Die Einheitlichkeit und Wiederholbarkeit, die monoclonale Antikörper im Verhältnis zu polyclonalen Antikörpern ermöglichen, stellen eine größere Genauigkeit sicher, was entscheidend für einen Test ist, bei dem der Analyt in solch geringer Konzentration vorliegt. Alternativ kann der Bindungsligand ein Antikörperfragment sein, z. B. F(ab), F(ab')₂ oder F(v) Fragment. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein und können durch die Hybridoma-Technologie hergestellt werden oder synthetischen Ursprungs sein und durch rekombinante DNA-Technologie oder chemische Synthese hergestellt werden. Einzelkettige Antikörper oder andere Antikörperderivate oder Mimetica können z. B. auch verwendet werden. Die Antikörper können gerichtet sein oder abgeleitet sein von einem beliebigen Epitop, Bestandteil oder Struktur des TC II oder Holo-TC II Proteins, wie geeignet.
Geeignete Antikörper zur Verwendung als Bindungsliganden gemäß der vorliegenden Erfindung werden z. B. offenbart in Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149–154; M^cLean et al. (1997) Blood 89(1): 235–242. Rezeptormoleküle, die in der Lage sind die Apo- und Holoform von TC II oder bevorzugt und speziell die Holo-TC II Form zu binden, können in ähnlicher Weise verwendet werden. Geeignete Rezeptoren sind Zelloberflächenrezeptoren oder membrangebundene TC II oder Holo-TC II Rezeptoren und Kreuzspeziesreaktivitätseigenschaften meint, dass solche Rezeptormoleküle aus jeder Säugerspezies verwendet werden können, obwohl vorzugsweise der Ursprung solcher Rezeptoren Mensch oder Rind ist. Obwohl die Rezeptormoleküle vorzugsweise in ziemlich reiner Form isoliert werden, wird auch die Verwendung von Zellmembranen oder gemischten Membranfraktionen umfassend die Rezeptoren vorzugsweise in konzentrierter Form beabsichtigt. Solche Rezeptoren oder rezeptorenthaltende Membranen oder Membranfraktionen können vorteilhafterweise aus Niere, Plazenta oder Tumorzellen isoliert werden. Hinterlegte Zellen sollten nicht generell als Quelle für solche Rezeptoren verwendet werden. Hinterlegte Zellen können jedoch als Quelle für Happtocorrinrezeptoren verwendet werden.
Eine mit TC II Rezeptoren angereicherte Membranfraktion kann erhalten werden wie beschrieben bei Seligmann et al., J. Biol Chem 253: 1766–1772 (1978) und Nexo et al., Biochem Biophys Act 628: 190–200 (1980). Im Wesentlichen wird dabei Gewebe z. B. menschliche Plazenta oder Hasenleber in kleine Teile geschnitten und in Tris Buffer, pH 7,4 der 0,15 M NaCl und 10 mM EDTA enthält, homogenisiert, gefolgt von Zentrifugation bei 25.000 g für 30 Minuten. Um restliches Blut zu entfernen wird die Homogenisierung/Zentrifugation zumindest einmal wiederholt. Diese Membranfraktion wird weiter extrahiert mit Detergenz, z. B. Ammonyx-LO, Triton X-100 oder Chapso, und durch Zentrifugation bei 100.000 g für 30 Minuten bei 4°C geklärt. Der Überstand wird als Quelle für TC II Rezeptoren verwendet.
Ein Beispiel für geeignete Rezeptormoleküle, die vorzugsweise den Holo-TC II Komplex binden, ist ein 62 kDa einzelkettiges Glykoprotein, das als nicht kovalentes Homodimer und wird auf der Zelloberfläche von allen Geweben gefunden (Rothenberg & Quadros (1996) Balliere's Clinical Haematology 8(3) 499–514; WO 96/085150). Ein weiteres Protein, das für die Verwendung in dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist gp300, ein 600 kDa Endozytose vermittelndes Membranprotein, das in absorbierenden Endothelzellen exprimiert wird, z. B. Zellen des proximalen Nierentubulus wie offenbart und beschrieben bei Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science 93: 8612–8617. Dieser Rezeptor ist ein LDL Rezeptor und bindet beides, Apo- und Holoform von TC II.
Wenn ein Zelloberflächenrezeptor verwendet wird, kann er immobilisiert durch Konjugierung and die Oberfläche, z. B. eines Kügelchens oder einer Lage, verwendet werden oder alternativ kann eine Zellmembranfraktion enthaltend die Rezeptoren als Vesikel oder in Lage ausgeformt werden um den Rezeptor zu präsentieren.
Wenn der Ligand immobilisiert ist, kann dies z. B. an der Oberfläche eines Festkörpers wie einem Filterfilm oder einer Lage oder dem Lumen einer Röhre sein. Die Immobilisierung auf Partikeln, z. B. Mikrosphären wie solchen, die von Dyno Industrier ASA, Norwegen, hergestellt werden, ist besonders bevorzugt. Solche Partikel können porös oder nicht porös sein und falls gewünscht mit Mitteln versehen sein, die erlauben sie zu sammeln, z. B. durch Einschließen von magnetischem Material in den Partikeln wie supermagnetische Eisenoxidkristalle. Solche magnetischen Mikroteilchen (microbeads) sind erhältlich von Dyno Industrier ASA und von Dynal AS, Norwegen, Bang Particles, USA and Prolabo, France. Wenn der Ligand im Gegensatz zu immobilisiert, lediglich immobilisierbar ist, kann dies erreicht werden durch Verbinden des Ligandens mit einem Teil eines spezifischen Bindungspaares (z. B. Biotin/Streptavidin) und Verwendung des anderen Teils des Bindungspaares, optional an ein Substrat gebunden, zum Agglomerieren oder anderweitigen Immobilisieren des Liganden oder des Ligand: TC II oder Ligand: Holo-TC II Komplexes vor dem Trennen der ligandgebundenen Fraktion von der nicht gebundenen Fraktion bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Es ist im Stand der Technik bekannt, Affinitätsmoleküle, z. B. Antikörper und Antikörperfragemente zum Zwecke von Trennungen zu Immobilisieren, z. B. durch Bindung oder Kupplung der Liganden, optional durch einen Linker, an irgendeinen bekannten festen Träger oder eine Matrix, die derzeit weit verbreitet verwendet wird oder vorgeschlagen wird für Trennungen oder Immobilisation an Säulen. Dabei können alle bekannten Verfahren verwendet werden. Solche festen Phasen können als Partikel, Lagen, Gele, Filter, Membranen, Fasern oder Kapillaren oder mikrotiter Streifen oder Röhren oder Wellplatten etc. ausgestaltet sein und geeigneter Weise aus Glas, Silikon, Latex oder einem Polymermaterial hergestellt sein. Techniken zur Bindung des Liganden an den festen Träger sind ebenfalls bekannt und weitreichend in der Literatur beschrieben.
