DE69835813T2

DE69835813T2 - Verfahren zur kultivierung von zellen und zur vermehrung von viren

Info

Publication number: DE69835813T2
Application number: DE69835813T
Authority: DE
Inventors: G. Russell New Brunswick CONDON; V. Nancy Union CONNELLY; Andreas Freehold FREI; Edward Point Pleasant GLOWACKI; Vijay Lafayette YABANNAVAR; Serge Edison BATONDOLO
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: IL131014A0; EP0981601B1; ATE338814T1; CA2278808C; CA2278808A1; JP2008067720A; EP0981601A1; WO1998033886A1; DE69835813D1; EP1731598A1; IL181695A0; DK0981601T3; ES2273404T3; JP2001509675A; AU6028898A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für eine Vielzahl von Verwendungszwecken in der Biotechnologie stehen viele etablierte Zellinien zur Verfügung. Einige Zellinien können als Einzelzell-Suspension kultiviert werden, während andere Zellinien ohne einen Träger nicht gut wachsen. Das Wachstum einer Zellinie, die eine Träger benötigt, wird häufig durch die Oberfläche beschränkt, die den Zellen für ein Wachstum auf ihr zur Verfügung steht, da viele Zellinien auf der Oberfläche nur eine Schicht aus Einzelzellen bilden. Zusätzlich können einige Zellinien dazu neigen, in Abwesenheit eins Trägers in Klumpen oder als Aggregate zu wachsen, was ein unerwünschtes Ergebnis darstellt, wenn sie als Einzelzell-Suspension benötigt werden, besonders aber, wenn die Zellen mit einem Virus zu infizieren oder mit einem rekombinanten Vektor zu transformieren sind, da das Virus oder der Vektor keinen Zugang zu den Zellen innerhalb des Klumpen oder Aggregats erhalten können. Daher können schwerwiegende Probleme beim Heraufsetzen des Maßstabs der Kultivierung einer Zellinie auftreten, insbesondere hinsichtlich des Bereitstellens von ausreichend Oberfläche, auf dem die Zellen wachsen können, und/oder der Vermeidung eines Verklumpens der Zellen.
Microcarrier-Technologie ist verwendet worden, um Zellen in Kultur zu kultivieren. Zum Beispiel haben Forestell et al. (Biotech. Bioeng. 40:1039–1044 (1992)) eine verlängert fortlaufende Subkultur von humanen diploiden Fibroblasten auf Microcarriern unter Verwendung eines Mediumzusatzes offenbart, das den Bedarf der kultivierten Zellen an Serum verringert. Weiterhin haben Ohlson et al. (Cytotechnology 14:67–80 (1994)) den Bead-zu-Bead-Transfer von Zellen aus Eierstöcken des Chi nesischen Hamsters unter Verwendung von makroporösen Gelatine-Microcarriern offenbart. Hu et al. (Biotech. Bioeng. 27:1466–1476 (1985)) haben schließlich die fortlaufende Vermehrung von Säugetierzellen auf Microcarriern unter Verwendung einer Selektions-pH-Trypsinierungstechnik offenbart. In Develop. Biol. Standard., Band 55, 1984, S. 67–75, wird die Trennung von Zellen von Microcarriern mittels der Verwendung eines Nylonsiebs offenbart.
Angesichts der oben genannten Probleme besteht jedoch ein Bedarf nach Verbesserungen bei den Kultivierungsverfahren von Zelllinien, bei Verfahren zum Produzieren von Viren für klinische Verwendungen und bei Verfahren zum Heraufsetzen des Maßstabs der Produktion von Viren für großtechnischere Vermarktung besonders von rekombinanten Viren für die Gentherapie. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und andere.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Trennung von Zellen von Microcarriern, auf denen sie kultiviert worden sind, von denen sie jedoch abgelöst worden sind, umfassend das Einbringen einer wässrigen Suspension aus Zellen und Microcarriern durch einen Zulauf in eine Trennvorrichtung, wobei die Trennvorrichtung

(a) einen Zulauf,
(b) eine Säule,
(c) einen Auslaß für die Entnahme von Zellen und der wässrigen Lösung, und
(d) ein Maschensieb umfaßt,

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren für die Trennung von Zellen von Microcarriern, auf denen die Zellen kultiviert worden sind, durch Verwenden eines Systems, das

(a) einen Bioreaktor, in dem die Zellen auf den Microcarriern kultiviert worden sind;
(b) einen Durchlauf von dem Bioreaktor zu einer Trennvorrichtung;
(c) eine Trennvorrichtung, die (i) einen Zulauf, (ii) eine Säule, (iii) einen Auslaß für die Entnahme von Zellen und der wäßrigen Lösung, und (iv) ein Maschensieb umfaßt, wobei die Microcarrier in der Trennvorrichtung durch einen Aufwärtsfluß in Suspension gehalten werden und durch ein Maschensieb in der Trennvorrichtung zurückgehalten werden, und wobei die Zellen und die wässrige Lösung durch den Auslaß entnommen werden, und
(d) eine Pumpe umfaßt, wobei die Pumpe den Fluß der wäßrigen Lösung von dem Bioreaktor zu dem Auslaß steuert.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Seitenansicht eines erfindungsgemäßen Systems, das zum Trennen von Medien, die freie Zellen und Virus enthalten, von Microcarriern verwendet wird.
2 ist eine auseinandergezogene Darstellung einer erfindungsgemäßen Trennvorrichtung, die zum Trennen von Medien, die freie Zellen und Virus enthalten, von Microcarriern verwendet wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der großtechnischen Kultivierung von Zellen für die Vermehrung von Viren, insbesondere rekombinanten Viren, für die Gentherapie, Impfstoffherstellung usw. Insbesondere befaßt sich die vorliegende Erfindung mit drei Aspekten der großtechnischen Kultivierung der Verwendung des Bead-zu-Bead-Transfers von adhärenten Zellen, um nachfolgendem die Anzahl der Zellen in Kultur heraufzusetzen, einschließlich der Verwendung von Trypsin zum Lösen der Zellen von Microcarriern in Bioreaktoren, der Verwendung von Wirbelschicht („fluidized bed")-ähnlicher Trennung von Zellen von dem Kügelchen während der Ernte, und der Verwendung von Mikrofiltration zum Aufbrechen der Zellen, um so Viruspartikel freizusetzen.
Der Begriff "Virus", wie er hier verwendet wird, schließt nicht nur natürlich vorkommende Viren ein, sondern auch rekombinante Viren, attenuierte Viren, Impfstoffstämme und so weiter. Rekombinante Viren schließen virale Vektoren ein, die ein heterologes Gen umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt. In einigen Ausführungsformen wird/werden (eine) Helferfunktion(en) für die Replikation der Viren durch die Wirtszelle, ein Helfervirus oder ein Helferplasmid bereitgestellt. Charakteristische Vektoren schließen solche ein, die Säugetierzellen, insbesondere menschliche Zellen, infizieren werden, und aus Viren, wie beispielsweise Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Herpesviren und Avipox-Viren, abgeleitet werden können, sind aber nicht auf solche beschränkt. Adenovirale Vektoren werden bevorzugt. Typ 2- und Typ5-adenovirale Vektoren werden mehr bevorzugt, wobei Typ 5-adenovirale Vektoren besonders bevorzugt werden. ACN53 ist ein rekombinantes Adenovirus Typ 5, welches das humane Wildtyp p53-Tumor-Suppressorprotein kodiert, und das z.B. in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO 95/11984 beschrieben ist.
Wie er hier verwendet wird, gibt der Begriff "konfluent" an, daß die Zellen eine kohärente einzellige Schicht auf der Oberfläche (z.B. des Microcarriers) gebildet haben, so daß praktisch die gesamte verfügbare Oberfläche genutzt wird. Beispielsweise wurde "konfluent" als der Zustand definiert (R.I. Freshney, Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. New York, NY, 1994, S. 363), bei dem "alle Zellen in ihrer Peripherie überall mit anderen Zellen in Kontakt stehen und kein verfügbares Substrat unbedeckt geblieben ist". Für Zwecke der vorliegenden Erfindung gibt der Begriff "im Wesentlichen konfluent" an, daß die Zellen auf der Oberfläche in allgemeinem Kontakt stehen, obwohl Lücken verbleiben können, so daß über ungefähr 70 %, bevorzugt über ungefähr 90 % der verfügbaren Oberfläche genutzt wird. Dabei steht "verfügbare Oberfläche" für ausreichend Oberfläche, um eine Zelle aufzunehmen. Daher können schmale Lücken zwischen benachbarten Zellen, die eine zusätzliche Zelle nicht aufnehmen können, keine "verfügbare Oberfläche" bilden.
Die Kultivierungsschritte in den erfindungsgemäßen Verfahren können in einem, in dem Fachgebiet bekannten Bioreaktor oder Fermenter von ungefähr 1 bis 5000 l durchgeführt werden, der mit geeigneten Zuläufen zum Einführen der Zellen und Microcarrier, von sterilem Sauerstoff, verschiedenen Medien zur Kultivierung etc.; Auslässen zum Entnehmen von Zellen, Microcarriern und Medien; und Mitteln zum Bewegen des Kulturmediums in dem Bioreaktor, bevorzugt einem Spin-Filter (der auch als ein Auslaß für Medien dienen kann), ausgerüstet ist. Beispielhafte Medien sind in der Literatur offenbart, siehe beispielsweise Freshney, Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. New York, NY, 1994, S. 82–100. Der Bioreaktor wird auch Mittel zum Kontrollieren der Temperatur und bevorzugt Mittel zum elektronischen Überwachen und Steuern der Funktionen des Bioreaktors aufweisen.
