DE69836753T2

DE69836753T2 - Papilloma virus capsomere impfstoff-formulierungen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69836753T2
Application number: DE69836753T
Authority: DE
Inventors: Lutz Gissmann; Martin Chicago MÜLLER
Original assignee: Loyola University Chicago
Current assignee: Loyola University Chicago
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: EP1021547B1; ATE449852T1; US20050031636A1; JP2001519161A; CA2305382A1; NO328128B1; US7371391B2; CY1105963T1; EP1690941A1; JP4520034B2; BR9814606A; NO20001768L; CZ20001244A3; JP5296665B2; HUP0004360A3; AU9684698A; PT1021547E; US20090028894A1; IL135528A; NO20091761L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Impfstoff-Formulierungen, welche Papillomavirus-Proteine entweder als Fusionsproteine, verkürzte Proteine oder verkürzte Fusionsproteine umfassen. Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung von Kapsomeren der Formulierungen wie auch prophylaktische und therapeutische Verfahren zu deren Verwendung.
HINTERGRUND
Es wird angenommen, dass Infektionen mit bestimmten Hochrisiko-Stämmen von genitalen Papillomaviren bei Menschen (HPV) – beispielsweise HPV 16, 18 oder 45 – der Hauptrisikofaktor für die Bildung von bösartigen Tumoren des Anogenitaltrakts sind. Von den möglichen malignen Erkrankungen sind Gebärmutterhalskarzinome bei weitem die häufigsten: gemäß einer Schätzung der Weltgesundheitsorganisation (WHO) treten jedes Jahr nahezu 500.000 neue Fälle der Erkrankung auf. Aufgrund der Häufigkeit, mit der diese Pathologie auftritt, ist die Verbindung zwischen HPV-Infektionen und Gebärmutterhalskarzinomen intensiv untersucht worden, was zu zahlreichen Generalisierungen geführt hat.
Beispielsweise ist bekannt, dass die Vorläufer-Läsionen einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) durch Papillomavirus-Infektionen verursacht werden [Crum, New Eng. J. Med. 310:880–883 (1984)]. DNA aus den Genomen von bestimmten HPV-Typen, einschließlich beispielsweise der Stämme 16, 18, 33, 35 und 45, ist in mehr als 95% der Tumorbiopsien aus Patienten mit dieser Erkrankung wie auch in primären Zelllinien, die ausgehend von den Tumoren kultiviert worden sind, nachgewiesen worden. Es ist festgestellt worden, dass ungefähr 50 bis 70% der aus Biopsien stammenden CIN-Tumorzellen DNA umfassen, die ausschließlich von HPV16 abgeleitet ist.
Die Proteinprodukte der frühen Gene E6 und E7 von HPV16 und HPV18 sind in Gebärmutterhalskarzinom-Zelllinien wie auch in in vitro transformierten humanen Keratinozyten nachgewiesen worden [Wettstein et al., in PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, Pfister (Hrsg.), CRC Press: Boca Raton, FL 1990, S. 155–179] und ein signifikanter Prozentsatz von Patienten mit Gebärmutterhalskarzinomen hat anti-E6- oder anti-E7-Antikörper. Es ist gezeigt worden, dass die E6- und E7-Proteine an der Induktion der zellulären DNA-Synthese in humanen Zellen, an der Transformation von humanen Keratinozyten und anderen Zelltypen und der Tumorbildung in transgenen Mäusen beteiligt sind [Arbelt et al., J. Virol., 68:4358–4364 (1994); Auewarakul et al., Mol. Cell. Biol., 14:8250–8258 (1994); Barbosa et al., J. Virol. 65:292–298 (1991); Kaur et al., J. Gen. Virol. 70:1261–1266 (1989); Schlegel et al., EMBO J., 7:3181–3187 (1988)]. Die konstitutive Ex pression der E6/E7-Proteine scheint notwendig zu sein, um den transformierten Zustand von HPV-positiven Tumoren aufrechtzuerhalten.
Trotz der Fähigkeit von einigen HPV-Stämmen, in vivo und in vitro neoplastische Phänotypen zu induzieren, verursachen noch andere HPV-Arten gutartige Feuchtwarzen, wie Condyloma acuminata, und sind nur selten mit malignen Tumoren assoziiert [Ikenberg, in Gross et al. (Hrsg.), GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS. Springer Verlag, Berlin, S. 87–112]. Mit einem niedrigen Risiko behaftete Stämme dieses Typs umfassen beispielsweise HPV 6 und 11.
Am häufigsten werden genitale Papillomaviren zwischen Menschen während des Geschlechtsverkehrs übertragen, was in vielen Fällen zu einer persistierenden Infektion in der anogenitalen Schleimhautmembran führt. Obwohl diese Beobachtung nahe legt, dass entweder die primäre Infektion eine inadäquate Immunantwort induziert oder dass das Virus die Fähigkeit entwickelt hat, die Immunsurveillance zu umgehen, legen andere Beobachtungen nahe, dass das Immunsystem während einer primären Manifestation wie auch während der malignen Weiterentwicklung von Papillomavirus-Infektionen aktiv ist [Altmann et al., in VIRUSES AND CANCER, Minson et al. (Hrsg.), Cambridge University Press, (1994), S. 71–80].
Beispielsweise kann die klinische Manifestation einer primären Infektion durch Kaninchen- und Rinder-Papillomaviren durch Impfung mit Warzenextrakten oder viralen Strukturproteinen verhindert werden [Altmann et al., a.a.O.; Campo, Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186:225–266 (1994); Yindle und Frazer, Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186:217–253 (1994)]. Nager, die zuvor mit rekombinanten Vacciniaviren, die die frühen Proteine E6 oder E7 von HPV 16 kodieren, oder mit synthetischen E6- oder E7-Peptiden geimpft worden sind, sind in ähnlicher Weise vor einer Tumorbildung nach Inokulation von mit HPV 16 transformierten autologen Zellen geschützt [Altmann et al., a.a.O.; Campo et al., a.a.O.; Yindle und Frazer et al., a.a.O.]. Eine Regression von Warzen kann durch den Transfer von Lymphozyten aus Regressor-Tieren nach einer Infektion durch tierische Papillomaviren induziert werden. Schließlich ist bei immunsupprimierten Patienten, wie beispielsweise Empfängern von Organtransplantaten oder Individuen, die mit HIV infiziert sind, das Auftreten von Feuchtwarzen, CIN und anogenitalen Krebserkrankungen erhöht.
Virology 234, 1997, Seiten 93–111, offenbart Verfahren, um chimäre Papillomavirus-artige Partikel, bestehend aus HPV 16-L1- und -E7-Fusionsproteinen, herzustellen. Li et al. (1997), J. Virology 71, 2988–2995, offenbaren das Herstellen von Kapsomeren durch Trypsinspaltung.
Bislang sind keine HPV-Impfungen beschrieben worden, die das späte Protein L1 des humanen Papillomavirus in Form von Kapsomeren, die sowohl für prophylaktische als auch therapeutische Zwecke geeignet sind, umfassen. Da das L1-Protein in malignen Genitalläsionen nicht vorkommt, hat eine Impfung mit dem L1-Protein keinerlei therapeutisches Potential für diese Patienten. Eine Konstruktion von chimären Proteinen, welche Aminosäurereste aus dem L1-Protein und beispielsweise dem E6- oder E7-Protein umfassen, welche chimäre Kapsomere erzeugen, kombiniert prophylaktische und therapeutische Funktionen eines Impfstoffs. Ein Verfahren zur Herstellung von chimären Kapsomeren in großem Ausmaß würde dementsprechend besonders wünschenswert sein in Hinblick auf die möglichen Vorteile, die ein solcher Impfstoff für prophylaktische und therapeutische Interventionen bietet.
