DE60120653T2

DE60120653T2 - High throughput screening durch messen der intrazellulären kalziumspiegel

Info

Publication number: DE60120653T2
Application number: DE60120653T
Authority: DE
Inventors: K. Stephan Rahway GRANT; J. Gregory Rahway KACZOROWSKI; E. Richard Rahway MIDDLETON
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: ES2264441T3; CA2402693C; AU2001247420A1; EP1266037B1; CA2402693A1; EP1266037A4; US6514709B1; EP1266037A1; ATE330027T1; WO2001068922A1; DE60120653D1; JP2003527113A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Assays, in denen intrazelluläre Chelatoren dazu verwendet werden, die Kinetik der Signalerzeugung, welche durch zweiwertige Kationen, insbesondere Calcium, induziert wird, zu verändern.
Hintergrund der Erfindung
Bei einer Vielfalt von zell-basierten funktionellen Assays werden Messungen der intrazellulären Calcium-Konzentration verwendet, um die Aktivität von Proteinen in einer normalen physiologischen Umgebung zu ermitteln. Diese umfassen einen Assay für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) und Plasmamembran-Ionenkanäle. Die große und schnelle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch Stimulation dieser Rezeptoren und Ionenkanäle kann durch für intrazelluläres Calcium sensitive Sonden, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, calcium-bindender Proteine, wie z.B. das biolumineszierende Protein Aequorin und eine Chimäre von modifiziertem grünen Fluoreszenzprotein und Calmodulin (Ungrin, M. D., Singh, L. M. R., Stocco, R., Sas, D. E., Abramovitz, M. (1999), An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled receptors, Anal. Biochem. 272, 34–42; Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., und Herman, B. (1999), Measurement of intracellular calcium, Physiological Reviews 79, 1089–1125; Gonzalez, J. E., Oades, K., Leychis, Y., Harootunian, A., und Negulescu, P. (1999), Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets, Drug Discovery Today 4, 431–439; Miyawaki, A., Llopsi, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., und Tsien, R. Y. (1997), Fluorescent indicators for Ca²⁺ based on green fluorescent proteins and calmodulin, Nature 388, 882–887; Creton, R., Kreiling, J. A., und Jaffe, L. F. (1999), Calcium imaging with chemiluminescence, Microsc. Res. Tech. 46, 390–397; Prasher, D., McCann, R. O., und Cormier, M. J. (1985), Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, A bioluminescent calcium-binding protein, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126, 1259–1268), nachgewiesen werden.
Der Nachweis schneller und vorübergehender Änderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration erfordert ein Instrument, welches gleichzeitig ein Stimulans mit den Zellen mischt und sofort die Veränderung der Fluoreszenz oder Lumineszenz des Calcium-Reporters nachweist. Diese Notwendigkeit von gleichzeitiger Flüssigkeitsabgabe und Signalnachweis beschränkte den Einsatz dieser Calcium-Transient-Messungen in zell- basierten funktionellen Assays aufgrund des Mangels verfügbarer Instrumente. Die vorliegende Erfindung demonstriert den Nutzen eines intrazellulären Calcium-Chelators, um die Calcium-Signalreaktion in einem Screeningformat hoher Dichte, wie z.B. 96-Mulden-, 384-Mulden-, 1526-Mulden- oder 3456-Mulden-Mikrotiterplatten, zu verzögern und/oder zu verlängern. Die Veränderung der Kinetik des Calcium-Signals in Anwesenheit des Chelators erhält die Integrität des Assays und gibt gleichzeitig mehr Zeit für die Messung des transienten Signals nach Zugabe des Stimulans. Deshalb können Hochdurchsatz-Screening-Funktionsassays auch mit einer größeren Vielfalt von Laborinstrumenten durchgeführt werden.
Praktiker auf dem Gebiet des Screenings versuchten Verfahren bereitzustellen, um die verfügbare Zeit zur Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Signalen zu verlängern. Beispielsweise bestand eine Idee in der Zugabe eines Reagens, um die Kinetik einer zellulären Reporterenzym-Reaktion zu ändern oder zu verlangsamen. Beispiele dieses Ansatzes sind der Übergang von Luciferase-basierter Blitzlumineszenz auf Glühlumineszenz-Formate wie z.B. der „PACKARD LUCLITE^® Luciferase Reporter Gene Assay Kit" (siehe US-Patent Nr. 5,618,682 und EP-Patentanmeldung 94 102 080.2) oder das „PROMEGA STEADY-GLO^TM Luciferase Assay System" (siehe US-Patent Nr. 5,283,179).
Intrazelluläre Chelatoren von Calcium werden routinemäßig verwendet, um Calcium-Reaktionen in einer Reihe von Systemen zu eliminieren, jedoch wurde die Kinetik intrazellulärer Calcium-Reaktionen primär in Abwesenheit von Chelatoren beschrieben (Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., und Herman, B. (1999), Measurement of intracellular calcium, Physiological Reviews 79, 1089–1125; Struk, A., Szucs, G., Kremmer, H., und Melzer, W. (1998), Fura-2 calcium signals in skeletal muscle fibres loaded with high concentrations of EGTA, Cell Calcium 23, 23–32; Keller, J. N., Guo, Q., Holtsberg, F. W., Bruce-Keller, A. J., und Mattson, M. P. (1998), Increased sensitivity to mitochondrial toxin-induced apoptosis in neural cells expressing mutant presenilin-1 is linked to perturbed calcium homeostasis and enhanced oxyradical production, J. Neurosci. 18, 4439–4450). Jedoch wurden bei Versuchen, die neuro-protektiven Eigenschaften von BAPTA-AM zu verstehen, die Wirkungen dieses Chelators auf intrazelluläre Calcium-Transients detaillierter untersucht (Tymianski, M., Wallace, M. C., Spigelman, I., Uno, M., Carlen, P. L., Tator, Ch. H., und Charlton, M. P. (1993), Cell-permeant Ca²⁺ chelators reduce early excitotoxic and ischemic neuronal injury in vitro and in vivo, Neuron 11, 221–235). Beispielsweise bot, wenn hohe Konzentrationen an Glutamat verwendet wurden, um Maus-Rückenmarkneuronen zu stimulieren, BAPTA-AM einen Schutz und beeinflusste primär den schnellen Transient durch Verringerung der Amplitude und Verzögerung der Anstieg- und Abklingzeit des Transients (Tymianski, M., Charlton, M. P., Carlen, P. L., und Tator, C. H. (1994), Properties of neuroprotective cell-permeant Ca²⁺ chelators: Effects on [Ca²⁺]; and glutamate neurotoxicity in vitro, J. Neurophys. 72, 1973–1992). Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung eines durch Ionomycin induzierten Calcium-Einstroms erhalten, wobei die beobachteten Calcium-Transients in Anwesenheit von BAPTA-AM um das 8fache langsamer waren (Collatz, M. B., Rudel, R., und Brinkmeier, H. (1997), Intracellular calcium chelator BAPTA protects cells against toxic calcium overload but also alters physiological calcium responses, Cell Calcium 21, 453–459).
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die Pufferung von intrazellulärem Calcium mit einem calcium-bindenden Reagens die Calcium-Signalreaktion auf eine Weise verzögern und/oder verlängern kann, dass sie praktisch auf Screening-Assays mit hohem Durchsatz angewandt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, bei denen intrazelluläre Chelatoren dazu verwendet werden, die Kinetik der durch zweiwertige Kationen, insbesondere Calcium-Anhäufung im Zell-Zytoplasma, induzierten Signalerzeugung zu verändern. Die Verwendung eines intrazellulären Chelators in dem Assay kann das Signal verzögern und verlängern und gestattet es, das Signal durch automatische Geräte nachzuweisen, ohne dass eine gleichzeitige Flüssigkeitshandhabung zum Zeitpunkt des Nachweises erforderlich ist.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist ein Assay mit hohem Durchsatz, bei dem Zellen mit einem Rezeptor, welcher nach Aktivierung einen Calcium-Einstrom in die Zelle induziert, mit einem intrazellulären Calcium-Chelator in Kontakt gebracht werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Chelator 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM). In speziellen Ausführungsformen enthalten die Zellen auch ein Signalerzeugungssystem auf Basis von Aequorin oder einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer Chimäre von grünem Fluoreszenzprotein und Calmodulin. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Assay in einem Mikrotiterplatten-Format durchgeführt und ein Instrument wird zum Nachweis des Signals in jeder Mulde eingesetzt.
"Ungefähr" bedeutet innerhalb von 10% bis 20% mehr oder weniger als speziell angegeben.
Wie hier verwendet, ist ein "Agonist" eine Verbindung oder ein Molekül, welche(s) mit einem Rezeptor wechselwirkt und eine Aktivität des Rezeptors stimuliert.
Wie hier verwendet, ist ein "Antagonist" eine Verbindung, welche mit einem Rezeptor wechselwirkt und die Aktivierung des Rezeptors inhibiert oder stört.
Wie hier verwendet, ist ein "Inhibitor" eine Verbindung, welche mit einem Rezeptor wechselwirkt und dessen Aktivierung inhibiert oder verhindert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Kinetik der calcium-abhängigen Lumineszenz nach Zugabe eines intrazellulären Chelators in einem Assay unter Verwendung eines Ionenkanals, der mit Apoaequorin koexprimiert wurde.
2 zeigt eine schematische Darstellung des zell-basierten funktionellen Lumineszenz-Assays mit einem intrazellulären Chelator in einem Assay unter Verwendung eines Ionenkanals, der mit Apoaequorin koexprimiert wurde.
3 zeigt die Wirkung eines Rezeptor-Antagonisten auf die Kinetik der Lumineszenz nach der Zugabe eines intrazellulären Chelators in einem Assay unter Verwendung eines Ionenkanals, der mit Apoaequorin koexprimiert wurde.
4 zeigt die Kinetik in einem Assay unter Verwendung eines mit Apoaequorin koexprimierten GPCR plus oder minus dem intrazellulären Calcium-Chelator.
5 zeigt die Kinetik der calcium-abhängigen Fluoreszenz nach der Zugabe eines intrazellulären Chelators in einem Assay unter Verwendung eines Ionenkanals.
