DE69905291T3

DE69905291T3 - Bioluminenztest für agonisten oder antagonisten eines kalzium-gekuppelten-rezeptors

Info

Publication number: DE69905291T3
Application number: DE69905291T
Authority: DE
Inventors: Vincent Dupriez; Michel Detheux; Marc Parmentier
Original assignee: PerkinElmer Cellular Sciences Belgium SPRL
Current assignee: PerkinElmer Cellular Sciences Belgium SPRL
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2019-07-07
Also published as: WO2000002045A3; JP2002519699A; JP3495987B2; DK1145002T3; EP1145002A2; EP1145002B1; DK1145002T4; ES2192060T3; ATE232298T1; WO2000002045A2; US6872538B1; CA2336929A1; CA2336929C; ES2192060T5; DE69905291D1; EP1145002B2; DE69905291T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hoch-Durchsatz-Screening-Verfahren und eine ebensolche Vorrichtung für die Diagnose und Dosierung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten für einen Calcium-gekoppelten Rezeptor und/oder den Antagonisten dieses Calcium-gekoppelten Rezeptors, der mittels dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung identifiziert worden ist.
Eine Reihe von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) lösen nach Bindung an einen Agonisten einen vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration aus. Diese Veränderung wirkt als ein interner sekundärer Bote und ist ein wichtiger Modulator von vielen physiologischen Mechanismen (Übersichtsartikel von Rink (1990), Tsunoda (1993) und Santella & Carafoli (1997)). Die Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration in Zellen, die einen GPCR exprimieren, kann somit verwendet werden, um die Wirksamkeit der Aktivierung eines GPCR durch verschiedene Verbindungen, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie ein Ligand für diesen GPCR sind, zu überwachen.
Die Aktivierung von anderen Rezeptoren wie Innenkanälen kann ebenfalls eine intrazelluläre Calcium-Konzentration induzieren.
Veränderungen in der Calcium-Konzentration können auf mehrere Weisen und mittels mehrerer Methoden wie die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen (zum Beispiel: Fura-2, Fluo-3, Fluo-4 und Indo-1) nachgewiesen werden.
Ca⁺⁺-sensitive Farbstoffe haben jedoch ihre Beschränkungen. Die Aktivierung der Farbstoffe mit einem Anregungsstrahl erfordert komplizierte und teure Instrumente und begrenzt die Verwendung von Plastikmaterial im Labor wie den Mikrotiter-Platten
Ein anderes Verfahren zur Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration besteht in der Verwendung von Zelllinien, die einen GPCR und Apoäquorin überexprimieren, wie es von Sheu et al. (1993) beschrieben worden ist. In diesem System werden Zellen, die Apoäquorin exprimieren, mit Coelenteracin, dem Co-Faktor von Äquorin, inkubiert. Während dieser Inkubation gelangt das Coelenteracin in die Zelle und konjugiert mit Apoäquorin unter Bildung von Äquorin, das die aktive Form des Enzyms ist. Nach Inkubation der Zellen mit einem Agonisten des GPCR steigt die intrazelluläre Calcium-Konzentration. Dieser Anstieg führt zur Aktivierung der katalytischen Aktivität von Äquorin, das Coelenteracin oxidiert und Apoäquorin, Coelenteramid, CO₂ und Licht ergibt. Nachdem das Photon einmal emittiert worden ist, muss der Komplex dissoziieren und das Apoäquorin mit einem neuen Molekül Coelenteracin rekombinieren, um nochmals in der Lage zu sein, Licht zu emittieren. Somit reflektiert die Messung der Lichtemission nach der Zugabe des Agonisten in diesem System die Fähigkeit, den GPCR zu aktivieren und so die intrazelluläre Calcium-Konzentration zu erhöhen. Da Licht nur während eines Zeitraums von 20 bis 30 Sekunden nach der Aktivierung des GPCR emittiert wird, muss das Aufzeichnen des emittierten Lichtes während der wenigen Sekunden nach Zugabe des Agonisten zu den Zellen erfolgen. Dieses Signal nach Art eines Blitzes beruht auf der Tatsache, dass (1) der intrazelluläre Anstieg der Calcium-Konzentration, ausgelöst durch den GPCR, nur vorübergehend auftritt, und (2) wie vorher erwähnt, Apoäquorin nach der Oxidation von Coelenteracin mit Coelenteracin rekombinieren muss, um befähigt zu sein, wiederum Licht zu emittieren.