Es besteht dementsprechend in diesem Fachgebiet ein Bedarf, Impfstoffformulierungen bereitzustellen, die HPV-Infektionen verhüten oder behandeln können. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffformulierungen, die Probleme, von denen in diesem Fachgebiet bekannt ist, dass sie mit der Expression und Reinigung von rekombinantem HPV-Protein verbunden sind, überwinden, würden augenscheinlich nützlich sein, um die Population von Individuen, die bereits mit HPV infiziert sind, zu behandeln, wie auch nützlich sein, um die Population von Individuen, die für eine HPV-Infektion anfällig sind, zu immunisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt therapeutische und prophylaktische Impfstoffformulierungen, welche chimäre humane Papilloma-Kapsomere umfassen, bereit. Die Erfindung stellt auch therapeutische Verfahren zur Behandlung von Patienten, die mit einem HPV infiziert sind, wie auch prophylaktische Verfahren zur Verhütung einer HPV-Infektion bei einem anfälligen Individuum bereit. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Kapsomeren und Proteinen der Erfindung werden ebenfalls mit berücksichtigt.
Unter einem Aspekt der Erfindung wird an prophylaktische Impfungen zur Verhütung einer HPV-Infektion gedacht, die die Strukturproteine L1 und L2 des Papillomavirus beinhalten. Einer Entwicklung eines Impfstoffs dieser Art stehen signifikante Hindernisse entgegen, da Papillomaviren in Zellkulturen oder anderen experimentellen Systemen nicht bis zu adäquaten Titern vermehrt werden können, um die viralen Proteine in ausreichender Menge für eine wirtschaftliche Impfstoffproduktion zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus sind Methodiken der in vitro-DNA-Rekombination, um die Proteine zu exprimieren, nicht immer geradlinig und führen oftmals zu geringer Proteinausbeute. Unlängst sind Virus-artige Partikel („virus-like particles"; VLP), die in ihrem Aufbau ähnlich zu viralen Kapsidstrukturen sind, beschrieben worden, die in Sf-9-Insektenzellen nach Expression der viralen Proteine L1 und L2 (oder L1 allein) unter Verwendung von rekombinanten Vaccinia- oder Baculoviren gebildet werden. Eine Reinigung der VLPs kann sehr einfach mittels einer Zentrifugation in CsCl- oder Sucrose-Gradienten erzielt werden [Kimbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 99:12180–12814 (1992); Kirnbaurer et al., J. Virol. 67:6929–6936 (1994); Proso et al., J. Virol. 6714:1936–1944 (1992); Sasagawa et al., Virology 2016:126–195 (1995); Volpers et al., J. Virol. 69:3258–3264 (1994); Zhou et al., J. Gen. Virol. 74:762–769 (1993); Zhou et al., Virology 185:251–257 (1991)]. WO 93/02184 beschreibt ein Verfahren, in welchem Papillomavirus-artige Partikel (VLPs) für diagnostische Anwendungen oder als ein Impfstoff gegen durch das Papillomavirus hervorgerufene Infektionen verwendet werden. WO 94/00152 beschreibt eine rekombinante Produktion von L1-Protein, welches das konformationale neutralisierende Epitop auf humanen und tierischen Papillomavirionen nachahmt.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung werden therapeutische Impfungen bereitgestellt, um Komplikationen von beispielsweise Gebärmutterhalskarzinomen oder Vorläufer-Läsionen, welche aus einer Papillomavirus-Infektion resultieren, zu lindern, und diese stellen dementsprechend eine Alternative zu einer prophylaktischen Intervention dar. Impfungen dieser Art können frühe Papillomavirus-Proteine, hauptsächlich E6 oder E7, die in den persistierend infizierten Zellen exprimiert werden, umfassen. Es wird angenommen, dass nach einer Verabreichung einer Impfung dieser Art möglicherweise zytotoxische T-Zellen gegen persistierend infizierte Zellen in Genitalläsionen aktiviert werden. Die Zielpopulation für eine therapeutische Intervention besteht aus Patienten mit mit HPV verbundenen prä-malignen oder malignen Genitalläsionen. Die PCT-Patentanmeldung WO 93/20844 offenbart, dass das frühe Protein E7 und antigene Fragmente davon des Papillomavirus aus HPV oder BPV therapeutisch wirksam bei der Regression, nicht aber bei der Verhütung von Papillomavirus-Tumoren in Säugetieren sind. Obwohl frühe HPV-Proteine durch rekombinante Expression in E. coli oder geeigneten eukaryotischen Zellarten produziert worden sind, hat sich die Reinigung der rekombinanten Proteine als schwierig erwiesen aufgrund der inhärenten geringen Löslichkeit und aufgrund von komplexen Reinigungsprozeduren, die im Allgemeinen eine Kombination von Schritten, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie, erfordern.
Gemäß der Erfindung werden Impfstoffformulierungen, welche Papillomavirus-Kapsomere umfassen, bereitgestellt, die entweder umfassen: (i) verkürztes virales Protein; (ii) ein verkürztes virales Protein, das als ein Fusionsprotein, welches teilweise aus Aminosäureresten aus einem zweiten Protein gebildet wird, exprimiert wird; oder (iii) irgendeine Kombination dieser beiden Arten von Proteinen. Gemäß der Erfindung werden Impfstoffformulierungen bereitgestellt, welche Kapsomere von Rinderpapillomavirus (BPV) und humanem Papillomavirus umfassen. Bevorzugte Rindervirus-Kapsomere umfassen Protein aus dem Rinderpapillomavirus vom Typ I. Bevorzugte humane Virus- Kapsomere umfassen Proteine aus einem beliebigen der humanen Papillomavirus-Stämme HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 und HPV45. Die am meisten bevorzugten Impfstoffformulierungen umfassen Kapsomere, die Proteine aus HPV16 umfassen.