6 zeigt, dass BAPTA die Calcium-Reaktion in VR1-Zellen verzögert, wie mittels Fluo-3-Fluoreszenz gemessen. VR1-Zellen wurden in 96-Mulden-Assayplatten über Nacht gezüchtet und dann mit 5 μM Fluo-3-AM für 30 Minuten in Anwesenheit oder Abwesenheit der angegebenen Konzentration von BAPTA-AM wie in Materialien und Methoden beschrieben beladen. Die Zellen wurden gewaschen und entweder PBS oder 20 μM Capsazepin wurde für 30 Minuten zugegeben. Die Platte wurde dann mit einem VIPR-Fluoreszenzdetektor (Anregung 480 nm; Emission 535 nm; Gonzalez, J. E., Oades, K., Leychis, Y., Harootunian, A., und Negulescu, P. (1999), Cell-based assays and instrumentation for screening ion- channel targets, Drug Discovery Today 4, 431–439), welcher 0,5 μM (A) oder 0,1 μM (B) Capsaicin nach einer Ablesung für 8 Sekunden hinzufügte und die Ablesung für insgesamt 180 Sekunden fortsetzte. Die Daten wurden bei 1 Hz ermittelt und alle Daten wurden auf die Ausgangs-Grundlinienfluoreszenz (2–5 s) normalisiert. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von vier identischen Mulden.
7 zeigt, dass BAPTA die Calcium-Reaktion in VR1-Zellen verzögert, wie mittels Aequorin-Lumineszenz gemessen. VR1 wurde stabil in HEK293-Zellen exprimiert, welche auch Apoaequorin exprimierten. Die Zellen wurden in 96-Mulden-Assayplatten über Nacht gezüchtet und dann 2 h lang mit dem Substrat Coelenterazin (5 μM) inkubiert, um Apoaequorin in Aequorin zu überführen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit der angegebenen Konzentration an BAPTA-AM für 30 Minuten inkubiert. Nach einem PBS-Waschschritt wurde den Zellen entweder PBS oder 50 μM Capsazepin für 30 Minuten oder länger hinzu gegeben. Die Platten wurden dann mit einem WALLAC MICROBETA JET-Luminometer abgelesen. (A) Daten wurden bei 1 Hz nach Zugabe von 50 nM Capsaicin ermittelt. Die Daten sind der Mittelwert von 6 individuellen Mulden. (B) In parallelen Experimenten wurde der Zeitpunkt, zu dem die Peak-Lumineszenz nach Inkubation mit den angegebenen BAPTA-AM-Konzentrationen auftrat (Mittel von 6 Bestimmungen), gegen die Capsaicin-Konzentration aufgetragen, welche mit dem WALLAC MICROBETA JET zugegeben worden war.
8 zeigt, dass BAPTA die Calcium-Reaktion in hGHSR1 verzögert, wie gemessen durch sowohl Fluoreszenz als auch Lumineszenz. Zellen, welche hGHSR1A exprimieren, wurden in 96-Mulden-Assayplatten über Nacht gezüchtet und dann mit entweder (A) 5 μM Fluo-4-AM für 70 Minuten wie in 2 beschrieben oder (B) 5 μM Coelenterazin wie in 3 beschrieben beladen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit den angegebenen Konzentrationen an BAPTA-AM für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden wiederum mit PBS gewaschen und dann mit oder ohne 10 μM L-756,867 für 30 Minuten inkubiert. (A) Fluoreszenz-Reaktion bei dem VIPR (Anregung 480 nm; Emission 535 nm) nach Zugabe von 100 nM Ghrelin. Daten wurden auf die Ausgangs-Grundlinienfluoreszenz (2–5 s) normalisiert und repräsentieren den Mittelwert von 12 oder vier Mulden in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von L-756,867. (B) Aequorin-Lumineszenz, gemessen mit dem WALLAC MICROBETA JET nach Zugabe von 100 nM Ghrelin. Die Daten sind der Mittelwert von 6 Mulden und die Einfügung zeigt die Daten für 20 μM BAPTA-AM in einem unterschiedlichen Maßstab mit der Standardabweichung für jede 1-Sekunden-Bestimmung.
9 zeigt, dass BAPTA die Calcium-Reaktion in HEK-AEQ-Zellen verzögert, wie mittels Fluo-4-Fluoreszenz gemessen. Die HEK-AEQ-Zellen haben einen endogenen mAChR, der mit der InsP₃-vermittelten Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern gekoppelt ist. (A) Zellen wurden über Nacht in 96-Mulden-Assayplatten gezüchtet und dann 60 Minuten lang mit 5 μM Fluo-4-AM +/– der angegebenen Konzentration an BAPTA-AM inkubiert. Zellen wurden mit PBS gewaschen und erhielten entweder PBS oder 50 μM Atropin für 15 Minuten zugesetzt. Die Platte wurde dann mit einem VIPR-Fluoreszenzdetektor (Anregung 480 nm; Emission 535 nm) abgelesen, welcher 10 μM Muscarin nach 8 Sekunden zusetzte. Die Daten wurden bei 1 Hz ermittelt und alle Daten wurden auf die Ausgangs-Grundlinienfluoreszenz (2–5 s) normalisiert. Die Linien repräsentieren den Mittelwert von 6 individuellen Mulden. (B) Identisch mit (A), mit Ausnahme dessen, dass alle Mulden mit 3 μM BAPTA-AM und den angegebenen Konzentrationen an Atropin inkubiert wurden. Vor der Zugabe von 10 μM Muscarin wurde mit dem VIPR die Fluoreszenz jeder Mulde 5 Sekunden lang abgelesen. Zur Bestimmung der Stabilität des Fluoreszenzsignals gab es eine Verzögerung von 5 Minuten nach der Zugabe des Muscarin, bevor die Platte in dem VIPR für weitere fünf Sekunden abgelesen wurde. Die Punkte repräsentieren den Mittelwert und die Standardabweichungen der Veränderung der Fluoreszenz, die in 8 individuellen Mulden aufgezeichnet wurde.
10 zeigt die Inhibierung der Lumineszenzreaktionen, die zwei Minuten nach Zugabe von Ghrelin oder Capsaicin gemessen wurde. Die Zellen wurden für die Lumineszenz-Ablesung auf dem WALLAC MICROBETA JET wie in 3 beschrieben präpariert, mit entweder keinem BAPTA-AM (Δ), 3 μM BAPTA-AM (O) oder 10 μM BAPTA-AM (☐). (A) hGHSR1A-Zellen, inkubiert mit den angegebenen Konzentrationen an L-756,867. (B) VR1-Zellen, inkubiert mit der angegebenen Konzentration an Capsazepin. (A) Ghrelin (100 nM) oder 0,5 μM Capsaicin (B) wurden manuell zu 6 Mulden zugegeben und nach zwei Minuten wurde die Lumineszenz 10 Sekunden lang abgelesen. Jeder Punkt ist der Mittelwert und die Standardabweichung von 1–10 Bestimmungen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, in denen intrazelluläre Chelatoren dazu verwendet werden, die Kinetik der Signalerzeugung, die von zweiwertigen Kationen, insbesondere dem Calcium-Einstrom in die Zelle, induziert wird, zu verändern. Die Verwendung eines intrazellulären Chelators in dem Assay kann das Signal verzögern und verlängern und gestattet den Nachweis des Signals durch automatische Instrumente ohne die Notwendigkeit einer gleichzeitigen Flüssigkeitshandhabung zum Nachweiszeitpunkt.
Die vorliegende Erfindung ist allgemein anwendbar auf die Messung intrazellulärer Calcium-Niveaus, sei es mittels Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder anderer Nachweistechniken, da der spezielle Rezeptor, das spezielle Enzym oder die spezielle Reaktion nicht direkt inhibiert wird, sondern nur die Kinetik der Signalerzeugung durch Änderung der Niveaus an freiem Calcium verändert wird. Obwohl spezielle Calcium-Chelatoren wie BAPTA und EGTA umfangreich verwendet wurden, um sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Calcium-Niveaus zu puffern, setzt die vorliegende Erfindung intrazelluläre Chelatoren ein, um die Kinetik des calcium-sensitiven Reporters (sei es ein Protein, Enzym oder eine Chemikalie) zu beeinflussen. Das Ergebnis ist, dass das Signal verzögert und verlängert wird. Darüber hinaus ist die Erfindung insbesondere anwendbar auf Hochdurchsatz-Screening und funktionelle Ganzzell-Assays für Verbindungen mit biologischer Aktivität.
Im allgemeinsten Fall kann man jeden Typ von Protein oder Verbindung verwenden, welcher intrazelluläres Calcium schnell binden und festhalten kann. Man kann testen, ob ein spezielles calcium-bindendes Reagens geeignet ist, indem es in einem hier gelehrten Assay getestet und das Ergebnis mit dem unter Verwendung von BAPTA-AM durchgeführten Assay verglichen wird.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von zell-permeablen Calcium-Chelatoren, wie z.B. BAPTA-AM, 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester, um Veränderungen der zellulären Calcium-Niveaus zu regulieren. Das Verfahren ist anwendbar auf das Screening hinsichtlich Verbindungen mit biologischer Aktivität, wobei schnelle und vorübergehende Veränderungen des zellulären Calciums gemessen werden. Beispiele beinhalten die Ermittlung von Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten für Calcium-Ionenkanäle oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR's), welche Veränderungen der zellulären Calcium-Konzentration hervorrufen. Die Zugabe des Calcium-Chelators BAPTA-AM zu den Zellen puffert die Calcium-Reaktion und verändert die Kinetik des Calcium-Signals, wie gemessen durch intrazelluläre Reporter, wie z.B. das calcium-sensitive biolumineszierende Aequorin-Protein oder fluoreszierende Proteine oder synthetische Sonden wie die fluoreszierenden Calcium-Farbstoffe (Fura 2, Fluo 3, Quin 2, Indo 1, etc.)
Wird ein intrazellulärer Calcium-Chelator wie BAPTA-AM zu Zellen hinzu gegeben (1–50 μM), wird die Stimulation der Rezeptoren nicht beeinflusst, jedoch das von den Reportern erzeugte Signal aufgrund der Pufferung der Konzentration an freiem Calcium durch Chelatbildung verzögert. Das Ergebnis ist die Verzögerung des calcium-abhängigen Signals (wie z.B. Lumineszenz- oder Fluoreszenzänderungen) um mehrere Sekunden und die Ver längerung des Signals um mehrere Minuten. Während viele funktionelle Assays für die Calcium-Signalisierung als "Blitz"-Assays bezeichnet werden, da sie sofort und transient stattfinden (vollständig innerhalb weniger Sekunden des Stimulus), ermöglicht es die Zugabe des Verzögerungsreagens BAPTA-AM, dass das Signal von Instrumenten ohne gleichzeitige Flüssigkeitshandhabung abgelesen wird.