Die europäische Patentanmeldung 0 341 477 lehrt die Expression des Photoproteins Äquorin aus der Qualle in einem Säugetier-Zellsystem durch Klonierung von Gen pAQ440, das für die Biosynthese des Äquorin verantwortlich ist, in einen Expressionsvektor eines Säugetier-Zellsystems. Die Anmeldung lehrt weiterhin, dass das resultierende Plasmid einer Transfektion unterzogen wird und das Photoprotein Äquorin in den Säugetierzellen produziert wird.
US-Patent 5,422,266 beschreibt ein Gen, das für das Apoäquorin-Protein kodiert und in einem Vektor enthalten ist, der zur Expression von Apoäquorin in E. coli in der Lage ist.
US-Patent 5,714,666 beschreibt Säugetier-Zelllinien oder transgene Tiere, die Apoäquorin und einen Rezeptor, der bei der Modulation der intrazellulären Calcium-Konzentration beteiligt ist, exprimieren. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren, die intrazelluläre Calcium-Konzentration zu bestimmen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, den Säugetierzellen, die Apoäquorin exprimieren, Coelenteracin-Co-Faktoren zuzusetzen und die Photoemission zu messen, wobei die Emission von Photonen die intrazelluläre Calcium-Konzentration anzeigt.
Die Verfahren des Standes der Technik erfordern jedoch zunächst das Ausbreiten von Zellen einer Saugetier-Zelllinie, die Apoäquorin exprimiert, auf einem festen Träger (zum Beispiel einer 96-Loch-Platte), zweitens die Zugabe des Coelenteracin-Co-Faktors auf die Zellen und die Inkubation, um funktionelles Äquorin zu rekonstituieren, drittens die Herstellung eines Agens, das auf einen Rezeptor wirkt, der bei der Modulation der intrazellulären Calcium-Konzentration involviert ist, und seine Zugabe zu den hergestellten Zellen, und schließlich die Messung der Lichtemission.
Außerdem wird Licht, wie oben erwähnt, nur während des Zeitraums von 20 bis 30 Sekunden nach der Aktivierung des GPCR emittiert. Daher muss die Aufzeichnung des emittierten Lichts während der wenigen Sekunden, nachdem der Agonist den Zellen zugefügt worden ist, erfolgen.
Boie und Mitarbeiter (Boie et al., Eur. J. Pharmacol. 340:227–241, 1997) verwendeten einen Aequorin-Lumineszenz-Assay in HEK 293-Zellen, die den Prostanoid-EP1-Rezeptor (einen GPCR) der Ratte exprimieren. Die transfizierten Zellen werden mittels Inkubation mit Coelenteracin beladen, und die Lichtemission wurde unter Verwendung eines Luminometers 30 Sekunden lang gemessen, woraufhin Triton X-100 zur Solubilisierung der Zellen zugegeben und die Lichtemission erneut für weitere 10 Sekunden gemessen wurden. Das Verfahren gestattet es jedoch nicht, die Zellen solange zu erhalten, wie es nötig ist, um ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren durchzuführen.
Daher sind die Verfahren, die im Stand der Technik verwendet werden, nicht geeignet für einen Nachweis basierend auf einem Hoch-Durchsatz-Screening-Niveau, das normalerweise Luminometer und die Verwendung von Mikrotiter-Platten zum Testen von Tausenden von Verbindungen erforderlich macht.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf, ein Verfahren und Mittel, das/die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen, zum Nachweis von biologisch aktiven Substanzen, speziell Agonisten und/oder Antagonisten, für Calcium-gekoppelte Rezeptoren, zur Verfügung zu stellen.
Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein solches Verfahren und Mittel, die den Nachweis von biologisch aktiven Substanzen in einem Hoch-Durchsatz- Maßstab erlauben, und die an spezielle Träger wie Mikrotiter-Platten adaptiert werden können, ohne dass eine Modifikation der Vorrichtung für den Hoch-Durchsatz-Screening-Prozess erforderlich ist, bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches und preiswertes Verfahren bereitzustellen, das einfach automatisiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hoch-Durchsatz-Screening-Verfahren und eine ebensolche Vorrichtung für die Diagnose und Dosierung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten für einen „Calcium-gekoppelten" Rezeptor, wobei das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

– einen Agonisten und/oder einen Antagonisten (vorzugsweise von einem Molekül) des Rezeptors auf einen festen Träger aufzubringen,
– mindestens eine Zelle, die Apoäquorin und den „Calcium-gekoppelten" Rezeptor exprimiert, mit Coelenteracin zu inkubieren, um durch diese Zelle(n) ein aktives Äquorin zu rekonstituieren,
– dem festen Träger mindestens eine Zelle zuzufügen, wobei diese mindestens eine Zelle in einer homogenen Suspension vorliegt und gehalten wird, und
– die Messung des von dieser/n Zelle(n) emittierten Lichts vorzunehmen.

Der Begriff „Calcium-gekoppelter" Rezeptor steht für irgendeinen Rezeptor (wie einen G-gekoppelten Rezeptor oder einen Innenkanal), dessen Aktivierung (mittels eines Ions, eines bekannten oder unbekannten Agonisten oder Antagonisten) die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Zelle, die den Rezeptor enthält, vorzugsweise in ihrer cytoplasmatischen Membran, erhöhen kann.
Der Begriff „...auf einen festen Träger aufzubringen" bedeutet den Schritt, die Verbindung auf einen Träger wie eine Mikrotiter-Platte oder irgendeinen anderen festen Träger aufzubringen, ohne dass die Fixierung (kovalent oder anderweitig) der Verbindung auf dem festen Träger nötig wäre.
Vorteilhafter Weise ist der feste Träger eine Mikrotiter-Platte, vorzugsweise eine Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungenn.
Vorzugsweise ist die Zelle, die Apoäquorin und den Calcium-gekoppelten Rezeptor exprimiert, eine Zelle, die einen G-gekoppelten Rezeptor und möglicherweise mindestens ein Protein, wie es benötigt wird, um eine Kopplung des Rezeptors an den Calcium-Signalweg zu gewährleisten, exprimiert.
Vorzugsweise ist das Protein ausgewählt aus einem natürlichen G-α16- oder G-α15-Protein, einem chimären G-Protein, das resultiert aus einer Fusion zwischen zwei verschiedenen G-Proteinen, oder ein Phospholipase-Cβ2-Protein.
Die Messung des emittierten Lichtes erfolgt vorteilhafter Weise mit einem oder mit mehreren Luminometern, möglicherweise ausgerüstet mit mehreren Dispensern und Messköpfen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, die nicht beschränkend sind, und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher beschrieben.
1 zeigt eine Reihe von Kurven, die die Intensität des von Zellen emittierten Lichts als Funktion der Zeit für jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte, die mit Zellen versehen ist, die den CCR5-Rezeptor, Apoäquorin und G-α16 exprimieren, darstellen. Der Maßstab ist für allen Graphen derselbe. Die Aufzeichnung des Signals erfolgte über einen Zeitraum von 30 Sekunden. Von Spalte 1 nach Spalte 12 steigen die Konzentrationen des Liganden. Alle Messungen wurden zweifach durchgeführt. Zeilen A und B: Ligand ist RANTES; Zeilen C und D: Ligand ist MIP-1α; Zeilen E und F: Ligand ist MIP-1β; Zeilen G und H: Ligand ist Derivat A von RANTES.