Unter einem Aspekt der Erfindung werden Kapsomer-Impfstoffformulierungen bereitgestellt, die aus verkürzten viralen Proteinen bestehen, welche eine Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten, die für die Bildung eines Virus-artigen Partikels notwendig sind, aufweisen. Es ist bevorzugt, dass die Aminosäuredeletion die Bildung von Kapsomeren durch das verkürzte Protein nicht inhibiert, und es ist am meisten bevorzugt, dass die Deletion die Kapsomer-Bildung begünstigt. Bevorzugte Impfstoffformulierungen dieser Art umfassen Kapsomere, welche verkürztes L1-Protein mit oder ohne virale L2-Proteine umfassen. Besonders bevorzugte Kapsomere umfassen verkürzte L1-Proteine. Verkürzte Proteine, an die im Rahmen der Erfindung gedacht wird, umfassen jene, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste von dem Carboxyterminus des Proteins deletiert sind oder ein oder mehrere Aminosäurereste von dem Aminoterminus des Proteins deletiert sind oder ein oder mehrere Aminosäurereste aus einer internen Region (d.h. nicht von einem der Termini) des Proteins deletiert sind. Bevorzugte Kapsomer-Impfstoffformulierungen umfassen Proteine, die am Carboxyterminus verkürzt sind. In Formulierungen, welche von HPV16 abgeleitetes L1-Protein umfassen, ist es bevorzugt, dass 1 bis 34 carboxyterminale Aminosäurereste deletiert sind. Es wird auch an relativ kürzere Deletionen gedacht, die den Vorteil einer geringeren Modifizierung der antigenen Eigenschaften der L1-Proteine und der daraus gebildeten Kapsomere bieten. Es ist jedoch am meisten bevorzugt, dass 34 Aminosäurereste deletiert sind aus der L1-Sequenz entsprechend den Aminosäuren 472 bis 505 in HPV16, aufgeführt in SEQ ID NO: 2, und kodiert durch die den Nukleotiden 1414 bis 1516 in der humanes HPV 16-L1 kodierenden Sequenz, aufgeführt in SEQ ID NO: 1, entsprechende Polynukleotidsequenz
Wenn eine Kapsomer-Impfstoffformulierung aus Proteinen, die eine interne Deletion tragen, hergestellt wird, ist es bevorzugt, dass die deletierte Aminosäuresequenz die Kernlokalisierungsregion des Proteins umfasst. In dem L1-Protein von HPV16 wird das Kernlokalisierungssignal von ungefähr Aminosäurerest 499 bis ungefähr Aminosäurerest 505 gefunden. Nach einer Expression von L1-Proteinen, in welchen das NLS (Kernlokalisierungssignal) deletiert worden ist, tritt ein Zusammenbau von Kapsomer-Strukturen im Zytoplasma der Wirtszelle auf. Folglich ist eine Reinigung der Kapsomere aus dem Zytoplasma möglich anstatt aus dem Kern, wo intakte L1-Proteine sich zu Kapsomeren zusammenfügen. Kapsomere, die aus einem Zusammenbau von verkürzten Proteinen, in welchen zusätzliche Aminosäuresequenzen die deletierten Proteinsequenzen nicht ersetzen, resultieren, sind notwendigerweise nicht chimärer Natur.
Unter noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden Kapsomer-Impfstoffformulierungen bereitgestellt, die verkürztes virales Protein umfassen, welches als ein Fusionsprotein angrenzend an Aminosäurereste aus einem zweiten Protein exprimiert wird. Bevorzugte verkürzte virale Proteine der Erfindung sind die Papillomavirus-Strukturproteine L1 und L2. Kapsomere, die verkürztes Virusprotein-Fusionen umfassen, können unter Verwendung von L1- und L2-Proteinkomponenten gemeinsam oder allein von L1-Protein hergestellt werden. Bevorzugte Kapsomere sind jene, die L1-Protein-Aminosäurereste umfassen. Verkürztes Virusprotein-Komponenten der Fusionsproteine umfassen jene, bei welchen ein oder mehrere Aminosäurereste von dem Carboxyterminus des Proteins deletiert sind oder ein oder mehrere Aminosäurereste von dem Aminoterminus des Proteins deletiert sind oder ein oder mehrere Aminosäurereste aus einer internen Region (d.h. nicht von einem der beiden Termini) des Proteins deletiert sind. Bevorzugte Kapsomer-Impfstoffformulierungen umfassen Proteine, die am Carboxyterminus verkürzt sind. In jenen Formulierungen, welche von HPV16 abgeleitetes L1-Protein umfassen, ist es bevorzugt, dass 1 bis 34 carboxyterminale Aminosäurereste deletiert sind. Es wird auch an relativ kürzere Deletionen gedacht, die den Vorteil einer geringfügigeren Modifizierung der antigenen Eigenschaften der L1-Proteinkomponente des Fusionsproteins und der daraus gebildeten Kapsomere bieten. Es ist jedoch am meisten bevorzugt, dass 34 Aminosäurereste von der L1-Sequenz, entsprechend den Aminosäuren 472 bis 505 in HPV16, aufgeführt in SEQ ID NO: 2, und kodiert durch die Polynukleotidsequenz entsprechend den Nukleotiden 1414 bis 1516 in der humanes HPV16-L1 kodierenden Sequenz, aufgeführt in SEQ ID NO: 1, deletiert sind. Wenn die Impfstoffformulierung Kapsomere umfasst, die aus Proteinen, die eine interne Deletion tragen, zusammengebaut sind, ist es bevorzugt, dass die deletierte Aminosäuresequenz die Kernlokalisierungsregion oder -sequenz des Proteins umfasst.
Aminosäuren des zweiten Proteins können von zahlreichen Quellen abgeleitet werden, solange das Hinzufügen der Aminosäurereste des zweiten Proteins zu dem ersten Protein die Bildung von Kapsomeren erlaubt. Vorzugsweise hemmt das Hinzufügen der Aminosäurereste des zweiten Proteins die Fähigkeit des intakten viralen Proteins, Virus-artige Partikel-Strukturen zu bilden; am meisten bevorzugt fördern die Aminosäurereste des zweiten Proteins die Kapsomer-Bildung. Aminosäurereste des zweiten Proteins können aus zahlreichen Quellen abgeleitet werden, einschließlich Aminosäureresten aus dem ersten Protein. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das zweite Protein ein jegliches humanes Tumorantigen, virales Antigen oder bakterielles Antigen sein, das bei der Stimulation einer Immunantwort bei neoplastischen Zuständen oder Infektionskrankheitszuständen von Bedeutung ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Protein auch ein Papillomavirus-Protein. Es ist auch bevorzugt, dass das zweite Protein das Expressionsprodukt eines frühen Papillomavirus-Gens ist. Es ist jedoch auch bevorzugt, dass das zweite Protein aus der Gruppe der in dem Genom der Papillomavirus-Stämme HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 oder HPV45 kodierten frühen Genprodukte E1, E2, E3, E4, E5, E6 und E7 ausgewählt wird. Es ist am meisten bevorzugt, dass das zweite Protein durch das E7-Gen von HPV16 kodiert wird, dessen offenes Leseraster in SEQ ID NO: 3 aufgeführt ist. Aus Fusionsprotein-Untereinheiten zusammengebaute Kapsomere werden hier als chimäre Kapsomere bezeichnet. In einer Ausführungsform umfasst die Impfstoffformulierung der Erfindung chimäre Kapsomere, in denen L1-Protein-Aminosäurereste ungefähr 50 bis 99% der gesamten Aminosäurereste des Fusionsproteins ausmachen. In einer anderen Ausführungsform machen L1-Aminosäurereste ungefähr 60 bis 90% der gesamten Aminosäurereste des Fusionsproteins aus; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen L1-Aminosäuren ungefähr 80% der Aminosäurereste des Fusionsproteins.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Proteine der Impfstoffformulierungen durch Methodiken der in vitro-DNA-Rekombination hergestellt. In Formulieren, die verkürzte virale Proteine umfassen, können die Proteine aus natürlichen Quellen als intakte Proteine isoliert und in vitro unter Verwendung einer chemischen Hydrolyse oder eines enzymatischen Verdaus mittels einer beliebigen von verschiedenen ortsspezifischen oder generell wirkenden Proteasen hydrolysiert werden, das verkürzte Protein nachfolgend modifiziert werden, um zusätzliche Aminosäurereste mit aufzunehmen, wie oben beschrieben, um ein verkürztes Fusionsprotein der Erfindung bereitzustellen.