Ein Modell wie die Calcium-Chelierung durch BAPTA die Aequorin-Lumineszenz verzögern könnte, kann unter Bezugnahme auf 2 erörtert werden. BAPTA-AM wird dazu verwendet, den Calcium-Chelator BAPTA vor der Stimulation in Zellen einzubringen. Zunahmen des intrazellulären Calciums, wie sie z.B. auftreten, wenn Capsaicin an den VR1-Rezeptor bindet, werden Aequorin veranlassen, Coelenterazin zu Coelenteramid unter gleichzeitiger Freisetzung von Photonen zu oxidieren. Die Lichtemission könnte verhindert werden, wenn ein Calcium-Chelator wie BAPTA freies Calcium schneller als Aequorin bindet. Die relativen Bindungsraten würden dann die Menge an Calcium bestimmen, welche an Aequorin (oder andere calcium-sensitive Reporter) gegenüber BAPTA bindet. Der Unterschied der Bindungsrate kann von vielen Faktoren abhängen, wie z.B. inhärente Assoziationsraten, freie Konzentration an Calcium und verfügbares BAPTA und Aequorin. Nachdem BAPTA in Zellen mit Konzentrationen, die mindestens 10fach höher sind als dessen Affinität für Calcium, eingebracht werden können, wird dessen Kapazität zur Chelierung des intrazellulären Calcium-Einstroms wahrscheinlich durch die freie BAPTA-Konzentration, die innerhalb des Zytoplasmas erreicht wird, und nicht die freie CalciumKonzentration bestimmt. Nachdem freies BAPTA an Calcium gebunden wird, würde weiterer Calcium-Einstrom primär zu Aequorin-Lumineszenz führen. Eine Inaktivierung des VR1-Rezeptors sowie eine andere Calcium-Pufferung innerhalb der Zelle wird schließlich den Calcium-Einstrom verlangsamen. Die Lumineszenz kann dann verlängert werden, wenn das BAPTA und die andere Pufferungskapazität der Zelle Calcium langsam zurück in das Zytoplasma der Zelle freisetzt, bis das Calcium auf Ruheniveaus zurückkehrt oder das Aequorin erschöpft ist.
Diese Erfindung stellt Protokolle bereit, welche die Calcium-Reaktion verzögern, wie gemessen durch calcium-sensitive Reporter, durch Verwendung eines zell-permeablen Calcium-Chelators, beispielsweise BAPTA-AM. Diese Protokolle eignen sich für sowohl fluoreszierende als auch lumineszierende calcium-sensitive Reporter. Beispielsweise kann mit BAPTA das Calcium-Signal, welches durch Aktivierung eines liganden-gesteuerten Calcium-Kanals in einer aequorin-exprimierenden Zelllinie verursacht wird, um mehrere Sekunden verzögert werden und die Antwort um mehrere Minuten verlängert werden, ohne den gesamten Signaloutput signifikant zu verringern. Dies bedeutet, dass die schnellen und transienten Calciumsignale, welche früher Instrumente erforderten, die gleichzeitig injizieren und dieses Signal messen, nun von einer Reihe anderer Instrumente erfasst werden können. Die Verfahren dieser Erfindung können vorteilhaft auf funktionelle Ganzzell-Assays sowohl eines Calcium-Ionenkanals als auch eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors angewandt werden. In beiden Fällen ist die Verzögerung der Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignale ausreichend für die gleichzeitige Addition eines Agonisten zu Mehrfachmulden durch ein externes Flüssigkeitshandhabungssystem, gefolgt von schneller Überführung in Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Bildgebungssysteme, beispielsweise die PE BIOSYSTEMS NORTHSTAR^TM HTS Workstation.
Glühlumineszenz-Assays wurden aufgrund ihrer inhärent hohen Empfindlichkeiten und langlebigen Signale unschwer für Hochdurchsatz-Screening-Einrichtungen adaptiert. Die Signale für Chemolumineszenz-Systeme wie Luciferase- und β-Galactosidase-Reportergene oder für Konjugate mit alkalischer Phosphatase sind oft mehrere Stunden lang stabil. Blitzlumineszenz-Assays erhielten weniger Aufmerksamkeit für primäre Screenings als Glüh-Assays und ihnen wurde eine eher sekundäre Rolle beim Screening zugewiesen. Es besteht jedoch zunehmend Bedarf zur Ermittlung der Aktivität großer chemischer Bibliotheken in funktionellen Ganzzell-Assays, welche in einem Hochdurchsatz-Screening-Format durchgeführt werden können.
Ein Beispiel eines auf Blitzlumineszenz basierenden funktionellen Assays ist die Messung von Calcium-Signalwegen in Zellen, die das Biolumineszenzprotein Aequorin enthalten (Button, D., und Brownstein, M. (1993), Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca²⁺ mobilization, Cell Calcium 14, 663–671). Aequorin ist ein calcium-abhängiges Enzym, das Licht (466 nm) nach Oxidation von Coelenterazin produziert. Typischerweise werden funktionelle zelluläre Assays auf Aequorin-Basis für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) oder liganden-gesteuerte Calcium-Kanäle initiiert durch Zugabe eines Agonisten, welcher die intrazelluläre Konzentration von Calcium aus intrazellulären Speichern oder durch die Aufnahme von externem Calcium erhöht. Die Zunahme der intrazellulären Calcium-Konzentration initiiert die Reaktion von Aequorin mit seinem Substrat und führt zu einem schnellen Lumineszenzsignal. Die Kinetik dieser Blitzlumineszenz-Reaktion wird in 1 demonstriert, wobei die Lumineszenzsignale für die Aktivierung eines liganden-gesteuerten Calcium-Kanals oder GPCR ihre maximalen Niveaus in nur wenigen Sekunden erreichen und in weniger als einer Minute vollständig sind. Deshalb muss der Nachweis dieser Signale gleichzeitig mit Zugabe des Agonisten erfolgen. Für Assays, die in Mikrotiterplatten durchgeführt werden, erfordert dies einen Luminometer, der gleichzeitige Flüssigkeitsinjektions- und Probennachweis-Einrichtungen aufweist.
Dieses Erfordernis für gleichzeitige Flüssigkeitsabgabe und Signalnachweis hat die Anwendung dieser Calcium-Transient-Messungen in HTS-Screenings begrenzt. Ein prinzipieller Vorteil dieser Erfindung, die Verwendung eines Chelators zur Verzögerung der Calcium-Kinetik, ist die Ermöglichung funktioneller HTS-Assays ohne kostspielige Instrumente. Mit der Einführung von FLIPR (MOLECULAR DEVICES) (Sullivan, E., Tucker, E. M., und Dale, I. L. (1999), Measurement of [Ca²⁺] using the fluorometric imaging plate reader (FLIPR), Calcium Signaling Protocols 114, 125–133) ist es nun mindestens möglich, die Fluoreszenz von 96- und 384-Mulden-Platten mit gleichzeitiger Flüssigkeitszugabe aufzuzeichnen, jedoch ist dies ein kostspieliges Instrument, das nicht allgemein zur Verfügung steht. Es gibt gegenwärtig keine äquivalenten Instrumente für die Messung von Lumineszenz.
Mehrere kommerzielle Lumineszenz- und Fluoreszenz-Detektoren sind verfügbar, welche gleichzeitig Flüssigkeit in einzelne oder mehrere Mulden injizieren können, wie z.B. der WALLAC VICTOR 2 (eine Mulde), MICROBETA^® JET (6 Mulden) oder AURORA VIPR (8 Mulden). Typischerweise benötigen diese Instrumente 12 bis 96 Minuten, um eine 96-Mulden-Platte im Blitzlumineszenz- oder -fluoreszenz-Modus (1 Min./Mulde) abzulesen – eine ziemlich lange Zeit für die meisten Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen. Ein alternatives Verfahren ist die Injektion des Stimulans/Agonisten in alle Probenmulden gleichzeitig und Messung der Lumineszenz in der gesamten Platte durch Bilderzeugung mit einer CCD-Kamera, ähnlich der Art und Weise, in der Calcium-Reaktionen durch calcium-sensitive Fluoreszenzfarbstoffe in den FLIPR- oder FLIPR-384-Instrumenten abgelesen werden. Andere Lumineszenz- oder Fluoreszenz-Bildgebungssysteme mit integrierter Flüssigkeitshandhabung werden von anderen kommerziellen Lieferanten erwartet, wie z.B. der LEADSEEKER der 2. Generation von AMERSHAM, der WALLAC VIEWLUX^TM ultraHTS-Mikroplatten-Imager und der MOLECULAR DEVICES CLIPR-Imager.
Kürzlich führte PE BIOSYSTEMS TROPIX einen CCD-basierten Luminometer, die NORTHSTAR^TM-HTS-Workstation, ein. Dieses Instrument weist keine Kapazität zur gleichzeitigen Flüssigkeitsabgabe auf, ist jedoch in der Lage, Flüssigkeit schnell in 96-Mulden- oder 384-Mulden-Mikrotiterplatten durch einen externen 8- oder 16-Kopfdispenser abzugeben, und kann dann die Platte schnell zu einer CCD-Kamera überführen, welche die gesamte Platte aufnimmt. Die Gesamtzeit für die Abgabe von Flüssigkeit auf eine Platte und Überführung in das Lesegerät kann 10 Sekunden oder mehr betragen, nicht schnell genug für viele Blitz-Assays, welche innerhalb von 5–10 Sekunden abgeschlossen sind. Bei der Integration von Flüssigkeitshandhabungssystemen in Nachweissysteme wäre auch zu erwarten, dass sie inhärent Prozessierungszeiten zwischen der Flüssigkeitsabgabe und dem Platten-transfer von 10 Sekunden oder mehr erfordert. Die vorliegende Erfindung demonstriert die Brauchbarkeit eines intrazellulären Calcium-Chelatorss zur ausreichenden Verzögerung und/oder Verlängerung der Calcium-Signalreaktion, um durch Instrumente ohne gleichzeitig Flüssigkeitsabgabekapazität wie die NORTHSTAR^TM HTS-Workstation gemessen zu werden.
Die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung wird demonstriert in einem funktionellen zellulären Modell-Assay auf Aequorinbasis für einen liganden-gesteuerten Calcium-Kanal. Für diesen Assay wurden HEK293-Zellen, welche den Rezeptor von Interesse und Apoaequorin koexprimierten, bis zur Konfluenz in undurchsichtigen weißen 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Mikrotiterplatten (BECTON DICKINSON) gezüchtet. Die Zellen wurden auf einem Standardwachstumsmedium aufrechterhalten. Die Zellen wurden mit Wachstumsmedium, das mit 5 μM Coelenterazin h ergänzt war (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR), 2 h lang bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 5% CO₂ beladen. Die beladenen Zellen wurden dann gewaschen und mit Assay-Puffer versorgt.