2 stellt die Dosis-Wirkung-Kurve von verschiedenen Agonisten des CCR5-Rezeptors dar, wobei die RLEen (Integration des emittierten Lichts auf 30 Sekunden) gegen die Endkonzentration des Liganden in logarithmischer Darstellung aufgezeichnet sind.
3 stellt die Dosis-Wirkung-Kurve von verschiedenen Agonisten des 5HT-2B-Rezeptors dar.
4 stellt die Dosis-Wirkung-Kurve des aus K562-Zellen, die CCR3 und Äquorin als Reaktion auf die Aktivierung des Rezeptors mittels Eotaxin exprimieren, emittierten Lichts dar.
5 stellt die Dosis-Wirkung-Kurven für Zellen dar, die Äquorin und Gα16 und (5A) den Orexin-1-Rezeptor oder (5B) den Orexin-2-Rezeptor exprimieren.
6 stellt die Dosis-Wirkung-Kurve für verschiedene Antagonisten des 5HT-2B-Rezeptors dar.
Der Nachweis von agonistischen Aktivitäten mittels Säugetier-Zelllinien, die Apoäquorin und einen GPCR exprimieren, erfordert die Messung des emittierten Lichts, wobei die Messung erfolgen muss, unmittelbar nachdem die Zellen mit dem potentiellen Agonisten in Berührung gebracht worden sind. Dies kann bei einem geringen Durchsatz unter Verwendung eines Einzelröhrchen-Luminometers auf einfache Weise erfolgen. Bisher konnte dieses biologische System jedoch nicht im Hoch-Durchsatz-Maßstab angewendet werden. In der Tat,

(1) zwingt einen die Notwendigkeit, das Licht zu messen, unmittelbar nachdem die Zellen mit dem Agonisten in Berührung gebracht worden sind, ein Luminometer zu verwenden, das mit einem eingebauten Dispenser ausgestattet ist. Aufgrund der Kürze der Lichtemission ist es beispielsweise unmöglich, die zu testenden Wirkstoffe auf die Zellen in den 96 Vertiefungenn zu geben, während die Platte außerhalb des Luminometers ist, und anschließend das emittierte Licht aufzeichnen, während die Platte im Luminometer ist. Selbst wenn die Platte schnell (d. h. in weniger als 15 Sekunden) in das Luminometer gesetzt werden könnte, nachdem die zu testenden Wirkstoffe auf die Zellen gegeben worden sind, ermöglicht die gegenwärtige Apparatur keine Messung von Licht aus den 96 Vertiefungenn vor der Extinktion des Blitzsignals von Äquorin, da diese Luminometer nicht mit 96 Detektoren ausgerüstet sind.
(2) erlauben Luminometer, die mit einem eingebauten Dispenser ausgestattet sind, nur die Injektion einer einzigen Lösung in die 96 Vertiefungen, was die Injektion von verschiedenen Wirkstoffen in jede Vertiefung unmöglich macht. Darüber hinaus ist der Waschvorgang des Dispensers vor jeder Messung für die Injektion eines anderen Wirkstoffes in die nächste Vertiefung zeitaufwendig und somit für einen Hoch-Durchsatz-Maßstab ungeeignet. Dasselbe Problem tritt mit Vorrichtungen auf, die mit 6 Dispenser (z. B. "Microbeta^® Jet" von EG&G Wallac) ausgestattet sind, da die 6 Dispenser nur eine einzige Lösung zuführen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, um ein Screening mit hohem Durchsatz auf Wirkstoffe, die an GPCRen binden, mittels Säugetier-Zelllinien, die Apoäquorin und einen GPCR exprimieren, und mittels eines konventionellen Luminometers durchzuführen. Nach diesem Verfahren werden die Lösungen, die auf (ant)agonistische Aktivitäten zu testen sind, in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gegeben. Zellen, die Apoäquorin und einen GPCR exprimieren, werden von der Kulturplatte abgelöst (oder aus Suspensionskulturen gesammelt) und mit Coelenteracin inkubiert, um aktives Äquorin zu rekonstituieren. Diese werden dann mit einem Magnetrührer in Suspension gehalten. Diese Zellsuspension wird dann, Vertiefung für Vertiefung, auf die Lösungen des potenziellen Agonisten, der getestet werden soll, injiziert. Dann wird die Lichtemission 1 Sekunde lang aufgezeichnet (alternativ bis zu 30 oder mehr Sekunden). Dieses Verfahren, dieselbe Zellsuspension in jedes der 96 Vertiefungen zu injizieren, vermeidet die Notwendigkeit, den Dispenser zwischen jeder Messung zu waschen und erlaubt 96 Messungen von Agonistinduzierter Äquorin-Lichtemission in 15 Minuten oder weniger mit einem einzigen Dispenser-Luminometer. Alternativ ermöglicht es 96 Messungen der Agonist-induzierten Äquorin-Lichtemission in 2 Minuten oder weniger mit einem Luminometer, das mit 6 Dispenser und Meßköpfen (z. B. "Microbeta^® Jet" von EG&G Wallac) ausgestattet ist.
Dieses Verfahren erlaubt somit die Durchführung eines Hoch-Durchsatz-Screenens (10.000 Proben/Tag) mit Säugetier-Zelllinien, die Apoäquorin und einen GPCR expremieren, mittels Verwendung eines konventionellen Luminometers. Dies reduziert die Zeit fürs Screenen und die Menge an Wirkstoffen, die für jede Messung benötigt wird.
Dieses System erlaubt auch die Durchführung eines funktionellen Screenings mit sehr wenigen Zellen pro Messung (herunter bis 5.000 oder weniger).
Die Injektion der Zellen in die Vertiefungen, die die Agonisten enthalten, erhöhten den Hintergrund der Messung (der beispielsweise seinen Ursprung haben könnte im Aufbrechen von Zellen, im Freisetzen von Äquorin-Molekülen aus den Zellen in das Kulturmedium, wo die Calcium-Konzentration die Emission von Licht aus Äquorin ausgelöst hätte) nicht. Ein Signal-Rausch-Verhältnis von über 50 wurde mit diesem System der Zellinjektion üblicherweise erhalten.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet für die Durchführung von Hoch-Durchsatz-Analysen der Stimulation von GPCR oder anderen Calcium-gekoppelten Rezeptoren durch bekannte oder potenzielle Agonisten mittels Zellen, die den Rezeptor und Apoäquorin exprimieren. Diese Zellen können Apoäquorin im Cytoplasma exprimieren, wie beschrieben von Sheu et al. (1993) oder Button und Brownstein (1993). Apoäquorin kann aber auch mittels Anfügen einer auf Mitochondrien zielgerichteten Sequenz an Äquorin, wie sie von Stables et al. (1997) verwendet wird, in Mitochondrien exprimiert werden. Schließlich kann Apoäquorin aber auch in irgendeinem anderen Teil der Zelle exprimiert werden. Diese Zellen können auch Proteine exprimieren, die die Kopplung des überexprimierten Rezeptors an den Calcium-Signalweg sicherstellen sollen. Dies können die natürlichen Proteine Gα16 oder Gα15 (Milligan et al., 1996), chimäre G-Proteine, die aus einer Fusion zwischen zwei verschiedenen G-Proteinen resultieren (Komatsuzaki et al., 1997), Phospholipase C-β2 (Park et al., 1992) oder irgendein anderes "universelles Kupplungs"-Protein sein. Wenn die Zellen erst einmal hergestellt und mit Coelenteracin beladen worden sind, können sie für mehrere Stunden (wenigstens 9 Stunden) verwendet werden. Die Beladung mit Coelenteracin und die Intensität des Lichts, das von den Zellen nach Stimulierung durch den Agonisten emittiert wird, ist für diese Zeitspanne stabil.
Beispiele
Beispiel 1
Es wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Chemokin-CCR-5-Rezeptor, das Kopplungsprotein Gα16 und Apoäquorin exprimiert. Zellen wurden als Monolager in HAMs F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet. Am Tag des Experiments wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS-EDTA (Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne Calcium, ergänzt mit 5 mM EDTA) inkubiert. Die Zellen wurden durch Schütteln der Kulturplatte mit der Hand und durch Auf- und Abpipettieren von dem Kulturgefäß abgelöst. Die Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt, um das EDTA zu eliminieren; der Bodensatz wurde in HAMs F12-Kulturmedium ohne FBS und mit 0,1% BSA resuspendiert. Die Zellen wurden mittels einer Thomas-Zelle gezählt, wieder zentrifugiert und in HAMs F12-Kulturmedium ohne FBS und mit 0,1% BSA in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Coelenteracin (oder ein Derivat von diesem, z. B. Coelenteracin f, h, n, cp oder hcp, von Molecular Probes Inc.) in einer Konzentration von 500 μM in Methanol wurde der Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 5 μM zugegeben. Die Zellsuspension wurde dann bei Raumtemperatur 3 bis 5 Stunden lang im Dunklen gelagert, wobei alle 15 bis 30 Minuten geschüttelt wurde, um die Zellen in Suspension zu halten.
Verdünnungsreihen bekannter Liganden wurden in HAMs F12-Kulturmedium ohne FBS und mit 0,1% BSA hergestellt. Jeweils 50 μl dieser Lösung wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gegeben. Die Zellsuspension wurde fünffach mit HAMs F12-Medium ohne FBS und mit 0,1% BSA verdünnt und in einem Glas- oder Plastikcontainer gegeben, der dadurch vor Licht geschützt war, dass er mit Aluminiumfolie eingepackt wurde. Ein Magnet-Rührfisch wurde der Suspension zugeben und ein magnetischer Rührer wurde bei langsamer Geschwindigkeit (1 bis 5 Umdrehungen/sec) verwendet, um die Zellen in einer homogenen Suspension zu halten. Der Magnet-Rührfisch wurde mit einem Ring versehen, um Verletzungen der Zellen und nachfolgende Freisetzung von Äquorin in das Kulturmedium zu vermeiden. Alternativ kann ein Kulturgefäß, das ausgerüstet ist für die Kultur von Zellen in Suspension, verwendet werden.
Man verwendet das EG&G Wallacs MicroLumatPlus Mikroplatten-Luminometer, das die Injektion und direkt nachfolgende Aufzeichnung des emittierten Lichts aus jeder Vertiefung einer 96-Loch-Platte erlaubt. Das Ende des Eintrittsröhrchens des Dispensers wurde auf den Boden der Zellsuspension gegeben. Der Dispenser wurde mit dem dreifachen Totvolumen der Apparatur gewaschen, so dass das gesamte Volumen des Röhrchens und der Pumpen mit der Zellsuspension gefüllt war. Die 96-Loch-Platte, die Lösungen der Agonisten enthielt, wurde dann in das Luminometer eingeführt. Dann wurden jeweils 50 μl der Zellsuspension (d. h. 100.000 Zellen) in jede Vertiefung gegeben (bei der niedrigsten Injektionsgeschwindigkeit: 0,4 sec), um das Aufbrechen von Zellen zu verhindern, das die Freisetzung von Äquorin in das Kulturmedium bedingen würde. Das emittierte Licht wurde über einen Zeitraum von 30 sec sofort aufgezeichnet. Nach dem Ablesen der ersten Vertiefung wurden Zellen in die nächste Vertiefung injiziert und das emittierte Licht aufgezeichnet, etc. Für jede Platte wurde eine Reihe von Kurven, die die Intensität des emittierten Lichts als Funktion der Zeit für jede Vertiefung darstellen, dargestellt (1). Die Intensität des emittierten Lichts wurde unter Verwendung der Winglow-Software, die mit dem Luminometer bereitgestellt wurde, über einen Zeitraum von 30 sec integriert. Es ergab sich für jede Vertiefung ein Wert, der repräsentativ ist für das emittierte Licht und deshalb für die Stimulation des CCR-5-Rezeptors durch den in der Vertiefung vorhandenen Agonisten. Diese Werte können gegen den Logarithmus der Liganden- Konzentration aufgetragen werden, um die Dosis-Wirkung-Kurve zu erzeugen, wie sie in 2 dargestellt ist. Diese erlauben die Bestimmung der Dosis für halbmaximale Antwort (EC₅₀) für jeden Liganden. Für die Erzeugung dieser Daten wurden 288 Messungen in weniger als 3 Stunden durchgeführt.
