DE60034781T2

DE60034781T2 - In vitro verfahren zur induzierung der regulierten pankreatische-hormon produktion in nicht-pankreatischen inselngeweben, damit verbundene pharmazeutische zusammenseztzungen

Info

Publication number: DE60034781T2
Application number: DE60034781T
Authority: DE
Inventors: Sarah Ferber
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: AU5097400A; US8119405B2; ATE361977T1; EP1180143B1; DE60034781D1; CA2371995C; EP1180143A2; WO2000072885A3; US20120329710A1; WO2000072885A2; AU779619B2; WO2000072885A9; JP2003500457A; US20040213769A1; CA2371995A1; US6774120B1; JP2011057716A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein In-vitro-Verfahren zur Einbringung eines pankreatisch endokrinen Phänotyps und eine Funktion, die die Produktion von Pankreashormon in nicht-endokrinem Gewebe einschließt, und insbesondere Verfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung endokriner Erkrankungen.
Das endokrine Pankreas besteht primär aus Inselzellen, die das Peptidhormon Glucagon, Insulin, Somatostatin und pankreatisches Polypeptid synthetisieren und sezernieren. Die Isulingenexpression wird über Steuermechanismen, die teilweise durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden, auf pankreatische β-Inselzellen des Säugetierpankreas beschränkt. In anderen Zellen sind die Gene für Insulin, die anderen pankreatischen Hormone und spezifischen Peptidasen transkriptionell still. Das Homeodomänenprotein PDX-1 (Pankreas- und Duodenal-Homeoboxgen 1, auch bekannt als IDX-1, IPF-1, STF-1 oder IUF-1) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation der Entwicklung und Funktion von pankreatischen Inseln. PDX-1 ist entweder direkt oder indirekt in die inselzellspezifische Expression von verschiedenen Genen involviert ist, wie etwa beispielsweise Insulin, Glucagon, Somatostatin, Proinsulin-Konvertase 1/3 (PC1/3), GLUT-2 und Glucokinase. Zudem vermittelt PDX-1 die Insulingentranskription in Reaktion auf Glucose.
WO 95/05463 beschreibt einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der die Insulinexpression in pankreatischen Inselzellen stimuliert.
Molekular Endocrinology, 11, 1997, S. 883 bis 837, beschreibt die Verwendung eines retroviralen Vektors zur ektopischen Expression von Insulin aus der Leber.
Bei einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptids oder einer Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer pankreas-assoziierten Erkrankung in einem Patienten, der der Produktion von Pankreashormon in einer anderen Zelle als einer endokrinen Zelle bedarf, wobei die Zelle aus Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzellen ausgewählt ist.
Bei einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein In-vitro-Verfabren des Einbringens oder Anreicherns eines pankreatischen Inselzellen-Phänotyps in einer Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle bereit, wie es im unten angegebenen Anspruch 17 beansprucht wird.
Bei einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein In-vitro-Verfahren des Induzierens der Pankreashormonproduktion in einer Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle bereitgestellt, wie es im unten angegebenen Anspruch 18 beansprucht wird.
Bei einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle bereitgestellt, welche Zelle gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, dass die ektopische Expression des Pankreas- und Duodenal-Homeoboxgens 1 (PDX-1) in der Leber die Expression der stillen Pankreashormongene und die Verarbeitungsmaschinerie induziert, die die Prohormone in reife biologisch aktive Hormone umwandelt. Auf diese Wiese können in einem Patienten Pankreashormon-, beispielsweise Insulin-, Glucagon- und Somatostatinpegel induziert werden.
Sofern es nicht anderweitig angegeben ist, weisen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie sie üblicherweise von einen Durchschnittsfachmann im Fachgebiet, dem diese Erfindung angehört, verstanden wird. Im Folgenden werden geeignete Verfahren und Materialien beschrieben, obgleich in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung Verfahren und Materialien verwendet werden können, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung, die den Nachweis von mRNA in Balb/c-Mauslebergewebe für Mausinsulin I (mI-1), Mausinsulin II (mI-2), Humaninsulin, PDX-1 und β-Actin nach Adenovirusbehandlung demonstriert, wie er durch RT-PCR bestimmt wird. Spur 1: keine DNA (negative Kontrolle für PCR); Spuren 2 bis 6: Lebern von mit AdCMV-PDX-1 behandelten Mausen; Spuren 7, 8: Lebern von mit AdCMV-PDX-1 + AdRIP-1-hIns behandelten Mausen; Spuren 9 bis 11: Lebern aus mit AdCMV-PDX-β-gal + AdRIP-1-hIns behandelten Kontrollmäusen; Spuren 12, 13: Lebern von mit AdCMV-hIns behandelten Mausen; Spur 14: normales Mauspankreas.
2 ist eine Darstellung des HPLC-Elutionsprofils von mit Insulin verwandten Peptiden, die aus Mausgewebe extrahiert wurden. Feld A zeigt das Profil aus dem Pankreas einer mit PDX-1 behandelten Maus. Feld B zeigt das Profil aus der Leber einer mit PDX-1 behandelten Maus.
3 ist eine Darstellung, die den Nachweis von mRNA für PDX-1, Somatostatin (Somato), Proinsulin-Konvertase PC1/3 (PC1/3), Glucagon (Glucg) und β-Actin, nachgewiesen durch RT-PCR, demonstriert: Gesamt-RNA extrahiert aus mit PDX-1 und kontrollbehandelten Mäusen wurde unter Verwendung eines PC1/3-spezifischen Primers revers transkribiert. Spuren 1 bis 3: Mause, die mit AdCMV-PDX-1 behandelt wurden; Spur 6: Pankreas; Spur 7: keine cDNA (Kontrolle für PCR).
4 ist eine Darstellung, die demonstriert, dass die ektopische PDX-1-Expression in Mauselebern die STZ-induzierte Hyperglykämie bessert: C57BL/6-Männchen mit 12 bis –13 Wochen wurden mit 220 mg/kg STZ in Citratpuffer behandelt. 36 bis 48 Stunden nach STZ-Behandlung wurde den Mausen AdCMVPDX-1 (n = 15 Mäuse) oder als Kontrolle AdCMVβ-gal (n = 22, jedoch starben 12 nach 3 bis 5 Tagen nach der STZ-Behandlung, zusätzlich starben 3 Mäuse 6 bis 7 Tage nach der STZ-Behandlung) injiziert. Bei Behandlung mit AdCMVPDX-1 trat keine Sterblichkeit auf. Jede Behandlung schloss systemische Injektion von 2 × 10⁹ PFU (Plaque bildende Einheiten) von rekombinantem Adenovirus in 200 μl Kochsalzlösung ein. Die Glucosepegel wurden in Blutproben bestimmt, die aus der Hohlvene gezogen wurden.
5 ist eine Darstellung, die demonstriert, dass die ektopische PDX-Expression in reifen Hepatozyten in Kultur den Insulinpromotor (Ratten-1-Promotor) aktiviert, wobei den Zellen AdRIPhIns kozugeführt wurde. Spur 1: Zellen, die mit AdCMV PDX-1 + AdRIP hIns behandelt wurden; Spur 2: AdCMVβ-Galactosidase + AdRIP hIns, Spur 3: Kontrolle.
6 ist eine Darstellung, die die Induktion der Genexpression von Insulin I und Somatostatin in primären Monoschichtkulturen von fötalen Hepatozyten von Fisher-Ratten (E14) demonstriert. Fötale Hepatozyten wurden an Tag 14 der Schwangerschaft aus Fisher-344-Rattenembryos isoliert und auf mit Collagen bedeckten Gewebekulturschalen ausplattiert. Die Zellen wurden mit AdCMV PDX-1 mit 2 bis 5 MOI (Multiplizität der Infektion = Zahl der Viruspartikel pro Zelle) infiziert. Die Gesamt-RNA wurde 4 Tage nach der viralen Behandlung aus der Kultur extrahiert und durch RT-PCR auf die Somatostatin-Genexpression analysiert. Die RNA wurde wie bei 1 unter Verwendung von Oligo-(dT)₁₅-Primern revers transkribiert und die Amplifizierung durch PCR wurde unter Verwendung von Primern und Bedingungen, wie in Tabelle 1 angegeben, durchgeführt. Spuren 1 bis 3: Proben aus Zellen, die mit PDX-1 behandelt wurden; Spuren 4 bis 6: unbehandelte Proben (Kontrolle); Spur 7: keine DNA. Die PCR-Produkte wurden mit 1,7 % Agarosegelelektrophorese aufgelöst.
7 ist eine Darstellung, die den Effekt von GLUT2 und GK-Überexpression auf die Glucoseregulation von PDX-1, das an die A3/A4-Stelle am Insulin-Promotor bindet, demonstriert. RIN-38-Zellen des Zwischendurchlaufs wurden unbehandelt (Spur 1), mit AdCMV-GLUT2 oder AdCMV-GK (Spuren 3,4) oder mit Kontroll-AdCMV (Spur 5) behandelt studiert. 48 Stunden nach de Virusbehandlungen wurde Kernextrakte präpariert und es wurde unter Verwendung der A3/A4-Sequenzen als Sonden eine EMSA-Analyse durchgeführt. Letzte zwei Spuren: 1 μl an Anti-PDX-1-Antikörper (eine Spende von C. Wright) wurde zu dem Kernextrakt hinzugefügt (+) und blockierte die Komplexbildung. Präimmunserum wurde zum Kernextrakt hinzugefügt (–), der verwendet wurde, um zu identifizieren, dass PDX-1 tatsächlich das Protein ist, das am gegebenen Abschnitt des Insulin-Promotors bindet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, dass die ektopische Expression des Pankreas- und Duodenal-Homeoboxgens 1 (PDX-1) in der Leber einen pankreatischen Inselzellen-Phänotyp in Leberzellen induziert und zur Expression, Produktion und Verarbeitung von Pankreashormonen führt. PDX-1 ist auch als IDX-1, IPF-1, STF-1 oder IUF-1 bekannt, die hierin alle gemeinsam als „PDX" bezeichnet werden. Die Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Pankreaserkrankungen bereit.
Bei ihren verschiedenen Gesichtspunkten und Ausführungsbeispielen schließt die Erfindung das in Kontakt bringen einer Zelle in vitro mit einer Verbindung ein, die die PDX-Expression oder -Aktivität erhöht. Die Verbindung ist ein PDX-Polypeptid oder eine Nukleinsäure, die ein PDX-Polypeptid kodiert. Die Nukleinsäure kann entweder endogen oder exogen sein.
Wie er hierin verwendet wird, soll der Begriff „Nukleinsäure" DNA-Moleküle (beispielsweise cDNA oder genomische DNA), RNA-Moleküle (beispielsweise mRNA), unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugte Analoga der DNA oder RNA und Derivate, Fragmente und Homologe davon einschließen. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure eine DNA. Die Nukleinsäure kann entweder endogen oder exogen sein.