Die Zugabe von Agonist verursachte das schnelle und vorübergehende Lumineszenzsignal, das innerhalb von 10–15 Sekunden abgeschlossen war (1). Die Kinetik des Blitzlumineszenzsignals wurde mittels eines WALLAC MICROBETA JET-Instruments verfolgt, wobei der Agonist direkt in die Mulden, welche die beladenen Zellen enthielten, injiziert wurde. Als Pufferungsreagens wurde der zell-permeable Acetoxymethylester BAPTA-AM verwendet. BAPTA ist ein spezifischer Calcium-Chelator, welcher Calcium schnell bindet und freisetzt. Die Zugabe von BAPTA-AM zu den Zellen war gleichermaßen effektiv, wenn der Chelator entweder während der Beladung der Zellen mit Coelenterazin eingeschlossen wurde oder durch eine nachfolgende Inkubation in Wachstumsmedium für 1 h bei 37°C und 5% CO₂. Eine schematische Darstellung dieses Assays erscheint in 2.
Die Zugabe zunehmender Niveaus an BAPTA-AM (0–30 μM) verursachte eine anfängliche Verzögerung des aequorin-basierten Lumineszenzsignals nach Injektion von Agonist und verlängerte das Signal weit länger als 30 Sekunden (1). Die Zugabe eines bekannten Rezeptor-Antagonisten war in der Lage, das Signal vollständig zu blockieren (3). Eine anschließende Zugabe von Lysispuffer (0,1% Triton X100) demonstrierte, dass die Abnahme des Signals auf eine kompetitive Blockierung des rezeptor-vermittelten Calcium- Signals durch den Antagonisten zurückzuführen war. Während die Kinetik der Aequorin-Reaktion durch Pufferung mit BAPTA verändert war, war das Gesamtsignal nicht signifikant supprimiert.
Zur Demonstration der allgemeinen Einsetzbarkeit eines solchen Verzögerungsreagens für die Calcium-Signalisierung wurde der beispielhafte Chelator BAPTA-AM in einem funktionellen aequorin-basierten zellulären Assay für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) getestet. Wie bei dem liganden-gesteuerten Calcium-Ionenkanal wurden HEK293-Zellen, welche den GPCR von Interesse und Apoaequorin koexprimierten, bis zur Konfluenz auf mit Poly-D-lysin beschichteten Platten gezüchtet und mit Coelenterazin beladen. Die Zugabe von BAPTA-AM veränderte auch die Kinetik des Calcium-Signals nach Stimulation mit Agonist durch die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über den G-Protein-Weg (4). Eine weitere Demonstration der allgemeinen Einsetzbarkeit des Verzögerungsreagens erfolgte, als die Fluoreszenz eines calcium-sensitiven Farbstoffes (Fluo 3, Fluo 4; 5) die Lumineszenz ersetzte, welche von der Aequorin-Reaktion erzeugt wurde, um die Fluktuation der intrazellulären Calcium-Konzentration nach Zugabe von Agonist zu HEK293-Zellen, die einen Calcium-Ionenkanal exprimierten, nachzuweisen.
Obwohl BAPTA-AM gewählt wurde, um das Potential der Verwendung eines intrazellulären Chelators bei der Pufferung der Calcium-Signalisierung in Zellen zu demonstrieren, können andere calcium-bindende Reagenzien geeignet sein. Diese umfassen andere strukturell verwandte Chelatoren, wie z.B. Fura-2 oder andere Fluoreszenzfarbstoffe, oder licht-aktivierte Chelatoren, wie z.B. Diazo-2, und deren zell-permeable Derivate. Alternativ können calcium-bindende Proteine, wie z.B. modifizierte Aequorine oder Calmodulin-GFP-Chimären, BAPTA als konstitutive Verzögerungsreagenzien ersetzen (Tsien, R. Y. (1980), New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures, Biochemistry 19, 2396–2404; Gonzalez, J. E., Oades, K., Leychis, Y., Harootunian, A., und Negulescu, P. (1999), Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets, Drug Discovery Today 4, 431–439; Ungrin, M. D., Singh, L. M. R., Stocco, R., Sas, D. E., Abramovitz, M. (1999), An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled receptors, Anal. Biochem. 272, 34–42).
Eine beliebige Anzahl dieser Reagenzien hat das Potential als Verzögerungsreagenzien für die aequorin-basierten funktionellen Assays von Nutzen zu sein. Ein geschulter Fachmann auf dem Gebiet muss lediglich irgendein spezielles Reagens in dem hier gelehrten Assay testen und die Ergebnisse mit den unter Verwendung von BAPTA-AM erhaltenen zu vergleichen. Diese Reagenzien könnten auch allgemein von Nutzen sein als Verzögerungsreagenzien für funktionelle Assays unter Verwendung der Calcium-Signalisierung im allgemeinen, nicht nur für den aequorin-basierten Biolumineszenz-Reporter-Assay.
Es wird auch angemerkt, dass die Zugabe eines spezifischen Rezeptor-Antagonisten die Kinetik des beobachteten Calcium-Transients beeinflussen kann. Für einige Anwendungen könnte die Verwendung eines Antagonisten ausreichend sein, um die Kinetik des funktionellen Assays zu verändern. In der Tat wurden mehrere kommerzielle Produkte eingeführt, welche Blitzfluoreszenz und -lumineszenz auf ein "Glüh"-Format verlängern. Der PACKARD LUCLITE^®-Assay-Kit ist ein Beispiel eines Assay-Verfahrens, welches einen spezifischen Luciferase-Inhibitor verwendet, um die Kinetik eines Lumineszenzsignals von einigen Minuten auf mehrere Stunden zu verzögern.
Assays
Assays der vorliegenden Erfindung können in vielen Formaten gestaltet werden, die allgemein auf dem Gebiet des Screenings von Verbindungen hinsichtlich biologischer Aktivität oder der Bindung an Rezeptoren bekannt sind. Assays der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft das Vermögen intrazellulärer Chelatoren zweiwertiger Kationen zur Pufferung der Kinetik der durch die Anhäufung zweiwertiger Kationen induzierten Signalerzeugung zu nutzen.
Diese Erfindung wird vorteilhaft in funktionellen Ganzzell-Assays und Hochdurchsatz-Screening-Assays für die Calcium-Signalisierung, wie z.B. Calcium-Kanäle und GPCR's, angewandt, um das Signal zu verlängern, so dass es von herkömmlichen Plattenlesegeräten abgelesen werden kann. Die vorliegende Erfindung kann allgemein auf funktionelle Ganzzell-Assays für einen beliebigen Calcium-Kanal oder irgendeinen Rezeptor oder Ionenkanal, der mit einem Calcium-Kanal gekoppelt ist, angewandt werden. Beispielsweise kann man die vorliegende Erfindung auf einen Assay eines Rezeptors anwenden, der an einen spannungsgesteuerten Calcium-Kanal gekoppelt ist. Jedoch beziehen wir uns aus Gründen der Klarheit bei der Beschreibung der Anwendung der Erfindung im allgemeinen entweder auf einen Calcium-Kanal oder einen Rezeptor.
Das Verzögerungsreagens kann für Praktiker Anwendung finden, welche die Calcium-Signalisierung in Zellen untersuchen müssen, jedoch keine Instrumente haben, um eine gleichzeitige Injektion und Messung des schnellen und transienten Signals durchzuführen.
Die in den Assays der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Verzögerung eignet sich besonders für das Hochdurchsatz-Screening funktioneller Ganzzell-Assays, bei denen 96-Mulden-, 384-Mulden-, 3456-Mulden- oder andere Plattenformate verwendet werden. Hier ermöglicht die Verzögerung der calcium-induzierten Signalerzeugung die Zugabe von Reagenzien und die Handhabung von Platten über einen längeren Zeitrahmen, der für diese Plattendichten besser geeignet ist. Man kann die intrazellulären Chelatoren in jedem Assay verwenden, der eine funktionelle Ablesung ergibt, wobei die zusätzliche Zeit, die durch die Verzögerung erhalten wird, eine zusätzliche Manipulation der Zellen erlauben würde, wie z.B. Zugabe anderer Reagenzien oder Transfer einer Probe, oder falls ein kinetisches Gleichgewicht etabliert werden muss.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche spezifisch mit Rezeptor-Polypeptiden wechselwirken. Verbindungen, welche mit einem Rezeptor wechselwirken, können die Aktivität eines Rezeptors stimulieren oder inhibieren. Die Spezifität der Bindung von Verbindungen mit Affinität für einen Rezeptor kann gezeigt werden durch Messen der Affinität der Verbindungen für Membranen aus rekombinanten Zellen, die ein Rezeptor-Polypeptid exprimieren. Die Expression von Rezeptor-Polypeptiden und das Screenen hinsichtlich Verbindungen, die an einen Rezeptor binden oder die Aktivierung eines Rezeptors inhibieren, bietet ein wirksames Verfahren zur schnellen Selektion von Verbindungen mit Affinität für einen Rezeptor.
Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung Assays, mit denen Verbindungen, die Rezeptor-Agonisten, -Antagonisten und -Inhibitoren sind, identifiziert werden können. Die Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von den im Stand der Technik beschriebenen, da die vorliegenden Assays mindestens einen Schritt beinhalten, bei dem die Zellen mit einem intrazellulären Chelator kontaktiert werden.
Die vorliegende Erfindung ist breit anwendbar auf Assay-Formate, die im Stand der Technik bekannt sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht in vorteilhafter Weise die Verwendung von Instrumenten zum Nachweis von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen aus Zellen ohne das Erfordernis einer gleichzeitigen Flüssigkeitshandhabung zum Nachweiszeitpunkt. Allgemeine Verfahren und Assay-Formate zur Identifizierung von Liganden, Agonisten und Antagonisten sind im Stand der Technik wohlbekannt und können adaptiert werden, um Agonisten und Antagonisten von Rezeptoren zu identifizieren, welche in Zellen exprimiert werden, die mit einem intrazellulären Chelator vor oder während eines Assays kontaktiert werden. Die Reihenfolge der Schritte in jedem gegebenen Verfahren kann variiert oder gleichzeitig durchgeführt werden, wie von Fachleuten auf dem Gebiet der Assays erkannt werden wird. Es folgen Beispiele der Vielfalt von Formaten, welche zur Durchführung eines Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Zellen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, enthalten ein calcium-sensitives Reportersystem. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle manipuliert, um das Reportersystem von stabil integrierten Genen zu exprimieren. Alternativ können die Zellen transient mit Nukleinsäuren transfiziert werden, die für einen calcium-sensitiven Reporter codieren. Am häufigsten besteht das Reportersystem aus einem in der Zelle exprimierten Protein, beispielsweise ein Apoaequorin oder eine grünes-Fluoreszenzprotein-Calmodulin-Chimäre. Es ist jedoch vorstellbar, dass ein Multiprotein-System oder eine Multipolypetid-Anordnung, welche(s) für Calcium sensitiv ist und als Reaktion darauf ein Signal erzeugt, eingesetzt werden kann. Alternativ kann man eine nicht-proteinhaltige organische Verbindung, einschließlich der hier angegebenen calcium-sensitiven Farbstoffe, einsetzen. Zellmembran-permeable Farbstoffe sind bevorzugt. Farbstoffe können im Inneren von Zellen durch Kontaktieren der Zellen mit derivatisierten Ester- oder Amid-Farbstoffen eingefangen werden. Nach Aufnahme des Farbstoffs wird das Amid oder der Ester gespalten, was die Farbstoffgruppierung innerhalb der Zelle einfängt (Tsien, R. Y. (1981), A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells, Nature 290, 527–528).
Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Kandidatenverbindung ein Inhibitor eines Rezeptors ist, unter Verwendung von Zellen, die einen calcium-sensitiven Reporter, wie z.B. Apoaequorin oder eine Chimäre von grünem Fluoreszenzprotein und Calmodulin, enthalten, welches Verfahren umfasst:

(a) Transfizieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der für ein Rezeptor-Polypeptid codiert;
(b) Wachsen lassen der transfizierten Zellen für eine ausreichende Zeit, um die Expression des Rezeptors in den Zellen zu gestatten;
(c) Aussetzen der Zellen einem intrazellulären Chelator von Calcium;
(d) Aussetzen der Zellen einem Aktivator des Rezeptors in Anwesenheit und in Abwesenheit der Verbindung;
(e) Messen des in den Zellen erzeugten Signals; und
(f) Vergleichen der Größe des Signals in Anwesenheit und in Abwesenheit der Verbindung, wobei eine Erhöhung der Signalgröße in Anwesenheit der Verbindung anzeigt, dass die Verbindung ein Inhibitor der Aktivierung des Rezeptors ist.

Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung in vitro, ob eine Kandidatenverbindung ein Agonist eines Rezeptors ist, unter Verwendung von Zellen, die einen calcium-sensitiven Reporter, wie z.B. Apoaequorin oder eine Chimäre von grünem Fluoreszenzprotein und Calmodulin, enthalten, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Transfizieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der für ein Rezeptor-Polypeptid codiert;
(b) Wachsen lassen der transfizierten Zellen für eine ausreichende Zeit, um die Expression des Rezeptors in den Zellen zu gestatten;
(c) Aussetzen der Zellen einem intrazellulären Chelator von Calcium;
(d) Aussetzen der Zellen einer Testverbindung;
(e) Messen des in den Zellen erzeugten Signals; und
(f) Vergleichen der Größe des Signals in Anwesenheit und Abwesenheit der Verbindung,

Die Bedingungen, unter denen Schritt (d) des Verfahrens praktiziert wird, sind Bedingungen, die typischerweise auf dem Gebiet zur Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden: z.B. physiologischer pH-Wert; Salzbedingungen, die von solchen herkömmlich verwendeten Puffern wie PBS repräsentiert werden, oder in Gewebekulturmedien; eine Temperatur von etwa 4°C bis etwa 55°C. In diesem Schritt können der Rezeptor und die Kandidatenverbindung der Zelle nacheinander oder gleichzeitig zugeführt werden. Es ist bevorzugt, dass die Kandidatenverbindung zuerst zugeführt wird oder dass die Verbindung und der Rezeptor gleichzeitig zugeführt werden.
In einer alternativen Modifizierung der oben beschriebenen allgemeinen Assays fehlt den Zellen ein endogenes calcium-sensitives Reporter-System und sie werden mit dem System zur Durchführung des Assays transient transfiziert. Diese Modifizierung kann von Nutzen sein bei Zellen, welche endogen einen Rezeptor, der in dem Assay verwendet werden soll, exprimieren oder stabil damit transfiziert sind. Eine zusätzliche Modifizierung wäre die Verwendung eines calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes, wie z.B. Fluo-3, anstelle eines endogenen calcium-sensitiven Reportersystems. Bei dieser Modifizierung würde ein zusätzlicher Schritt zwischen (b) und (c) hinzugefügt werden, worin die Zellen mit 1–10 μM Fluo-3-AM, einem membran-permeablen Ester von Fluo-3, inkubiert werden. Eine weitere Modifizierung der allgemeinen Assay-Formate wäre die Eliminierung der Schritte (a) und (b) und stattdessen der Beginn mit Zellen, welche das Rezeptor-Polypeptid stabil exprimieren.
Als weitere Modifizierung der oben beschriebenen Verfahren kann für Rezeptor codierende RNA hergestellt werden, wie z.B. durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines Plasmids, welches den Rezeptor unter der Kontrolle eines Bakteriophagen T7-Promotors enthält, und die RNA kann in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert werden, um die Expression des Rezeptors in den Oozyten zu veranlassen. Die Oozyten werden dann einem intrazellulären Chelator ausgesetzt. Verbindungen werden dann hinsichtlich Bindung an den Rezeptor oder Inhibierung der Aktivierung des in den Oozyten exprimierten Rezeptors getestet. Wie bei allen Assays dieser Erfindung ist ein Schritt, bei dem die Zellen einem intrazellulären Chelator ausgesetzt werden, in den Assay inkorporiert.
Die obigen Ganzzell-Verfahren können in Assays eingesetzt werden, bei denen man ermitteln möchte, ob eine Verbindung mit Rezeptor wechselwirken kann.
BEISPIEL 1
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimieren (293AEQ17-Zellen) (Button, D., und Brownstein, M. (1993), Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca²⁺ mobilization, Cell Calcium 14, 663–671), wurden eingesetzt, um stabile klonale Zelllinien zu entwickeln, die einen liganden-gesteuerten Calcium-Ionenkanal oder GPCR exprimieren. Die Ionenkanal-293AEQ17-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 1 μg/ml Puromycin (CLONTECH) und 10% fötales Rinderserum (Gemini Bio-Products, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 5% CO₂, aufrechterhalten. Die GPCR-293AEQ17-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES, 0,5 mg/ml Geneticin, 0,2 mg/ml Hygromycin (BOEHRINGER MANNHEIM) und 10% fötales Rinderserum (HYCLONE, definiert) enthielt, bei 37°C, 5% CO₂, aufrechterhalten.
Ausplattierung und Beladung von Zellen
Zellen wurden bis zur Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Die Zellen wurden in weiße undurchsichtige oder transparentbödige 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten (BECTON DICKINSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Für die Beladung der Zellen mit Coelenterazin wurde das Wachstumsmedium durch Absaugen unter Verwendung eines TITERTEK-Zellwäschers entfernt, gefolgt von Zugabe von Wachstumsmedium (DMEM-Medium mit 0,1% fötalem Rinderserum und 0,15 mM reduziertem Glutathion), ergänzt mit 5 μM Coelenterazin h (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR). Für einige Experimente wurden stattdessen andere Coelenterazin-Analoga in dem Beladungspuffer wie angegeben verwendet. Die Zellen wurden weiter in Beladungspuffer für 2 h bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und die Zellen wurden mit Dulbecco's phosphat-gepufferter Salzlösung mit Calcium und Magnesium (PBS, GIBCOBRL, enthaltend 10 mM HEPES und 2 mg/ml Glucose), ergänzt mit 0–30 μM 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES) und 0,02% Pluronic F-127-Lösung (MOLECULAR PROBES), gewaschen und 1 h lang bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Alternativ wurden die Zellen gleichzeitig mit Coelenterazin h und BAPTA-AM für 2 h bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 5% CO₂ beladen. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 90 μl PBS, ergänzt mit 10 mM HEPES und 2 mg/ml Glucose, beladen. Antagonist oder DMSO-Kontrollen wurden Mulden zugegeben (10 μl, 1% DMSO Endkonzentration).
Die potentielle Pufferung oder Verzögerung der aequorin-basierten Lumineszenz wurde in einem funktionellen zellulären Assay für einen liganden-gesteuerten Calcium-Kanal ermittelt. Wir stellten fest, dass niedrige Niveaus an BAPTA in der Lage waren, die Kinetik des Lumineszenzsignals nach Zugabe eines Agonisten zu verändern, ohne das gesamte akkumulierte Licht signifikant zu supprimieren, wie für die Zugabe niedriger Niveaus von Antagonist beobachtet (1–4).
BEISPIEL 2
Fluoreszenzmessung mit VR1-Zellen
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden zur Entwicklung stabiler klonaler Zelllinien verwendet, welche den Ratten-VR1-Capsaicin-Rezeptor exprimierten (Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., und Julius, D. (1997), The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway, Nature 389, 816–824). Die VR1-293AEQ17 wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 1 μg/ml Puromycin (CLONTECH) und 10% fötales Rinderserum (GEMINI BIO-PRODUCTS, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in schwarze 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) mit transparentem Boden in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 10% CO₂ inkubiert. Zellen wurden einmal mit 200 μl angereichertem PBS (Dulbecco's PBS (GIBCOBRL # 14040-117), 10 mM HEPES, 2 g/l Glucose; pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl an 5 μM Fluo-3-AM (MOLECULAR PROBES # F1241) mit oder ohne 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N',-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES # B1205) in angereichertem PBS, enthaltend 0,02% Pluronic F-127 (MOLECULAR PROBES # P-3000), für 30–70 Minuten inkubiert. Die Mulden wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS gewaschen und dann wurden 100 μl angereichertes PBS mit oder ohne Antagonist für 15–30 Minuten vor dem Assay auf dem AURORA-Fluoreszenzplattenleser VIPR (Anregung 480 nm, Emission 535 nm) zugegeben. Das BAPTA-AM kann 30 Minuten als separater Schritt nach der Anfärbung mit Fluo-3 und vor der Wirkstoffzugabe inkubiert werden, ohne nennenswerte Unterschiede im Signal. Die Calcium-Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an Capsaicin (SIGMA # M2028). Das VIPR-Instrument wurde zur Zugabe von Agonist (in 100 μl angereichertem PBS) nach Aufzeichnung einer 10-Sekunden-Grundlinie verwendet und die Fluoreszenz wurde bis zu 300 Sekunden gemessen.
