DE69914463T2

DE69914463T2 - Therapeutische chemokine rezeptor antagonisten

Info

Publication number: DE69914463T2
Application number: DE69914463T
Authority: DE
Inventors: Ian Clark-Lewis; Jiang-Hong Gong; Vincent Vancouver DURONIO
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2019-03-13
Also published as: DE69914463D1; US7423011B2; ATE258444T1; JP2002506830A; WO1999047158A2; US6946445B1; EP1061944A2; AU2821699A; US20050265969A1; AU762472B2; WO1999047158A3; EP1061944B1; JP2010047598A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Chemokinrezeptor-Antagonisten, einschließlich Peptid-Antagonisten des CXC-Chemokinrezeptors 4, zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Krebs und einer Autoimmunerkrankung verwendet werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Cytokine sind lösliche Proteine, sezerniert von verschiedenen Zellen, einschließlich Monozyten oder Lymphozyten, welche die Immunantworten regulieren. Chemokine sind eine Überfamilie von Proteinen, die als chemische Lockstoffe wirksam sind. Chemokine regulieren verschiedene biologische Antworten, und sie fördern die Rekrutierung zahlreicher Blutzellinien von Leukozyten und Lymphozyten zu einem Körperorgangewebe. Chemokine können entsprechend der relativen Position der ersten zwei Cysteinreste im Protein in zwei Familien eingeteilt werden. In einer Familie, den CXC-Chemokinen, sind die ersten zwei Cysteine durch einen Aminosäurerest voneinander getrennt, und in der anderen Familie, den CC-Chemokinen, grenzen die beiden ersten Cysteine aneinander.
Die molekularen Ziele für Chemokine sind Zelloberflächenrezeptoren. Ein derartiger Rezeptor ist der CXC-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), ein 7-transmembranäres Protein, das an G1 gekoppelt ist, und früher LESTR (Loetscher, M., Geiser, T., O'Reilly, T., Zwahlen, R., Baggionlini, M., and Moser, B. (1994), J. Biol. Chem. 269, 232–237), HUMSTR (Federsppiel, B., Duncan, A. M. V., Delaney, A., Schappert, K., Clark-Lewis, I., and Jirik, F. R. (1993), Genomics 16, 707–712) und Fusin (Feng, Y., Broeder, C. C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996), HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane G protein-coupled receptor, Science 272, 872–877) genannt wurde. CXCR4 wird in großem Umfang auf Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimiert und ist ein hauptsächlicher Co-Rezeptor mit CD4⁺ für das menschliche Immundefizienzvirus-1 (Human immunodeficiency virus 1, HIV-1) (Feng, Y., Broeder, C. C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996), HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane G protein-coupled receptor, Science Gegenwärtig ist der einzige bekannte Ligand für CXCR4 der sich von Stromazellen ableitende Faktor-1 (Stromal cell derived factor 1, SDF-1). Der Stromal cell derived factor-1α (SDF-1α) (SEQ ID NO: 6) und der Stromal cell derived factor-1β (SDF-1β) (SEQ ID NO: 7) sind eng miteinander verwandte Mitglieder (hier gemeinsam als SDF-1 bezeichnet). Die nativen Aminosäuresequenzen von SDF-1α und SDF-1β sind bekannt, ebenso wie die genomischen Sequenzen, die für diese Proteine kodieren (US-Patent Nr. 5,563,048, erteilt am B. Oktober 1996, und US-Patent Nr. 5,756,084, erteilt am 26. Mai 1998).
SDF-1 unterscheidet sich funktionell insofern von anderen Chemokinen, als beschrieben wurde, daß dem Faktor eine fundamentale Rolle beim Wandern von Immunzellen (Trafficking), beim Export und beim Homing von Knochenmarkvorläuferzellen zukommt (Aiuti, A., Webb, I. J., Bleul, C., Springer, T., and Guierrez-Ramos, J. C. (1996), J. Exp. Med. 185, 11–120, und Nagasawa, T., Hirota, S., Tachibana, K., Takakura N., Nishikawa, S.-I., Kitamura, Y., Yoshida, N., Kikutani, H., and Kishimoto, T. (1996), Nature 382, 635–638). SDF-1 unterscheidet sich strukturell auch insofern, als dieser Faktor eine nur ungefähr 22%ige Aminosäuresequenzidentität mit anderen CXC-Chemokinen aufweist (Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109). SDF-1 scheint konstitutiv durch verschiedene Zelltypen produziert zu werden, und besonders hohe Konzentrationen werden in Knochenmarkstromazellen gefunden (Shirozu, M., Nakano, T., Inazawa, J., Tashiro, K., Tada, H. Shinohara, T., and Honjo, T. (1995), Genomics, 28, 495–500, und Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109). Eine grundsätzliche physiologische Bedeutung von SDF-1 wird durch das hohe Maß an Konservierung der SDF-1-Sequenz zwischen verschiedenen Spezies nahegelegt. In vitro stimuliert SDF-1 die Chemotaxis einer großen Auswahl von Zellen, einschließlich Monozyten und dem Knochenmark entstammenden Vorläuferzellen (Aiuti, A., Webb, I. J., Bleul, C., Springer, T., and Guierrez-Ramos, J. C. (1996), J. Exp. Med. 185, 111–120, und Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109). Besonders bemerkenswert ist seine Fähigkeit, eine hohe Prozentzahl ruhender und aktivierter T-Lymphozyten zu stimulieren (Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109, und Campbell, J. J., Hendrick, J., Zlotnik, A., Siani, M. A., Thompson, D. A., and Butcher, E. C., (1998) Science 279, 381–383).
Die 3-dimensionale Kristallstruktur von SDF-1 ist beschrieben worden (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Eine Struktur/Aktivität-Analyse von SDF-1 (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007) zeigt, daß, obwohl die N-terminalen Reste 1-8 und 1-9 an der Rezeptorbindung beteiligt sind, die Peptide 1-8 und 1-9 alleine keine in vitro-Aktivität, die eine Rezeptoraktivität anzeigen würde, aufweisen, was eine Schlußfolgerung unterstützt, von der berichtet wurde, wonach die Peptide die Konformation, die für eine Bindung an den Rezeptor notwendig ist, nicht annehmen. Dieses Ergebnis wurde zum Anlaß genommen, zu unterstellen, daß der Rest des Proteingerüsts und/oder verschiedene Konsensus-Rezeptorbindungsstellen an anderer Stelle im Protein zur Vermittlung der konformationellen Voraussetzungen für eine N-terminale Bindung an den Rezeptor wichtig sind (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Zwei-Stellen-Modell für die Bindung von SDF-1 an CXCR4 vorgeschlagen, das zwei Bindungsstellen im Bereich der Reste 1-17, eine N-terminale Stelle und eine strangaufwärts liegende RFFESH-Stelle vorsieht (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Die beiden putativen Bindungsstellen sind durch die Sequenz: KPVSLSYR-CPC-RFFESH (SEQ ID NO: 1) charakterisiert, worin die beiden putativen Bindungsstellen durch das CXC-Motiv, das die gesamte CXC-Chemokinfamilie charakterisiert, verbunden sind (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Diese beiden putativen Bindungsregionen wurden auch in anderen CC- und CXC-Chemokinen als wichtig identifiziert (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007, und Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Dies stimmt mit dem Befund überein, daß, obwohl die N-terminale Regionen einer großen Auswahl von Chemokinen für eine Rezeptoraktivierung wesentlich sind, von anderen N-terminalen Peptiden von Chemokinen als SDF-1 das Fehlen einer Rezeptorbindungsaktivität berichtet worden ist, und daß diese keine Rezeptor-Agonisten sind (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007, und Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
Übereinstimmend mit der Tatsache, daß CXCR4 ein hautpsächlicher Co-Rezeptor für HIV-1 ist, blockiert SDF-1 das Eindringen von HIV-1 in CD4⁺-Zellen (Oberlin, E., Amara, A., Bachelerie, F., Bessia, C., Virelizier, J.-L., Arenzana-Seisdedos, F., Schwartz, O., Heard, J.-M., Clark-Lewis, I., Legler, D. F., Loetscher, M., Baggiolini, M., and Moser, B. (1996), Nature 382, 833–835, und Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroksi, J., and Springer, T. A. (1996), Nature 382, 829–833). Es wurden Fortschritte erzielt, SDF-1-abgeleitete Peptide, die selektiv mit dem Eindringen des HIV, nicht aber mit der SDF-1-Signaltransduktion interferrieren, zu identifizieren (Heveker, N. et al., 1998, Current Biology 8(7): 369–376). Eine große Auswahl potentieller CXCR4-bindender Fragmente von SDF-1 wurden zur Verwendung beim Aufhalten einer HIV-Infektion vorgeschlagen (WO 97/28258, offengelegt am 7. August 1997, WO 98/04698, offengelegt am 5. Februar 1998). Wie diese Publikationen klarstellen, hängt die anti-HIV-Aktivität von SDF-1 oder Fragmenten von SDF-1 nicht von einem Antagonismus des CXCR4-Rezeptors ab.
Interferon-gamma ist eine bedeutendes Cytokin, das durch aktivierte T-Lymphozyten (T-Zellen) freigesetzt wird und als ein wirksamer Immunmodulator wirkt. Eine Interferon-gamma-Produktion durch T-Zellen in vivo kann andere Zellen im Körper veranlassen, zusätzliche Cytokine, Enzyme und Antikörper, die in der Lage sind, viele Bereiche einer Immunantwort zu modulieren, freizusetzen. Wirkstoffe, welche die Fähigkeit aktivierter T-Zellen, Interferon gamma zu produzieren, beeinflussen, werden als Immunmodulatoren charakterisiert.
Autoimmunerkrankungen stellen eine Gruppe von Krankheiten dar, bei denen allgemein davon ausgegangen wird, daß sie durch die Überproduktion von Cytokinen, Lymphotoxinen und Antikörpern durch weiße Blutzellen, einschließlich bestimmter T-Zellen, verursacht wird. Es wird davon ausgegangen, daß T-Zellen während einer Autoimmunreaktion chemische Mediatoren, wie etwa Interferon-gamma, freisetzen, was zur Entwicklung der pathologischen Symptome der Autoimmunreaktion führt. Eine Behandlung von Autoimmunerkrankungen kann deshalb die Verwendung von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Freisetzung von Interferon gamma aus T-Zellen zu hemmen, beinhalten. Derartige Autoimmunerkrankungen können beispielsweise Multiple Sklerose (MS), das Guillain-Barré-Syndrom, amyotrophische Lateralsklerose, die Parkinson'sche Krankheit, die Alzheimer'sche Krankheit, Gicht, Lupus und jede andere menschliche Krankheit einschließen, bei der T-Zellen eine Hauptrolle spielen.
Interferon-beta ist ein Cytokin, für das eine therapeutische Bedeutung bei der Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen festgestellt wurde. Bei Autoimmunerkrankungen, wie etwa MS, wird angenommen, daß die Aktivierung von T-Zellen vom Typ Th1 ein primärer Bestandteil der Autoimmunantwort ist. Beim MS wird durch die Autoimmunantwort die Myelinscheide neuronaler Axone angegriffen. Einer der klassischen Marker einer Th1-Zellaktivierung ist die Produktion von Interferon-gamma. Bei der Entwicklung von Interferon-beta als einem therapeutischen Wirkstoff zur Behandlung von MS wurden Studien durchgeführt, um die Fähigkeit von Interferon-beta, die Produktionsrate von Interferon-gamma aus Lymphozyten in vitro herabzusetzen, zu demonstrieren (Ann. Neurol. 1998, 44: 27–34, und Neurology 1998, 50: 1294–1300). Die Reduktion der Interferon-gamma-Freisetzung durch Behandlung mit Interferon-beta ist eine Hinweis auf die Wirksamkeit von Interferon-beta bei der Behandlung von MS. Es besteht ein anhaltender Bedarf an anderen Wirkstoffen, welche die Produktion von Interferon-gamma hemmen, insbesondere Wirkstoffen zur Verwendung bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung, einschließlich Wirkstoffen, die synergistisch wirken können, um die Wirkung vorhandener Wirkstoffe, wie etwa Interferon-beta, zu steigern.
Das Wachstum solider Tumoren ist allgemein abhängig von einer Angiogenese (Neovaskularisierung), und Angiogenese-Inhibitoren sind deshalb als Wirkstoffe zur Behandlung solider Tumoren und Metastasen eingesetzt worden. Endothelzellen (EC) in der Vaskulatur spielen eine wesentliche Rolle bei der Angiogenese, und dementsprechend besteht ein Bedarf an therapeutischen Wirkstoffen, die an dieser Aktivität ansetzen. Es wird davon ausgegangen, daß die Proliferation, Migration und Differenzierung von Gefäßendothelzellen während der Angiogenese sowohl im Normalzustand als auch bei Krankheitszuständen durch die komplexen Interaktionen verschiedener Chemokine und Chemokinrezeptoren moduliert wird. CXCR4 wird auf Gefäß-ECs exprimiert und ist Berichten zufolge der häufigste Rezeptor unter allen untersuchten Chemokinrezeptoren (Gupta et al, 1998).
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Sequenz des nativen SDF-1 (Stand der Technik)
2: Aktivität von SDF-1-Peptiden als chemische Lockstoffe. Konzentrationsabhängige Migration von CEM-Zellen (a) und T-Lymphozyten (b) als Antwort auf die SDF-1-Peptide 1-8 (
); 1-9 (Δ); 1-9 dimer (
); und 1-9 [Aba] (⊞); und als Antwort auf natives SDF-1 (
). Die gezeigten Werte stellen Mittelwerte ± SD von gewanderten Zellen dar. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erhalten.
3: Hemmung der Chemotaxis durch Chemokin-Antagonisten. CEM-Zellmigration, induziert durch SDF-1 (1-9)-Peptid (10 μM) in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen des SDF-1-Antagonisten SDF-1 (1-67) [P2G] (
); oder des IL-8-Antagonisten IL-8 (6-72) (
. Die Migrationsereignisse werden angegeben in Prozent der Antwort, die in Abwesenheit des Antagonisten (Kontrolle,
) erhalten wurden. Die Werte zeigen die Mittelwerte ± SD von Doppelbestimmungen aus zwei separaten Experimenten.
4: Rezeptorbindung von SDF-1-Peptiden. Dargestellt ist die Kompetition um die spezifische Bindung ¹²⁵I-SDF-1 (4 nM) an CEM-Zellen mit den Peptiden 1-8 (
); 1-9 (Δ); 1-9 Dimer (
); 1-9 [Aba-9] (⊞; natives SDF-1 (
) Gezeigt werden spezifisch gebundene cpm in Prozent in Abwesenheit des Kompetitors (
). Repräsentative Ergebnisse aus zwei bis sechs Experimenten.
5: Rezeptorselektivität der SDF-1-Peptide. Mit Fura-2 beladene T-Lymphozyten wurden nacheinander mit Chemokinen und SDF-1 (1-9) stimuliert, und es wurden die resultierenden (Ca²⁺)_i-abhängigen Änderungen der Fluoreszenz erfaßt.