Das Kuppeln eines Liganden an ein Substrat oder an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares kann durch konventionelle Techniken erzielt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird grundsätzlich die Zugabe eines markierten Stoffs, der um die Bindung an den Liganden kompetitiert, zu der Probe beinhalten, wenn der Test als Kompetitionstest durchgeführt wird. Grundsätzlich wird hierbei bevorzugt sein, einen markierten Holo-TC II in dieser Hinsicht zu verwenden. Die zu verwendende Markierung kann jedwede Markierung sein, die eine direkte oder indirekte Bestimmung erlaubt, z. B. eine Chromophore (wobei der Begriff Fluorophoren beinhaltet), eine Radiomarkierung (grundsätzlich kovalent oder chelatgebunden), ein Enzym oder Enzymsubstrat, eine magnetische Markierung etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet dieses das In-Kontakt-Bringen eines immobilisierten oder eines immobilisierbaren TC II oder Holo-TC II Bindungsliganden mit einer zu untersuchenden Probe; das Separieren einer ligandgebundenen Fraktion von einer nicht ligandgebundenen Fraktion; Dissoziation gebundenen Cobalamins aus dem Holo-TC II Molekül in der gebundenen Fraktion und Bestimmen der Konzentration des freigesetzten Cobalamins vorzugsweise durch eine so durchgeführte Dissoziation, das die Konzentration des freigesetzten Cobalamins zumindest dreifach, vorzugsweise fünffach und am meisten bevorzugt zehnfach größer ist als die Konzentration von Holo-TC II in der ursprünglichen Probe.
Das wichtige bei diesem Aspekt der Erfindung ist, die Trennung und Konzentration von TC II oder Holo-TC II, die die Verwendung von Standardmethoden der Cobalaminbestimmung im Verfahren erlaubt. Wir zuvor angedeutet, sind die im Stand der Technik bekannten Verfahren ohne solch einen Konzentrationsschritt nicht geeignet zur Cobalaminbestimmung, da es in zu geringer Konzentration vorliegt. Jedes geeignete Mittel zur Freisetzung von Cobalamin aus dem Holo-TC II kann verwendet werden. Üblicherweise wird jedoch Hitze oder eine Änderung des pH des umgebenden Mediums in dieser Hinsicht verwendet. Die unterschiedlichen Cobalaminformen können zu weniger lichtempfindlichen Cyanocobalaminen umgewandelt werden durch Behandlung mit KCN. Jedes geeignete Mittel zur Bestimmung freien Cobalamins kann im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, z. B. ein Kompetitionstest, der durch In-Kontakt-Bringen eines immobilisierenden Bindepartners für Cobalamin mit dem dissoziierten Cobalamin in der Probe in Anwesenheit eines makierten Liganden, der mit dem isolierten Cobalamin um die Bindung an den immobilisierten Bindepartner kompetitiert, durchgeführt wird. Ein Verfahren wie in Kuemerk et al. (1992) Clin. Chem 38: 2073–2077 beschrieben, wäre z. B. geeignet. Ein alternatives Mittel zur Bestimmung freien Cobalamins ist in US Patent No. 5451508 beschrieben und beinhaltet Immunoassaytechniken.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ist bevorzugt, dass der Bindungsligand für TC II immobilisiert ist und sowohl an Holo- als auch Apo-TC II bindet.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Testverfahren das In-Kontakt-Bringen eines festen Trägers mit darauf immobilisierten TC II oder Holo-TC II Bindungsliganden mit der zu untersuchenden Probe und auch mit einem nicht immobilisierten Liganden, wobei der immobilisierte Ligand in der Lage ist, TC II oder Holo- TC II zu binden, an den nicht immobilisierten Liganden oder an den Komplex des TC II oder Holo-TC II und dem nicht immobilisierten Liganden zu binden und der nicht immobilisierte Ligand in der Lage ist zumindest einen der immobilisierten Liganden zu binden, TC II oder Holo-TC II und Komplexe des immobilisierten Liganden und TC II oder Holo-TC II; wobei, falls das Testverfahren ein Sandwichtest ist, zumindest einer der Liganden spezifisch für Holo-TC II und, falls das Verfahren ein Kompetitionassay ist, der immobilisierte Ligand spezifisch für Holo-TC II und Kompetitoren davon ist;
wobei der Anteil des immobilisierten Liganden, der an TC II oder Holo-TC II gebunden ist von dem nicht immobilisierten Liganden oder von dem Komplex des nicht immobilisierten Liganden mit TC II oder Holo-TC II abhängt von der Menge von Holo-TC II, die in der Probe anwesend ist und der nicht immobilisierte Ligand in der Lage ist ein direktes oder indirektes nachweisbares Signal zu generieren, falls gebunden oder ungebunden; Trennen einer gebundenen Fraktion von einer nicht gebundenen Fraktion und direktes oder indirektes Bestimmen des nicht immobilisierten Liganden, der an einen immobilisierten Liganden gebunden ist (gebundene Fraktion) oder nicht gebunden und in Lösung vorliegt (die nicht gebundene Fraktion); wobei das In-Kontakt-Bringen der Probe und des nicht immobilisierten Liganden mit dem festen Träger getrennt, simultan oder nacheinander durchgeführt werden kann und, falls getrennt oder nacheinander durchgeführt, die Reihenfolge variiert werden kann.
Als Ergebnis davon beinhaltet die alternative bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das Bestimmen des nicht immobilisierten Liganden, der entweder direkt oder indirekt gebunden ist oder alternativ nicht in der Lage war direkt oder indirekt an den immobilisierten Liganden zu binden. Dabei kompetitiert der nicht immobilisierte Ligand um die Bindung mit dem immobilisierten Liganden an das Holo-TC II, wobei ein hoher Spiegel an ungebundenen, nicht immobilisierten Liganden hierbei ein Anzeichen für eine hohe Konzentration von Holo-TC II in der Probe ist und ein geringer Spiegel an ungebundenen, nicht immobilisierten Liganden ist ein Anzeichen für eine geringe Konzentration von Holo-TC II in der Probe ist. Wenn der nicht immobilisierte Ligand an TC II oder Holo-TC II bindet, das wiederum an den immobilisierten Liganden gebunden ist, ist ein hoher Spiegel an gebundenen nicht immobilisierten Liganden ein Anzeichen für eine hohe Konzentration von Holo-TC II in der Probe und ein geringer Spiegel an gebundenen nicht immobilisierten Liganden ist ein Anzeichen für eine geringe Konzentration von Holo-TC II in der Probe.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird somit der metabolisch aktive Anteil an Cobalamin durch Messung vom Holo-TC II Komplex oder Messung der Menge von Cobalamin, die an TC II Moleküle gebunden ist, bestimmt, der in einer Probe des Körpers, die eine Mischung von sowohl Apo- als auch Holo-TC II und Apo- und Holo-HC (Haptocorrin oder TC-I und III) enthält, anwesend ist.
Ein vorläufiger Trennungsschritt wird unter Verwendung von immobilisierten Cobalamin oder einem Analogon oder Fragment davon durchgeführt, das selektiv an die Apo-Formen oder beides, TC II und Haptocorrin, bindet. In einem solchen vorläufigen Schritt werden die Apo-Formen von TC II und HC Proteinen von dem immobilisierten Cobalamin Analogon oder Fragment davon gebunden und getrennt von den Holo-TC II und dem Holo-HC Komplexen. Die Analyse der getrennten Holo-Formen von TC II findet dann wieder nach der zuvor beschriebenen Ausführungsformen statt, ist aber klar am meisten zweckmäßig, wo die Bestimmung des Holo-TC II Komplexes als durch die Dissoziation des Komplexes und die nachfolgende Bestimmung des freigesetzten Cobalamins stattfindet. Es versteht sich für den Fachmann, dass, wenn der vorläufige Schritt den zuvor genannten alternativen bevorzugten Ausführungsformen vorangeht, das Erfordernis, für zumindest einen Liganden im Sandwichassay spezifisch zu sein, für Holo-TC II im Vergleich zu TC II und das Erfordernis, für den immobilisierten Liganden in einem Kompetitionsassay spezifisch zu sein, für Holo-TC II und Kompetitoren davon im Gegensatz zu TC II nicht länger relevant ist, da die Apo-Form von TC II bereits eingefangen ist und nicht länger erhältlich ist. Somit können der immobilisierte oder nicht immobilisierte Ligand spezifisch für Holo-TC II oder TC II oder Kempetitioren davon sein.