Geeignete Quellen für Nukleinsäuren, die PDX kodieren, schließen beispielsweise die Human-PDX-Nukleinsäure (und die kodierten Proteinsequenzen) ein, die als GenBank Zugriffsnummern U35632 bzw. AAA88820 erhältlich sind. Andere Quellen schließen Ratten-PDX-Nukleinsäure und Proteinsequenzen ein, die als GenBank Zugriffsnummern U35632 bzw. AAA18355 hinterlegt sind. Eine zusätzliche Quelle schließt Zebrafisch-PDX-Nukleinsäure und Proteinsequenzen ein, die als GenBank Zugriffsnummern AF036325 bzw. AAC41260 hinterlegt sind.
Die Verbindung kann dem Patienten entweder direkt (d. h. der Patient wird direkt der Nukleinsäure oder dem die Nukleinsäure enthaltenden Vektor ausgesetzt) oder indirekt (d. h Zellen werden zuerst mit der Nukleinsäure in vitro transformiert, dann in den Patienten transplantiert) verabreicht werden. Beispielsweise können Säugetierzellen aus dem Patienten isoliert und die PDX-Nukleinsäure in vitro in die isolierte Zellen eingebracht werden. Vorzugsweise wird die Zelle in einen autologen Patienten eingebracht. Die Verabreichungswege der Verbindung können beispielsweise parenterale, intravenöse, intradermale, subkutane, orale (beispielsweise Inhalation), transdermale (topisch) transmukosale und rektale Verabreichung einschließen. Die Verbindung kann intravenös verabreicht werden. Vorzugsweise wird die Verbindung unter der Nierenkapsel implantiert oder in die Pfortader injiziert.
Die Zelle kann irgendeine Zelle sein, die in der Lage ist, Pankreashormone zu produzieren, beispielsweise Muskel, Milz, Blut, Haut oder Leber. Bei einem Ausführungsbeispiel ist die Zelle in der Lage, als pankreatische Inselzelle zu fungieren, d. h. nach einem extrazellularem Triggern Pankreashormone, vorzugsweise Insulin, zu speichern, zu verarbeiten und zu sezernieren. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Zelle eine Hepatozyte. Bei zusätzlichen Ausführungsbeispielen ist die Zelle totipotent oder pluripotent. Bei alternativen Ausführungsbeispielen ist die Zelle eine hämopoetische Stammzelle, eine embryonale Stammzelle oder vorzugsweise eine hepatische Stammzelle, mit Ausnahme von menschlichen embryonalen Stammzellen.
Der Patient ist vorzugsweise ein Säugetier. Das Säugetier kann beispielsweise ein Mensch, ein nichtmenschlicher Primat, eine Ratte, ein Hund, eine Katze, ein Pferd oder ein Rind sein.
Verfahren zum Induzieren der Pankreashormonproduktion
Das Medikament der Erfindung kann verwendet werden, um in einem Patienten die Produktion von Pankreashormonen zu induzieren. Beispielsweise kann einem Patienten die Verbindung, die die PDX-Expression oder Aktivität verstärkt, in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um eine Pankreashormonproduktion zu induzieren.
Alternativ kann eine Zelle aus einem Patienten bereitgestellt werden, welche Zelle mit der Verbindung, die die PDX-Expression verstärkt, in einer Menge in Kontakt gebracht wird, die ausreicht, um die Pankreashormonproduktion zu steigern. Diese Zelle kann in einen Patienten eingebracht werden. Die Pankreashormonproduktion erfolgt in vitro und nach Einbringen der Zelle in den Patienten in vivo. Alternativ kann die Pankreashormonproduktion nach Einbringen der Zelle in den Patienten in vivo erfolgen.
Das Pankreashormon kann beispielsweise Insulin, Glucagon, Somatostatin oder Inselamyloid-Polypeptid (IAPP) sein. Insulin kann hepatisches Insulin oder Seruminsulin sein. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Pankreashormon hepatisches Insulin. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel ist das Pankreashormon Seruminsulin (d. h. vollständig aus einem Insulin verarbeitet, das beispielsweise in der Lage ist, die Glucoseverwertung, den Kohlenhydrat-, Fett- und Proteinmetabolismus zu fördern).
Bei einigen Ausführungsbeispielen liegt das Pankreashormon in der „Prohormon"-Form vor. Bei anderen Ausführungsbeispielen liegt das Pankreashormon in der vollständig verarbeiteten biologisch aktiven Form des Hormons vor. Das Pankreashormon kann regulatorischer Kontrolle unterliegen, d. h. die Sekretion des Hormons unterliegt ernährungsbedingter und hormoneller Kontrolle, ähnlich den endogen produzierten Hormonen. Beispielsweise kann das Hormon der regulatorischen Kontrolle von Glucose unterliegen.
Die Zellpopulation, die der Verbindung ausgesetzt wird, d. h. damit in Kontakt gebracht wird, kann irgendeine Zahl von Zellen sein, d. h. eine oder mehrere Zellen, und kann in vitro, in vivo oder ex vivo bereitgestellt werden.
Medikamente zur Behandlung oder zum Verhindern von Pankreaserkrankungen
Das Medikament kann zur Behandlung, d. h. Verhindern oder Verzögern des Ausbruchs von Pankreaserkrankungen in einem Patienten verwendet werden. Die Verbindung kann die PDX-Expression oder -Aktivität modulieren. Mit „modulieren" ist gemeint, dass es die Zunahme oder die Abnahme der PDX-Expression oder -Aktivität einschließt. Vorzugsweise führt die Modulation zu einer Änderung der Expression oder Aktivität von PDX in einem Patienten auf einen Pegel ähnlich oder identisch einer Person, die nicht an der Pankreaserkrankung leidet. Nachdem sie dem Patienten verabreicht ist, induziert die Verbindung eine nicht-pankreatische Zelle mit einer pankreatischen Inselzellenfunktion, beispielsweise in der Lage zu sein, Insulin, Somatostatin oder Glucagon zu exprimieren. Die Verbindung kann die PDX-Expression oder -Aktivität modulieren.
Die Pankreaserkrankung kann jede mit dem Pankreas assoziierte Erkrankung sein. Beispielsweise kann das Medikament bei der Behandlung von pankreatischem Hormonmangel (Beispielsweise Diabetes), Insulinom und Hyperglykämie sinnvoll sein. Im Wesentlichen würde jede Erkrankung, die ursächlich mit der PDX-Aktivität verknüpft ist, als der Behandlung zugänglich erachtet werden.
Die hierin beschriebenen PDX-modulierenden Verbindungen werden hierin, wenn sie therapeutisch verwendet werden, als „Therapeutika" bezeichnet. Verfahren zur Verabreichung von Therapeutika schließen intradermale, intramuskulare, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Wege ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Therapeutika der vorliegenden Erfindung können durch jeden zweckdienlichen Weg verabreicht werden, beispielsweise durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Aufnahme über die epitheliale oder mukokutane Auskleidung (beispielsweise Mundschleimhaut, Rektumschleimhaut und Darmschleimhaut etc.), und kann zusammen mit anderen biologisch aktiven Wirkstoffen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Zudem kann es vorteilhaft sein, das Therapeutikum durch irgendeinen geeigneten Weg im zentralen Nervensystem zu verabreichen, einschließlich intraventrikularer und intrathekales Injektion. Die intraventrikulare Injektion kann durch einen Intraventrikularkatheter erleichtert werden, der an einem Reservoir (beispielsweise einem Ommaya-Reservoir) angebracht ist. Zudem kann eine pulmonale Verabreichung unter Verwendung eines Inhalators oder Verneblers und Formulierung mit einem Verneblungsmittel eingesetzt werden. Es kann auch wünschenswert sein, das Therapeutikum lokal am behandlungsbedürftigen Gebiet zu verabreichen; dies kann beispielsweise durch lokale Infusion während einer Operation, topische Applikation, durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Suppositoriums oder mittels eines Implantats, erreicht werden, ohne es darauf zu beschränken. Es sind verschiedene Zuführungssysteme bekannt und können verwendet werden, um ein Therapeutikum der vorliegenden Erfindung zu verabreichen, beispielsweise: (i) Einkapseln in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln; (ii) rekombinante Zellen, die in der Lage sind, das Therapeutikum zu exprimieren; (iii) rezeptorvermittelte Endozytose (siehe beispielsweise Wu und Wu, 1987, J Biol Chem 262: 4429-4432); (iv) Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen, adenoviralen oder anderen Vektors und dergleichen.
Das Therapeutikum kann in einem Vesikel, insbesondere in einem Liposom, zugeführt werden. In einem Liposom wird das Protein, zusätzlich zu anderen pharmazeutisch zulässigen Trägern, mit amphipatischen Wirkstoffen kombiniert, wie etwa Lipiden, die in wässrigen Lösungen in aggregierter Form als Mizellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristallen oder lamellaren Schichten existieren. Geeignete Lipide zur liposomalen Formulierung schließen ohne Einschränkung Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen ein. Die Herstellung solcher liposomaler Formulierungen liegt innerhalb des Niveaus der Fertigkeiten im Fachgebiet, wie sie beispielsweise im US-Patent Nr. 4,837,028 und US-Patent Nr. 4,737,323 offenbart sind, die jeweils hierin durch Inbezugnahme übernommen werden. Alternativ kann das Therapeutikum in einem System zur kontrollierten Freisetzung zugeführt werden, beispielsweise über eine Zuführungspumpe (siehe beispielsweise Saudek et al., 1989. New Engl J Med 321: 574) und ein semipermeables polymeres Material (siehe beispielsweise Howard et al., 1989. J Neurosurg 71: 105). Zudem kann das System zur kontrollierten Freisetzung in der Umgebung des therapeutischen Ziels (beispielsweise dem Hirn) platziert werden, wodurch lediglich ein Teil des systemischen Dosis benötigt wird (siehe beispielsweise Goodson, in Medical Applications of Controlled Release 1984, CRC Press, Bocca Raton, FL).
Wenn das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, die ein Protein kodiert, kann die therapeutische Nukleinsäure, um die Expression des kodierten Proteins zu fördern, dadurch in vivo verabreicht werden, dass sie als Teil eines geeigneten Nukleinsäure-Expressionsvektors konstruiert und dieser so verabreicht wird, dass er intrazellular wird, beispielsweise unter Verwendung eines retroviralen Vektors durch direkte Injektion, unter Verwendung von Mikropartikelbeschuss, durch Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch dessen Verabreichen in Verknüpfung mit einem homeoboxartigen Peptid, das dafür bekannt ist, in de Kern einzudringen (siehe beispielsweise Joliot et al., 1991. Proc Natl Acad Sci USA 88: 1864-1868) und dergleichen. Alternativ kann ein Nukleinsäure- Therapeutikum zur Expression intrazellular und in der Wirtszellen-DNA eingebaut eingebracht werden, durch homologe Rekombination oder episomal verbleiben.
Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge einer jeden aktiven Komponente der pharmazeutischen Zusammensetzung, die ausreicht, um einen bedeutenden Patientennutzen zu zeigen, d. h. eine Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Besserung des relevanten medizinischen Zustands oder eine Steigerung des Grads der Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Besserung solcher Zustände. Wenn er auf einen einzelnen aktiven Bestandteil, allein verabreicht, angewendet wird, bezieht sich der Begriff auf den Bestandteil alleine. Wenn er auf eine Kombination angewendet wird, bezieht sich der Begriff auf kombinierte Mengen der aktiven Bestandteile, die zu einer therapeutischen Wirkung führen, ob in Kombination, der Reihe nach oder gleichzeitig verabreicht.