Änderungen des intrazellulären Calciums wurden mit Hilfe des Fluo-3-Farbstoffs und Nachweis der Kinetik der Reaktion nach Zugabe des VR1-Agonisten Capsaicin (0,5 μM) zu Zellen, die VR1 exprimierten, unter Verwendung eines VIPR-Fluoreszenzplattenlesers (5 & 6A) gemessen. In Abwesenheit von BAPTA erreichte die Reaktion einen Gipfel in etwa 20 Sekunden und fiel in etwa 150 Sekunden auf 50% ab. Diese Reaktion wurde vollständig durch 20 μM Capsazepin, einem selektiven kompetitiven Antagonisten von VR1, blockiert. Die Inkubation der Zellen für 30 Minuten mit 3 μM BAPTA-AM führte zu einer Verzögerung des Fluoreszenzsignals mit einem Gipfel bei etwa 40 Sekunden, jedoch war die Abklingzeit des Fluo-3-Signals (150 s) nicht beeinflusst. Jedoch verursachte die Erhöhung der Konzentration von BAPTA-AM auf 10 und 30 μM eine signifikante Verzögerung in der Gipfelreaktionszeit von bis zu 100 Sekunden, mit einem anhaltenden Fluoreszenzsignal, welches keinen signifikanten Abfall auf dieser Zeitskala (3 Minuten) zeigte. Es ist bemerkenswert, dass die Fluoreszenz nach den 3 Minuten nur partiell abklang, sogar in Abwesenheit von BAPTA-AM, und dieses Abklingen kann teilweise auf eine Photobleichung von Fluo-3 zurückzuführen sein.
Es war wichtig, das korrekte Gleichgewicht zwischen dem Ausmaß der Agonist-Aktivierung und Calcium-Chelierung durch BAPTA zu verwenden. Deshalb sind Titrationsexperimente nützlich, um geeignete Parameter zu etablieren. Erwartungsgemäß gab es, wenn eine niedrigere Agonist-Konzentration verwendet wurde (6B, 0,1 μM Capsaicin), eine Abnahme der Fluoreszenzreaktion und sie klang schneller ab. Bei dieser niedrigen Agonist-Konzentration verringerten 3 μM BAPTA das Gipfelsignal ohne große Auswirkungen auf die Zeit bis zum Gipfel oder die Abklingkinetik. Bei 30 μM Chelator ist das stabile Calcium-Signal in Abwesenheit des Antagonisten nur leicht größer im Vergleich zur Anwesenheit von 20 μM Capsazepin. Trotzdem wurde sogar dieses geringe Fluoreszenzsignal über 30–180 Sekunden aufrechterhalten und ergab ein leicht wahrnehmbares Fenster, verglichen mit dem Abklingen des Fluoreszenzsignals, wenn es durch einen Antagonisten blockiert wurde.
BEISPIEL 3
Fluoreszenzmessung mit Zellen, die Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptor 1a exprimierten
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden dazu verwendet, eine stabile klonale Zelllinie zu entwickeln, die humanen Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptortyp 1a exprimierte (hGHSR1A, Smith, R. G., Griffin, P. R., Xu, Y., Smith, A. G. A., Liu, K., Calacay, J., Feighner, S. D., Pong, C.-S., Leong, D., Pomes, A., Cheng, K., Van der Ploeg, L. H. T., Howard, A. D., Schaeffer, J., & Leonard, R. J. (2000), Adenosine: A partial agonist of the growth hormone secretagogue receptor, Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, 1306–1313; Bednarek, M. A., Feighner, S. C., Pong, S.-S., McKee, K. K., Hreniuk, D. L., Silva, M. V., Warren, V. A., Howard, A. D, Van der Ploeg, L. H. Y., und Heck, J. V. (2000), Structure-function studies on the new growth hormone-releasing peptide, ghrelin: Minimal sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a, J. Med. Chem. 43, 4370–4376). Die hGHSR1A- und Ausgangs-293AEQ17-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 0,2 mg/ml Hygromycin (BOEHRINGER MANNHEIM) und 10% fötales Rinderserum (HYCLONE, definiert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in schwarze 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 mg/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 10% CO₂ inkubiert. Zellen wurden einmal mit 200 μl angereichertem PBS (Dulbecco's PBS (GIBCOBRL # 14040-117), 10 mM HEPES, 2 g/l Glucose; pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl 5 μM Fluo-4-AM (# F14202) mit oder ohne 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES # B1205) in angereichertem PBS mit 0,02% Pluronic F-127 (MOLECULAR PROBES # P-3000) für 30–70 Minuten inkubiert. Die Mulden wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS gewaschen und dann wurden 100 μl angereichertes PBS mit oder ohne Antagonist 15–30 Minuten lang vor dem Assay auf dem AURORA-Fluoreszenzplattenleser VIPR (Anregung 480 nm, Emission 535 nm) zugegeben. Die Calcium-Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an Ghrelin (PHOENIX PHARMACEUTICALS # 031031). Das VIPR-Instrument wurde zur Zugabe von Agonist (in 100 μl angereichertem PBS) nach Aufzeichnung einer 10-Sekunden-Grundlinie verwendet und die Fluoreszenz wurde für bis zu 300 Sekunden gemessen.
Der Calcium-Transient, der durch den hGHSR1a-Agonisten Ghrelin (100 nM) aktiviert wurde, überwacht mit Fluo-4, wurde mit Hilfe des VIPR gemessen (8A). Die ghrelin-induzierten Calcium-Reaktionen wurden durch den bekannten GHSR-Antagonisten L-756,867 inhibiert. Die Aktivierung von hGHSR1a verursachte eine schnelle Erhöhung der Fluoreszenz, die ein Maximum nach etwa 15 Sekunden erreichte und nach etwa 100 Sekunden vollständig auf das Grundniveau abfiel. Die Zugabe von BAPTA (30 μM BAPTA-AM) verzögerte die Gipfel-Fluoreszenzreaktion von 15 Sekunden auf 150 Sekunden, mit einem stabilen Fluoreszenzsignal für bis zu fünf Minuten.
BEISPIEL 4
Fluoreszenzmessung mit Zellen, die muscarinerge Acetylcholin-Rezeptoren exprimieren
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden in Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung) und 10% fötales Rinderserum (GEMINI BIO-PRODUCTS, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in schwarze 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator bei 10% CO₂ inkubiert. Zellen wurden einmal mit 200 μl angereichertem PBS (Dulbecco's PBS (GIBCOBRL # 14040-117), 10 mM HEPES, 2 g/l Glucose; pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl 5 μM Fluo-4-AM (MOLECULAR PROBES # F14202) mit oder ohne 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES # B1205) in angereichertem PBS mit 0,02% Pluronic F-127 (MOLECULAR PROBES # P-3000) für 30–70 Minuten inkubiert. Die Mulden wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS gewaschen und dann wurden 100 μl angereichertes PBS mit oder ohne Antagonist für 15–30 Minuten vor dem Assay auf dem AURORA-Fluoreszenzplattenleser VIPR (Anregung 480 nm, Emission 535 nm) zugegeben. Die Calcium-Reaktion wurde initiiert durch die Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an (+/–)-Muscarin (SIGMA # M0405). Das VIPR-Instrument wurde dazu verwendet, um Agonist (in 100 μl angereichertem PBS) nach Aufzeichnung einer 10-Sekunden-Grundlinie zuzugeben, und die Fluoreszenz wurde für bis zu 300 Sekunden gemessen.
Muscimol stimulierte einen endogenen muscarinergen Rezeptor (Moriya, H., Takagi, Y., Nakanishi, T., Hayashi, M., Tani, T., und Hirotsu, I. (1999), Affinity profiles of various muscarinic antagonists for cloned human muscarinic acetylcholine receptor (MACHR) subtypes and MACHRS in rat heart and submandibular gland, Life Sciences 25, 2351–2358; Caulfield, M. P. (1993), Muscarinic receptors – characterization, coupling and function, Pharmac. Ther. 58, 319–379) in HEK-AEQ17-Zellen, welche ein robustes Fluoreszenzsignal ergaben, wenn sie mit Fluo-4 unter Verwendung des VIPR gemessen wurden. Die Kinetik dieses Calcium-Transients unterschied sich von der für entweder den VR1- oder hGHSR1a-Calcium-Transient gemessenen. Die Aktivierung mit Muscimol (10 μM) verursachte eine schnelle transiente Reaktion, gefolgt von einer langsameren Reaktion (9A). Die schnelle transiente Reaktion war sehr sensitiv für BAPTA und wurde durch geringe Niveaus des Chelators (3 μM BAPTA-AM) eliminiert, jedoch konnte unter diesen Bedingungen ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden, das für mindestens drei Minuten stabil war. Bei höherer BAPTA-Konzentration (10 μM BAPTA-AM) war die Fluoreszenzerhöhung sehr langsam und hatte sich sogar nach drei Minuten noch nicht stabilisiert.
BEISPIEL 5
Lumineszenzmessung mit VR1 exprimierenden Zellen
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden dazu verwendet, stabile klonale Zelllinien zu entwickeln, welche den Ratten-VR1-Capsaicin-Rezeptor exprimierten. Die VR1-293AEQ17 wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 1 μg/ml Puromycin (CLONTECH), und 10% fötales Rinderserum (GEMINI BIO-PRODUCTS, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in weiße 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator bei 10% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden mit dem Aequorin-Substrat Coelenterazin h (MOLECULAR PROBES, # C6780) durch Entfernen des Wachstumsmediums und Inkubieren der Zellen mit 75 μl Beladungspuffer (DMEM GIBCOBRL # 12320-032; 0,1% FBS GEMINI BIO-PRODUCTS, Inc. # 100–107; 5 μM Coelenterazin h; 30 μM reduziertes Glutathion) für 2 h bei 37°C, 10% CO₂, beladen. Der Beladungspuffer wurde dann entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS (pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl angereichertem PBS, ergänzt mit 0–30 μM BAPTA-AM, für 30–120 Minuten bei 37°C, 10% CO₂, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 100 μl angereichertem PBS mit dem oder ohne den angegebenen Antagonisten beladen. Die Calcium-Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an Capsaicin (SIGMA # M2028) zu den Mulden mit einem WALLAC MICROBETA JET. Um einheitlichere Kinetiken zu erhalten, wurde der Jet so eingestellt, dass er gleichzeitig nur 6 Mulden pro Bestimmung ablas.