Das immobilisierte Cobalamin sollte keine signifikante Tendenz entwickeln von dem Träger zu dissoziieren, da dies in der Bindung von Apo-TC II und Transformation davon in Holo-TC II resultieren könnte. Biotinyliertes Cobalamin bindet in sehr stabiler Weise an eine feste Oberfläche mit daran gebundenes Avidin/Streptavidin. Das Binden von Cobalamin an einen Träger in dieser Weise ist bequem für die Durchführung dieses Schritts. Wenn biotinyliertes Cobalamin verwendet wird, kann es tatsächlich zu der zu analysierende Probe in einer nicht immobilisierten Form hinzu gegeben werden, wo es an die Apo-Form von TC II und HC bindet. Die Probe kann dann mit einer festen Oberfläche mit einem darauf immobilisierten Bindepartner für Biotin, z. B. Avidin, in Kontakt gebracht werden. Ein Komplex von Avidin-biotinylierten Cobalamin-TC II bindet sich sodann und kann leicht aus der Probe isoliert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung, wobei ein vorläufiger Trennschritt durchgeführt wurde, wird der Holo-TC II Anteil darauf folgend bestimmt durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem immobilisierten TC II Liganden, der den Holo-TC II Komplex einfängt und das Haptocorrin in der Lösung belässt und anschließendes In-Kontakt-Bringen des immobilisierten Holo-TC II mit einem TC II Liganden, der markiert und daher nachweisbar ist. Beispiele von geeigneten TC II Bindungsliganden wären nicht überlappende monoklonale Antikörper oder tatsächlich ein polyklonaler Antikörper, spezifisch für TC II, wäre in dieser Ausführungsform geeignet zum Einfangen und dedektieren, da unterschiedliche Epitope auf dem TC II Molekül erkannt werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei ein vorläufiger Trennschritt durchgeführt wurde, kompetitiert das Holo-TC II Molekül mit einem markierten nicht immobilisierten Liganden um die Bindung an den immobilisierten Liganden dafür und die Menge von Holo-TC II wird berechnet in Bezug auf die Menge an gebundenen oder nicht-gebundenen, markierten, nicht immobilisierten Liganden, durch den immobilisierten Liganden.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Bindung von Apo-TC II und Apo-HC an Cobalamin, Analoga oder Fragmente davon in dem vorläufigen Trennschritt statt an einer Stelle oder in einer Weise, dass eine nachfolgende Erkennung und Bindung an immobilisiertes Cobalamin gebundenes TC II durch den nicht immobilisierten Liganden oder Bindungspartner für TC II verhindert wird. In dieser Ausführungsform ist kein Bedarf für eine Isolierung des Holo-TC II oder Holo-HC von den gebundenen Apo-Formen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Tests. In dieser Ausführungsform ist die Stelle, an die der nicht immobilisierte Bindungspartner oder Ligand gerichtet ist sehr wichtig und sollte ein Epitop von TC II sein, das maskiert oder abgeschirmt oder in sonstiger Weise für die Bindung nicht zugängig ist, wenn Apo-TC II und Apo- HC an das Cobalamin, Analogon oder Fragment davon immobilisiert werden.
Vollständige Trennung, d. h. Trennung von allen Apo- und Holo-TC II Proteinen aus der Probe ist kein Erfordernis für das Verfahren und es ist ausreichend, dass eine Fraktion aus der Probe getrennt wird, welche zumindest einen Teil der gewünschten „TC II Gruppe von Proteinen" enthält.
D. h. in einer bestimmten Ausführungsform können die Bindungspartner oder Liganden und Bindungsbedingungen so ausgewählt werden, dass eine Trennung von im Wesentlichen allen oder einer ausgewählten Gruppe erreicht wird. In diesem Fall könnte die nicht gebundene Fraktion als im Wesentliche frei von TC II oder Holo-TC II Proteinen betrachtet werden, d. h. als zumindest 80%, 90% oder 95% frei von entweder TC II oder Holo-TC II, abhängig davon, welcher Stoff als Basis für die Fraktionierung ausgewählt ist.
In einer alternativen Ausführungsform können die Bindungspartner und Bedingungen so ausgewählt werden, dass lediglich ein Teil der TC II Proteine in der Probe in Fraktion gedrängt wird. In diesem Fall sollte die partielle Trennung mit Bedacht im Hinblick auf das Konstruieren einer Standardkalibrierungskurve für den Test durchgeführt werden. In dieser Hinsicht werden Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet um eine Standardkalibrierungskurve zu generieren, aus der die Konzentration des nachgewiesenen Holo-TC II bestimmt werden kann.
Falls im Fraktionierungsschritt ein TC II Bindungsligand verwendet wird, wird zumindest ein Teil des TC II gebundenen Cobalamins daher in der gebundenen Fraktion vorliegen und alles Cobalamin in der Probe, das an andere Moleküle als TC II gebunden ist, z. B. an HC oder Albumin, wird in der nicht gebunden (d. h. in der nicht getrennten Fraktion oder Fraktionen) vorliegen. TC II in der gebundenen Fraktion kann durch cobalaminähnliche Substanzen oder Analoga zusätzlich zu Cobalamin komplexiert werden.
Falls gewünscht, kann das erfindungsgemäße Verfahren einen weiteren vorläufigen Trennschritt umfassen, in welchem die Probe mit immobilisierten oder immobilisierbaren spezifischen Bindungsliganden für Haptocorrin (in Apo- und Holo-Formen oder in Holo-Formen allein) in Kontakt gebracht wird. Auf diese Weise kann der Beitrag zu Fehlern bei der TC II gebundenen Cobalaminbestimmung der von Holo-HC rührt, reduziert werden und spezifische Bindungsliganden für TC II oder Holo-TC II können verwendet werden, die auch etwas Bindungsaffinität für Haptocorrin besitzen.
Anderfalls sind, wie bereits zuvor erwähnt, aufgrund der sehr geringen Serumkonzentration von TC II in Apo- oder Holo-Form, Liganden oder Bindungspartner mit besonders hoher Spezifität und Affinität nötig für die Durchführung der Erfindung. Die für die erfindungsgemäßen Liganden benötigten Affinitätskonstanten hängen davon ab, ob der Ligand spezifische TC II oder Holo-TC II ist und auch von seiner Verwendung als entweder Einfang- oder Detektionsligand, da die Serumkonzentration von TC II etwa 0,5–1 nM, aber die Konzentration für Holo-TC II lediglich 35–160 pM ist. Für einen TC II Einfangliganden ist somit eine Affinitätskonstante von zumindest 10⁹ M^–1, vorzugsweise größer als 2 × 10⁹ M^–1 und besonders bevorzugt 10¹⁰ M^–1 wünschenswert. Für einen Holo-TC II Einfangliganden ist eine Affinitätskonstante von zumindest 10¹⁰ M^–1 wünschenswert, vorzugsweise 2 × 10¹⁰ M^–1 ganz besonders bevorzugt größer als 2 × 10¹⁰ M^–1 und am meisten bevorzugt 10¹¹M^–1. Die Affinitätskonstante für einen Nachweisbindepartner kann klar weniger als die für den Einfangliganten sein wegen des Konzentrationseffektes des Tests.