Beispielhafte Microcarrier, auf denen die Zellen wachsen können, sind im Fachgebiet bekannt und sind bevorzugt besonders an die Zwecke der Zellkultivierung angepasst. Es wird allgemein Bezug genommen auf das von Pharmacia veröffentlichte Handbuch „Microcarrier Cell Culture – Principles & Methods". Es sollte jedoch beachtet werden, daß einige der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellinien nicht stark an die Oberflächen der Microcarrier adhärieren dürften, und es im Vermögen des Fachmanns liegt, eine geeignete Kombination aus Zellinie, Virus (soweit anwendbar), Microcarrier und Kulturbe dingungen zu bestimmen. Der Microcarrier hat bevorzugt eine Partikelgröße im Bereich von ungefähr 100 bis 250 μm, bevorzugter im Bereich von ungefähr 130 bis 220 μm, und sollte aus einem nicht-toxischen Material zusammengesetzt sein. Der Mittelwert der Probengröße fällt bevorzugt in diese Bereiche, so daß diese Größenbereiche bevorzugt solche von mindestens der mittleren 90 % der Microcarrierprobe sind. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Microcarrier aus im Wesentlichen kugelförmigen Mikrokügelchen mit einer mittleren Partikelgröße von ungefähr 150 bis 200 μm, bevorzugt 170 bis 180 μm. Die Mikrocarrieroberfläche kann behandelt sein, um die Zelladhäsion zu verändern, insbesondere um die Zelladhäsion zu erhöhen, aber dennoch Vermehrung und Ausbreitung zu erlauben; die Microcarrier können daher beschichtet sein, z.B. mit Kollagen. Bevorzugt sind Microcarrier etwas dichter als das Kulturmedium, so daß sie leichtes Rühren in Suspension hält, während einfache Mittel, wie beispielsweise Sedimentation oder Zentrifugation, ihre Trennung ermöglicht. Eine Dichte von 1,03 bis 1,045 g/ml bei Äquilibrierung der Microcarrier mit einer Standardlösung wie beispielsweise 0,9 % NaCl (oder mit dem Kulturmedium) ist geeignet. Die Erfinder haben herausgefunden, daß die Cytodex 3-Microcarrier von Pharmacia diese Anforderungen im Allgemeinen erfüllen, obwohl die besonderen Anforderungen, die für bestimmte Zellinien oder Viren gelten, die Auswahl eines bestimmten Cytodex-Microcarriers erforderlich machen können.
Die Zellen können die einer jeden geeigneten Wirtszellinie sein, die in der Lage ist, sich selbst zu replizieren und insbesondere die Replikation des Virus von Interesse unterstützt. Eine besonders bevorzugte Zellinie ist die humane embryonale Nierenzellinie 293 (ATCC-Katalognummer CRL 1573). Diese Zellen adhärieren nicht stark an alle Microcarrier und werden bevorzugt mit Cytodex 3-Microcarriern von Pharmacia verwendet, die für eine bessere Zelladhäsion Kollagen-beschichtet sind. Cytodex 3-Microcarrier haben eine mittlere Partikelgröße von ungefähr 175 μm, wobei die mittleren 90 % der Probe eine Größe von ungefähr 140 bis 210 μm aufweisen, die Dichte solcher Microcarrier beträgt 1,04 g/ml, wenn sie mit 0,9 % NaCl equilibriert werden. Die Zellen werden in einem ersten Schritt bevorzugt auf einem derartigen Microcarrier kultiviert und dann von ihm gelöst und für einen Herstellungsschritt auf zusätzliche Microcarrier überführt.
Das Rühren kann herkömmlicherweise nicht nur durch eine Schaufel am Grund des Bioreaktors durchgeführt werden, sondern auch durch einen rotierenden Spin-Filter, der sich bevorzugterweise von der Spitze des Bioreaktors abwärts in den Großteil des Mediums erstreckt. Die Zellen und Microcarrier können durch Rotieren des Spin-Filters in der Kultur in Suspension gehalten werden, wobei der Spin-Filter auch mit feinen Ausflußöffnungen ausgerüstet sein kann, welche die Entnahme von Medium ohne Verlust an Zellen ermöglichen. Das Medium kann gleichzeitig oder abwechselnd entnommen und ersetzt werden, wobei es häufig günstig ist, einen wesentlichen Teil (z.B. bis zu ungefähr 50 %) des Mediums zu entnehmen und es dann mit dem geeigneten Ersatzmedium aufzufüllen, während weiterhin Medium, z.B. durch den Spin-Filter, entnommen wird.
Üblicherweise werden die Zellen ausgehend von einem Röhrchen mit dem Zellbankstamm über verschiedene Größen von T-Flaschen und bevorzugt letztendlich in Bioreaktoren hochge zogen. Ein bevorzugtes Gefäß ist die CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflasche (CF, NUNC), eine speziell entworfene große Flasche, die praktischerweise verschiedene innere Abteilungen aufweist, die eine große Oberfläche bereitstellen, an der die Zellen adhärieren oder anhaften können und auf der sie wachsen können. Nach Kultur bis zur wesentlichen Konfluenz können die Zellen durch Trypsinierung gelöst und isoliert werden. Die Trypsinierung wird für einen kurzen Zeitraum (bevorzugt weniger als 5 Minuten, bevorzugter ungefähr 3 Minuten) durchgeführt, und das Trypsin dann durch die schnelle Zugabe von Serum in das Wachstumsmedium neutralisiert. Falls gewünscht, können die Zellen zentrifugiert und das Trypsin-enthaltende Medium entfernt werden, bevor das Serum zugegeben wird. Die entstehende Zellsuspension wird dann üblicherweise in einen Anzucht-Produktionsbioreaktor (üblicherweise mit 20 bis 30 l Volumen) zur weiteren Kultivierung gegeben, und, in einigen Ausführungsformen, in einen größeren Produktionsbioreaktor (üblicherweise mit 150 bis 180 l Volumen).
Das Verhältnis des Volumens des zweiten (größeren) Bioreaktors zu dem Anzucht-Bioreaktor hängt von dem Grad ab, bis zu dem die Zellinie in dem ersten Bioreaktor vermehrt wird, liegt aber üblicherweise im Bereich von 5 : 1 bis 10 : 1, z.B. im Bereich von (6–8) : 1.
Die Zellen werden durch ein Trypsinierungsverfahren von den Microcarriern gelöst, das in dem Kultivierungsgefäß, vorzugsweise einem Bioreaktor, durchgeführt wird, während die Microcarrier suspendiert sind. Der Spin-Filter wird verwendet, um Mediumwechsel durchzuführen, um die Serum- und Calciumgehalte in dem Medium zu reduzieren, was die Wirksamkeit der Trypsi nierung erhöht, während in dem Bioreaktor ein konstantes Volumen beibehalten wird. Absetzschritte, die Schaden an den Zellen auf den Microcarriern hervorrufen können, werden vermieden. Die entstehende Zell/Microcarrier-Suspension kann dann in einen Produktionsbioreaktor überführt werden, der vorher mit Kulturmedium und Microcarriern bestückt wurde.
Nach dem Transfer der Zell/Microcarrier-Suspension aus dem Anzucht-Bioreaktor wird der Produktionsbioreaktor (z.B. ungefähr 200 l) zum Beispiel bei ungefähr 37 °C und ungefähr pH 7,3 betrieben. Eine Perfusion frischen Mediums während der Zellvermehrung kann dann durchgeführt werden, um die Laktatkonzentration unter ungefähr 1,0 g/l zu halten. Den Zellen wird üblicherweise ermöglicht, auf für ungefähr 4 bis 7 Tage den Microcarriern zu wachsen, bis mehr als 50 % der Microcarrier vollständig konfluent sind. Bevorzugt wird dann ein Virusinfektionsprozess eingeleitet. Ein Röhrchen mit 40 bis 50 ml viralen Inokulum, das üblicherweise ungefähr 1,0 × 10¹³ virale Gesamtpartikel enthält, wird verwendet, um den Produktionsbioreaktor zu infizieren. Dem Virus wird ermöglicht, sich in dem Produktionsbioreaktor für 3 bis 5 Tage bis zum Erreichen des Zeitpunkts des maximalen Virustiters zu replizieren. Üblicherweise werden sich dann mehr als 90 % der Zellen wegen der zellschädigenden Wirkungen des Virus von den Microcarriern gelöst haben. Die endgültige Ausbeute an rekombinantem Adenovirus aus dem Produktionsbioreaktor beträgt üblicherweise ungefähr 8,5 × 10⁹ virale Partikel/ml. Dies ergibt eine Gesamtausbeute an viralen Partikeln von ungefähr 1,4 × 10¹⁵ aus jeder Charge von 160 l.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird der Produktionsbioreaktor mit Zellen inokuliert, die durch Trypsinisierung gewonnen wurden und dann direkt verwendet werden, um den Produktionsbioreaktor anzuimpfen. Üblicherweise werden 8 bis 12 CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen verwendet, um die Gesamt-Anzuchtdichte des Inokulums für den Bioreaktor von 0,6 bis 1 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten. Die übliche Virusausbeute in diesem Verfahren reicht von ungefähr 1,7 bis 2,6 × 10¹⁰ viralen Partikeln/ml. Daher stellt dieses besondere Verfahren eine Gesamtviruspartikelzahl von ungefähr 3 bis 4 × 10¹⁵ aus jeder Charge von 160 l zur Verfügung.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Wirbelschicht-ähnliches Verfahren verwendet, um die Zellen aus dem Bioreaktor zu ernten. Üblicherweise wird der Bioreaktor geerntet, nachdem sich ungefähr 90 % der Zellen von den Microcarriern gelöst haben. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, scheint die zellschädigende Wirkung der Virusvermehrung in den Wirtszellen für die Zellablösung verantwortlich zu sein. In anderen Ausführungsformen können nicht-infizierte Zellen durch das erfindungsgemäße Trypsinierungsverfahren von den Microcarriern gelöst werden. Nachdem der Bioreaktor geerntet wurde, enthält die Brühe („broth") Zellen, Microcarrier und Medium. Das Virus liegt in den Zellen und in dem Medium vor. Daher wird bevorzugt dieses gesamte Material für die Prozessierung gesammelt. Die spezifische Schwere (Dichte) der Microcarrier ist ähnlich der Dichte der Zellen. Bevorzugt werden die Microcarrier frei suspendiert gehalten, während die Zellen von den Kügelchen getrennt werden, da Prozessierungsschritte, die eine Sedimentierung einsetzen, ein Absetzen der Zellen mit den Microcarriern verursachen, was zu Verlusten bei der Ausbeute führt.