Bei der Herstellung von Kapsomeren können Techniken der rekombinanten Molekularbiologie eingesetzt werden, um DNA herzustellen, die entweder das gewünschte verkürzte Protein oder das verkürzte Fusionsprotein kodiert. Methodiken der in vitro-DNA-Rekombination, die benötigt werden, um eine DNA herzustellen, die ein gewünschtes Protein kodiert, sind wohlbekannt und werden in diesem Fachgebiet routinemäßig praktiziert. Laborhandbücher, beispielsweise Sambrook et al. (Hrsg.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) und Ausubel et al. (Hrsg.), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. (1994–1997), beschrieben im Detail Techniken, die notwendig sind, um die erforderlichen DNA-Manipulationen auszuführen. Für eine Produktion von chimären Kapsomeren in großem Maßstab kann eine Proteinexpression ausgeführt werden unter Verwendung von entweder viralen oder eukaryotischen Vektoren. Bevorzugte Vektoren umfassen jegliche der wohlbekannten prokaryotischen Expressionsvektoren, rekombinanten Baculoviren, COS-Zell-spezifischen Vektoren, rekombinanten Vacciniaviren oder Hefe-spezifischen Expressionskonstrukten. Wenn rekombinante Proteine verwendet werden, um Kapsomere der Erfindung bereitzustellen, können die Proteine zuerst aus der Wirtszelle ihrer Expression isoliert und danach unter Bedingungen, die einen selbsttätigen Zusammenbau, um Kapsomere bereitzustellen, erlauben, inkubiert werden. Alternativ können die Proteine unter Bedingungen, bei welchen Kapsomere in der Wirtszelle gebildet werden, exprimiert werden.
Die Erfindung zieht auch Verfahren zur Herstellung von Kapsomeren der Impfstoffformulierungen mit in Betracht. In einem Verfahren werden L1-Proteine ausgehend von DNA, welche sechs zusätzliche Histidine am Carboxyterminus der das L1-Protein kodierenden Sequenz kodiert, exprimiert. L1-Proteine, die mit zusätzlichen Histidinen exprimiert werden (His-L1-Proteine), werden am meisten bevorzugt in E. coli exprimiert und die His-L1-Proteine können unter Verwendung einer Nickel-Affinitätschromatographie gereinigt werden. His-L1-Proteine in Zelllysat werden in einem Denaturierungspuffer, beispielsweise 6 M Guanidinhydrochlorid, oder einem Puffer von äquivalentem Denaturierungsvermögen suspendiert und dann einer Nickel-Chromatographie unterworfen. Aus dem Nickel-Chromatographieschritt eluiertes Protein wird renaturiert, beispielsweise in 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 0,01% Triton-X 100,10 mM HEPES (2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), pH 7,4. Gemäß einem bevorzugten Verfahren der Erfindung findet der Zusammenbau von Kapsomeren nach einer Dialyse der gereinigten Proteine statt, vorzugsweise nach einer Dialyse gegen 150 mM NaCl, 25 mM Ca²⁺, 10% DMSO (Dimethylsulfoxid, 0,1 % Triton-X 100, 10 mM Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethan]-Essigsäure mit einem pH-Wert von 5,0.
Die Bildung von Kapsomeren kann durch Elektronenmikroskopie überwacht werden und in Fällen, wo Kapsomere Fusionsproteine umfassen, kann das Vorhandensein von verschiedenen Proteinkomponenten in dem zusammengebauten Kapsomer durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von spezifischen Antiseren bestätigt werden.
Gemäß der Erfindung werden Impfstoffformulierungen für eine Verwendung bei einer therapeutischen Behandlung von mit HPV infizierten Individuen bereitgestellt.
Eine Verwendung der Impfstoffformulierungen ermöglicht auch eine prophylaktische Behandlung von Individuen, die für eine HPV-Infektion anfällig sind. Während infizierte Individuen leicht unter Verwendung von diagnostischen Standardtechniken identifiziert werden können, können anfällige Individuen beispielsweise als jene, die sexuelle Beziehungen zu einem infizierten Individuum unterhalten, identifiziert werden. Jedoch sind aufgrund der hohen Häufigkeit von HPV-Infektionen alle sexuell aktiven Personen für Papillomavirus-Infektionen anfällig.
Eine Verabreichung einer Impfstoffformulierung kann eine oder mehrere zusätzliche Komponenten, wie pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und/oder Puffer, umfassen. Impfstoffe können zu einem einzigen Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten verabreicht werden. Eine Impfstoffformulierung der Erfindung kann über verschiedene Routen abgegeben werden, einschließlich beispielsweise einer oralen, intravenösen, intramuskulären, nasalen, rektalen, transdermalen, vaginalen, subkutanen und intraperitonealen Verabreichung.
Impfstoffformulierungen der Erfindung bieten zahlreiche Vorteile, wenn sie mit herkömmlichen Impfstoffpräparaten verglichen werden. Als Teil einer therapeutischen Impfung können Kapsomere die Eliminierung von persistierend infizierten Zellen bei beispielsweise Patienten mit CIN oder Gebärmutterhalskarzinomen fördern. Zusätzlich können therapeutische Impfungen dieser Art auch einem prophylaktischen Zweck zum Schützen von Patienten mit CIN-Läsionen vor einer Reinfektion dienen. Als ein zusätzlicher Vorteil können Kapsomere einer Neutralisation durch bereits vorher existierende Antikapsid-Antikörper entrinnen und besitzen dadurch längere Zirkulationshalbwertszeiten verglichen mit chimären Virus-artigen Partikeln.
Impfstoffformulierungen, die chimäre Kapsomere umfassen, können den zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Antigenität von beiden Proteinkomponenten des Fusionsproteins, ausgehend von welchem das Kapsomer gebildet wird, bieten. Beispielsweise können in einem VLP Proteinkomponenten des zugrunde liegenden Kapsomers in der Gesamtstruktur als Ergebnis einer internalisierten Positionierung innerhalb des VLPs selbst vergraben sein. In ähnlicher Weise können Epitope der Proteinkomponenten als Ergebnis eines Kapsomer-Kapsomer-Kontakts sterisch gehindert werden und dementsprechend für die Auslösung einer Immunantwort unzugänglich sein. Vorläufige Ergebnisse unter Verwendung von L1/E7-Fusionsproteinen, um VLPs herzustellen, unterstützen diese Ansicht, indem keine Antikörperreaktion gegen die E7-Komponente detektiert wurde. Diese Beobachtung ist konsistent mit früheren Ergebnissen, die anzeigen, dass die carboxyterminale Region von L1 inter-pentamere Armstrukturen bildet, die einen Zusammenbau von Kapsomeren zu Kapsiden ermöglichen [Garcia et al., J. Virol. 71:2988–2995 (1997)]. In einer chimären Kapsomer-Struktur sind mutmaßlich beide Proteinkomponenten der Fusionsprotein-Substruktur zugänglich, um eine Immunantwort auszulösen. Kapsomer-Impfstoffe würden dementsprechend den zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Antigenität bezüglich einer jeglichen Proteinkomponente, einschließlich beispielsweise neutralisierender Epitope aus anderen Virusproteinen, die als eine Fusion mit L1-Aminosäuresequenzen exprimiert werden, bieten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren, um Fusions- oder chimäre virale Proteine zu produzieren. Beispiel 2 betrifft die Erzeugung von rekombinanten Baculoviren für die Expression von viralen Proteinen. Beispiel 3 richtet sich an die Reinigung von Kapsomeren. Beispiel 4 beschreibt ein Immunisierungsprotokoll für die Herstellung von Antiseren und monoklonalen Antikörpern. Beispiel 5 gibt einen Peptid-ELISA, um die Kapsomer-Bildung zu quantifizieren, an. Beispiel 6 beschreibt einen Antigen-Einfang-ELISA, um die Kapsomer-Bildung zu quantifizieren. Beispiel 7 gibt einen Hämagglutinin-Assay, um auf die Induktion von neutralisierenden Antikörpern zu testen, an.