Der Grad an Kreuzreaktivität von Holo-TC II oder TC II Bindungsliganden mit HC sollte vorzugsweise weniger als 1%, besonders bevorzugt zwischen 0,1% und 1% und am meisten bevorzugt weniger als 0,1%, sein. Ähnlich sollte ein Holo-TC II Bindungsligand vorzugsweise nicht einen Grad von Kreuzreaktivität mit Apo-TC II oberhalb von 1%, mehr bevorzugt zwischen 0,1% und 1%, aufweisen und am meisten bevorzugt sollte die Kreuzreaktivität weniger als 0,1% sein.
Durch Verwendung solcher hochaffiner Liganden kann deren Funktion erweitert werden über einfache Verbindungs- oder Detektionsliganden und sie können eine essentielle Rolle spielen, da sie in der Lage sind TC II Proteine aus der zu analysierenden Probe zu separieren und konzentrieren. Die Bindungsliganden für TC II oder Holo-TC II sollen vorzugsweise den Liganden um zumindest dreifach, mehr bevorzugt fünffach und am meisten bevorzugt zehnfach ankonzentrieren.
In einer weiteren Ausführungsform des Tests, mehr verwandt zu einem Austauschtest als einem Kompetitionstest, wird die Holo-TC II Komplex enthaltende Probe mit einer festen Phase, an die ein markierter Ligand gebunden ist, der die selben Bindungsstellen an den immobilisierten Liganden wie Holo-TC II erkennt, in Kontakt gebracht. Das Holo-TC II in der Probe kompetitiert mit dem gebundenen markierten Liganden um die Bindungsstellen, so dass nach Einstellung eines Gleichgewichts des Systems eine direkt proportionale Beziehung zwischen der Menge des markierten Liganden, der von dem festen Träger freigesetzt wird und in Lösung detektierbar ist, und der Menge von Holo-TC II, das in der Originalprobe besteht. Der markierte Ligand kann direkt oder indirekt detektiert werden und kann bestimmt werden als Menge an an den festen Träger gebundenen oder nicht gebundenen markierten Liganden, je nachdem wie angebracht. In dieser Ausführungsform ist der nicht immobilisierte Ligand, auf den vorher Bezug genommen wurden, somit gebunden an den immobilisierten Liganden vor der Anwendung der Probe, aber diese Bindung sollte nicht dahingehend verstanden werden, dass der Ligand auf jeden Fall immobilisiert ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform beinhaltet das In-Kontakt-Bringen von der Holo-TC II enthaltenden Probe mit einem festen Träger auf dem Holo-TC II immobilisiert ist und einem markierten nicht immobilisierten Holo-TC II spezifischen Bindepartner. Das freie Holo-TC II in der Probe und das immobilisierte Holo TC II kompetitieren um die Bindung mit dem markierten nicht immobilisierten Liganden und die Bestimmung des markierten Liganden, der an die feste Phase gebunden ist oder in Lösung bleibt, ermöglicht die Berechnung der Holo-TC II Konzentration. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der markierte nicht immobilisierte Holo-TC II Bindungsligand ein Antikörper.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Probe, die den Analyten von Interesse umfasst, mit einer markierten Holo-TC II und immobilisierten Liganden in Kontakt gebracht. Das markierte und nicht markierte Holo-TC II kompetitiert um Bindung mit dem immobilisierten Liganden und nachdem ein Gleichgewicht erreicht ist, ist die Menge des markierten Holo-TC II, das an immobilisierten Liganden gebunden ist, indirekt proportional zu der Menge an Holo-TC II in der interessierenden Probe. Wiederum kann das markierte Holo-TC II direkt oder indirekt nachgewiesen werden und bestimmt werden als die Menge von markiertem Holo-TC II, das gebunden oder ungebunden an den festen Träger ist, je nachdem wie angebracht.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein nicht immobilisierter, aber immobilisierbarer Ligand, der spezifisch für den Holo-TC II Komplex ist (z. B. ein Ligand, der an Biotin oder ein anderes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars konjugiert ist) mit der Probe in Kontakt gebracht um einen Holo-TC II/nicht immobilisierten Liganden-Komplex zu binden. Der Ligand/Holo-TC II-Komplex kann dann aus der Lösung durch bekannte Mittel präzipitiert werden und isoliert werden für die Analyse.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zwei markierte Bindungspartner zu der Probe hinzu gegeben nach einem vorläufigen Schritt des Abreicherns der Probe von Apo-Formen von TC II und HC. Die Bindungspartner in diesem Fall sind markierte Holo-TC II oder Analoge oder Fragmente davon und ein markierter Bindepartner dafür, z. B. ein markierter Antikörper. In dieser Ausführungsform wird ein nachweisbares Signal nur generiert, wenn die Markierungen nah bei einander sind, d. h., wenn die beiden markierten Bindungspartner aneinander binden. Zusätzlich zur Probe kann daher der markierte Bindungspartner für Holo-TC II entweder an nicht markiertes Holo-TC II, was in der Probe anwesend ist, binden, in diesem Fall wird kein nachweisbares Signal generiert, oder an ein markiertes Holo-TC II oder ein Analogon oder Fragment oder Variante davon, das den markierten TC II Bindungspartner bindet, in welchem Fall ein detektierbares Signal generiert wird.
Agenzien zur Markierung, wie die des Amersham Scintillation Proximity Assays, wie in US Patent Nr. 4568649 beschrieben, sind geeignet zur Verwendung in einer solchen Ausführungsform und die hohe Sensibilität der Prozedur ist sehr geeignet für einen Test, wobei der Analyt in einer so geringen Konzentration vorliegt. Ein Mitglied des Bindungspaars kann z. B. mit einem β-emittierenden Nuklid wie, I¹²⁵ oder H³, markiert werden und das andere Mitglied kann markiert werden mit einem geeigneten Scintillationsmolekül. Die emittierten β-Teilchen verlieren ihre Energie in wässriger Umgebung, es sei denn, der Scintillator ist innerhalb von 1,5 μm und das bedeutet, dass beide Markierungspartner aneinander gebunden sein müssen für ein detektierbares Signal. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei markierte Partner aneinander binden, wird durch die Konzentration von Holo-TC II, das in der Probe vorliegt, bestimmt, so dass ein größeres Signal generiert wird, je geringer die Konzentration von Holo-TC II in der Probe ist.
Wie hierin verwendet, beinhalten die Begriffe „bestimmen" oder „zuordnen" sowohl die Quantifizierung um absolute Werte für die Menge oder Konzentration von Holo-TC II oder TC II-gebundenen Cobalamin in der Probe zu erhalten als auch die halbquantitative und qualitative Zuordnung oder Bestimmung. Ein Index, ein Verhältnis, eine Prozentzahl oder eine ähnliche Angabe des Spiegels oder der Menge von TC II-gebundenen Cobalamin, z. B. bezogen auf das Gesamtcobalamin, kann erhalten werden.