Die Aequorin-Blitzlumineszenz-Reaktion nach Aktivierung von VR1 wurde nicht so leicht durch intrazelluläres BAPTA verzögert, wie das Fluo-3-Fluoreszenzsignal. Für diese Experimente wurde die Kinetik der Blitzlumineszenz mit Hilfe eines WALLAC MICROBETA JET-Luminometers verfolgt, welcher das Reagens injiziert und die Lichtemission von 6 Mulden einer 96-Mulden-Platte simultan aufzeichnet. Die Zugabe von Capsaicin (50 nM) verursachte ein schnelles und transientes Lumineszenzsignal, das innerhalb von 30 Sekunden weitgehend vollständig war, mit einem Peakniveau, das in lediglich etwa 10 Sekunden auftrat (7A). Die Zugabe von zunehmenden Niveaus an BAPTA (0–30 μM BAPTA-AM) verursachte eine progressive Verzögerung im Auftreten des Aequorin-Lumineszenzsignals, mit einer maximalen Reaktion bei 30 Sekunden, verzögert von 10 Sekunden. Dieses Signal wurde für bis zu 3 Minuten ausgedehnt, wobei die maximale Zeit aufgezeichnet wurde. Für diese Experimente war es wichtig, eine niedrige Konzentration an Agonist zu verwenden, da bei einer hohen Agonist-Konzentration (0,5 μM) sogar 30 μM BAPTA-AM die Peakreaktion nur von etwa fünf Sekunden auf 10 Sekunden verzögerte (7B). Während die Kinetik der Aequorin-Reaktion durch Pufferung mit BAPTA verändert wurde, wurde das Gesamtsignal nicht signifikant supprimiert, da sich das Gesamtsignal bei einer gegebenen Agonist-Konzentration bei Verwendung von 0 μM bis 30 μM BAPTA-AM nicht signifikant veränderte.
BEISPIEL 6
Lumineszenzmessung mit Zellen, die Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptor 1a exprimieren
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden dazu verwendet, um stabile klonale Zelllinien zu entwickeln, die den Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptortyp 1a exprimierten (hGHSR1A). Die hGHSR1A-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/ml Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 0,2 mg/ml Nygromycin (BOEHRINGER MANNHEIM) und 10% fötales Rinderserum (HYCLONE, definiert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in weiße 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator bei 10% CO₂ inkubiert. Zellen wurden mit dem Aequorin-Substrat Coelenterazin h (MOLECULAR PROBES, # C-6780) beladen durch Entfernen des Wachstumsmediums und Inkubieren der Zellen mit 75 μl Beladungspuffer (DMEM GIBCOBRL # 12320-032; 0,1% FBS GEMINI BIO-PRODUCTS, Inc. # 100–107; 5 μM Coelenterazin h; 30 μM reduziertes Glutathion) für 2 h bei 37°C, 10% CO₂. Der Beladungspuffer wurde dann entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS (pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl angereichertem PBS, ergänzt mit 0–30 μM BAPTA-AM, für 30–120 Min. bei 37°C, 10% CO₂, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 100 μl angereichertem PBS mit dem oder ohne den angegebenen Antagonisten beladen. Die Calcium-Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an Ghrelin (PHOENIX PHARMACEUTICALS # 031031) mit einem WALLAC MICROBETA JET initiiert. Um einheitlichere Kinetiken zu erhalten, wurde der Jet so eingestellt, dass nur 6 Mulden pro Bestimmung gleichzeitig abgelesen wurden.
Nach Zugabe des hGSHR1a-Agonisten (100 nM Ghrelin) gab es eine schnelle Erhöhung der Lichtemission, die einen Gipfel in nur drei Sekunden erreichte und im wesentlichen nach 30 Sekunden vorbei war, wie gemessen mit dem Jet-Luminometer (8B). Im Gegensatz dazu verringerte die Zugabe von BAPTA (30 μM BAPTA-AM) das Lumineszenzsignal auf nur etwa 5% der Reaktion in Abwesenheit von BAPTA, jedoch wurde die Zeit, um die maximale Lichtemission zu erreichen, auf 75 Sekunden verzögert (8B, Einsatz). Darüber hinaus gab es, obwohl die Amplitude des Signals verringert war, ein signifikantes Fenster zwischen dem Signal in Abwesenheit und Anwesenheit von Antagonist, das in einem Screening-Assay verwendet werden kann.
BEISPIEL 7
Manuelle Fluoreszenzmessungen mit muscarinergen Acetylcholin-Rezeptoren
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/ml Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung) und 10% fötales Rinderserum (GEMINI BIO-PRODUCTS, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in schwarze 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator bei 10% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit 200 μl angereichertem PBS (Dulbecco's PBS (GIBCOBRL # 14040-117), 10 mM HEPES, 2 g/l Glucose; pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl 5 μM Fluo-4-AM (MOLECULAR PROBES # F14202) mit oder ohne 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES # B1205) in angereichertem PBS, enthaltend 0,02% Pluronic F-127 (MOLECULAR PROBES # P-3000), für 30–70 Minuten inkubiert. Mulden wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS gewaschen und dann wurden 100 μl angereichertes PBS mit oder ohne Antagonist 30 Minuten lang vor dem Assay auf dem AURORA-Fluoreszenzplattenleser VIPR (Anregung 480 nm, Emission 535 nm) zugegeben. Die Calcium-Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an (+/–)-Muscarin (SIGMA # M0405) unter Verwendung einer manuellen Vorrichtung. Das VIPR-Instrument wurde zur Messung einer 5sekündigen Anfangsfluoreszenz und dann zur Aufzeichnung einer weiteren fünfsekündigen Fluoreszenzreaktion nach einer Verzögerung von fünf Minuten verwendet.
Kinetische Experimente unter Verwendung der Geräte VIPR und Jet demonstrieren, dass niedrige Niveaus an intrazellulärem BAPTA Calcium-Reaktionen in einer Vielfalt funktioneller Assays für Ionenkanäle und GPCR's verzögern und verlängern können. Ein empirischer Ansatz ist zunächst erforderlich, um die verwendete Konzentration des Chelators und Agonisten auszubalancieren, jedoch wurde in jedem Fall ein geeigneter fluoreszenz- basierter oder aequorin-basierter Assay mit einer ausgedehnten Calcium-Reaktion entwickelt.
Eine nützliche Anwendung dieser Erfindung ist die Entwicklung von Assay-Bedingungen, welche das transiente Calcium-Signal ausreichend verlängern würden, um eine Messung der Fluoreszenz oder Lumineszenz mit Standard-Laborplattenlesegeräten zu erlauben. Um die oben verwendeten Instrumente zu ersetzen, die eine gleichzeitige Flüssigkeitszugabe und Aufzeichnung aufweisen, muss ein beobachtbares Signal nach der Zugabe eines Agonisten in der Größenordnung von mehreren Minuten aufrechterhalten werden. Auf Grundlage der Ergebnisse dieser kinetischen Experimente wurde getestet, ob man Agonist zu einer 96-Mulden-Platte mit einer Hand-Pipettiervorrichtung zugeben und dann die Platte in ein geeignetes Lesegerät überführen und immer noch ein stabiles Signal gegenüber dem Hintergrund, geeignet zur Entwicklung von HTS-Assays, erhalten konnte.
Eine Platte von HEK-AEQ17-Zellen wurde mit 5 μM Fluo-4 und 3 μM BAPTA-AM beladen. Eine Ausgangsfluoreszenzmessung wurde vorgenommen unter Verwendung des VIPR (fünf Sekunden) und dann wurde Muscimol (10 μM) der Platte per Hand zugegeben unter Verwendung einer Multikanal-Pipette, um die endogenen muscarinergen AChR zu aktivieren. Die Platte wurde fünf Minuten lang inkubiert, bevor eine zweite Fluoreszenzablesung unter Verwendung des VIPR (fünf Sekunden) durchgeführt wurde. Sogar fünf Minuten nach der Stimulation mit Muscimol wurde eine klare Erhöhung des Fluoreszenzsignals nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen wurde eine dosisabhängige Abnahme des Fluoreszenzsignals mit Atropin beobachtet, welche einen K_I-Wert = 0,7 nM ergab, was der erwarteten Wirksamkeit für Atropin nahekam (9B).
BEISPIEL 8
Manuelle Lumineszenzmessung mit Zellen, die VR1 exprimieren
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden zur Entwicklung stabiler klonaler Zelllinien verwendet, welche den Ratten-VR1-Capsaicin-Rezeptor exprimierten. Die VR1-293AEQ17- und Ausgangs-293AEQ17-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 1 μg/ml Puromycin (CLONTECH) und 10% fötales Rinderserum (GEMINI BIO-PRODUCTS, hitze-inaktiviert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in weiße 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator mit 10% CO₂ inkubiert. Zellen wurden mit dem Aequorin-Substrat Coelenterazin h (MOLECULAR PROBES, # C-6780) beladen durch Entfernen des Wachstumsmediums und Inkubieren der Zellen mit 75 μl Beladungspuffer (DMEM GIBCOBRL # 12320-032; 0,1% FBS GEMINI BIO-PRODUCTS, Inc. # 100–107; 5 μM Coelenterazin h; 30 μM reduziertes Glutathion) für 2 h bei 37°C, 10% CO₂. Der Beladungspuffer wurde dann entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS (pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl angereichertem PBS, ergänzt mit 0 oder 10 μM BAPTA-AM, für 30 Minuten bei 37°C, 10% CO₂, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 100 μl angereichertem PBS mit dem oder ohne den angegebenen Antagonisten beladen. Die Calcium-Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration von Capsaicin (SIGMA # M2028) zu dem entsprechenden Satz von 6 Mulden unter Verwendung einer manuellen Vorrichtung initiiert. Der WALLAC MICROBETA JET wurde zur Messung von 10 Sekunden Lumineszenz nach einer Verzögerung von zwei Minuten eingesetzt.
VR1-Zellen wurden mit Coelenterazin beladen, mit oder ohne BAPTA-AM behandelt und dann mit zunehmenden Konzentrationen des Antagonisten Capsazepin inkubiert. Unter Verwendung einer Hand-Multikanalpipette wurde Capsaicin (0,5 μM) den 96-Muldenplatten, welche die VR1-exprimierenden Zellen enthielten, zugegeben (10B). Nach einem Intervall von zwei Minuten wurden die Platten mit Hilfe des WALLAC MICROBETA JET-Luminometers abgelesen. Komplexe Dosis-Antwort-Kurven wurden für den Antagonisten Capsazepin erhalten. Das Lumineszenzsignal nahm tatsächlich mit der Antagonistenkonzentration bis zu einem gewissen Punkt zu, war jedoch bei höheren Konzentrationen vollständig blockiert. Diese komplexe Dosis-Antwort-Kurve wurde sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit von BAPTA beobachtet. Jedoch erhöhte insgesamt die Zugabe von BAPTA die Lumineszenz so, dass ein vierfaches Signal gegenüber dem Hintergrund zwei Minuten nach Stimulation mit Agonist gemessen werden konnte. Darüber hinaus zeigten die Rezeptor-Antagonisten die erwartete Wirksamkeit in Anwesenheit von BAPTA.