Eine bevorzugte Ausführungsform einer Trennvorrichtung ist in den 1 und 2 dargestellt. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird die Trennvorrichtung als Teil eines Systems bereitgestellt. Ein beispielhaftes System ist in 2 dargestellt. Das System umfasst daher einen Bioreaktor 100, in dem die Zellen auf Microcarriern kultiviert werden, einen Durchlauf 102 von dem Bioreaktor zu der Trennvorrichtung 104, die Trennvorrichtung umfaßt eine Säule 106; ein Auslaß 108 für die Entnahme von Zellen und der wässrigen Lösung; und ein Maschensieb 110. Die Microcarrier werden durch einen Aufwärtsfluß in der Trennvorrichtung in Suspension gehalten und durch ein Maschensieb in der Trennvorrichtung zurückgehalten, und die Zellen und die wässrige Lösung werden durch den Auslaß entnommen. Ebenfalls in dem System wird eine Pumpe 112 bereitgestellt, wobei die Pumpe den Fluß der wäßrigen von dem Bioreaktor zu dem Auslaß steuert. In einigen Ausführungsformen können ein Mikrofilter 114 und ein Ultrafilter 116 als Komponenten des Systems bereitgestellt werden.
In der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt die Trennvorrichtung üblicherweise eine Säule 106, wie beispielsweise eine Chromatographiesäule, die einen Zulauf 114 aufweist, durch den eine wässrige Suspension von Zellen und Microcarriern aus dem Bioreaktor 100 in die Trennvorrichtung 104 eingebracht wird, und mindestens einen Auslaß 108 für die Entnahme von Zellen und der wäßrigen Lösung, und ein Maschensieb 110. Die Microcarrier werden in der Säule durch einen Aufwärtsfluß in der Trennvorrichtung in Suspension gehalten und durch ein Maschensieb in der Trennvorrichtung zurückgehalten, und wobei die Zellen und die wäßrige Lösung durch den Auslaß entnommen werden. Die Flußrate in der Trennvorrichtung beträgt ungefähr 1 bis ungefähr 3 cm/min. Üblicherweise wird ein Aufwärtsfluß durch die Säule durch Pumpen einer wäßrigen Lösung, wie beispielsweise der Zellsuspension oder eines Puffers, durch den Zulauf erzeugt, wobei der Zulauf am Boden der Einrichtung angeordnet ist und der Auslaß an der Spitze der Einrichtung angeordnet ist.
2 ist eine erweiterte schematische Ansicht einer Trennvorrichtung 200, die eine Auslaßanordnung 210, eine Maschensiebanordnung 212, einen Zulauf 214 und eine Säule 216, die einen oberen Abschnitt 218 und einen unteren Abschnitt 220 aufweist, genauer darstellt. Der untere Abschnitt umfaßt üblicherweise ungefähr 20 bis 50 %, bevorzugter ungefähr 30 % des Säulenvolumens und enthält den Zulauf. Der untere Abschnitt ist bevorzugt konisch mit einem bevorzugten Winkel von ungefähr 15 bis 45°.
Die Fermentationsbrühe aus dem Bioreaktor wird daher in die Basis der Säule gepumpt. Die Flußrate wird eingestellt, um einen Aufwärtsfluß bereitzustellen, der ausreicht, um die Zellen und viralen Partikel in dem Medium suspendiert zu halten, während er das Zurückhalten der Microcarrier innerhalb der Trennvorrichtung ermöglicht. Bevorzugt beträgt die Flußrate ungefähr 1–2 cm/min, da die Zellen eine spezifische Schwere ähnlich derer der Microcarrier aufweisen. Die geklärte Brühe, die Zellen und Virus enthält, passiert durch das Maschensieb am oberen Ende der Wirbelschicht-ähnlichen Säule und wird für die Mikrofiltration gesammelt.
Für eine Anordnung im 200 l-Maßstab ist der untere Abschnitt der Säule bevorzugt konisch. Der Konus ermöglicht eine graduelle Verringerung der linearen Beschleunigung der Fermentationsbrühe, die in den Konus einfließt. Die Flüssigkeitsbeschleunigung der Einlaßlinie wird verringert, um einen verringerten linearen Fluß in einer einheitlichen Verteilung über den Querschnitt des oberen Endes des Konus zu erhalten. Die Wände des Konus sind in einem Winkel angeordnet, der es den Kügelchen, die sich an den Wänden absetzen, ermöglicht, sich abwärts zum Zulauf zu bewegen. Auf diese Weise werden diese Kügelchen resuspendiert, um ein Einfangen der Zellen zwischen den abgesetzten Kügelchen zu vermeiden. Der Winkel der konischen Wände beträgt bevorzugt ungefähr 30°. Winkel von weniger als 15° stellen einen außergewöhnlich langen Konus zur Verfügung und Winkel größer als ungefähr 45° können den Einlaßfluß nicht wirksam verteilen. Der obere Bereich der Säule wirkt als eine Zone, in der sich die Kügelchen mit einer Rate absetzen, die größer als die lineare Flußrate des Fermentationsmediums ist. Dieser Abschnitt der Säule ist von zylindrischer Form. Innerhalb dieser Zone wird eine Grenze gebildet, so daß sich die Microcarrier in dem unteren Bereich der Säule anreichern. Eine Endplattenanordnung 222 (2) der Säule wirkt als ein Sammelpunkt für das geklärte Fermentationsmedium, das Zellen und Virus enthält. Dieses besteht aus einer Endplatte 224, die mit einer Maschenanordnung ausgerüstet ist. Dieses Sieb, bevorzugt mit ungefähr 50er-120er-Maschen, bevorzugter mit ungefähr 100er-Maschen, wirkt als ein zweiter Punkt zur Entnahme der Microcarrier.
Die oben beschriebene Ausführungsform ist die in den hierin enthaltenen Beispielen bevorzugte Ausführungsform. Die Säulenabmessungen und das Maschensieb können auf Grundlage des Lösungsvolumen, das zu prozessieren ist, der Konzentration der Kügelchen, der bestimmten verwendeten Microcarrier und der Medienzusammensetzung (z.B. der spezifischen Schwere des Mediums) variiert werden. Eine bevorzugte Säule besteht aus einem Basiskonus, der aus rostfreiem Stahl maßgeschneidert gefertigt wurde, um an zwei KS370-"section tubes" von Pharmacia befestigt zu werden, die mit einer KS370-Endanordnung ausgerüstet sind, in der das Sieb des Verkäufers gegen ein Sieb aus rostfreiem Stahl (ss) (bevorzugt ungefähr 50er bis 120er-Maschen, bevorzugter ungefähr 100er-Maschen) ausgetauscht wurde.
Nachdem Zellen gesammelt wurden, werden sie bevorzugt lysiert, um weitere Viruspartikel freizusetzen. Homogenisierung oder Gefrier-Tau-Schritte können verwendet werden, um die Viruspartikel freizusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Mikrofiltration angewendet, um gleichzeitig Virus-enthaltende Zellen zu lysieren und die Brühe von Zelltrümmern zu klären, die ansonsten die virale Aufreinigung stören würden. Beispielsweise kann die Mikrofiltration unter Verwendung eines Prostak (Millipore)-Systems mit einer hydrophilen oder hydrophoben Membran von 0,65 μm und einer Schergeschwindigkeit von 7000 l/sek durchgeführt werden. Die Schergeschwindigkeit wird durch den Fluß des zurückgehaltenen Materials ("retentate") durch die tangentialen Flußkanäle der Membran erzeugt. Der Querstrom ("cross-flow") wird daher nicht nur verwendet, um ein Verkrusten ("fouling") der Membran zu verhindern, sondern kann auch verwendet werden, um ausreichend Scherkräfte zum Lysieren der Zellen zu erzeugen. Die Porengrö ße des Filters sollte ausreichend sein, um ein Passieren des Virus zu ermöglichen, während Zelltrümmer zurückgehalten werden. Daher reicht die Porengröße üblicherweise von ungefähr 0,2–0,65 μm. Die Schergeschwindigkeit reicht üblicherweise von ungefähr 2000 bis 10 000 l/sek, bevorzugter beträgt sie ungefähr 7000 l/sek.
Da virale Partikel mit zellulären Nukleinsäuren komplexiert werden können, wird üblicherweise BENZONASE^TM-Endonuklease (American International Chemical, Inc.) in die geklärte Brühe zugegeben, um zelluläre Nukleinsäuren zu verdauen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird zum Konzentrieren des Virus eine Ultrafiltration unter Verwendung eines Pellicon-Systems (Millipore) mit einer regenerierten Pellicon I-Cellulosemembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von nominal 1 Million durchgeführt. Der Ultrafiltrationsschritt erfüllt zwei Funktionen: das Virus wird für die Aufreinigung auf konzentriert und eine Diafiltration wird durchgeführt, um den Puffer auszutauschen, so daß die Virussuspension direkt auf eine DEAE-Säule gegeben werden kann. Das Eluat aus dem Mikrofilter enthält das freigesetzte Virus und wird bevorzugt aufkonzentriert, z.B. durch Ultrafiltration.
Zwischen jedem Kultivierungsschritt können die Zellen gelockert und durch Trypsinierung, z.B. durch Behandlung mit Trypsin, von dem Microcarrier entfernt werden. In der vorliegenden Erfindung wird das in der Kultivierung verwendete Serum bevorzugt entfernt, da das Serumprotein das Trypsin inhibiert, das Entfernen des Serums daher die Verwendung einer geringeren Menge Trypsins erlaubt. Dies ist vorteilhaft, da die Zugabe einer größeren Menge örtlich begrenzte hohe Konzentrationen von Trypsin hervorrufen kann, welche die Zellen beschädigen können. Hinsichtlich des nächsten Schrittes werden Ca⁺⁺-Ionen entfernt, da die Entfernung dieser Ionen von den Zellen dazu führt, die Zellen zu lockern und es ermöglicht, weniger Trypsin zu verwenden. Daher kann das Lockern und das Abstreifen von Zellen, insbesondere von der humanen embryonalen Nierenzellinie 293 in geeigneter Weise die folgenden Schritte beinhalten:

(i) schnelles Waschen der Zellen zum Entfernen von Serum und anderen löslichen Materialien;
(ii) Entfernen von Ca⁺⁺ von den gewaschenen Zellen durch Zugabe eines komplexbildenden Mittels;
(iii) schnelles Entfernen des komplexbildenden Mittels;
(iv) schnelles Zugeben von Trypsin;
(v) Trypsinieren der Zellen über einen kurzen Zeitraum (der bevorzugt von ungefähr 3 Minuten bis ungefähr 15 Minuten reicht); und
(vi) schnelles Neutralisieren des Trypsins durch Zugeben von Protein.