Beispiel 1
Konstruktion von chimären L1-Genen
DNA, welche das offene Leseraster von HPV 16-L1 kodiert, wurde aus dem Plasmid 16-114/k-L1/L2-pSynxtVI^– [Kirnbauer et al., J. Virol. 67:6929–6936 (1994)] unter Verwendung von BglII herausgeschnitten und das resultierende Fragment in pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA), der zuvor an der einmalig vorkommenden BamHI-Restriktionsstelle linearisiert worden war, subkloniert. Es wurden zuerst zwei grundlegende Expressionskonstrukte erzeugt, um eine nachfolgende Insertion von DNA, um eine Fusionsprotein-Expression zu ermöglichen, zu erlauben. Ein Konstrukt kodierte HPV 16 L1Δ310, welches eine neun Aminosäuren-Deletion aufwies: es war bekannt, dass die deletierte Region ein geringes Ausmaß an Homologie zu allen anderen Papillomavirus-L1-Proteinen zeigte. Das zweite Konstrukt, HPV 16 L1 ΔC, kodierte ein Protein mit einer 34 Aminosäuren-Deletion der carboxyterminalen L1-Reste. Andere Konstrukte umfassen eine EcoRV-Restriktionsstelle an der Position der Deletion für eine vereinfachte Insertion von DNA, welche andere Proteinsequenzen kodiert. Das Hinzufügen der EcoRV-Stelle kodiert zwei Nicht-L1-Protein-Aminosäuren, Aspartat und Isoleucin.
A. Erzeugung eines HPV 16 L1Δ310-Expressionskonstrukts
Es wurden zwei Primer (SEQ ID NOs: 5 und 6) gestaltet, um den pUC19-Vektor und die vollständige kodierende Sequenz von HPV 16-L1 mit der Ausnahme der Nukleotide 916 bis 942 in SEQ ID NO: 1 zu amplifizieren. Die Primer wurden so synthetisiert, dass eine einmalig vorkommende EcoRV-Restriktionsstelle (in SEQ ID NOs: 5 und 6 unterstrichen) an den Termini des Amplifizierungsprodukts eingeführt wurde.
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRV verdaut, um komplementäre Enden bereitzustellen, und das Produkt des Verdaus durch Ligation zirkularisiert. Mit ligierter DNA wurden E. coli unter Verwendung von Standardtechniken transformiert und Plasmide aus den resultierenden Kolonien wurden auf das Vorhandensein einer EcoRV-Restriktionsstelle gescreent. Es wurde ein als HPV 16 L1Δ310 bezeichneter Klon derart identifiziert, dass er die geeignete siebenundzwanzig Nukleotide-Deletion aufwies, und dieses Konstrukt wurde verwendet, um DNA-Fragmente, die andere HPV 16-Proteine kodierten, an der EcoRV-Stelle, wie nachfolgend diskutiert, zu inserieren.
B. Erzeugung eines HPV 16 L1ΔC-Expressionskonstrukts
Es wurden zwei Primer (SEQ ID NOs: 7 und 8) komplementär zu dem offenen Leseraster von HPV 16-L1 derart gestaltet, dass die Primer aneinander angrenzten, um eine Amplifizierung in umgekehrten Richtungen an der Matrizen-DNA, welche HPV 16-L1 kodierende Sequenzen in dem oben beschriebenen pUC19 umfasste, zu erlauben.
Jeder Primer führte eine EcoRV-Restriktionsstelle an dem Terminus des Amplifizierungsprodukts ein. In dem strangabwärts gelegenen Primer (SEQ ID NO: 8) folgte der EcoRV-Stelle ein TAA-Translationsstopcodon, welches derart positioniert war, dass das Amplifizierungsprodukt nach Ligation der EcoRV-Enden zur Zirkularisierung eine Deletion der 34 carboxyterminalen Aminosäuren von L1 umfassen würde. Es wurde eine PCR ausgeführt, um das partielle offene Leseraster von L1 und den kompletten Vektor zu amplifizieren. Das Amplifizierungsprodukt wurde mit EcoRV gespalten, mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert und damit E. coli DH5 α-Zellen transformiert. Plasmide aus lebensfähigen Klonen wurden auf das Vorhandensein einer EcoRV-Stelle, die das Plasmid linearisieren würde, analysiert. Es wurde ein positives Konstrukt, welches als pUCHPV16L1ΔC bezeichnet wurde, identifiziert und verwendet, um DNA aus anderen HPV 16-Proteinen unter Verwendung der EcoRV-Stelle zu inserieren.
C. Insertion von DNA-Fragmenten in HPV 16 L1Δ310 und HPV16 L1ΔC
DNA-Fragmente aus HPV 16-E7, welche die Aminosäuren 1-50, 1-60, 1-98, 25-75, 40-98, 50-98 in SEQ ID NO: 4 kodierten, wurden unter Verwendung von Primern, die terminale 5'-EcoRV-Restriktionsstellen einführten, um eine Insertion des Fragments in ent weder die modifizierte HPV 16 L1 Δ310- oder HPV16 L1ΔC-Sequenz zu vereinfachen, amplifiziert. In den verschiedenen Amplifizierungsreaktionen wurde der Primer E7.1 (SEQ ID NO: 9) verwendet in Kombination mit dem Primer E7.2 (SEQ ID NO: 10), um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das die E7-Aminosäuren 1-50 kodierte; mit dem Primer E7.3 (SEQ ID NO: 11), um ein DNA-Fragment zu erzeugen, welches die E7-Aminosäuren 1-60 kodierte; oder mit dem Primer E7.4 (SEQ ID NO: 12), um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das die E7-Aminosäuren 1-98 kodierte. In anderen Amplifizierungsreaktionen wurden die Primerpaare E7.5 (SEQ ID NO: 13) und E7.6 (SEQ ID NO: 14) verwendet, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, welches die E7-Aminosäuren 25-75 kodierte; E7.7 (SEQ ID NO: 15) und E 7.4 (SEQ ID NO: 12) wurden verwendet, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, welches die E7-Aminosäuren 40-98 kodierte; und E7.8 (SEQ ID NO: 16) und E7.4 (SEQ ID NO: 12) wurden verwendet, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, welches die E7-Aminosäuren 50-98 kodierte.
In ähnlicher Weise wurden Nukleotide aus DNA, welche das Influenza-Matrixprotein (SEQ ID NO: 17) kodiert, unter Verwendung des Primerpaares, das in SEQ ID NOs: 19 und 20 aufgeführt ist, amplifiziert. Beide Primer führten eine EcoRV-Restriktionsstelle in das Amplifizierungsprodukt ein.
PCR-Produkte aus jeder Amplifizierungsreaktion wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV-Stelle von entweder der HPV 16 L1 Δ310- oder der HPV16 L1ΔC-Sequenz, die zuvor mit dem gleichen Enzym linearisiert worden waren, inseriert. Um die Orientierung von Inserts in Plasmiden, welche die E7-Aminosäuren 25-75 und 50-98 kodierten, und einem Plasmid, welches Influenza-Matrixprotein umfasste, zu bestimmen, wurde ein ClaI-Verdau eingesetzt, wobei ein Vorteil aus einer Restriktionsstelle, die die neu erzeugte EcoRV-Restriktionsstelle überlappte (GATATCGAT) und in dem strangaufwärts gelegenen Primer enthalten war, gezogen wurde. Für die drei Expressionskonstrukte, welche das Methionin-Startcodon von HPV16-E7 umfassten, wurde die Insert-Orientierung unter Verwendung einer NslI-Restriktionsstelle innerhalb der kodierenden Region von E7 bestimmt.