Zum besseren Verständnis der Komplexität der Dosis-Antwort-Kurven wurde die Kinetik der Aequorin-Lumineszenz in den VR1-HEK293-AEQ-Zellen in Anwesenheit zunehmender Konzentrationen an Antagonist untersucht. Es wurde festgestellt, dass der Antagonist selbst bei weniger als sättigenden Konzentrationen eine Verzögerung des Calcium-Signals in Abwesenheit von Chelator verursachte. Mutmaßlich sind die verzögerten Kinetiken auf eine Konkurrenz zwischen dem Agonisten und Antagonisten um den Rezeptor zurückzuführen. Dies unterscheidet sich erheblich von dem Mechanismus, mit dem BAPTA die Lumineszenz verzögert, welcher auf die Chelierung von Calcium zurückzuführen ist. Obwohl der Mechanismus unterschiedlich ist, zeigen die Resultate an, dass ein bekannter Antagonist ebenfalls zur Verzögerung des Calcium-Transients verwendet werden könnte. Jedoch sollte die Verwendung eines intrazellulären Chelators universeller auf einen beliebigen calcium-basierten funktionellen Assay anwendbar sein.
BEISPIEL 9
Manuelle Lumineszenzmessung mit Zellen, die Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptor 1a exprimieren
Zelllinien und Wachstumsbedingungen
Ausgangs-HEK293-Zelllinien, die Apoaequorin exprimierten (293AEQ17-Zellen), wurden verwendet zur Entwicklung stabiler klonaler Zelllinien, welche den Human-Wachstumshormon-Sekretagogum-Rezeptortyp 1a exprimierten (hGHSR1A). Die hGHSR1A-Zellen wurden auf Wachstumsmedium, das DMEM (GIBCOBRL, hohe Glucose, mit L-Glutamin, mit 110 mg/l Natriumpyruvat, mit Pyridoxin-HCl), 25 mM HEPES (GIBCOBRL, 1 M Stammlösung), 0,5 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL, 50 mg/ml Stammlösung), 0,2 mg/ml Hygromycin (BOEHRINGER MANNHEIM) und 10% fötales Rinderserum (HYCLONE, definiert) enthielt, bei 37°C, 10% CO₂, aufrechterhalten.
Präparation von Zellen für den Assay
Zellen wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekulturgefäßen (T-225, CORNING) gezüchtet und durch Trypsinbehandlung (Trypsin/EDTA, GIBCOBRL) geerntet. Zellen wurden in weiße 96-Mulden-BIOCOAT-Poly-D-lysin-Platten mit transparentem Boden (BECTON DICKENSON, Bedford, MA) in Wachstumsmedium aufgeteilt (etwa 1 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Mulde) und über Nacht bei 37°C in einem Feuchtluft-Inkubator bei 10% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden mit dem Aequorin-Substrat Coelenterazin h (MOLECULAR PROBES, # C-6780) beladen durch Entfernen des Wachstumsmediums und Inkubieren der Zellen mit 75 μl Beladungspuffer (DMEM GIBCOBRL # 12320-032; 0,1% FBS GEMINI BIO-PRODUCTS, Inc. # 100–107; 5 μM Coelenterazin h; 30 μM reduziertes Glutathion) für 2 h bei 37°C, 10% CO₂. Der Beladungspuffer wurde dann entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 100 μl angereichertem PBS (pH 7,2) gewaschen und dann mit 100 μl angereichertem PBS, ergänzt mit 0–10 μM BAPTA-AM, für 30 Minuten bei 37°C, 10% CO₂, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 100 μl angereichertem PBS mit dem oder ohne den angegebenen Antagonisten beladen. Die Calcium-Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl der angegebenen Konzentration an Ghrelin (Phoenix Pharmaceuticals # 031031) zu dem entsprechenden Satz von 6 Mulden unter Verwendung einer manuelllen Vorrichtung initiiert. Der WALLAC MICROBETA JET wurde zur Messung von 10 Sekunden Lumineszenz nach einer Verzögerung von zwei Minuten eingesetzt.
hGHSR1a-Zellen wurden mit Coelenterazin beladen, mit oder ohne BAPTA-AM behandelt und dann mit zunehmenden Konzentrationen des Antagonisten L-756,867 inkubiert (Smith, R. G., Griffin, P. R., Xu, Y., Smith, A. G. A., Liu, K., Calacay, J., Feighner, S. D., Pong., C.-S., Leong, D., Pomes, A., Cheng, K., Van der Ploeg, L. H. T., Howard, A. D., Schaeffer, J., & Leonard, R. J. (2000), Adenosine: A partial agonist of the growth hormone secretagogue receptor, Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, 1306–1313; Bednarek, M. A., Feighner, S. C., Pong, S.-S., McKee, K. K., Hreniuk, D. L., Silva, M. V., Warren, V. A., Howard, A. D., Van der Ploeg, L. H. Y., und Heck, J. V. (2000), Structure-function studies on the new growth hormone-releasing peptide, ghrelin: Minimal sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a, J. Med. Chem. 43, 4370–4376). Unter Verwendung einer Hand-Multikanalpipette wurde Ghrelin (100 nM) den 96-Muldenplatten, welche die hGHSR1a-Zellen enthielten, zugegeben (10A). Nach einem Intervall von zwei Minuten wurden die Platten unter Verwendung des WALLAC MICROBETA JET-Luminometers abgelesen. Das Lumineszenzsignal nahm tatsächlich mit der Antagonistenkonzentration bis zu einem gewissen Punkt zu, war jedoch bei höheren Konzentrationen vollständig blockiert. Diese komplexen Dosis-Antwort-Kurven wurden sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit von BAPTA beobachtet. Jedoch erhöhte insgesamt die Zugabe von BAPTA die Lumineszenz so, dass ein 6faches Signal gegenüber dem Hintergrund zwei Minuten nach Stimulation mit Agonist gemessen werden konnte. Darüber hinaus zeigten die Rezeptor-Antagonisten die erwartete Wirksamkeit in Gegenwart von BAPTA.
Diskussion
Niedrige Niveaus an intrazellulärem Chelator, BAPTA, können die Kinetik von Calcium-Transients, erzeugt durch den Einstrom durch einen Plasmamembran-Ionenkanal (VR1) oder Freisetzung aus intrazellulären Speichern (InsP₃-gesteuerten Kanälen), verlangsamen. In den hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wurde der zell-permeable Acetoxymethylester des Calcium-Chelators BAPTA verwendet, da er im Handel erhältlich ist und unschwer in Zellen, die in 96-Mulden-Platten kultiviert wurden, eingebracht werden kann. Die Calcium-Bindungskinetik und Wirksamkeit vieler Calcium-Chelatoren wurde gemessen und zeigte eine schnelle Bindung (2–8 × 10⁸ M^–1s^–1), jedoch mit stark variablen Freisetzungsraten (100–10.000 s^–1) und Affinitäten. Diese umfassen fluoreszente Calcium-Sonden wie Fura-2 und den hier eingesetzten nicht-fluoreszierenden Chelator BAPTA. Die am häufigsten verwendeten Calcium-Chelatoren, EDTA und EGTA, binden und freisetzen Calcium viel langsamer (100fach) als BAPTA und könnten nicht so wirksam wie BAPTA bei der Verzögerung der sehr schnellen Calcium-Änderungen, welche durch den VR1-Kanal erzeugt werden, sein.
Die Calcium-Reaktionen konnten erwartungsgemäß bei ausreichend hohen Konzentrationen an BAPTA-AM vollständig blockiert werden. Die Daten demonstrieren, dass es wichtig ist, die Rezeptor-Stimulation und intrazelluläre BAPTA-Konzentration auszubalancieren. Nachdem die intrazelluläre BAPTA-Konzentration von mehreren Faktoren bestimmt wird, einschließlich u. a. Inkubationszeit, Temperatur und Zelltyp, sollte die BAPTA-AM-Konzentration sorgfältig titriert werden.
Es gibt viele andere in der Literatur beschriebene Calcium-Chelatoren sowie calcium-bindende Proteine, welche zur Verzögerung der mittels calcium-sensitiver Reporter gemessenen Reaktion eingesetzt werden könnten. Beispielsweise könnte man stabile Zelllinien erzeugen, die calcium-bindende Proteine exprimieren, was der Notwendigkeit zur Beladung von Zellen mit BAPTA-AM entheben würde.
Nach der technischen Lehre dieser Erfindungsbeschreibung muss man nur einen beliebigen speziellen Chelator oder ein beliebiges spezielles Bindungsprotein testen, um die geeignete Konzentration festzustellen, welche effektiv ein Fenster zur Verfügung stellt, das bei der Gestaltung eines Hochdurchsatz-Assays eingesetzt werden kann. Ein beliebiger Chelator oder beliebiges Bindungsprotein können auf Grundlage seiner Eigenschaften gewählt werden, einschließlich beispielsweise Verfügbarkeit innerhalb einer Zelle, Calcium-Affinität und Freisetzungsrate von Calcium und Gesamtperformance bei der Verzögerung eines Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignals.

Claims

Verfahren zur Bestimmung in vitro, ob eine Kandidatenverbindung ein Agonist oder ein Inhibitor eines Proteins ist, unter Verwendung von Zellen, die einen calcium-sensitiven Reporter enthalten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von Zellen, welche das Protein exprimieren und einen calcium-sensitiven Reporter enthalten; (b) Aussetzen der Zellen einem Chelator von Calcium unter Bedingungen, unter denen der Chelator in die Zelle eintritt und intrazellulär bleibt; (c) Aussetzen eines ersten Teils der Zellen einer Kandidatenverbindung und Zurückbehalten eines zweiten Teils von Zellen, welche nicht der Kandidatenverbindung ausgesetzt werden; (d) Messen des im ersten Teil der Zellen erzeugten Signals und des im zweiten Teil der Zellen erzeugten Signals; und (e) Vergleichen der Größe des Signals, das in den ersten und zweiten Teilen der Zellen erzeugt wurde, wobei eine Erhöhung der Signalgröße in Anwesenheit der Kandidatenverbindung anzeigt, dass die Kandidatenverbindung ein Agonist des Proteins ist; wobei das von dem calcium-sensitiven Reporter erzeugte Signal durch die Anwesenheit des Chelators von Calcium in den Zellen verzögert wird und das Protein ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor ist oder ein Ionenkanal, der an einen Calciumkanal gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) umfasst das Bereitstellen von Zellen, die transient mit einem Expressionsvektor, welcher die Expression des Proteins steuert, transfiziert wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reporter ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zellen transient mit einem Expressionsvektor, welcher die Expression des Reporters steuert, transfiziert wurden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein Polynukleotid, welches die Expression des Reporters steuert, stabil in das Genom der Zellen integriert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Reporter Aequorin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Chelator von Calcium 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäuretetra(acetoxymethyl)ester ist.