Im obigen Schritt (i) steht der Ausdruck "schnelles Waschen" für die Perfusion eines Austauschvolumens an Medium mit einer Rate von ungefähr 1 bis 3 l/min, bevorzugter von ungefähr 2 l/min bei konstantem Bioreaktorvolumen. Der Ausdruck "schnelles Entfernen des komplexbildenden Mittels" in Schritt (iii) oben steht für die Perfusion von ein und einem halben Austauschvolumen an Medium mit einer Rate von ungefähr 1 bis 3 l/min, bevorzugter ungefähr von 2 l/min bei konstanten Bioreaktorvolumen. Der Ausdruck "schnelles Zugeben von Trypsin" in Schritt (iv) oben steht für das Zugeben des geeigneten Vo lumens an Trypsinlösung (üblicherweise eine 2,5 %ige Lösung) mit einer Rate von ungefähr 1 bis 3 l/min, bevorzugter von ungefähr 2 l/min. Der Ausdruck "schnelles Neutralisieren des Trypsins durch Zugeben von Serum" in Schritt (vi) oben steht für das Zugeben des geeigneten Volumens an Serum mit einer Rate von ungefähr 1 bis 3 l/min, bevorzugter von ungefähr 2 l/min.
Wenn das Serum in Schritt (i) nicht entfernt wird, dann kann die Zugabe der benötigten Mengen an Trypsin zu örtlich begrenzten hohen Konzentrationen von Trypsin führen, welche die Zellen schädigen oder sogar abtöten können, anstatt sie einfach zu lösen. Das Entfernen des Serums in Schritt (i) und des Ca⁺⁺ in Schritt (ii) verringert die Menge des in den Schritten (iv) und (v) benötigten Trypsins. Um zu vermeiden, dass die Zellen tatsächlich geschädigt oder sogar abgetötet werden, sollte die Behandlung mit dem komplexbildenden Mittel und mit dem Trypsin bevorzugt kurz gehalten werden (d.h. lang genug, um die Zellen von den Microcarriern zu lösen, aber bevorzugter nicht länger). Beispiele von bevorzugten komplexbildenden Mitteln umfassen EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und EGTA (Ethylen-bis(oxyethylen-nitrilo)tetraessigsäure).
Das Serum wird durch einen Mediumwechsel entfernt, zum Beispiel kann das Medium durch einen Spin-Filter abgepumpt werden. Serum-freies Waschmedium wird zugegeben, um das zu ersetzen, was abgepumpt wurde, und die Mischung wird gerührt. Alternativ kann die Zugabe von Serum-freien Waschmedium kontinuierlich durch ein Entfernen des Mediums durch den Spin-Filter erfolgen. Der Vorgang wird wiederholt, bis die Serumkonzentration auf ein ausreichend niedriges Niveau, z.B. weniger als ungefähr 1,0 bis 0,2 %, bevorzugt ungefähr 0,2 % verringert worden ist. Das komplexbildende Mittel, bevorzugt EDTA, wird in Serumfreiem komplexbildenden Medium zugegeben, die Mischung wird erneut gerührt und das komplexbildende Medium abgepumpt. Alternativ kann die Zugabe des komplexbildenden Mittels in Serum freiem Medium kontinuierlich durch das Entfernen des Mediums durch den Spin-Filter erfolgen.
Das Trypsin wird bevorzugt in Schritt (v) verwendet, um im Bioreaktor eine Konzentration von ungefähr 0,5 bis 0,1 % bereitzustellen, und ihm wird ermöglicht für 5 bis 10 Minuten auf die Zellen einzuwirken, zum Beispiel bevorzugt mit einer Trypsinkonzentration von ungefähr 0,065 % für ungefähr 8 Minuten. Protein, üblicherweise in der Form von bovinem Kälberserum, wird dem Bioreaktor bevorzugt in einer Endkonzentration von ungefähr 10 bis 20 % zugegeben, um das Trypsin zu inhibieren.
Daher bereitet die Zugabe von Serum in Schritt (vi) die Zellen nicht nur für weitere Kultivierung vor, sondern neutralisiert auch verbliebenes Trypsin. Die gesamte Abfolge der Schritte (i) bis (vi) kann in situ in dem Bioreaktor stattfinden, in einigen Ausführungsformen kann die Suspension von Microcarriern und Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt werden, indem für den nächsten Schritt der Kultivierung weitere Microcarrier zugegeben werden. Den Zellen wird ermöglicht, sich an die Microcarrier anzulagern und werden dann weiter kultiviert. Wenn sie erneut im Wesentlichen konfluent vorliegen (zum Beispiel nach 3 bis 4 Tagen Kultivierung bei ungefähr 37 °C) kann mit ihnen die nächste Stufe durchlaufen werden, die zum Beispiel ein Ernten, Lockern für weiteres Her aufsetzen des Kulturmaßstabs („upstaging") oder Animpfen mit Virus sein kann. Wenn die Zellen bloß für die Ernte kultiviert worden sind, können sie in diesem Stadium geerntet werden, z.B. durch eine Wiederholung der obigen Schritte (i) bis (vi). Wenn sie für weiteres Heraufsetzen des Kulturmaßstabs („upstaging") benötigt werden, können die obigen Schritte (i) bis (vi) wiederholt werden. Wenn sie für die Vermehrung eines Virus kultiviert wurden, kann das Virus nun in das Medium geimpft werden.
Die hier beschriebenen Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Die gewählten Vektoren und Wirte und anderen Materialien, die Konzentration der Reagenzien, die Temperaturen und die Werte der anderen Variablen veranschaulichen die Anwendung der vorliegenden Erfindung.
EXPERIMENTELLE BEISPIELE
I. ÜBERBLICK
A. Zubereitung des Zellinokulums
Jede virale Fermentationscharge wird ausgehend von einer Zelllinie gestartet, die von einem Röhrchen 293-Zellen der "Manufacturers Working Cell Bank" (MWCB) vermehrt wird. Die Bioreaktoren werden mit 293-Zellen (ATCC-Katalognummer CRL 1573) angeimpft, die durch Vermehren in T-Flaschen und CELL FACTORY^TM durch Verwenden des Wachstumsmediums (Medium 1), wie in Tabelle 1 unten dargestellt, erhalten werden. Jeder Transfer stellt eine Passage dar. Üblicherweise werden Passa gen mit den Nummern 4 bis 30 für die Animpfung eines Anzucht-Bioreaktors eingesetzt. TABELLE 1: ZUSAMMENSETZUNG DER MEDIEN

¹ DMEM-Pulver (erhältlich von American Biorganics, Katalog-Nr. D2807): bevorzugt zur Bereitstellung von 4,5 g/l Glukose und 0,584 g/l L-Glutamin verwendet; kein Natriumbicarbonat und kein HEPES.
² Ca⁺⁺-freies DMEM-Pulver (erhältlich von American Biorganics, Katalog-Nr. D2807403): bevorzugt zur Bereitstellung von 4,5 g/l Glukose und 0,584 g/l L-Glutamin verwendet; kein Natriumbicarbonat, kein Calciumchlorid und kein HEPES.
³ Bovines Kälberserum: erhältlich von Hyclone, Katalog-Nr. 2151.
⁴ EDTA-Stammlösung: 186,1 g/l EDTA und 20 g/l NaOH-Pellets.
⁵ Glutamin-Stammlösung: 29,22 g/l.

Um den Transfer von Zellen von Flasche zu Flasche während der Zellexpansion vorzubereiten, wird das verbrauchte Medium abgegossen und die Zellen in der Flasche dann mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Eine Trypsinlösung wird zu der einzelligen Schicht („monolayer") auf der Oberfläche der Flasche zugegeben und die Zellen dieser ausgesetzt, bis sie sich von der Oberfläche lösen. Die Trypsinwirkung wird dann durch Zugeben von Wachstumsmedium (Medium 1, Tabelle 1), das Serum enthält, weitestgehend neutralisiert; eine vollständige Neutralisierung ist nicht notwendig, da verbliebenes Trypsin eine niedrige Aktivität aufweisen wird. Die Zellen können durch Zentrifugation gewonnen und in frischem Wachstumsmedium (Medium 1) resuspendiert werden. Tabelle 2 zeigt die üblichen verwendeten Volumina. TABELLE 2: ÜBLICHE BEIM TRANSFER VON ZELLEN VERWENDETE VOLUMINA
B. ZUBEREITUNG DES VIRUSINOKULUMS
Virusinokuli können durch Infizieren von reifen CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen zubereitet werden. In diesem Verfahren werden zuerst 293-Zellen aus T-Flaschen in CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen vermehrt. Wenn die Kulturen in CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen reif sind (üblicherweise 80–90 % konfluent) werden sie mit einem Inokulum aus der "Manufacturer's Working Virus Bank" (MWVB) infiziert. Die infizierten CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen werden inkubiert, bis die 293-Zellen sich von der sie tragenden Oberfläche lösen. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und durch mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen aufgebrochen. Nach einer sich anschließenden Zentrifugation wird das Virus in den Überstand gewonnen und als Aliquots bei –20 °C oder niedriger gelagert. Dieses Material ist das "Virusinokulum", das verwendet wird, um Bioreaktoren zu infizieren. Wahlweise kann das Virusinokulum auch aus der Bioreaktorernte gewonnen werden, die Filter-sterilisiert wird (siehe "Ernte des Produktionsbioreaktors" unten).
C. Zubereitung und Betrieb des Anzucht-Bioreaktors
Bevorzugt wird ein Anzucht-Bioreaktor verwendet, um das 293-Zellinokulum für den Produktionsbioreaktor herzustellen. Der Anzucht-Bioreaktor ist Dampf-sterilisiert und wird mit einer Charge von Filter-sterilisiertem Wachstumsmedium (Medium 1, Tabelle 1, oben) für den Suspensionsvorgang freier Zellen geladen. Für das Microcarrierverfahren werden jedoch bevorzugt in diesem Stadium gequollene, sterile Microcarrier-Kügelchen (Cytodex 3 oder Äquivalente) zugegeben.