(a) Kreuz-Desensibilisierung von SDF-1 und dem 1-9-Peptid.
(b) Fehlen einer Desensibilisierung von SDF-1 (1-9) durch die angegebenen CXC- oder CC-Chemokine. Die Chemokine wurden in einer Konzentration von 100 nM zugesetzt, abgesehen von SDF-1, das in einer Konzentration von 1 nM zugesetzt wurde, gefolgt von einer Zugabe des 1-9-Peptids (30 μM) nach 60 s. Gezeigt werden repräsentative Ergebnisse von zwei bis drei unabhängigen Experimenten.

6: Zellen der Lungenkarzinomzellinie Linie-1 (Line-1 lung carcinoma; 5 × 10⁵/50 μl in PBS-Puffer) wurden jeder BALB/c-Maus (Männchen, 6–8 Wochen alt, bezogen von Jackson Labs, Bar Harbour, ME) subkutan in den Rücken injiziert. Die Mäuse wurden blind in vier Gruppen eingeteilt (drei in jeder Gruppe). Unmittelbar nach der Implantation erhielten die Mäuse i. p. oder s. c. eine Injektion von SDF-1P2G (9 mg/kg in 100 μl PBS-Puffer). Den Kontrollmäusen wurde dieselbe Dosis Rinderserumalbumin (BSA) oder lediglich PBS-Puffer injiziert. Die Injektion erfolgte einmal täglich. Die Größe des Tumors wurde täglich erfaßt. Am Tag 16 wurde die Tumormasse bestimmt. Die Schnitte von Tumor und Lunge wurden gefärbt und morphologisch auf Blutgefäße und Metastasen untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Tumorgröße.
7: Zellen der Karzinom-Linie-1 (1 × 10⁶/Maus) wurden implantiert (s. c.), wie oben beschrieben. Die Mäuse wurden blind in vier Gruppen (jeweils 2) eingeteilt und mit SDF-1P2G (9 mg/kg) oder der dimeren Form von SDF (1-9) P2G (18 mg/kg) behandelt. Den Kontrollgruppen wurde lediglich PBS-Puffer oder BSA injiziert. Die Injektion erfolgte täglich i. p. Größe und Masse der Tumoren wurden wie oben beschrieben bestimmt. Am Tag 12 wurde die Histologie des Tumors untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Tumorgröße.
8: Masse des Tumors aus dem Experiment in 7.
9: Hemmung des Wachstums des Mäuse-Lungenkarzinoms (Lewis-Lungenkarzinom) durch den Vollänge-SDF-1-Antagonisten oder einen Kurzpeptid-Antagonisten.
10: Tumormasse (Lewis-Lungekarzinom) am Tag 12.
11: Wirkung von SDF-1 auf die ConA-stimulierte Interferon-gamma-Produktion in menschlichen T-Zellen.
12: Wirkung eines SDF-1-Antagonisten auf die ConA-stimulierte Interferon-gamma-Produktion in menschlichen T-Zellen.
13: Wirkung von 10 nM SDF-1 und einem Antagonisten auf die mit 10 nM ConA stimulierte Interferon-gamma-Produktion.
14: Dimerstruktur der Peptid-Antagonist-Verbindungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Gegenstand der Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
CXCR4-Antagonisten können wie folgt therapeutisch angewendet oder verwendet werden, um ein Medikament für derartige therapeutische Behandlungen herzustellen: zur Reduktion der Interferon-gamma-Produktion durch T-Zellen, zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, zur Behandlung von Multipler Sklerose, zur Behandlung anderer neurologischer Erkrankungen, zur Behandlung von Krebs und zur Regulation der Angiogenese. CXCR4-Inhibitoren können, insbesondere zur Behandlung von Multipler Sklerose, mit oder ohne Interferon-beta verwendet werden. Zur medizinischen Behandlung soll eine therapeutische Dosis eines CXCR4-Antagonisten in einer pharmakologisch akzeptablen Formulierung verabreicht werden. Dementsprechend macht die Erfindung auch eine therapeutische Zusammensetzung verfügbar, die einen CXCR4-Antagonisten, Interferon-beta und einen pharmakologisch akzeptablen Arzneimittelträger oder Träger umfaßt, wie oben beschrieben. Die therapeutische Zusammensetzung kann vorteilhafterweise in einer wäßrigen Lösung bei einem physiologisch akzeptablen pH-Wert löslich sein.
Die CXCR4-Antagonisten können Peptidverbindungen sein, die ein im wesentlichen gereinigtes Peptidfragment, ein modifiziertes Fragment, ein Analogon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz von SDF-1 umfassen. In einigen Ausführungsformen kann die Peptidverbindung eine N-terminale Aminosäuresequenz KGVSLSYRC-R₁ (SEQ ID NO: 2) umfassen, wobei R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Polypeptiden, die zumindestens zu einem Teil von SDF-1 homolog sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Peptidverbindung eine dimerisierte N-terminale Aminosäuresequenz umfassen (hier dargestellt durch das zweite Dimer, geschrieben vom Carboxy zum Aminoende): KGVSLSYR-X-RYSLSVGK (ein Dimer mit der SEQ ID NO: 3, wie in 14 gezeigt), wobei X eine Lysin-Aminosäure sein kann, bei der sowohl die α- als auch ε-Aminogruppen mit der Bildung einer Amidbindung im Zusammenhang stehen und die Lysylcarboxygruppe geschützt sein kann. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Peptidverbindung weiterhin eine dimerisierte N-terminale Aminosäure enthalten (hier dargestellt durch das zweite Dimer, geschrieben vom Carboxy zum Aminoende): KGVSLSYRC-X-CRSLSVGK (ein Dimer mit der SEQ ID NO: 4, wie in 14 gezeigt), wobei X eine Lysin-Aminosäure sein kann, bei der sowohl die α- als auch ε-Aminogruppen mit der Ausbildung einer Amidbindung in Zusammenhang stehen und die Lysylcarboxygruppe geschützt sein kann. Alternativ kann X in den zuvor erwähnten dimerisierten Peptidverbindungen jede brückenbildende Gruppe sein, die Peptide kovalent miteinander verbindet, so daß eine Vielzahl von Peptiden durch die Brücke miteinander verbunden sind, um eine Vielzahl von N-Termini in den Verbindungen verfügbar zu machen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit verschiedenen Aspekten der Erfindung können CXCR4-Antagonisten verwendet werden, um Medikamente zur Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen herzustellen. Derartige Erkrankungen schließen Multiple Sklerose, das Guillain-Barré-Syndrom (GBS), amyotrophische Lateralsklerose (ALS) und andere Erkrankungen der Nerven, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Diabetes vom Typ 1, Colitis ulzerosa, Gicht, Lupus und Transplantat-Abstoßungen ein.
Antagonisten von CXCR4 können therapeutisch verwendet werden, um die Angiogenese und das Zellwachstum bei menschlichen pathologischen Erkrankungen, einschließlich Krebserkrankungen, wie etwa einem Lymphom und einem Karzinom, ebenso wie eine Restenose, zu regulieren. Wie hier beispielhaft dargestellt, sind zwei CXCR4-Peptid-Antagonisten verwendet worden, um eine Angiogenese und das Tumorwachstum in Mäusemodellen von Säugetierkrebs zu hemmen.
Die SDF-1-Antagonisten der Erfindung können verwendet werden, um die Interferon-gamma-Produktion durch aktivierte T-Zellen zu hemmen. Dies kann bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung von besonderer Bedeutung sein, bei der die Produktion von Interferon-gamma durch T-Zellen einen im Stand der Technik anerkannten Kranheitsmarker darstellt. Beispiele von Erkrankungen, von denen bekannt ist, daß sie durch Interferon-gamma vermit telt werden, sind MS (Proc. Natl. Acad Sci. Vol. 95; 675–680; 1998), das Guillain-Barré-Syndrom (Ann. Neurol, Vol. 27; S57–S63; 1990), eine autoimmune Nierenschädigung (J. Immunol. 161; 494–503; 1998), Arthritis (Immunol. 95; 480–487; 1998) sowie verschiedene andere neurologische Erkrankungen (Acta Neurol. Scand. 90; 19–25; 1994). Allgemeinere Beschreibungen von durch Interferon-gamma vermittelten Autoimmunerkrankungen sind in J. Immunol. 161; 6878–6884; 1998, und J. Exp. Med. 186; 385–391, 1997, zu finden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Peptid-Antagonist SDF-1 (1-67) [P2G] beispielsweise verwendet worden, um eine Produktion von Interferon-gamma durch T-Zellen zu hemmen. Auch das Peptid SDF-1 (1-9) P2G reduzierte die Interferon-gamma-Freisetzung aus menschlichen T-Zellen (d. h., diese Peptide sind Regulatoren menschlicher Autoimmunerkrankungen).
Die Anmeldung beschreibt auch einen Test, um CXCR4-Inhibitoren zu identifizieren, die verwendet werden können, um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen, insbesondere bei einer Autoimmunerkrankung. Ein derartiger Test wird hier in Beispiel 2 offenbart.
Der Test umfaßt Concanavalin A-stimulierte T-Zellen, die Interferon-gamma freisetzen. In dem Test werden die T-Zellen mit dem putativen CXCR4-Antagonisten in Kontakt gebracht, und der Grad der Interferon-gamma-Freisetzung wird gemessen. Die Verbindungen, die auf ihre antagonistische Aktivität hin getestet werden sollen, können nach ihrer Fähigkeit, das Ausmaß der Interferon-gamma-Produktion herabzusetzen, ausgewählt werden.
Ein Test für Verbindungen, die eine Angiogenese hemmen, wird ebenfalls offenbart. In dem Test wird ein vaskularisierter Tumor in einer Maus mit dem putativen CXCR4-Antagonisten in Kontakt gebracht, und der Grad der Vaskularisierung wird gemessen. Die Verbindungen, die auf ihre anti-angiogenetische Aktivität hin untersucht werden sollen, können nach ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, das Ausmaß einer Vaskularisierung in einem Tumor herabzusetzen.
Die vorliegende Erfindung nutzt CXCR4-Antagonisten in verschiedener Hinsicht. In einigen Ausführungsformen können die CXCR4-Antagonisten der Erfindung im wesentlichen gereinigte Peptidfragmente, modifizierte Peptidfragmente, Analoga oder pharmakologisch akzeptable Salze sowohl von SDF-1α als auch von SDF-1β sein. Von SDF-1 abgeleitete Peptid-Antagonisten von CXCR4 können durch bekannte physiologische Tests und verschiedenen Synthesetechniken (wie etwa offenbart in Cramp et al., 1997, The EMBO Journal 16 (23): 6996–7007, und Heveker et al., 1998, Current Biology 8 (7): 369–376; jede Publikation ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen) identifiziert werden. Derartige Analoga von SDF-1 schließen Homologe von nativem SDF-1 ein, wie etwa natürlich vorkommende Isoformen oder genetische Varianten oder Polypeptide mit einer wesentlichen Sequenzähnlichkeit zu SDF-1, wie etwa einer 40%igen Sequenzidentität, einer 60%igen Sequenzidentität, oder vorzugsweise einer 80%ige Sequenzidentität, mit mindestens einem Bereich der nativen SDF-1-Sequenz, vorausgesetzt, daß sie CXCR4-antagonistische Aktivität aufweisen. In einigen Ausführungsformen können Aminosäuren in der nativen SDF-1-Sequenz durch chemisch ähnliche Aminosäuren ersetzt werden (um Substitutionen konservativer Aminosäuren verfügbar zu machen). In einigen Ausführungsformen weisen Peptide ein N-terminales LSY-Sequenzmotiv im Bereich von 10, oder vorzugsweise im Bereich von 7, Aminosäuren des N-Terminus auf und/oder es kann ein N-terminales RFFESH-Sequenzmotiv (SEQ ID NO: 5) im Bereich von 20 Aminosäuren des N-Terminus verwendet werden, vorausgesetzt, sie weisen CXCR4-antagonistische Aktivität auf. Der Einzelbuchstabencode und der Dreibuchstabencode für Aminosäuren wird hier austauschbar verwendet. Eine Familie derartiger Kandidaten für Peptid-Antagonisten weist ein KP-Motiv als N-Terminus und ein LSY-Motiv im Bereich der Aminosäuren 5–7 auf. Alternative Peptide schließen weiterhin das RFFESH-Motiv (SEQ ID NO: 5) im Bereich der Aminosäuren 12–17 ein. Bei alternativen Ausführungsformen ist das LSY-Motiv in den Positionen 3–5 eines Peptids lokalisiert. Die Erfindung macht auch Peptid-Dimere mit zwei Aminosäuresequenzen verfügbar, die jeweils die vorangehenden Sequenzelemente aufweisen können, verknüpft durch eine Disulfidbrücke im Bereich von 20, oder vorzugsweise im Bereich von 10, Aminosäuren des N-Terminus, wobei Cysteinreste oder α-Aminobutyrsäurereste verbunden sind.
Unter einem Aspekt verwendet die Erfindung CXCR-Antagonisten, bei denen Glycin durch Prolin in der Aminosäureposition 2 ersetzt ist. Die gesamten (d. h. eine Länge von 67 Aminosäuren) Versionen dieses Analogons, bezeichnet als SDF-1 (1-67) [P2G], sind ein wirksamer CXCR4-Rezeptor-Antagonist (Crump et al., 1997, The EMBO Journal 16 (23): 6996–7007). Verschiedene kleine SDF-1-Peptidanaloga können ebenfalls als CXCR4-Antagonisten verwendet werden. Ein derartiges Peptid ist ein Dimer der Aminosäuren 1-9, wobei in jedem Monomer des Dimers Prolin in Position 2 durch Glycin substituiert ist, und wobei die Aminosäureketten durch eine Disulfidbindung zwischen jedem der Cysteine in Position 9 in jeder Sequenz verbunden sind (bezeichnet als SDF-1 (1-9 [P2G])₂). SDF-1 (1-9 [P2G])₂ fehlte eine nachweisbare chemotaktische Aktivität (2a), kompetierte jedoch um die SDF-1-Bindung mit ähnlicher Affinität wie ein SDF-1 (1-9)₂-Dimer (4). Das SDF-1 (1-9 [P2G])₂-Dimer hemmte die SDF-1-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise (3b). Es waren 50 μM des SDF-1 (1-9 [P2G])₂-Dimers erforderlich, um die Aktivität von 10 nM SDF-1 um 50%, einem Verhältnis von 5.000, zu hemmen.