Waren einmal Expressionskonstrukte, welche die geeigneten Inserts aufwiesen, identifiziert, wurde die Protein kodierende Region für sowohl L1 als auch inserierte Aminosäuren als eine Einheit unter Verwendung der Restriktionsenzyme XbaI und SmaI herausgeschnitten und die isolierte DNA in das Plasmid pVL1393 (Invitrogen) ligiert, um rekombinante Baculoviren zu erzeugen.
D. Beseitigung von EcoRV-Restriktionsstellen in Expressionskonstrukten
Die HPV 16 L1 ΔC-Sequenz umfasst DNA aus der EcoRV-Stelle, die zu einer Translation von Aminosäuren, die in Wildtyp-L1-Polypeptiden normalerweise nicht gefunden werden, führt. Dementsprechend wurde eine Reihe von Expressionskonstrukten gestaltet, in denen die künstliche EcoRV-Stelle eliminiert war. Die L1-Sequenz für diese Reihe von Expressionskonstrukten wurde als HPV16 L1ΔC* bezeichnet.
Um ein Expressionskonstrukt zu erzeugen, welches die HPV16 L1ΔC*-Sequenz enthielt, wurden zwei PCR-Reaktionen ausgeführt, um zwei überlappende Fragmente aus dem pUC-HPV16 L1ΔC, welcher die E7-Aminosäuren 1-50 kodierte, zu amplifizieren. Die resultierenden DNA-Fragmente überlappten an der Position der L1/E7-Grenze, enthielten aber nicht die beiden EcoRV-Restriktionsstellen. Es wurde ein Fragment 1 unter Verwendung der Primer P1 (SEQ ID NO: 21) und P2 (SEQ ID NO: 22) und ein Fragment 2 unter Verwendung der Primer P3 (SEQ ID NO: 23) und P4 (SEQ ID NO: 24) erzeugt.
Nach den ersten beiden Amplifizierungsreaktionen wurden die beiden gereinigten Produkte als Matrizen in einer anderen PCR-Reaktion unter Verwendung nur der Primer P1 und P4 verwendet. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde mit den Enzymen EcoNI und HindIII verdaut, in das oben beschriebene HPV 16 L1ΔC-Expressionskonstrukt nach einem Verdau mit den gleichen Enzymen inseriert. Das resultierende Expressionskonstrukt unterschied sich von dem ursprünglichen HPV16 L1ΔC-Konstrukt mit DNA, welche L1 und die E7-Aminosäuren 1-50 kodiert, durch den Verlust der beiden internen EcoRV-Restriktionsstellen. Die erste EcoRV-Stelle wurde durch DNA, welche native L1-Alanin- und -Glycin-Aminosäuren an dieser Position kodiert, ersetzt und die zweite wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt. Zusätzlich enthielt das Expressionskonstrukt, welches als HPV 16 L1ΔC* E7 1-52 bezeichnet wird, die ersten 52 Aminosäuren von HPV 16-E7 als Ergebnis einer Verwendung des Primers P4, der auch die E7-Aminosäurereste Histidin an Position 51 und Tyrosin an Position 52 kodiert. HPV 16 L1ΔC* E7 1-52 wurde dann verwendet, um zusätzliche HPV16 L1ΔC-Expressionskonstrukte, die des Weiteren DNA, welche die E7-Aminosäuren 1-55 kodierte, umfassten, unter Verwendung der Primer P1 (SEQ ID NO: 21) in Verbindung mit Primer P5 (SEQ ID NO: 25), die E7-Aminosäuren 1-60 mit dem Primerpaar P1 und P6 (SEQ ID NO: 26) und die E7-Aminosäuren 1-65 mit dem Primerpaar P1 und P7 (SEQ ID NO: 27) zu erzeugen. Die zusätzlichen Aminosäure-kodierenden DNA-Sequenzen in den Amplifizierungsprodukten resultierten aus der Gestaltung der Primer, indem sie zusätzliche Nukleotide für die gewünschten Aminosäuren umfassten.
In ähnlicher Weise wurde HPV 16 L1ΔC* E7 1-70 erzeugt unter Verwendung von Matrizen-DNA, welche HPV 16 L1ΔC* E7 1-66 kodierte, und des Primerpaars P1 und P8 (SEQ ID NO: 28).
Nach jeder PCR-Reaktion wurden die Amplifizierungsprodukte mit EcoNI und HindIII verdaut und in zuvor mit den gleichen Enzymen verdauten HPV16L1ΔC inseriert. Die Sequenzen von jeglichen Konstrukten wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems Prism 377-Sequenzierungsgeräts mit fluoreszierenden Kettenabbruch-Didesoxynukleotiden bestimmt [Prober et al., Science 238:336–341 (1987)].
Beispiel 2
Erzeugung von rekombinanten Baculoviren
Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen wurden in Suspensions- oder Monolayer-Kulturen bei 27° in TNMFH-Medium (Sigma), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 2 mM Glutamin, kultiviert. Für die Konstruktion von auf HPV 16-L1-basierenden rekombinanten Baculoviren wurden Sf9-Zellen mit 10 μg Transfer-Plasmid zusammen mit 2 μg linearisierter Baculo-Gold-DNA (PharMingen, San Diego, CA) transfiziert. Rekombinante Viren wurden gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll gereinigt.
Um auf eine Expression von HPV 16-L1-Protein zu testen, wurden 10⁵ Sf9-Zellen mit rekombinanten Baculoviren mit einer Infektionsmultiplizität (m.o.i) von 5 bis 10 infiziert. Nach einer Inkubation für drei bis vier Tage bei 28°C wurden die Medien entfernt und Zellen wurden mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von anti-HPV16-L1- und anti-HPV 16-E7-Antikörpern analysiert.
Um zu bestimmen, welche der chimäres L1-Protein-Expressionskonstrukte präferentiell Kapsomere produzieren würden, wurden Extrakte aus transfizierten Zellen einer Gradientenzentrifugation unterworfen. Aus dem Gradient erhaltene Fraktionen wurden hinsichtlich des L1-Proteingehalts durch Western-Blotting und auf VLP-Bildung durch Elektronenmikroskopie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Es wurde gezeigt, dass das intakte HPV-L1-Protein wie auch die Expressionsprodukte HPV 16 L1Δ310 und HPV 16 L1ΔC jeweils Kapsomere und Virus-artige Partikel in gleichen Anteilen produzierten. Wenn E7 kodierende Sequenzen in den HPV 16 L1Δ310-Vektor inseriert wurden, erzeugten nur Fusionsproteine, die die E7-Aminosäuren 1 bis 50 umfassten, eine detektierbare Kapsomer-Bildung.
Wenn E7 kodierende DNA in den HPV 16 L1ΔC-Vektor inseriert wurde, wurde festgestellt, dass alle Fusionsproteine Kapsomere produzierten; chimäre Proteine, die die E7-Aminosäurereste 40-98 umfassten, erzeugten die höchste Konzentration von ausschließlich Kapsomer-Strukturen. Chimäre Proteine, welche die E7-Aminosäuren 1-98 und 25-75 umfassten, erzeugten beide überwiegend Kapsomere, auch wenn eine Bildung von Virus-artigen Partikeln auch beobachtet wurde. Das chimäre Protein, welches die E7-Aminosäuren 1-60 umfasste, führte zu nahezu gleichen Niveaus von Kapsomer- und Virus-artige Partikel-Produktion.