Der Anzucht-Bioreaktor wird mit den aus den CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen geernteten 293-Zellen angeimpft. Die Betriebsbedingungen werden wie in Tabelle 3 gezeigt eingestellt. Der pH und der gelöste Sauerstoff (DO) werden durch Einsprudeln von CO₂ bzw. Sauerstoff kontrolliert. Zusätzliches Wachstumsmedium kann dem Bioreaktor durch Perfusion zugegeben werden. Das Zellwachstum wird durch mikroskopische Untersuchung und durch Messen der Laktatbildung und des Glukoseverbrauchs überwacht. Üblicherweise ist der Anzucht-Bioreaktor zum Animp fen des Produktionsbioreaktors bereit, wenn in ihm die Zelldichte in der Suspensionskultur 1 × 10⁶ Zellen/ml erreicht. Jedoch sind für das Animpfen bei dem Microcarrierverfahren einige zusätzliche Schritte nötig. Das Serum und Calcium in dem Bioreaktormedium werden, wenn die Zellen auf den Microcarriern >50 % konfluent sind, durch Verwenden von in Tabelle 1 beschriebenen Medien abgewaschen. Trypsin wird dann schnell zugegeben und, wenn die Zellablösung übliche Niveaus erreicht, Serum zugegeben, um das Trypsin zu inaktivieren. Die Anzucht-Bioreaktorinhalte werden dann in den Produktionsbioreaktor überführt.
Wahlweise können 293-Zellen, die aus mehreren CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen geerntet wurden, direkt als Inokulum für einen Produktionsbioreaktor verwendet werden. Üblicherweise werden 8–12 solcher Kulturen geerntet und vereint, um ein Inokulum zu bilden. TABELLE 3: BETRIEBSBEDINGUNGEN FÜR DEN ANZUCHT-BIOREAKTOR
D. Vorbereitung und Betrieb des Produktionsbioreaktors
Das virale Produktionsverfahren wird anhand eines 200 l-Produktionsbioreaktors unter Verwendung von Wachstumsmedium (Medium 1, Tabelle 1) veranschaulicht. In dem Suspensionskulturverfahren wird Filter-sterilisiertes Medium in den Bioreaktor dosiert („batched"). In dem Microcarrier-Prozess werden die Microcarrier jedoch entweder in situ in dem Produktionsbioreaktor sterilisiert oder extern autoklaviert und dazugegeben. Diese Microcarrier werden dann vor der Animpfung mit 293-Zellen in dem Wachstumsmedium (Medium 1) konditioniert.
Der Produktionsbioreaktor wird mit den 293-Zellen aus dem Anzucht-Bioreaktor angeimpft. Die Betriebsbedingungen werden wie in Tabelle 4 gezeigt eingestellt. Der pH und der gelöste Sauerstoff (DO) werden durch Einsprudeln von CO₂ bzw. Sauerstoff kontrolliert. Wahlweise kann dem Bioreaktor durch Perfusion zusätzliches Wachstumsmedium zugegeben werden. Das Zellwachstum wird durch mikroskopische Untersuchung und durch Messen der Laktatbildung und des Glukoseverbrauchs überwacht. Den Zellen wird ermöglicht, bis ungefähr 1 × 10⁶-Zellen/ml zu wachsen. Der Bioreaktor wird dann mit einem Virus angeimpft. Bevorzugt wird ein Mehrfachinfektionsverhältnis ("multiplicity of infection (MOI) ratio"), dargestellt als die viralen Gesamtpartikel pro Zelle, von 50 : 1 bis 150 : 1 eingesetzt. Virale Titrierung wird üblicherweise unter Verwendung des Resource Q-HPLC-Assays durchgeführt. Dem Virus wird ermöglicht sich zu vermehren, bis die Lebensfähigkeit der Zellen auf unter 10 % fällt.
Die Art des Virus und seine Wirkung auf die Wirtszellen kann bestimmen, ob es notwendig ist, die Wirtszellen von den Microcarriern abzulösen und/oder die Zellen zu lysieren. Ungefähr zum Zeitpunkt des maximalen Virustiters (häufig, wenn die Zellen anfangen, sich von den Microcarriern zu lösen und einige von ihnen lysieren können, so daß das Virus anfängt, freigesetzt zu werden) kann die Inkubation gestoppt werden und die Zellen und das Virus kann geerntet werden. Tatsächlich können sich in dem Microcarrierprozess 80–90 % der Zellen, manchmal sogar mehr als 90 % von den Microcarriern lösen. Ohne an eine Theorie beschränkt zu sein, scheint die zellschädigende Wirkung der viralen Vermehrung in den Wirtszellen für das Ablösen der Zellen verantwortlich zu sein. Wenn das Adenovirus ACN53 mit 293-Zellen verwendet wird, fangen die Zellen daher nach 3 oder 4 Tagen Kultivierung mit dem Virus an, sich von den Microcarriern abzulösen. TABELLE 4: BETRIEBSBEDINGUNGEN DES PRODUKTIONS-BIOREAKTORS
E. Ernte des Produktionsbioreaktors
1. Trennung der Zellen von dem Microcarrier
Bei der Ernte müssen die Bioreaktorinhalte abhängig davon, ob das Verfahren eine freie Suspension oder einen Microcarrier verwendet, unterschiedlich gehandhabt werden. In dem Microcarrier-Verfahren wird bevorzugt eine Wirbelschicht-Säule verwendet, um die Microcarrier von Zellen und Überstand zu trennen. Eine Aufwärtsflußrate wird aufrechterhalten, um die Microcarrier zurückzuhalten, während die Zellen und der Überstand passieren können. Das Fließbett wird mit Medium oder Waschpuffer gewaschen, um die meisten restlichen Zellen und Virus zu gewinnen, und die Waschungen werden mit den Zellen und dem Überstand als ein Eluat vereint. Das Betreiben eines Fließbetts ist für das Verfahren mit freier Zellsuspension nicht notwendig.
Das Eluat, das Zellen und Virus enthält, wird weiter bearbeitet, indem die Zellen durch hohe Scherkräfte lysiert werden, um das Virus freizusetzen, und das Eluat dann mittels einer Kreuzfluß-Mikrofiltration („cross flow microfiltration") geklärt wird. Üblicherweise werden 0,65 μm-Durapore (Millipore)- oder ähnliche Membranen verwendet. Gegen Ende der Mikrofiltration wird das verbleibende Material ("retentate") mit Waschpuffer gewaschen, um das verbleibende Virus in das Permeat zu gewinnen. Nach der Mikrofiltration kann das Permeat wahlweise mit einer Nuklease, wie beispielsweise BENZONASE^TM-Endonuklease, behandelt werden.
Das Permeat aus der Mikrofiltration wird durch Ultrafiltration (mit einem Molekulargewichts-Cutoff von üblicherweise 1 Million) auf konzentriert und ein Pufferwechsel wird unter Verwendung des Waschpuffers durchgeführt. Das auf konzentrierte und diafiltrierte verbliebene Material ("retentate"), welches das Virus enthält, wird dann durch einen letzten Filter gegeben. Das entstehende Filtrat wird als "virales Konzentrat" in einem Gefrierschrank bei –20 °C oder niedriger gelagert.
2. Zusammensetzung und Zubereitung der Medien
Die obige Tabelle 1 listet die Medien auf, die in der Zubereitung des viralen Inokulums und in dem Fermentationsprozeß verwendet werden. All diese Kulturmedien werden zubereitet, indem zuerst das trockene DMEM-Pulver und andere Reagenzien in gereinigtem Wasser gelöst werden. Nach Lösen der trockenen Pulver wird der pH dieser Medien mit Salzsäure auf 7,2–7,6 eingestellt. Die Medien werden dann durch Passieren durch einen 0,2 μm-Filter in ein geeignetes Lagergefäß sterilisiert. Die sterilen Medien werden bei weniger als 10 % gefroren und 1 Monat nach Zubereitung verworfen.
Tabelle 5 listet verschiedene Puffer auf, die in dem Verfahren verwendet werden. TABELLE 5: BEI DER FERMENTATION UND BEIM ERNTEN VERWENDETE PUFFER
Tabelle 6 faßt die verfahrensinternen Kontrollen während der Fermentations- und Ernteverfahren zusammen. TABELLE 6: VERFAHRENSINTERNE KONTROLLEN
II. Bead-zu-Bead-Transfer vom Saat-Bioreaktor zum Produktionsbioreaktor
A. Zubereitung des 293-Zellinokulums für den Saat-Bioreaktor
1. Hochskalieren vom Röhrchen zur T75-Flasche
Ein gefrorenes Röhrchen der 293-Zellinie, das insgesamt 2 × 10⁷-Zellen enthält, wurde in einem Wasserbad mit 37 °C aufgetaut. Die Zellen wurden mit 10 ml von Medium 1 gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in einem Gesamtvolumen von 30 ml des Mediums 1 resuspendiert und in eine Gewebekulturflasche von 75 cm² (T75) gegeben. Die Kultur wurde in einen Inkubator mit 37 °C mit einer 5 % CO₂-Atmosphäre und einem Feuchtigkeitsgehalt von 100 % gegeben. Dies entsprach der Passage 1 der Kultur.
2. Hochskalieren von T75-Kultur zu T500-Flaschen unter Einsatz der Trypsinierung
Die T75-Kultur erreichte innerhalb von 3 Tagen ein Konfluenzniveau von 90 %. Zu diesem Zeitpunkt wurde die T75-Kultur in der folgenden Weise trypsinisiert. Die 30 ml des überstehenden Mediums wurde aus der Flasche entfernt. Ein Volumen von 10 ml CMF-PBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne Calciumchlorid und ohne Magnesiumchlorid) wurde verwendet, um die Kulturoberfläche zu waschen. Das überstehende CMF-PBS wurde aus der Flasche entfernt. 2 ml TE (0,05 % grobes Trypsin mit 0,53 mM EDTA-4Na)-Lösung wurden in die Flasche gegeben. Die Flasche wurde bewegt, so daß die Lösung die gesamte Kulturoberfläche bedeckte. Die Zellen lösten sich innerhalb von 5 Minuten von der Flaschenoberfläche. 10 ml Medium 1 wurden sofort in die Flasche gegeben, nachdem sich die Zellen von der Oberfläche abgelöst hatten. Die Zellsuspension wurde mit 100 UpM für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur mit Abbremsen zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 5 ml Medium 1 resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in eine sterile Flasche mit 200 ml Medium 1 überführt. Die 200 ml-Zellsuspension wurde in eine Gewebekulturflasche mit 500 cm² (T500) gegeben. Der Flüssigkeit in der T500 wurde ermöglicht, sich zwischen den Kammern ins Gleichgewicht zu bringen, bevor sie in dem Inkubator in eine horizontale Position gebracht wurde. Die Kultur wurde in einen Inkubator bei 37 °C mit einer 5 %igen CO₂-Atmosphäre und einem Feuchtigkeitsgehalt von 100 % gegeben. Dies entsprach der Passage 2 der Kultur.
3. Hochskalieren und Passagieren der T500-Kultur unter Einsatz der Trypsinierung
Die T500-Kultur erreichte in 4 Tagen ein Konfluenzniveau von 90 %. Am vierten Tag wurde die T500-Kultur in der folgenden Weise trypsinisiert und hinsichtlich des Kulturmaßstabs vergrößert („scaled-up"). Das überstehende Medium wurde verworfen. Die Kulturoberfläche wurde mit 25 ml CMF-PBS gewaschen. Ein Volumen von 25 ml TE wurde in die Flasche gegeben. Die Flasche wurde bewegt, so daß die TE-Lösung alle drei Schichten der Kulturoberfläche bedeckte. Die Zellen lösten sich innerhalb von 5 Minuten von der Flaschenoberfläche ab. Nachdem sich die Zellen abgelöst hatten, wurden 50 ml Medium 1 in die Flasche gegeben. Alle Flächen wurden durch Bewegen der Flasche mit dem Medium in Kontakt gebracht. Die resultierende Zellsuspension wurde in eine konische Zentrifugenflasche von 200 ml gegossen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 UpM für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur mit Abbremsen sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in 5 bis 15 ml von Medium 1 resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in 800 ml (200 ml pro neuer T500-Flasche) Medium 1 gegeben. Die Zellsuspension wurde gemischt. Ein Volumen von 200 ml der Zellsuspension wurde in jede von vier T500-Flaschen gegeben. Dem Flüssigkeitsniveau in jedem Gefäß wurde ermöglicht, sich zwischen den Kammern ins Gleichgewicht zu bringen, bevor sie in dem Inkubator in eine horizontale Position gebracht wurde. Das Aufteilungsverhältnis für diese Passage betrug 1 : 4. Dies entsprach der Passage 3. Die Kultur wurde auf diese Weise für die Passagen 4 bis 13 passagiert. In Passage 14 wurden vier T500-Kulturen in der oben beschriebenen Weise trypsinisiert. Die Zellsuspensionen wurden vereint und in eine Flasche gegeben, die 1,5 l Medium 1 enthält. Diese Zellsuspension wurde in eine CELL FACTORY^TM (CF)-Gewebekulturflasche von 6000 cm² gegeben. Dem Flüssigkeitsniveau in der CF wurde ermöglicht, sich zwischen den Kammern ins Gleichgewicht zu bringen, bevor sie in dem Inkubator in eine horizontale Position gebracht wurde.
4. Hochskalieren und Passagieren der Kulturen in CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen
Die CF-Kultur erreichte in 3 Tagen ein 80 %iges Konfluenzniveau. Die Trypsinierung wurde für DIE Passage 15 in der folgenden Weise durchgeführt. Die 1,5 l an Medium 1 wurden aus der CF-Kultur abgelassen. Die Kulturoberflächen wurden mit 500 (± 100) ml CMF-PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden 250 (± 50) ml TE-Lösung zu der CF-Kultur zugegeben. Die CF wurde bewegt, so daß die TE-Lösung jede der Oberflächen bedeckte. Nachdem die Zellen sich von der Oberfläche ablösten, wurden 500 ml Medium 1 zu der CF gegeben. Die CF wurde bewegt, so daß das Medium 1 mit jeder der Oberflächen in Kontakt kam. Die entstandene Zellsuspension wurde in vier konische Zentrifugenflaschen von 250 ml aliquotiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 100 UpM für 10 Minuten mit eingeschalteter Bremse sedimentiert. Das überstehende Medium wurde aus jeder Zentrifugenflasche abgegossen. In jeder Zentrifugenflasche wurden die Zellen in 5 ml Medium 1 resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in einer Zentrifugenflasche vereint. Die drei verbleibenden Zentrifugenflaschen wurden mit zusätzlichen 5–10 ml von Medium 1 gewaschen, die zu der vereinten Zellsuspension zugegeben wurden. Diese Zellsuspension wurde gleichmäßig auf 6 Flaschen verteilt, die 1,5 l Medium 1 enthalten. Jede der sechs 1,5 l-Zellsuspensionen wurden in eine CF gegeben. Dem Flüssigkeitsniveau von jeder CF wurde ermöglicht, sich zwischen den Kammern ins Gleichgewicht zu bringen, bevor die CF in dem Inkubator in eine horizontale Position gebracht wurde. Die Kultur wurde für die Passage 16 auf die gleiche Weise passagiert.
Daten für das Passagieren werden in Tabelle 7 bereitgestellt. TABELLE 7: PASSAGIERUNGSDATEN
5. Herstellung des Zellinokulums aus Kulturen in CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen für den Anzucht-Bioreaktor
Die CF-Kulturen erreichten in 5 Tagen ein 80 %iges Konfluenzniveau. Vier der sechs CF-Kulturen wurden verwendet, um den Anzucht-Bioreaktor wie folgt anzuimpfen. Die 1,5 l des Medium 1 wurden aus der CF-Kultur abgelassen. Die Kulturoberfläche wurde mit 500 (± 100) ml CMF-PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden 250 (± 50) ml TE-Lösung zu der CF-Kultur zugegeben. Die CF wurde bewegt, so daß die TE-Lösung jede der Oberflächen bedeckte. Sofort nachdem sich die Zellen von der Oberfläche ablösten, wurden 500 ml Medium 1 in die CF gegeben. Die CF wurde bewegt, so daß das Medium 1 mit jeder der Oberflächen in Kontakt kam. Die entstandene Zellsuspension wurde in vier konische Zentrifugenflaschen von 250 ml aliquotiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 UpM für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur mit eingeschalteter Bremse sedimentiert. Das überstehende Medium wurde aus jeder Zentrifugenflasche verworfen. In jeder Zentrifugenflasche wurden die Zellen in 5 ml Medium 1 resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in einer Zentrifugenflasche vereint. Die verbleibenden drei Zentrifugenflaschen wurden mit zusätzlichem 5–10 ml Medium 1 gewaschen, die zu der vereinten Zellsuspension zugegeben wurden. Die Zellsuspensionen aus jeder der vier Zentrifugenflaschen wurden dann miteinander vereint, was ein Gesamtvolumen von 50–100 ml ergab. Ein zusätzliches Volumen Medium 1 wurde zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 1000 ml zu bringen. Dies entsprach dem Zellinokulum. Die Gesamtmenge an Zellen in den Zellinokulum betrug 2,88 × 10⁹ Gesamtzellen und 2,84 × 10⁹ lebende Zellen. Die 1000 ml des Zellinokulums wurden in ein steriles Erlenmeyer-Gefäß überführt und in den 30 l-Anzucht-Bioreaktor überimpft, der ein Gesamtvolumen von 18 l Medium 1 mit 66 g Cytodex 3-Microcarriern enthielt.
B. Anzucht-Bioreaktor
1. Vorbereitung der Cytodex 3-Microcarrier für den 30 l-Anzucht-Bioreaktor
Eine Charge von 66 g Cytodex 3-Microcarriern wurde in der folgenden Weise zubereitet. Die 66 g Cytodex 3-Microcarrier wurden in ein 5 l-Erlenmeyer-Glasgefäß gegeben. 2 l CMF-PBS mit 0,2 ml Tween 80 wurden zugegeben. Den Microcarriern wurde ermöglicht, bei Umgebungstemperatur für 5 Stunden und 30 Minuten zu quellen. Nach dieser Quellperiode wurde das überstehende CMF-PBS aus dem Gefäß dekantiert und ließ den Cytodex 3-Microcarrierschlamm zurück. Der Cytodex 3-Microcarrierschlamm wurde mit 2 l CMF-PBS gewaschen, und dann in CMF-PBS bis zu einem Gesamtvolumen von 2 l resuspendiert. Die Charge Cytodex 3 wurde in dem 5 l-Gefäß bei 121 °C für 3 und eine halbe Stunde mit einem Flüssigkeitszyklus autoklaviert. Die sterilisierte Cytodex 3-Charge wurde am nächsten Tag für den 30 l-Anzucht-Bioreaktor verwendet.
Am Tag der Cytodex 3-Zugabe in den 30 l-Anzucht-Bioreaktor wurden die folgenden Aktionen durchgeführt. Das überstehende CMF-PBS wurde aus dem 5 l-Gefäß dekantiert. Der Mikrocarrierschlamm wurde mit 2 l des Mediums 1 gewaschen. Nach dem Waschen wurde dem Gefäß Medium 1 bis zu einem Gesamtvolumen von 2 l zugegeben.
2. Vorbereitung des 30 l-Anzucht-Bioreaktors
Der 30 l-Anzucht-Bioreaktor, der einen Spin-Filter enthielt, wurde gereinigt und dampfdesinfiziert. Der Bioreaktor wurde für 50 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Ein Tag vor der Animpfung mit 293-Zellen wurde der 30 l-Anzucht-Bioreaktor mit 18 l Medium 1 gefüllt. Die 2 l, welche 66 g der Cytodex 3-Microcarrier mit Medium 1-Lösung enthielten, wurden in den 30 l-Bioreaktor zugegeben. Die Betriebsbedingungen des 30 l-Anzucht-Bioreaktors sind in Tabelle 8 aufgelistet. TABELLE 8: BETRIEBSBEDINGUNGEN DES 30 L-ANZUCHT-BIOREAKTORS
3. Kultivieren von 293-Zellen in dem 30 l-Anzucht-Bioreaktor
Die 293-Zellen wurden auf den Cytodex 3-Microcarriern für 5 Tage vermehrt. Die tatsächlichen Betriebsbedingungen in dem 30 l-Anzucht-Bioreaktor während dieses Zeitraums sind in Tabelle 9 aufgelistet. TABELLE 9: BETRIEBSBEDINGUNGEN IN DEM 30 L-ANZUCHT-BIOREAKTOR
Am fünften Tag der Kultivierung enthielten 54 % der Microcarrier-Population mehr als 50 Zellen/Microcarrier, 38 % enthielten 1–25 Zellen, 8 % enthielten keine Zellen und 8 % lagen in Aggregaten aus 2 Microcarriern vor, wie durch Untersuchung einer Probe unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. TABELLE 10: ERGEBNISSE DER MIKROSKOPISCHEN UNTERSUCHUNG VON 293-ZELLEN AUF CYTODEX 3-MICROTRÄGERN IN DEM 30 L-BIOREAKTOR AM TAG 5 DER KULTIVIERUNG
B. Bead-zu-Bead-Transferverfahren
1. Vorbereitung der Cytodex 3-Microcarrier für den Produktionsbioreaktor
Eine Charge von 420 g Cytodex 3-Microcarriern wurde in der folgenden Weise vorbereitet. Die 420 g Cytodex 3-Microcarrier wurden in einen Glasballon von 50 l gegeben. Ein Volumen von 21,5 l CMF-PBS mit 2,0 ml Tween 80 wurden zugegeben. Den Microcarriern wurde ermöglicht, bei Umgebungstemperatur für 17 Stunden zu quellen. Nach dieser Quellperiode wurde das überstehende CMF-PBS aus dem Glasballon entfernt und ließ den Cytodex 3-Microcarrierschlamm. zurück. Der Cytodex 3-Microcarrierschlamm wurde mit 25 l CMF-PBS gewaschen und dann in CMF-PBS bis zu einem Gesamtvolumen von 20 l resuspendiert.
Der 200 l-Bioreaktor, der einen Spin-Filter enthielt, wurde gereinigt und dampfdesinfiziert. Die 20 l Cytodex 3-Microcarrierschlamm wurden in den Bioreaktor überführt. 5 l CMF-PBS wurden verwendet, um den Glasballon von 50 l auszuwaschen und in den Bioreaktor überführt. Der Bioreaktor wurde für 50 Minuten bei 123 °C sterilisiert. Der Bioreaktor wurde über Nacht bei 4 °C gehalten. Am nächsten Tag wurden 120 l Medium 1 in den 200 l-Bioreaktor gegeben. Die Microcarrier-Lösung wurde in dem Bioreaktor mit 90 UpM für 10 Minuten gerührt. Das Volumen wurde durch Entnahme von Flüssigkeit durch den Spin-Filter auf 55 l verringert. Zusätzliche 110 l Medium 1 wurden in den 200 l-Bioreaktor gegeben. Die Microcarrier-Lösung wurde in dem Bioreaktor mit 90 UpM für 10 Minuten gerührt. Das Volumen wurde durch Entnahme von Flüssigkeit durch den Spin-Filter auf 55 l verringert. Medium 1 wurde in den Bioreaktor gegeben, um das Volumen auf 125 l zu bringen. Die Betriebsbedingungen des Bioreaktors wurden entsprechend Tabelle 11 eingestellt. TABELLE 11: OPERATIONSBEDINGUNGEN DES BIOREAKTORS
Der 200 l-Produktionsbioreaktor war bereit, um das Inokulum aus dem Anzucht-Bioreaktor zu erhalten.
2. Trypsinierung der Kultur im Anzucht-Bioreaktor
Am fünften Tag der Kultivierung der 293-Zellen auf den Cytodex 3-Microcarriern wurde die Bead-zu-Bead-Transferprozedur durchgeführt. Die Serum- und Calciumgehalte des Mediums in der Kultur wurden durch Perfusion von 22 l Medium 2 mit einer Rate von 2 l/min unter Nutzung des Spin-Filters bei einem konstanten Bioreaktorvolumen von 20 l verringert. Die Perfusion wurde mit 22 l des Medium 3 bei einer Perfusionsrate von 2 l/min bei einem konstanten Bioreaktorvolumen von 20 l fortgesetzt. Dies verringerte die Serum- und Calciumgehalte weiter. Medium 3 enthielt die Natriumethylendiamintetraessigsäure-Dihydrat (EDTA), das zweiwertige Kationen wie beispielsweise Magnesium und Calcium komplexierte. Eine dritte Runde Perfusion wurde unter Einsatz von 33 l des Medium 2 durchgeführt, mit dem beabsichtigt war, die Serum- und Calciumgehalte weiter zu verringern und die Konzentration des EDTA im Medium zu verringern. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium durch den Spin-Filter entzogen, um das Gesamtkulturvolumen auf 15,5 l zu verringern. Ein Volumen von 480 ml einer 2,5 %igen Trypsinlösung wurde innerhalb einer Minute in den Bioreaktor gegeben. Wie durch mikroskopische Beobachtung gezeigt, hatten sich 8 Minuten nach der Zugabe der Trypsinlösung 90 % der Zellen von den Microcarriern abgelöst. Zu diesem Zeitpunkt wurden vier Liter Serum innerhalb von zwei und einer halben Minute in den Bioreaktor zugegeben, um die Wirkung des Trypsins zu inhibieren und die Zellen vorm Scheren während des Transfers in den Produktionsbioreaktor zu schützen. Die trypsinisierten Zellen und Microcarrier wurden durch Druck in den Produktionsbioreaktor überführt. Der Transfer wurde innerhalb von 8 Minuten vollzogen. Sofort nach dem Transfer wurden 5 l Medium 1 als Spülung in den Anzucht-Bioreaktor gegeben und mittels Druck in den Produktionsbioreaktor überführt. Die Betriebsbedingungen des Anzucht-Bioreaktors während der Bead-zu-Bead-Transferprozedur sind in Tabelle 12 angegeben. TABELLE 12: BETRIEBSBEDINGUNGEN DES ANZUCHT-BIOREAKTORS WÄHREND DER BEAD-BEAD-TRANSFERPROZEDUR
C. Kultivierung von 293-Zellen in dem 200 l-Produktionsbioreaktor vor der Infektion
Die 293-Zellen wurden für 6 Tage auf den Cytodex 3-Microcarriern vermehrt. Die tatsächlichen Betriebsbedingungen in dem 200 l-Produktionsbioreaktor während dieses Zeitraums sind in Tabelle 13 aufgelistet. TABELLE 13: BETRIEBSBEDINGUNGEN IN DEM 200 l-PRODUKTIONSBIOREAKTOR
Ein Gesamtvolumen von 115 l Medium 1 wurde von Tag vier bis Tag sechs perfundiert. Die Raten wie folgt: 24 l wurden am Tag vier in einer Stunde perfundiert, 40 l wurden am Tag fünf in einer Stunde perfundiert und 50 l wurden am Tag sechs in einer Stunde perfundiert. Die Sauerstoffaufnahmerate, gemessen als die Abnahme des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff (Prozent der Luftsättigung, %DO) pro Minute (% DO-Abnahme/min) erreichte 1,65 %/min am Tag sechs. Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung am Tag sechs der Kultivierung von 293-Zellen auf Cytodex 3-Microcarriern in dem 200 l-Bioreaktor sind in Tabelle 14 angegeben. TABELLE 14: ERGEBNISSE DER MIKROSKOPISCHEN UNTERSUCHUNG AN DEM SECHSTEN TAG DER KULTIVIERUNG VON 293-ZELLEN AUF CYTODEX 3-MICROCARRIERN IN DEM 200 l-BIOREAKTOR
D. Infektion der 293-Zellen in dem 200 l-Produktionsbioreaktor
Die Bioreaktorkultur wurde am Tag sechs mit dem Virus angeimpft. Das virale Inokulum ist bei –80 °C gefroren gelagert worden. Ein Volumen von 45 ml des viralen Inokulums, 2-2, wurde in einem Wasserbad bei 20–25 °C aufgetaut. Die Gesamtmenge des zu dem Tank zugegebenen Virus betrug 1,1 × 10¹³ virale Partikel, wie durch den Resource Q HPLC-Assay gemessen. Das virale Inokulum wurde gemischt und in eine Flasche mit 1 l Medium 4 (293-1-R07 Dulbecco's Modified Eagle's-Medium mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat (3,7 g/l)) gegeben. Die virale Lösung wurde durch eine Gelman Maxi-Kulturkapsel in ein steriles Zugabegefäß („addition flask") von 5 l filtriert. Die virale Suspension wurde über sterile Verbindungen, die mittels eines Schlauchschweißgerätes hergestellt wurden, in den 200 l-Produktionsbioreaktor zugegeben. Die Betriebsbedingungen des Produktionsbioreaktors nach der Infektion sind in Tabelle 15 angegeben. TABELLE 15: BETRIEBSBEDINGUNGEN DES PRODUKTIONS-BIOREAKTORS NACH DER INFEKTION
Drei Tage nach der Infektion wiesen 89 % der Microcarrier keine angehefteten Zellen auf und die gemessene Sauerstoffauf nahmerate betrug 0,53 %/min. Die Gesamtkonzentration infizierter Zellen, die in der überstehenden Brühe vorlag, betrug 1,0 × 10⁶ Zellen/ml. Das Gesamtvolumen in dem Bioreaktor betrug 162 l. Der Bioreaktor wurde zu diesem Zeitpunkt geerntet.
E. Arbeitsgänge für die Rückgewinnung
Ein Volumen von 400 l des Puffers für die Gewinnung der Ernte wurden zubereitet und durch einen Pall Ultipor N66 (0,2 μm Porengröße) filtriert und in der folgenden Weise in sterile Gefäße aliquotiert. Drei Aliquots von 210 l, 230 l und 50 l wurden zubereitet. Das Volumen von 210 l wurde für das Waschen des Bioreaktors und das Betreiben der Wirbelschicht-Säule verwendet. Das 130 l-Aliquot wurde während der Mikrofiltration verwendet. Das 50 l-Aliquot wurde während des Mikrofiltrationsprozesses verwendet.
F. Trennung von Zellen von den Microcarriern unter Verwendung der Wirbelschicht-Säule
Das Fließbett wurde unter Verwendung einer ätzenden Lösung (0,1 N Natriumhydroxid) desinfiziert. Ein T-förmiges Anschlußstück wurde an dem Ernteanschluß des Bioreaktors angebracht. Auf einer Seite des T-Anschlusses wurde ein Sänitärschlauch (15,9 mm iD) samt Ventil mit der Wirbelschicht-Säule verbunden. Eine peristaltische Pumpe (Modell Watson Marlow 604S) wurde in dieser Linie geschaltet. Die zweite Seite des T-Anschlusses wurde an einen Sanitätsschlauch (15,9 mm iD) samt Ventil angeschlossen, der zu dem Puffertank führt. Der Auslaß der Wirbelschicht-Säule, durch den die Brühe, welche Zellen und Virus enthält, passiert, wurde mit einem Tank ver bunden, der als der Mikrofiltrations-Rückführungsbehälter verwendet wurde.
Die Brühe aus dem Bioreaktor wurde durch die Wirbelschicht-Säule mit einer Zielflußrate von 2–3 Litern pro Minute gegeben. Die Flussrate wurde mit der peristaltischen Pumpe kontrolliert. Das Rühren in dem Bioreaktor wurde beibehalten. Wenn das Bioreaktorvolumen weniger als 100 Liter betrug, wurde der Spin-Filter abgeschaltet. Wenn das Bioreaktorvolumen weniger als 30 Liter betrug, wurde das Rühren abgeschaltet. Nachdem die Bioreaktorinhalte durch die Wirbelschicht-Säule geführt wurden, wurde der Bioreaktor mit 90 l Puffer für die Gewinnung der Ernte gewaschen. Dieses Waschmaterial wurde durch die Wirbelschicht-Säule gegeben. Am Ende dieses Prozesses verblieben die Microcarrier in der Wirbelschicht-Säule und wurden verworfen. Die Daten sind in Tabelle 16 angegeben. TABELLE 16: DATEN AUS DEM FLIEßETT-SÄULENBETRIEB
G. Mikrofiltration der von Microcarriern aufgereinigten Brühe – Lysieren der infizierten Zellen und Behandlung mit BENZONASE^TM-Endonuklease
Das Startmaterial für den Mikrofiltrationsprozess war die Brühe aus der Wirbelschicht-Säule, die von den Microcarriern befreit war und Zellen und Viren enthielt. Während des Mikrofiltrationsschrittes wurden die Zellen durch die verwendete Scherrate lysiert, die Brühe von Trümmern größer als 0,65 μm geklärt, und die verbliebenen Nukleinsäuren aus den lysierten Zellen wurden durch BENZONASE^TM-Endonuklease (z.B. 0,5 Millionen Einheiten pro 200 l-Charge), einer enzymatischen Aufbereitung, verdaut.
Die Mikrofiltrationseinheit war ein Prostak-System (Millipore). Es enthielt eine hydrophile Durapore-Membran mit 0,65 μm Porengröße (Katalog-Nr. SK2P446E0) und mit einer Oberfläche von 54 Quadratfuß. Die Einspeisungs- und Retentatanschlüsse der Prostak-Filtereinheit wurden mit dem Mikrofiltrations-Rückführungsbehälter verbunden, welches die von Microcarriern befreite Brühe aus der Wirbelschicht-Säule enthielt. Eine Linie, die verwendet wurde, um den Puffers für die Gewinnung der Ernte in den Mikrofiltrations-Rückführungsbehälter einzuspeisen, wurde verbunden. Die Permeatlinie der Prostak-Einheit wurde mit dem Ultrafiltrations-Rückführungsbehälter verbunden. Die Temperatur der Brühe wurde im Bereich von 25–35 °C gehalten. Wenn sich die Einspeisung der Brühe in die Prostak-Einheit in den Mikrofiltrations-Rückführungsbehälter auf ein Volumen von 10 bis 30 l verringerte, wurden 50 l des Puffers für die Gewinnung der Ernte in das Gefäß gegeben und die Mikrofiltration fortgesetzt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Die Mikrofiltration wurde fortgesetzt, bis sich das Volumen in dem Mikrofiltrations-Rückführungsbehälter auf 10 bis 30 l verringerte. Zu diesem Zeitpunkt wurden 0,5 Millionen Einheiten BENZONASE^TM-Endonuklease zu der geklärten Brühe in dem Ultrafiltrations-Rückführungsbehälter gegeben. Die Inhalte des Gefäßes wurden gut gemischt und die Brühe wurde für 2 Stunden aufbewahrt, bevor die Ultrafiltration gestartet wurde. Die Daten sind in Tabelle 17 dargestellt. TABELLE 17: DATEN VON EINER MIKROFILTRATIONSVORGANGES
H Ultrafiltration der Brühe zur Aufkonzentration des Virus mit Diafiltration, um einen Pufferwechsel durchzuführen
Das Startmaterial für den Ultrafiltrationsprozess in dem Ultrafiltrations-Rückführungsbehälter war die BENZONASE^TM-Endonuklease-behandelte geklärte Brühe aus dem Mikrofiltrationspermeat. Die Ultrafiltrationseinheit war ein Pellicon-System (Millipore). Es enthielt eine regenerierte Pellicon II-Cellulosemembran (Katalog-Nr. P2C01MC05) mit einem Molekulargewichts-Cutoff von nominal 1 Million mit einer Oberflächen von 40 Quadratfuß. Die Einspeisungs- und Retentatanschlüsse der Pellicon-Einheit wurden mit dem Ultrafiltrations-Rückführungsbehälter verbunden. Der Ultrafiltrations-Permeatanschluß wurde mit einem Abfallgefäß verbunden. Ein Gefäß, welches den Puffer für die Gewinnung der Ernte (50 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid-hexahydrat und 2 % Saccharose) enthielt, wurde mit dem Ultrafiltrations-Rückführungsbehälter verbunden. Wenn das Ultrafiltrations-Retentatvolumen 5 bis 10 Liter erreichte, wurde eine Zugabe von 15 l des Puffers für die Gewinnung der Ernte durchgeführt und die Ultrafiltration fortgesetzt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Die Ultrafiltration wurde fortgesetzt, bis das Retentatvolumen kleiner als 5 bis 10 Liter war. Das Retentat aus der Ultrafiltration enthielt das auf konzentrierte Virus. Das Retentat wurde aus der Pellicon-Einheit entnommen. Eine Spülung mit 3 bis 6 Litern des Puffers für die Gewinnung der Ernte wurde verwendet, um das gesamte Material aus der Pellicon-Einheit zu entnehmen. Dieses gespülte Material wurde zu der Ultrafilter-Retentatbrühe gegeben. Diese wurde durch einen Millipore-Durapore-Filter mit 0,45 μm Porengröße (Katalog-Nr. CVHL71PP3) in einen sterilen Beutel filtriert. Das Material im sterilen Beutel wurde gefroren bei –80 °C gelagert. Die Daten sind in Tabelle 18 angegeben. TABELLE 18: DATEN EINER ULTRAFILTRATIONSVORGANGES
I. Allgemeine Anmerkungen
Alle 293-Zellkulturen in T75-, T500- und CELL FACTORY^TM-Gewebekulturflaschen wurden in Medium 1 in einen Inkubator bei 37 °C, 100 % Feuchte und einer 5 %igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Alle offenen Operationen wurden aseptisch unter einer Biosicherheits-(Laminarfluß)-Sterilbank durchgeführt. Mediumbefüllungen und -zugaben wurden durch einen PALL Ultipor N66-Filter mit 0,2 μm Porengröße, der für 30 Minuten bei 121 °C dampfsterilisiert worden ist, durchgeführt, der an den Einspeisungsanschluß des Bioreaktors in Reihe angeschlossen war. Alle anderen Zugaben in den Bioreaktor wurden jeweils unter Verwendung eines sterilen Erlenmeyer-Gefäßes mit PHARMED^TM-Schläuchen durchgeführt, das mittels eines Schlauchschweißgerätes aseptisch zwischen dem Bioreaktor und dem Zugabegefäß angeschlossen war. Alle in dem Rückgewinnungsprozess verwende ten Puffer wurden durch einen PALL Ultipor N66-Filter (SLK7002NFP) mit 0,2 μm Porengröße filtriert, der in Reihe an einen Anschluß des Empfangsgefäßes installiert war. Beachte, dass für die Mikrofiltrationsvorgänge entweder eine hydrophile oder eine hydrophobe Membran verwendet werden kann.

Claims

Verfahren für die Trennung von Zellen von Microcarriern, auf denen sie kultiviert worden sind, von denen sie jedoch abgelöst worden sind, umfassend das Einbringen einer wäßrigen Suspension aus Zellen und Microcarriern durch einen Zulauf in eine Trennvorrichtung, wobei die Trennvorrichtung (a) einen Zulauf; (b) eine Säule; (c) einen Auslaß für die Entnahme von Zellen und der wäßrigen Lösung; und (d) ein Maschensieb umfasst; wobei die Microcarrier in der Trennvorrichtung durch einen Aufwärtsfluß in Suspension gehalten werden und durch ein Maschensieb in der Trennvorrichtung zurückgehalten werden, und wobei die Zellen und die wäßrige Lösung durch den Auslaß entnommen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Zulauf am Boden der Vorrichtung angeordnet ist, wobei die Säule einen zylindrischen oberen Abschnitt und einen konischen unteren Abschnitt aufweist, wobei die Wände des Konus in einem Winkel angeordnet sind, der es den Kügelchen, die sich an den Wänden absetzen, ermöglicht, sich abwärts zum Zulauf zu bewegen, wobei der Auslaß an der Spitze der Vorrichtung angeordnet ist, und wobei das Maschensieb am oberen Ende der Säule lokalisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Aufwärtsfluß durch Pumpen der wäßrigen Lösung durch den Zulauf erzeugt wird, wobei der Zulauf am Boden der Vorrichtung angeordnet und der Auslaß an der Spitz der Vorrichtung angeordnet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem der Aufwärtsfluß durch Pumpen der wäßrigen Lösung durch den Zulauf erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Säule einen oberen Abschnitt und einen unteren Abschnitt umfaßt, wobei der untere Abschnitt ungefähr 20–50 % des Volumens der Säule umfaßt und den Zulauf enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem der untere Abschnitt konisch ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 oder 6, bei dem der Winkel des unteren Abschnitts ungefähr 15 bis ungefähr 45 Grad beträgt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem die Flußrate in der Trennvorrichtung ungefähr 1 bis ungefähr 3 cm/min beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die entnommenen Zellen und das entnommene wäßrige Medium einer Mikrofiltration unterzogen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem die Mikrofiltration eine Schergeschwindigkeit von ungefähr 2000 bis 10.000 l/sek umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die wäßrige Suspension aus Zellen und Microcarriern weiterhin in den Zellen vermehrte Viren umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zellen 293-Zellen sind.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 oder 12, bei dem das Virus ein Adenovirus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem das Virus ein rekombinantes Virus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14 zum Herstellen rekombinanter Viren für die Gentherapie.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das Verfahren einen weiteren Schritt des Freisetzens von Viren aus kultivierten Zellen umfaßt.