Die Körperproben, die im erfindungsgemäßen Testverfahren verwendet werden können, können alle Cobalamin enthaltenden Proben sein, z. B. Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben oder Suspensionen etc. Vorzugsweise ist die Probe jedoch eine Körperflüssigkeit, z. B. Samenflüssigkeit, cerebrospinal Flüssigkeit oder Amnionflüssigkeit, aber grundsätzlich eine vom Blut abgeleitete Probe. Wenn dies der Fall ist, kann entweder Serum oder Plasma verwendet werden, da die Probe, die zur Analyse verwendet wird vorzugsweise zellfrei ist. Die Probe kann vor Verwendung in dem erfindungsmäßigen Testverfahren behandelt werden, z. B. kann sie verdünnt werden durch Hinzufügen von Puffer oder anderen wässrigen Medien und kann gelagert oder konserviert werden, z. B. durch Abkühlen oder Einfrieren vor der Analyse.
Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung, wo eine gebundene Fraktion von einer ungebundenen Fraktion abgetrennt wird, kann dies durch jedes geeignete Mittel durchgeführt werden, z. B. Präzipitation, Zentrifugation, Filtration, chromatographische Methoden etc.
Um Zweifel auszuräumen, der Begriff „Cobalamin" wird hierin Synonym zu „Vitamin B₁₂" verwendet und beinhaltet alle Formen von Vitamin B₁₂ (Cyanocobalamin; 5-6-dimethylbenzimidazolyl Cyanocobamid; Methylcobalamin; 5'-deoxyadenosylcobalamin), die auftreten können und metabolisch im Körper aktiv sind (falls in geeigneter Weise präsentiert).
Wie zuvor ausgeführt wurde, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Bestimmung von TC-gebundenen Cobalamin durchgeführt werden durch Detektion eines Liganden, der an getrenntes Holo-TC II gebunden ist oder durch Durchführung eines Kompetitionstests unter Verwendung von markierten Kompetitor für Holo-TC II, wobei das Holo-TC II mit dem markierten Kompetitor um die Bindung an einen Bindungsliganden dafür kompetitiert oder durch Nachweis von Cobalaminfreisetzung von separariertem Holo-TC II.
Der nachweisbare Ligand kann bequemerweise markiert werden durch jedes konventionelle Mittel, z. B. mit einem Signal bildenden Marker, der z. B. durch Luminescence, Chemiluminescence, Colorimetrische Bestimmung, Fluoreszenz, Radioaktivität oder durch enzymatische Aktivität bestimmt werden kann. Im Endeffekt kann jeder Signal bildende Marker, der im Stand der Technik bekannt ist, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Beispielhaft sind einige farbige oder fluoreszierende Stoffe, die zur Markierung von nachweisbaren Bindungsliganden in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Anthraquinone, Azofarbstoffe, Azinfarbstoffe wie Oxazine und Thiazine, Triazine, natürlich vorkommende Pikmente wie Porphyrine, Phycobiliproteine beinhaltend Phycoerythine und Phycoquanine, Chlorophyll und seine Analoga und Derivate, Carotinoide, Acrinidine, Xanthene beinhaltend Fluoresceine und Rhodamine, Indigofarbstoffe, Thioxanthene, Coumarine, Polymethine beinhaltend di- und tri-Acrylmethine und Derivate von Phthalocyaninen und Metallphthalocyaninen.
Ähnlich kann ein breites Spektrum an radioaktiven Stoffen als Signal generierende Markierung des Reagenz verwendet werden, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird unter ihnen Iod-125-markierte Stoffe.
Alternativ können die Bindungsliganden an natürliche oder synthetische Stoffe konjugiert sein, die ein chemiluminisierendes Signal produzieren, das in bekannter Weise nachgewiesen werden kann. (Cormier, M. J. et al.; Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973). Geeignete chemoluminisierende Stoffe beinhalten Luciferin, Oxalsäureester, 1,2-Dioxyethan, Luminol oder Derivate davon, sind aber nicht auf diese beschränkt. Falls angebracht, können Hydrogenperoxid, Enzyme wie Luciferase oder andere Chemikalien verwendet werden um das chemoluminisierende Signal aus dem Signal erzeugenden Molekül, das verwendet wird, zu produzieren.
Stark-anionische Signal bildende Moleküle sind für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren nicht bevorzugt, da sie eine Tendenz aufweisen, Serumproteine wie humanes Serumalbumin (HSA), die in der Probe anwesend sind zu binden. Besonders geeignete Beispiele, die verwendet werden können, sind Fluoreszinisothiocyanat, Rhodamin B oder N-(resorufin-4-carbonyl)piperidin-4-carboxylsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester) oder Resos.
Eine Cobalamin enthaltende Fraktion (z. B. umfassend Holo-TC II und Holo-HC) kann vom Rest der Probe getrennt werden durch Reaktion der untersuchenden Körperflüssigkeit mit einem immobilisierten oder angebundenen Cobalamin oder Analogon oder Fragment davon, das Apo-TC II und Apo-HC bindet und trennen von der gebundenen Fraktion vom Rest der Probe, die Holo-TC II und Holo-HC umfasst. Ein detektierbarer TC II Bindungsligand kann dann verwendet werden um den TC II-Cobalaminkomplex, der in der abgetrennten Fraktion vorliegt, nachzuweisen. Der nachweisbare TC II Bindungsligand kann mit der zu untersuchenden Probe vor, gleichzeitig oder nach Kontakt mit dem gebundenen Cobalamin in Kontakt gebracht werden und vor oder nach der Trennung der gebundenen Fraktion vom Rest der Probe.
In einigen Ausführungsformen kann der immobilisierte Ligand für entweder Apo- und/oder Holo-TC II/HC-Komplex in einer Säule angeordnet werden. Die Körperflüssigkeit, die der TC II-Komplex enthält, kann auf die Säule aufgebracht werden und mit dem Bindungsliganden in Kontakt gebracht werden. Die Säule kann ausgepresst oder gewaschen werden und, falls nötig, kann ein eluierendes Agenz verwendet werden, um die Freisetzung der gebundenen Fraktion von der Säule zu gestatten und das Einsammeln zu ermöglichen. Falls die Inhaltsstoffe der ungebundenen Fraktion analysiert oder auch im Hinblick auf andere Bestandteile analysiert werden sollen, sollte die Säule mit einem Puffer gewaschen werden oder ein Medium sollte verabreicht werden unter Verwendung einer kalibrierten Mikropipette um sicher zu stellen, dass ein genaues bekanntes Volumen verabreicht und gesammelt wird. Das verabreichte Volumen beträgt vorzugsweise 3% des gewünschten (d. h. kalibrierten) Volumens, mehr bevorzugt innerhalb 1 oder 2%. Gleichfalls sollte das verwendete eluierende Agenz um den Komplex freizusetzen unter Verwendung einer kalibrierten Mikropipette aufgetragen werden, falls die zu analysierende Fraktion vor dem Nachweis von der Säule freigesetzt werden soll.