Die Menge des Therapeutikums der Erfindung, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder Erkrankung wirksam ist, wird von der Natur der Störung oder Erkrankung abhängen und kann durch einen Durchschnittsfachmann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Zudem können wahlweise In-vitro-Tests eingesetzt werden, um die optimalen Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die bei der Formulierung einzusetzende präzise Dosis wird auch vom Weg der Verabreichung und von der allgemeinen Ernsthaftigkeit der Erkrankung oder Störung abhängen und sollte gemäß der Beurteilung des Praktikers und der jeweiligen Patientenumstände festgesetzt werden. Schließlich wird der behandelnde Arzt die Menge an Protein festsetzen, mit dem jeder einzelne Patient zu behandeln ist. Zunächst wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen an Protein verabreichen und die Ansprechverhalten des Patienten beobachten. Es können größere Dosen an Protein verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erhalten wird, und an diesem Punkt wird die Dosis nicht weiter erhöht. Geeignete Dosisbereiche zur intravenösen Verabreichung des Therapeutikums der vorliegenden Erfindung beragen allerdings im Allgemeinen etwa 20 bis 500 Mikrogramm (μg) an aktiver Verbindung pro Kilogramm (kg) Körpergewicht. Geeignete Dosisbereiche zur intranasalen Verabreichung betragen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Wirkungs-Kurven extrapoliert werden, die aus In-vitro- oder Tiermodell-Testsystemen abgeleitet werden. Suppositorien enthalten den Bestandteil im Allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 10 Gewichtsprozent; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10 % bis 95 % aktiven Bestandteil.
Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung des Therapeutikums der vorliegenden Erfindung wird in Abhängigkeit von der Schwere der behandelten Krankheit und des Zustands und der potentiellen ideosynkratischen Reaktion eines jeden einzelnen Patienten variieren. Es ist vorgesehen, dass die Dauer einer jeden Anwendung des Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegen wird. Schließlich wird der behandelnde Arzt über die geeignete Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung entscheiden.
Die Zellen können auch ex vivo in der Gegenwart von therapeutischen Wirkstoffen oder Proteinen der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, um eine gewünschte Wirkung an oder Aktivität in solchen Zellen zu vermehren oder zu erzeugen. Die behandelten Zellen können dann zu therapeutischen Zwecken in vivo eingebracht werden.
In-vitro-Verfahren zum Induzieren eines Inselzell-Phänotyps
Die Erfindung beinhaltet zudem ein In-vitro-Verfahren des Induzierens oder Anreicherns eines pankreatischen Inselzell-Phänotyps in einer Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle. Das Verfahren beinhaltet das in Kontakt bringen der Zelle mit der Verbindung in einer Menge, die ausreicht, um den pankreatischen Inselzell-Phänotyp zu induzieren oder anzureichern, beispielsweise Beta-, Alpha- und Delta-Inselzellen. Vorzugsweise erhöht die Verbindung die PDX-Expression, -Produktion oder -Aktivität. Vorzugsweise induziert das Verfahren einen pankreatischen β-Inselzell-Phänotyp.
Mit „pankreatischer Inselzell-Phänotyp" ist gemeint, dass die Zelle eine oder mehrere Eigenschaften zeigt, die für pankreatische Inselzellen typisch sind, beispielsweise Hormonproduktion, -verarbeitung, -speicherung in Sekretgranula, nahrungsbedingte und hormonell regulierte Sekretion oder ein charakteristisches Inselzell-Genexpressionsprofil. Der pankreatische Inselzell-Phänotyp kann beispielsweise durch Messung der Produktion von Pankreashormon, beispielsweise Insulin, Somatostatin oder Glucagon, bestimmt werden. Die Hormonproduktion kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise Immunoassay, Westernblot, Rezeptorbindungstests oder funktionell durch die Fähigkeit, nach Implantation in einen diabetischen Wirt Hyperglykämie zu verbessern.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist die Zelle in der Lage, als eine pankreatische Inselzelle zu fungieren, d. h. Pankreashormone zu speichern, verarbeiten und zu sezernieren, vorzugsweise Insulin nach extrazellulärem Triggern. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Zelle eine Hepatozyte, d. h. eine Leberzelle. Bei zusätzlichen Ausführungsbeispielen ist die Zelle totipotent oder pluripotent. Die Zellen sind keine menschlichen embryonalen Zellen.
Die Zellpopulation, die der Verbindung ausgesetzt wird, d. h. damit in Kontakt gebracht wird, kann irgendeine Anzahl von Zellen sein, d. h. eine oder mehrere Zellen.
Induzieren eines Pankreasinsel-Genexpressionsprofils
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch zum Induzieren oder Anreichern eines Pankreasinsel-Genexpressionsprofil in einem Patienten oder in einer Zelle. Mit „Pankreas-Genexpressionsprofil" ist gemeint, dass ein oder mehrere Gene enthalten sind, die normalerweise transkriptionell still sind in nicht-endokrinem Gewebe, beispielsweise PC1/3, Insulin, Glucagon oder Somatostatin. Das Medikament kann einem Patienten in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um ein Pankreasinsel- oder endokrines Genexpressionsprofil zu induzieren. Das Medikament kann in einem Patienten eine PC1/3-Genexpression induzieren.
Die Induktion des Pankreasinsel-Genexpressionsprofils kann unter Verwendung von Techniken nachgewiesen werden, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Beispielsweise können Pankreashormon-RNA-Sequenzen mit z. B. Northernblot-Hybridisierungsanalysen, mit auf Amplifizierung beruhenden Nachweisverfahren, wie etwa auf reverser Transkription beruhender Polymerase-Kettenreaktion, oder systemischem Nachweis durch Mikroarraychipanalyse nachgewiesen werden. Alternativ kann die Expression auch auf dem Proteinniveau nachgewiesen werden, beispielsweise durch Messen der Pegel von Polypeptiden gemessen werden, die durch diese Gene kodiert werden. Die PC1/3-Gen- oder Proteinexpression kann durch ihre Aktivität bei der Verarbeitung von Prohormonen zu ihrer aktiven reifen Form nachgewiesen werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und schließen beispielsweise Immunoassays, die auf Antikörpern gegen Proteine beruhen, die durch die Gene kodiert werden, oder HPLC der verarbeiteten Prohormone ein.
Verfahren zum Identifizieren von durch PDX modulierten Genen
Nukleinsäuren, die durch PDX moduliert werden, können durch Messen der Expression einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einer Testzellpopulation nachgewiesen werden, die einer Verbindung ausgesetzt ist, die die PDX-Aktivität oder -Expression moduliert. Die Expression der Nukleinsäuresequenzen in der Testzellpopulation wird dann mit der Expression der Nukleinsäuresequenzen in einer Referenzzellpopulation verglichen, welches eine Zellpopulation ist, die der Verbindung nicht ausgesetzt worden ist, oder eine Zellpopulation ist, die der Verbindung ausgesetzt wurde. Der Vergleich kann an Test- und Referenzproben durchgeführt werden, die gleichzeitig oder zu zeitlich unterschiedlichen Zeiten gemessen werden. Ein Beispiel für Letzteres ist die Verwendung von kompilierter Expressionsinformation, beispielsweise eine Sequenzdatenbank, die Information über die Expressionspegel von bekannten Sequenzen nach Verabreichung von verschiedenen Wirkstoffen sammelt. Beispielsweise kann die Änderung des Expressionspegels nach Verabreichung eines Verbindung mit den Veränderungen der Expression verglichen werden, die bei den Nukleinsäuresequenzen nach Verabreichung eines Kontrollwirkstoffs, wie etwa PDX, beobachtet werden.
Eine Änderung der Expression der Nukleinsäuresequenz in der Zellpopulation im Vergleich zur Expression der Nukleinsäuresequenz in der Referenzzellpopulation, die der Verbindung nicht ausgesetzt worden ist, zeigt an, dass die Expression der Nukleinsäure durch PDX moduliert wird.
Die Testzelle kann irgendeinem Gewebe entnommen werden, das in der Lage ist, durch PDX moduliert zu werden, beispielsweise Pankreas, Leber, Milz oder Niere. Die Zelle kann aus nicht-endokrinem Gewebe stammen. Vorzugsweise ist die Zelle Lebergewebe.
Vorzugsweise werden Zellen in der Referenzzellpopulation aus einem soweit als möglich gleichen Gewebetyp wie die Testzelle gewonnen, beispielsweise Lebergewebe. Die Kontrollzelle kann aus dem gleichen Patienten wie die Testzelle stammen, beispielsweise aus einem Bereich in der Nähe des Bereichs des Ursprungs der Testzelle. Alternativ kann die Kontrollzellpopulation aus einer Datenbank für molekulare Information stammen, die aus Zellen abgeleitet wurde, für die der getestete Parameter oder Zustand bekannt ist.
Die Expression der Nukleinsäuren kann auf dem RNA-Niveau unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren gemessen werden. Beispielsweise kann die Northern-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung von Sonden, die eine oder mehrere dieser Sequenzen erkennen verwendet werden, um die Genexpression festzustellen. Alternativ kann die Expression unter Verwendung von auf reverser Transkription beruhender PCR-Tests gemessen werden. Die Expression kann auch auf dem Proteinniveau gemessen werden, beispielsweise durch Messen der Pegel von Polypeptiden, die durch die Genprodukte kodiert werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und schließen beispielsweise Immunoassays ein, die auf Antikörpern für Proteine beruhen, die durch die Gene kodiert werden.
Wenn Änderungen in der Genexpression mit der Genamplifikation oder -Deletion verbunden sind, können Sequenzvergleiche in Test- und Referenzpopulationen durch Vergleichen relativer Mengen an untersuchten DNA-Sequenzen in den Test- und Referenzpopulationen durchgeführt werden.
Rekombinante PDX-Expressionsvektoren und Wirtszellen
Bei einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Medikament nach dem unten angegebenen Anspruch 16 bereitgestellt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, mit der sie verknüpft ist. Der Vektor ist ein viraler Vektor (beispielsweise replikationsdefekte Retroviren, Adenviren und adeno-assoziierte Viren), wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden. Bestimmte Vektoren sind zu autologer Replikation in einer Wirtszelle in der Lage, in die sie eingebracht wurden (beispielsweise Bakterienvektoren, die einen bakteriellen Replikationsursprung haben und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (beispielsweise nichtepisomale Säugetiervektoren) werden nach Einbringung in eine Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle eingebaut und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen zu steuern, mit denen sie funktionell verknüpft sind. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Der virale Vektor ist in der Lage, auf einen bestimmten Zelltyp, ausgewählt aus Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut oder Leberzelle, entweder spezifisch oder nichtspezifisch abzuzielen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure, die ein PDX-Polypeptid in einer Form kodiert, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen enthalten, die auf der Grundlage der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt sind, die funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft ist. Im Rahmen eines rekombinanten Expressionsvektors soll „funktionell verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der (den) regulatorischen Sequenz(en) in einer Art und weise verknüpft ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht wird (beispielsweise in einem In-vitro-Transkriptions/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerelemente einschließen (beispielsweise Polyadenylierungssignale). Solche regulatorischen Sequenzen werden beispielsweise bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und jene, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in einer bestimmten Wirtszelle steuern (beispielsweise gewebespezifische regulatorische Sequenzen). Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass der Entwurf des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionspegel des gewünschten Proteins etc. abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide herzustellen, einschließlich Fusionsproteine oder -peptide, die durch Nukleinsäuren kodiert werden, wie hierin beschrieben (beispielsweise PDX-Proteine, mutante Formen von PDX, Fusionsproteine etc.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können zur Expression von PDX in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen entworfen werden. Beispielsweise kann PDX in Bakterienzellen, wie etwa E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden darüber hinaus bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert werden, beispielsweise unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird häufig in E. coli mit Vektoren ausgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression entweder von Fusionsproteinen oder von Nichtfusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen an ein darin kodiertes Protein eine Anzahl von Aminosäuren an, üblicherweise am Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: (1) um die Expression von rekombinanten Proteinen zu steigern, (2) um die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu steigern und (3) um bei der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als ein Ligand bei der Affinitätsreinigung zu helfen. Häufig wird bei Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltungsstelle an der Verbindungsstelle des Fusionsteils und des rekombinanten Proteins eingefügt, um die Abtrennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsteil im Anschluss an die Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein. Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith und Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) ein, die jeweils Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-Bindungsprotein oder Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nichtfusions-Expressionsvektoren aus E. coli schließen pTrc (Amrann et al., Gene 69: 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89) ein.