Beispiel 2
Es wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Serotonin-5HT-2B-Rezeptor, das Kopplungsprotein Gα16 und Apoäquorin exprimiert. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und nach ihrer Verdünnung (100 μl/Loch, entsprechend 50.000 Zellen) zu je 100 μl Lösung eines für diesen Rezeptor bekannten Agonisten gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Dosis-Wirkung-Kurven, die für verschiedene Agonisten erhalten wurden, sind in 3 dargestellt. Für die Erzeugung dieser Daten wurden 144 Messungen in weniger als 1 Stunde durchgeführt.
Beispiel 3
K562-Zellen, die den Chemokin-CCR3-Rezeptor exprimieren, wurden durch ein Plasmid für die Expression von Äquorin und das Gα16-Kupplungsprotein transfiziert. Auf stabil transfizierte Zellen wurde über einen Zeitraum von 2 Wochen mit dem Antibiotikum Zeocin selektiert. Diese Zellen wurden in DMEM-Kulturmedium, enthaltend 10% FBS, in Suspension kultiviert. Sie wurden zentrifugiert, der Bodensatz wurde verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben, um Äquorin-Messungen vorzunehmen. Eine Dosis-Wirkung-Kurve mit Eotaxin und MCP-4, wie sie durch dieses Verfahren erzeugt wurde, wird in 4 beschrieben.
Beispiel 4
Es wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Orexin 1- oder Orexin 2-Rezeptor, das Kopplungsprotein Gα16 und Apoäquorin exprimiert. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und nach ihrer Verdünnung (100 μl/Loch, entsprechend 25.000 Zellen) zu je 50 μl Lösung eines bekannten Agonisten für diese Rezeptoren bekannten Agonisten gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Eine Dosis-Wirkung-Kurve, die für verschiedene Agonisten erhalten wurde, ist in 5A dargestellt.
Beispiel 5
Es wurde eine CHO-Zelllinie etabliert, die den Kanabinoid-CB1-Rezeptor, das Kopplungsprotein Gα16 und Apoäquorin exprimiert. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und nach ihrer Verdünnung (100 μl/Loch, entsprechend 50.000 Zellen) zu je 100 μl Lösung eines bekannten Agonisten für diesen Rezeptor gegeben. Das emittierte Licht wurde für jede Vertiefung über einen Zeitraum von 20 sec aufgezeichnet. Die Dosis-Wirkung-Kurve, die für dieses Verfahren erhalten wurde, ist in 5B dargestellt.