Die Erfindung verwendet CXCR4-Antagonisten zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen. Derartige Zusammensetzungen beinhalten eine CXCR4-Antagonist-Verbindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die Produktion von Interferon-gamma zu verändern und vorzugsweise zu hemmen, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Zusammensetzung beinhaltet die Verbindung eines CXCR4-Antagonisten in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, die Angiogenese, vorzugsweise diejenige Angiogenese, die mit Karzinomen und Lymphomen im Zusammenhang steht, zu hemmen, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Eine „therapeutische wirksame Menge" bezieht sich auf eine wirksame Menge in Dosierungen und Zeiträumen, die notwendig sind, um das gewünschte therapeutische Ergebnis, wie etwa eine Reduktion oder Umkehrung der Angiogenese im Fall von Krebs oder eine Reduktion oder Hemmung der Interferon-gamma-Produktion durch T-Zellen im Fall von Autoimmunerkrankungen, zu hemmen. Eine therapeutisch wirksame Menge von CXCR4-Antagonisten kann in Abhängigkeit von Faktoren, wie etwa dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit der CXCR4-Antagonisten, in dem Individuum eine gewünschte Antwort hervorzurufen, variieren. Dosierungspläne können entsprechend angepaßt werden, um die optimale therapeutische Antwort hervorzurufen. Eine therapeutisch wirksame Menge ist auch diejenige, bei der jede toxische oder nachteilige Wirkung des CXCR4-Antagonisten durch die therapeutisch vorteilhaften Wirkungen aufgewogen werden. Eine „prophylaktisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine wirksame Menge in Dosierungen oder Zeiträumen, die notwendig sind, um das gewünschte prophylaktische Ergebnis zu erzielen, wie etwa die Metatastasierungsrate eines Tumors oder den Beginn von Anfällen oder Episoden von Multipler Sklerose zu verhüten oder zu hemmen. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann, wie oben für die therapeutisch wirksame Menge beschrieben, bestimmt werden. Da die prophylaktische Dosis bei Patienten vor oder während eines früheren Krankheitsstadiums angewendet werden soll, wird die prophylaktisch wirksame Menge typischerweise geringer sein als die therapeutisch wirksame Menge.
Ein bevorzugter Bereich für therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Mengen an einen CXCR4-Antagonisten kann bei 0,1 nM bis 0,1 M, vorzugsweise 0,1 nM bis 0,5 M, stärker bevorzugt 0,05 nM bis 15 μM, und am stärksten bevorzugt 0,01 nM bis 10 μM, liegen. Anzumerken ist, daß die Werte für die Dosierungen mit der Schwere des Leidens, das gelindert werden soll, insbesondere Multiple Sklerose, variieren kann. Ferner ist davon auszugehen, daß für jedes einzelne Versuchsobjekt entsprechend dem individuellen Bedarf und der professionellen Beurteilung derjenigen Person, welche die Zusammensetzungen verabreicht oder die Verabreichung überwacht, eine Anpassung der speziellen Dosierungspläne über eine Zeit erfolgen sollte, und daß hier festgesetzte Dosierungsbereiche lediglich beispielhaft sind und nicht beabsichtigen, den Umfang oder die Ausführbarkeit der beanspruchten Zusammensetzung zu beschränken.
Die Menge der aktiven Verbindung in der Zusammensetzung kann in Abhängigkeit von Faktoren, wie etwa dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums, variieren. Dosierungspläne können entsprechend angepaßt werden, um die optimale therapeutische Antwort zu erzielen. Beispielsweise kann ein einzelner Bolus verabreicht werden, es können mehrere aufgeteilte Dosen über die Zeit verabreicht werden, oder es kann die Dosis portionsweise reduziert oder gesteigert werden, je nachdem, was die Anforderungen der therapeutischen Situation indizieren. Vorteilhaft ist insbesondere, parenterale Zusammensetzungen in Form von Dosiereinheiten zur erleichterten Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. „Dosiereinheit" (Dosage unit form), wie hier verwendet, betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die für die zu behandelnden Säugetier-Versuchsobjekte als einheitliche Dosierungen geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktiver Verbindung enthält, die berechnet wurde, um den gewünschten therapeutischen Effekt hervorzurufen, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Maßangaben für die Dosiereinheiten der Erfindung werden durch (a) die einzigartigen Kennzeichen der aktiven Verbindung und die besondere therapeutischen Wirkung, die erzielt werden soll, sowie durch (b) die Einschränkungen, die der Kunst des Herstellens einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung einer Überempfindlichkeit von Individuen zueigen sind, diktiert und sind davon abhängig.
Ein „pharmazeutisch akzeptabler Träger" oder „Arzneistoffträger", wie hier verwendet, beinhaltet jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, anti-bakterielle und fungizide Wirkstoffe, isotonische und resorptionsverzögernde Wirkstoffe und ähnliches, die physiologisch verträglich sind. In einer Ausführungsform ist der Träger zur parenteralen Verabreichung geeignet. Alternativ kann der Träger zur intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, sublingualen oder oralen Verabreichung geeignet sein. Pharmazeutisch akzeptable Träger schließen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen sowie sterile Pulver zur unvorbereiteten Präparation steril injizierbarer Lösungen oder Dispersionen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Wirkstoffe für pharmazeutisch aktive Substanzen sind im Stand der Technik gut bekannt. Außer insoweit, als irgendein herkömmliches Medium oder irgendein herkömmlicher Wirkstoff mit der aktiven Verbindung unverträglich ist, ist deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Betracht zu ziehen. Unterstützende aktive Verbindungen können ebenfalls in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen typischerweise unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen steril und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als Lösung, Mikroemulsion, Liposom oder einer anderen geordneten Struktur, die für eine hohe Arzneistoffkonzentration geeignet ist, formuliert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches) enthält, und geeignete Mischungen daraus sein. Die richtige Fluidität kann beispielsweise aufrechterhalten werden, indem eine Beschichtung, wie etwa Lecithin, verwendet wird, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Agenzien. In vielen Fällen wird bevorzugt sein, isotonische Wirkstoffe, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie etwa Mannitol, Sorbitol oder Natriumchlorid, in die Zusammensetzung aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem ein Wirkstoff, der die Absorption verzögert, beispielsweise Monostearatsalze und Gelatine, in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Darüberhinaus können die CXCR4-Antagonisten in einer, an eine zeitlich veränderte Freisetzung angepaßte Formulierung verabreicht werden, beispielsweise in einer Zusammensetzung, die ein Polymer zur verlangsamten Freisetzung (Slow release) einschließt. Die aktiven Verbindungen können mit Trägern hergestellt werden, welche die Verbindung gegen eine rasche Freisetzung schützen, wie etwa bei eine Retard-Formulierung (Controlled release formulation), einschließlich Implantaten und Freisetzungssystemen auf der Grundlage von Mikrokapseln. Biologisch abbaubare und biologisch verträgliche Polymere, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäure sowie Polylactat- und Polyglycolat- Copolymere (PLG) können verwendet werden. Viele Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen sind patentiert oder den Fachleuten allgemein bekannt.
Steril injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die aktive Verbindung (z. B. ein CXCR4-Antagonist) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem der oben aufgezählten Inhaltsstoffe oder einer Kombination davon aufgenommen wird, erforderlichenfalls gefolgt von anschließender Sterilfiltration. Dispersionen werden im allgemeinen hergestellt, indem die aktive Verbindung in einem sterilen Vehikel aufgenommen wird, das ein Basis-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen der oben aufgezählten Inhaltsstoffe enthält. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steril injizierbarer Lösungen sind bevorzugte Herstellungsverfahren die Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, woraus ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs plus jedes zusätzlich gewünschten Inhaltsstoffs aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung hervorgeht.
In Übereinstimmung mit einem alternativen Aspekt der Erfindung kann ein CXCR4-Antagonist mit einer oder mehreren zusätzlichen Verbindungen, welche die Löslichkeit des CXCR4-Antagonisten erhöhen, formuliert werden.
Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zum Auswählen von CXCR4-Antagonisten, die an den CXCR4-Rezeptor binden. Bei diesem Verfahren wird eine Testverbindung mit aktivierten menschlichen T-Zellen in Kontakt gebracht, die Produktion von Interferon-gamma wird gemessen, und ein CXCR4-Antagonist wird aufgrund der Fähigkeit der Testverbindung, die Produktion von Interferon-gamma herabzusetzen oder zu hemmen, ausgewählt. Die Testverbindung kann ein im wesentlichen gereinigtes Peptidfragment, ein modifiziertes Fragment, ein Analogon oder ein pharmakologisch akzeptables Salz von entweder SDF-1α oder SDF-1β sein. Die Testverbindung wird mit einer Menge an T-Zellen im molaren Überschuß in Kontakt gebracht. Die Menge und/oder Rate der Interferon-gamma-Produktion in Gegenwart der Testverbindung kann durch einen geeigneten Test, wie hier an anderer Stelle beschrieben, bestimmt werden. In Gegenwart einer Testverbindung, welche die Interferon-gamma-Produktion hemmt, ist die Produktion von Interferon-gamma im Vergleich zu der Situation, wenn der CXCR4-Antagonist fehlt, reduziert.
CXCR4-Antagonist-Verbindungen der Erfindung schließen SDF-1-Derivate, wie etwa C-terminale Hydroxymethylderivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C-terminale Hydroxyme thylbenzylether), N-terminal modifizierte Derivate, einschließlich substituierter Amine, wie etwa Alkylamiden und Hydraziden, und Verbindungen, bei denen ein C-terminaler Phenylalaninrest durch ein Phenethylamid-Analogon (z. B. Ser-Ile-Phenethylamid als ein Analogon des Tripeptids Ser-Ile-Phe) ersetzt ist, ein.
Eine CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann eine Peptidstruktur (wie etwa ein SDF-1-abgeleitetes Peptid) direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt sein. Der Begriff „modifizierende Gruppe" soll Strukturen einschließen, die direkt an die Peptidstruktur angehängt sind (z. B. durch kovalente Kopplung), ebenso wie jene, die indirekt an die Peptidstruktur angehängt sind (z. B. durch eine stabile, nicht-kovalente Assoziierung oder durch kovalente Kopplung an zusätzliche Aminosäurereste oder Mimetika, Analoga oder Derivate davon, welche die Kernstruktur des SDF-1-Kernpeptids flankieren). Beispielsweise kann die modifizierende Gruppe an den Aminoterminus oder Carboxyterminus einer SDF-1-Peptidstruktur oder an eine Peptid- oder Peptidmimetikum-Region, welche die Kerndomäne flankiert, gekoppelt sein. Alternativ kann die modifizierende Gruppe an eine Seitenkette von mindestens einem Aminosäurerest einer SDF-1-Peptidstruktur oder an eine Peptid- oder Peptidmimetikum-Region, welche die Kerndomäne flankiert (z. B. durch die epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes/von Lysinresten, über die Carboxygruppe eines Asparaginsäurerestes/von Asparaginsäuresten oder eines Glutaminsäurerestes/von Glutaminsäuren, über eine Hydroxygruppe eines Tyrosinrestes/von Tyrosinresten, eines Serinrestes/von Serinresten oder eines Threoninrestes/von Threoninresten oder andere geeignete reaktive Gruppen in einer Aminosäureseitenkette) gekoppelt sein. Modifizierende Gruppen, die kovalent an die Peptidstruktur gekoppelt sind; können mittels und unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik zum Verknüpfen chemischer Strukturen, einschließlich beispielsweise Amide, Alkylamino, Carbamate oder Harnstoffbindungen, bekannt sind, angehängt werden.
Der Begriff „modifizierende Gruppe" soll Gruppen einzuschließen, die nicht natürlicherweise an natürliche SDF-1-Peptide in deren nativer Form gekoppelt sind. Dementsprechend soll der Begriff „modifizierende Gruppe" nicht Wasserstoff einschließen. Die modifizierende Gruppe ist/die modifizierenden Gruppen sind derart ausgewählt, daß die CXCR4-Antagonist-Verbindung die Interferon-gamma-Produktion verändert, vorzugsweise hemmt.
Die Erfindung macht auch „modifizierende Gruppen" verfügbar, derart ausgewählt, daß die CXCR4-Antagonist-Verbindung eine Angiogenese von Tumoren hemmt, wenn sie mit den T-Zellen bzw. dem Tumor in Kontakt gebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die modifizierende Gruppe/die modifizierenden Gruppen eine zyklische, heterozyklische oder polyzyklische Gruppe. Der Begriff „zyklische Gruppe", wie hier verwendet, soll eine zyklische gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppe mit ungefähr 3 bis 10, vorzugsweise ungefähr 4 bis 8, und stärker bevorzugt ungefähr 5 bis 7 Kohlenstoffatomen, einschließen. Beispielhafte zyklische Gruppen beinhalten Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cyclooctyl. Zyklische Gruppen können nicht-substituiert oder an einer oder mehreren Ringpositionen substituiert sein. Demnach kann eine zyklische Gruppe mit z. B. Halogenen, Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen, Heterozyklen, Hydroxy-, Amino-, Nitro-, Thiolamin-, Imin-, Amid-, Phsophonat-, Phosphin-, Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-, Thioether-, Sulfonyl-, Sulfonat-, Selenether-, Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF₃, -CN oder ähnlichem substituiert sein.
Der Begriff „heterozyklische Gruppe" soll zyklische, gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppen mit ungefähr 3 bis 10, vorzugsweise ungefähr 4 bis 8, und stärker bevorzugt ungefähr 5 bis 7, Kohlenstoffatomen beinhalten, wobei die Ringstruktur ungefähr 1 bis 4 Heteroatome einschließt. Heterozyklische Gruppen schließen Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Imidazol, Oxazol, Piperidin, Piperazin und Morpholin ein. Der heterozyklische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit solchen Substituenten substituiert sein, wie beispielsweise Halogenen, Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen, anderen Heterozyklen, Hydroxy-, Amino-, Nitro-, Thiol-, Amin-, Imin-, Amid-, Phosphonat-, Phosphin-, Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-, Thioether-, Sulfonyl-, Selenether, Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF₃, -CN oder ähnlichem. Heterozyklen können auch, wie unten beschrieben, durch Brücken mit anderen zyklischen Gruppen verbunden oder mit diesen kondensiert sein.
Der Begriff „polyzyklische Gruppe", wie hier verwendet, soll sich auf zwei oder mehrere gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) zyklische Ringe beziehen, bei denen sich zwei benachbarte Ringe zwei oder mehrere Kohlenstoffe teilen, z. B. sind die Ringe „kondensierte Ringe". Ringe, die über nicht-benachbarte Atome miteinander verbunden sind, werden als „überbrückte" Ringe bezeichnet. Jeder der Ringe der polyzyklischen Gruppe kann mit solchen Substituenten, wie oben beschrieben, substituiert sein, beispielsweise durch Halogene, Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen, anderen Heterozyklen, Hydroxy-, Amino, Nitro, Thiol, Amin-, Imin-, Amid-, Phosphonat-, Phosphin-, Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-Thioether-, Sulfonyl-, Selenether-, Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF₃, -CN oder ähnlichem.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf das Radikal gesättigter aliphatischer Gruppen, einschließlich geradkettiger Alkylgruppen, verzweigtkettiger Alkylgruppen, Cycloalkylgruppen (alizyklische Gruppen), Alkyl-substituierte Cycloalkylgruppen und Cycloalkyl-substituierte Alkylgruppen. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl 20 oder weniger Kohlenstoffatome in seinem Gerüst auf (z. B. C₁-C₂₀ bei einer geraden Kette, C₃-C₂₀ bei einer verzweigten Kette), und stärker bevorzugt 10 oder weniger. Gleichermaßen weisen bevorzugte Cycloalkyle 4 bis 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur auf, und stärker bevorzugt 5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in der Ringstruktur. Sofern die Anzahl an Kohlenstoffen nicht anders angegeben ist, bedeutet „niedriges Alkyl", wie hier verwendet, eine Alkylgruppe, wie oben definiert, wobei diese jedoch 1 bis 6 Kohlenstoffatome in seiner Gerüststruktur aufweist. Gleichermaßen weisen ein „niedriges Alkenyl" und ein „niedriges Alkynyl" ähnliche Kettenlängen auf. Bevorzugte Alkylgruppen sind niedrige Alkylgruppen. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein hier als Alkyl bezeichneter Substituent ein niedriges Alkyl.
Der Begriff „Alkyl" (oder „niedriges Alkyl"), wie in der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, soll sowohl „nicht-substituierte Alkyle" als auch „substituierte Alkyle" beinhalten, wobei letzteres sich auf Alkylgruppen mit Substituenten bezieht, die ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen des Kohlenwasserstoffgerüst ersetzen. Derartige Substituenten können beispielsweise Halogen, Hydroxy, Carbonyl, wie etwa Carboxyl- und Ketongruppen (einschießlich Alkylcarbonyl- und Arylcarbonylgruppen), und Ester (einschließlich Alkyloxycarbonyl- und Aryloxycarbonylgruppen), Thiocarbonyl, Acyloxy, Alkoxyl, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphinat, Amino, Acylamino, Amido, Amidin, Imino, Cyano, Nitro, Azido, Sulfhydryl, Alkylthio, Sulfat, Sulfonat, Sulfamoyl, Sulfonamido, eine heterozyklische Gruppe, Aralkyl oder eine aromatische oder heteroaromatische Gruppe beinhalten. Der Fachmann wird verstehen, daß die an der Kohlenwasserstoffkette substituierten Gruppen erforderlichenfalls selbst substituiert sein können. Beispielsweise können die Substituenten eines substituierten Alkyls substituierte und nicht-substituierter Formen von Amino-, Azido-, Imino-, Amido-, Phophorylgruppen (einschließlich Phosphonat- und Phosphinat guppen), Sulfonyl- (einschließlich Sulfat-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- und Sulfonatgruppen) und Silylgruppen enthalten, ebenso wie Ether-, Alkylthio-, Carbonylgruppen (einschließlich Keton-, Aldehyd-, Carboxylat- und Estergruppen), -CF₃, -CN und ähnliches beinhalten. Beispielhaft substituierte Alkyle werden unten beschrieben. Cycloalkyle können weiterhin substituiert sein mit Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy-, Alkylthio-, Aminoalkylgruppen, Carbonyl-substituierten Alkylgruppen, -CF₃, -CN und ähnlichem.
Die Begriffe „Alkenyl" und „Alkynyl" beziehen sich auf ungesättigte aliphatische Gruppen, die hinsichtlich ihrer Länge und einer möglichen Substitution zu den oben beschriebenen Alkylen analog sind, die jedoch mindestens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
Der Begriff „Aralkyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Alkyl- oder Alkylenylgruppe, die mit mindestens einer Arylgruppe (z. B. einer aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe) substituiert ist. Beispielhafte Aralkyle beinhalten Benzyl (z. B. Phenylmethyl), 2-Naphtylethyl, 2-(2-Pyridyl)propyl, 5-Dibenzosuberyl und ähnliches.
Der Begriff „Alkylcarbonyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf C(O)-Alkyl. Gleichermaßen bezieht sich der Begriff „Arylcarbonyl" auf C(O)-Aryl. Der Begriff „Alkyloxycarbonyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Gruppe -C(O)-O-Alkyl, und der Begriff „Aryloxycarbonyl" bezieht sich auf -C(O)-O-Aryl. Der Begriff „Acyloxy" bezieht sich auf -O-C(O)-R₇, wobei R₇ Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl oder ein Heterozyklus ist.
Der Begriff „Amino", wie hier verwendet, bezieht sich auf -N(R₈)(R₉), wobei R₈ und R₉ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aralkyl, Aryl sind, oder R₈ und R₉ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an das sie angehängt sind, einen Ring mit 4 bis 8 Atomen bildet. Dementsprechend schließt der Begriff „Amino", wie hier verwendet, nicht-substituierte, monosubstituierte (z. B. Monoalkylamino oder Monoarylamino) und disubstituierte (z. B. Dialkylamino oder Alkylarylamino) Aminogruppen ein. Der Begriff „Amido" bezieht sich auf -C(O)-N(R₈)(R₉), wobei R₈ und R₉ wie oben definiert sind. Der Begriff „Acylamino" bezieht sich auf -N(R'₈)C(O)-R₇, wobei R₇ wie oben definiert ist und R'₈ Alkyl ist.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „Nitro" -NO₂; der Begriff „Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff „Sulfhydryl" bedeutet -SH; und der Begriff „Hydroxy" bedeutet -OH.
Der Begriff "Aryl", wie hier verwendet, beinhaltet 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Gruppen, die 0 bis 4 Heteroatome im Ring enthalten können, beispielsweise Phenyl, Pyrrolyl, Furyl, Thiophenyl, Imidazolyl, Oxazol, Thiazolyl, Triazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl und Pyrimidinyl und ähnliches. Solche Arylgruppen mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als "Arylheterozyklen" oder "Heteroaromaten" bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit jenen Substituenten substituiert sein, wie oben beschrieben, wie beispielsweise Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Hydroxy, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, einer heterozyklischen, einer aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe, -CF₃, -CN oder ähnlichem. Arylgruppen können auch Teil einer polyzyklischen Gruppe sein. Beispielsweise schließen Arylgruppen kondensierte aromatische Gruppen, wie etwa Naphtyl, Anthracenyl, Chinolyl, Indolyl und ähnliches ein.
Eine CXCR4-Antagonist-Verbindung kann an ihrem Carboxyterminus mit einer Cholylgruppe nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert werden (siehe z. B. Wess, G. et al. (1993), Tetrahedron Letters 34: 817–822; Wess, G. et al. (1992), Tetrahedron Letters 33: 195–198; und Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 18598–18604). Cholylderivate und -analoga können als modifizierende Gruppen ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugtes Cholylderivat ist beispielsweise Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-cholyl), das eine freie Aminogruppe aufweist, die benutzt werden kann, um die CXCR4-Antagonist-Verbindung weiter zu modifizieren.
In einer Ausführungsform kann die modifizierende Gruppe eine "Biotinylstruktur" sein, welche Biotinylgruppen und -analoga und -derivate (wie etwa eine 2-Iminobiotinylgruppe) beinhaltet. In einer anderen Ausführungsform kann die modifizierende Gruppe eine "Fluoreszeinenthaltende Gruppe", wie etwa eine Gruppe, die aus der Reaktion einer SDF-1-abgeleiteten Peptidstruktur mit 5- (und 6-)-Carboxyfluoreszeinsuccinimidylester oder Fluoreszeinisothiocyanat, hervorgeht, umfassen. Bei verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die modifizierende Gruppe/können die modifizierenden Gruppen eine N-Acetylneuraminylgruppe, eine trans-4-Cotinincarboxygruppe, eine 2-Imino-1-imidazolidinacetylgruppe, eine (S)-(–)-Indolin-2-carboxygruppe, eine (–)-Menthoxyacetylgruppe, eine 2-Norbornanacetylgruppe, ein γ-Oxo-5-acenaphthenbutyryl, eine (–)-2-Oxo-4-Thiazolidincarboxygruppe, eine Tetrahydro-3-furoylgruppe, eine 2-Iminobiotinylgruppe, eine Diethylentriaminpentaacetylgruppe, eine 4-Morpholinocarbonylgruppe, eine 2-Thiophenacetyigruppe oder eine 2-Thiophensulfonylgruppe umfassen.
Modifizierende Gruppen können Gruppen einschließen, die Biotinylstrukturen, Fluoreszeinenthaltende Gruppen, eine Diethylentriaminpentaacetylgruppe, eine (–)-Menthoxyacetylgruppe und eine N-Acetylneuraminylgruppe umfassen. Stärker bevorzugte modifizierende Gruppen sind solche, die eine Cholylstruktur oder eine Iminobiotinylgruppe umfassen.
Zusätzlich zu den oben besprochenen zyklischen, heterozyklischen und polyzyklischen Gruppen können andere Arten modifizierender Gruppen in einem CXCR4-Antagonisten der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können kleine hydrophobe Gruppen geeignete modifizierende Gruppen sein. Ein Beispiel einer geeigneten, nicht-zyklischen modifizierenden Gruppe ist eine Acetylgruppe.
Eine CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann weiterhin modifiziert werden, um die spezifischen Eigenschaften der Verbindung zu verändern, während die Fähigkeit der Verbindung, entweder die Angiogenese zu hemmen oder die Interferon-gamma-Produktion zu hemmen, erhalten bleibt. Beispielsweise wird die Verbindung in einer Ausführungsform weiter modifiziert, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung, wie etwa Stabilität oder Halbwertszeit, in vivo zu verändern. In einer weiteren Ausführungsform wird die Verbindung weiter modifiziert, um eine Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. In noch einer weiteren Ausführungsform wird die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung an eine zusätzliche therapeutische Gruppe zu koppeln.
Um die Verbindung weiter chemisch zu modifizieren, etwa um ihre pharmakokinetischen Eigenschaften zu verändern, können reaktive Gruppen derivatisiert werden. Wenn beispielsweise die modifizierende Gruppe an das aminoterminale Ende der SDF-1-Kerndomäne angehängt wird, kann das carboxyterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert werden. Bevorzugte C-terminale Modifikationen schließen jene ein, welche die Fähigkeit der Verbindung, als Substrat für Carboxypeptidasen zu wirken, reduzieren. Beispiele bevorzugter C-terminale modifizierender Gruppen schließen eine Amidgruppe, eine Ethylamidgruppe und verschiedene nicht-natürliche Aminosäuren, wie etwa D-Aminosäuren und β-Alanin, ein. Wenn alternativ die modifizierende Gruppe an das carboxyterminale Ende der Aggregationskerndomäne angehängt wird, kann das aminoterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert werden, beispielsweise, um die Fähigkeit der Verbindung, als Substrat für Aminopeptidasen zu wirken, zu reduzieren.
Eine CXCR4-Antagonist-Verbindung kann weiter modifiziert werden, um die Verbindung durch Reaktionen der Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. Geeignete detektierbare Substanzen beinhalten verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierendes Material, lumineszierendes Material und radioaktives Material. Beispiele geeigneter Enzyme beinhalten Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter Komplexe prosthetischer Gruppen beinhalten Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignetes Fluoreszenzmaterial beinhalten Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel eines lumineszierenden Materials schließt Luminol ein; und Beispiele für geeignetes radioaktives Material beinhalten ¹⁴C, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^99mTc, ³⁵S oder ³H. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine CXCR4-Antagonist-Verbindung radioaktiv mit ¹⁴C markiert, entweder durch Aufnahme von ¹⁴C in die modifizierende Gruppe oder in eine oder mehrere Aminosäurestrukturen der CXCR4-Antagonist-Verbindung. Markierte CXCR4-Antagonist-Verbindungen können benutzt werden, um die in vivo-Pharmakokinetiken der Verbindungen zu bestimmen, ebenso wie um das Fortschreiten der Erkrankung oder die Anfälligkeit eines Versuchsobjekts nachzuweisen, beispielsweise zu diagnostischen Zwecken. Die Gewebeverteilung von CXCR4-Rezeptoren kann unter Verwendung einer markierten CXCR4-Antagonist-Verbindung entweder in vivo oder in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, in vitro nachgewiesen werden.
Zur Verwendung als diagnostischer Wirkstoff in vivo kann eine CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung mit radioaktivem Technetium oder Jod markiert werden. Es kann eine modifizierende Gruppe ausgewählt werden, die eine Stelle verfügbar macht, an der eine Chelatgruppe für die Markierung eingeführt werden kann, wie etwa das Aic-Derivat von Cholsäure, das eine freie Aminogruppe aufweist. In einer anderen Ausführungsform macht die Erfindung eine CXCR4-Antagonist-Verbindung verfügbar, die mit radioaktivem Jod markiert ist. Beispielsweise kann ein Phenylalaninrest in der SDF-1-Sequenz (wie etwa Aminosäurerest 13) mit radioaktivem Jodtyrosin substituiert sein. Jedes der verschiedenen Isotope von radioaktivem Jod kann eingebaut werden, um einen diagnostischen Wirkstoff zu schaffen. Vorzugsweise wird ¹²³I (Halbwertszeit = 13,2 Stunden) zur Ganzkörper-Szintigraphie verwendet, ¹²⁴I (Halbwertszeit = 4 Tage) wird zur Positronen-Emissions-Tomographie (PET) verwendet, ¹²⁵I (Halbwertszeit = 60 Tage) wird für Stoffwechselumsatzstudien verwendet und ¹³¹I (Halbwertszeit = 8 Tage) wird zur Ganzkörperzählung und zu Delayed-Low-Resolution-Imaging-Studien verwendet.
Eine zusätzliche Modifikation einer CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann dazu dienen, der Verbindung eine zusätzliche therapeutische Eigenschaft zu verleihen. D. h., die zusätzliche chemische Modifikation kann eine zusätzliche funktionelle Gruppe umfassen. Beispielsweise kann eine funktionelle Gruppe, die dazu dient, eine Apoptose von Tumorzellen herbeizuführen, an die CXCR4-Antagonist-Verbindung gekoppelt werden. In dieser Form kann der von SDF-1 abgeleitete Teil des CXCR4-Antagonisten dazu dienen, die Verbindung an den Tumor zu bringen, um eine Angiogenese zu hemmen, wobei die zusätzliche funktionelle Gruppe dazu dient, eine Apoptose der Krebszellen auszulösen, nachdem die Verbindung diese Stellen besetzt hat.
Bei einer alternativen chemischen Modifikation wird eine Verbindung der Erfindung in Form eines "Pro-Pharmakons" hergestellt, wobei die Verbindung selbst die Interferon-gamma-Produktion oder die Angiogenese eines Tumors nicht moduliert, sondern in der Lage ist, durch Metabolisierung in vivo in eine CXCR4-Antagonist-Verbindung, wie hier definiert, umgewandelt zu werden. Beispielsweise kann bei dieser Art von Verbindung die modulierende Gruppe in einer Pro-Pharmakon-Form vorhanden sein, die in der Lage ist, nach Metabolisierung in die Form wie bei einem aktiven CXCR4-Antagonisten umgewandelt zu werden. Eine derartige Pro-Pharmakon-Form einer modifizierenden Gruppe wird hier als eine "sekundäre modifizierende Gruppe" bezeichnet. Im Stand der Technik sind eine Reihe von Strategien zum Herstellen von Pro-Pharmakon-Peptiden bekannt, die eine Metabolisierung begrenzen, um die Verabreichung der aktiven Form des Arzneistoffs auf der Grundlage von Peptiden zu optimieren (siehe z. B. Moss, J. (1995) in: Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M. D. and Amidon, G. L. (eds), Chapter 18).
CXCR4-Antagonist-Verbindungen der Erfindung können durch Standardtechniken hergestellt werden, die im Stand der Technik im Stand der Technik bekannt sind. Die Peptidverbindung eines CXCR4-Antagonisten ist mindestens teilweise aus einem Peptid aufgebaut, das unter Verwendung von Standardtechniken, wie etwa jenen, die in Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993), und Grant, G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992), beschrieben sind, synthetisiert werden. Automatische Peptid-Syntheseapparate sind kommerziell verfügbar (z. B. Advanced ChemTech Model 396 Milligen/Biosearch 9600). Zusätzlich können an den von SDF-1 abgeleiteten Peptidbestandteilen eine oder mehrere modulierende Gruppen durch Standardverfahren angehängt werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren zur Reaktion über eine Aminogruppe (z. B. die alpha-Aminogruppe am Aminoterminus eines Peptids), einer Carboxylgruppe (z. B. der Carboxy-Terminus eines Peptids), eine Hydroxygruppe (z. Bein Tyrosin-, Serin- oder Threoninrest) oder eine andere geeignete Gruppe an einer Aminosäureseitenkette (siehe z. B. Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991)). Beispielhafte Synthesen bevorzugter CXCR4-Antagonisten werden in den Beispielen weiter beschrieben.
Peptide der Erfindung können chemisch unter Verwendung von Standardtechniken, wie etwa jenen, die bei Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993), und Grant, G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992) (alle Literaturstellen sind hiermit durch Referenz aufgenommen), beschrieben sind, chemisch synthetisiert werden. Automatisierte Peptid-Syntheseautomaten sind kommerziell verfügbar (z. B. Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung können Peptide nach Standardtechniken beim Umgang mit rekombinanter DNA unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, welches das Peptid kodiert, synthetisiert werden. Eine Nukleotidsequenz, welche das Peptid kodiert, kann unter Verwendung des genetischen Codes bestimmt werden, und ein Oligonukleotidmolekül, das diese Nukleotidsequenz aufweist, kann durch DNA-Standardsyntheseverfahren synthetisiert werden (z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Syntheseautomaten). Alternativ kann ein DNA-Molekül, das für eine Peptidverbindung kodiert, von dem natürlichen Vorläuferprotein-Gen oder der cDNA nach molekularbiologischen Standardtechniken abgeleitet werden (z. B. unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsenzymverdau).
Die Erfindung macht auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid der Erfindung kodiert, verfügbar. In einigen Ausführungsformen kann das Peptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens eine Aminosäure-Deletion im Vergleich zu nativem SDF-1 aufweist. Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle und RNA-Moleküle, die einzelstrangig oder doppelstrangig sein können, einschließen. In alternativen Ausführungsformen kodiert die isolierte Nukleinsäure für ein Peptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren des N-Terminus, C-Terminus und/oder an einer innen gelegenen Stelle von SDF-1 deletiert sind. In noch anderen Ausführungsformen kodiert die isolierte Nukleinsäure ein Peptidfragment, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren im Vergleich zu nativem SDF-1 deletiert sind.
Um die Expression einer Peptidverbindung in einer Wirtszelle durch Rekombinate-DNA-Standardtechniken zu erleichtern, kann die isolierte Nukleinsäure, die das Peptid kodiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Dementsprechend macht die Erfindung auch rekombinante Expressionsvektoren verfügbar, welche die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung umfassen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft ist, zu transportieren. Eine Vektorart ist ein Plasmid, was sich auf eine zirkuläre doppelstrangige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert sein können. Ein weiterer Typ von Vektor ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das Virusgenom ligiert sein können. Bestimmte Vektoren sind zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in welche sie eingeführt wurden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung sowie episomale Säugetiervektoren) fähig. Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert und werden dadurch mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, an die sie funktionsfähig gekoppelt sind, zu dirigieren. Derartige Vektoren werden hier als "rekombinante Expressionsvektoren" oder einfach als "Expressionsvektoren" bezeichnet.
Bei rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung kann die Nukleotidsequenz, die ein Peptid kodiert, funktionsfähig an eine oder mehrere regulatorische Sequenzen geknüpft sein, die auf der Grundlage der zur Expression verwendeten Wirtszellen ausgewählt werden. Die Begriffe "funktionsfähig verknüpft" oder "wirksam verknüpft" bedeuten, daß die das Peptid kodierende Sequenzen mit der regulatorischen Sequenz/den regulatorischen Sequenzen in einer Weise verknüpft ist, welche eine Expression der Peptidverbindung erlaubt. Der Begriff "regulatorische Sequenz" beinhaltet Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale und andere Elemente der Expressionskontrolle. Derartige regulatorische Sequenzen werden beispielsweise bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) (durch Bezugnahme hier aufgenommen), beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen dirigieren, solche, die eine direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmen Wirtszellen dirigieren (z. B. gewebsspezifische regulatorische Sequenzen) und solche, die eine Expression auf eine regulierbare Weise dirigieren (z. B. nur in Gegenwart eines induzierenden Wirkstoffs). Der Fachmann wird erkennen, daß die Ausgestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann, wie etwa der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression der gewünschten Peptidverbindung etc. Die Expressionsvektoren der Erfindung können dabei in Wirtszellen eingeführt werden, um Peptidverbindungen, welche durch Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, kodiert werden, zu produzieren.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für eine Expression von Peptidverbindungen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen entworfen werden. Beispielsweise können Peptidverbindungen in Bakterienzellen, wie etwa E. coli, in Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990), ausführlicher besprochen. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter Verwendung von regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerivisae beinhalten pYepSec1 (Baldari et al. (1987), EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982), Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.). Baculovirus-Vektoren, verfügbar zur Expression von Proteinen oder Peptiden in kultivierten Insektenzellen (z. B. Sf 9-Zellen), schließen die pAc-Serien (Smith et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow, V. A., and Summers, M. D. (1989), Virology 170: 31–39) ein. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren beinhalten pCDM8 (Seed, B. (1987), Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6: 187–195). Bei Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente vermittelt. Häufig verwendete Promotoren sind beispielsweise von Polyom, Adenovirus-2, Cytomegalovirus und Simian-Virus40 abgeleitet.
Zusätzlich zu den oben besprochenen regulatorischen Kontrollsequenzen kann der rekominante Expressionsvektor weitere Nukleotidsequenzen enthalten. Beispielsweise kann der rekombinante Expressionsvektor für ein selektionsfähiges Marker-Gen kodieren, um Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, zu identifizieren. Derartige selektionsfähige Marker-Gene sind im Stand der Technik bestens bekannt. Um darüber hinaus eine Sekretion der Peptidverbindung durch eine Wirtszelle, insbesondere Säugetierwirtszellen zu erleichtern, umfaßt der rekominante Expressionsvektor vorzugsweise eine Signalsequenz, die funktionsfähig mit Sequenzen verbunden ist, die den Aminoterminus der Peptidverbindung kodieren, so daß nach einer Expression die Peptidverbindung mit der Signalsequenz, die mit deren Aminoterminus fusioniert ist, synthetisiert wird. Diese Signalsequenz dirigiert die Peptidverbindung in den Sekretionsweg der Zelle und wird dann gespalten, was die Freisetzung der reifen Peptidverbindung (d. h. der Peptidverbindung ohne die Signalsequenz) aus der Wirtszelle erlaubt. Die Verwendung einer Signalsequenz, um die Sekretion von Proteinen oder Peptiden aus Säugetierwirtszellen zu erleichtern, ist Stand der Technik.
Ein rekominanter Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure umfaßt, die eine Peptidverbindung kodiert, die entweder die Interferon-gamma-Produktion hemmt oder die Angiogenese hemmt, kann in eine Wirtszelle eingeführt werden, um dadurch die Peptidverbindung in der Wirtszelle zu produzieren. Demgemäß macht die Erfindung auch Wirtszellen mit den rekominanten Expressionsvektoren der Erfindung verfügbar. Die Bezeichnungen "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" wird hier austauschbar verwendet. Es ist klar, daß sich solche Begriffe nicht nur auf die bestimmte Zelle eines Versuchsobjekts beziehen, sondern auch auf die Vorläuferzelle oder die potentielle Vorläuferzelle. Da bestimmte Modifikationen in aufeinanderfolgenden Generationen entweder aufgrund einer Mutation oder von Umwelteinflüssen auftreten, muß eine Vorläuferzelle nicht tatsächlich mit der Elternzelle identisch sein, sondern ist noch vom Umfang der Bezeichnung, wie hier verwendet, umfaßt. Eine Wirtszelle kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann eine Peptidverbindung in Bakterienzellen, wie etwa E. coli, in Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen exprimiert werden. Vorzugsweise wird die Peptidverbindung in Säugetierzellen exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidverbindung in Säugetierzellen in vivo in einem Säugetier-Versuchsobjekt exprimiert, um das Versuchsobjekt durch Gentherapie (wie weiter unten besprochen) zu behandeln. Vorzugsweise wird die Peptidverbindung, die durch den rekombinanten Expressionsvektor kodiert wird, von der Wirtszelle sezerniert, nachdem sie in der Wirtszelle exprimiert worden ist.
Die Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels konventioneller Transformation- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hier verwendet, sollen sich die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" auf verschiedene Standardtechniken zum Einführen fremder Nukleinsäuren (d. h. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Kalziumphosphat- oder Kalziumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofectin, Elektroporation, Mikroinjektion und virusvermittelte Transfektion. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen können bei Sambrock et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden. Verfahren zum Einführen von DNA in Säugetierzellen in vivo sind im Stand der Technik ebenfalls bekannt und können verwendet werden, um die Vektor-DNA einem Versuchobjekt zu gentherapeutischen Zwecken (wie weiter unten besprochen) zu verabreichen.
In Bezug auf eine stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird im allgemeinen ein Gen, daß für einen selektionsfähigen Marker (z. B. eine Resistenz gegenüber Antibiotika) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle eingeführt. Bevorzugte selektionsfähige Marker beinhalten solche, die eine Resistenz gegenüber Wirkstoffen, wie etwa G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Nukleinsäuren, die für einen selektionsfähigen Marker kodieren, können auf dem selben Vektor, wie dem, der für die Peptidverbindung kodiert, oder auf einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert wurden, können durch eine Selektion mittels Wirkstoffen identifiziert werden (z. B. werden Zellen, die das Selektionsmarker-Gen aufgenommen haben, überleben, während die anderen Zellen sterben).
Eine Nukleinsäure der Erfindung kann Zellen in vivo verabreicht werden, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, wie etwa eine direkte Injektion von DNA, rezeptorvermittelte DNA-Aufnahme oder virusvermittelte Transfektion. Die direkte Injektion ist verwendet worden, um nackte DNA in Zellen in vivo einzuführen (siehe z. B. Acsadi et al. (1991), Nature 332: 815–818 und Wolff et al. (1990), Science 247: 1465–1468). Es kann eine Apparatur zum Injizieren von DNA in Zellen in vivo (z. B. "Gene Gun") verwendet werden. Ein derartiger Apparat ist kommerziell erhältlich (z. B. von BioRad). Nackte DNA kann in Zellen auch eingeführt werden, indem die DNA mit einem Kation, wie zum Polylysin, das an einen Liganden eines Zell-Oberflächenrezeptors gekoppelt ist, komplexiert wird (siehe beispielsweise Wu, G. and Wu, C. H. (1988), J. Biol. Chem. 263: 14621, Wilson et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 963–967 und das US-Patent 5,166,320). Eine Bindung des DNA-Ligand-Komplexes an den Rezeptor erleichtert die Aufnahme der DNA durch rezeptorvermittelte Endocytose. Zusätzlich kann ein DNA-Ligand-Komplex, gebunden an die Adenovirus-Capside, die natürlicherweise Endosomen ausbrechen, wodurch Material in das Zytoplasma freigesetzt wird, verwendet werden, um den Abbau des Komplexes durch intrazelluläre Lysosomen zu verhindern (siehe beispielsweise Curiel et al. (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850 und Cristiano et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122–2126).
Fehlerhafte Retroviren für die Verwendung zum Gentransfer zu gentherapeutischen Zwecken sind gut charakterisiert (zur Übersicht siehe Miller, A. D. (1990), Blood 76: 271). Protokolle zum Herstellen rekombinanter Retroviren und zum Infizieren von Zellen in vitro oder in vivo mit derartigen Viren können in den Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10–9.14 und anderen Standard-Laborhandbüchern gefunden werden. Beispiele geeigneter Retroviren schließen pLJ, pZIP, pWE und pEM ein, welche dem Fachmann bestens bekannt sind. Beispiele geeigneter Verpackungsviruslinien schließen die .pψi.Crip, .pψi.Cre, .pψi.2 and .pψ.Am. ein. Retroviren sind eingesetzt worden, um verschiedene Gene in viele verschiedene Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Endothelzellen, Lymphozyten, Myoblasten, Hepatozyten, Knochenmarkzellen in vitro und/oder in vivo einzuführen (siehe beispielsweise Eglitis, et al. (1985), Science 230: 1395–1398, Danos and Mulligan (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464, Wilson et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014–3018, Armentano et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141–6145, Huber et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8043, Ferry et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377–8381, Chowdhury et al. (1991), Science 254: 1802–1805, van Beusechem et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640–7644, Kay et al. (1992), Human Gene Therapy 3: 641–647, Dai et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892–10895, Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104–4115, sowie das US-Patent 4,868,116, das US-Patent. 4,980,286, die PCT-Anmeldung WO 89/07136, die PCT-Anmeldung WO 89/02468, die PCT-Anmeldung WO 89/05345 und die PCT-Anmeldung WO 92/07573).
Alternativ kann das Genom eines Adenovirus manipuliert werden, derart, daß es für eine Peptidverbindung der Erfindung kodiert und diese exprimiert, daß es jedoch im Hinblick auf seine Fähigkeit, sich in einem normalen lytischen Viruslebenszyklus zu replizieren, inaktiviert ist. Siehe beispielsweise Berkner et al. (1988), BioTechniques 6: 616, Rosenfeld et al. (1991), Science 252: 431–434 und Rosenfeld et al. (1992), Cell 68: 143–155. Geeignete adenovirale Vektoren, abgeleitet vom Adenovirus-Stamm Ad Typ 5 dl324 oder anderen Stämmen von Adenoviren (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) sind dem Fachmann gut bekannt. Rekombinante Adenoviren sind vorteilhaft insofern, als sie keine sich teilenden Zellen benötigen, um wirksame Genübertragungsvehikel zu sein und verwendet werden können, um eine große Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Zellen des Atemwegepithels (Rosenfeld et al. (1992), wie oben zitiert), Endothelzellen (Lemarched et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6482–6486), Hepatozyten (Herz and Gerard (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812–2816) und Muskelzellen (Quantin et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581–2584) zu infizieren.
Das adeno-assoziierte Virus (AAV) kann ebenfalls zur Übertragung von DNA zu gentherapeutischen Zwecken verwendet werden. AAV ist ein natürliche vorkommendes fehlerhaftes Virus, das einen weiteren Virus, wie etwa einen Adenovirus oder einen Herpesvirus als Helfervirus für eine wirksame Replikation und einen produktiven Lebenszyklus benötigt (zur Übersicht siehe Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And Immunol. (1992), 158: 97–129). Er ist auch einer der wenigen Viren, die ihre DNA in sich nicht teilende Zellen integrieren können, und weist eine hohe Frequenz stabiler Integrationen auf (siehe beispielsweise Flotte et al. (1992), Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349–356, Samulski et al. (1989), J. Virol. 63: 3822–3828 und McLaughlin et al. (1989), J. Virol. 62: 1963–1973). Ein AAV-Vektor, wie etwa der von Tratschin et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260 beschrieben, kann verwendet werden, um DNA in Zellen einzuführen. Verschiedene Nukleinsäuren wurde in verschiedene Zelltypen unter Verwendung von AAV-Vektoren eingeführt (siehe treispielsweise Hermonat et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466–6470, Tratschin et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081, Wondisford et al. (1988), Mol. Endocrinol. 2: 32–39, Tratschin et al. (1984), J. Virol. 51: 611–619 und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781–3790).
In einer weiteren Ausführungsform macht die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Versuchsobjekts, das an Krebs oder einer Autoimmunerkrankung (z. B. Multiple Sklerose) leidet, verfügbar, das ein Verabreichen eines rekombinanten Expressionsvektors umfaßt, der für eine von SDF-1 abgeleitete Peptidverbindung kodiert, an das Versuchsobjekt derart, daß die Peptidverbindung in dem Versuchsobjekt synthetisiert wird, und das Versuchsobjekt wegen einer Störung, die mit Krebs oder einer Autoimmunerkrankung verbunden ist, behandelt wird. Die Peptidverbindung kann ein Peptidfragment umfassen, das im Vergleich zu nativem SDF-1 mindestens eine Aminosäure-Deletion aufweist.
Eine weitere Anwendung von CXCR4-Antagonisten kann auch auf dem Gebiet der Krebstherapie liegen. Da das Wachstum solider Tumoren von einer Angiogenese abhängig ist und die Endothelzellen (die wesentlich sind für die Blutgefäßbildung) den SDF-1-Rezeptor tragen, ist es möglich, daß von SDF-1 abgeleitete Antagonisten das Tumorwachstum durch ihre anti-angiogenetische Wirkung hemmen.
Allgemeine Verfahren zur Gentherapie sind nach dem Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise das US-Patent 5,399,346 von Anderson et al. Eine biologisch verträgliche Kapsel zum Verabreichen genetischen Materials wird in der PCT-Offenlegungsschrift WO 95/05452 von Baetge et al. beschrieber. Verfahren zum Einpflanzen genetisch modifizierter Zellen, um Störungen des zentralen Nervensystems zu behandeln, werden in dem US-Patent 5,082,670 und in den PCT-Offenlegungsschriften WO 90/06757 und WO 93/10234, alle von Gage et al., beschrieben.
Weiterhin kann alternativ zur Expression eines von SDF-1 abgeleiteten Peptids, um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen oder eine Angiogenese zu hemmen, ein Antisense-Oligonukleotid, das zu einer Region der mRNA des SDF-1-Vorläuferproteins komplementär ist, das mit den hier beschriebenen Peptiden korrespondiert, in einem Versuchsobjekt exprimiert werden, um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen oder eine Angiogenese zu hemmen. Allgemeine Verfahren zum Exprimieren von Antisense-Oligonukleotiden um Störungen des Nervensystems zu modulieren, werden in der PCT-Offenlegungsschrift WO 95/09236 beschrieben.
Peptide können nach Standardverfahren hergestellt werden (wie etwa bei Clark-Lewis, I., Dewald, B., Loetscher, M., Moser, B., and Baggiolini, M., (1994), J. Biol. Chem., 269, 16075–16081 offenbart) und auf CXCR4-antagonistische Aktivität nach Standardverfahren getestet werden. Peptide können durch HPLC gereinigt und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Peptide können mittels einer Disulfidbrücke dimerisiert werden, die sich durch milde Oxidation der Cysteine unter der Verwendung von 10% DMSO in Wasser bildet. Nach der HPLC-Reinigung kann die Dimer-Bildung durch Massenspektrometrie verifiziert werden.
Für Tests der CXCR4-Antagonisten können menschliche periphere mononukleäre Blutzellen unter Verwendung von Standardverfahren isoliert werden, wie etwa aus Buffy coats aus Spenderblut durch Zentrifugation über Ficoll-Paque. Die Zellen werden mit Phytohämagglutinin (1,0 μg·ml^–1) zentrifugiert und in Gegenwart von IL-2 (100 U·ml^–1) 7 bis 17 Tage wie beschrieben (Loetscher, P., Seitz, M., Clark-Lewis, I., Baggiolini, M., and Moser, B. (1994), FASEB J., 8,1055–1060) expandiert. Diese Zellen können als "T-Lymphozyten" für verschiedene Tests auf CXCR4-Rezeptoraktivität verwendet werden. CEM-Zellen, eine menschliche lymphoblastoide CD4⁺T-Zellinie (ATCC, Rockville, MD) kann in RPMI-Medium mit 15 μg·ml^–1 8-Azaguanin (Aldrich Chemical Company, Milwaukee WI) und 10% FCS kultiviert werden.
Die Migration von T-Lmyphozyten oder CEM-Zellen kann nach Standardverfahren getestet werden. Derartige Verfahren können 48-Well-Kammern (NeuroProbe, Cabin John, MD) unter Verwendung von Kollagen-beschichteten Polyvinylpyrrolidon-freien Polycarbonat-Membranen mit 3 μm-Poren verwenden (Loetscher, P., Seitz; M., Clark-Lewis, I., Baggiolini, M., and Moser, B. (1994), FASEB J., 8,1055–1060). Gewanderte Zellen können nach einstündiger Migration in fünf zufällig ausgewählten Feldern bei 1000-facher gezählt werden. Einweg-Transwell-Träger (Colstar, Cambridge, MA) mit Kammern von 6,5 mm Durchmesser und einer Membran-Porengröße von 3 um können verwendet werden, um die Chemotaxis der CEM-Zellen zu bestimmen. Der putative Antagonist in Hepes-gepuffertem RPMI 1640, supplementiert mit 10 mg·ml^–1 BSA (0,6 ml), kann in das untere Well gegeben werden, und 0,1 ml CEM-Zellen (1 × 10⁷·ml^–1) in dem selben Medium ohne Antagonist wurde in die oberen Wells gegeben. Der monoklonale Antikörper 12G5 (von Tscharner, V., Prod'hom, B., Baggiolini, M., and Reuter, H. (1986), Nature, 324, 369–372; R&D Systems, Minneapolis, MN) kann in einer Konzentration von 10 μg·ml^–1 mit den Zellen 15 Minuten bei 0°C vorinkubiert werden. Der Antikörper kann auch in einer Konzentration von 10 μg·ml^–1 in das untere Well gegeben werden. Nach 2 Stunden können Zellen, die in die unteren Wells gewandert sind, gezählt werden. Die chemotaktische Migration kann durch Subtraktion der Zellen, die in das Medium ohne Agonist gewandert sind, bestimmt werden.
Die Sequenzen verschiedener Peptide, die auf ihre Aktivität an CXCR4 getestet wurden, werden in 1 gezeigt. Sowohl die SDF (1-8)- als auch die SDF (1-9)-Peptide induzierten eine dosisabhängige Chemotaxis von CEM-Zellen (2a). Die Konzentrationen, die für 50% der maximalen Antwort (EC50) erforderlich sind, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Das 1-9-Peptid war ungefähr 1000-fach weniger wirksam als natives SDF-1. Das 1-9-Peptid war jedoch um das 7-fache stärker wirksam als das 1-8-Peptid. Die Peptide wurden auch an T-Lymphozyten (2b) getestet, und die Ergebnisse waren denen ähnlich, die mit CEM-Zellen erhalten wurden, außer, daß die T-Lymphozyten auf SDF-1 oder die Peptide weniger gut reagierten. Die chemische Lockstoff-Aktivität von SDF-1 (1-9) wurde durch den SDF-1-Antagonisten SDF-1 (1-67) [P2G] (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007), vollständig gehemmt, nicht jedoch durch einen IL-8-Antagonisten, der CXCR1 blockiert (Crump M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007) (3).
Um die Wirkung einer zunehmenden Peptid-Länge zu untersuchen, damit sowohl das N-terminale CXC-Motiv als auch RFFESH-bindende Domänen aufgenommen werden konnten, präparierten wir SDF-1 (1-17). Dieses Peptid war stärker wirksam als das (1-9)-Peptid, seine chemotaktische Aktivität war jedoch mehrfach geringer als die des (1-9)-Dimers (2a). Die Dimerisierung des (1-17)-Peptids beeinflußte dessen Wirksamkeit nicht (nicht gezeigt). Dies legt nahe, daß ein SDF-1 (1-17)-Peptid, in dem sich eine P2G-Substitution befindet, einen aktiven CXCR4-Antagonisten darstellen würde.
Ein Test auf Kompetition der Bindung von ¹²⁵I-markiertem SDF-1 an CEM-Zellen kann durchgeführt werden, wie beschrieben (Crump M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007. Die Bindung von MCP-1 und RANTES kann mit THP-1-Zellen gemessen werden (Gong, J.-H., Uguccioni, M., Dewald, B., Baggiolini, M., and Clark-Lewis, I. (1996), J. Biol. Chem., 271, 10521–10527).
CEM-Zellen können verwendet werden, um die Bindung des SDF-1-Peptids an CXCR4 zu bestimmen (Crump M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007). Die Kompetition um die Bindung von ¹²⁵I-markiertem, nativem SDF-1 durch unmarkiertes natives SDF-1 und die N-terminalen Peptide wird beispielsweise in 4 gezeigt. Die K_d-Werte sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Um zu bestimmen, ob Peptide an andere Chemokinrezeptoren binden, kann eine Kompetition um die Bindung von MCP-1 oder RANTES an THP-1-Zellen gemessen werden. THP-1-Zellen exprimieren CXCR4 ebenso wie eine Reihe von CC-Chemokinrezeptoren, einschließlich Rezeptoren für MCP-1 und RANTES.
T-Lymphozyten und CEM-Zellen, die mit Fura-2 beladen sind, können mit dem putativen Antagonisten stimuliert werden, und die [Ca²⁺]_i-abhängigen Änderungen der Fluoreszenz können 0–60 Sekunden aufgezeichnet werden (Jones, S. A., Dewald, B., Clark-Lewis, I., and Baggiolini, M., (1997), J. Biol. Chem. 272, 16166–16169). Eine Rezeptor-Desensibilisierung kann geprüft werden, indem Änderungen während aufeinanderfolgender Zugaben in 60 Sekunden-Intervallen dargestellt werden. Die Zellen können vor einer Chemokinbehandlung mit dem 12G5-Antikörper vorinkubiert werden.
CXCR4-Agonisten, wie etwa nativer SDF-1 und die N-terminalen Peptide induzieren einen raschen und vorübergehenden Anstieg der cytoplasmatischen [Ca²⁺]_i-Konzentration bei T-Lymphozyten (5a) ebenso wie bei CEM-Zellen (6). Die Rate und Größe kann mit der Konzentration zunehmen. Während eine Antwort auf SDF-1 bei 1 × 10^–9 M beobachtet wurde, induzierten die Peptide [Ca²⁺]_i-Änderungen im mikromolaren Bereich. Eine Rezeptorbindung durch SDF-1-abgeleitete Peptiden kann durch Aufzeichnung von [Ca²⁺]_i-Änderungen nach aufeinanderfolgender Stimulation bestimmt werden. Wie in 5a gezeigt, wurde durch die Behandlung von T-Lymphozyten mit SDF-1 die Reaktionsfähigkeit auf das (1-9)-Peptid vollständig unterbunden, und umgekehrt schwächte das (1-9)-Peptid die Antwort auf nativen SDF-1 deutlich ab. Das (1-9)-Dimer (50 μM) desensibilisierte die Antwort auf nachfolgenden nativen SDF-1 vollständig (nicht gezeigt). Kein Effekt auf die durch das (1-9)-Peptid ausgelöste Antwort wurde beobachtet, wenn T-Lymphozyten mit MCP-1, RANTES, MIP-1β, IP10 oder Mig vorinkubiert wurden (5b). Unter den eingesetzten Bedingungen wurde bei diesen Zellen keine Antwort auf Eotaxin, 1–309 oder TARC (5b) erhalten, und erwartungsgemäß wurde keine Desensibilisierung gegenüber dem (1-9)-Peptid bewirkt.
Die Peptide können auf eine Rezeptorbindung unter Verwendung eines CXCR4-blockierenden monoklonalen Antikörpers (von Tscharner, V., Prod'hom, B., Baggiolini, M., and Reuter, H. (1986), Nature 324, 369–372) getestet werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die hemmenden Wirkungen von CXCR4-Antagonisten auf das Tumorwachstum unter Verwendung von Mäusemodellen.
Zwei CXCR4-Antagonisten wurden verwendet: (i) der Vollänge SDF-1-Antagonist, SDF-1 (1-67) [P2G] und (ii) der dimere Kurzpeptid-Antagonist SDF-1 (1-9) [P2G])₂. Die beiden eingesetzten Tiermodelle waren: (i) das Lewis-Lungenkarzinom in seinem Gen-identischen Wirt, den C57BL/6-Mäusen und (ii) das Linie-1-Karzinom (ein schwach antigenes, hochmalignes Metastasierungsmodell) in seinem Gen-identischen Wirt, den BALB/c-Mäusen. Mäusemännchen im Alter von 1,5–3 Monaten wurden eingesetzt.
Die Behandlungsprotokolle waren wie folgt: an Tag 0 wurden Tumorzellen (1–2 × 10⁶) subkutan (sc) am Rücken jeder Maus implantiert. Eine Behandlung mit den CXCR4-Antagonisten begann unmittelbar nach der Tumorimplantation. Das SDF-1 (1-67) [P2G] (9 mg/kg/Tag) oder das SDF-1 (1-9) [P2G])₂-Dimer (18 mg/kg/Tag), gelöst in Phosphatpuffer, wurden intraperitoneal (i. p.) verabreicht, wie in den Figuren angegeben. Die Injektion erfolgte einmal täglich insgesamt 12–16 Tage lang. Die Tumorgröße wurde mit einem Mikrometer bestimmt, und das Volumen des Tumors wurde durch die Formel Breite² × Länge berechnet. Die Tumormasse wurde am Ende jedes Experiments bestimmt.
Sowohl die CXCR4-Antagonisten, die von dem Vollänge-SDF-1 (SDF-1 P2G) als auch die, die von dem Kurzpeptid-SDF-1 abgeleitet sind, hemmten das Wachtung der Linie-1- und Lewis-Lungenkarzinome. Im Vergleich zu den Kontrollen am Tag 12 hemmte der SDF-1 (1-67) [P2G] das Wachstum des Linie-1-Lungenkarzinoms um >80% bei einer Dosis von 9 mg/kg (6) oder 64% bei einer Dosis von 4 mg/kg (7). Im Fall des Lewis-Lungenkarzinoms hemmte das SDF-1 (1-67) [P2G] zum Tag 12 das Tumorwachstum um 45% bei eine Dosis von 4 mg/kg (9). Eine subkutane Injektion hemmte das Tumorwachstum ebenfalls, die Wirksamkeit war jedoch geringer als die bei einer i. p.-Injektion.
Der Grad der Hemmung des Tumorwachstums durch CXCR4-Inhibitoren korrelierte mit dem Aktivitätsgrad des CXCR4-Antagonisten in der Zusammensetzung. Das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer war allgemein ein weniger wirksamer Inhibitor des Tumorwachstums als das Vollänge-SDF-1 (1-67) [P2G]-Analogon. Dies weist darauf hin, daß es die antagonistische Aktivität dieser Verbindungen ist, die deren chemotherapeutische Wirkung vermitteln. Dennoch zeigte selbst das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer eine signifikante, das Tumorwachstum hemmende Aktivität. In einer Dosis von 18 mg/kg hemmte das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer das Wachstum des Linie-1-Tumors um 35% am Tag 12, und es und hemmte das Wachstum des Lewis-Lungenkarzinoms um 43% am Tag 12. Die Tumormasse korrelierte im allgemeinen mit der gemessenen Tumorgröße (8 und 10).
Histologische Studien zeigen, daß die Tumoren der mit CXCR4-Antagonisten behandelten Mäusen eine geringere Dichte an Blutgefäßen aufwies als Tumoren in den Kontrollmäusen, was darauf hinweist, daß es SDF-1-Antagonisten als Angiogenese-Inhibitoren wirken, um eine Neovaskularisierung von Tumoren zu reduzieren.
In den Mäusemodellen wurde während der Behandlung bis zu der Dosis von 18 mg/kg keine Toxizität von CXCR4-Antagonisten gefunden.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Hemmung der Interferon-gamma-Produktion von aktivierten T-Zellen durch CXCR4-Inhibitoren.
T-Zellen wurden unter Verwendung von Standardverfahren wie folgt isoliert und kultiviert. Menschliches Blut wurde gesunden Spendern durch Venenpunktion abgenommen. Das Blut wurde in eine gerinnungshemmende Lösung (ACD) abgezapft, damit und mit einem gleichen Volumen Salzlösung gemischt und über Histopaque geschichtet. Nach Zentrifugation (1200 Upm, 30 Minuten) wurde die obere Lösung aus Plasma verworfen, und es wurden die Zellen in der Zwischenschicht zwischen den Lösungen gewonnen. Die Zellen wurden zweimal durch Resuspension in Tyrode-Puffer und Zentrifugation, um die Zellen zu pelletieren, gewaschen. Das endgültige Zellpellet wurde in RPMI 1640 mit Antibiotika und 20% fötalem Rinderserum resuspendiert. Die Zellen wurden in Gewebekulturflaschen für 2 Stunden ausgesät, um den adhärenten Zellen zu erlauben, sich anzuheften. Die nicht-adhärenten Zellen (angereichert mit T-Lymphozyten) wurden unter Verwendung von Trypanblau gezählt, um wachstumsfähige Zellen nachzuweisen. Die Zellen wurden mit einer Anfangskonzentration von 1 × 10⁶ pro ml 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂, 95% Luft inkubiert. Zum Zeitpunkt 0 wurden 1 μg/ml Concanavalin A, 1000 Units/ml Interferon-beta und/oder Peptide in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Um die Interferon-gamma-Produktion zu testen, wurde die Zellsuspension zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und der Überstand wurde unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Testkits (Pharmingen) getestet.
Tabelle 2 zeigt durch T-Zellen in Kultur produziertes Interferon-gamma nach Stimulation mit 1 μg/ml Concanavalin-A (ConA) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von SDF-1 (d. h. 0, 2,5, 5, 7,5 oder 10 nM). Bei diesen Untersuchungen bildeten mit Interferon-beta behandelte Zellen als Antwort auf SDF-1 kein zusätzliches Interferon-gamma. Allerdings wurde eine signifikante Abnahme der Produktion von Interferon-gamma beobachtet, wenn die Zellen synergistisch mit Interferon-beta und SDF-1 (–67) [P2G] stimuliert wurden.
Tabelle 1: Interferon-gamma-Produktion (pg/ml Interferon-Gamma)
Tabelle 1 zeigt, daß die Konzentration von Interferon-gamma, das aus T-Zellen in Kultur als Antwort auf eine Stimulation mit Concanavalin A freigesetzt wird, nahezu 4.000 pg/ml beträgt, und daß diese durch Behandlung mit Interferon-beta reduziert wird. Eine Behandlung von T-Zellen mit SDF-1 zur selben Zeit wie Concanvalin A steigert die Produktion von Interferon-gamma. SDF-1-Zugabe zeigt keinen Effekt hinsichtlich eines Rückgängigmachens der Wirkung von Interferon-beta.
Von SDF-1 abgeleitete CXCR4-Antagonisten weisen im Gegensatz dazu eine signifikante Wirkung auf die Produktion von Interferon-gamma aus den T-Zellen auf. Dies wird durch Experimente gezeigt, die den Untersuchungen mit Interferon-beta ähnlich sind. Menschliche Lymphozyten wurden verschiedenen Konzentrationen an SDF-1-Antagonist (SDF-1-P2G) ausgesetzt, und die Zellen wurden dann mit Concanavalin A (ConA) aktiviert. Die Produktion von Interferon-gamma aus T-Zellen, die einem SDF-1-Antagonisten ausgesetzt waren, wurde gemessen und mit derjenigen Menge verglichen, die aus T-Zellen, die nicht mit dem Antagonisten behandelt wurden, freigesetzt wurde.
Tabelle 2 zeigt die Wirkung eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-67) [P2G]) auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus mit Concanavalin A (ConA) aktivierten T-Zellen in Gegenwart von Interferon-beta und ohne (Kontrolle) Interferon-beta-Behandlung.
Tabelle 2: SDF-1 (1-67) [P2G]-Konzentration (nM)
Die Werte in Tabelle 2 zeigen, daß ein CXCR4-Antagonist die Freisetzung von Interferon-gamma durch die T-Zellen vermindern kann. Darüber hinaus ist die Wirkung auf die Reduktion der Interferon-gamma-Produktion sogar noch größer, wenn der SDF-1-Antagonist zusammen mit Interferon-beta zugesetzt wird. Dementsprechend kann ein CXCR4-Antagonist zusammen mit Interferon-beta verwendet werden, um die Interferon-gamma-Produktion durch aktivierte T-Zellen, beispielsweise T-Zellen, die physiologisch in einem Patienten aktiviert worden sind, zu reduzieren. Beispielsweise können CXCR4-Antagonisten mit Interferon-beta zur Behandlung von Patienten mit MS eingesetzt werden.
Tabelle 3 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Agonisten (SDF-1) und eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-67) [P2G]) auf die Produktion von Interferon-Gamma aus den ConA-aktivierten T-Zellen, wenn jeder mit Interferon-beta verwendet wurde. Zum Vergleich zeigt Tabelle 4 auch Werte für Interferon-beta alleine.
Tabelle 3: Wirkung von 10 nM SDF-1 und SDF-1 (1-67 (P2G] (Antagonist) auf die Produktion von Interferon-gamma durch menschliche T-Zellen

Interferon-gamma (pg/ml)

Kontrolle (ConA) 3 950

Interferon-beta 3 500

SDF-1 + Interferon-beta 3 500

Antagonist (SDF-1-P2G) + Interferon-beta 1 300
Der CXCR4-Antagonist (SDF-1 (1-67) [P2G]) ist in der Lage, die Wirkung von Interferon-beta beim Abregulieren der Produktion von Interferon-gamma durch aktivierte T-Zellen synergistisch zu potenzieren. Die Zugabe von Interferon-beta selbst hatte nur eine geringe Wirkung auf die Reduktion der Interferon-gamma-Freisetzung aus T-Zellen. Die SDF-1-Behandlung veränderte die Wirkung von Interferon-beta nicht, der SDF-1-Antagonist (SDF-1-P2G) verursachte jedoch eine dramatische Reduktion der Interferon-gamma-Produktion.
Tabelle 4 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-67) [P2G]) auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus mit Concanavalin A (ConA) aktivierten T-Zellen in Abwesenheit von Interferon-beta.
Tabelle 4: Wirkung von 0,1 μM und 1 μM SDF-1 (1-67) [P2G] auf die Produktion von Interferon-gamma aus menschlichen T-Zellen

Interferon-gamma (pg/ml)

Kontrolle (unstimuliert) 80

ConA (aktiviert) 2 200

ConA + SDF-1 (1-67)[P2G] (0,1 μM) 1 050

ConA + SDF-1 (1-67)[P2G] (1 μM) 1 100
Die Werte in Tabelle 4 zeigen, daß ein CXCR4-Antagonist die Freisetzung von Interferon-gamma durch T-Zellen vermindern kann. Dementsprechend kann ein CXCR4-Antagonist verwendet werden, um die Interferon-Gamma-Produktion durch aktivierte T-Zellen, beispielsweise T-Zellen, die physiologisch in einem Patienten, der an multipler Sklerose leidet, aktiviert wurden, zu reduzieren.
Tabelle 5 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-9) P2G) auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus durch Concanavalin A (ConA) aktivierten T-Zellen in Abwesenheit von Interferon-beta.
Tabelle 5: Wirkung von 1 μM und 10 μM SDF-1 (1-9) [P2G] auf die Produktion von Interferon-gamma aus menschlichen T-Zellen

Interferon-gamma (pg/ml)

Kontrolle (unstimuliert) 100

ConA (aktiviert) 2 200

ConA + SDF-1 (1-9) [P2G] (1 μM) 1 100

ConA + SDF-1 (1-9) [P2G] (10 μM) 1 000
Die Werte in Tabelle 5 zeigen weiter, daß ein verkürztes CXCR4-Antagonist-Peptid die Freisetzung von Interferon-gamma durch T-Zellen vermindern kann. Dementsprechend kann ein CXCR4-Antagonist von kürzerer Länge verwendet werden, um die Interferon-gamma-Produktion durch aktivierte T-Zellen zu reduzieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines CXCR4-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmun-Erkrankung in einem Säugetier.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von multipler Sklerose in einem Säugetier.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 2, wobei das Medikament Interferon-beta umfaßt.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Säugetier einer Behandlung mit Interferon-beta unterzogen wird.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Säugetier.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Angiogenese in einem Säugetier.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs durch Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der CXCR4-Antagonist eine Peptidverbindung ist, die ein im wesentlichen gereinigtes, modifiziertes Fragment, Analogon oder pharmakologisch akzeptables Salz von SDF-1 umfaßt.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 8, wobei die Peptidverbindung eine N-terminale Aminosäuresequenz KGVSLSYRC-R₁ (SEQ ID. NO: 2) umfaßt, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Polypeptiden, die zu mindestens einem Teil von SDF-1 homolog sind.
Therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen CXCR4-Antagonisten, Interferon-beta und einen pharmakologisch akzeptablen Träger.
Verwendung eines. CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 8, wobei die Peptidverbindung ein Dimer von SEQ ID. NO: 3 gemäß der folgenden Formel
umfaßt, worin X Lysin ist und sowohl die α- als auch die ε-Aminogruppen des Lysins mit der Ausbildung einer Amidbindung im Zusammenhang steht und die Lysyl-Carboxygruppe geschützt ist.
Verwendung eines CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 8, wobei die Peptidverbindung ein Dimer von SEQ ID. NO: 4 gemäß der folgenden Formel
umfaßt, worin X Lysin ist und sowohl die α- als auch die ε-Aminogruppen des Lysins mit der Ausbildung einer kovalenten Bindung an den angrenzenden Cystein-Aminosäureresten in Zusammenhang steht.
Polymerer CXCR4-Antagonist, umfassend eine Vielzahl von Peptiden, die kovalent miteinander durch eine Brückengruppe verbunden sind, so daß der polymere CXCR4-Antagonist eine Vielzahl von N-Termini aufweist, wobei die Peptidverbindung ein Dimer von SEQ ID. NO: 4 gemäß der folgenden Formel
umfaßt, worin X Lysin ist und sowohl die α- als auch die ε-Aminogruppen des Lysins mit der Ausbildung einer kovalenten Bindung an den angrenzenden Cystein-Aminosäureresten in Zusammenhang steht.
Verwendung von Polymeren des CXCR4-Antagonisten nach Anspruch 12, wobei der polymere CXCR4-Antagonist SDF-1(1-9[P2G])₂ ist.