Eine Strategie, um die rekombinante Proteinexpression in E. coli zu maximieren, ist, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer beeinträchtigten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins zu exprimieren, siehe Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Eine andere Strategie ist es, die Nukleinsäuresequenz der Nukleinsäure, die in einen Expressionsvektor einzufügen ist, so zu ändern, dass die einzelnen Kodons für die jeweilige Aminosäure jene sind, die in E. coli bevorzugt eingesetzt werden (Wada et al., (1992) Nucleic Acid Res. 20: 2111-2118). Solch eine Änderung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kann durch Standard-DNA-Synthesetechniken ausgeführt werden.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist der PDX-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae schließen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schulz et al., (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) und picZ (In Vitrogen Corp, San Diego, Calif.) ein.
Alternativ kann PDX in Inselzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Zur Expression von Proteinen in kultivierten Inselzellen (beispielsweise SF9-Zellen) erhältliche Baculovirus-Vektoren schließen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39) ein.
Die Nukleinsäure der Erfindung kann in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektors exprimiert werden. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufan et al. (1987) EMBO J 6: 187-195). Wenn sie in Säugetierzellen verwendet werden, wird die Kontrollfunktion des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Beispielsweise sind üblicherweise verwendete Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian-Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe beispielsweise die Kapitel 16 und 17 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (beispielsweise werden gewebespezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nichtlimitierende Beispiele geeigneter gewebespezifischer Promotoren schließen den Albumin-Promotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1: 268-277), lymphoidspezifische Promotoren (Calme und Eaton (1988) Adv Immunol 43: 325-275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J 8: 729-733) und Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (beispielsweise den Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916) und brustdrüsenspezifische Promotoren (beispielsweise den Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4,873,316 und die europäische Patentanmeldung Nr. 264166). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls umfasst, beispielsweise Maus-hox-Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev 3: 537-546).
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist mit einer regulatorischen Sequenz auf solche Art und Weise funktionell verknüpft, dass die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls ermöglicht wird, das zur PDX-mRNA antisense ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionell mit einer in Antisense-Richtung klonierten Nukleinsäure verknüpft sind und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, beispielsweise können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in welchen Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen siehe Weintraub et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung eingebracht worden ist. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es versteht sich von selbst, dass diese Begriffe nicht nur eine bestimmte Patientenzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Weil bei aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen tatsächlich nicht unbedingt mit der Mutterzelle identisch, sind aber noch im Umfang des Begriffs, wie er hierin verwendet wird, enthalten. Zudem können die Wirtszellen moduliert werden, wenn sie einmal PDX exprimieren, und können entweder ihre ursprünglichen Eigenschaften behalten oder verlieren.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann ein PDX-Protein in Bakterienzellen, wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie etwa Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Alternativ kann eine Wirtszelle eine unreife Säugetierzelle, d. h. eine pluripotente Stammzelle. Eine Wirtszelle kann auch aus anderem menschlichen Gewebe gewonnen werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.
Vektor-DNA kann über herkömmliche Transformations-, Transduktions-, Infektions- oder Transfektionsverfahren in prokaryotische oder eukaryotische Zelleneingebracht werden. Die Begriffe „Transformation", „Transduktion", „Infektion" und „Transfektion", wie sie hier verwendet werden, sollen sich auf eine Vielzahl von im Fachgebiet bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (beispielsweise DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Kopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Zudem kann die Transfektion durch ein Transfektionsmittel vermittelt werden. Mit „Transfektionsmittel soll irgendeine Verbindung umfasst sein, die den Einbau von DNA in die Wirtszelle vermittelt, beispielsweise Liposom. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen können bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) und in anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
Die Transfektion kann „stabil" (d. h. Einbau der fremden DNA in das Wirtsgenom) oder „transient" (d. h. DNA wird in der Wirtszelle episomal exprimiert) sein.
Es ist für die stabile Transfektion von Säugetierzellen bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik nur ein kleiner Anteil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom einbaut, der Rest der DNA bleibt episomal. Um diese Bestandteile zu identifizieren und zu selektieren, wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Verschiedene selektierbare Marker umfassen jene, die eine Resistenz gegen Medikamente verleihen, wie etwa G418, Hygromycin und Methotrexat. Die Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker kodiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der PDX kodiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert wurden, können durch Medikamentenselektion identifiziert werden (beispielsweise werden Zellen, die das selektierbare Markergen eingebaut haben, überleben, während die anderen Zellen absterben). Die durch PDX modulierten Zellen oder die tranfizierten Zellen können durch die Induktion der Expression eines endogenen Reportergens identifiziert werden. Der Promotor kann der Insulin-Promotor sein, der die Expression von grün fluoreszierendem Protein steuert.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist die PDX-Nukleinsäure in einem viralen Vektor vorhanden. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die PDX-Nukleinsäure in einem Virus eingekapselt. Bei einigen Ausführungsbeispielen infiziert das Virus vorzugsweise pluripotente Zellen verschiedener Gewebetypen, beispielsweise hämatopoetische Stammzellen, neuronale Stammzellen, hepatische Stammzellen oder embryonale Stammzellen, vorzugsweise ist das Virus hepatotrop. Mit „hepatotrop" ist gemeint, dass das Virus die Fähigkeit besitzt, bevorzugt die Zellen der Leber entweder spezifisch oder nichtspezifisch anzugreifen. Bei weiteren Ausführungsbeispielen ist das Virus ein moduliertes Hepatitisvirus, SV-40 oder Epstein-Barr-Virus. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Virus ein Adenovirus.
Gentherapie
Eine Nukleinsäure oder Nukleinsäuren, die ein PDX-Polypeptid oder funktionelle Derivate davon kodiert bzw. kodieren, kann mittels Gentherapie verabreicht werden. Gentherapie bezieht sich auf eine Therapie, die dadurch ausgeführt wird, dass einem Patienten eine spezielle Nukleinsäure verabreicht wird. Die Nukleinsäure produziert ihr kodiertes Peptid bzw. ihre kodierten Peptide, die dann dazu dienen, durch Modulieren der Funktion einer zuvor genannten Erkrankung oder Störung, beispielsweise Diabetes, eine therapeutische Wirkung auszuüben. Es kann irgendeine der innerhalb des Fachgebiets verfügbaren, die Gentherapie betreffenden Methodiken eingesetzt werden, siehe beispielsweise Goldspiel et al., 1993, Clin Pharm 12; 488-505.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst das Medikament der Erfindung eine Nukleinsäure, die ein Teil eines Expressionsvektors zum Exprimieren des zuvor genannten PDX-Polypeptids innerhalb eines geeigneten Wirts ist. Bei einem speziellen Ausführungsbeispiel besitzt solch eine Nukleinsäure einen Promotor, der funktionell mit kodierenden Bereichen eines PDX-Polypeptids verknüpft ist. Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv und wahlweise gewebespezifisch sein. Der Promotor kann beispielsweise viralen oder Säugetierursprung besitzen. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird ein Nukleinsäuremolekül verwendet, bei dem kodierende Sequenzen (und irgendwelche anderen gewünschten Sequenzen) von Bereichen flankiert werden, die die homologe Rekombination an einer gewünschten Stelle innerhalb des Genoms fördern, wodurch für die intrachromosomale Expression von Nukleinsäuren gesorgt wird, siehe beispielsweise Koller und Smithies, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86; 8932-8935. Die Nukleinsäure, die zugeführt wird, kann episomal bleiben und ein endogenes und ansonst stilles Gen induzieren.
Die Zuführung der therapeutischen Nukleinsäure in einen Patienten kann entweder direkt (d. h. der Patient wird der Nukleinsäure oder dem die Nukleinsäure enthaltenden Vektor direkt ausgesetzt) oder indirekt (d. h. Zellen werden zuerst in vitro mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht, dann in den Patienten transplantiert) erfolgen. Diese zwei Vorgehensweisen sind jeweils als In-vivo- oder Ex-vivo-Gentherapie bekannt. Die Nukleinsäure kann zur direkten Verabreichung in vivo vorliegen, wobei sie exprimiert wird, um das kodierte Produkt zu exprimieren. Dies kann durch irgendeines von zahlreichen im Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt werden, die das Konstruieren der Nukleinsäure als Teil eines geeigneten Nukleinsäure-Expressionsvektors und Verabreichen desselben auf eine Art und Weise, so dass es intrazellular wird (beispielsweise durch Infektion unter Verwendung eines defekten oder abgeschwächten Retrovirus oder eines anderen viralen Vektors, siehe das US-Patent Nr. 4,980,286 ), direktes Injizieren nackter DNA, Verwendung von Mikropartikelbeschuss (beispielsweise „Gene Gun^®", Biolistic, DuPont), Beschichten der Nukleinsäuren mit Lipiden, Verwenden assoziierter Zelloberflächenrezeptoren/Transfektionsmitteln, Einkapseln in Liposomen, Mikropartikeln oder Mikrokapseln, Verabreichung in Verknüpfung mit einem Peptid, das dafür bekannt ist, in den Kern einzudringen, oder Verabreichung in Verknüpfung mit einem Liganden, der für rezeptorvermittelte Endozytose prädisponiert ist (siehe beispielsweise Wu und Wu, 1987, J Biol Chem 262: 4429-4432), die verwendet werden kann, um auf Zelltypen abzuzielen, die spezifisch die Rezeptoren von Interesse exprimieren, etc. einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Eine weitere Vorgehensweise zur Gentherapie umfasst das Transferieren eines Gens in eine Zelle in In-vitro-Gewebekultur durch solche Verfahren, wie etwa Elektroporation, Lipofektion, durch Calziumphosphat vermittelte Transfektion, virale Infektion oder dergleichen. Im Allgemeinen schließt die Transfermethodik die gleichzeitige Übertragung eines selektierbaren Markers auf die Zelle ein. Die Zellen werden dann unter Selektionsdruck gesetzt (beispielsweise antibiotische Resistenz), so dass die Isolierung jener Zellen erleichtert wird, die das transferierte Gen aufgenommen haben und dieses exprimieren. Diese Zellen werden dann einem Patienten zugeführt.
Vor der In-vivo-Verabreichung der sich ergebenden rekombinanten Zelle kann die Nukleinsäure durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren in eine Zelle eingebracht werden, die Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem die Nukleinsäuresequenz von Interesse enthaltenden viralen oder Bakteriophagenvektor Zellfusion, durch Chromosomen vermittelter Gentransfer, durch Mikrozellen vermittelter Gentransfer, sphäroplastische Fusion und ähnliche Methodiken, die sicherstellen, dass die nötigen Entwicklungs- und physiologischen Funktionen der Empfängerzellen nicht durch den Transfer gestört werden, einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Die gewählte Technik sollte für einen stabilen Transfer der Nukleinsäure in die Zelle sorgen, so dass die Nukleinsäure durch die Zelle exprimierbar ist. Vorzugsweise ist die transferierte Nukleinsäure durch den Zellnachkommen erblich und exprimierbar. Alternativ kann die transferierte Nukleinsäure episomal bleiben und die Expression der sonst stillen endogenen Nukleinsäure induzieren.
Die sich ergebenden rekombinanten Zellen können einem Patienten durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren zugeführt werden, die Injektion von Epithelialzellen (beispielsweise subkutan), Anwendung von rekombinanten Hautzellen als ein Hauttransplantat am Patienten und intravenöse Injektion von rekombinanten Blutzellen (beispielsweise hämatopoetische Stamm- oder Progenitorzellen) oder Leberzellen. Die Gesamtmenge an Zellen, die zur Verwendung vorgesehen sind, hängt von der gewünschten Wirkung, dem Patientenstatus und dergleichen ab und kann durch einen Fachmann bestimmt werden.
Zellen, in denen eine Nukleinsäure zum Zweck der Gentherapie eingebracht werden kann, umfassen irgendeinen gewünschten, zugänglichen Zelltyp und kann xenogen, heterogen, syngen oder autogen sein. Die Zelltypen schließen ausdifferenzierte Zellen, wie etwa Epithelialzellen, Endothelialzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatozyten und Blutzellen oder verschiedene Stamm- oder Progenitorzellen, insbesondere nichtembryonale Herzmuskelzellen, Leberstammzellen (Internationales Patent WO 94/08598 ), neuronale Stammzellen (Stemple und Anderson, 1992, Cell 71: 973-985), hämatopoetische Stamm- oder Progenitorzellen, beispielsweise wie sie aus Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut, fötaler Leber und dergleichen erhalten werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die zur Gentherapie eingesetzten Zellen können vorzugsweise autolog zum Patienten sein.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Die Verbindung, d. h. ein erfindungsgemäßes PDX-Polypeptid oder eine Nukleinsäure, die ein PDX-Polypeptid kodiert (hierin auch als „aktive Verbindungen" bezeichnet), kann in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet werden, die zur Verabreichung geeignet sind. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nukleinsäuremolekül oder das Protein und einen pharmazeutisch zulässigen Träger. Wie er hierin verwendet wird, soll „pharmazeutisch zulässiger Träger" irgendeines und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antimykotischen Wirkstoffe, isotonischen und absorptionsverzögernden Mittel und dergleichen einschließen, die mit der pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Geeignete Träger werden in der neuesten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, einem Standardreferenztext im Fachgebiet, beschrieben. Bevorzugte Beispiele solcher Träger oder Verdünnungsmittel schließen Wasser, Kochsalzlösung, Fingers-Lösung, Dextroselösung und 5 %-iges menschliches Serumalbumin ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Liposomen und nichtwässrige Vehikel, wie etwa Fettöle, können ebenso verwendet werden. Die Verwendung solcher Medien und Wirkstoffe für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Fachgebiet wohlbekannt. Insoweit nicht irgendein herkömmliches Medium oder Mittel inkompatibel mit der aktiven Verbindung ist, wird deren Verwendung in der Zusammensetzung ins Auge gefasst. Zudem können zusätzliche aktive Verbindungen in die Zusammensetzung aufgenommen werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wird so formuliert, dass sie mit dem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispiele für Verabreichungswege schließen parenterale, beispielsweise intravenöse, intradermale, subkutane, orale (beispielsweise Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung ein. Lösungen oder Suspensionen, die parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung verwendet werden, können die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, Fettöle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel, antibakterielle Wirkstoffe, wie etwa Benzylalkohol oder Methylparabene, Antioxidantien, wie etwa Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, Chelatbildner, wie etwa Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer, wie etwa Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie etwa Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen, wie etwa Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Die parenterale Zusammensetzung kann in Ampullen, Wegwerfspritzen oder Mehrfachdosisfläschchen enthalten sein, die aus Glas oder Kunststoff gefertigt sind.
Zur Injektionsanwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen schließen sterile wässrige Lösungen (wo wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Puder für die provisorische Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Für die intravenöse Verabreichung schließen geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, N. J.) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte dermaßen flüssig sein, dass eine leichte Spritzfähigkeit besteht. Es sollte unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die Kontaminationswirkung von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien und Pilzen, bewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon enthält. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung, wie etwa, Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall der Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Wirkstoffe, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, erreicht werden. In vielen Fällen wird es zweckmäßig sein, isotonische Mittel in der Zusammensetzung zu enthalten, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie etwa Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid. Eine anhaltende Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann dadurch bewirkt werden, dass in der Zusammensetzung ein Mittel enthalten ist, das die Absorption verzögert, beispielsweise Aluminiummonostereat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Aufnahme der aktiven Verbindung (beispielsweise ein PDX-Polypeptid oder eine PDX kodierende Nukleinsäure) in der erforderlichen Menge eines geeigneten Lösungsmittels mit einem Bestandteil oder einer Kombination von Bestandteilen, die oben aufgezählt wurden, wenn erforderlich, gefolgt von Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Aufnahme der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen oben aufgezählten Bestandteile enthält. Im Fall steriler Puder zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind Verfahren zur Herstellung das Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, die einen Puder der aktiven Bestandteile plus irgendeinen zusätzlichen gewünschten Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergibt.
Orale Zusammensetzungen beinhalten im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen genießbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen werden oder in Tabletten gepresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Trägersubstanzen aufgenommen werden und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch unter Verwendung eines flüssigen Trägers zur Verwendung als Mundwasser hergestellt werden, wobei die Verbindung im flüssigen Träger oral angewendet und bewegt und ausgespuckt oder geschluckt wird. Als Teil der Zusammensetzung können pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Hilfsmaterialien enthalten sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen kann irgendeine der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel, wie etwa mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine, einen Arzneiträger, wie etwa Stärke oder Laktose, ein Sprengmittel, wie etwa Alginsäure, Primogel oder Maisstärke, ein Schmiermittel, wie etwa Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie etwa kolliadales Siliziumdioxid, einen Süßungsmittel, wie etwa Sucrose oder Saccharin, oder einen Aromastoff, wie etwa Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosolsprays aus einem unter Druck stehenden Behälter oder Spender, der ein geeignetes Treibmittel enthält, beispielsweise ein Gas, wie etwa Kohlendioxid, oder einem Vernebler zugeführt.
De systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden für die zu durchdringende Barriere geeignete Durchdringungsmittel in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringungsmittel sind im Allgemeinen im Fachgebiet bekannt und schließen beispielsweise zur transmukosalen Verabreichung Tenside, Gallensalze und Fusidinsäurederivate ein. Die transmukosale Verabreichung kann durch die Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien bewerkstelligt werden. Zur transdermalen Verabreichung wird die aktive Verbindung in Salben, Balsame, Gele oder Cremes formuliert, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Die Verbindungen können auch in der Form von Suppositorien (beispielsweise mit herkömmlichen Suppositoriengrundlagen, wie etwa Kakaobutter und andere Glyceride) oder Bleibeklistiere zur rektalen Verabreichung hergestellt werden.
Bei einem Ausführungsbeispiel werden die aktiven Verbindungen mit Trägern angefertigt, die die Verbindung gegen schnelle Eliminierung aus dem Körper schützen werden, wie etwa eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroverkapselte Zuführungssysteme. Es können biologisch abbaubare, biokompatible Polymere verwendet werden, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Die Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen werden dem Fachmann geläufig sein. Die Materialien können zudem kommerziell von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. erhalten werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die gezielt auf infizierte Zellen ausgerichtet sind, mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene) können ebenso als pharmazeutisch zulässige Träger verwendet werden. Diese können gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie im US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben sind.
Es ist zur Erleichterung der Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung besonders vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen in der Form von Dosiseinheiten zu formulieren. Die Form der Dosiseinheiten, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für den zu behandelnden Patienten taugen, wobei jede Einheit eine festgelegte Menge an aktiver Verbindung enthält, die so berechnet ist, dass sie in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger die gewünschte Wirkung erzeugt. Die Spezifikation für die Form der Dosiseinheiten der Erfindung wird durch die individuellen Eigenschaften der aktiven Verbindung und die bestimmte therapeutische Wirkung, die zu erzielen ist, diktiert und davon direkt abhängen.
Die Nukleinsäuremoleküle können in Vektoren eingebracht werden und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können einem Patienten durch irgendeine einer Anzahl von Wegen zugeführt werden, wie sie beispielsweise im US-Patent Nr. 5,703,055 beschrieben sind. Die Zuführung kann demgemäß auch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (siehe US-Patent Nr. 5,328,470 ) oder stereotaktische Injektion (siehe beispielsweise Chef et al.,1994, PNAS 91: 3054-3057) einschließen. Die pharmazeutische Zubereitung des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem zulässigen Verdünnungsmittel einschließen oder kann eine Matrix mit langsamer Freisetzung umfassen, in der das Genzuführungsvehikel eingebettet ist. Alternativ kann die pharmazeutische Zubereitung, wo der komplette Genzuführungsvektor intakt aus rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, beispielsweise retrovirale Vektoren, eine oder mehrere Zellen enthalten, die das Genzuführungssystem produzieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung in einem Behälter, in einer Packung oder in einem Spender enthalten sein.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben werden.
Spezielle Beispiele
Beispiel 1: Rekombinante Adenoviren
AdCMVPDX-1 wurde so konstruiert, wie es bei R. Seijffers et al., Endocrinology 140: 1133 (1999) beschrieben ist. Es enthält die STF-1 cDNA, das Rattenhomologe von PDX-1, ligiert in die BamH1-Stelle des pACCMVpLpA-Vektors.
AdCMVβ-gal enthält das Kernlokalisierungssignal für β-Galaktosidase.
AdCMV-hIns enthält die Humaninsulin-cDNA unter der Kontrolle des heterologen Cytomegalovirus-Promotors.
AdRIP-1-hIns enthält die Humaninsulin-cDNA unter der Kontrolle des Ratteninsulin-Promotors-1 (RIP-1). RIP-1 sind 410 Basen der 5'-flankierenden DNA-Region des Insulin-1-Gens.
Beispiel 2: Bestimmung der durch PDX-1 induzierten Insulingenexpression und Aktivierung des ektopisch kozugeführten Insulin-Promotors.
Um die Wirkung der ektopischen PDX-1-Expression in der Leber zu beurteilen, wurden männliche Balb/c- und C57BL/6-Mäuse (11 bis 14 Wochen alt) mit 2 × 10⁹ Plaque bildenden Einheiten (in 0,2 ml Kochsalzlösung) von AdCMV-PDX-1 rekombinantem Adenovirus in die Schwanzvene injiziert. Als Kontrollen wurden Mäuse gleicherweise mit AdCMVβ-gal oder AdCMV-hIns und AdRIP-1-hIns rekombinantem Adenovirus injiziert. Die Tiere wurden in einer klimatisierten Umgebung unter einem 12-stündigen Hell-/Dunkelzyklus bei einer unbeschränkten Diät untergebracht und eine Woche nach der Virusverabreichung getötet. Für die Isolierung der Gesamt-RNA wurden die Leber, die Milz, das Pankreas und die Niere freigelegt und wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70 °C gelagert.
Die PDX-1- und Insulingenexpression wurde durch RT.PCR bestimmt. Die Gesamt-RNA wurde aus den gefrorenen Geweben unter Verwendung von RNAzol (CINNABIOTEX) isoliert. RNA-Proben wurden mit 10 μl DNase I (Promega) behandelt.
cDNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von 1μg DNA-freier Gesamt-RNA und 0,5 μg Oligo(dT)₁₅ hergestellt. 1,5 μl an RT-Reaktion wurde unter Verwendung von Primer und PCR-Bedingungen, wie sie unten in Tabelle 1 angegeben sind, amplifiziert. Die PCR wurde in einem GeneAmp-PCR-System 2400 (Perkin Elmer) ausgeführt und die Produkte wurden in einem 1,7 % Agarosegel getrennt. Für jede RNA-Probe wurde eine separate PCR-Reaktion ohne reverse Transkriptase ausgeführt, um sicherzustellen, dass das amplifizierte Produkt nicht von einer DNA-Kontamination herrührte. Die Primer wurde so entworfen, dass nur die Ratten-PDX-1-Expression, nicht das Maus-Homologe erfasst wurde. Die Primer für die mI-2-Aplifikation sind auf unterschiedlichen Exons lokalisiert. Der erste Schritt der Probendenaturierung war für alle amplifizierten Gene identisch: 1 Minute bei 94 °C.
Die Analyse der Gesamt-RNA ergab, dass die AdCMV-PDX-1-Verabreichung hauptsächlich zu einer PDX-1-Expression in der Leber führte. Die Milz, das Pankreas und die Niere aus denselben Mäusen wurden durch RT-PCR negativ auf das Ratten-Homologe von PDX-1 getestet.
75 % (25 von 35) der Mäuse, die positiv auf das Ratten-PDX-1-Signal getestet wurden, exprimierten das mI-2-Gen, wohingegen 35 % der Mäuse das mI-1-Gen exprimierten (1). Um zu bestimmen, ob diese Disparität der Expression zwischen mI-2 und mI-1 davon herrührt, dass der mI-1-Promotor durch die Identität oder die Pegel der Transkriptionsfaktoren, die in den PDX-1 exprimierenden Leberzellen vorhanden sind, unterschiedlich aktiviert wurde, wurde den Mausen wie oben beschrieben AdRIP-1-hIns rekombinanter Adenvirus zusammen mit AdCMV-PDX-1 zugeführt. Wie es in 1 demonstriert wird, wurden bei Lebern, bei denen PDX-1 nur die Expression des endogenen mI-2 induzierte, auch der Ratteninsulin-1-Promotor (RIP-1) aktiviert. Dies deutet darauf hin, dass die unterschiedlichen Pegel an DNA-Methylierung oder die verschiedene Chromatinstruktur die Ursache für die geringe Wirksamkeit der Aktivierung der endogenen mI-1-Expression durch PDX-1-Expression in der Leber sein könnten. Darüber hinaus demonstrieren diese Daten die Kapazität, den β-zellspezifischen Insulinpromotor in der Leber bei Kozuführung mit PDX zu aktivieren.
Die Expression der endogenen Mausinsulin- und der ektopischen Humaninsulingene wurde jeweils nicht durch die Behandlung mit der gleichen Konzentration an rekombinantem Kontroll-Adenoviren AdCMVβ-gal oder AdCMV-hIns und AdRIP-1-hIns erhalten (n = 20). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass PDX-1 essentiell und ausreichend ist, um die Expression der endogenen Insulingene zu induzieren und RIP-1 in einem extra-pankreatischen Gewebe zu aktivieren.
Beispiel 3: Bestimmung von durch PDX-1 induzierter Somatostatin-Genexpression und Proteinproduktion in vivo
Die Tiere wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit rekombinanten Adenviren behandelt. Die Somatostatin-Genexpression wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durch RT-PCR gemäß den in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen bestimmt.
Wie in 3 demonstriert, zeigten Lebern in Mäusen, die mit AdCMV-PDX-1 behandelt wurden, Somatostatin-Genexpression. Mäuse, die mit AdCMV-PDX-1 behandelt wurden, zeigten positive Anfärbung für das Somatostatinprotein in Lebergewebe, das durch Immunchemie analysiert wurde. Mit AdCMVβ-gal behandelte Mäuse exprimierten kein Somatostatin.
Beispiel 4: Bestimmung der durch PDX-1 induzierten Glucagon-Genexpression
Die Tiere wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben mit AdCMV-PDX-1 rekombinantem Adenvirus behandelt. Die Glucagon-Genexpression wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben durch RT-PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen und Primer bestimmt.
Wie in 3 demonstriert, zeigten Lebern in Mäusen, die mit AdCMV-PDX-1 behandelt wurden, Glucagon-Genexpression. Mit AdCMVβ-gal behandelte Mause exprimierten kein Glucagon.
Beispiel 5: Bestimmung der durch Prohormon Konvertase 1/3 induzierte Genexpression

Die Tiere wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben mit einem rekombinanten Adenvirus behandelt. Die Prohormon Konvertase 1/3 (PC1/3) Genexpression wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben durch RT-PCR bestimmt, mit der Ausnahme, dass cDNA unter Verwendung eines genspezifischen Oligonukleotids (TCCAGGTGCCTACAGGATTCTCT) anstelle von Oligo(dT)₁₅ revers transkribiert wurde. Wie in 3 demonstriert, zeigten nur Leber von Tieren, die mit PDX-1 behandelt wurden, die Induktion von PC1/3-Expression, den Proteasen aus der Kexin-Familie angehörig, ist die PC1/3-Expression auf endokrine und neuroendokrine Zellen mit reguliertem sekretorischen Pfad beschränkt. Zusammen mit der Kapazität, die produzierten Hormone in intrazellularen Kompartimenten zu speichern, deutet dies auf eine PDX-1-abhängige Induktion eines endokrinen Phänotyps hin, was die Induktion des regulierten Pfads zu Hormonproduktion, -verarbeitung, -speicherung und -ausscheidung einschließt. Tabelle 1: RT-PCR-Analyse zur Bestimmung von durch PDX-1 induzierter Genexpression

Gen	Primersequenzen 5'-3	PCR-Bedingungen
		PCR-Produkt	Anlagerung		Verlängerung
			°C	sec	°C	sec	Zyklen
Ratten-PDX-1 (ektopisch)	F: CCAGTTTGCAGGCTCGCTGG R: GCTGCGTATGCACCTCCTGC	279 bp	62	60	72	60	31
Humaninsulin (ektopisch)	F: CTTTGTGAACCAACACCTGTGC R: GCAGATGCTGGTACAGCATTGT	239 bp	63	60	72	60	38
Mausinsulin I	F: TTGCCCTCTGGGAGCCCAAA R: CAGATGCTGGTGCAGCACTG	253 bp	62	60	72	60	38
Mausinsulin II	F: TCTTCCTCTGGGAGTCCCAC R: CAGATGCTGGTGCAGCACTG	259 bp	62	60	72	60	38
Maus-β-Actin	F: ATGGATGACGATATCGCT R: ATGAGGTAGTCTGTCAGGT	500 bp 5	56	45	72	60	35
Maus-PC1/3	F: CTGGTTGTCTGGACC TCTGAGTA R:CCAACAGCAGAAGTGAGTGTGAC	361 bp	55	45	72	60	38
Maus-PDX-1 (endogen)	F: CAAGCTCGCTGGGATCACTGGAGCAG R: GATGTGTCTCTCGGTCAAGTTCAACATC	421 bp	58	45	72	60	38
Maus- und Rattensomatostatin	F: CCTGGCTTTGGGCGGTGTCA R: CTCGGGCTCCAGGGCATCATTC	165 bp	68	45	72	60	38
Mausglucagon	F: ACCAGCGACTACAGCAAATACCTC R: AGCAATGGCGACTTCTTCTGG	242 bp	60	45	72	60	38
Ratteninsulin I	F: GTGACCAGCTACAATCATAG R:AGTTCTCCAGTTGGTAGAGG	370 bp	57	45	72	60	38
Ratten-β-Actin	F: CGTAAAGACCTCTATGCCAA R: AGCCATGCCAAATGTGTCAT	350 bp	57	45	72	60	35

Beispiel 6: PDX-1-induzierte Proinsulinsynthese in Lebern
Die Tiere wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit rekombinanten Adenviren behandelt. Die Leber, die Milz, das Pankreas und die Niere wurden freigelegt. Teile des Gewebes wurden zum immunhistochemischen Anfärben in 4 % Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die restlichen Leber- und Pankreasgewebe wurden zur RIA-Bestimmung des IRI-Gehalts in 70 % Ethanol – 0,18 N HCl homogenisiert, lyophilisiert und in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) resuspendiert.
Immunhistochemie
Schnitt mit 5 μm der in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden deparaffiniert, in 3 % H₂O₂ inkubiert und dann entweder in Citratpuffer zur Antigengewinnung vor der Inkubation in Blockierungslösung mit Mikrowellen behandelt (PDX-1-Nachweis) oder unmittelbar der Blockierungslösung ausgesetzt (Insulinnachweis). (Histomouse^TM-SP Kit, Zymed Laborstories, Ca, USA).
PDX-1-Nachweis: Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit gegen den N-terminalen Abschnitt von Frosch-PDX-1 gezüchtetem Antiserum inkubiert.
Insulinnachweis: Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit monoklonalem Anti-Humaninsulin (Sigma, St. Lous MO) inkubiert.
Die Objektträger wurden 30 Minuten lang dem sekundären biotinylierem IgG ausgesetzt, in Streptavidin-Peroxidase gefolgt von Chromogen-Peroxidlösung inkubiert.
Die Immunhistochemische Analyse der Leberschnitte von mit PDX-1 behandelten Mäusen zeigten eine Expression des Homeoproteins in 30 bis 60 % der Hepatozytenkerne, wobei 0,1 bis 1 % der Leberzellen positiv auf (Pro)Insulin angefärbt wurden. Mit Kontroll-AdCMVβ-gal behandelte Lebern färbten sich nicht positiv auf (Pro)Insulin an, obwohl in 50 % der Kerne β-Galactosidaseaktivität evident war. Lebern aus mit AdCMV-hIns behandelten Mäusen färbten sich bei den hepatischen Schnitten nicht positiv auf Insulin an, obwohl das Serum-IRI aus denselben Mäusen dreifach erhöht war, als es Serum-IRI-Pegel in mit PDX-1 behandelten Mäusen war. Die Tatsache, dass die ektopische Expression von PDX-1, aber nicht von Insulin, zu positiver Immunfärbung für (Pro)Insulin führte, mag auf die Induktion einer zellularen Modulation hindeuten, die die Insulinspeicherung in einer kleinen Subpopulation von Leberzellen (sekretorische Vesikel, die dem regulierten Pfad angehören, charakteristisch für endokrine Zellen, aber nicht für Leberzellen), welche sich zu einem β-Zellenphänotyp verändert haben.
Radioimmunoassay
Um zu bestimmen, ob hepatisches Insulin-mRNA effektiv in Protein übertragen wird, wurde der Gehalt an immunreaktivem Insulin (IRI) in aus hepatischem Gewebe stammenden Extrakten durch Radioimmunoassay (RIA) getestet. Lebern aus mit PDX-1 behandelten Mäusen, die positiv auf Insulin-Genexpression getestet wurden (1), enthielten etwa 25-mal mehr IRI als Lebern von mit einem Kontrollvirus behandelten Tieren (Tabelle 2). Mittlere IRL-Pegel in aus mit PDX-1 behandelten Lebern stammenden Extrakten betrugen 20,7 ± 3,97 μU/mg Protein, während der IRI in Kontrolllebern nur 0,78 ± 0,25 μU/mg Protein betrug. Der Hintergrundpegel an Insulin, der in Kontrollleberproben gemessen wurde, repräsentiert möglicherweise Insulin (pankreatischen Ursprungs), das an seine Rezeptoren gebunden ist, die bei diesem Ursprung reichlich vorhanden sind. Während in Extrakten aus mit PDX-1 behandelten Lebern erfasstes PDX-1 <1 % der in den pankreatischen Extrakten (Tabelle 2) ermittelten Pegel betrug, waren die IRL-Pegel bei mit PDX-1 behandelten Mäusen fast 3-mal höher im Vergleich zu Kontrollen (jeweils 323 ± 48,4 gegen 118,2 ± 23,7 μU/ml (Tabelle 2)), was darauf hinweist, dass Insulin synthetisiert wurde und ein großer Anteil davon in den Blutstrom sezerniert wurde. Diese Daten weisen darauf hin, dass die durch die molekulare Manipulation induzierte Insulin-Genexpression erfolgreich in spezifische hepatische Produktion des Pro-/Hormons übertragen wurde.
Immunreaktives Insulin, das in mit PDX-1 behandelten Lebern gefunden wurde, betrug weniger als 1 % der IRL-Pegel in pankreatischen Extrakten (Tabelle 2). Die IRI-Werte, die durch Radioimmunoassay (IRA) in Leberextrakten bestimmt wurden, können die tatsächliche Insulinproduktion in diesem Organ unterschätzen. Der Antikörper, den wir für den IRA verwendeten, bindet bevorzugt an das verarbeitete Hormon und weist nur 60 % Kreuzreaktivität mit Proinsulin auf, von dem erwartet wird, dass es hauptsächlich in Hepatozyten und zu wesentlich geringerem Maße in Pankreas vorhanden ist.
Beispiel 7: Blutglucose- und Seruminsulinpegel
Die Tiere wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit rekombinantem Adenvirus behandelt. Vor der Tötung wurde zur Bestimmung der Glucosekonzentration (Accutrend^® GC, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) und der Insulinpegel durch Radioimmunoassay (Coat-a-count, DPC, Los Angeles, CA, USA, unter Verwendung von Ratteninsulinstandards (Linco) weist der verwendete Anti-Insulin-Antikörper nur 60 % Kreuzreaktivität mit Humanproinsulin auf) Blut aus der unteren Hohlvene gezogen.
Mit AdCMV-PDX-1 rekombinantem Adenviren behandelte Mäuse waren nicht hyperglykämisch, ihre Blutglucosepegel waren jedoch signifikant niedriger als die von Mäusen, die mit AdCMVβ-gal oder AdCMV-Luc behandelt wurden (jeweils 197 ± 11,2 gegen 228 ± 15,74 mg/dl (Tabelle 2)). Die Plasmapegel des immunreaktiven Insulins waren signifikant höher bei mit PDX-1 behandelten Mausen im Vergleich zu Kontrollen (jeweils 323 ± 48,4 gegen 118,2 ± 23,7 μU/ml (Tabelle 2)).

Die dreifache Erhöhung der Serum-IRI-Pegel bei mit PDX-1 behandelten Mäusen kann nicht selbst die 25-fache Zunahme (siehe Tabelle 2) des hepatischen IRL-Gehalts erklären, der sich bei Extrakten von mit PDX-1 behandelten Lebern zeigt. Somit rührt die Zunahme des hepatischen Pro-/Insulingehalts von lokaler Produktion her. Tabelle 2: Pegel an Blutglucose und immunreaktivem Insulin (IRI) in Serum und Leberextrakten.

	Mit einem Kontrollvirus behandelte Mäuse	Mit AdCMV-PDX-1 behandelte Mäuse
Blutglucose, mg/dl	228 ± 15,74 (n = 18)	197 ± 11,2 (n = 40)
Serum-IRI, μU/ml	118 ± 23,7 (n = 14)	323 ± 48,4 (n = 26)
Leberextrakt-IRI μU/mg Protein	0,78 ± 0,25 (n = 10)	20,7 ± 3,97 (n = 12)
Pankreasextrakt-IRI μU/mg Protein	2627 ± 24 (n = 6)

Beispiel 8: HPLC-Analyse von insulin-verwandten Peptiden
Die Tiere wurden wie bei Beispiel 2 beschrieben mit rekombinantem Adenvirus behandelt. Die Leber und das Pankreas wurden freigelegt und in 70 % Ethanol – 0,18 N HCl homogenisiert, lyophilisiert und zur HPLC-Analyse in 0,1 M HCl – 0,15 % BSA resuspendiert.
Mit Insulin verwandte Peptide aus der Leber und pankreatischen Extrakten wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Lichrospher 100 RP-18 Säule (Merck, Darmstadt, Deutschland) und Elutionsbedingungen wie von Gross et al. beschrieben aufgelöst. Fraktionen von 1 ml wurden in Röhrchen gesammelt, die 0,1 ml 0,1 % BSA in Wasser enthielten, in einem Speed-Vac-Gerät getrocknet und zur Peptidbestimmung durch RIA in 1 ml Puffer (0,1 % BSA in PBS) rekonstituiert. Zur jeweiligen Bestimmung des Maus- oder Human-IRI wurden Guineaschwein-Antischweineinsulin-Antikörper (Linco, St. Charles, MO) entweder mit Ratten- oder mit Humaninsulinstandards verwendet.
Die HPLC-Analyse des hepatischen IRI-Gehalts aus mit PDX-1 behandelten Mausen zeigten 59 ± 7 % (n = 3) Konversion in vollständig verarbeitetes mI-1 und mI-2. Im Vergleich dazu enthielten pankreatische Extrakte 85 ± 5 % (n = 3) reifes Insulin ( 2), wohingegen die ektopische Expression von Humaninsulin (AdCMV-hIns) nicht zu Retention von IRI in den Leberzellen führte, mit der Ausnahme für eine Leber, bei der das meiste des extrahierten IRI unreifes Insulin war. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen bei transfizierten FAO-Zellen, bei denen keine Retention des Insulingenprodukts beobachtet wird und das meiste davon durch den konstitutiven sekretorischen Pfad sezerniert wird. Diese Daten demonstrieren, dass die ektopische PDX-1-Expression in der Leber eine zellulare Maschinerie induziert, die für endokrines Gewebe charakteristisch ist, das in der Lage ist, das induzierte Prohormon zu verarbeiten, und sie nicht induziert wird, wenn nur Proinsulin in der Leber ektopisch exprimiert wird, wodurch durch ektopische PDX-1-Expression ein erweiterter β-Zellen-Phänotyp in Leberzellen induziert wird.
Beispiel 9: Biologische Aktivität der hepatischem Pro-/Insulin-Produktion
Es wurde die Fähigkeit der durch PDX-1 induzierten hepatischen Insulinproduktion, Blutglucosepegel in diabetischen Mausen zu kontrollieren, untersucht. C57BL/6-Mäuse wurden mit Ketoazidose, 24 Stunden nach intraperitonaler STZ-Injektion von 200 mg/kg diabetisch gemacht (> 600 mg/dl). 24 bis 48 Stunden nach STZ-Injektion wurden die Mäuse entweder mit AdCMV-PDX-1 oder mit AdCMVβ-gal (Kontrolle) rekombinantem Adenovirus behandelt, die in Kochsalzlösung über die Schwanzvene verabreicht wurden. Wie es in 4 demonstriert wird, zeigten mit AdCMV-PDX-1 behandelte Mäuse beginnend zwei Tage nach der Behandlung mit dem rekombinanten Adenvirus eine graduelle Abnahme der Blutglucosepegel von etwa 600 auf 200 bis 300 mg/dl. Im Gegensatz dazu blieb die Hyperglykämie bei den mit AdCMVβ-gal behandelten Kontrollmäusen bestehen und wurde von einer gesteigerten Sterberate begleitet, 12 von 22 getesteten Mäusen starben mit schwerer Ketoazidose 1 bis 3 Tage nach der Adenovirusbehandlung. Darüber hinaus verloren beide Gruppen nach Induktion der Hyperglykämie an Gewicht und erlangten es nicht wieder zurück; bevor sie getötet wurden. Zusammenfassend demonstrieren die Daten, dass die Expression von PDX-1 ausreicht, um die Produktion von reifem, biologisch aktivem Insulin in der Leber zu induzieren, das die Hyperglykämie in Mäusen verbessert, die eine fehlende β-Zellenfunktion aufweisen.
Beispiel 10: In-vitro-Aktivierung des Insulin-Promotors durch ektopische PDX-1-Expression
PDX-1 aktiviert den Ratteninsulin-I-Promotor, wenn es zusammen mit einem rekombinanten Adenovirus AdRip-1 hIns zugeführt wird, bei dem die Humaninsulin-Expression durch einen Ratteninsulin-1-Promotor zugeführt wird (siehe Beispiel 2 und 1). PDX-1 zeigte sich als ausreichend, um den Ratteninsulin-1-Promotor in vitro in Rattenleberzellen zu aktivieren. Primare Kulturen von reifen und fatalen Hepatozyten wurden auf mit Kollagen-1 bedeckten Kulturschalen in serumfreien, chemisch definierten Medien kultiviert. Zwei Tage nach Plattieren wurden die Zellen entweder mit AdCMV-PDX-1 und AdRip-1 hIns oder mit AdCMVβ-gal und AdRip-1 hIns behandelt. 48 Stunden nach der adenoviralen Behandlung wurde die gesamt-RNA extrahiert und die Proinsulin-Genexpression wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
PDX-1 aktivierte das ektopisch exprimierte RIP-hIns (Ratteninsulinpromotor-I, 410 bp dieses Promotors, die das Humaninsulin steuern, eingebracht über ein rekombinantes Adenvirus), während β-gal keine solche Kapazität aufwies (5).
Beispiel 11: In-vitro-Induktion der endogenen Somatostatin-Genexpression in Hepatozyten
Primäre Kulturen von Hepatozyten, die aus fatalen E14-Fisher-344-Ratten isoliert wurden, wurden kultiviert und mit rekombinanten Adenoviren behandelt, wie es in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Somatostatin-Genexpression wurde wie in Beispiel 2 beschrieben in revers transkribierten RNA-Proben unter Verwendung von Primern und RT-PCR-Bedingungen ermittelt, wie sie in Tabelle 1 beschrieben sind.
Die Daten demonstrieren, dass die ektopische PDX-1-Expression in Hepatozyten in vitro die Expression der endogenen, ansonst stillen Somatostatin-Genexpression in Hepatozyten in vitro induziert (6).
Beispiel 12: In-vitro-Induktion der endogenen Insulin-Genexpression in Hepatozyten
Primäre Kulturen von Hepatozyten, die aus fötalen E14-Fisher-344-Ratten isoliert wurden, wurden kultiviert und mit rekombinanten Adenviren behandelt, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist. Die Ratteninsulin-I-Genexpression wurde wie in Beispiel 2 beschrieben in revers transkribierten RNA-Proben unter Verwendung von Primern und RT-PCR-Bedingungen ermittelt, wie sie in Tabelle 1 beschrieben sind.
Die Daten demonstrieren, dass die ektopische PDX-1-Expression in primären Kulturen von fötalen Hepatozyten in vitro die Expression der endogenen, ansonst stillen Insulin-Genexpression induziert (6).
Beispiel 13: Ektopische PDX-1-Expression in Leberzellen induziert eine intrazellulare Kompartimentchrakteristik von endokrinen und neuroendokrinen Zellen, was die Retention der produzierten Hormone und ihre regulierte Sekretion ermöglicht
Die Mäuse wurden wie in Beispiel 2 beschrieben entweder mit Ad-CMVhIns oder mit AdCMVPDX-1 behandelt. Die Behandlung führte zu einer dreifachen Zunahme des Serum-IRI, was die Humaninsulinproduktion durch Leberzellen demonstriert (1). Zellen, die durch Immunhistochemie für Insulinprotein positive waren, wurden nur bei der AdCMVPDX-Behandlung festgestellt. Darüber hinaus stellte die HPLC-Analyse von Leberextrakten nur Spuren von IRI in Leberextrakten fest, die bei den mit Ad-CMVhIns behandelten Mäusen alle unverarbeitet waren, im Vergleich zur 25-fachen Zunahme bei den mit AdCMVPDX-1 behandelten Mäusen. Darüber hinaus war 59 % des Insulins, das in AdCMVPDX-1 behandelten Mäusen produziert wurde, verarbeitet. Zudem zeigten nur Lebern, die mit AdCMVPDX-1 behandelt wurden, die Induktion des das Prohormon verarbeitenden Enzyms PC1/3, was nur für Zellen charakteristisch ist, die für den regulierten Pfad der Insulinverarbeitung, -speicherung und regulierten Sekretion in der Lage sind. Diese Daten demonstrieren, dass PDX die regulierte Sekretion von Insulin in Leberzellen induziert.
Beispiel 14: Identifizierung von durch PDX modulierten Nukleinsäuren
Nukleinsäuren, die durch PDX moduliert werden, werden durch ektopische PDX-Expression identifiziert. Nukleinsäuren, die nicht in kontrollbehandeltem extra-pankreatischem Inselgewebe exprimiert werden, im Vergleich zu pankreatischen Gewebe, werden durch PDX moduliert. Diese so identifizierten Nukleinsäuren werden als therapeutische Verbindungen verwendet, um pankreatisch assoziierte Störungen zu behandeln.
Die Identifizierung der Zielgene wird entweder durch subtraktive Bibliotheken, kommerziell erhältliche Mikroarraychips (Incyte oder Affimetrix) oder Membranhybridisierungen (CLONTECH Atlas^TM-Expressionsarrays oder Multiple Tissue Northern (MTN^®) Blots) ausgeführt. Die RNA-Isolierung aus behandelten Geweben, seine Reinigung und cDNA-Sondensynthese wird gemäß der Herstellerangaben ausgeführt.
Die Gene, die im PDX-behandelten nichtpankreatischen Inselgewebe exprimiert werden und auch in den mit pankreatischen Inseln sondierten Membranen oder Chips vorhanden sind, aber nicht im kontrollbehandelten nichtpankreatischen Inselgewebe, sind die direkten und nichtdirekten PDX-Zielgene, die das Inselzellen-Eigenschaftsprofil der Genexpression repräsentieren. Die Diskriminierung zwischen direkt und indirekt wird durch Kandidatenzielgenpromotoranalyse durch Elektromobilitätsshift-Assay (EMSA) wie in 7 und Promotor-Footprinting (wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 beschrieben) geklärt.
Beispiel 15: Induzieren der regulierten Expression eines gewünschten ektopisch exprimierten Gens in Wirtsgewebe
Dieses Beispiel illustriert die Induktion der regulierten Expression irgendeines Reporters zusätzlich zu Insulin. Wenn PDX den Insulinpromotor in nichtpankreatischem Inselgewebe aktiviert und ihre Glucose- und Wachstumsfaktor-Erkennungsfähigkeit vermittelt, dann wird irgendein zusätzlicher Promotor gleichfalls durch Glucose und Wachstumsfaktoren reguliert. Demgemäß kann diese Erfindung dazu eingesetzt werden, die Expression zahlreicher sezernierter oder nicht sezernierter Faktoren, wie etwa beispielsweise Glucagon, Wachstumshormon, Steroidhormone, die durch den Insulinpromotor gesteuert werden, womit ihre Transkription und regulierte Sekretion kontrolliert wird, aus einem sonstigen nichtendokrinen Gewebe ernährungsbedingt und hormonell zu regulieren (7).
Beispiel 16: Identifizierung der PDX-Lage in der Hierarchie von für β- oder Inselzellen spezifischen Transkriptionsfaktoren
Dieses Beispiel illustriert die Identifizierung der PDX-Lage in der Hierarchie von für β- oder Inselzellen spezifischen Transkriptionsfaktoren. Jeder in pankreatischen Inseln exprimierte, aber nicht durch ektopische PDX-1-Expression in der Leber induzierte Transkriptionsfaktor könnte mit PDX zur Induktion eines umfangreicheren, vollständigeren oder nahezu vollständigen β-Zellenphänotyps in nichtpankreatischem Gewebe, wie etwa der Leber, kooperieren. Der Nachweis der induzierten Expression von inselzellspezifischen Transkriptionsfaktoren in der Leber wird wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung der geeigneten Primer und Bedingungen, deren Beispiel in Tabelle 1 ausgeführt ist, ausgeführt.
Ein zusätzliches Verfahren, die Aktivität der Transkriptionsfaktoren gemäß Beispiel 2 positiv zu analysieren wird durch Footprinting und durch Elektromobilitätsshift-Assay (EMSA) ausgeführt: Kernextrakte (3 bis 4 μg an Protein) wurden 10 Minuten lang auf Eis in DNA-Bindungsmischung, enthaltend 10 % Glycerin, 15 mM Hepes (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT und 0,3 μg a Poly-dIdC, Poly-dAdT (Sigma, St-Louis MO) inkubiert. Nach der ersten Inkubation wurden für eine zusätzliche 25 minütige Inkubation auf Eis ungefähr 0,2 ng der Sonde hinzugegeben. Die Bindungsreaktion wurde auf einem nativen 4 % Polyacrylamidgel analysiert.
Oligonukleotide (Sonden): Synthetische doppelsträngige Oligonukleotide wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase mit [α³²P] endmarkiert. Die Sequenzen der Oligonukleotide A3/A4, welches ein Beispiel für eine PDX-1-Bindungsstelle (eine davon) auf dem Insulinpromotor 5'-GATCTGCCCCTTGTTAATAATCTAATG-3' (SEQ ID NO: 24) ist. Die Sequenz für Al (zusätzliche PDX-1-Bindungsstelle am Insulinpromotor) ist 5'-GATCCGCCCTTAATGGGCCAAACGGCA-3' (SEQ ID NO: 25). Die markierten Oligos werden als Sonden für Elektromobilitätsshift-Assays verwendet, wie es in 7 beschrieben ist. Die Identität von PDX-1 wird durch Supershift unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers doppelgeschätzt, der verhindert, dass sich PDX-1 an seine verwandte Stelle am Promotor bindet, oder der das Molekulargewicht des Komplexes erhöht, der mit PAGE (Antikörper + pdx-1 + Sonde) abgetrennt wurde, im Vergleich zu dem, der nur pdx-1 + markierte Sonde enthält (letzte zwei Spuren in 7).

Claims

Verwendung eines Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptids oder einer Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer pankreas-assoziierten Erkrankung bei einem Patienten, der der Produktion von Pankreashormon in einer anderen Zelle als einer endokrinen Zelle bedarf, wobei die Zelle aus Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzellen ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament dazu geeignet ist, in dem Patienten ein Pankreasinsel-Genexpressionsprofil zu induzieren.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, ein DNA-Molekül ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, in einem Plasmid oder einem viralen Vektor vorhanden ist oder in einem Virus eingekapselt ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Virus hepatotrop ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Pankreashormon aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Insulin, Glucagon und Somatostatin besteht.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Pankreasinselgen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Insulin, Glucagon, Somatostatin und Proinsulin-Konvertase 1/3 besteht.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Pankreashormon Insulin ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, hepatische Insulinpegel oder Seruminsulinpegel erhöht.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Patient ein Nagetier oder ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, zur Verabreichung in Verbindung mit einem Transfektionsmittel vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, zur Verabreichung durch eine Route vorgesehen ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus intraperitonealer, subkutaner, nasaler, intravenöser, oraler und transdermaler Zuführung besteht.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder die Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, zur intravenösen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Pankreas-erkrankung Diabetes ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zelle eine Hepatozyte ist.
Medikament, wie in einem der vorherigen Ansprüche beschrieben, wobei das Medikament einen Nukleinsäure-Expressionsvektor umfasst, der eine Nukleinsäure enthält, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, welcher Vektor ein viraler Vektor ist, der in der Lage ist, eine Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einem bestimmten Typ von Zellen zu regulieren, die aus Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzellen ausgewählt sind.
In-vitro-Verfahren des Induzieren oder Anreicherns eines Pankreasinselzellen-Phänotyps in einer Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder einer Nukleinsäure, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, in einer Menge umfasst, die ausreicht, um den Pankreasinselzellen-Phänotyp in der Zelle zu induzieren oder zu verstärken.
In-vitro-Verfahren zum Induzieren der Pankreashormonproduktion in einer Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid oder einer Nukleinsäure umfasst, die ein Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Polypeptid kodiert, wobei die Zelle zur Einbringung in den Patienten vorgesehen ist und, wenn sie derart eingebracht ist, im Patienten die Pankreashormonproduktion induziert.
Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei die Zelle eine Hepatozyte ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Pankreashormon Insulin ist.
Muskel-, Milz-, Nieren-, Blut-, Haut- oder Leberzelle, die sich durch Pankreashormonproduktion auszeichnet, welche Zelle gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20 erhältlich ist.