Für die Messung von antagonistischen Aktivitäten wurden Zellen auf Verdünnungsreihen von Antagonisten gegeben. In diesem Stadium wurde das emittierte Licht aufgezeichnet, um zu überprüfen, dass die potenziellen Antagonisten keine agonistische Aktivität aufwiesen. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit den Antagonisten inkubiert. Eine Lösung des Agonisten (Alpha-Methyl-5HT) des 5HT-2B-Rezeptors wurde dann auf die Zellen injiziert und das emittierte Licht sofort für jede Vertiefung aufgezeichnet. Das emittierte Licht wurde als Funktion der logarithmischen Konzentration des Antagonisten aufgetragen und ergab die gezeigte Kurve. Steigende Konzentrationen des Antagonisten resultieren in der Abnahme der Lichtemission nach Zugabe des Agonisten. Ein Agonist eines anderen Rezeptors, der von den Zellen exprimiert wurde (gewöhnlicher Weise ATP, das an P2-Rezeptoren wirkt), kann dann auf das Gemisch des Antagonisten mit den Zellen und auf den Agonisten als Kontrolle gegeben werden, um zu überprüfen, ob die Zellen immer noch aktives Äquorin bis zu diesem Moment des Experiments haben. Zum Beispiel können cytotoxische Verbindungen, die die intrazelluläre Calcium-Konzentration erhöhen, dazu führen, das das Äquorin sämtliches Coelenteracin, das in der Zelle vorliegt, aufbraucht. Eine derartige cytotoxische Verbindung wird durch die Abwesenheit des Signals nach ATP-Injektion (6) nachgewiesen.
LITERATUR

– Button, D. & Brownstein, M., Cell Calcium 14, pp. 663–671 (1993)
– Komatsuzaki, K. et al., FEBS Lett. 406, pp. 165–170 (1997)
– Milligan, G. et al., TIPS 17, pp. 235–237 (1996)
– Park, D. et al., J. Biol. Chem. 267, pp. 16048–16055 (1992)
– Rink, T. J., FEBS Lett. 268, pp. 381–385 (1990)
– Santella, L. & Carafoli, FASEB J. 11, 1091–1109 (1997)
– Sheu, Y.-A. et al., Analytical Biochemistry 209, pp. 343–347 (1993)
– Stables, J. et al., Analytical Biochemistry 252, pp. 115–126 (1997)
– Tsunoda, Y., Biochem. Biophys. Acta 1154, pp. 105–156 (1993)

Claims

Diagnostisches und/oder Dosierungsverfahren für einen Agonisten und/oder einen Antagonisten für einen Calcium-gekoppelten Rezeptor oder einen Calcium-gekoppelten Kanal oder irgendein anderes Calcium-gekoppeltes Protein, wobei das Verfahren die folgenden sukzessiven Schritte umfaßt: – den Agonisten und/oder Antagonisten auf einen festen Träger aufzubringen, – eine oder mehrere Apoaequorin oder irgendein anderes verwandtes Protein und den Calcium-gekoppelten Rezeptor exprimierende Zellen mit Coelenterazin oder irgendeinem anderen Co-Faktor eines Calcium-sensitiven Proteins zu inkubieren, um durch diese Zelle(n) ein aktives Aequorin zu rekonstituieren, wobei die Zellen in einer homogenen Suspension vorliegen und gehalten werden, – diesem festen Träger eine oder mehrere dieser Zellen zuzusetzen und – das durch diese Zelle(n) emittierte Licht zu messen.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Mikrotiter-Platte ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrotiter-Platte eine Mikrotiter-Platte mit 96 oder 384 oder 1536 Vertiefungen oder eine Mikrotiter-Platte anderer Größe ist.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle Apoaequorin im Cytoplasma, in den Mitochondrien oder in irgendeinem anderen Bereich der Zelle exprimiert.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die einen Calciumgekoppelten Rezeptor exprimierende Zelle eine einen endogenen oder rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimierende Zelle und/oder eine Zelle ist, die Proteine exprimiert, die eine Kopplung des analysierten Rezeptors an den Calcium-Stoffwechselweg gewährleisten sollen.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den natürlichen Gα16- oder Gα15-Proteinen, aus einem durch Fusion zwischen zwei verschiedenen G-Proteinen gebildeten chimären G-Protein, aus der Phospholipase Cβ2, aus irgendeinem anderen Kopplungsprotein und aus irgendeiner anderen Kopplungschemikalie.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung des emittierten Lichts mit einem oder mehreren Luminometer/n, vorzugsweise versehen mit mehreren Verteilern und Meßköpfen, erfolgt.