Wenn E7-Sequenzen in den HPV 16 L1Δ*C-Vektor inseriert wurden, wurde gezeigt, dass alle Fusionsproteine Kapsomere produzierten. Eine Insertion von DNA, welche die E7-Reste 1-52, 1-55 und 1-60 kodierte, erzeugte die höchste Konzentration von Kapsomeren, es wurden aber gleiche Niveaus einer Produktion von Virus-artigen Partikeln beobachtet. Während eine Insertion von DNA, welche E7-DNA für die Reste 1-65, 1-70, 25-75, 40-98 und 1-98 kodierte, zu vergleichsweise niedrigeren Konzentrationen oder nicht nachweisbaren Konzentrationen von Kapsid führte, wurden Kapsomere in großen Mengen produziert.
Kapsomer- und Kapsid-Bildungsvermögen von chimären HPV-L1-Proteinen TABELLE 1
Beispiel 3
Reinigung von Kapsomeren
Trichopulsia ni (TN) High Five-Zellen wurden bis zu einer Dichte von ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml in Serum-freiem Ex-Cell 405-Medium (JRH Biosciences) kultiviert. Ungefähr 2 × 10⁸ Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 × g für 15 min pelletiert, in 20 ml Medium resuspendiert und mit rekombinanten Baculoviren mit einer m.o.i von 2 bis 5 1 h bei Raumtemperatur infiziert. Nach Zugabe von 200 ml Medium wurden Zellen ausplattiert und 3 bis 4 Tage bei 27°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden Zellen geerntet, pelletiert und in 10 ml Extraktionspuffer resuspendiert.
Die folgenden Schritte wurden bei 4°C ausgeführt. Zellen wurden 45 s bei 60 Watt beschallt und das resultierende Zelllysat wurde bei 10000 Upm in einem Sorval-SS34-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und aufbewahrt, während das resultierende Pellet in 6 ml Extraktionspuffer resuspendiert, zusätzliche 3 s bei 60 Watt beschallt und erneut zentrifugiert wurde. Die beiden Überstände wurden vereinigt, als Schicht auf einen zweistufigen Gradienten, der 14 ml 40% Sucrose auf 8 ml einer CsCl-Lösung (4,6 g CsCl pro 8 ml in Extraktionspuffer) enthielt, aufgetragen und in einem Sorval AH629-Swinging Bucket-Rotor 2 h bei 27000 Upm bei 10°C zentrifugiert. Die Grenzflächenregion zwischen dem CsCl und der Sucrose wurde zusammen mit der vollständigen CsCl-Phase in 13,4 ml-Quickseal-Röhrchen (Beckman) gesammelt und es wurde Extraktionspuffer zugesetzt, um das Volumen auf 13,4 ml einzustellen. Proben wurden über Nacht bei 50000 Upm bei 20°C in einem Beckman 70 TI-Rotor zentrifugiert. Gradienten wurden frak tioniert (1 ml pro Fraktion), indem die Röhrchen oben und unten mit einer 21 Gauge-Nadel durchbohrt wurden. Aus jedem Röhrchen wurden Fraktionen gesammelt und 2,5 μl von jeder Fraktion wurden durch ein 10% SDS-Polyacrylamidgel und Western-Blotting unter Verwendung eines anti-HPV16L1-Antikörpers analysiert.
Virus-artige Partikel und Kapsomere wurden aus den oben identifizierten Fraktionen durch Sedimentation auf 10 bis 50% Sucrose-Gradienten abgetrennt. Peak-Fraktionen aus CsCl-Gradienten wurden vereinigt und 2 h gegen 5 mM HEPES (pH 7,5) dialysiert. Die Hälfte des Dialysats wurde verwendet, um durch Zugabe von EDTA (Endkonzentration 50 mM), EGTA (50 mM), DTT (30 mM), NaCl (100 mM) und Tris/HCl, pH 8,0, (10 mM) Kapsomere durch Auseinanderbau von intakten VLPs über Nacht herzustellen. Als Kontrolle wurden zu der anderen Hälfte nur NaCl und Tris/HCl zugesetzt.
Für eine Analyse von Kapsomeren, die aus auseinandergebauten VLPs hergestellt worden sind, wurden EDTA, EGTA und DDT (Endkonzentrationen jeweils 5 mM) zu den Sucrose-Kissen zugegeben, die bei 250000 × g 2 bis 4 h bei 4°C zentrifugiert wurden. Fraktionen wurden gesammelt, indem Röhrchen von unten durchbohrt wurden. Eine 1:10-Verdünnung von jeder Fraktion wurde dann durch einen Antigen-Einfang-ELISA analysiert.
Beispiel 4
Immunisierungsprotokoll für die Produktion von polyklonalen Antiseren und monoklonalen Antikörpern
Balb/c-Mäuse werden subkutan drei Mal alle vier Wochen mit ungefähr 60 μg chimären HPV-Kapsomeren, 1:1 mit komplettem oder nicht-komplettem Freund'-Adjuvans gemischt, in einem Gesamtvolumen von 100 μl immunisiert. Sechs Wochen nach der dritten Immunisierung werden die Mäuse getötet und Blut wird durch Herzpunktion gesammelt.
Beispiel 5
Peptid-ELISA, um die Kapsomer-Bildung zu quantifizieren
Mikrotiterplatten (Dynatech) werden über Nacht mit 50 μl Peptid E701 [Muller et al., 1982] in einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS beschichtet. Vertiefungen werden 2 h bei 37°C mit 100 μl eines Puffers, der 5% BSA und 0,05% Tween 20 in PBS enthält, blockiert und dreimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen. Nach der dritten Wäsche werden 50 μl von Seren, die 1:5000 in BSA/Tween 20/PBS verdünnt worden sind, zu jeder Vertiefung zugesetzt und es wird eine Inkubation für 1 h ausgeführt. Platten werden erneut gewaschen, wie zuvor, und es werden 50 μl Ziege-anti-Maus-Peroxidase-Konjugat in einer Verdünnung von 1:5000 zugesetzt. Nach 1 h werden die Platten gewa schen und unter Verwendung von ABTS-Substrat (0,2 mg/ml, 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-β-sulfonsäure in 0,1 M Na-Acetat-Phosphat-Puffer (pH 4,2) mit 4 μl 30% H₂O₂ pro 10 ml) angefärbt. Die Extinktion wird nach 1 h bei 490 nm in einem automatisierten Dynatech-Plattenlesegerät gemessen.
Beispiel 6
Antigen-Einfang-ELISA, um die Kapsomer-Bildung zu quantifizieren
Um eine relative Quantifizierung von Virus-artigen Partikeln und Kapsomeren in Fraktionen von CsCl-Gradienten zu ermöglichen, wurde ein Antigen-Einfang-ELISA eingesetzt. Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit 50 μl/Vertiefung einer 1:500-Verdünnung (Endkonzentration von 2 μg pro ml, in PBS) mit einem Protein A-gereinigten, für HPV 16-L1 immunspezifischen monoklonalen Maus-Antikörper (Antikörper 25/C, MM07 und Ritti 1 wurden aus Mäusen, die mit HPV 16-VLPs immunisiert worden waren, erhalten) beschichtet. Platten wurden mit 5% Milch/PBS 1 h blockiert und 50 μl von Fraktionen der CsCl-Gradienten wurden für 1 h bei 37°C unter Verwendung einer 1:300-Verdünnung (in 5% Milch/PBS) zugesetzt. Nach drei Wäschen mit PBS/0,05% Tween 20 wurden 50 μl eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums (1:3000-Verdünnung in Milch/PBS), das gegen HPV 16-VLPs erzeugt worden war, zugegeben und Platten wurden bei 37°C 1 h inkubiert. Platten wurden erneut gewaschen und weiter mit 50 μl eines Ziege-anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugats (Sigma), 1:5000 in 5% Milch enthaltender PBS verdünnt, 1 h inkubiert. Nach einem abschließenden Waschen wurden Platten mit ABTS-Substrat 30 min angefärbt und die Extinktion bei 490 nm in einem automatisierten Dynatech-Plattenlesegerät gemessen. Als eine Negativkontrolle umfasste der Assay auch Vertiefungen, die nur mit PBS beschichtet worden waren.