In einer alternativen Ausführungsform können die Bindungsliganden, die verwendet werden um eine Fraktion von der Probe zu trennen, an einem besonderen Festphasenträger immobilisiert sein, z. B. Latex oder Polymerkügelchen (beads). Um die Handhabung und Trennung zu unterstützen, können magnetische Kügelchen verwendet werden und dies ist tatsächlich eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Der Begriff „magnetisch" wie hierin verwendet, meint, dass der Träger in der Lage ist ein magnetisches Moment aufzuweisen, wenn er in einem Magnetfeld platziert wird. In andere Worten kann ein Träger, der magnetische Partikel umfasst schnell durch magnetische Aggregation entfernt werden, was ein schneller, einfacher und effizienter Weg zur Trennung der Fraktion nach Ligandenbindung ist.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, können die magnetischen Partikel mit dem TC II-Cobalaminkomplex daran gebunden, durch Anlegen eines magnetischen Felds auf eine geeignete Oberfläche entfernt werden, z. B. durch Verwendung eines Permanentmagneten. Es ist üblicherweise ausreichend, den Magneten an der Seite des Gefäßes, das die Probenmischung enthält, anzubringen um zu verursachen, dass die Partikel an der Wand des Gefäßes kongregieren, und so sie für die weitere Analyse zu isolieren.
Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, z. B. die beschrieben bei Sintef in EP-A-106873, da magnetische Aggregationen und Verklumpungen der Partikel während der Reaktion verhindert wird. Die gut bekannten magnetischen Kügelchen von Bang Particles (US) können besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sein.
Neben der zu untersuchenden Probe werden grundsätzlich auch Kalibrierungsproben mit bekanntem Holo-TC II-Komplexgehalt bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens bestimmt. Solche Bestimmungen können verwendet werden, um eine Kalibrierungskurve, aus der der TC II-gebundene Cobalamingehalt der zu untersuchenden Probe bestimmt werden kann, aufzuzeichnen. Die Natur der Kalibrierungskurven und Ausfall von Konversions- oder Einstellungsfaktoren, die bei der Bestimmung von Holo-TC II-Komplex verwendet werden, kann variieren, abhängig von z. B. dem besonderen Liganden, der in den Bindungs- und Trennschritten des Tests verwendet wird und anderen Aspekten des Verfahrens, die die Bindung und Trennung der Probe berühren, z. B. Pufferzusammensetzung, Testbedingungen etc. Typischerweise werden Kalibrierungsproben, die einen Holo-TC II-Gehalt von 0 bis 300 pmol/l enthalten, verwendet. Der Referenzbereich innerhalb dessen der Wert für TC II-gebundenes Cobalamin grundsätzlich vorliegt, ist 30 bis 160 pmol/l.
Der Holo-TC II-Kalibrierungsstandard kann typischerweise humanes, natives oder rekombinantes Holo-TC II sein. Die Verwendung von Holo-TC II als Kalibrator in Holo-TC II-Tests ist neu und stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Aus noch einem anderen Aspekt betrachtet stellt die Erfindung eine Zusammenstellung (Kit) für einen diagnostischen Test gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, wobei der Kit umfasst: einen immobilisierten oder immobilisierbaren spezifischen Bindungsliganden für TC II oder Holo-TC II; eine Lösung einer bekannten Konzentration oder eine Zusammenstellung solcher Lösungen, die eine Abfolge an Konzentrationen von Holo-TC II-Komplexen aufweisen; optio nal ein freisetzendes Agenz, das Cobalamin von Holo-TC II freisetzt; und optional einen markierten Liganden.
Das Testverfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt den metabolisch aktiven Anteil von Cobalamin durch Bestimmung des Holo-TC II-Komplex oder Isolierung des Holo-TC II-Komplex und darauf folgende Bestimmung des Cobalamins, das daran assoziiert ist, und stellt somit ein bequemes Verfahren zur Bestimmung von Cobalaminmängeln vor und nach auftreten von klinischen Manifestationen von Cobalaminmangel bereit. Das Testverfahren kann vorteilhafterweise vor dem Auftreten von Symptomen verwendet werden, da es genaue prediktive Werte einer negativen Cobalaminbalance angibt.
Die vorliegende Erfindung wird nun illustriert durch die nachfolgenden nicht beschränkenden Beispiele und die dazugehörigen Zeichnungen:
1 ist eine Standardkurve für Holo-TC II. 2 ist eine Aufzeichnung, die die Beziehung zwischen Gesamtserumcobalamin und Holo-TC II-Konzentration aufzeigt; 3 ist ein Aufzeichnung, die die Beziehung zwischen Gesamtserumcobalamin und Holo-HC-Konzentration aufzeigt.
Beispiel 1
Antikörper (z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper), die für TC II spezifisch sind, werden auf magnetisierbaren Partikeln immobilisiert. Ein Aliquot vom Serum (100–500 μl) wird mit gleichem Volumen von PBS vermischt und für 15 Minuten mit einem Überschuss an immobilisierten Antikörpern und einem Überschuss an einem nicht überlappenden Anti-Holo-TC II-Antikörper (z. B. ein monoklonaler Antikörper) inkubiert, der mit I¹²⁵ radiomarkiert ist. Die magnetisierbaren Partikel werden unter Verwendung eines starken Magne ten sedimentiert, der Überstand wird entfernt und die Partikel werden mit PBS gewaschen.
Die Radioaktivität wird gemessen und die Holo-TC II-Konzentration in der Probe wird durch Interpolierung an einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 2
Antikörper (z. B. monoklonale oder polyklonale Antikörper), die für TC II spezifisch sind, werden auf magnetisierbaren Partikeln immobilisiert. Ein Aliquot an Serum (600 μl) wird mit einem gleichen Volumen PBS vermischt und es wird ihm gestattet, für 30 Minuten mit dem Antikörper zu reagieren. Die magnetisierbaren Partikel werden unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert und der Überstand wird entfernt. Die Partikel werden einmal mit PBS gewaschen und sodann mit Natriumhydroxid (0,3 M), welches Kaliumcyanid (100 μM), Dithiothreitol (15 mM) und eine feste Menge von Cyanocobalamin, das mit I¹²⁵ oder Co⁵⁷ radiomarkiert, enthält in einem Gesamtvolumen von 100 μl für 15 Minuten, um das an das immobilisierte Holo-TC II gebundene Cobalamin freizusetzen und gleichzeitig alle Formen von Cobalamin in Cyanocobalamin umzuwandeln und mit einer festen Menge von markierten Cyanocobalamin zu vermischen. Eine eingeschränkte Menge an Intrinsischen Faktor in 100 μl von Boratpuffer wird hinzugefügt und für 10 Minuten inkubiert. Die magnetisierbaren Partikel werden sedimentiert unter Verwendung eines starken Magneten und 150 μl des Überstands wird für eine Messung der Radioaktivität entfernt. Die Konzentration von TC II-gebundenen Cobalamit in der Serumprobe wird bestimmt aus einer Standardkurve.
Alternativ kann das freigesetzte Cobalamin gemessen werden unter Verwendung von Abbot's IMx Verfahren oder ähnlichen Verfahren.
Beispiel 3
Antikörper (monoklonal oder polyklonale Antikörper), die spezifisch für Holo-TC II sind, sind immobilisiert auf magnetisierbaren Partikeln. Ein Aliquot an Serum (100–500 μl) wird mit einem gleichen Volumen PBS vermischt, einer festen Menge von I¹²⁵ markierten Holo-TC II und einer limitierten Menge an immobilisierten Anti-Holo-TC II-Antikörper. Nach 15 minütiger Inkubation werden die magnetisierbaren Partikel unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert. Die Partikel werden mit PBS gewaschen und die Radioaktivität wird gemessen. Die Konzentration von Holo-TC II wird aus einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 4
Rekombinantes Holo-TC II wird immobilisiert auf magnetisierbare Partikel. Ein Aliquot an Serum (100–500 μl) wird mit einem gleichen Volumen PBS vermischt und eine feste Menge an immobilisierenden Holo-TC II und ein Überschuss an Antikörpern (z. B. an monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern), der spezifisch für Holo-TC II ist und mit I¹²⁵ radiomarkiert ist, wird hinzu gegeben. Nach 15 minütiger Inkubation werden die Partikel unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert. Die Partikel werden gewaschen mit PBS und die Radioaktivität wird gemessen. Die Konzentration von Holo-TC II wird aus einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 5
Ein Aliquot an Serum (100–500 μl) wird einem Überschuss an biotinyliertem Cobalamin hinzugeführt, so dass alles Apo-TC II und Apo-HC gebunden wird. Nach 10 minütiger Inkubation wird die Serumprobe mit Avidin beschichteten magnetischen Partikeln für 10 Minuten behandelt. Die Partikel werden unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert. Der Überstand wird entfernt und vermischt mit nicht überlappenden monoklonalen Anti-TC II-Antikörpern, einer davon mit I¹²⁵ radiomarkiert und der andere mit Biotin konjugiert. Nach 10 Minuten werden avidinbeschichtete magnetisierbare Partikel hinzugeführt und es wird ihnen gestattet, die biotinylierten Addukte für 10 Minuten zu binden. Anschließend werden die Partikel mit einem starken Magneten sedimentiert und mit PBS gewaschen. Die Radioaktivität wird gemessen und die Holo-TC II-Konzentration wird bestimmt durch Interpolation an einer Standardkurve.
Beispiel 6
Genau wie Beispiel 5, aber das Apo-TC II abgereicherte Serum wird mit einer festen Menge I¹²⁵-markiertem Holo-TC II und einer eingeschränkten Menge an Anti-TC II-Antikörper immobilisiert, auf magnetisierbaren Partikeln vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation werden die Partikel unter Verwendung eines starken Magneten sedimentiert. Die Partikel werden mit PBS gewaschen und die Radioaktivität wird gemessen.
Beispiel 7
Cobalamin wird auf magnetisierbaren Mikrosphären immobilisiert, z. B. durch kovalente Kupplung oder durch Verwendung von Biotin-(Strept)avidinkupplung. Typischerweise werden mit Streptavidin beschichtete magnetisierbare Mikrosphären mit 1 μM biotinyliertem Cobalamin für 30 Minuten bei Raum temperatur in Dunkelheit inkubiert. Die Kügelchen werden unter Verwendung eines Magneten sedimentiert, zweimal mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 1% in PBS und 5 mg/ml HSA resuspendiert. Zu einem Aliquot von Serum (100–500 μL) wird ein gleiches Volumen von PBS und ein zehntel Volumen von Cobalamin-beschichteten magnetisierbaren Mikrosphären. Die Mischung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert, so dass alles Apo-TC II und Apo-HC bindet. Die Partikel werden durch einen Magneten sedimentiert und der Überstand wird wieder gewonnen und mit zwei nicht überlappenden monoklonalen Anti-Human-TC II-Antikörpern, einer mit I¹²⁵ radiomarkiert und der andere mit Biotin konjugiert, vermischt. Nach 10 Minuten werden (Strept)avidin-beschichtete magnetisierbare Mikrosphären hinzugefügt und es wird ihnen gestattet, die biotinylierten Addukte für 10 Minuten zu binden. Anschließend werden die Partikel mit einem Magneten sedimentiert und mit PBS gewaschen. Die Radioaktivität wird gemessen und die Holo-TC II-Konzentration wird durch Interpolation auf einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 8
Genau wie Beispiel 7, aber ein Überschuss an biotinyliertem Cobalamin wird direkt zur Serumprobe und PBS hinzugefügt, so dass alles Apo-TC II und Apo-HC bindet. Nach 10-minütiger Inkubation wird die Serumprobe mit (Strept)avidin-beschichteten magnetisierbaren Mikrosphären für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit behandelt.
Beispiel 9
Kaninchen-Antikörper, die spezifisch für humanes TC II sind und mit einer apparenten Bindungskonstanten von >5 × 10⁹ M^–1, wurden auf 1 μm magnetisierbaren Mikrosphären beschich tet mit Schaf-Anti-KaninchenIgG-Antikörpern (Indica Diagnostics) immobilisiert. Serumproben von 400 μL jeweils von 49 gesunden Freiwilligen wurden mit gleichem Volumen an PBS und 40 μL des immobilisierten Antikörpers (1%) vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 1 Stunde aufbewahrt und die Mikrosphären wurden unter Verwendung eines Magneten sedimentiert. Die Präzipitate wurden einmal mit eiskaltem Waschpuffer (PBS plus 0,02% Tween 20) gewaschen und anschließend in 50 μL 50 mM Dithiothreitol, 0,001% Kaliumcyanid und einer feststehenden Menge von 57 Co-CN-Cobalamin (Amersham) in Phosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Dieser Mischung wurde eine Standzeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur gestattet nach der 25 μL 0,5 M Kaliumhydroxid hinzu gegeben wurde und 15 Minuten später 300 μL Intrinsischer Faktor auf Dextran immobilisiert in Boratpuffer, pH 8,6 (genug, um 50% des Tracers zu binden). Nach einer Stunde bei Raumtemperatur in Dunkelheit wurden die Proben bei 1000 g und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, die Überstände wurden vorsichtig entfernt und die Pellets wurden in einem Packard Riastar gezählt. Die Konzentration von TC II-gebundenen Cobalamin wurde bestimmt aus einer Standardkurve, die mit 8 Kalibratoren (0–500 pM von Holo-TC II) identisch behandelten Proben konstruiert wurde. 37 Serumproben wurden auch im Hinblick auf das Gesamtserumcobalamin analysiert unter Verwendung des Abbot IMx B12 Tests.
Die Standardkurve für Holo-TC II ist in 1 gezeigt und die Beziehung zwischen komplettem Serumcobalamin und Holo-TC II-Konzentration in 37 gesunden Freiwilligen ist in 2 dargestellt. Es ist evident, dass die Korrelation gering ist, mit r² = 0,50. Im Vergleich dazu ist die Konzentration zwischen Holo-HC und Gesamtserumcobalamin hoch, r² = 0,96 (3). Die durchschnittliche Holo-TC II-Konzentration für die 49 gesunden Freiwilligen war 64 ± 28 pM und der 95% Referenzbereich war 23–127 pM. Der Test hat einen CV von 10% einer analytischen Sensitivität (0-Kalibrator – 3 s. d.) unter 10 pM und verursacht keine Kreuzreaktivität mit Haptocorrin.

Claims

Nachweisverfahren zur Bestimmung von an Transcobalamin II (TC II)-gebundenem Cobalamin in einer Probe aus dem Körper, umfassend In-Kontakt-Bringen einer zellfreien Probe einer Körperflüssigkeit mit immobilisiertem Cobalamin oder einem Analogon oder Fragment davon, das selektiv die Apoformen von TC II und Haptocorrin bindet, und anschließendes In-Kontakt-Bringen dieser Probe mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren spezifischen Bindungsliganden für TC II oder Cobalamin-gebundenes TC II (Holo-TC II), Separieren einer ligandgebundenen Fraktion von einer nicht-ligandgebundenen Fraktion und Messen des Holo-TC II- oder TC II-gebundenen Cobalamingehalts darin.
Nachweisverfahren nach Anspruch 1, wobei der spezifische Bindungsligand ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Polypeptid, ein Oligopeptid, eine niedermolekulare, organische Chemikalie, einen spezifischen Bindepartner, der aus einer kombinatorischen chemischen oder Phagen-Präsentations (phage display)-Bibliothek ausgewählt ist, eine spezifische Bindungssequenz aus DNS oder RNS oder einen Zelloberflächenrezeptor.
Nachweisverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der spezifische Bindungsligant ein hohes Maß an Selektivität und Spezifität für TC II und eine geringe Affinität für andere TC-Proteine, entweder in der Apo- oder Holoform, oder für irgendein anderes cobalaminbindendes Protein aufweist.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Cobalamin von den Holo-TC II-Molekülen durch Änderung der Temperatur oder des pH-Werts des umgebenden Mediums freigesetzt wird.
Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei das freigesetzte Cobalamin durch einen Kompetitions-Assay bestimmt wird, der mittels In-Kontakt-Bringen eines immobilisierten Bindepartners für Cobalamin mit dissoziiertem Cobalamin aus der Probe in Anwesenheit eines markierten Liganden, der mit dem isolierten Cobalamin um die Bindung des immobilisieren Bindepartner kompetitiert, durchgeführt wird.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen eines festen Trägers mit einem immobilisierten TC II- oder Holo-TC II-Bindungsliganden mit der zu untersuchenden Probe und mit einem nicht-immobilisierten Liganden umfasst, wobei der immobilisierte Ligand in der Lage ist, an TC II oder Holo-TC II, an den nicht-immobilisierten Liganden oder an Komplexe des TC II oder Holo-TC II und des nicht-immobilisierten Liganden zu binden und der nicht-immobilisierte Ligand in der Lage ist, zumindest an den immobilisierten Liganden, an TC II oder Holo-TC II und an Komplexe des immobilisierten Liganden und TC II oder Holo-TC II zu binden, wobei, falls das Nachweisverfahren ein Sandwich-Assay sein sollte, zumindest einer der Liganden spezifisch für Holo-TC II ist, und falls der Assay ein Kompetitions-Assay ist, der immobilisierte Ligand spezifisch für Holo-TC II und Kompetitoren davon ist, wobei der Anteil des immbolisierten Liganden der an TC II oder Holo-TC II, an nicht-immobilisierten Liganden oder an Komplexe von nicht-immobilisierten Liganden und TC II oder Holo-TC II gebunden ist von der Menge an Holo-TC II, die in der Probe anwesend ist, abhängt, und der nicht-immobilisierte Ligand, gebunden oder ungebunden, in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu generieren, Separieren einer gebundenen Fraktion von einer nicht-gebundenen Fraktion, und direkte oder indirekte Bestimmung des nicht-immobilisierten Liganden, der an den immobilisierten Liganden gebunden ist (gebundene Fraktion) oder nicht gebunden ist und in Lösung vorliegt (nicht-gebundene Fraktion), wobei das In-Kontakt-Bringen der Probe und des nicht-immobilisierten Liganden mit dem festen Träger entweder separat, gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden kann und, falls es separat oder nacheinander durchgeführt wird, diese in beliebiger Reihenfolge In-Kontakt gebracht werden können.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der TC II Bindungsligand eine Affinitätskonstante von mindestens 109 M-1 aufweist.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Affinitätskonstante größer als 1011 M-1 ist.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Anteil an Kreuzreaktivität des Holo-TC II- oder TC II-bindenden Liganden mit HC zwischen 0,1% und 1% beträgt.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Grad an Kreuzreaktivität des Holo-TC II- oder TC II-bindenden Liganden mit HC weniger als 0,1% beträgt.
Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe mit dem Holo-TC II-Komplex mit einer festen Phase an die ein markierter Ligand, der dieselben Bindungsstellen wie Holo-TC II an dem immobilisierten Liganden er kennt, gebunden ist in Kontakt gebracht wird; Holo-TC II kompetitiert in dieser Probe mit dem gebundenen markierten Liganden um diese Bindungsstellen, so dass nach Einstellen eines Gleichgewichts in dem System eine direkte proportionale Beziehung zwischen der Menge des markierten Liganden, der von der festen Phase freigesetzt wird und in Lösung detektierbar ist und der Menge von Holo-TC II, die in der Originalprobe anwesend ist, besteht; der markierte Ligand kann direkt oder indirekt als Menge des markierten Liganden, der an den festen Träger gebunden oder nicht gebunden nachgewiesen werden, je nachdem wie angebracht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Holo-TC II enthaltene Probe mit einem festen Träger mit darauf immobilisiertem Holo-TC II und einem markierten, nicht-immobilisierten Holo-TC II spezifischen Bindepartner in Kontakt gebracht wird, wobei freies Holo-TC II in der Probe und immobilisiertes TC II mit dem markierten nicht-immobilisierten Liganden kompetitieren, und Bestimmung des markierten Liganden, der an die feste Phase gebunden ist oder in Lösung verbleibt, was die Bestimmung der Holo-TC II-Konzentration gestattet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Holo-TC II enthaltende Probe mit einem markierten Holo-TC II und immbolisiertem Liganden dafür in Kontakt gebracht wird, die markierten und nicht markierten Holo-TC II-Komplexe zum Binden mit dem immobilisierten Liganden und nachdem ein Gleichgewicht erreicht ist, kompetitieren, und wobei die Menge des markierten Holo-TC II, das an den immobilisierten Liganden gebunden ist, indirekt proportional zu der Menge von Holo-TC II in der Probe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Probe aus dem Körper ausgewählt ist aus der Gruppe Samen flüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Amnionflüssigkeit oder einer aus Blut gewonnenen Probe.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die aus Blut gewonnene Probe entweder Serum oder Plasma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die gebundene Fraktion von der ungebundenen Fraktion durch Präzipitation, Zentrifugation, Filtration oder chromotographische Verfahren getrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der nachweisbare Ligand mit einem Signal bildenden Marker markiert ist, der durch Lumineszenz, Chemolumineszenz, colorimetrische Messung, Fluorenszenz, Radioaktivität oder durch enzymatische Aktivität nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei in dem Verfahren eine Kalibrierung durch Verwendung eines Holo-TC II-Standards durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Standard humanes, natives oder rekombinantes Holo-TC II ist.
Kit zur Verwendung in einem diagnostischen Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfassend: immobilisiertes Cobalamin oder ein Analogon oder Fragment davon, das selektiv die Apoform von TC II und Haptocorrin bindet; ein immobilisierter oder immobilisierbarer spezifischer Bindungsligand für TC II oder Holo-TC II, Lösung einer bekannten Konzentration oder eine Zusammenstellung solcher Lösungen, die eine Abfolge an Konzentrationen von Holo-TC II-Komplexen aufweisen, optional ein freisetzendes Agens, das Cobalamin von Holo-TC II freisetzt, und optional einen markierten Liganden.
Verwendung von Holo-TC II zum Kalibrieren in einem Verfahren für Holo-TC II nach einem der Ansprüche 1 bis 19.