Um monoklonale Antikörper auf Kapsomer-Spezifität zu testen, VLPs mit EDTA/DTT, um Partikel auseinanderzubauen. Behandelte Partikel-Präparationen wurden in dem Antigen-Einfang-ELISA gemessen und Ablesungen mit unbehandelten Kontrollen verglichen. Für den Auseinanderbau wurden 40 μl VLPs über Nacht bei 4°C in 500 μl Aufbrechpuffer, enthaltend 30 mM DTT, 50 mM EGTA, 60 mM EDTA, 100 mM NaCl und 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, inkubiert. Aliquots von behandelten und unbehandelten Partikeln wurden in dem obigen Einfang-ELISA in einer Verdünnung von 1:20–1:40 verwendet.
Beispiel 7
Hämagglutinin-Inhibitionsassay
Um das Ausmaß zu bestimmen, in welchem chimäre Kapsomer-Impfstoffe eine Produktion von neutralisierenden Antikörpern auslösen, wird ein Hämagglutinations- Inhibitionsassay ausgeführt, wie nachfolgend kurz beschrieben. Dieser Assay basiert auf früheren Beobachtungen, dass Virus-artige Partikel in der Lage sind, rote Blutkörperchen zu hämagglutinisieren.
Mäuse werden mit einem beliebigen der chimären Kapsomer-Impfstoffe immunisiert und Seren werden gesammelt, wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Als positive Kontrollen werden parallel zu einer chimären Kapsomer-Zubereitung HPV16-L1-Virus-artige-Partikel (VLPs) und Rinder-PV1(BPV)L1-VLPs getestet. Um eine positive Grundlinie zu ermitteln, werden die HPV16- oder BPV1-VLPs zuerst mit oder ohne Seren, die aus immunisierten Mäusen gesammelt worden sind, inkubiert, wonach rote Blutkörperchen zugegeben werden. Das Ausmaß, in welchem eine Vorinkubation mit Mäuseseren die Hämagglutinisierung von roten Blutkörperchen inhibiert, ist ein Hinweis auf das Neutralisierungsvermögen der Mäuseseren. Die Experimente werden dann unter Verwendung von chimären Kapsomeren wiederholt, um die neutralisierende Wirkung der Mäuseseren auf den Impfstoff zu bestimmen. Ein kurzes Protokoll für den Hämagglutinationstest wird nachfolgend beschrieben.
Einhundert Mikroliter Heparin (1000 usp-Einheiten/ml) werden zu 1 ml frischem Mäuseblut hinzugegeben. Rote Blutkörperchen werden dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation und Resuspendierung in einem Volumen von 10 ml. Als nächstes werden Erythrozyten in 0,5 ml PBS resuspendiert und bei 4°C bis zu drei Tage aufbewahrt. Für den Hämagglutinin-Assay werden 70 μl der Suspension pro Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet.
Chimäres Kapsomer-Aliquots aus CsCl-Gradienten werden eine Stunde gegen 10 mM Hepes (pH 7,5) dialysiert und 100 μl von zweifachen Reihenverdünnungen in PBS werden zu Mäuse-Erythrozyten in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und rundem Boden hinzugegeben, die 3-16 h bei 4°C weiter inkubiert werden. Für die Inhibition der Hämagglutination werden Kapsomere mit Verdünnungen von Antikörpern in PBS 60 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann zu den Erythrozyten hinzugegeben. Das Ausmaß der Erythrozyten-Hämagglutination und dementsprechend das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern wird durch Standradmethoden bestimmt.
In vorläufigen Ergebnissen wurde beobachtet, dass Mäuseseren, die gegen chimäre Kapsomere, umfassend HPV16L1ΔC-Protein in Kombination mit den E7-Aminosäureresten 1-98, erzeugt worden waren, die Hämagglutination durch HPV16-VLPs, nicht aber durch BPV-VLPs inhibierten. Die Mäuseseren waren dementsprechend positiv hinsichtlich neutralisierenden Antikörpern gegen die humanen VLPs und diese differenzielle Neutralisierung war höchstwahrscheinlich das Ergebnis von Antikörperspezifität für Epitope, gegen welche die Antikörper erzeugt worden waren.
Es wird erwartet, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen in der Erfindung, wie sie in den obigen, illustrativen Beispielen dargelegt worden ist, den Fachleuten auf diesem Gebiet ersichtlich sein können. Folglich sollten der Erfindung nur solche Einschränkungen auferlegt werden, wie sie in den beigefügten Ansprüchen auftauchen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antigene Formulierung, umfassend ein humanes Papillomavirus-Kapsomer zur Verwendung als Impfstoff, wobei das Kapsomer ein Fusionsprotein umfasst, das ein verkürztes humanes Papillomavirus-L1-Protein angrenzend an Aminosäurereste eines zweiten Proteins umfasst, wobei das L1-Protein und die Aminosäuren des zweiten Proteins so positioniert sind, dass die Bildung von Virus-artigen Partikeln inhibiert wird, wobei die Formulierung eine Immunantwort hervorruft, die humane Papillomavirus-Virionen neutralisiert.
Antigene Formulierung, umfassend ein humanes Papillomavirus-Kapsomer zur Verwendung als Impfstoff, wobei das Kapsomer ein verkürztes humanes Papillomavirus-L1-Protein umfasst, das eine Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten, die für die Bildung von Virus-artigen Partikeln notwendig sind, aufweist, wobei die Formulierung eine Immunantwort hervorruft, die humane Papillomavirus-Virionen neutralisiert.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 2, wobei das Kapsomer ein Fusionsprotein umfasst, das ein verkürztes humanes Papillomavirus-L1-Protein angrenzend an Aminosäurereste eines zweiten Proteins umfasst.
Antigene Formulierung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Protein in dem Genom eines humanen Papillomavirus, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 und HPV45, kodiert wird.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 4, wobei das Papillomavirus HPV16 ist.
Antigene Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, wobei carboxyterminale Aminosäurereste von dem L1-Protein deletiert sind.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 6, wobei 1 bis 34 carboxyterminale Aminosäurereste von dem L1-Protein deletiert sind.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 7, wobei 34 carboxyterminale Aminosäurereste von dem L1-Protein deletiert sind.
Antigene Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, wobei aminoterminale Aminosäurereste von dem L1-Protein deletiert sind.
Antigene Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, wobei interne Aminosäurereste aus dem L1-Protein deletiert sind.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 10, wobei die Aminosäurereste, die aus dem L1-Protein deletiert wurden, ein Kernlokalisierungssignal umfassen.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Aminosäurereste des zweiten Proteins von einem HPV-Protein abgeleitet sind.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 12, wobei das HPV-Protein ein frühes HPV-Protein ist.
Antigene Formulierung gemäß Anspruch 12, wobei das frühe HPV-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E1, E2, E3, E4, E5, E6 und E7.
Verwendung der Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer HPV-Infektion und von damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen.
Verwendung der Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhütung einer HPV-Infektion und von damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen.