DE69835433T2

DE69835433T2 - Disulfid-vernetzte glycoprotein-hormone, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69835433T2
Application number: DE69835433T
Authority: DE
Inventors: R. William Piscataway MOYLE
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: JP2001521402A; KR20020006720A; ATE439439T1; ATE335000T1; PT996629E; PT1775346E; BR9810478A; JP2007016040A; US8530190B1; SI1775346T1; EP0996629B1; CN100404551C; HUP0100681A1; DE69835433D1; ES2268781T3; CY1109439T1; EP1775346A1; AU747179B2; DK1775346T3; CA2293731A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Glycoprotein Hormonanaloge und ihre Herstellung und Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung Disulfidbindung vernetzte Analoga von Glycoproteinhormonen und ihre Herstellung und Verwendung.
Beschreibung des Standes der Technik
Zu den Glycoproteinhormonen zählen die Hormone Choriongonadotropin (CG), auch als: Choriogonadotropin bekannt, das luteinisierende Hormon (LH), auch als Lutropin bekannt, das Follikel stimulierende Hormon (FSH), auch als Follitropin bekannt, und das Schilddrüsenstimulierende Hormon (TSH), auch als Thyrotropin bekannt. Jene von Menschen sind als humanes Choriongonadrotropin (hCG), humanes luteinisierendes Hormon (hLH), humanes Follikel-stimulierendes Hormon (hFSH), und das humane Schilddrüsen-stimulierende Hormon (hTSH) bekannt. Diese Hormone besitzen wichtige Rollen bei gonadalen und Schilddrüsenfunktion (Pierce et. al., 1981, Moyle et. at. 1995). CG und LH binden an und stimulieren LH Rezeptoren, FSH bindet an und stimuliert FSH Rezeptoren und TSH bindet an und stimuliert TSH Rezeptoren. CG ist ein Hormon, das in großen Mengen hauptsächlich durch die Plazenta einiger weniger Säugetiere einschließlich jenen von Primaten, erzeugt wird. Die Aminosäuresequenzen der β-Untereinheiten von CG von Primaten unterscheiden sich üblicherweise von jenen von LH. Pferde produzieren ebenfalls ein CG, jedoch hat dieses die gleiche Aminosäuresequenz wie Pferde-LH (Murphy et. al. 1991).
Wie in Pierce et al (1981) zusammengefasst wurde, sind Glycoproteinhormone Heteromere, die aus einer α- und β-Untereinheit aufgebaut sind. Die Heterodimere sind nicht kovalent miteinander verbunden und ihre Untereinleiten können durch Behandeln der Hormone mit Säure oder Harnstoff dissoziert werden (Pierce et al, 1981). Die meisten höheren Wirbeltiere enthalten nur ein Gen, welches die α-Untereinheiten kodiert (Fiddes et al, 1984); die gleiche α-Untereinheit bindet sich normalerweise mit den β-Untereinheit von LH, FSH, TSH, und wenn vorhanden CG. Nichtsdestotrotz können posttranslatorische Proteinbearbeitung, besonders Glycosylierung (Baezinger et al, 1988), zu Unterschieden in den Zusammensetzungen der α-Untereinheiten von LH, FSH, TSH und CG beitragen. Die meisten der Aminosäuresequenzunterschiede zwischen den Hormonen befinden sich in ihren hormonspezifischen β-Untereinheiten (Pierce et al, 1981). Diese werden von getrennten Genen erzeugt (Fiddes et al, 1984, Bo et al, 1992).
Mit wenigen Ausnahmen (Blithe et at, 1991), besitzen die α-β-Heterodimere eine viel höhere hormonale Aktivität als beide freien Untereinheiten (Pierce et al, 1981). Die natürlich vorkommenden α- und β-Untereinheiten bilden viel besser α, β-Heterodimere, als sie α, α-Homodimere oder β, β-Homodimere bilden. Tatsächlich führt die gemeinsame Expression von hCG α-Untereinheit – und β-Untereinheitgenen in Säugetierzellen zu der Bildung von α- β-Heterodimeren, α-Untereinheit Monomeren, und β-Untereinheit Monomeren. Es werden nur Spurenmengen, wenn überhaupt, des α-α-Homodimers oder β-β-Homodimers gemacht oder von der Zelle sezerniert.
Hochauflösende Röntgen Kristallstruktur von humanem Choriongonadotropin (hCG) wurde durch zwei Laboratorien berichtet (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994). Diese Strukturen offenbarten, dass die ursprünglich vorgeschlagenen Disulfid-Bindungsmuster (Mise et al, 1980 und 1981) inkorrekt waren und dass, das Hormon ein Mitglied der Cysteine-KnotenFamilie ist (Sun et al, 1995). Da die relativen Lagen der Cysteine in allen Glycoproteinhormonen ähnlich sind, ist es wahrscheinlich, dass sie die Cysteine-Knoten-Architektur, die in hCG gefunden wird, aufweisen.
Die Lokalisation der Cysteinreste in den α-Untereinheiten von Wirbeltier-Glycoproteinhormonen sind ähnlich (1A und 1B). Unter Verwendung der hCG α-Untereinheit als ein Modell, kann gesehen werden, dass der Cystein-Knoten durch das zweite, dritte, fünfte, siebente, achte und neunte α-Untereinheit-Cystein gebildet wird. Dieser erzeugt drei große α-Untereinheit-Schleifen (1A und 1B). Schleife 1 ist die Aminosäuresequenz zwischen dem zweiten und dritten Cystein; Schleife 2 ist die Aminosäuresequenz zwischen dem fünften und siebten α-Untereinheit-Cystein; und Schleife 3 ist die Aminosäuresequenz zwischen dem siebten und achten Cystein. Die Lokalisationen der Cysteinreste in den β-Untereinheiten von Wirbeltier-Glycoproteinhormonen sind ähnlich (Pierce et al, 1981). Unter Verwendung der hCG β-Untereinheit als Modell, kann gesehen werden, dass der Cystein-Knoten durch das erste, vierte, fünfte, sechste, achte und neunte Cystein gebildet wird. Dies erzeugt drei große β-Untereinheit-Schleifen (2A und 2B). Schleife 1 ist die Aminosäuresequenz zwischen dem ersten und vierten Cystein; Schleife 2 ist die Aminosäuresequenz zwischen dem fünften und sechsten Cystein; und Schleife 3 ist die Sequenz zwischen dem sechsten und achten Cystein.
Durch Ersetzten von Abschnitten der α-Untereinheit mit homologen Abschnitten einer anderen α-Untereinheit oder durch Ersetzen von Abschnitten der β-Untereinheit mit homologen Abschnitten einer anderen β-Untereinheit ist es möglich, funktionelle Chimäre von jeder Glycoproteinhormon-Untereinheit herzustellen (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1990; Moyle et al, 1994; Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995; Cosowsky et al, 1997). Ein allgemeines Schema der Strukturelemente in Glycoproteinhormon-Untereinheiten wird die 1C gezeigt, und die Übereinstimmung mit humanem Glycoproteinhormon-Untereinheiten über die Aminosäurereste ist unten in Tabelle 1A gezeigt. Tabelle 1A Korrespondenz der menschlichen Hormon-Untereinheit Aminosäure-Sequenzen zu den in Fig. 1C gezeigten Struktur-Elementen
Zusätzlich zu ihrem Cysteinknoten enthält die β-Untereinheit auch eine Sequenz, die als Sitzgurt bekannt ist (Lapthorn et al, 1994), die um die zweite α-Untereinheit-Schleife gewickelt ist. Der Sitzgurt beginnt an dem neunten Cystein, dem letzen Rest in dem β-Untereinheit-Cystein-Knoten, und beinhaltet das zehnte, elfte, und zwölfte Cystein. Es ist an die erste β-Untereinheit-Schleife durch eine Disulfid-Bindung gebunden, die zwischen Cystein zwölf (d.h. am Carboxyl-Terminalende des Sitzgurtes) und Cystein 3 (d.h., in der ersten β-Untereinheitenschleife) gebildet wird.
Der Sitzgurt ist ein Abschnitt auf der hCG β-Untereinheit, der einen signifikanten (wenn nicht den wichtigsten) Einfluss auf die Fähigkeit von hCG hat, zwischen LH und FSH Rezeptoren zu unterscheiden (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994). Der Austausch der gesamten oder eines Teils der hCG-Sitzgurt-Aminosäuresequenz mit der in hFSH gefundenen Sitzgurtsequenz veränderte die Rezeptor-Bindungsspezialität des resultierenden Hormonanalogons. Normalerweise bindet hCG an LH-Rezeptoren mehr als 1000-fach besser als an FSH oder TSH-Rezeptoren. Analoga von hCG wie CF91-117 und CF101-109, in welchem die hCG-Sitzgurtreste 101-109 (das heißt, Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr) mit ihrem hFSH-Gegenstücken (d.h., Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr) ersetzt sind, banden an FSH-Rezeptoren jedoch viel besser als hCG (auf Moyle et al, 1994). Weiters ist es durch Manipulieren der Sitzgurtzusammensetzung möglich, Analoga von hCG herzustellen, die verschiedene Ausmaße an LH und FSH-Aktivitäten aufweisen (Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). Diese haben potentiell wichtige therapeutische Verwendungen für das Erhöhen der Fertilität in Männern und Frauen.
Die meisten, jedoch nicht alle, der Intrauntereinheit-Disulfidbindungen der Glycoproteinhormone sind für ihre biologischen Aktivitäten essenziell. Studien, in welche individelle Cysteine durch andere Aminosäuren, besonders Alanin, ersetzt wurden, zeigten, dass alle der Disulfidbindungen des Cysteinknotens und des Sitzgurtes für das Falten des Heterodimer essentiell sind (Suganuma et al, 1989; Bedows et al, 1993; Furuhashi et al, 1994). Die restlichen Disulfidbindungen zwischen den humanen α-Untereinheit-Cysteinen 7-31 und 59-87 und zwischen den hCG β-Untereinheit-Cysteinen 23-72 sind für die Heterodimer-Bildung oder für die Hormonaktivität nicht essentiell.
Bis jetzt gibt es keine hoch-auflösende Kristallstruktur, die die Interaktion eines beliebigen Glycoproteinhormons mit dessen Rezeptor beschreibt. Mehrere Modelle sind in einem Bemühen erstellt worden, um die Struktur des Hormon-Rezeptor-Komplexes zu beschreiben. Die meisten von diesen basieren auf den Kristallstrukturen von hCG und Ribonuclease-Inhibitor, einem Protein, das zu den extrazellulären Domänen von Glycoproteinhormonrezeptoren strukturell ähnlich sein kann. Die meisten Anstrengungen, um die Hormonreste, die den Rezeptor kontaktieren, zu identifizieren, basierten auf dem Einfluss von chemischen, enzymatischen oder genetischen Mutationen, die zu der Verringerung der Rezeptorbindung führten. Da die Verringerung der Bindung durch die Zerstörung eines spezifischen Kontakts oder durch eine Veränderung der Hormonkonformation verursacht sein könnte (Cosowsky et al, 1997), sind die Wirkungen dieser Veränderungen leider schwierig, wenn nicht unmöglich, zu interpretieren. Dies hat zu beachtlicher Unstimmigkeiten in diesem Gebiet geführt (Remy et al, 1996; Berger et al, 1996) und einige Untersucher haben schlussgefolgert, dass es unmöglich ist, die Orientierung des Hormons in dem Rezeptorkomplex zu bestimmen (Blowmick et al, 1996).
Andere Ansätze, um die Orientierung des Hormons in dem Rezeptorkomplex zu bestimmen, beruhen auf dem Identifizieren von Regionen des Hormons, die mit dem Rezeptor nicht in Kontakt sind. Diese bleiben, nachdem das Hormon an den Rezeptor gebunden hat, exponiert und/oder können ohne Zerstören der Hormon-Rezeptor-Interaktionen verändert werden. Wenn diese auf der Kristallstruktur von hCG kartiert werden (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994) ist es möglich, ein hypotetisches Modell des Weges, auf dem hCG mit LH-Rezeptoren interagieren könnte, zu entwickeln (Moyle et al, 1995). Dieser Ansatz weist darauf hin, dass die Hormonfurche, die durch die zweite α-Untereinheitsschleife und der ersten und dritten β-Untereinheitsschleifen gebildet ist, in den primären Rezeptorkontakt eingebunden ist (Cosowsky et al, 1995). Dies würde auch erklären, warum beide Untereinheiten für die höchste Hormonrezeptorbindung benötigt werden (Pierce et al, 1981). Die Daten, die diese Schlussfolgerung unterstützen, sind in den nächsten mehreren Absätzen diskutiert. Es sollte jedoch bemerkt werden, dass die meisten, wenn nicht alle anderen Untersucher auf diesem Gebiet, ein Modell unterstützen, in welchem das Hormon sehr unterschiedlich ausgerichtet ist (Remy et al, 1996; Berger et al, 1996) obwohl diese Untersucher von dem gerade beschriebenen Modell gewusst haben (d.h. sie zitieren die Veröffentlichung, die das Modell beschreibt, in welchem die Primär-Rezeptorbindungsstelle durch die Hormonfurche gebildet wurde).
Viele Abschnitte der hCG-α-Untereinheit, die nicht mit dem Rezeptor in Kontakt zu sein scheinen, können ohne Zerstören der Bindung an LH-Rezeptoren ersetzt werden. Einige dieser Regionen sind eindeutig in dem Hormon-Rezeptorkomplex exponiert, da sie auch durch monoklonale Antikörper erkannt werden können, während hCG an LH-Rezeptoren gebunden ist. (Moyle et al, 1990; Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995). Obwohl die humane und bovine α-Untereinheiten sehr unterschiedliche Aminosäuren aufweisen, binden zum Beispiel Heterodimere, die die bovine α-Untereinheit und die hCG-β-Untereinheit enthalten, an Ratten und humane LH-Rezeptoren gut (Cosowsky et al, 1997). Diese Heterodimere werden leicht durch die meisten monoklonalen Antikörper, die Epitope auf den Schleifen 1 und 3 der α-Untereinheit von hCG erkennen, unterschieden (Moyle et al, 1995). Die Beobachtungen zeigen, dass sich die Oberflächen der humanen und bovinen α-Untereinheitenschleifen 1 und 3 unterscheiden und weist darauf hin, dass diese Region des Hormons keine essentiellen Schlüsselrezeptorkontakte bildet.
Durch Vergleichen der Fähigkeiten von monoklonalen Antikörper hCG-Analoga, in welchen Teile der α-Untereinheit entweder von den humanen oder bovinen Proteinen abgeleitet sind, zu erkennen, war es möglich, Schlüssel-α-Untereinheitreste zu identifizieren, die in der Antikörperbindung teilnehmen (Moyle et al, 1995). Einige der monoklonalen Antikörper, die Epitope auf der hCG α-Untereinheit erkennen, banden ebenfalls an ein Fragment der α-Untereinheit, das durch Trypsinverdau hergestellt wurde und dem ein Großteil der zweiten α-Untereinheitenschleife fehlte (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994; Birken et al, 1986). Diese Beobachtung wurde auch verwendet, um die Bindungsstellen dieser Antikörper zu bestimmen und/oder zu bestätigen (Moyle et al, 1995). Zwei monoklonale Antikörper, die α-Untereinheit-Epitope erkennen, und die als A105 und A407 bezeichnet werden (Moyle et al, 1995), banden an hCG, wenn das Hormon mit LH-Rezeptoren komplexiert war. Somit scheinen die α-Untereinheitenreste, die durch diese Antikörper erkannt werden, nicht in Kontakt mit dem LH-Rezeptor zu sein (Moyle et al, 1995). Der Rest der α-Untereinheit beinhaltet die zweite α-Untereinheitschleife und den C-Terminus des Proteins. Einige der Reste in diesen hoch konservierten Abschnitten der α-Untereinheit können in den Rezeptorkontakten teilnehmen.
Viele Abschnitte der hCG-β-Untereinheit, die nicht in Kontakt mit dem LH-Rezeptor zu sein scheinen, können ebenfalls durch Mutagenese ohne Zerstören der LH-Rezeptorbindung ersetzt werden. Zu diesen zählt die hCG β-Untereinheitschleife 2. Ein Analogon von hCG, in welchem die Reste der hCG β-Untereinheitschleife 2 mit jenen ersetzt wurden, die normalerweise in hFSH β-Untereinheitschleife 2, als CF39-58 bezeichnet, gefunden werden (Campell et al, 1991), wurde leicht durch monoklonale Antikörper, die FSH, nicht jedoch hCG-Reste in der β-Untereinheitschleife 2 erkennen, unterschieden. Dies zeigte, dass sich die Struktur der zweiten Untereinheitsschleife in diesem Analogon und in hCG unterscheiden. Nichtsdestotrotz interagierte dieses β-Untereinheitanalogon kombiniert mit der α-Untereinheit um ein α,β-Heterodimer zu bilden, mit LH-Rezeptoren ähnlich zu hCG (Campell et al, 1991).
Somit scheinen nur einige, wenn überhaupt, Reste in der zweiten β-Untereinheitschleife von hCG essentielle direkte LH-Rezeptorkontakte zu machen. Ähnlicherweise scheint die zweite β-Untereinheitschleife von hFSH nicht in Kontakt mit FSH-Rezeptoren zu sein. Es ist von Analoga der hCG β-Untereinheit berichtet worden, in welchen die Reste zwischen dem zehnten β-Untereinheitcystein und dem C-Terminus oder zwischen den Resten 94-114 mit den entsprechenden Resten von hFSH ersetzt wurden. Diese Analoga werden CF 94-117 (Campell et al, 1991) und CFC94-114 (Wang et al, 1994) bezeichnet. Beide binden an FSH Rezeptoren viel besser als an LH-Rezeptoren, obwohl sie die gesamte Sequenz von hCG in der zweiten β-Untereinheitschleife enthalten. Da die zweite β-Untereinheitschleife von hCG einen minimalen Einfluss auf die Fähigkeit des Hormons, entweder an LH oder FSH Rezeptoren zu binden, zu haben scheint, scheint es unwahrscheinlich, dass sie in essentiellen Hochaffinität-Kontakten mit den LH oder FSH Rezeptoren teilnimmt. Weiters ist die zweite β-Untereinheitschleife von hCG in der Nähe der ersten und dritten α-Untereinheitschleife lokalisiert, einem Abschnitt der α-Untereinheit, der ebenfalls nicht mit dem Rezeptor in Kontakt zu sein scheint. Somit erscheint es wahrscheinlich, dass die gesamte Region von hCG, die Reste in der ersten und dritten α-Untereinheitschleife und der zweiten β-Untereinheitschleife enthält, den Rezeptor nicht kontaktieren. Wie später diskutiert wird, wird angenommen, dass dieser Abschnitt des Hormons, in einen Hohlraum, der durch die Hufeisenform der extra zellulären Domäne des Rezeptors gebildet ist, projiziert. (Moyle et al, 1995).
Reste der hCH β-Untereinheit, die nicht an den Hochaffinität-Rezeptorkontakten beteiligt sind, können ebenfalls durch monoklonale Antikörper, nachdem das Hormon an die LH Rezeptoren gebunden hat, erkannt werden (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1990; Moyle et al, 1994; Cosowsky et al, 1995). Diese beinhalten Abschnitte der hCG β-Untereinheit, die in Schleife 1 und 3, die am weitesten von der α-Untereinheitschnittstelle entfernt sind, gefunden werden, die durch Antiköper wie B105, B108, B111, und B112 erkannt werden können. Diese Antikörper binden hCG, wenn es mit LH Rezeptoren komplexiert ist (Moyle et al, 1990; Cosowsky et al, 1995), was zeigt, dass diese Abschnitte der β-Untereinheitschleifen 1 und 3 keine wesentlichen Rezeptorkontakte machen. Andere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, Reste zwischen dem N-Terminus und dem ersten Cystein und zwischen dem zwölften Cystein und dem C-Terminus der hCG β-Untereinheit ohne Eliminieren der Fähigkeit des Hormons an LH Rezeptoren zu binden, zu entfernen (Huang et al, 1993). Der verbleibende Abschnitt der β-Untereinheit enthält den Sitzgurt. Einige dieser Reste scheinen essentielle Kontakte, die für eine Hochaffinitätsbindung an LH oder FSH Rezeptoren benötigt werden, zu machen. Es wurde gefunden, dass zum Beispiel das Ändern der Reste in dem Sitzgurt zwischen dem elften und zwölften Cystein eine minimale, wenn überhaupt, Auswirkung auf die Bindung an LH Rezeptoren hat (Moyle et al, 1994). Das Ändern von Resten zwischen dem zehnten und elften Cystein hat eine geringe als fünffache Auswirkung auf die FSH Rezeptorbindung (Moyle et al, 1994). Weiters unterscheiden sich die meisten Reste in dem Sitzgurt der Pferde LH (eLH) und Pferde CG (eCG) von FSH (Pierce et al, 1981; Murphy et al, 1991), dennoch binden diese Hormone gut an Ratten FSH Rezeptoren. In der Tat bindet gereinigtes eLH zumindest 30 % so gut wie hFSH an den Ratten FSH Rezeptor in vitro (Moyle et al, 1994). Zu den Abschnitten der hCG β-Untereinheit, die unberücksichtigt blieben, zählen die die Oberflächen der Schleife 1 und 3, die am nächsten zu der α-Untereinheit-Schnittstelle sind. Somit sind diese Stellen, wahrscheinliche Stellen des Hormons, die den Rezeptor kontaktieren. Abschnitte der α-Untereinheit können ebenfalls durch monoklonale Antikörper, wenn hCG mit LH Rezeptoren komplexiert ist, erkannt werden. Zu diesen zählen Resten, die durch Antikörper A105 und A407 erkannt werden (Moyle et al, 1995).
Andere Strategien für das Identifizieren von Regionen der Glycoproteinhormone, die mit Rezeptoren interagieren, beinhalten die Verwendung von Hormon-Analoga, die mehr als ein Rezeptor erkennen (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994; Han et al, 1996; Campbell et al, 1997). Somit war es möglich, Analoga von hCG herzustellen, die an FSH und TSH Rezeptoren binden, einfach durch Ändern des β-Untereinheit-Sitzgurtes von hCG, zu jenem der in hFSH gefunden wird (Campbell et al, 1997). Dieses Analogon enthält keine TSH-spezifische Reste, war dennoch in der Lage eine TSH Reaktion auf das selbe Maximalniveau wie TSH zu stimulieren. Durch Vergleichen der Aktivitäten von mehreren dieser multifunktionellen Analoga, war es möglich, zu dem Schluss zu kommen, dass die meisten Sitzgurtreste und beinahe alle von der zweiten β-Untereinheitschleife unwahrscheinlich sind, essentielle Schlüssel-Hochaffinität-Rezeptorkontakte zu bilden.
Es gibt keine Berichte über eine Kristallstruktur für irgendeinen LH, FSH, oder TSH Rezeptor. Die Aminosäuresequenzen von mehreren Glycoprotein-Hormon-Rezeptoren sind jedoch bekannt (Moyle et al, 1994; McFarland et al, 1989; Loosfelt et al, 1989; Segaloff et al, 1990; Sprengel et al, 1990; Braun et al, 1991; Nagayama et al, 1991; Nagayama et al, 1989; Jia et al, 1991). Diese Proteine scheinen extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluläre Domänen zu besitzen. Wenn sie ohne die Transmembran- oder intrazellulären Domänen (Braun et al, 1991 Ji et al, 1991; Xie et al, 1990; Moyle et al 1991) exprimiert werden, oder in Verbindung mit anderen Transmembrandomänen (Moyle et al, 1991), scheint die extrazelluläre Domäne, am meisten zu der Affinität des Rezeptors für dessen Ligand beizutragen. Die extrazellulären Domänen dieser Proteine sind Mitglieder der Leucin-reichen Wiederholungsfamilie von Proteinen und die Transmembrandomänen scheinen sieben hydrophobe Helices, die die Plasmamembran umspannen, zu haben (McFarland et al, 1989). Eine Kristallstruktur eines Ribonuklease Inhibitors, einer Modellstruktur eines Leucin-reichen Wiederholungsproteins, wurde bestimmt und gezeigt, dass sie eine Hufeisenform besitzen (Kobe et al, 1993 und 1995).
Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die extrazellulären Domänen der LH, FSH, und TSH Rezeptoren hufeisenförmig sind (Moyle et al, 1995). Abschnitte der extrazellulären Domäne der LH und FSH Rezeptoren, die ihre hCG und hFSH Bindungspezifitäten steuern, wurden durch die Verwendung von LH/FSH Rezeptorchimären identifiziert (Moyle et al, 1994). Durch Betrachten der Abschnitte von hCG, die am wahrscheinlichsten den LH Rezeptor kontaktieren, und der Abschnitte des LH-Rezeptors, die für die Ligand Bindungsspezifität verantwortlich sind, wurde ein Modell entwickelt, das die Fähigkeit dieses Hormons, mit LH Rezeptoren zu interagieren und die Signalübertragung aufzulösen, erklärt (Moyle et al, 1995). In diesem Modell kontaktiert die Furche zwischen der zweiten α-Untereinheitschleife und der ersten und dritten β-Untereinheitschleife den Rand der Rezeptor extrazellulären Domäne in der Nähe der Mitte des Hufeisens (Moyle et al, 1995). Der Rest des Hormons projiziert in den Raum zwischen den Armen des Hufeisens. Wenn das Hormon an den Rezeptor bindet und in diesen Raum projiziert, stabilisiert es eine Konformation der extrazellulären Domäne, die für die Signaltransduktion benötigt wird. Dies wird zu der Transmembrandomäne durch spezifische Kontakte zwischen der extrazellulären und der Transmembrandomäne geführt, dass für eine richtige Rezeptorexpression auf der Zelloberfläche benötigt wird (Moyle et al, 1991). Das Modell berücksichtigt die Fähigkeiten von Oligosacchariden, die Signaltransduktion zu beeinflussen (Moyle et al, 1975; Matzuk et al, 1989). Obwohl das Modell diese Daten erklären kann, wurden jedoch andere Modelle vorgeschlagen, in welchen unterschiedliche Teile von hCG mit den Rezeptoren interagieren (Jiang et al, 1995). Es ist somit nach wie vor unklar, wie Glycoproteinhormone mit ihren Rezeptoren interagieren.
Diese Ansicht der Hormon Rezeptor Interaktion erklärt auch die Inhibierung der hCG-Bindung durch einige monoklonale Antikörper, die Regionen von hCG erkennen, von denen angenommen wird, dass sie in Schlüssel-Rezeptor-Kontakten nicht teilnehmen. Wie früher diskutiert ist, zählen zu diesen Hormonoberflächen, die durch die α-Untereinheitschleife 1 und 3 und β-Untereinheitschleife 2 gebildet sind. In dem Modell projizieren diese Regionen in einem Raum zwischen den N- und C-terminalen Armen der extrazellulären Domäne des Rezeptors. Bindung von Antikörper an diesen Stellen verhindert das Eindringen des Hormons in diesen Raum.
Die Ähnlichkeiten in den Lokalisationen der Cysteine in Glycoproteinhormonen von den meisten Wirbeltierspezies (Pierce et al, 1981) weisen darauf hin, dass sie ähnlich wie hCG falten werden. Die Strukturen der Rezeptoren für die Glycoproteinhormone sind wahrscheinlich auch aufgrund der Ähnlichkeiten in den Leukin-reichen Wiederholungen ihrer extrazellulären Domänen und der großen Anzahl von konservierten Resten in ihren Transmembran-Domänen ziemlich vergleichbar (Moyle et al, 1994; Braun et al, 1991; Nagayama et al, 1991). Es scheint somit wahrscheinlich, dass jedes Modell, das erfolgreich die Interaktion von hCG mit LH Rezeptoren erklärt, ebenfalls die Fähigkeiten andere Glycoproteinhormone mit ihren Rezeptoren zu interagieren, voraussagen wird. Ein Weg, wie der Sitzgurt die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion beeinflussen kann, würde das Verändern der relativen Positionen der Hormonuntereinheiten sein (Cosowsky et al, 1997). Dies würde die Form der Furche zwischen der zweiten α-Untereinheitschleife und den ersten und dritten β-Untereinheitsschleifen verändern. Es wurde der Vorschlag gemacht, dass inhibitorische Elemente in dem Hormon und dem Rezeptor für das Verhindern von unsachgemäßen Ligand-Rezeptor-Interaktionen verantwortlich sind (Moyle et al, 1994). Die Wirkung des Sitzgurtes würde deshalb sein, die Form des Hormons zu verändern, um dessen Fähigkeit zu reduzieren, in den zentralen Abschnitt des Hufeisens zu passen.
Die Glycoproteinhormone besitzen mehrer therapeutische Verwendungen. FSH wird verwendet, um die Entwicklung von Eierstockfollikeln in Vorbereitung auf die Ovulationsinduktion zu induzieren (Galway et al, 1990, Shoman et al, 1991; Gast, 1995; Olive, 1995). LH und hCG werden ebenfalls verwendet, um die Ovulation von Follikeln, die die Entwicklung eingeleitet haben, zu induzieren. FSH, LH, und hCG werden verwendet, um die Hodenfunktion in Männern zu induzieren. Während die existierenden Hormone verwendet werden können, um die Funktionen der männlichen und weiblichen Gonaden und der Schilddrüse zu stimulieren, erfordern die praktischen Anwendungen der Hormone für diese Verwendung, dass sie Heterodimere sind. Diese können von der Hypophyse (d.h. LH und FSH), Serum (Pferde-Chroriongonadotropin) oder Urin von Schwangeren (hCG) oder postmenopausalen Frauen (Mischung aus hLH und hFSH) isoliert werden. Aktive Heterodimere können ebenfalls aus Kulturen von Zellen, die sowohl die α- und β-Untereinheiten exprimieren, einschließlich einigen von Tumoren (Cole et al, 1981) oder jenen, die mit cDNA oder genomischer DNA, die die α- und β-Untereinheiten kodieren (Reddy et al, 1985), transfiziert sind, isoliert werden. In der Tat sind die letzteren wichtige Quellen von Glycoproteinhormonen, die therapeutischen Nutzen aufweisen. Da von den Oligosacchariden der Glycoproteinhormone gezeigt wurde, ihre Fähigkeiten, eine Signaltransduktion auszulösen, zu beeinflussen (Moyle et al, 1995; Matzuk et al, 1989) wird die Herstellung und Synthese von aktiven Heterodimeren am besten in eukaryotischen Zellen ausgeführt. Diese Zellen sind in der Lage Hoch-Mannose-Oligosaccharide an Oligosaccharide hinzuzufügen, und in einigen Fällen diese zu bearbeiten, um die komplexen Oligosaccharide, die in natürlichen Hormonen gefunden werden, zu ergeben (Baezinger et al, 1988).
Da eukaryotische Zellen Glycoproteine unterschiedlich bearbeiten können, wird trotzdem die Synthese von Glycoproteinhormonen häufig in Säugetierzelllinien, wie jene die vom chinesischen Hamster ovarium (CHO) abgeleitet sind, ausgeführt. Während die Hormone in Nicht-Säugetier-eukaryotischen-Zellen gemacht werden können, beschränkt die potenzielle Antigenizität der Oligosaccharidketten ihre klinische Verwendung.
Die heterodimeren Hormone wurden ebenfalls als Immunogene verwendet, um Antisera auszulösen, das verwendet werden kann, um die Fertilität zu beschränken (Singh et al, 1989; Pal et al, 1990; Talwar et al, 1986; Talwar et al, 1992; Moudgal et al, 1971 und 1972; Moudgal, 1976; Ravindranath et al, 1990; Moudgal et al, 1978). Aufgrund der essentiellen Rolle von hCG beim Aufrechterhalten einer menschlichen Schwangerschaft, würde die Entwicklung einer Immunreaktion auf hCG als ein Mittel zur Empfängnisverhütung günstig sein, und eine beachtliche Anstrengung wurde unternommen, um ein hCG-basierendes Verhütungsmittel- Vakzin zu entwickeln. Grundsätzlich können aber auch Antikörper gegen die Hormone verwendet werden, um die Fertilität zu Fördern. Zum Beispiel scheinen die LH Konzentrationen in einigen Frauen, die eine polyzystische Eierstockerkrankung haben, überhöht zu sein. Somit würde die Entwicklung eines Verfahrens, das die zirkulierende LH-Aktivität reduziert, jedoch nicht eluminiert, bei der Wiederherstellung der Fertilität vorteilhaft sein.
Der Glycoproteinhormon Metabolismus ist sehr schlecht verstanden. Es ist bekannt, dass die Hormonhalbwertszeiten durch ihren Gehalt von Oligosacchariden (Baenzinger et al, 1988), insbesondere ihren terminalen Zuckerresten, beeinflusst ist. Die stabilsten Hormone sind jene, die den höchsten Gehalt an Sialinsäure in dieser Stelle aufweisen (Murphy et al, 1991; Baenzinger et al, 1992; Fiete et al, 1991; Smith et al, 1993; Rosa et al, 1984). Trotzdem sind die Oligosaccharide nicht gänzlich für die Stabilität der Hormone verantwortlich, da die freien Hormon-Untereinheiten signifikant kürzere Halbwertszeiten haben, obwohl sie die selben Oligosaccharide wie die Heterodimere aufweisen (Wehmann et al, 1984; Kardana et al, 1991).
Es ist allerdings vorgeschlagen worden, dass die Hormone durch Proteolyse inaktiviert werden können, was zu der Untereinheit-Dissoziation führt (Kardana et al, 1991; Birken et al, 1991; Cole et al, 1991; Cole et al., 1991; Cole et al, 1993). Durchschnittenes hCG dissozierte in ihre inaktiven Untereinheiten viel schneller als hCG (Cole et al, 1993). Es wird somit erwartet, dass ein Verfahren, das die Untereinheiten Dissoziation verhindern oder reduzieren kann, die Hormonwirksamkeit potenzieren würde.
Die Glycoproteinhormon-Untereinheiten dissozieren schnell unter denaturierenden Bedingungen, die Hitzebehandlung, pH-Extreme und Harnstoff enthalten (Pierce et al, 1981; Cole et al, 1993). Aus diesem Grund werden die meisten Glycoproteinhormonzubereitungen als lyophilisiertes Pulver gelagert. Ein Verfahren, dass zu einer erhöhten Stabilität des Heterodimers führt, kann das Lagern und Verteilen der Hormonzubereitungen in wässrigen Lösungen ermöglichen. Dies würde den Bedarf für den Versand eines getrennten Hormonverdünnungsmittels und den zusätzlichen Schritt der Hormon-Rekonstituierung durch den Endverbraucher eliminieren.
Mehrere Versuche wurden gemacht, um Hormone durch Vernetzen ihrer Untereinheiten zu stabilisieren. Chemischen Vernetzungsverfahren sind verwendet worden (Weare et al, 1979 und 1979); jedoch führen diese zu einer reduzierten Aktivität. Es ist auch möglich, α- und β-Untereinheiten genetisch zusammen zu fusionieren, um ein Einzelkettenhormon zu erzeugen.
Dieses Molekül ist stabiler als das Heterodimer und weist eine höhere biologische Aktivität auf (Sugahara et al, 1995); es ist jedoch stark von dem nativen Molekül verschieden.
Ein anderes Verfahren von quervernetzten Proteinen würde das Verbinden dieser mittels einer Disulfidbindung sein. Diese Strategie tritt natürlich auf, um andere Proteine der Cysteinkonten-Superfamilie zu stabilisieren (Sun et al, 1995) und nimmt wahrscheinlich den Platz des Sitzgurtes ein. Weiters kann die Addition von Disulfidbindung zu Proteinen ihre Stabilität erhöhen, vorausgesetzt, dass der Zusatz der Disulfidbindung nicht die interne Spannung innerhalb des Proteins erhöht (Matthews, 1987; Matsumura et al, 1989). Versuche, um die Glycoprotein Heterodimere durch eine Disulfidbindung zu stabilisieren, sind im Kanadischen Patent CA 2188508 beschrieben worden. Es gibt auch einen Kommentar in Han et al (1996), der auf solche Disulfidbindungen zwischen Untereinheiten hinweist, jedoch berichtet diese Literaturstelle, dass die Einführung einer solchen Disulfidbindung die Aktivität des Hormons reduzieren kann. Es ist höchstwahrscheinlich deshalb, da diese Heterodimere komplexe Proteine mit mehreren Disulfiden sind. Das Hinzufügen eines Cysteins zu diesen hat das Potenzial, die Faltung zu zerstören, was in nicht-funktionellen Proteinen resultiert. Zusätzlich ist es unwahrscheinlich, dass andere Cysteinknoten-Proteine als eine Basis verwendet werden können, um die Lokalisationen der Disulfidbindungen vorherzusagen, die die Glycoproteinhormone stabilisieren würden, da die Organisation der Untereinheiten in anderen Cysteinknoten-Proteinen sich im Wesentlichen von der in den Glycoproteinhormonen unterscheidet (Sun et al, 1995).
Die Zitierung von jedem Dokument hierin ist nicht als ein Zugeständnis beabsichtigt, dass ein solches Dokument ein relevanter Stand der Technik ist oder maßgeblich für die Patentierbarkeit von jedem Anspruch der vorliegenden Anmeldung betrachtet wird. Jede Aussage über Inhalt oder Datum von jedem Dokument basiert auf den für den Anmelder erhältlichen Informationen zu dem Zeitpunkt der Einreichung und stellt kein Zugeständnis über die Richtigkeit einer solchen Aussage dar.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist dementsprechend ein Ziel der Erfindung, die Mängel im Fachgebiet, wie oben diskutiert, zu überwinden. Die Glycoprotein-Hormon-Analoga der vorliegenden Erfindung bietet eine verbesserte Stabilität, während zumindest ein Teil der Bioaktivität des entsprechenden Glycoproteinhormons beibehalten wird. Vorzugsweise behalten die Analoga der vorliegenden Erfindung zumindest 25 % der Affinität des entsprechenden Hormons für dessen nativen Rezeptor. Diese Analoga der vorliegenden Erfindung bieten eine Verbesserung gegenüber den Glycoproteinhormonanaloga des Standes der Technik, da eine richtig gestaltete Positionierung der Interuntereinheit-Disulfidbindung, die durch Modifizierung von Resten in einer oder beiden der α- oder β-Untereinheit erzeugt wurden, die potenziellen Auswirkungen der Inter-Untereinheitverbindungen auf die Hormonstruktur minimieren.
Es wurde vom vorliegenden Anmelder gefunden, dass solche verbesserten Glycoproteinhormonanaloga vorzugsweise der Regel entsprechen, wobei die Inter-Untereinheitvernetzungen innerhalb von zwei Resten von existierenden (nativen) Cysteinen, die in native Disulfidverbindungen eingebunden sind und nicht außerhalb der äußersten Cysteine der entsprechenden Untereinheit sind, platziert werden müssen. Keines der Glycoproteinhormonanaloga des Standes der Technik mit Interuntereinheit-Disulfiden entspricht dieser Regel.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Glycoproteinhormonanaloga mit einer Interuntereinheit-Disulfidverbindung zwischen einem Cysteinknoten einer α-Untereinheit und einem Cysteinknoten einer β-Untereinheit. Dies minimiert Störungen des Glycoproteinhormons und ermöglicht diesem, die Aktivität zum Stimulieren eines Gonadotropin-Rezeptors, die das entsprechende native Hormon besitzt, im wesentlichen beizubehalten, während es eine verbesserte Stabilität verleiht. Dieses Merkmal ist ebenfalls nicht im Stand der Technik offenbart oder angedeutet.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung von Glycoproteinhormonanaloga mit einer Interuntereinheit-Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest der innerhalb der Schleife 3 der α-Untereinheit lokalisiert ist, und einen Cysteinrest, der innerhalb der Schleife 2 und β-Untereinheit lokalisiert ist, oder zwischen Schleife 1 der α-Untereinheit und der Schleife 2 der β-Untereinheit. Dies beschränkt auch die Störungen an dem Glycoproteinhormon und ermöglicht diesem, einen Teil der Aktivität zum Stimulieren eines Gonadotropin-Rezeptors beizubehalten, die das entsprechende native Hormon besitzt, während eine verbessere Stabilität verliehen wird. Dieses Merkmal wird auch nicht im Stand der Technik offenbart oder angedeutet.
Die Analoga der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, wenn sie in einer pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt sind, um die Unfruchtbarkeit zu behandeln oder um die Fruchtbarkeit eines Patienten, der es benötigt, zu begrenzen. Das Heterodimer der Analoga der vorliegenden Erfindung ist stabil, und als eine flüssige pharmazeutische Formulierung transportiert und gelagert zu werden.
Die vorliegende Erfindung sieht weiters rekombinante DNA-Moleküle vor, die Nukleodidsequenzen, die die α- und β-Untereinheiten eines Glycoprotein-Hormon-Analogons kodieren, enthalten, wobei die rekombinanten DNA-Moleküle Expressionsvektoren sein können.
Mit solchen rekombinanten DNA-Molekülen transformierte eukaryotische Wirtszellen sind ebenfalls vorgesehen und in einem Verfahren zum Herstellen der Analoga der vorliegenden Erfindung verwendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A-1C zeigen die Struktur der α-Untereinheit von hCG (1A) zusammen mit der Aminosäuresequenz in Einbuchstabencode (1B) und ein allgemeines Schema der Strukturelemente in Glycoprotein-Hormon-Untereinheiten (1C). Wie in 1A gesehen werden kann, teilt sich der Cysteinknoten die Untereinheit in drei große Schleifen. Schleife 1 und 3 sind oben gezeigt. Beachten Sie, dass sich die schwarzen Linien auf die Cα-Atome des Aminosäurerückgrates beziehen, während sich die grauen Linien auf die Disulfidverbindungen beziehen. Die Linien in der 1B wurden gezeichnet, um die Disulfidbindungen darzustellen. Die Strukturelemente der Glycoproteinhormonuntereinheiten, wie in Tabelle 1A aufgelistet, sind in der 1C in schematischer Form dargestellt.
2A und 2B zeigen die Struktur der β-Untereinheit von hCG (2A) zusammen mit ihrer Aminosäuresequenz im Einbuchstabencode (2B). Wie in 2A gesehen werden kann, teilt sich der Cysteinknoten die β-Untereinheit in drei große Schleifen. Schleife 2 ist oben gezeigt. Die kleine Schleife auf der rechten Seite der Figur wird im Sitzgurt gefunden. Positiv und negativ geladene Reste in dieser Region sind für die LH bzw. TSH Aktivität wichtig. Die gezeigten Reste, die diese schmale Schleife an die Schleife 1 der β-Untereinheit verbinden, die von der kleinen Sitzgurtschleife abwärts zu dem Rest der β-Untereinheit verlaufen, haben einen großen Einfluss auf die FSH und TSH Rezeptorbindung. Beachte, dass die schwarzen Linien sich auf die Cα-Atome des Aminosäurerückgrats beziehen, während sich die grauen Linien auf die Disulfidbindungen beziehen. Die Linien in 2B wurden gezeichnet, um die Disulfidbindungen darzustellen.
Die 3A und 3B zeigen die translatierte Aminosäure der Sequenzen von α-(3A) und αC7S (3B), die durch die Plasmide pSVL-α, pCI-α, pSVL-αC7S und pC7-αC7S kodiert werden. Da jedes translatierte Protein die gleiche Leitsequenz aufweist, wird erwartet, dass beide auf die gleiche Art und Weise bearbeitet werden, um Proteine zu erzeugen, die aus 92 Aminosäuren bestehen und eine N-Terminale Aminosäuresequenz beginnend mit APD aufweisen. Der in dieser und anderen Figuren verwendete Einbuchstabencode ist: A, Alanin (Ala); C, Cystein (Cys); D, Asparinsäure (Asp); E, Glutaminsäure (Glu); F, Phenylalanin (Phe); G, Glycin (Gly); H Histidin (His); I, Isoleucin (Ile); K, Lysin (Lys); L, Leucin (Leu); M, Methionin (Met); N, Asparagin (Asn); P, Prolin (Pro); Q, Glutamin (Gln); R, Arginin (Arg); S, Serin (Ser); T, Threonin (Thr); V, Valin (Val); W, Tryptophan (Trp); und Y, Tyrosin (Tyr). Der Großbuchstabe bezeichnet die Position der Cys7 Substitution, durch Serin, die C7S bildet.
Die 4A und 4B zeigen die translatierten Aminosäuresequenzen von hCGβ' (4A) und hCGβ'Y37C (4B), die durch die Plasmide pSVL-hCGβ' und pSVL-hCGβ'C7S kodiert sind. Da jedes dieselbe Leitsequenz aufweist, wird erwartet, dass beide auf die gleiche Art und Weise bearbeitet werden, um Proteine zu erzeugen, die aus 145 Aminosäuren bestehen und eine N-terminale Aminosäuresequenz beginnend mit SKE aufweisen. Der Großbuchstabe bezieht sich auf die Position der Tyr37 zu Cystein-Mutation.
5 zeigt den Einfluss der C7S Mutation in der α-Untereinheit auf die Bindung von α-Untereinheit monoklonalen Antikörpern A113 und A407. In Zellstruktur hergestelltes rekombinantes hCG (rhCG) und die unter jedem Balkenpaar angegebenen Analoga und deren Strukturen, die in den Beispielen beschrieben sind, wurden Sandwich-Immunountersuchungen unter Verwendung von B112 als Einfangantikörper und entweder radioiodiertem A113 oder A407 als Detektionsantikörper, unterzogen. B112 erkennt ein Epitop, das Reste in der Schleife 3 der β-Untereinheit enthält; A113 erkennt Epitope, das Reste in der Schleife 1 der α-Untereinheit enthält; und A407 erkennt Epitope, das Reste im N-Terminus der α-Untereinheit und einen unterschiedlichen Teil der Schleife 1 der α-Untereinheit enthält. Die Epitope für A407 und A113 überlappen sich nicht, da beide zur gleichen Zeit an hCG binden können. Der Balken auf der rechten Seite jedes Paares bezieht sich auf die B112/A407 Untersuchung. Der Balken auf der linken Seite bezieht sich auf die B112/A113 Untersuchung. Wie hier gesehen wird, hatte die Mutation von C7S eine viel größere Auswirkung auf die Bindung von A407, als auf die Bindung von A113.
6 zeigt die LH-Rezeptorbindung von hCG (α31-β37). Diese Figur illustriert die Fähigkeit von in Zellkultur hergestelltem rhCG (aufwärtsgerichtete Dreiecke). Aus Urin gereinigtes hCG (Quadrate) oder in Zellkultur hergestelltes hCG (α31-β37) (nach unten gerichtete Dreiecke), die Bindung von ¹²⁵I-hCG an 200.000 CHO Zellen, die LH Rezeptoren exprimieren, zu inhibieren. Die Werte auf der Ordinate beziehen sich auf die Menge an radiomarkiertem hCG, das am Ende der Inkubation an die Zellen gebunden war. Diese Untersuchung zeigte, dass hCG (α31-β37) an LH Rezeptoren ähnlich wie an hCG band.
Die 7 zeigt eine LH Rezeptorsignal-Transduktionsaktivität von hCG (α31-β37) und illustriert die Fähigkeit von rhCG und hCG (α31-β37) die zyklische AMP Akkumulation in 200.000 CHO-Zellen, die LH Rezeptorenexprimieren, zu fördern. Die Produktion von zyklischem AMP als Antwort auf die homorale Stimulation ist ein weit anerkannter Parameter der Signaltransduktion. Diese Untersuchung zeigte, dass hCG (α31-β37) die zyklische AMP Akkumulation ähnlich zu hCG stimuliert.
8 zeigt die thermischen Stabilitäten von hCG und hCG Analoga, die eine Interuntereinheit Disulfid-Bindung enthalten. Ähnliche Mengen an hCG und Analoga wurden bei 85°C für die auf der Abszisse angegebenen Intervalle inkubiert. Die Proben wurden gekühlt und einer Sandwich-Immunountersuchung unter Verwendung von Anti-hCG α-Untereinheit Antikörper A113 (Einfang) und radioiodiniertem Anti-hCG β-Untereinheit Antikörper B112 (Detektion) unterzogen, um die Menge an Heterodimer, die übrig blieb, zu bestimmen. Die Werte auf der Abszesse beziehen sich auf die Menge an Aktivität, die in dieser Untersuchung in Bezug auf die Ausgangsmenge an hCG vor der Erwärmung übrig blieb. Diese Untersuchung zeigte, dass hCG leicht bei 85°C zerstört wird, wohingegen die vernetzten Analoga ihre Aktivitäten für mindestens 20 Minuten beibehielten.
9 zeigt die Stabilität von hCG und vernetzten Analoga gegenüber einer Harnstoffdissoziation. Der Einfluss von 8M Harnstoff auf rhCG und die vernetzten hCG Analoga, die über jeder Bahn bezeichnet sind, ist dargestellt. Die Behandlung von hCG mit 8M Harnstoff ist bekannt, die Dissoziation ihrer Untereinheiten zu fördern, einem hierin bestätigten Ergebnis. Wie gesehen werden kann, förderte die Behandlung der vernetzten Analoga mit 8M Harnstoff die Untereinheit Dissoziation nicht, welche zu dem Verlust der Bande, die dem Heterodimer entspricht, geführt hätte. Die Positionen des Heterodimers und der freien β-Untereinheit sind auf der linken Seite der Figur vermerkt. Im Anschluss an die Elektrophorese der unbehandelten und Harnstoff behandelten Proben, wurden die Proteine in dem Gel auf Nitrozellulose elektrogeblottet, die restlichen nicht spezifischen Proteinstellen auf der Oberfläche der Nitrozellulose wurden blockiert, und das Dimer und die freie β-Untereinheit wurden unter Verwendung von radioiodiniertem B105 ermittelt.
Die 10A und 10B zeigen die translatierten Aminosäuresequenzen von CFC101-114β' (10A) und CFC101-114β'Y37C (10B), die durch die Plasmide pSVL-CFC101-114β und pSVLCFC101-114βY37C kodiert sind, im Einbuchstaben-Aminosäurecode. Da jedes die gleiche Leitsequenz aufweist, wird erwartet, dass beide auf die gleiche Art und Weise bearbeitet werden, um Proteine zu erzeugen, die aus 145 Aminosäuren mit einer N-Terminalen Aminosäuresequenz beginnend mit SKE, bestehen. Die Lokalisation der Großbuchstaben weist auf die Stelle der Tyr37 zu Cystein-Mutation hin. Die unterstrichenen Sequenzen sind von der hFSH-β-Untereinheit abgeleitet. Die Kodons für die Reste Arg95-Ser96 bilden eine BglII Stelle und jene für Val102-Arg103-Gly104 bilden eine SstII Stelle.
11 zeigt den Einfluss der α31-β37 und α51-β99 Disulfide auf die Bindung der α-Untereinheit monoklonalen Antikörper A113 und A407 an ein bifunktionales hCG/hFSH chimäres Analogon. Die hCG und die unter jedem Balkenpaar angegebenen CFC101-114 Analoga und dessen Strukturen sind in dem Beispielen beschrieben, wurden einer Sandwich-Immunountersuchung unter Verwendung von B112 als Einfang-Antikörper und entweder radioiodiniertem A113 oder A407 als Detektions-Antikörper unterzogen. B112 erkennt ein Epitop, das Reste in der β-Untereinheitschleife 3 enthält; A113 erkennt Epitope, die Reste in der Schleife 1 der α-Untereinheit enthält; und A407 erkennt Epitope, die Reste in dem N-Terminus der α-Untereinheit und einem unterschiedlichen Teil der Schleife 1 der α-Untereinheit enthält. Die Epitope für A407 und A113 überlappen sich nicht, da beide zur gleichen Zeit an hCG binden können. Der Balken auf der rechten Seite jedes Paars bezieht sich auf die B112/A407 Untersuchung. Der Balken auf der linken Seite bezieht sich auf die B112/A113 Untersuchung. Wie hier gesehen werden kann, stellte weder das α31-β37 noch das α51-β99 Disulfid die Bindungsaktivität von A407 zu CFC101-114 wieder her.
12 zeigt die thermischen Stabilitäten von hCG, CFC101-114, und CFC101-114 Analoga, die eine Interuntereinheit-Disulfidbindung enthalten. hCG, CFC101-114, und CFC101-114 Analoga wurden bei 85°C für die unter der Abszisse angegebenen Intervalle inkubiert.
Proben wurden gekühlt und einer Sandwich-Immunountersuchung unter Verwendung von Anti-hCG α-Untereinheit Antikörper A113 (Einfang) und radioiodiertem Anti-hCG β-Untereinheit Antikörper B112 (Detektion) unterzogen, um die Menge an Heterodimer zu bestimmen, die übrig blieb. Die Werte auf der Abszisse beziehen sich auf die Menge an in dieser Untersuchung verbleibenden Aktivität im Bezug auf die Ausgangsmenge an hCG vor der Erwärmung. Diese Untersuchung zeigte, dass hCG und CFC101-114 leicht bei 85°C zerstört werden, wohingegen die vernetzten Analoga im Wesentlichen ihre Aktivität für 20 Minuten beibehielten.
13 zeigt die Fähigkeiten von hCG, CFC101-114, und CFC101-114 die zyklische-AMP Akkumulation in LH-Rezeptoren exprimierenden Zellen zu stimulieren. Diese Figur illustriert, dass die Wirksamkeit von CFC101-114 (α31-β37) (geschlossenes Dreieck) zumindest so groß war wie die von CFC101-114 (offene Symbole) in Untersuchungen, die so ausgebildet sind, um ihre Fähigkeiten, die LH-Rezeptor-Signaltransduktion zu stimulieren, zu vergleichen. Während CFC101-114 (α51-β99) ebenfalls die Singaltransduktion stimulierte, war ihre Wirksamkeit geringer als die von CFC101-114 oder CFC101-114 (α51-β99). Im Gegensatz zu den benötigten Mutationen, um das α51-β99 Disulfid herzustellen, beeinflussten die Mutationen, die benötigt wurden, um das α31-β37 Disulfid herzustellen, die Signaltransduktion nicht. Der Sitzgurt ist bekannt, die Rezeptorbindungs-Spezifität zu beeinflussen. Somit unterstützen die Daten in dieser Figur die Idee, dass die Einführung von Disulfiden in Hormonregionen, von denen nicht gedacht wird, dass sie in Rezeptor-Kontakte oder Bindungsspezifität nicht teilnehmen, einen minimalen Einfluss auf die Rezeptorbindung oder Signaltransduktion haben wird. Somit werden Regionen des Hormons, die den Rezeptor nicht kontaktieren und/oder nicht zur Spezifität der Rezeptorbindung beitragen, bevorzugte Stellen für die Herstellung Disulfidbindungs-vernetzter Heterodimere sein.
14 zeigt die Fähigkeiten von hFSH, CFC101-114, und CFC101-114 (α31-β37), die zyklische-AMP Akkumulation in FSH-Rezeptoren exprimierenden Zellen zu stimulieren.
Diese Figur zeigt, dass die halbmaximale Reaktion auf CFC101-114 (α31-β37) (geschlossene Dreiecke) ähnlich war zu der von CFC101-114 (offene Symbole) in Untersuchungen, die so ausgebildet sind, um ihre Fähigkeiten, die FSH-Rezeptorsignal-Transduktion zu stimulieren, zu vergleichen. Die Aktivität von CFC101-114 (α51-β99) war viel geringer als die von CFC101-114 oder CFC101-114 (α51-β99). Somit hatten, im Gegensatz zu den benötigten Mutationen, um das α51-β99 Disulfid herzustellen, die benötigten Mutationen, um das α31-β37 Disulfid herzustellen, einen minimalen Einfluss auf die FSH induzierte Signaltransduktion. Der Sitzgurt ist bekannt die Rezeptorbindungsspezifität zu beeinflussen. Somit unterstützen die Daten dieser Figur die Idee, dass die Einführung von Disulfiden in Hormonregionen, von denen nicht angenommen wird, dass sie in Rezeptor-Kontakten oder Bindungsspezifität nicht teilnehmen, einen minimalen Einfluss auf die FSH-Rezeptorbindung oder Signaltransduktion haben wird. Somit werden Regionen des Hormons, die den Rezeptor nicht kontaktieren und/oder nicht zu der Spezifität der Rezeptorbindung beitragen, bevorzugte Stellen für die Herstellung von Disulfidbindung vernetzten Heterodimeren sein.
Die 15A und 15B zeigen die translatierten Aminosäuresequenzen von αKSIC (15A) und hCGβD99C (15B), die durch die Plasmide pSVL-αK51C und pSVL-hcGβ'D99C kodiert sind. Da jedes hCG α-Untereinheit basierende Protein und hCG β-Untereinheit basierende Protein die gleiche Signal-Peptid-Leitsequenz als die α- und β-Untereinheiten von hCG aufweisen, wird erwartet, dass sie auf die gleiche An und Weise bearbeitet werden. Es würde somit erwartet werden, dass αK51C 92 Aminosäurereste, die die N-terminale Sequenz APD aufweist, enthält, und es würde erwartet werden, dass hCGβ'D99C, 145 Aminosäurereste, die die N-terminale Sequenz SKE aufweist, enthält. Der hier verwendete Einbuchstaben-Aminosäurecode wurde in der Legende zu den 3A und 3B definiert. Der Großbuchstabe bezieht sich auf die Lokalisationen der Mutationen, die gemacht wurden, um die Interuntereinheit Disulfidbindung zu bilden.
16 zeigt die relativen Fähigkeiten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, und hCG (α51-β99), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, die Bindung von radiomarkierten hCG an LH-Rezeptoren exprimierende CHO-Zellen zu inhibieren.
17 zeigt die relativen Fähigkeiten von hCG, die als durchgezogene Linien mit Quadraten dargestellt ist, hCG (α-βD99C), die als eine gestrichelte Linie mit abwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, hCG (α51-β99), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, und hCG (αK51c-β), die als eine gestrichelte Linie mit Rauten dargestellt ist, die Bindung von radiomarkiertem hCG an LH-Rezeptoren exprimierenden CHO-Zellen zu inhibieren.
18 zeigt die relativen Fähigkeiten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, und hCG (αK51A-β), die als eine gestrichelte Linie mit abwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, mit radiomarkierten hCG um die Bindung an LH-Rezeptoren exprimierenden CHO-Zellen zu konkurrieren.
19 zeigt die relativen LH-Rezeptor Signal-Transduktionsaktivitäten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, hCG (α51-β99), die als eine gestrichelte Linie mit offenen Quadraten dargestellt ist, hCG (α-βD99C), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, und hCG (αK51C-β), die als eine gestrichelte Linie:' mit Kreisen dargestellt ist.
20 zeigt die relativen LH-Rezeptor Signal-Transduktionsaktivitäten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist; und hCG (αK51A-β), die als eine gestrichelte Linie mit offenen Quadraten dargestellt ist.
21 zeigt die translatierte Aminosäuresequenz, die durch das Plasmid pSVL-CFC101-114β'D99C kodiert ist. Da dieses translatierte Protein die gleiche Signalsequenz wie die hCG β-Untereinheit aufweist, wird erwartet, dass sie auf die gleiche Art bearbeitet wird und zu einem sezernierten Protein mit 145 Aminosäuren mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz SKE führt. Der Großbuchstabe bezieht sich auf die Lokalisation der Mutation, die gemacht wurde, um die Disulfidbindung einzuführen.
22 illustriert die relativen LH-Rezeptorbindungsaktivitäten von hCG, die als eine durchgezogene Linie dargestellt ist, CFC101-114, die als eine dick gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, CFC101-114 (α51-β99), die als eine gestrichelte Linie mit abwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, CFC101-114 (α-βD99C), die als eine gestrichelte Linie mit geschlossenen Rauten dargestellt ist, und CFC101-114 (αK51C-β), die als ein gestrichelte Line mit offenen Rauten dargestellt ist.
23 illustriert die relativen LH-Rezeptor Bindungsaktivitäten von rhCG, die als eine durchgezogene Linie mit Quadraten dargestellt ist; CFC101-114, die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist; und CFC101-114 (αK51C-β), die als eine gestrichelte Linie mit Kreisen dargestellt ist.
24 illustriert die relativen LH-Rezeptor Transduktionsaktivitäten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit geschlossenen Kreisen dargestellt ist; CFC101-114, die als eine gestrichelte Linie mit offenen Quardraten dargestellt ist; CFC101-114 (α-βD99C), die als eine gestrichelte Linie mit Rauten dargestellt ist; CFC101-114 (αK51C-βD99C), die als ein einzelner Punkt dargestellt ist; und CRC101-114 (αK51C-β), die als eine Linie nächst zu der Abszisse dargestellt ist.
25 zeigt die relativen LH-Rezeptor Signaltransduktionsaktivitäten von rhCG, die als eine durchgezogen Linie mit Kreisen dargestellt ist; und CFC101-114 (αK51A-β), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist.
26 illustriert die relativen Fähigkeiten von hFSH, die als eine durchgezogenene Linie mit Kreisen dargestellt ist; CFC101-114, die als eine gestrichelte Linie mit Quadraten dargestellt ist; CFC101-114 (α-βD99C), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist; CFC101-114 (αK51C-βD99C), die als eine durchgezogene Linie mit abwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist; und CFC101-114 (αK51C-β), die als eine durchgezogene Linie mit offenen Symbolen dargestellt ist, die Bindung von ¹²⁵I-hFSH an CHO-Zellen, die hFSH-Rezeptoren expremieren, zu inhibieren.
27 illustriert die relativen Fähigkeiten von hFSH, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, und CFC101-114, die als eine gestrichelte Linie mit offenen Symbolen dargestellt ist, die Signaltransduktion in hFSH-Rezeptoren tragenden CHO-Zellen zu inhibieren. Die Signaltransduktionsaktivitäten von CFC101 (α51-β99), CFC101-114 (α-βD99C) und CFC101-114 (αK51C-β) waren zu gering, um bei den Konzentrationen der eingesetzten Analoga ermittelt zu werden.
28 illustriert die relativen Fähigkeiten von hFSH, die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, CFC101-114, die als eine gestrichelte Linie mit offenen Quadraten dargestellt ist, und CFC101-114 (αK51A-β), die als eine gestrichelte Linie mit aufwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, die Signaltransduktion in hFSH-Rezeptoren exprimierenden CHO-Zellen zu stimulieren.
29 illustriert die Fähigkeiten von hCG, die als eine durchgezogene Linie mit offenen Symbolen dargestellt ist, und hCG (α31-β37, α51-β99), die als eine gestrichelte Linie mit geschlossenen Symbolen dargestellt ist, die Bindung von ¹²⁵I-hCG an LH-Rezeptoren exprimierende CHO-Zellen zu inhibieren.
30 illustriert die Fähigkeiten von hCG, als eine durchgezogene Line mit abwärtsgerichteten Dreiecken dargestellt ist, und hCG (α31-β37, α51-β99), die als eine durchgezogene Linie mit Kreisen dargestellt ist, die Signaltransduktion in LH-Rezeptoren exprimierenden CHO-Zellen zu stimulieren.
31A und 31B zeigen die Aminosäuresequenzen von αC7S, K51C (31A) und hCGβ'Y37C, D99C (31B) in Kleinbuchstaben, die den Einbuchstaben-Aminosäurecode darstellen. Das Serin in 31A, welches Cys7 ersetzt, und die Cysteine in 31B, welche Tyr37 und Asp99 ersetzen, sind in Großbuchstaben dargestellt.
Die 32A und 32B zeigen die Aminosäuresequenzen von αC7A (32A), einem α-Untereinheit Analogon, von welchem erwartet wird, dass es für die Herstellung von hCG, hLH, hFSH, und hTSH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Intercysteinknoten-Disulfid zwischen der α- und β-Untereinheit stabilisiert sind, und hFSHβY31C (32B), einem β-Untereinheit Analogon, von welchem erwartet wird, bei der Herstellung von hFSH Analoga nützlich zu sein, die durch ein Intercysteinknoten-Disulfid zwischen der α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind. Diese Figur illustriert die Aminosäuresequenzen eines α-Untereinheit Analogons und eines hFSH β-Untereinheit Analogons in Kleinbuchstaben, die den Einbuchstaben-Aminosäurecode darstellen. Es würde erwartet werden, dass der Austausch von Cys 7 durch Alanin in der α-Untereinheit, in Großbuchstaben in der αC7A Aminosäuresequenz dargestellt, den gleichen Effekt hat, wie der Austausch von Cys7 durch Serin wie in den Beispielen 1 und 2 dargestellt ist. Das Vorhandensein eines Cysteinrestes an Position 31 in der hFSHβY31C Sequenz wird ebenfalls in Großbuchstaben gezeigt. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die dieses FSH β-Untereinheit Analogon und αC7A oder das α-Untereinheit Analogon expremieren, die früher als αC7S identifiziert wurden, das Disulfid-vernetzte heterodimere Protein mit FSH-Aktivität zu sezernieren. Diese Signalsequenz von hFSHβY31C ist identisch, zu der der hFSH β-Untereinheit und, es wird deshalb erwartet, dass sie ähnlich zu der hFSH β-Untereinheit bearbeitet wird. Folglich wäre ihre N-Terminale Sequenz NSC.
33 zeigt den genetischen Code zum Herstellen von Glycoproteinhormon Analoga.
34A und 34B zeigen die Aminosäuresequenzen von αV5C (34A), einem α-Untereinheit Analogon, von dem erwartet wird, dass es zur Herstellung von hCG, hLH, hFSH, und hTSH nützlich sein wird, die durch ein Interuntereinheit Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind, und hCGβR8C (34B), einem β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet wird, dass es zum Herstellen von hCG Analoga nützlich sein wird, die durch ein Interuntereinheit Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind. Diese Figur illustriert die kodierende Sequenz eines Analogons eines α-Untereinheit Analogons und eines hCG β-Untereinheit Analogons, von dem, wenn es co-exrempiert wird, erwartet werden würde, ein Disulfidvernetztes Hormonanalogon mit LH-Aktivität zu bilden. Die Aminosäuresequenzen der Proteine und ihre Signalsequenzen sind im Einbuchstabencode dargestellt. Der Großbuchstabe stellt die Positionen der Mutationen dar, die benötigt werden, um das Interuntereinheit Disulfid zu bilden.
35 zeigt die Aminosäuresequenz von hFSHβ52C, einem hFSH β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet wird, dass es zum Herstellen von hFSH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind, in welchen Ser 2 zu Cystein umgewandelt ist. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die αQSC (früher beschrieben) und hFSHβS2C co-exprimieren, ein Disulfid-vernetztes Heterodimer zu erzeugen, das eine substantielle FSH-Aktivität aufweist.
36 zeigt die Aminosäuresequenz von hLHβY37C, einem β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet wird, dass es zum Herstellen von hLH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Intercysteinknotendisulfid zwischen den α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind, wobei die Kleinbuchstaben den Einbuchstaben-Aminosäurecode darstellen. Die Gegenwart eines Cysteinrestes an der Position 37 wird als Großbuchstabe dargestellt. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die diese LH β-Untereinheit Analogon und das α-Untereinheit Analogon, die zuvor als αC7S oder αC7A identifiziert wurde, ein Disulfid-vernetztes-heterodimeres Protein mit LH-Aktivität sezernieren. Diese Signalsequenz von hLHβY31C ist identisch zu der der hLHβ-Untereinheit und es wird deshalb erwartet, dass sie auf eine ähnliche Art wie die hLHβ-Untereinheit bearbeitet wird. Folglich wäre ihre N-terminale Sequenz SRT.
37 zeigt die Aminosäuresequenz von hLHβW8C, einem β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet werden würde, dass es zum Herstellen von hLH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Interuntereinheit Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten, in welchen Trp8 in ein Cystein umgewandelt ist, stabilisiert sind. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die αQSC (früher beschrieben) und hLHβW8C co-exprimieren, ein Disulfid-vernetztes Heterodimer erzeugen, das eine substantielle LH-Aktivität aufweist.
38 zeigt die Aminosäurefrequenz von hTSHβY30C, einem β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet werden würde, dass es zum Herstellen von hTSH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Intercystein-Knotendisulfid zwischen den α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind, wobei die Kleinbuchstaben den Einbuchstaben-Aminosäurecode darstellen. Die Gegenwart eines Cysteinrestes an Position 30 wird durch einen Großbuchstaben dargestellt. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die dieses TSH β-Untereinheit Analogon und die α-Untereinheit Analoga, die zuvor als αC7S oder als αC7A identifiziert wurden, exprimieren, ein Disulfid vernetztes heterodimeres Protein mit TSH-Aktivität sezernieren. Die Signalsequenz von hTSHβY31C ist identisch zu der der hTSH β-Untereinheit, und es wird deshalb erwartet, dass sie ähnlich zu der hTSH β-Untereinheit bearbeitet wird. Folglich werden ihre N-terminale Sequenz FCI.
39 zeigt die Aminosäuresequenz von hTSHβF1C, einem β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet werden würde, dass er zur Herstellung von hTSH Analoga nützlich sein wird, die durch ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten, in welchen Phel gegen ein Cystein ausgetauscht ist, stabilisiert sind. Es würde erwartet werden, dass Zellen, die αQSC (früher beschreiben) und hTSHβF1C co-exprimieren, ein Disulfid-Heterodimer produzieren, das eine substantielle TSH-Aktivität aufweisen.
40 illustriert schematisch die Herstellung des αC7S Kodons.
41 illustriert schematisch die Herstellung von pSVL-CFC101-114β'.
42 illustriert schematisch die Herstellung von pSVL-CFC94-114β'.
43 illustriert schematisch die Herstellung von pSVL-CFC101-106β'.
44 illustriert schematisch die Herstellung von pSVL-αK51C.
55 zeigt die Fähigkeiten von hFSH und des Analogons αV76C + hFSHβV38C, die, zyklische-AMP Akkumulation in den humanen FSH Rezeptor exprimierenden CHO Zellen zu stimulieren.
46 zeigt die Fähigkeiten von hCG und den Analogon, α+hCGβR6C, Y37C die zyklische AMP-Akkumulation in LH-Rezeptoren exprimierenden CHO-Zellen zu stimmulieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Analoga der Glycoproteinhormone gemäß der vorliegenden Erfindung stellten eine Verbesserung gegenüber den verallgemeinerten Lehren der CA 2188508 und Han et al (1996) dar. Interuntereinheit-Disulfidbindungen stabilisieren die α- und β-Untereinheiten des Glycoproteinhormon-Heterodimers. Die verbesserten Analoga sind spezifisch konstruiert, um die Störungen der dreidimensionalen Struktur des Hormons zu reduzieren, dadurch bilden einer höheren Wahrscheinlichkeit, dass das Dimer in vivo gebildet wird und das gebildete Dimer eine Affinität für die nativen Rezeptoren aufweisen wird und eine agonistische Aktivität darauf hat.
Die Begriffe „Analogon" oder „Analoga", sowie hierin verwendet, sind beabsichtigt, ein Glycoproteinhormon zu bedeuten die ausgewählt sind aus humanem Choriongonadotropin (hCG), humanem luteinisierendem Hormon (hLH), humanem Follikel stimulierendem Hormon (hFSH), humanem Schilddrüsen stimulierendem Hormon (hTSH), und funktionellen Muteinen davon, in welchen die Aminosäuresequenzen ihrer α- und β-Untereinheiten modifiziert sind, um freie Cysteine in jeder der Untereinheiten zu erzeugen, die Interuntereinheit Disulfidbindungen bilden, dadurch Stabilisieren des Heterodimers.
So wie hierin verwendet, bedeuten die Begriffe „Mutein" oder „Muteine" sich auf die Glycoproteinhorme hCG, hLH, hFSH, und hTSH, welche modifiziert sind, zu beziehen, jedoch nicht so modifiziert sind, um Interuntereinheit Disulfidbindungen zu erzeugen, und welche im Wesentlichen (zumindest 80 %) ihre funktionelle biologische Aktivität, z.B. Rezeptoraffinität und Hormonwirksamkeit, Antikörpererkennung, beibehalten oder die ihre Affinität oder Spezifität für ein unterschiedliches Glycoproteinhormon erhöhen, wie bei chimären Glycoproteinhormonen auftreten kann, ob diese Proteine ausdrücklich als funktionell ausgewiesen sind oder nicht.
Um Muteine von Glycoproteinhormonen zu erzeugen, können die Proteine durch jedes im Stand der Technik bekannte Mittel modifiziert werden. Der einfachheitshalber, werden Modifikationen in jene, die durch Expression in einer geeigneten Wirtszelle eines modifizierten Gene(s), welche(s) das modifizierte Protein kodieren, erzielbar sind, welche „Mutationen" genannt werden, und jene, die nicht durch Expression erzielbar sind, welche „Derivatisationen" genannt werden, eingeteilt.
Während normalerweise Derivate Erstens durch Synthetisieren des Leitmoleküls und dann Derivatisieren des Leitmoleküls hergestellt werden, können Derivate auch direkt hergestellt werden. In dem Begriff „Derivate" ist jedoch eingeschlossen, dass es technisch durchführbar ist, Derivate durch Modifizieren des Leitmoleküls zu erhalten, auch wenn das nicht das bevorzugte Herstellungsverfahren ist.
Modifikationen von Proteinen können wie folgt klassifiziert werden:
Günstig – Diese Modifikationen erhöhen den Nutzen eines Proteins für eine bestimmte Verwendung.
Neutral – Diese Modifikationen weder Erhöhen noch Verringern den Nutzen eines Proteins für eine bestimmte Verwendung.
Ungünstig – Diese Veränderungen verringern, eliminieren jedoch nicht notwenigerweise, den Nutzen eines Proteins für eine bestimmte Verwendung.
Inaktivierend – Diese Modifikationen eliminieren den Nutzen eines Proteins für eine bestimmte Verwendung.
Tolerierbar – Diese Modifikationen sind günstig, neutral oder ungünstig, jedoch nicht inaktivierend.
Da ein Protein mehr als eine Verwendung haben kann, ist es möglich, dass eine Modifikation für eine erste Verwendung günstig, für eine zweite ungünstig, für eine dritte neutral und für eine vierte inaktivierend ist.
Im Allgemeinen wird die Auswirkung der Modifikationen auf die Eignung des Proteins für Verwendungen, die spezifisch sind, zu einem mehr oder weniger großen Ausmaß, auf die spezifische Struktur des Proteins, als auf jene, die nur von der Proteinaminosäurezusammensetzung, Molekulargewicht oder groben physikalischen Eigenschaften abhängig sind, diskutiert.
Ein Protein kann für eine Vielzahl von Gründen modifiziert werden, einschließlich einem oder mehreren der folgenden Zwecke:

• um das Molekül mehr detektierbar zu machen, wie im Fall von radiomarkierten, enzymmarkierten und fluoreszenzmarkierten Derivaten;
• um das Molekül in Bezug auf ein bestimmtes physikalisches, chemisches oder biologisches Mittel, wie Wärme, Licht, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel, und Enzyme, stabiler zu machen;
• um das Molekül in einem Lösungsmittel von Interesse löslicher zu machen, z.B. um eine Verabreichung zu fördern, oder um das Molekül weniger löslich zu machen, z.B. um seine Präzipitation zu fördern oder seine Verwendung beim Einfangen eines anderen Moleküls zu ermöglichen:
• um die Natur der Reaktionen, in welchen das Molekül teilnehmen kann, z.B. das Plazieren von Schutzgruppen auf Aminosäurenseitenketten, zu beschränken, oder umgekehrt, um die möglichen Reaktionen zu erweitern, z.B. das Plazieren einer Schutzgruppe auf dem Molekül, um eine nachfolgende Kopplungsreaktion zu fördern;
• um das Molekül weniger (oder mehr) immogen zu machen;
• um die Zeit, die das Molekül in einem bestimmten Organ oder Gewebe verbringt, wenn an ein Lebewesen verabreicht, zu erhöhen (oder verringern), oder um seine Ankunft in einem bestimmten Organ oder Gewebe zu beschleunigen (oder verlangsamen);
• um eine oder mehrere ihrer biologischen oder immunologischen Aktivitäten zu verstärken (oder verringern), z.B. die Affinität für einen Rezeptor zu erhöhen oder verringern, oder um seine Spezifität zu verändern; oder
• um eine neue Aktivität zu verleihen, welche eine frühere Aktivität (z.B. Anhängen eines Toxins an einen Antitumor Antikörper) komplementiert; oder
• um eine ungewünschte Nebenwirkung des Moleküls zu inhibieren.

Die meisten Reste eines Proteins können einen gewissen Grad an Mutation tolerieren. Die Mutationen können in Form einer einzelnen oder multiplen Substitutionen, Insertionen, oder Deletionen sein. Vorzugsweise sind die Insertionen oder Deletionen auf die Termini des Moleküls, oder auf die Oberflächenschleifen oder Interdomaingrenzen gerichtet.
Es gibt kein bevorzugtes Maximum in Bezug auf eine Insertion an einem Terminus, die treffender eine „Addition" oder „Fusion" genannt wird. Es ist Routine, ein Protein an ein anderes zu Fusionieren, um die Expression zu fördern, oder um ein Fusionsprotein bereitzustellen, welches die kombinierten biologischen Aktivitäten ihrer Komponenten aufweist. Ein Fusionsprotein kann als ein Vorläufer nützlich sein, welcher gespalten werden kann, um ein aktives Protein freizusetzen, sogar dann, wenn dem Fusionsprotein selbst die Aktivität fehlt.
Im Bezug auf eine Deletion an einem Terminus, treffender „Verkürzung" genannt, ist der Zweck der Modifikation wichtig. Es ist Routine, ein Protein erheblich zu verkürzen, wenn jemand nur in seine immunologischen Eigenschaften interessiert ist. Man kann von einem Protein ein Epitop, so klein wie fünf Aminosäuren, herausnehmen, und es selbst verwenden, um eine T-Zellreaktion auszulösen, oder konjugiert an Kopien von sich selbst, oder zu einem immunogenen Träger, um eine B-Zellreaktion auszulösen. Wenn es eine biologische Aktivität ist, die konserviert werden muss, können die Einschränkungen auf die Verkürzung strikter sein.
Vorzugsweise ist die Mutante, nach dem alle Substitutionen, und jede der internen Deletionen und Insertionen betrachtet wurden, zumindest 50 %, mehr bevorzugt zumindest 80 % identisch zu der Sequenz des ursprünglichen Proteins.
Es ist wahrscheinlicher, dass ein Protein eine Mutation toleriert, welche:

(a) eher eine Substitution als eine Insertion oder Deletion ist;
(b) eine Insertion oder Deletion an den Termini, als intern, oder wenn intern, an einer Schleife, oder an einem Interdomainlinker;
(c) eher einen Oberflächenrest als einen inneren Rest betrifft;
(d) einen Teil des Moleküls betrifft, der distal zu der Bindungsstelle ist;
(e) eine Substitution einer Aminosäure für eine andere von ähnlicher Größe, Ladung und/oder Hydrophobizität ist; und
(f) an einer Stelle ist, die einer wesentlichen Variation unter einer Familie von homologen Proteinen ausgesetzt ist, zu welcher das Protein von Interesse gehört Diese Betrachtungen können verwendet werden, um funktionelle Mutanten zu entwickeln.

Vorzugsweise, für die Framework-Reste, und noch mehr bevorzugt für die ganze Kette, hat die vorausgesagte oder experimentell bestimmte 3D-Struktur des modifizierten Proteins eine Hauptkette (Cα-Kohlenstoff) Konformation, dessen mittlere quadratische Abweichung der vorausgesagten oder experimentell bestimmten 3D-Struktur des ursprünglichen Proteins vorzugsweise geringer als 5 Å, mehr bevorzugt weniger als 3 Å, noch mehr bevorzugt weniger als 2 Å, und am meisten bevorzugt weniger als 1 Å.
Die Bestimmung der 3D-Struktur eines Proteins kann eine beachtliche Leitlinie für einen bereitstellen, der versucht, das Protein für einen nützlichen Zweck zu modifizieren, oder zumindest, um inaktivierende Modifikationen zu vermeiden. Wenn die gesamte 3D-Struktur bekannt ist, weiß der Fachmann, welche Reste auf der Oberfläche sind und welche an der Innenseite sind, welche Reste Seitenketten aufweisen, die in Richtung der Außenseite zeigen, welche Reste eng zusammengepackt sind und welche nicht, wo die Kette flexibel ist und wo sie eingeschränkt ist, welche Reste in der Sekundärstruktur sind, welche Reste in die als Folge der
Kettenfaltung, Nachbarschaft gebracht werden, und welche in Form von Wasserstoffbindung und Salzbrücken interagieren können.
Mutationen an Oberflächenresten sind eher toleriert als an internen Resten. Mutationen an den letzteren Positionen haben ein größeres Potential, das Protein zu destabilisieren, dadurch, durch Denaturieren des Proteins, alle seine Bindungsaktivitäten zu beeinflussen. Mutation an einem Oberflächenrest kann überhaupt keine Auswirkung auf die Bindungsaktivität haben, oder es kann einige Aktivitäten beeinflussen, jedoch nicht andere. In jedem Fall ist es unwahrscheinlich, dass sie das Protein denaturieren.
Die Hauptverfahren zum Bestimmen der vollständigen 3D-Struktur eines Proteins sind Röntgenstrahlen Kristallographie und NMR-Spektorsokopie, und das Haupthindernis beim Erhalten von hochauflösenden Röntgenstrahlen-Beugungsdaten ist der Kristallisierungsschritt.
Hochauflösende Kristallstrukturen von hCG sind von zwei Laboratorien (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994) erhältlich und dienen als ein Modell für hLH, hFSH, und hTSH.
Im Falle von kleineren Proteinen, vorzugsweise kleiner als 20kDa, kann die Kernmagnetresonanz (NMR) Spektroskopie ebenfalls die 3D-Struktur aufklären. Für die Verwendung der NMR-Strukturbestimmung siehe McIntosh et al, (1987). NMR kann ebenfalls Teilinformationen über die Struktur von größeren Proteinen liefern. Regionen eines größeren Proteins, die von speziellem Interesse sind, können entweder durch rekombinante DNA-Techniken oder durch gesteuerte Proteolyse getrennt erzeugt werden, die dann durch NMR studiert werden.
Verschiedene spektrale Veränderungen begleiten die Änderungen der Ladungen der Umgebung von bestimmten Aminosäuren. Wenn die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin und Histidin in eine weniger polare Umgebung verschoben werden, erhöht sich λmax und e. [Folglich, wenn sie für eine dieser Aminosäuren in einem polaren Lösungsmittel höher sind, dann muss für die freie Aminosäure dem gleichen Lösungsmittel, der Rest durch nicht-polare Aminosäuren verdeckt und umgeben sein.] Wenn das Spektrum eines Proteins ferner sensitiv gegenüber Änderungen der Lösungsmittelpolarität ist, muss die fragliche Aminosäure auf der Oberfläche sein. Um ein anderes Beispiel zu geben, erhöhen sich λmax und e immer für Aminosäuren, wenn eine titrierbare Gruppe (z.B. das OH von Tyrosm, das Imidazol von Histidin, und SH von Cystein) geladen ist. Infolgedessen kann durch Korrelieren der speziellen Änderungen mit pH-Änderungen, abgeleitet werden, ob die titrierbare Gruppe auf der Oberfläche ist oder verdeckt ist. Reste in tiefen Spalten können von jenen, die vollständig auf der Oberfläche sind, oder vollständig verdeckt sind, unterschieden werden, in dem die Ergebnisse mit Lösungsmitteln, der Moleküle unterschiedliche mittlere Durchmesser haben, verglichen werden.
Abgesehen von der Verwendung zum Bestimmen der Stelle von bestimmten Resten, können diese spektroskopischen Techniken dabei helfen, Zweideutigkeiten in der Röntgenstrahlen- und NMR-Analyse aufzulösen.

Aminosäure-spezifische chemische Affinitätsmarkierungen können verwendet werden, um aufzuspüren, welche Reste tatsächlich exponiert sind. Die am meisten nutzbaren Markierungen sind eher jene, die mit geladenen Resten reagieren, da jene eher auf der Oberfläche erscheinen. Zu Proben-Markierungen zählen die Folgenden:

Aminosäure	Affinitätsmarkierung
Asp, Glu	Diazo-Verbindung (mit nicht-ionisierten AA) oder Epoxide (mit ionisierten AA)
Lys	2, 4, 6-Trinitrobenzensulfonsäure, Essig-, Bernstein-, Maleinsäure und Citraconsäureanhydride
Arg	Cyklohexandion, Hyrazin

Markiertes und unmarkiertes Protein wird dann getrennt einem Fragmentierungsreagenz wie Cyanbromid, Pepsin, Papain, Chymotrypsin, Trypsin, oder Iodosobenzoesäure unterzogen. Die von der Spaltung des markierten Proteins resultierenden Peptide werden mit jenen verglichen, die von dem nativen Protein abgeleitet sind, unter Verwendung der zweidimensionalen Elektrophorese. Peptide, die eine veränderte Mobilität aufweisen, werden sequenziert und modifizierte Aminosäuren werden bestimmt.
Adachi et al (1989) verwendete Arg- und Lys-spezifische Reagenzien, um die Rolle dieser Reste in sowohl der katalytischen als auch der Heparin-Bindungsaktivitäten von EC-SOD zu untersuchen. Sie fanden, dass die Modifikation dieser Reste zu einer Abnahme dieser Aktivitäten führte, sie versuchten jedoch nicht zu erkennen, welche Reste modifiziert wurden.
Oberflächenreste könne auch mittels Photoaffinitätsmarkierungen identifiziert werden, welche, bei Aussetzen zu Licht, hoch-reaktive Zwischenprodukte bilden, z.B. Nitrene und Carbene. Diese Spezies sind zum Einfügen in C-H Bindungen in der Lage, und können deshalb mit jeder zugänglichen Aminosäure reagieren. Aus diesem Grund wurden Photoaffinitätsmarkierungen verwendet, um die Membrantopographie zu studieren. Einige Proteine liegen an der Peripherie der Membran, andere sind in ihr eingebaut.
Ein anderes Beispiel eines nicht-spezifischen Markierungsreagenzes ist Tritium. Ein gefaltenes Protein kann tritiiert werden (durch Wasserstoffaustausch mit tritriertem Wasser), denaturiert, und fragmentiert, und die Fragmente sequenziert und auf das Vorhandensein von Tritium (welches radioaktiv ist) getestet werden.
Alle diese Markierungsverfahren können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob Reste, abgesehen davon, dass sie auf der Oberfläche sind, Teil einer Bindungsstelle sind. Die Verteilung der Markierung, die erhalten wird, wenn freies Protein markiert wird, wird mit jener verglichen, die erhalten wird, wenn das komplexierte Protein markiert wird. Da in dem Komplex der Bindungspartner die Bindungsstellenreste des Bindungsproteins verdecken, sollten die Bindungsstellenreste in dem freien Protein markiert sein, und nicht in dem komplexierten Protein.
Im Allgemeinen variieren Oberflächenreste, innerhalb von Familien von Proteinen mit ähnlicher Sequenz und Funktion, eher als innere Reste. Dies ist höchstwahrscheinlich deswegen, weil die Oberflächenreste unwahrscheinlich, in Interaktionen mit anderen Resten eingebunden sind, die notwendig sind, um die Gesamtkonformation des Proteins zu bewahren.
Das am meisten zuverlässige Verfahren zum Identifizieren der Oberflächenreste eines Proteins ist, die 3D-Struktur des Proteins durch Röntgenbeugung zu bestimmen. Sogar eine unvollständige 3D-Struktur kann beim Entwickeln von Mutanten nützlich sein. Reste mit hoher Mobilität, wie durch einen überdurchschnittlich hohen kristallografischen Thermalfaktor gezeigt ist, sind jene, die gegenüber destabilisierenden Mutationen am wenigsten empfänglich sind. Siehe Alber et al (1987).
Obwohl viele Aminosäuresubstitutionen an Oberflächenpositionen ohne nachteilige Wirkungen gemacht werden können, tendieren Substitutionen an internen Positionen dazu, stark destabilisierend zu sein. Innerhalb von Familien von homologen Proteinen, sind die am meisten konservierten Reste, abgesehen von den funktionellen Aminosäuren, jene, die verdeckt sind.
Der Hauptbeitrag zur der freien Energie der Proteinfreisetzung, und somit zu der Proteinstabilität, kommt von verdeckten hydrophoben Seitenketten im Inneren, wodurch diese von dem Lösungsmittel abgeschirmt werden. Üblicherweise sind die Packungsdichten hoch. Im Allgemeinen ist die Fähigkeit eines Proteins, Mutationen zu tolerieren, die das Volumen von Kernresten verändern, mehr von der Nettoladung des Gesamtkernrestvolumens, als von der Höhe der individuellen Restvolumenänderungen abhängig. In anderen Worten, kann eine Zunahme im Volumen einer Kernposition eine Abnahme des Volumens einer anderen Kernposition kompensieren. Vorzugsweise ist die Nettoänderung im Gesamtkernrestvolumen nicht mehr als 10 %, mehr bevorzugt, nicht mehr als 5 %. Siehe Lim et al (1989); Lim et al (1992).
In der Abwesenheit von gegenteiligen Hinweisen, können alle als innere Reste als identifizierten Reste als ein Teil eines einzelnen Kerns angenommen werden. Wenn es jedoch wahrscheinlich ist, dass das Protein faltet, um mehrere unterschiedliche Kerne zu binden, sollte die oben erwähnte Volumenkonservierungsreggel auf jeden Kern getrennt angewendet werden.
Der Aufbau des verdeckten Kerns eines Proteins ist abhängig, nicht nur von der Neigung jeder Aminosäure, wenn vorhanden, versteckt zu sein, aber auch von der Gesamthäufigkeit des Auftretens dieser Aminosäure in dem Protein. Die am häufigsten verdeckten Reste sind, in abnehmender Reihenfolge, Val, Gly, Leu, Ala, Ile und Ser.
Lim et al (1992) berichtete, dass das Austauschen einer einzelnen hydrophoben Aminosäure (Leu, Val) in dem Proteinkern gegen eine hydrophile Aminosäure (Asn, Gln) die vollständige Faltung des Proteins verhinderte und die biologische Aktivität zerstörte.
Verdeckte Cys, (-S-S-Form), Asp, Gly, His, Pro, und Trp sind zu mehr als 70 % wahrscheinlich in einem homologen Protein unverändert. Wenn diese Reste in einer verdeckten Position in dem Protein von Interesse auftreten, ist es deshalb bevorzugt, diese unverändert zu belassen. Ihre Konservierung ist wahrscheinlich wie folgt erklärbar: Cys (Disulfidbindung), Asp (geladen jedoch starre Seitenkette), Gly (Kettenflexibilität), His (sowohl geladener als auch ungeladener Zustand bei physiologischen pH vorhanden), Pro (einzigartige Kettengeometrie), und Trp (längste Seitenkette).
Die anderen Reste, mit der Ausnahme von Met, sind zu 40-60 % wahrscheinlich unverändert zu bleiben, wenn sie verdeckt ist, (Met wird nur 26 % der Zeit verändert, ist jedoch zu 25 % wahrscheinlich, durch Leu, ersetzt zu werden).
Die folgenden verdeckten Reste-Substitutionswahrscheinlichkeiten überschreiten 10 %
Diese weiteren Substitutionen haben Wahrscheinlichkeiten im Berich von 5-10 %
Siehe Overington et al (1992), Tabelle 5.
Die am meisten beständigen Austauschgruppen scheinen (Arg, Lys), (Leu, Ile, Met, Val, Phe), und (Ser, Thr, Ala) zu sein. Jedoch scheinen Ala und Val ziemlich vermischt zu sein.
Es ist deshalb im Allgemeinen bevorzugt, das Mutieren von verdeckten Resten überhaupt zu vermeiden. Wenn sie jedoch mutiert sind, sollte die Gesamtänderung des Volumens des Kerns limitiert sein, und am meisten bevorzugt sollte die Mutation auf den Austausch eines Restes mit einem anderen beschränken, dessen typische Substitutionswahrscheinlichkeit Null überschreitet, vorzugsweise zumindest 5 % ist, und am meisten bevorzugt zumindest 10 % ist. Die Mutation von verdeckten Cys (-S-S), Asp, Gly, His, Pro und Trp sollte vermieden werden, fehlende Begründung durch andere Beweise. Die sichersten Kernmutationen sind Auswechselungen von einer hydrophoben Aminosäure mit einer anderen, und von Arg für Lys (oder umgekehrt).
Nichtsdestotrotz kann eine vernünftige Mutation an internen Resten verwendet werden, um die Proteinstabilität zu erhöhen. Solche Mutationen könnten zusätzliche stabilisierende Interaktionen (Wasserstoffbindungen, Ionenpaare), die mit der nativen Struktur kompatibel sind, einführen oder könnte die Mobilität von benachbarten interagierenden Gruppen durch Austauschen kleiner Aminosäuren mit größeren, oder linearen Seitenketten mit verzweigten oder aromatischen Seitenketten reduziert werden. Siehe Alber et al (1987).
Wichtiger ist, dass es zusätzlich zu den Verallgemeinerungen der Modifikationen der Reste der Glycoproteinhormone, die oben diskutiert sind, eine beachtliche Menge an verfügbaren Informationen von Region der Glycoproteinhormone (hCG insbesondere) gibt, die bei der Bindung an einen Glycoproteinrezeptor exponiert sein können oder nicht und die die Hormonrezeptorinteraktionen nicht stören, d.h. Rezeptoraffinität und Hormonwirkung. Solch verfügbare Information von Resten und Regionen, die sicher modifiziert werden können, wird in der Beschreibung des Standes der Technik, sowie an anderer Stelle der vorliegenden Spezifikation dargestellt. Von der Fülle an Struktur und Funktionsdaten, wie hierin dargestellt und aus der wissenschaftlichen Literatur verfügbar ist, liegt es im Können eines Fachmannes, Modifikationen an den Aminosäuresequenzen der Glycoproteinhormone vorzunehmen, die ihre Funktion nicht zerstören.
Weiters sind funktionelle Muteine der Glycoproteinhormone beabsichtigt, chimäre Glycoproteinhormone, in welchen ein oder mehrere Reste oder Regionen eines Glycoproteinhormons, d.h. der β-Untereinheitsitzgurt, durch einen entsprechenden Reste) oder Regionen) eines anderen Glycoproteinhormons ersetzt ist, die z.B. die Rezeptorbindungsspezifität verändern. Wenige Beispiele von Resten und Regionen, die die Rezeptorbindungsspezifität, etc. beeinflussen, sind in der vorliegenden Spezifikation diskutiert.
Es ist weiters beabsichtigt, dass die Muteine der Glycoproteinhormone Einzelketten-Glycproteinhormone umfassen, in welchen die α- und β-Untereinheiten als eine Einzelkette translatiert werden und richtig in die Heterodimer-Konformation falten.
Ein Verfahren, dass verwendet werden kann, um Reste zu identifizieren, die das Potenzial besitzen, Disulfidbindungen zu bilden, ist unten dargestellt. Wie in den folgenden Beispielen demonstriert werden wird, bewahren nicht alle Disulfidbindungs-stabilisierten Heterodimere von hCG und deren Analoga ihre volle biologische Wirksamkeit. Die Einführung eines Interuntereinheit Disulfid zwischen den Cysteinknoten hat jedoch die Fähigkeit, die Proteinstabilität ohne Zerstören der Hormonwirksamkeit zu erhöhen.
Disulfidbindung-vernetzte Glycoproteinhormonanaloga gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Erzeugen freier Cysteine in jeder der Untereinheiten, welche vernetzt werden können, um eine oder mehrere Interuntereinheit-Disulfidbindungen zu bilden, erzeugt werden. Dies kann durch Austauschen der Kodons für eine oder mehrere Aminosäuren mit jenen für Cystein oder durch Austauschen des Kodons für ein Cysteinrest in einer existierenden Disulfidbindung mit einem Kodon für irgendeine andere Aminosäure erreicht werden. Es würde jedoch erwartet werden, dass nicht alle derartigen Substitutionen Interuntereinheit-Disulfidbindungen erzeugen. Zwei der Faktoren, die bei der Entwicklung der Analoga beachtet werden sollten, werden hier dargestellt.
1) Die am meisten nützlichen Disulfid-vernetzten Glycoproteinhormonanaloga werden erwartet, eine Struktur ähnlich zu der von hCG, hLH, hFSH oder hTSH zu haben. Folglich sollte das Disulfid die Gesamtkonformation des Proteins nicht grob stören. Die Lokalisationen der Disulfide, von denen erwartet wird, dass sie den geringsten störenden Einfluss auf die Proteinkonformation haben, können aus den Daten der Tabelle 1B vorausgesagt werden, die die ungefähre Distanz zwischen den Cα und Cβ Kohlenstoffatomen der ausgewählten Aminosäurereste in der α-Untereinheit von hCG (linke Spalte von jedem Paar von Spalten) und einem oder mehreren benachbarten Resten der hCG β-Untereinheit (rechte Spalte von jedem Paar von Spalten) illustriert. Diese Werte können aus der Kristallstruktur von hCG durch ein beliebiges von mehreren bekannten, weit verbreiteten und öffentlich erhältlich molekularen Modellierungspakete berechnet werden, einschließlich Sybyl, Insight, Rasmol, und Kinemage, um nur einige zu nennen. Die Entfernung zwischen Aminosäureresten in der α-Untereinheit des hCG und einem oder mehreren benachbarten Resten auf der hCG β-Untereinheit, neben jenen die Tabelle 1B gezeigt sind, kann leicht aus den veröffentlichten Kristallstrukturdaten von hCG (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994) berechnet werden. Tabelle 1B Ungefähre Abstände zwischen Cα und Cβ Kohlenstoffatome von ausgwählten hCG α- und β-Untereinheit- Resten

* [Abstand zwischen Cα Kohlenstoffen (Å), Abstand zwischen Cβ-Kohlenwasserstoffen (Å)]

Der linke Wert von jedem Wertepaar, das in den Klammern dargestellt ist, die mit jedem β-Untereinheit Rest assoziiert ist, zeigt die Distanz zwischen dem Cα Kohlenstoffatom dieses β-Untereinheitrestes und dem entsprechenden α-Untereinheitrest in der linken Spalte. Der rechte Wert von jedem Wertepaar, das in den Klammern dargestellt ist, zeigt die entsprechende Distanz zwischen den Cβ Kohlenstoffatomen dieser Reste. Grundsätzlich würde der Austausch dieser Paare von Resten mit Cysteinen die Bildung einer Interuntereinheit-Disulfidbindung ermöglichen, vorausgesetzt, dass kein anderes interferierendes Cystein in beiden Untereinheiten vorhanden war. Nicht alle Cysteinpaare würde eine gleiche Wahrscheinlichkeit aufweisen, ein Interuntereinheit Disulfid zu bilden. Die Bildung eines Interuntereinheit Disulfids, von dieser erwartet wird, den geringsten Einfluss auf die Konformation des Heterodimers zu haben, würde durch die Orientierung der Seitenkettenatomen von ihren Komponent-Cysteinen beeinflusst werden. Günstige und bevorzugte Positionen für das Platzieren von Disulfiden würden Aminosäurepaare enthalten in welchen die Distanz zwischen Cβ Kohlenstoffatomen kleiner ist, als zwischen Cα Kohlenstoffen. Die günstigsten und am meisten bevorzugten Lokalisationen für die Platzierung einer Interuntereinheit-Disulfidbindung sind jene, in welchen die Entfernungen zwischen den Cα und Cβ Kohlenstoffen ähnlich zu jenen in natürlich vorkommenden Disulfiden sind, nämlich etwa 5,0-6,0 Å bzw. etwa 3,5-4,2 Å.
Somit würde von Substitutionen erwartet werden, die ein Interuntereinheit-Cysteinpaar mit Cα Kohlenstoffatome, die 4-8 Å auseinander sind, und Cβ Kohlenstoffatomen erzeugen, die 1-2 Å näher sind, erwartet werden, die beste Chance zu haben, ein Disulfid mit dem, geringsten Einfluss auf die Gesamtproteinstruktur zu bilden und/oder die intermolekulare Vernetzung von zwei oder mehreren Molekülen zu fördern. Tatsächlich wurden diese Faustregel gemäß der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen gezeigt ist, erfolgreich verwendet, um mehrere Disulfid-vernetzte hCG Analoga zu erzeugen, die viele ihrer immunologischen und hormonellen Eigenschaften behalten.
2) Es würde erwartet werden, dass die am meisten aktiven Disulfid vernetzten Glycoproteinhormonanaloga, die Vernetzung an Stellen enthalten, die nicht für die Rezeptorbindung oder Signaltransduktion benötigt werden und/oder an Stellen, die nicht für die Stabilisierung der aktiven Konformation des Hormons benötigt werden. Es gibt eine große Zahl von Resten in Glycoproteinhormonen, die bekannt sind, dass sie für ihre biologischen Aktivitäten nicht benötigt werden. Zu diesen zählen die meisten Reste, die N-Terminal zu dem Cysteinknoten liegen (d.h. das zweite Cystein in der nativen α-Untereinheit und das erste Cystein in den nativen β-Untereinheiten). Zum Beispiel wurden hochwirksame Analoga von hFSH hergestellt, in welchen diese FSH β-Untereinheitreste (Asn1, Ser2) mit ihren hCG Gegenstücken (Ser1, Lys2, Glu3, Pro4, Leu5, Arg6, Pro7, Arg8) ersetzt wurden. Somit würde nicht erwartet werden, dass ein Disulfid in dieser Region des Moleküls, welches durch Austauschen des hCG α-Untereinheit Gln5 und des β-Untereinheit Arg 8 mit Cysteinen hergestellt wurde, die LH-Aktivität des Disulfid-vernetzten Heterodimers eliminiert. Ähnlicherweise würde nicht erwartet werden, dass ein Disulfid, welches durch Austauschen des hFSH α-Untereinheit Gln5 und des β- Untereinheit Ser2 mit Cysteinen hergestellt wurde, die FSH-Aktivität des Disulfid-vernetzten Heterodimers eliminiert. Durch Ändern des α-Untereinheit Cys31 zu Ala oder Ser und durch Austauschen des hCG β-Untereinheit Arg6 mit Cys oder Hinzufügen eines Cys zu den N-Terminus der FSH β-Untereinheit, wird erwartet, dass ein Disulfid in der N-terminalen Region der α- und β-Untereinheiten von hCG oder hFSH erzeugt werden könnte. Dieses Disulfid würde nicht erwartet werden, die Aktivität von beiden Hormonanaloga zu stören.
Die Kristallstruktur von hCG offenbarte, dass jede ihrer Untereinheiten aus einem Cysteinknoten aufgebaut ist. Somit enthält jede Untereinheit drei Schleifen, die als α1, α2, α3, und β1, β2, β3 bezeichnet werden. Zusätzlich hat die β-Untereinheit 20 zusätzliche Aminosäuren, die als der Sitzgurt bekannt sind, der α2 umgibt, um das Heterodimer zu sichern und in einer Konformation zu stabilisieren, die in der Lage ist, an seinen einzigartigen Rezeptor zu binden. Die Lokalisationen der Cysteine in Lutropinen, Follitropinen, und Thyrotropinen weisen darauf hin, dass alle drei Moleküle ein ähnliches Gesamtfaltungsmuster aufweisen und dass die Kristallstruktur von hCG ein angemessener Führer sein wird, um Interuntereinheit Disulfide einzuführen. Die Strukturen von FSH und TSH wurden jedoch nicht bestimmt und können nur von der von hCG abgeleitet werden. Jede der Kristallstrukturen der Cysteinknoten jeder Untereinheit zeigen sehr ähnlich zu sein. Dies ist, da sie durch ihre drei Komponenten-Disulfidbindungen stark eingeschränkt sind. Somit wird erwartet, dass die Reste innerhalb und der Cysteinknoten und an diese angrenzende Reste in jedem Hormon ähnliche Konformationen aufweisen. Weiters gibt es ein Cystein in den Schleifen β1 und β3 an ähnlichen Positionen in allen drei Klassen von Hormonen. Diese bilden ein Disulfid in hCG und es würde erwartet werden, dass ein Disulfid in allen Glycoproteinhormonen gebildet wird. Dieses Disulfid und die erhebliche Anzahl von Wasserstoffbindungen innerhalb und zwischen den Rückgrat-Atomen in diesen Schleifen von hCG weist darauf hin, dass die Konformationen von β1 und β3 in allen drei Hormonklassen sehr ähnlich sein werden. Die Schleifen α1 und α3 enthalten ebenfalls mehrere Wasserstoffbindungen, was darauf hinweist, dass dieser Abschnitt des Moleküls ebenfalls in allen drei Hormonklassen ähnlich sein wird. Diese Ansicht wird durch die Beobachtung unterstützt, dass eine NMR-Struktur der freien α-Untereinheit zeigt, dass α1 und α3 ähnliche Konformationen aufweisen, selbst wenn nicht im Heterodimer (DeBeer, et al, 1996). Obwohl die restlichen Abschnitte von allen drei Hormonklassen in Konformation ziemlich sicher ähnlich sind zu der von hCG, sind sie wahrscheinlich nicht so eng verwandt zu der Struktur von hCG wie die Abschnitte der gerade diskutierten Moleküle. Zum Beispiel enthält β2 relativ wenig interne Wasserstoffbindungen und/oder Kontakte mit α1 und α3. Da es in hCG nicht stark beschränkt zu sein scheint, gibt es keinen Grund, zu glauben, dass seine Struktur völlig identisch sein wird, zu der in den anderen Hormonen. Tatsächlich ist die Schleife β2 in TSH 2 Aminosäurereste länger, als in hCG oder hFSH. Die N- und C-terminalen Enden von α2 nehmen in umfangreichen Wasserstoff-Bindungskontakten teil und Abschnitte des C-terminalen Endes von α2 kontaktieren ebenfalls β1. Somit könnten diese Teile von α2 in den meisten Hormonen ähnlich sein. Der zentrale Abschnitt von α2 kontaktiert jedoch nur den Sitzgurt, einer Region des Proteins, die in den drei Hormonklassen nicht gut konserviert ist. Die NMR-Struktur der α-Untereinheit zeigte, dass α2 stark ungeordnet ist, eine Beobachtung, die darauf hinweist, dass dieser Teil des Hormons in hCG eine gut-geordnete Struktur in dem Heterodimer aufweist, nur weil es zwischen β1, und β3 und dem Sitzgurt eingepfercht ist. Es würde erwartet werden, dass Unterschiede in dem Sitzgurt, die Konformation von α2, insbesondere jenen Abschnitten, die nicht in der Nähe des Cysteinknotens lokalisiert sind, ändert.
Die Einblicke in den Einfluss des Sitzgurtes auf die Hormonstruktur wurden durch den vorliegenden Erfinder unter Verwendung von immunologischen Sonden erhalten, um hCG-Analoga zu studieren, die die Fähigkeit besitzen, an Lutropin und Follitropin Rezeptoren zu binden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Zusammensetzung des Sitzgurtes die Konformation des Hormons ändern kann. Ähnliche Daten weisen ebenfalls darauf hin, dass die Konformation des Hormons durch den Rezeptor beeinflusst werden kann. Zum Beispiel wurden monoklonale Antiköper, dessen Bindungsstellen teilweise bestimmt wurden (Moyle et al, 1990; Moyle et al, 1995) verwendet, um die Konformation eines bifunktionalen hCG-Analogons (CF101-109) zu studieren, wenn es frei ist und wenn es an LH und FSH Rezeptoren gebunden ist. CF101-109 wurde durch Ersetzen der hCG-Sitzgurtreste 101-109 mit den hFSH-Sitzgurtresten 95-103 hergestellt (Moyle et al, 1994). Die Fähigkeiten von CF101-109 durch monoklonale Antikörper erkannt zu werden, zeigten, dass die Gegenwart der FSH-Reste im Sitzgurt, die Interaktion zwischen den zwei Untereinheiten änderte. Somit hatte A407, ein Antikörper gegen ein konformatives Epitop, welches Reste am N-terminalen Ende der α-Untereinheit in hCG nicht jedoch hFSH, enthielt, eine stark reduzierte Affinität für CF101-109, obwohl sein Epitop von der Mutationsstelle entfernt ist (Tabelle 1C). Der Einfluss des Rezeptors auf die Hormonstruktur wurde durch die Tatsache erkannt, dass A407 CF101-109 erkannte, wenn es an LH-Rezeptoren gebunden war, nicht jedoch wenn es an FSH-Rezeptoren gebunden war (Tabelle 1D). Andere Antikörper, die Epitope erkennen, die vollständig innerhalb von al und/oder α2 oder innerhalb von β1 und/oder β3 lokalisiert sind, erkannten CF101-109, sogar dann, wenn es mit Rezeptoren kombiniert war.
Zusammengenommen weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass die Positionen der Untereinheiten innerhalb der Hormone nicht identisch sein können und durch Interaktionen mit ihren Rezeptoren beeinflusst werden können. Deshalb hat der vorliegende Erfinder bestimmt, dass zusätzlich zum Betrachten der relativen Lokalisationen und Orientierungen von potentiellen Cystein-Substituenten, die von der Kristallstruktur von hCG erhalten wurden, sollte auch die Wahrscheinlichkeit beachtet werden, dass die Kristallstruktur von hCG, die Strukturen von Follitropinen und Thyrotropinen und/oder die Konformation des Hormons in dem Hormon-Rezeptorkomplex repräsentieren wird. Zu den Abschnitten der Hormone, die am ehesten identisch zu jenen von hCG und wenigstens wahrscheinlich sind, während der Rezeptorinteraktion verändert zu werden, zählen jene, die in dem Cysteinknoten oder in der Nähe von Resten in dem Cysteinknoten sind. Tabelle 1C Erkennung von hCG, hFSH und hCG/hFSH-Chimäre durch Anti-hCG-α-Untereinheit-Antkörper
Bemerkungen: Die Chimären wurden durch die Reste von hCG identifiziert, die durch jene von hFSH ersetzt wurden. Somit bezieht sich CF94-97 auf ein Analogon, in welchem die hCG β-Untereinheit-Reste 94-97 durch ihre FSH Gegenstücke ersetzt sind. hCGβ-Untereinheit-Reste 94-97 sind in der kleinen Sitrgurtschleife; 101-109 sind in der Carboxy-terminalen Hälfte des Sitrgurtes; 94-117 sind in der kleinen Sitrgurtschleife, Carboxy-terminalen Hälfte des Sitrgurtes, und Carboxy-Terminus; und 39-58 sind in Schleife 2 und dem ersten Rest von Schleife 3. hCG und Chimären wurden mit B112 (obere Linie) und B410 (untere Linie) eingefangen. hFSH wurde durch Antikörper B602 eingefangen. Die Werte bedeuten den Mittelwert von Dreifachbestimmung und werden in Bezug auf hCG (als 100% gezeigt) normalisiert. NurA105 und A407 binden auch an hCG, wenn es mit LHR komplexiert ist (Moyle et al, 1995).
Tabelle 1D Bindung von radiomarkierten Antikörpern an hCG oder CF101-109, die mit Ratten LHR oder menschlichen FSHR komplexiert sind
Bemerkungen: Ligand-Rezeptor-Komplexe wurden gebildet und dann unter Verwendung von radiomarkierten monoklonalen Antikörpern, wie im Text beschrieben, detektiert. Die illustrierten Werte (Mittelwert einer Dreifachbestimmung ± SEM) sind cpm minus dem Blindwert. In den meisten Fällen wurden die Daten für die Bindung an LHR und FSHR im selben Experiment erhalten (identifiziert durch die Nummer in der linken Spalte). „Verhältnis zu B105" wurde durch Dividieren der Menge an Radiomarkierung, die mit jedem Antikörper gesehen wird, dividiert durch jene, die mit B105 erhalten wird und Nehmen des Mittelwerts dieser Werte, berechnet. Alle Werte, mit Ausnahme jener für die Bindung von A407 an CF94-117 und CF101-109, die an FSHR gebunden sind, sind größer als 0 (p < 0,05).
Die Region zwischen den gebundenen Cysteinknoten ist eine der am meisten attraktiven Stellen für das Herstellen einer Disulfidbindung und ist eine bevorzugte Stelle für eine Interuntereinheit-Disulfidbindung. Der Cysteinknoten jeder Untereinheit wird durch drei Disulfide stabilisiert, was es zu einem der starrsten Teile des Moleküls macht. Die Ergebnisse des Labors des vorliegenden Erfinders deuten an, dass das Ändern des hCG β-Untereinheitrestes Tyr37 relativ wenig Einfluss auf die Hormonaktivität hatte. Somit wird durch den vorliegenden Erfinder nicht erwartet, dass die Gegenwart eines Cysteins an dieser Stelle, die Hormonaktivität verändert. Das Kanadische Patent CA 2188508 offenbart nicht, dass ein Interuntereinheit- Disulfid zwischen den Cysteinknoten der α- und β-Untereinheit, ein Gonadotropin Heterodimer stabilisieren würde und die Hormonaktivität beibehält. Wie in den vorliegenden Beispielen gezeigt ist, wie dies erreicht werden kann, ist das Ersetzen des α-Untereinheitrestes Cys7 mit Ala oder Ser, um das Cys7-Cys31 Intrauntereinheit Disulfid zu stören, und Ersetzten des hCG β-Untereinheit Tyr37 mit Cys. Das vernetzte Analogon von hCG, das erzeugt wurde, hatte eine hohe LH-Aktivität. Ähnlicherweise in einem anderen nicht einschränkenden Beispiel, war es möglich, ein vernetztes Analagon von CFC101-114, einer hCG/hFSH Chimäre, in welcher die hCG β-Untereinheit-Aminosäurereste 101-114 durch ihre hFSH Gegenstücke (d.h. β-Untereinheitreste 95-108) ersetzt wurden, herzustellen. CFC101-114 bindet und aktiviert sowohl LH und FSH Rezeptoren. Das Disulfid-vernetzte-Analogon war ebenfalls in der Lage, sowohl LH und FSH Rezeptoren zu binden und zu aktivieren. Die letztere Beobachtung zeigt, dass dieses Disulfid die FSH Rezeptoraktivität nicht verhindert, was es wahrscheinlich macht, dass ein ähnliches Disulfid in hFSH, ebenfalls seine hormonale Aktivität nicht zerstören würde. Die Herstellung eines Disulfid-vernetzten hFSH konnte durch co-exprimieren der α-Untereinheit cDNA, in welcher Cys7 zu Ala umgewandelt ist, und der hFSH β-Untereinheit cDNA, in welcher Tyr31 zu Cys umgewandelt ist, erreicht werden. Eine Disulfidbindung zwischen den Cysteinknoten kann auch mit anderen Interuntereinheit-Disulfidbindungen an anderer Stelle, wie zwischen α-Schleife 2 und β-Sitzgurt oder zwischen α-N-Terminus und β-Endterminus, als eine bevorzugte Ausführungsform, auftreten. Weiters würde die Disulfidbindungen, die zwischen Cys-Knoten der α- und β-Untereinheiten gebildet sind, einen Rest in der Nähe des N-Terminus, d.h. αCys7Ser, freisetzen, der vorteilhafterweise für eine PEGylierung verwendet werden kann.
Eine Interuntereinheit-Disulfidbindung, die zwischen den Cysteinknoten der α- und β-Untereinheiten lokalisiert ist, kann ebenfalls in die allgemeine Regel zum Minimieren des potenziellen Einflusses der Interuntereinheit Verbindungen auf die Hormonstruktur durch Platzieren beider Verbindungspositionen innerhalb von zwei Resten von existierenden (nativen) Cysteinen, die in nativen Disulfidbindungen eingebunden und nicht außerhalb, d.h. ferner N-Terminal oder C-Terminal des am meisten N-Termial oder C-Terminal nativen Cysteins (die äußerste Cysteinheit der entsprechenden nativen Untereinheit) als ein Mittel, um das Risiko von strukturellen Störungen zu minimieren, passen. Keines der im kanadischen Patent CA 2188508 offenbarten und gelehrten Intreruntereinheit-Disulfiden, passt in diese allgemeine Regel.
Hormonanaloga, die durch ein Disulfid zwischen α-Untereinheitschleife 1 oder 3 und β-Untereinheitsschleife 2 vernetzt sind, die nicht der allgemeinen Regel, die oben beschrieben ist, folgen, würden ebenfalls erwartet werden, die Hormonaktivität beizubehalten. Diese Regionen sind stark für Aminosäuresubstitiutionen empfänglich. Somit wird der Austausch der humanen α-Untereinheit in hCG oder hFSH mit der bovinen α-Untereinheit üblicherweise nicht die Hormonaktivität eliminieren, obwohl die bovine und humane α-Untereinheit in dieser Region sich stark unterscheiden. Ähnlicherweise eliminierte die Massensubstitution von hFSH-Resten für hCG-Reste und umgekehrt in der β-Untereinheitschleife 2 die Aktivität von beiden Hormonen nicht. Es würde somit nicht erwartet werden, dass Disulfide in dieser Region die biologische Aktivität von entweder Lutropinen oder Follitropinen stört. Zu diesen Disulfiden zählen jene, die durch Ändern des α-Untereinheit Gln27 und hCG oder hLH β-Untereinheit Val44 oder hFSH β-Untereinheit Val38 zu Cys erzeugt wurden. Sie beinhalten auch Disulfide, die durch Ändern des α-Untereinheit Val76 und hCG β-Untereinheit Val44 oder hFSH β-Untereinheit Val38 zu Cys erzeugt wurden. Ein anderes Interuntereinheit-Disulfid vernetztes Analogon, von dem erwartet wird, eine wesentliche Aktivität beiinhalten, ist eines, in dem der α-Untereinheitrest Lys75 und hCG oder hLH β-Untereinheitrest Gln46 oder hFSH β-Untereinheitrest Lys40 in ein Cystein umgewandelt ist. Das letztere Analogon würde jedoch weniger stark positiv geladen sein, als entweder hCG oder hFSH und somit könnte ihre Gesamt-LH oder FSH Aktivität gering sein. Es ist weiters möglich, Interunter-Disulfide in andere Regionen von Lutropinen und Follitropinen einzuführen. Einige dieser Disulfide schließen Reste in dem β-Untereinheitsitzgurt (d.h, die durch Substitution von hCG β-Untereinheit Asp99 durch Cys erzeugt wurden) und der α-Untereinheitschleife 2 (d.h. die durch Substitution von α-Untereinheit Lys51 mit Cys erzeugt wurde) ein. Dieses Disulfid reduzierte die LH-Aktivität von hCG und die LH und die FSH Aktivitäten des bifunktionalen Analogons CFC101-114 signifikant. Die Lokalisation der Reste in hLH, hFSH, und hTSH, die zu Cystein mit der Erwartung eine Disulfidbindung zu erzeugen, mutiert werden können, können von den „äquivalenten" Lokalisationen der α- und β-Untereinheitsreste in diesen Proteinen, wie in Tabelle 2-4 definiert ist, bestimmt werden.
Die Information in Tabelle 2 kann verwendet werden, um Reste, die „äquivalente" Positionen in jeder humanen Hormon β-Untereinheit zu berechnen. Kristallstrukturen sind nur für hCG verfügbar. Aufgrund der hohen Ähnlichkeiten in den Aminosäuresequenzen von allen Glycoproteinhormonen, insbesondere ihrer Intrauntereinheit-Disulfiden, wird jedoch erwartet, dass alle Hormone ähnliche Formen haben werden. Die Schlussfolgerung, dass die Gesamtkonformation von allen Heterodimeren ähnlich ist zu der von hCG, wird ebenfalls durch die Beobachtung unterstützt, dass es möglich ist, hCG/hFSH, hCG/hLH, und hCG/hTSH Chimäre herzustellen, die Epitope bewahren, die in Regionen ihrer Vorläufer gefunden werden, die verwendet wurden, um die Chemäre abzuleiten. Es wird somit erwartet, dass Substitution der äquivalenten Reste, wie in dieser Tabelle definiert ist, zu Interuntereinheit-Disulfidbindungen führen, die ähnliche Eigenschaften zu jenen haben, die hergestellt und charakterisiert wurden. „Äquivalente" Positionen sind in einer vertikalen Achse definiert. Somit ist Cystein 3 in der hFSH β-Untereinheit äquivalent zu Cystein 9 in der hCG β-Untereinheit.
Die Information in Tabelle 3 kann verwendet werden, um Reste, die „äquivalente" Positionen in jeder Hormon α-Untereinheit besetzen, zu berechnen. Die Kristallstruktur von hCG ist die Einzige, die berichtet ist. Aufgrund der hohen Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenzen von allen Glycoproteinhormonen, insbesondere ihrer Interuntereinheit-Disulfiden, wird erwartet, dass die Hormone aller Spezies ähnliche Formen haben werden. Diese Idee wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass es möglich ist, humane/bovine α-Untereinheit Chimäre zu erzeugen, die Epitope bewahren, die in Regionen ihrer Vorläufer gefunden werden, die in den Chimären gefunden werden. Es wird somit erwartet, dass Substitutionen von äquivalenten Resten, wie in dieser Tabelle definiert ist, zu Intrauntereinheiten-Disulfidbindungen führen, die ähnliche Eigenschaften zu jenen haben, die gemacht und charakterisiert worden sind.
Die Information in Tabelle 4 kann verwendet werden, um Reste, die „äquivalente" Positionen in jeder der Wirbeltier β-Untereinheiten besetzen zu berechnen.
Die Beispiele in der vorliegenden Erfindung lehren, wie Disulfidbindungen in Glycoproteinhormone und Analoga, die in der Lage sind, an LH, FSH und/oder TSH-Rezeptoren binden, eingeführt werden können. Die Gegenwart von Interuntereinheit-Disulfidbindungen erhöhte die Stabilität von hCG und einem hCG Analogon, das eine signifikante FSH und TSH Aktivität aufweist. Es würde somit erwartet werden, dass die Addition von Interuntereinheit Disulfiden auch andereMitglieder und verwandte Analoga dieser Hormonfamilie stabilisieren würde. Wenn sie an Hormonstellen lokalisiert sind, die nicht zu Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität eingebunden sind, verhindern die Disulfide die Hormonfunktion nicht. In der Tat können einige Interuntereinheit Disulfide die Funktion von Hormonanaloga verstärken. Mit einer Ausnahme (Blithe et al, 1991), sind die Hormon-Untereinheiten nahezu ohne Endokrin-Aktivität. Somit ist es wahrscheinlich, dass Verfahren, die das Heterodimer stabilisieren, die biologischen Aktivitäten dieser Hormone ausdehnen und es würde erwartet werden, ihren therapeutischen Nutzen zu erhöhen.
Das Verfahren zum Verbessern der Stabilität von heterodimeren Glycoproteinhormonen gemäß der vorliegenden Erfindung schließt das Identifizieren von Resten ein, welche ersetzt werden können, um freie Cysteine in jeder der Untereinheiten zu erzeugen, wobei die freien Cysteinen ein hohes Potenzial aufweisen, eine Interuntereinheit-Disulfidbindung zu bilden, die die Stabilität des Heterodimers, ohne Zerstören der Gesamtformation des Hormonproteins, verbessern würde. Das Ersetzen von Resten, um freie Cysteine in jeder Untereinheit zu erzeugen, kann auf der genetischen Ebene durch Ersetzten der entsprechenden Kodons in den Nukleotidsequenzen der α- und β-Untereinheiten erreicht werden.
Wirtszellen, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind, die modifizierte Nukleotidsequenzen tragen, die α- und β-Untereinheiten kodieren, die wirkungsmäßig mit einer Promotorsequenz verbunden sind, und in der Lage sind, das modifizierte Glycoprotein zu exprimieren, werden kultiviert, und das modifizierte Glycoproteinhormon, welches als das Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung genannt, wird exprimiert. Das exprimierte Glycoproteinhormon Analogon wird dann gewonnen und gemäß Techniken, die im Fachgebiet der Glycoproteinhormon-Reinigung bekannt sind, gereinigt.
Auf der genetischen Ebene, werden Glycoproteinhormon-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung durch jede geeignete ortsgerichtete Mutagenese, die dem Stand der Technik bekannt ist, erzeugt, wie in Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications und Whiley Interscience (New York, 1987-1997), Kapitel 8 über Mutagenese von klonierter DNA, beschrieben ist. Diese Current Protocols in Molecular Biology Publikation, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, ist ein Beispiel eines Standardreferenztextes, der die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie darlegt.
Die Nukleotidsequenzen, die die α- und β-Untereinheiten des Glycoproteinhormon-Analogons, wie in einem rekombinanten DNA-Molekül enthalten ist, kodieren, können in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, die in der Lage sind, die Analoga in Wirtszellen zu exprimieren, um in der Lage zu sein, dass Glycoproteinhormon Analogon zu exprimieren, sollte ein Expressionsvektor spezifische Nukleotidsequenzen enthalten, die transkriptionale und translationale regulatorische Informationen enthalten, die an die DNA, die die Untereinheiten kodiert, auf eine Art gebunden sind, um die Genexpression und Herstellung des Glycoproteinhormon-Analogon zu ermöglichen. Erstens, um das Gen zu transkribieren, muss diesem ein Promotor vorangehen, der durch eine RNA Polymerase erkennbar ist, an welchen die Polymerase bindet und somit den Transkribitonsvorgang initiiert.
Eine DAN gilt als „in der Lage zum Exprmieren" eines Polypeptids, wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die transkriptionale und translationale regulatorische Informationen enthalten und solche Sequenzen sind „wirkungsmäßig" an Nukleotidsequenzen „gebunden", welche das Polypeptid kodieren. Eine wirkungsmäßige Bindung ist eine Bindung, in welcher die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenzen die zu exprimieren sind, derart verbunden sind, um eine Genexpression zu ermöglichen. Die für die Genexpression benötigten regulatorischen Regionen enthalten im Allgemeinen eine Promotorregion sowie die DNA-Sequenzen, welche, wenn in eine RNA transkribiert, die Einleitung der Proteinsythese signalisieren werden. Solche Regionen werden normalerweise jene 5'-nicht-kodierenden Sequenzen enthalten, die an der Einleitung der Transkription und Translation beteiligt sind. Es gibt eine Reihe von Promotoren in Allgemeiner Verwendung für die Proteinexpression auf hohem Niveau in Säugetier- und Insektenzellsystemen.
Die rekombinanten DNA-Moleküle, die die Nukleotidsequenzen, die die α- und β-Untereinheiten der Analoga der Erfindung kodieren, und die wirkungsmäßig verbundenen transkriptionalen und translationalen, regulatorischen Signale enthalten, können in einen Vektor oder Vektoren eingefügt werden, die entweder die Untereinheiten in Wirtszellen vorübergehend exprimieren, oder in der Lage sind, die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellen-Chromosom zu integrieren. Um in der Lage zu sein, die Zellen zu selektieren, die die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosome integriert haben, werden ein oder mehrere Marker, die die Selektion der Wirtszellen, die den Expressionsvektor enthalten, ermöglichen, verwendet. Der Marker kann eine Prototropsie einem auxotrophen Wirt, Brozidresitenz, z.B. Resistenz gegen Antibiotika, oder Schwermetalle, wie Kupfer oder dergleichen, vorsehen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt an die zu exprimierenden DNA-Gensequenzen gebunden sein, oder in dieselbe Zelle durch co-Transfektion eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können ebenfalls für die optimale Synthese von nRNA benötigt werden. Zu diesen Elementen zählen Spleißsignale, sowie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationsignale. Zu cDNA Expressionsvektoren, die solche Elemente beinhalten, zählen jene die in Okayama (1983) beschrieben sind.
Expressionsvektoren, die in der Lage sind, das gewünschte Protein in einer hohen Konzentration vorübergehend zu exprimieren, wenn es in eukaryotische Wirtszellen transfiziert ist, sind im Stand der Technik bekannt und sind im Allgemeinen öffentlich zugänglich oder von Molekularbiologie-Lieferanten kommerziell erhältlich (z.B. Plasmid pcDM8, ist von Invitrogen erhältlich, San Diego, CA; pSVL ist von Pharmacia erhältlich, Piscataway, NJ; pCI ist von Promega, Madison, WI erhältlich; etc.). Sobald der Vektor oder DNA-Sequenz, die die Konstrukte enthalten, für die Expression hergestellt wurden, kann der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle durch irgendeine Vielfalt von geeigneten Mitteln, wie Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Kalziumphosphat
Präzipitation, direkte Microinjektion, etc., eingeführt werden. Eukaryotische Wirtszellen können Säugetierzellen, z.B. menschliche Zellen, Affen (COS Zellen), Maus und chinesische Hamsterovarien (CHO) Zellen sein, da sie posttranslatorische Modifikationen an dem Proteinmolekül bereitstellen, einschließlich der richtigen Faltung, der korrekten Disulfidbildung sowie Glycosylierung an korrekten Stellen.
Insektenzellen, z.B. Baculovirus, können jedoch Polypeptide überproduzieren und können auch post-translatorische Modifikationen, einschließlich Glycosylierung durchführen. Die ekotopische Proteinexpression in COS, CHO und Insektenzellen ist im Stand der Technik bekannt und Protokolle, wie jene die in Ausubel et al, (1987-1997), Abschnitte 16.9-16.14 über die Expression von Proteinen in Insektenzellen mittels Baculoviren Vektoren und in Säugetierzellen bereitgestellt sind, können entsprechend verwendet werden. Die transformierten Wirtszellen, die die α- und β-Untereinheiten eines Glycoproteinhormonanalogons exprimieren, können kultiviert werden, um das Analogon zu erzeugen.
Die transformierten Wirtszellen, die die α- und β-Untereinheiten eines Glycoproteinhormonanalogons exprimieren, können kultiviert werden, um das Glycoproteinhormonanalogon zu erzeugen, welches dann gewonnen wird und gemäß gewöhnlicher und bekannter Reinigungsverfahren für Glycoproteinhormone gereinigt Die Menge an erzeugtem Glycoproteinhormon kann durch ein Verfahren, wie das in Beispiel 1 beschreibene Sandwich-Immunountersuchungsverfahren quantifiziert, konfisziert werden.
Weiters können die Untersuchungen für das Bestimmen der Rezeptoraffinität und der biologischen Aktivität der Glycoproteinhormonanaloga der vorliegenden Erfindung, wie die Radioligandrezeptor- und Signaltransduktion- (Messen der Fähigkeit, an den Rezeptor zu binden, um eine zyklische AMP Akkumulationsreaktion auszulösen) Untersuchungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, leicht ohne unnötige Experimentierung durchgeführt werden.
Die Glycoproteinhormonanaloga gemäß der folgenden Erfindung besitzen mehrere therapeutische Anwendungen. Analoga von hFSH können verwendet werden, um die Entwicklung von Eierstockfollikel als Vorbereitung der Ovulationsinduktion in Frauen auszulösen. Analoga von hLH und hCG können verwendet werden, um und die Ovulation von Follikeln, die die Entwicklung eingeleitet haben, zu induzieren. Diese Analoga können ebenfalls verwendet werden, um die Hodenfunktion in Männern auszulösen Weiters können die Glycoproteinhormonanaloga gemäß der vorliegenden Erfindung als Immunogene verwendet werden, um Antisera auszulösen, um die Fertilität einzuschränken, z.B. Verhütungsmittel-Vakzin. Im Gegensatz dazu könnten Antagonist-Analoga oder Antikörper gegen Glycoproteionhormon-Analoga verwendet werden, um die Fertilität zu fördern, wie wenn überhöhte hLH-Konzentration in einigen Frauen mit polyzytischen Eierstockerkrankung aufscheinen. Ein Glycoproteinhormonanalogon mit verbesserter Stabilität, welches die biologische Aktivität und Funktion beibehält, z.B. Affinität für Glycoproteinhormonrezeptoren und Hormonwirksamkeit, wie in den Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung, sind sehr nützlich. Nicht nur sind die Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung für spezifische Therapeutische Zwecke nützlich, sondern bieten diese Analoga auch die besseren Eigenschaften einer funktionellen Stabilität in Lösung und gegenüber erhöhten Temperaturen, Resistenz gegen Proteindenaturierungsmittel, wie Harnstoff etc. Aufgrund dieser Stabilitätseigenschaften wird erwartet, dass die Analoga der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Halbwertszeit in vivo haben würden.
Die Glycoproteinhormonanaloga der vorliegenden Erfindung können einen Patienten, der es benötigt, durch irgendein Mittel, das den beabsichtigten Zweck errreicht, verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung durch eine Vielzahl von unterschiedlichen parenteralen Routen einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, auf subkutanem, auf intravenösem, auf intradermalem, auf intramuskulärem, auf intraperitonalem, auf intranasalem, auf oralem, auf transdermalem, oder auf bukkalem Weg erfolgen. Die parenterale Verabreichung kann eine Bolusinjektkion sein oder durch graduelle Infusion mit der Zeit erfolgen.
Ein typischer Behandlungsplan für das Verhindern, Unterdrücken, oder Behandeln eines Zustandes, der mit Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Ablagerungen in Verbindung steht, weist die Verabreichung einer wirksamen Menge in einer oder mehreren Dosen über eine Zeitdauer bis zu und einschließlich mehreren Monaten bis mehreren Jahren auf.
Es ist verständlich, dass die verabreichte Dosierung von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und dem Gewicht des Empfängers, der Art einer gleichzeitigen Behandlung, wenn überhaupt, der Häufigkeit der Handlung, und der Art des gewünschten Effekts abhängen wird. Die für jede Behandlung benötigte Gesamtdosis kann durch Mehrfachdosen oder in einer Einzeldosis verabreicht werden. Durch „ effektive Menge", wird eine Konzentration des Glycoproteinhormonanalogons gemeint, welche in der Lage ist, den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Solche Konzentrationen können routinemäßig durch einen Fachmann bestimmt werden.
Zu Zubereitung für die parenterale Abweichung zählen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, welche Hilfsstoffe oder Excipienten enthalten können, die im Stand der Technik bekannt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Glycoproteinhormonanaloga der vorliegenden Erfindung enthalten, schließen alle Zusammensetzungen ein, wobei die Analoga in einer Menge enthalten sind, die wirksam ist, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Zusätzlich können pharmazeutische Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch-akzeptable Träger, die Excipienten und Hilfstoffe enthalten, welche die Verarbeitung der aktiven Wirkstoffe in Zubereitungen fördern, die pharmazeutisch verwendet werden können, enthalten. Geeignete pharmazeutische-akzeptable Vehikel sind im Stand der Technik bekannt und z.B. in Alfons Gennaro, Herausgeber, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co. (Easton, PA, 1990), einem Standardreferenztext auf diesem Gebiet, beschrieben.
Pharmazeutisch akzeptable Vehikel können gemäß der Verabreichungsart und der Löslichkeit und Stabilität der Glycoproteinhormonanaloga ausgewählt werden. Zum Beispiel können Formulierungen für die intravenöse Verabreichung sterile wässrige Lösungen enthalten, die ebenfalls Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten
Geeignete Formulierungen für die parenterale Verabreichung beinhalten wässrige Lösungen des aktiven Wirkstoffes in wasserlöslicher Form, z.B., wasserlöslichen Salzen. Zusätzlich können Suspensionen des aktiven Wirkstoffes als geeignete ölige Suspensionen verabreicht werden. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln zählen Fettöle, z.B.
Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, z.B. Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen, die Substanzen enthalten können, die die Viskosität der Suspension erhöhen, enthalten, zum Beispiel, Natriumcarboxylmethylzellulose, Sorbitol und/oder Dextran.
Gegebenenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten. Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche nur zur Illustration bereitgestellt sind, und nicht dafür bestimmt sind, die vorliegende Erfindung einzuschränken besser verstanden werden.
Gemäß den Kriterien für die Interuntereinheit-Vernetzung durch Disulfidbindungen, weisen die Daten der Tabelle 1B darauf hin, dass es möglich sein würde, ein Analogon von hCG herzustellen, welches durch ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen seinen Cysteinknoten stabilisiert ist, wenn ein freien Cystein an dem α-Untereinheit-Rest 31 erzeugt werden würde und wenn das β-Untereinheit Tyr37 durch Cystein ersetzt werden würde. Diese wurde durch Herstellen eines Analogon der hCG β-Untereinheit, in welcher das Tyr37 durch Cys ersetzt wurde und eines Analogon der humanen α-Untereinheit, in welcher das Cys7 durch Ser ersetzt wurde, erreicht. Diese letztere Änderung zerstörte das Disulfid, welches normalerweise in der α-Untereinheit zwischen den Aminosäuren Cys7 und Cys31 gefunden wird, wodurch das freie α-Untereinheit-Cystein bei Rest 31 für das Bilden einer Disulfidbindung mit dem β-Untereinheit-Cystein, welches bei Rest 37 eingeführt ist, verfügbar hinterlassen wird. Wenn jedes dieser Untereinheit-Konstrukte in kultivierten Säugetierzellen exprimiert wurde, bildeten die Cysteine der α-Untereinheit bei Rest 31 und der β-Untereinheit bei Rest 37 ein Interuntereinheit-Disulfidbindung.
Die Bildung der Disulfidbindung erhöhte dramatisch die Stabilität des Heterodimers. Im Gegensatz zu hCG, dissoziierte das vernetzte Heterodimer in der Gegenwart von Harnstoff oder niederem pH nicht. Die Fähigkeit von hCG (α31-β37), durch die meisten monoklonalen Antikörper erkannt zu werden, an LH Rezeptoren zu binden, und die Signaltransduktion auszulösen, war jedoch ähnlich zu der von hCG. Dies zeigte, dass das Vorhandensein der Disulfidbindung, die Hormonfunktion nicht zerstörte.
Das Ändern des Kodons für Cys7 zu einem Kodon für Serin in der α-Untereinheit wurde in einem Expressionsvektor (pKBM-hCGα) durchgeführt, der in Campbell et al (1991) beschrieben wurde und der die hCG α-Untereinheit cDNA enthält. Der pKBM Vektor ist ein Derivat des pUC Vektors (Yanisch-Perron et al., 1985), in welchem der Polylinker durch einen, der eine XhoI Stelle enthält, ersetzt wurde und der das Übertragen der cDNA Inserts zwischen dem pKBM und dem Expressionsvektor pSVL (Pharmacia, Piscataway, NJ) ermöglicht. Da es nur ein α-Untereinheit-Gen gibt, enthält die cDNA für die α-Untereinheiten von hCG, hLH, hFSH, und hTSH die gleichen Kodons und dieser Expressionsvektro wird von nun an als pKBM-α bezeichnet. Wie in 40 gezeigt ist, enhält pKBM-α eine einzigartige XhoI Endonuklease-Restriktionsstelle 5' der α-Untereinheit kodierenden Sequenz und eine einzigartige BsmI Endonuklease-Restriktionsstelle, in der Nähe der Kodons für die Aminosäuren 9-11.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer (Oligo425 und Oligo847, Tabelle 5) wurden entwickelt, um diese Region einzuklammern, um das Kodon für Cys7 gegen Ser zu tauschen, und um eine neue Endonuklease-Restriktionsstelle (BspEI) zu erzeugen, die verwendet werden könnte, um das Identifizieren der Mutantenkonstrukte zu erleichtern.
Tabelle 5: Sequenzen der verwendeten Primer, um die Disulfid-vernetzten Analoga herzustellen
Das Produkt der PCR unter Verwendung dieser Primer und pSVL-hCGα (Campbell et al, 1991) als Matrize wurde mit XhoI und BsmI verdaut und in die einzigartigen XhoI-BsmI Stellen von pKBMα mittels Verfahren subkloniert, die im Stand der Technik bekannt sind (Maniatis et al, 1989)
Die Sequenz eines rekombinanten Plasmids, welches eine BspEI Endonuclease-Restrikitonsstelle enthält, wurde durch Dideoxyverfahren (Maniatis et al, 1989) in der Region bestimmt, die durch PCR-basierende Mutagenese verändert wurde. Dieser Vektor (pKBM-αC7S) kodierte ein Protein mit der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz. Die modifizierte α-Untereinheit cDNA wurde aus dem pKBM Vektor durch XhoI und BamHI-Verdau entfernt und in die XhoI-BamHI Stellen von pSVL subkloniert, um pSVL-αC7S zu erzeugen, ein Verfahren, das ermöglichte, dass αC7S in COS-7 Zellen exprimiert werden kann. Die kodierenden Sequenzen werden ebenfalls in die XhoI-BamHI Stellen eines anderen Expressionsvektors (pCI), der von Promega (Madison, WI) erhalten wurde, eingefügt, der modifiziert wurde, um das Subklonieren dieses und verwandter Konstrukte zu erleichtern. Die Modifikation des pCI schloss das Entfernen einer BamHI Stelle und das Ersetzens eines Polylinkers (d.h. Restriktionsstellen NheI-NotI), durch einen neuen Polylinker mit den folgenden Endonuklease-Restriktionsstellen: NheI-XhoI-EcoRI-MluI-KpnI-XbaI-SalI-BamHI ein. Dies ermöglichte das Subklonieren von Konstrukten aus pKBM und pSVL basierenden Vektoren in pCI basierende Vektoren durch Entfernen des XhoI-BamHI Fragments, dass die gewünschte kodierende Region von entweder pKBM oder pSVL enthielt, und Ligieren dieses an pCI, der mit XhoI und BamHI verdaut wurde. Die weiter Bezugnahme auf pCI basierende Vektoren ist hierin beabsichtigt, sich auf den modifizierten pCI Vektor, der unmittelbar zuvor beschrieben wurde, zu beziehen. Der Transfer der α-Untereinheit kodierenden Region von pSVL auf pCI, erzeugte pCI-α bzw. pCI-αC7S und wurde gemacht, um die Expression in kultivierten Zellen zu erleichtern.
Es ist nicht notwendig, die Substitution von Cystein gegen Serin zu verwenden, um ein α-Untereinheitanalogon herzustellen, dem die Fähigkeit fehlt, ein Disulfid zwischen Cys7 und Cys31 zu bilden. Alanin wurde verwendet um diese Bindung zu stören (Furuhashi et al, 1994), und es würde erwartet werden, dass der Austausch von Cys7 gegen jede andere Aminosäure die Cys7-Cys31 Disulfidbindung stören würde.
Die Modifikation der hCG β-Untereinheit kodierenden Sequenz, um das Kodon für Tyr37 mit dem für Cys zu ersetzen, wurde durch Kassettenmutagenesen in der hCG β-Untereinheit cDNA erreicht, die in einen pUC-basierenden Vektor, als pKBM-hCGβ' bezeichnet wurde (Campell et al, 1991). Dieses Konstrukt enthält einzigartige NgoMI und PstI Restriktionsstellen an den Kodons für die Aminosäure 35-36 und 45-46. Das Mutantenkodon wurde durch Ersetzen des kurzen DNA-Stückes zwischen den NgoMI und PstI Stellen mit der Kassette, die durch Anlagern von Oligo845 und Oligo874 (Tabelle 5) erzeugt wurde, eingeführt. Dies führte ebenfalls eine PmlI Endonuklease-Restriktionsstelle ein, die verwendet werden könnte, um die Identifikation von Plasmiden zu erleichtern, die die Mutation enthalten.
Das Subklonieren dieser Kassette in pKBM-hCGβ' (Campbell et al, 1991) wurde durch im Stand der Technik bekannten Standardverfahren (Maniatis et al, 1989) durchgeführt, und die gewünschte Sequenz der mutierten Region wurde durch die Dideoxy Sequenzierungsverfahren bestätigt. Da pKBM kein Expressionsvektor ist, wurde es in pSVL sukloniert, um zu ermöglichen, dass dieses β-Untereinheit Konstrukt in Säugetierzellen exprimiert wird. Dies wurde erreicht, in dem das kurze Stück, welches durch Verdau von pKBM-hCGβ' mit XhoI und BamHI erhalten wurde, genommen wird und mit dem großen Fragment, welches nach dem Verdau von pSVL mit XhoI und BamHI übrig blieb, ligiert wird, um einen als pSVL-hCGβ'Y37C bezeichneten Expressionsvektor zu erzeugen. Die durch pSVL-hCGβ' und pSVL-hCGβ'Y37C kodierten Aminosäuresequenzen sind in 4 gezeigt. Diese wurden die ebenfalls in den modifizierten pCI Vektor an den XhoI und BamHI stellen subkloniert.
Die Herstellung von diesen kodierenden Sequenzen könnte ebenfalls durch Standard-DNA-Syntheseverfahren unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Instrumenten erreicht werden. Diese Verfahren können verwendet werden, um lange Oligonukleotide herzustellen, die dann zusammen ligiert werden können, wie beschrieben ist (Campbell et al, 1992). Es sollte beachtet werden, dass die DNA-kodierenden Sequenzen, ebenfalls von einer von mehreren Firmen, die auf die Konstruktion von synthetischen Oligonukleotiden und das Herstellen synthetischer cDNA Gene spezialsiert sind, gekauft werden können. Zu diesen Zellen Midland Certified Reagent Company, Midland, Texas und Genosys Biotechnologie, Inc., The Woodlands, Texas. Die Expression dieser Untereinheiten kann ebenfalls in kultivierten Säugetierzellen (d.h., COS-7 Zellen) unter Verwendung eines von mehreren kommerziell erhältlichen Vektoren, wie pSVL (Pharmacia, Piscataway, NJ) oder pCI (Promega, Madison, WI) unter Verwendung von Verfahren, die ähnlich sind zu jenen, die beschrieben wurden (Campbell et al, 1991) und die im Stand der Technik üblich sind, erreicht werden.
Die Co-Expression von pSVL-α und pSVL-hCGβ', pSVL-αC7S und pSVL-hCGβ'Y37C, pCI-α und pCI-hCGβ', und pCI-αC7S und pCI-hCGβ'Y37C in COS-7 Zellen wurde durch Routineverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, und die beschrieben wurden, (Campbell et al, 1991), durchgeführt. Die Transfektion in COS-7 Zellen, wurde durch ein Standardkalziumphosphat-Präzipitationsverfahren, wie beschrieben (Kriegler, 1990) durchgeführt. Die COS-7 Zellen wurden von der ATCC, Rockville, MD erhalten. Am Tag, der der Transfektion folgt, wurde das Zellkulturmedium entfernt und das Medium mit serumfreien DMEM Medium ersetzt. Die Zellen wurden drei zusätzliche Tage inkubiert, um den sezernierten Produkten zu ermöglichen, in dem Kulturmedium zu akkumulieren. Die Medien wurden dann zentrifugiert, um die Zelltrümmer und andere Präzipitate zu entfernen, der Überstand wurde in einen Dialysebeutel überführt, und die Komponenten mit hohen Molekulargewicht konzentriert, indem der Beutel in ein hygroskopisches Pulver enthaltendes Bett (Aquacide, Calbiochem, La Jolla, CA) platziert wurde.
Das hCG und vernetztes hCG, die in das Kulturmedium sezerniert wurden, wurden unter Verwendung einer Sandwich-Immunountersuchung (Moyle et al, 1982) unter Verwendung der Antikörper A113 und ¹²⁵I-B105 für Einfang bzw. Detektion, quantifiziert und hCG, das aus Urin gereinigt wurde, wurde als Standard verwendet. In dieser Untersuchung wurde Anti-hCG α-Untereinheit Antikörper A113 (1 μg in 0,05 ml) auf die Oberfläche einer Mikrotiterplatte für eine Stunde bei 37°C absorbiert. Der nicht-absorbierte Antikörper wurde entfernt und jede Kammer mit einer Lösung, die 0,9% NaCl und 1 mg bovines Serumalbumin/ml enthält, inturbiert, um die restlichen Proteinabsorptionsstellen zu blockieren. Ein Aliquot (0,05 ml) des Kulturmediums von Zellen, die seit drei Tagen transfiziert waren, wurde zu den Kammern hinzugefügt und dem hCG oder dem vernetzten hCG Analgon wurde ermöglicht, an den absorbierten Antikörper für eine Stunde bei 37°C zu binden. Das nichtgebundene Hormon oder Hormonanalogon wurde entfernt, die Kammern mit 0,9% NaCl-Lösung gespült, und dem eingefangenen Analyten ermöglicht, mit radioiodiniertem Anti-hCG β-Untereinheit Antikörper ¹²⁵I-B105, der wie unten beschrieben hergestellt wurde, zu binden. Der ¹²⁵I-B105, der nicht an hCG oder vernetztes hCG Analogon band, wurde aspiriert, und die auf die Oberfläche der Mikrotiterkammern gebundene Radiomarkierung wurde unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt. Diese Untersuchung detektierte leicht 0,1 ng of hCG. Es war nicht notwendig, diese bestimmten Antikörper für diese Untersuchung zu verwenden und es gibt mehrere kommerziell erhältliche Antikörper die anstelle verwendet werden können. Die meisten Anti-hCG α-Untereinheit-Antikörper und jeder Anti-hCG β-Untereinheit-Antikörper, der eine Affinität für hCG und freie hCG β-Untereinheit von größer als 108M^–1 aufweist, wird ausreichen. Der letztere würde auch ZMCG13 und ZMCG7 beinhalten, die von Pierce, 3747 North Meridian Road, Rockford, IL erhältlich sind.
Die Radioiodierung von Antikörpern, hCG und hFSH wurde mit Iodo-Gen, welches von Pierce Chemical Co, Rockford, IL erhalten wird, erreicht. Bei diesem Verfahren wurden 1,5 Mikrogamm Iodo-Gen in 50 Mikrolitern Aceton zu einem kleinen Glasröhrchen hinzugefügt, welches in der Lage ist, etwa 0,75 ml Flüssigkeit aufzunehmen und dem Aceton wurde ermöglicht zu evaporieren. Dies ließ den Iodo-Genrückstand, der den Boden des Röhrchens beschichtet, zurück. Nachdem wurden 10 Mikrogamm B105 hinzugefügt, dass Röhrchen mit einer Plastikkappe verschlossen, und 5 Mikroliter, die 250-500 μCi Na¹²⁵I in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH7,2) enthalten, durch Injizieren der Lösung mit einer Mikrospritze durch die Kappe, wurden hinzugefügt. 20 bis 30 Sekunden später, wurde 0,1 ml einer 0,9% NaCl Lösung in 0,02 M Natriumphospatpuffer (pH 7,2) hinzugefügt und die Mischung aspiriert und auf eine 2 ml BioGel P6DG Säule (BioRad, Richmond, CA) geladen. Das freie Iod und das iodinierte Protein wurden durch Gelfiltation getrennt. Die für die Iodinierung verwendete Na¹²⁵I Menge varierte in Abhängigkeit von der Fähigkeit des Proteins, seine Funktion im Anschluss an die Radioiodierung beizubehalten. Antikörper und hCG wurden üblicherweise auf eine spezifische Aktivität von 50μCI/μg radioiodiniert, wohingegen hFSH üblicherweise auf eine spezifische Aktivität von 10-25 μCi/μg radioiodiniert wurden.
Tabelle 6 illustriert, dass die Mutation die Bildung des vernetzen hCG Analogons nicht störte. Zellen, die entweder mit pSVL-enthaltenen Kodierungssequenzen oder pCI-Kodierungssequenzen transfiziert wurden, erzeugen vergleichbare Mengen an vernetztem Analogon und hCG.
Tabelle 6 Herstellung von hCG und hCG (α31-β37) durch transfizierte COS-7 Zellen
hCG und hCG (α31-β37) wurden in Sandwich-Immunountersuchungen in Bezug auf einen hCG-Standard unter Verwendung von Antikörpern gegen die α- Untereinheit (A113) für den Einfang und radioiodinierten Antikörper gegen die β-Untereinheit (B105) für die Detektion, gemessen.
Die Antikörper A113 und B105 wurden in der Sandwich-Immunountersuchung verwendet, um die Produktion des vernetzten hCG Analogons zu bestimmen, da sie Regionen auf dem Hormon erkannten, von denen erwartet wurden, dass sie von der Mutationsstelle distanziert sind (Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995). Das hCG (α31-β37) Analogon band nicht wie hCG an A407 (5), einem Antikörper, der ein Epitop erkennt, von dem gezeigt wurde, einen Teil des N-Terminus der α-Untereinheit zu beinhalten, der Stelle der C7S Mutation (Moyle et al, 1995). Der Antikörper 407 wurde von Dr. Robert E. Canfield, Columbia University, New York, NY erhalten. Da gezeigt wurde, dass A407 hCG-Rezeptorkomplexe erkennt (Moyle et al, 1995), wurde jedoch nicht erwartet, dass diese kleine Änderung in der Hormonkonformation mit der biologischen Aktivtät der vernetzten hCG Analogs interferiert.
Die biologischen Aktivitäten von hCG (α31-β37) und anderer vernetzter Analoga wurden in Radioligand-Rezeptor- und Signaltransduktionsuntersuchungsen überwacht. Diese verwendeten CHO-Zellen, die mit den Genen, die die LH-Rezeptor cDNA kodieren, transfisziert wurden, und die deshalb funtktionelle LH Rezeptoren auf ihren Oberflächen exprimieren. CHO Zellen wurden von der ATCC, Rockville, MD, erhalten. Die Ratten-LH Rezeptor cDNA wurde von einer Ratten-Eierstockbibliothek unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion, wie beschrieben wurde (Bernard et al, 1990), erhalten. Es solle beachtet werden, dass diese LH-Rezeptor exprimierenden Zellen der einfachheitshalber verwendet wurden, und das die Radioligand-Rezeptor-Untersuchung mit anderen Geweben, die LH-Rezeptoren exprimieren, ausgeführt werden kann. Zu diesen zählen Homogenate von erwachsenen Rattenhoden oder Homogenate von Eierstöcken, die von sexuell-unreifen Ratten erhalten wurden, die mit Serum-Gonadotropin von schwangeren Stuten und hCG (bei von Sigma, St. Louis, MO erhältlich sind) injiziert wurden. Um eine Eierstockzubereitung, die hCG mit Hochaffinität binden kann, zu erzeugen, wurden weiblichen 21-Tage-alten Ratten eine subkutane Injektion von 50 i.u. Serum-Gonadotropin von schwangeren Stuten gegeben. Etwa 65 Stunden später, wurde ihnen eine subkutane Injektion von 25 i.u. hCG gegeben. Sieben Tage später wurden sie getötet, ihre Eierstöcke homogenisiert und Aliquote des Homogenisats, wobei entsprechend einem Zwanzigstel eines Eierstockes für jedes Untersuchungsröhrchen verwendet wurde. Zellen, die Ratten LH-Rezeptoren exprimieren, binden radioiodiniertes hCG, einem Tracer, der wie früher beschrieben, hergestellt oder von New England Nuclear, Boston, MA gekauft werden kann. Sie binden ebenfalls unmarkiertes hCG, einem Hormon, welches von Sigma Co., St. Louis, MO gekauft werden kann. LH-Rezeptor exprimierende CHO Zellen synthetisieren auch zyklisches AMP als Reaktion auf die hCG Behandlung für 10-30 Minuten bei 37°C. Das zyklische AMP, das erzeugt wird, wird durch eine Radioimmuniountersuchung (RIA), die für zyklisches AMP spezifisch ist, und die beschrieben wurde (Brooker et al, 1979), gemessen.
Die Addition eines Interuntereinheit-Disulfids zwischen die Reste in den α- und β-Untereinheit-Cysteinknoten von hCG zerstörte die Fähigkeit des vernetzen Heterodimers nicht, an LH-Rezeptoren zu binden und/oder eine zyklische AMP-Akkumulationsantwort auszulösen. Somit waren sowohl hCG und hCG3 (α31-β37) in der Lage, die Bindung von ¹²⁵I-hCG an LH Rezeptoren exprimierende Zellen zu blockieren (6). Sowohl hCG als auch hCG (α31-β37) waren in der Lage, eine zyklische AMP Akkumulation in diesen selben Zellen auszulösen (7). Dies zeigte, dass die Gegenwart dieser Intrauntereinheit-Disulfidbindung die gesamte funktionelle Aktivität von hCG nicht störte.
Die Gegenwart der Interuntereinheit-Disulfidbindung ermöglicht hCG (α31-β37), den Behandlungen mit Säure, Harnstoff, und Hitze, die hCG zerstörten, zu widerstehen. Dies kann von den Daten in den 8 und 9 gesehen werden. 8 illustriert den Einfluss einer erhöhten Temperatur auf die Stabilität des Heterodimers, wie in einer Sandwich-Immunountersuchung, die A113 für den Einfang und ¹²⁵I-B112 für die Detektion einsetzte, überwacht wurde. Beachte, dass B105 und B112 an ein überlappendes Epitop, das Reste in der Nähe der Wendung der dritten β-Untereinheitschleife beinhaltet, binden (Moyle et al, 1990; Cosowsky et al, 1995), einer Stelle, die von den Mutationen in entweder der α- oder β-Untereinheit von hCG (α31-β37) entfernt ist. In dieser Untersuchung wurde hCG und hCG (α31-β37) einer Temperatur von 85°C für verschiedene Intervalle bis zu 20 Minuten ausgesetzt. Während die Aktivität von hCG nach 7-8 Minuten so gut wie zerstört war, verblieb zumindest 75 % der Aktivität des vernetzten Analogons nach 20 Minuten der Inkubation (8). Da diese Sandwich-Immunountersuchung Dimer-spezifisch ist, schien der Verlust der hCG-Aktivität aufgrund der Interuntereinheit-Disulfidbindung verhindert wird.
Die Inkubation von Gonadoatropin in hohen Harnstoffkonzentrationen ist bekannt, die Untereinheitdissoziation zu fördern (Pierce et al, 1981). Wenn hCG in der Gegenwart von 8M Harnstoff inkubiert wird, dissoziiert es somit in seine Untereinheiten, ein Phänomen, welches leicht durch Western Blotting detektiert wird (9). Säugetierzellen, die mit jenen transfiziert wurden, die die hCG α- und β- Untereinheiten kodieren, sezernieren häufig die freie β-Untereinheit sowie das 2β-Heterodimer in die Kulturmedien. Diese können leicht durch Sandwich-Immunountersuchungen, die einen α-Untereinheit-spezifischen und einen β-Untereinheit-spezifischen Antikörper verwenden, unterschieden werden. Das αβ-Heterodimer und die freie β-Untereinheit können auch durch ihre Größen in Western Blots unterscheiden werden. Es ist somit möglich, die realtiven Mengen an hCG und der freien β-Untereinheit in Kulturmedien zu überwachen, indem sie unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden und dann Detektieren dieser in Western Blots. Dies wird durch die Verwendung eines radioiodinierten monoklonalen Antikörpers, der hCG und die frei β-Untereinheit bindet, erleichtert, wie in 9 gezeigt ist. Die Analyse von Kulturmedien von Zellen, die sowohl die α- als auch die β-Untereinheiten von hCG exprimieren, zeigte das Vorhandensein von sowohl dem Heterodimer (oberere Bande) als auch der freien β-Untereinheit (untere Bande) an. Die Behandlung des Kulturmediums mit 8M Harnstoff führte zu der Dissosation des Heterodimers in seine Untereinheiten. Infolgedessen verschwand die obere Bande. Harnstoff förderte die Dissozitation von hCG (α31-β37), das Disulfid-vernetzte Heterodimer in seine Untereinheiten nicht und die dem Heterodimer entsprechende Bande blieb intakt (9).
Beispiel 2: Ein multi-funktionelles Glycoproteinhormonanalogon, welches durch eine Interuntereinheitdisulfid stabilisiert ist, welches zwischen den Cysteinknoten seiner α- und β-Untereinheiten lokalisiert sind.
Der Sitzgurt ist bekannt, die Rezeptorbindungsaktivität von hCG zu beinflussen (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). Der Austausch der hCG β-Untereinheit Aminosäurereste 101-109 mit ihren hFSH Gegenstücken (d.h. hFSH β-Untereinheitresten 95-103) führte zu einem drastischen Anstieg der FSH-Aktivität des Analogons ohne Beeinträchtigung seiner LH-Aktivität (Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). Tatsächlich verstärkte diese Substitution auch die hTSH-Aktivität von hCG (Campbell et al 1997), obwohl sie nicht irgendwelche Reste einführt, die spezifisch in hTSH gefunden werden. Das Untersuchen des Einflusses von Interuntereinheit Disulfiden auf die Aktivitäten eines verwandten multfunktionellen Analogons zeigte, wie spezifisch Disulfide die Aktivitäten von Lutropinen, Follitropinen, und Thyrotropinen beeinflussen würde. Dieses Beispiel illustriert, wie ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen den Cysteinknoten die LH und FSH Aktivität des hCG Analogons (CFC101-114), in welchem die hCG β-Untereinheitreste 101-114 mit ihren hFSH-Gegenstücken (d.h. hFSH β-Untereinheitresten 95-108) ersetzt wurden, beeinflusst.
Die Expression von CFC101-114 (α31-β37), erfordert, dass Zellen, mit Vektoren, die αC7S und CFCβ'101-114Y37C kodieren, transfiziert sind. Die Modifikation der α-Untereinheit wurde in Beispiel 1 beschrieben. Die DNA-Sequenzen des verwendeten CFC 101-114 β-Untereinheitvorläufers, um CFC101-114β'Y37C, die die hCG β-Untereinheitreste 1-100, hFSH β-Untereinheitreste 95-108, und hCG β-Untereinheitreste 115-145 kodiert, die sequenziell in dieser Reihenfolge verbunden sind, herzustellen Es wurde durch Kombinieren der kodierenden Sequenzen von zwei hCG/hFSH β-Untereinheiten Chimären an ihren gemeinsamen SstII-Stellen, hergestellt (41-43). Das XhoI-SstII fragment von pSVL-CFC101-106β', das Kodons für die Signalsequenz und Reste 1-103 von pSVL-CFC101-114β' enthält, wurde in das XhoI-BamHI Fragment von pSVL-CFC94-114β' subkloniert. Dies ersetzte die Kodons für hFSH β-Untereinheitreste 88-94, die in pSVL-CFC101-114β' gefunden werden, mit ihren hCG β- Untereinheithomologa (d.h. Reste 94-100) und führte eine BglII Stelle ein. Jeder dieser Kodierungsvektoren wurde von der hCG β-Untereinheit cDNA durch Modifizieren der Kodons in der 3' Hälfte des Moleküls, wie als nächstes beschrieben ist, abgeleitet.
pSVL-CFC94-114β' wurde durch PCR Mutagenese von pSVL-CFC94-106β', einem Vektor, der die hCG β-Untereinheitreste 1-93, die hFSH β-Untereinheitreste 88-100, und die hCG β-Untereinheitreste 107-145 kodiert, die sequentiell in dieser Reihenfolge verbunden sind, hergestellt. Der erste Schritt beim Herstellen von pSVL-CFC94-114β' war pSVL-CFCβ'94-106 durch SOEing PCR Mutagenese (Ho et al, 1989) herzustellen. Eine PCR Reaktion mit Oligo508 und Oligo368 (Tabelle 5) als Primer und pSVL-hCGβ' (Campbell et al, 1991) als Matrize gab ein Produkt, welches die CFC94-106 β-Untereinheit Kodons 101-145, das hCG β-Untereinheit Terminationskodon, die 3'-untranslatierte Region, eine BamHI Endonuklease Restriktionsstelle, und einen Teil der pSVL Vektorsequenz 3' der BamHI Stelle enthält. Eine zweite PCR Reaktion mit Oligo510 und Oligo365 (Tabelle 5) ergab ein Produkt, das die pSVL-Sequenzen 5' ihrer XhoI Stelle, die 5' untranslatierte Region von pSVL-hCGβ (Campbell et al, 1991), die 20 Kodons für die hCG β-Untereinheit Signalsequenz, und CFC94-106 β-Untereinheit Kodons 1-107 enthält. Die Abschnitte dieser PCR Produkte, die CFC94-106 β-Untereinheit Kodons 101-107 enthalten, waren komplementär, eine Anforderung an die überlappende Erweiterung während der „SOEing PCR". Diese zwei PCR-Produkte wurden mit den Oligo363 und Oligo364 (Tabelle 5) gemischt und in einer dritten PCR Reaktion amplifiziert, um ein PCR-Produkt zu ergeben, das die Sequenz der CFC94-106 β-Untereinheit in voller Länge kodiert, die XhoI und BamHI Restriktionsstellen in der Nähe ihrer 5' bzw. 3' Termini aufweist. Dieses PCR Produkt, welches ebenfalls eine SstII-Stelle bei den Kodons für die Reste 102-104 aufweist, wurde ebenfalls in die XhoI und BamHI Stellen von pSVL kloniert, um pSVL-CFC94-106β' zu erzeugen. Die Sequenz der kodierenden Region wurde durch Dideoxysequenzierungsverfahren bestätigt.
Der letzte Schritt beim Herstellen der pSVL-CFC94-114β' β-Untereinheit schloss PCR unter Verwendung von Primer Oligo596 und Oligo368 (Tabelle 5) und pSVL-hCGβ' als Matrize ein, um ein Produkt zu erzeugen, welches SstII und BamHI Stellen in der der Nähe ihres 5' bzw. 3' Endes aufweist. Wenn es mit diesen Enzymen verdaut wurde, ergab es ein DNA-Fragment, das die Kodons für die hFSH β-Untereinheitreste 97 bis 108 und die hCG β-Untereinheitkodons 115-145 in dieser Reihenfolge enthielt. Dies wurde in die einzigartige SstII-BamHI Stelle von pSVL-CFC94-106β' subkloniert, um pSVL-CFC94-114β' zu erzeugen, und der Abschnitt der Sequenz, der während der PCR amplifiziert wurde, wurde durch Dideoxysequenzierungsverfahren bestätigt.
Die Herstellung von pSVL-CFC101-106β' begann mit einem als pMB135 bezeichneten Vektor, der ein hCG β-Untereinheit Analogon, welches beim Rest 114 verkürzt ist kodiert und der ein Kodon für Valin anstelle von Gly102 enthielt. pMB135 wurde durch Anlagern von Oligo435 und Oligo436 (Tabelle5) und enzymatisches Auffüllen der 3' Enden hergestellt, um eine doppelsträngige Kassette zu erzeugen, die PvuII und SstI Stellen enthielt. Die letztere war 3' des Terminationskodons. Diese Kassette kodierte die hCG β-Untereinheitreste 87-101, Valin, und die hCG β-Untereinheitreste 103-114 in dieser Reihenfolge, und enthielt eine Restriktionsstelle für BglII an den Kodons 94-95. Es wurde in die PvuII und SstI Stellen von pSVL-hCGβ' subkloniert und ihre Sequenz zwischen den PvuII und SstI Stellen durch Dideoxysequenzierungsverfahren bestätigt. pMB135 wurde in der PCR-Reaktion mit Oligo562 und Oligo365 (Tabelle 5) als Matrize verwendet, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, welches wenn es mit XhoI und SstII verdaut wurde, die hCG β-Untereinheit cDNA untranslatierte Region und Signalsequenz, die hCG β-Untereinheit Kodons 1-100, und die hFSH β-Untereinheit Kodons 95-98 in dieser Reihenfolge aufwies. Dieses PCR-Produkt wurde in die XhoI-SstII Stellen von pSVL-CFC94-106β' kloniert, um pSVL-CFC101-106β' herzustellen, und ihre Sequenz wurde durch Dideoxysequenzierungsverfahren bestimmt.
Es war offensichtlich nicht notwenig diesen Ansatz zu nehmen, um pSVL-CFC101-114β' zu erzeugen. Diese Schritte wurden aus historischen Gründen verwendet. Die verschiedenen Zwischenvektoren wurden im Zuge von anderen Experimenten hergestellt und waren für die Herstellung des Vektors, der CFC101-114β' kodiert, verfügbar. Das Plasmid pSVL-CFC101-114β'Y37C wurde durch Kombinieren der 5' „Hälfte" von pSVL-hCGβ'Y37C, die die Y37C Mutation kodiert, mit der 3' „Hälfte" von pSVL-CFC101-114β', die die hFSH β-Untereinheit Aminosäuren 95-108 kodiert, hergestellt. Dies wurde durch Ligieren des kleinen Stückes von pSVL-hCGβ'Y37C, welches durch Verdau mit XhoI und Bsu36I erhalten wurde, an das große Stück, welches durch Verdau von pSVL-CFC101-114β' mit denselben Enzymen hergestellt wurde, erreicht. Dies ersetzte die Kodone für die Signalsequenz und die Aminosäuren 1-54 von CFC101-114β' mit jenen von hCGβ'Y37C, eine Änderung, die in der Substitution von Tyr37 mit Cystein resultiert. Das Subklonieren des XhoI-BamHI Fragments in die XhoI-BamHI Stellen des zuvor beschriebenen modifizierten pCI-Konstrukts führt zu dem Konstrukt mit dem Namen pCI-CFC101-114β'Y37C. Die Aminosäuresequenzen von CFC101-114β' und CFC'101-114β'Y37C sind in 10 beschrieben.
Die Herstellung von CFC101-114 und CFC101-114 (α31-β37) wurde durch C-Expremieren von pSVL-α plus pSVL-CFC101-114; pSVL-αC7S plus pSVL-CFC101- 114βY37C; pCI-α plus pCI-CFC101-114β; und pCI-αC7S plus pCI-CFC101-114βY37C in COS-7 Zellen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erreicht. CFC101-114 und vernetztes CFC101-114 (α31-β37) in dem konzentrierten Kulturmedium wurden unter Verwendung einer Sandwich-Immunountersuchung quantifiziert (Moyle et al, 1982), die die Antikörper A113 für Einfang und entweder ¹²⁵I-B105 oder ¹²⁵I-B112 für die Detektion mit hCG, welches aus Urin gereinigt wurde und als Standard verwendet wurde verwendete. Es sollte wie zuvor beachtete werden, dass es nicht notwendig ist, diese bestimmten Antikörper für diese Untersuchung zu verwenden; kommerziell erhältliche Antikörper sind erhältlich, von denen erwartet wird, zufrieden stellend zu arbeiten Die meisten Anti-hCG α-Untereinheit Antikörper, die auch eine hohe Affinität für hFSH aufweisen, wie A113 oder Anti-hFSH α-Antikörper, die eine hohe Affinität für hCG aufweisen, können in dieser Untersuchung verwendet werden. Da jedoch diese Analoga hFSH Reste in dem Teil der Sitzgurtregion enthalten, die einen Haupteinfluss auf die FSH-Aktivität (d.h. Aminosäurereste zwischen dem elften und zwölften β-Untereinheit Cystein (Moyle et al, 1994)), hat, werden nicht alle Analoga von CFC101-114 durch alle Anti-hCG α-Untereinheit Antikörper erkannt. Dies kann für A407 gesehen werden (11), einem Antikörper, der hCG, nicht jedoch hFSH bindet. Während somit A407 hCG band, hatte es eine viel geringe Fähigkeit an CFC401-104 und vernetzte CFC 101-114 Analoga zu binden. A407 hatte auch eine geringe Fähigkeit an CFC101-114 (α31-β37) zu binden.
CFC101-114 Analoga können durch die meisten Anti-hCG β-Untereinheit Antikörper, die eine Affinität von mehr als 10⁸M^–1 für hCG und freie hCG β-Untereinheit aufweisen, ermittelt werden, mit Ausnahme jener, die Reste in der β-Untereinheit in der Nähe der Region, die durch FSH-Reste besetzt sind, erkennen. Somit wurde CFC101-114 und Analoga nicht durch B111 erkannt, einem Antikörper, von dem gezeigt wurde, dass er durch hCG-Reste 108-114 stark beeinflusst wird (Cosowsky et al, 1995). Nichtsdestotrotz können die meisten Antikörper, die hCG, hLH, freie hCG β-Untereinheit, und freie hLH β-Untereinheit erkennen, wie 8 105, in dieser Untersuchung verwendet werden. Zusätzlich können viele Antikörper, die hCG und freie hCG β-Untereinheiten erkennen, wie B112, ebenfalls in dieser Untersuchung verwendet werden. Die B105/B112 Epitopregion ist eine der am meisten antigenen Regionen von hCG in Mäusen und Antikörper gegen diese Region sind kommerziell erhältlich, wie in Beispiel 1 bemerkt ist.
Die Gegenwart einer Disulfidvernetzung in CFC101-114 (α31-β37) erhöhte seine thermische Stabilität in Bezug auf die von CFC101-114 (12). Sandwich-Immunountersuchungen zeigten, dass die Aktivitäten von hCG und CFC101-114 beinahe zerstört wurden, durch 7,5 minütiges bzw. 15 minütiges Erwärmen bei 85°C. Eine wesentliche Menge an CFC101-114 (α31-β37) verblieb jedoch nach 20 Minuten bei derselben Temperatur. Dies zeigte, dass die Gegenwart eines Disulfids, die Stabilität dieses Analogons erhöhte. Da dieses und andere Analoga, die FSH-Reste zwischen der elften und zwölften β-Untereinheit aufweisen, haben sowohl FSH und TSH Aktivitäten (Campbell et al, 1997), würde erwartet werden, dass die Disulfidbindung die Stabilität von FSH und TSH erhöht.
CFC 101-114 kann die Signaltransduktion an LH-Rezeptoren stimulieren. Die Addition des α31-β37 Interuntereinheit-Disulfid zwischen den Cysteinknoten von CFC101-114 reduzierte seine Aktivität in dieser Untersuchung nicht (13). Somit weisen sowohl CFC101-114 als auch CFC101-114 (α31-β37) etwa die selbe hohe Fähigkeit auf, die zyklische AMP Akkumulation in Untersuchungen, die CHO Zellen, die so konstruiert wurden, um LH Rezeptoren zu exprimieren, verwenden, zu stimulieren. Somit scheint die Gegenwart dieser Disulfidbindung, die Aktivität von Molekülen wird Lutropin-Aktivität nicht zu beeinflussen. Es würde erwartet werden, dass die Fähigkeit dieser Bindung, diese Moleküle zu stabilisieren, an Lukopine nützliche-therapeutische Eigenschaften zu verleihen.
Obwohl die Aminosäuresequenz von CFC101-114 viel ähnlicher zu jener von hCG als zu hFSH ist, hat CFC101-114 (α31-β37) eine viel höhere FSH-Aktivität als hCG, einem Hormon, welches dafür bekannt ist, in dieser Untersuchung beinahe ohne Aktivität zu sein. Die Adddition von α31-β37 Interuntereinheit-Disulfidbindung zwischen den Cysteinknoten von CFC101-114 hatte nur einen kleinen Einfluss auf seine Fähigkeit, die zyklische AMP Akkumulation in CHO Zellen, die FSH Rezeptoren exprimieren, zu stimulieren (14). Es würde somit nicht erscheinen, dass die Gegenwart dieser Disulfidbindung, die Aktivität von Molekülen mit Follitropin Aktivität negativ beeinflusst und es würde erwartet werden, dass die Fähigkeit dieser Bindung, diese Moleküle zu stabilisieren, Follitropinen nützliche therapeutische Eigenschaften verleiht.
Beispiel 3: hCG, das durch ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen dem Sitzgurt und der α-Untereinheitschleife 2 stabilisiert ist.
Die Entfernung zwischen den Cα und Cβ Kohlenstoffatomen von Resten in der α- und β-Untereinheit von hCG (Tabelle 1 B) weist darauf hin, dass es möglich sein würde, andere zusätzliche Dimere, in welchen die Untereinheiten durch ein oder mehrere Disulfidbindungen verbunden wurden, herzustellen. Die Vernetzung von hCG und CFC101-114 zwischen dem α-Untereinheitrest 31 und dem β-Untereinheitrest 37 erhöhte die Stabilität der resultierenden Analoga wesentlich und hatte einen minimalen Einfluss auf ihre biologischen Aktivitäten. Um in Erfahrung zu bringen, ob die Einführung einer Disulfidvernetzung in einem Teil des Moleküls, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er die Rezeptorbindung beeinflusst, seine Stabilität und Aktivität ändern würde, wurden Disulfidbindungen in hCG und CFC101-140 zwischen der α-Untereinheit Schleife 2 und dem Sitzgurt konstruiert. Diese Studien zeigten, dass die Einführung eines Disulfids in diese Region der Glycoproteinhormone, ihre Stabilität erhöhte. Die Substitutionen, die zur Erzeugung des Disulfids erforderlich waren, beeinflusste jedoch ihre Fähigkeiten, mit Rezeptoren zu interagieren und die Signaltransduktion auszulösen. Dies zeigte, dass die Einführung einer Disulfidbindung in einem Teil des Hormons, der nicht in Rezeptorinteraktionen und Rezeptorspezifität teilnimmt, bevorzugt ist, um die hohe endokrine Aktivität zu bewahren. Da beide Arten von Disulfid-vernetzen-Analoga ihre Immunologische Aktivität behielten, kann die Position des Disulfids beim Konstruieren von Immunogen weniger wichtig sein. Der Einfluss dieses Disulfids auf die Signalübertragung kann für die Entwicklung von Hormonantagonisten oder Immunogen nützlich sein.
Um ein durch ein Interunteruntereinheit Disulfid zwischen der α-Untereinheitschleife 2 und dem Sitzgurt stabilisiertes hCG herzustellen, wurden das Lys51 der α-Untereinheitschleife 2 und das Asp99 des β-Untereinheit Sitzgurts durch Cysteine ausgetauscht. Die Änderung in der
α-Untereinheit schloss die Kassettenmutagenese von existierenden Vektoren, die zuvor noch nicht beschrieben worden sind, ein. Die Konstruktion dieser Zwischenvektoren wird deshalb hier beschrieben (44).
Der Polylinker von pIBI31, einem Klonierungsvektor, der von International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT) gekauft wurde, wurde mit einem Polylinker, der die Restriktionsenzymstellen EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcoRI enthält, ersetzt, um einen Vektor mit der Bezeichnung pRM102 herzustellen. pKBM-α wurde mit NcoI und BamHI verdaut und in die NcoI-BamHI Stellen von pRM102 kloniert, um pRM116 zu erzeugen, wodurch seine 5' untranslatierte Leitsequenz und eine unerwünschte 5' XbaI Stelle, die während des Klonierens von pKBM-α eingefügt wurde, eliminiert werden. Somit entsprach die einzige XbaI Stelle in pRM116 den Kodons für die α-Untereinheit Aminosäuren 34-35. Das XbaI-BamHI Fragment von pRM116 wurde mit dem XbaI-BamHI Fragment eines Vektors, das durch PCR der α-Untereinheit cDNA mit Oligo758 und Oligo760 (Tabelle 5) erzeugt wurde, ersetzt, um pRM117 zu erzeugen. Dies eliminiert die 3' untranslatierte Region, die in der α-Untereinheit cDNA gefunden wird, einem Vorgang, der ebenfalls die ungewünschten PstI Restriktionsstellen in dieser Region eliminierte. Die einzige in pRM17 verbleibende PstI Stelle war bei den Kodons für die Reste 83-85 lokalisiert. Das Klonieren des Produkts, das durch PCR der α-Untereinheit cDNA mit Oligo730 und Oligo839 (Tabelle 5) erhalten wird, in die einzigartigen XbaI-PstI Stellen von pRM117, führte zu pMB507. Dies führte BglII und SpeI Stellen in die α-Untereinheit kodierende Sequenz bei den Kodons 42-43 bzw. 54-55 ein. Das Subklonieren des XhoI-BamHI Fragments von pMB507 in die XhoI-BamHI Stellen von pSVL, führte zu pMB512. Das Fragment von pMB512 zwischen den BglII und SpeI Stellen wurde mit Oligo877 und Oligo878 (Tabelle 5) ersetzt, um pMB561 zu erzeugen. Schlussendlich wurde das BglII-SpeI Fragment von pMB512 mit einer Kassette, die durch Anlagern von Oligo921 und Oligo922 (Tabelle 5) gemacht wurde, ersetzt, um pSVL-αK51C zu erzeugen (15). Diese Strategie würde nicht erforderlich sein, um pSVL-αK51C herzustellen, und wurde nur aus historischen Gründen verwendet, aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen Vektorzwischenprodukten, die während anderen Experimenten hergestellt wurden.
Das β-Untereinheitanalogon hCGβ'D99C wurde durch PCR Mutagenese unter Verwendung des pSVL-hCGβ' als Matrize und Oligo368 und Oligo925 (Tabelle 5) als Primer hergestellt. Oligo368 ist ein Umkehrprimer, der komplementär zu einer Stelle in pSVL 3' der BamHI Endonuklease Restriktionsstelle ist. Oligo925 enthält die gewünschte Mutation und erzeugt ebenfalls die BglII Stelle. Das PCR-Produkt wurde mit BglII und BamHI verdaut und in die BglII-BamHI Stellen von pSVL-CFC101-114β' subkloniert. Dies entfernt die hFSH Kodons von pSVL-CFC101-114β' und veränderte das Asp99 zu einem Cystein (15).
Die Plasmide pSVL-αK51C und pSVL-hCGβ'D99C wurden in COS-7 Zellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, co-exprimiert. hCG und hCG (α51-β99) wurden in einer Sandwich-Immunountersuchung in Bezug auf einen hCG Standard unter Verwendung von Antikörpern gegen die α-Untereinheit (A113) für den Einfang und radioiodinierten Antikörper gegen die β-Untereinheit (B115) für die Detektion, gemessen. Es ist nicht notwendig, diese bestimmten Antikörper für diese Untersuchung zu verwenden. Beinahe jeder Antikörper, der die hCG α-Untereinheit in dem Heterodimer erkennt, und jeder β-Untereinheit Antikörper, der hCG und seine freie β-Untereinheit erkennt, mit Affinitäten von größer als 10⁸M^–1 kann in dieser Untersuchung verwendet werden. Diese Erzeugung von hCG und hCG (α51-β99) durch transfizierte COS-7 Zellen führte zu der Akkumulation eines vernetzten Protein Analogons in dem Zellkulturmedium, welches leicht durch A113/¹²⁵IB105 oder A113/¹²⁵IB112 Sandwich-Untersuchung detektiert wird (Tabelle 7), welche zeigt, dass die benötigten Mutationen, um das Disulfid einzuführen, die Untereinheit-Kombination nicht verhinderte.
Tabelle 7 Herstellung von hCG und hCG (α51-β99) durch transfizierte COS-7 Zellen
Die biologische Aktivität von hCG (α51-β99) wurde in LH Rezeptorbindungs- und Signaltransduktionsuntersuchungen unter Verwendung der im Beispiel 1 dargelegten Verfahren gemessen. hCG (α51-β99) war in der Lage, die Bindung von ¹²⁵I-hCG an LH-Rezeptoren exprimierende CHO Zellen zu inhibieren, wenn auch nur mit 5-10% der Wirksamkeit von hCG (16). Die Reduktion der Affinität für die LH-Rezeptoren, die durch die Disulfidbindung hervorgerufen wird, könnte sein aufgrund von: 1) dem Austausch des α-Untereinheitrestes Lys51 durch Cystein (d.h. Substitution einer geladenen Aminosäure durch eine neutrale Aminosäure), 2) dem Austausch des β-Untereinheitrestes Asp99 durch Cystein (d.h. Substitution einer negativ geladenen Aminosäure durch eine neutrale Aminosäure), oder 3) der, durch das Vorhandensein einer kovalenten Bindung zwischen den zwei Untereinheiten hinzugefügten Einschränkungen. Modifikationen von Asp99 haben gezeigt, die LH-Aktivität von hCG zu reduzieren oder zu eliminieren (Chen et al, 1991). Durch Vergleichen der LH Rezeptorbindungsaktivitäten von hCG Analoga, die eine unmodifizierte β-Untereinheit und eine α-Untereinheit, in welcher Lys51 zu einem Cystein geändert wurde (hCG (αK51C-β)) enthält, und hCG Analoga, die eine unmodifizierte α-Untereinheit und eine β-Untereinheit, in welcher Asp99 gegen Cysteine geändert wurde (hCG (α-βD99C)) enthalten, mit jenen von hCG und hCG (α51-β99), war es möglich, den Einfluss der Cysteinsubstitutionen von dem der Disulfidbindung zu unterscheiden (17). Diese Analysen zeigten, dass die Substitution des α-Untereinheit Lys51 mit Cystein einen wesentlichen inhibitorischen Einfluss auf die Fähigkeit von Analoga hatte, die ¹²⁵I-hCG Bindung an LH-Rezeptoren zu inhibieren. Die Aktivitäten von hCG (α51-β99) und hCG (α-β99) waren ähnlich, was demonstriert, das die Substitution des β-Untereinheit Asp99 gegen Cystein, für den Großteil der reduzierten LH-Rezeptorbindungsaktivität von hCG (α51-β99) bedingen.
Die Änderung von Lys51 zu Alanin reduzierte die Aktivität von hCG ebenfalls (18). Die Fähigkeiten von diesen hCG Analoga, die Signaltransduktion (zyklische AMP Akkumulation) zu stimulieren, wurden ebenfalls getestet. Das Austauschen des α-Untereinheit Restes Lys51 mit entweder Cystein oder Alanin bewirkte einen nahezu vollständigen Verlust der Fähigkeit des Hormons, die zyklische AMP Akkumulation zu stimulieren (19 und 20). Die Addition von Cysteinen zu beiden Untereinheiten, um hCG (α51-β99) zu erzeugen, stellte signifikante Mengen an Aktivität in Bezug auf das Analagon, welches nur eine einzelne Cysteinsubstitution für das α-Untereinheit Lys51 enthält, wieder her (19). Der Austausch des β-Untereinheitrestes bei Asp99 mit Cystein hatte an sich die Ansicht einen viel geringeren Einfluss auf die LH-REzeptorsignaltransduktion. Dies weist darauf hin, dass das Disulfid die relative Wirksamkeit der hCG Analoga reduziert einer Eigenschaft, die bei der Entwicklung von Antagonisten nützlich sein kann.
Das Vorhandensein eines Interuntereinheit-Disulfids zwischen dem Sitzgurt und der α-Untereinheitschleife 2 erhöhte die thermische Stabilität von hCG (8). Es verhindert ebenfalls, dass die Untereinheiten in der Gegenwart von 8M Harnstoff dissoziieren (9). Diese Beobachtungen bestätigen die vorteilhaften Wirkungen einer Interuntereinheit-Disulfidbindung auf die Stabiltät der Glycoproteinhorme.
Beispiel 4: Ein bifunktionales Glycoproteinhormonanalogon, welches durch ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen dem Sitzgurt und der α-Untereinheitschleife 2 stabilisiert wird.
Eine Disulfidbindung wurde zwischen dem Sitzgurt und der α-Untereinheitschleife 2 von CFC101-114 erzeugt wurde, dem Glycproteinhormonanalogon, welches die Fähigkeiten aufwies, mit allen drei Haupt-Glycoproteinhormonrezeptoren zu interagieren. Dies ermöglichte die Charakterisierung des relativen Einflusses dieser Region des Proteins auf die Interaktionen mit LH und FSH Rezeptoren.
Der β-Untereinheit Expressionsvektor, der für die Produktion von CFC101-114β' (α51-β99), (d.h. pSVL-CFC101-114β'D99C) benötigt wird, wurde durch Kassettenmutagenese von pSVL-CFC101-114β' hergestellt. Dieser Vektor enthält eine BglII Endonuklease Restriktionsstelle in den Kodons für die Aminosäuren 95-96 und eine SstII Stelle in den Kodons für die Aminosäuren 102-104. pSVL-CFC101-114β'D99C wurde durch Verdauen von pSVL-CFC101-114β' mit BglII und SstII und Austauschen des kleinen Fragments mit einer synthetischen Oligonukleotid-Kassette, die durch Anlagern von Oligo924 und Oligo923 (Tabelle 5) erhalten wird, hergestellt. Dies führte ebenfalls eine BsrGI Stelle ein, die verwendet wurde, um rekombinante Klone zu selektieren. Die Sequenz der Basen, die im resultierenden Vektor, pSVL-CFC101-114β'D99C verändert wurden, wurde durch die Dideoxysequenzierungsverfahren bestätigt. Die Aminosäuresequenz von CFC101-114β' (α51-β99), die durch diesen Vektor kodiert ist, ist in 21 illustriert.
Die Co-Expression von pSVL-αK51C und pSVL-CFC101-114β'D99C von COS-7 Zellen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Dimer wurde in einer Sandwich-Immunountersuchung unter Verwendung von A113 für Einfang, radioiodiniertem B112 für die Detektion, und gereinigtem Urin-hCG als Standard gemessen. Wie in dem Falle der anderen Analoga, würde es nicht notwendig sein, diese spezifischen Antikörper zu verwenden, um CFC101-114 (α51-β99) im Kulturmedium zu detektieren. Die meisten α-Untereinheit Antikörper, die in der Lage waren, sowohl hCG als auch hFSH zu binden, könnten für den Einfang verwendet werden. Die meisten Antikörper, die in der Lage sind, an hCG und die freie β- Untereinheit zu binden, außer jenen, die Reste erkennen, die die Sequenzen, die zu FSH geändert wurden, einschließen, könnten für die Detektion verwendet werden. Ein Beispiel für einen Antikörper, der nicht verwendet werden konnte, ist B111 (Cosowsky et al, 1995) A407, ein α-Untereinheit monoklonaler Antikörper, der eine Determinante auf dem N-terminalen Abschnitt der α-Untereinheit in hCG (Moyle et al, 1995) erkennt, erkennt CFC101-114 bei weitem nicht so gut wie es an hCG bindet (5). Es wurde angenommen, dass dies aufgrund des Einflusses des Sitzgurtes auf die Gesamtinteraktion der Glycoproteinhormon α- und β-Untereinheiten, die in die Steuerung der Rezeptorbindungsspezifität eingebunden sein können, war. Die Addition des Disulfids zwischen dem α-Untereinheitrest 51 und dem β-Untereinheitrest 99 ermöglichte dem resultierenden Analogon nicht, durch A407 erkannt zu werden (11).
Wie die anderen Disulfid-vernetzten Analoga, wurde von CFC101-114 (α51-β99) ebenfalls gefunden, stabiler zu sein, als sein parentaler Vorläufer (d.h. CFC101-114 und hCG) in thermischen Denaturierungsuntersuchungen (12). Tatsächlich erschien es, dass die Gegenwart des Disulfids zwischen dem α-Untereinheitrest 51 und dem β-Untereinheitrest 99 die Stabilität des Proteins mehr erhöhte, als das Disulfid zwischen dem α-Untereinheitrest 31 und dem β-Untereinheitrest 37.
Das Vorhandensein der Disulfidbindung zwischen dem Sitzgurt und der α-Untereinheitschleife 2 von CFC101-114 (α51-β99) reduzierte seine Fähigkeit, an LH-Rezeptoren zu binden (22). Wohingegen CFC101-114 beinahe so wirksam war wie rekombinantes hCG beim Inhibieren der Bindung von radiomarkierten hCG an LH-Rezeptoren, war CFC 101-114 (α51-β99) etwa 100-fach weniger aktiv. Die relative Wichtigkeit der individuellen Untereinheit-Mutationen und der Disulfidbindung wurden durch Überwachen der Aktivitäten von CFC101-114, CFC101-114 (α51-β99), CFC101-114 (αK51-β), CFC101-114 (αK51-β), und CFC101-114 (α-βD99C) verglichen. Diese Vergleich zeigte, dass die Substitution des α-Untereinheit Lys51 mit Cystein oder Alanin an sich einen wesentlichen inhibitorischen Einfluss auf die Rezeptorbindung hatte (22 und 23).
Somit war die Aktivität von CFC101-114 (αK51C-β) im Bezug auf jene von CFC101-114 (α51-β99)]. Im Gegensatz zu ihrer Beeinflussung der LH Aktivität von hCG, beeinträchtig die Substitution des CFC101-114 β-Untereinheit Asp99 mit Cystein um einen Teil der reduzierten Fähigkeit von CFC 101-114 (α51-β99) an LH Rezeptoren zu binden. Nichtsdestotrotz war CFC101-114 (α51-β99) wesentlich aktiver als CFC 101-114 (αK51 C-β), eine Wirkung, die durch das Vorhandensein von Cystein in der α-Untereinheit anstelle von Lys51 nicht erklärt werden könnte.
Studien wurden ebenfalls durchgeführt, um den Einfluss der Sitzgurt α-Untereinheit Disulfidbindung auf die Signaltransduktionsaktivitäten von CFC101-114 zu bestimmen (24 und 25). CFC101-114 war nur etwas weniger wirksam beim Stimulieren der Signaltransduktion an LH-Rezeptoren als hCG (24). Jedoch war, CFC101-114 (α51-β99), das Disulfid vernetzte Analogon nur bei der höchsten untersuchten Konzentration aktiv. Als Bestätigung von früherer-diskutierten Studien erschien dies hauptsächlich aufgrund der Änderung des α-Untereinheit Lys51 zu Cystein, dass das Analogon, in welchem nur das β-Untereinheit Asp99 zu Cystein umgewandelt wurde (d.h. CFC 101-114 (α51-β99)) eine wesentliche Aktivität beibehielt. Wie in dem Fall der Bindungsuntersuchungen, wo das Disulfid in der Lage war, einen Teil des Verlustes der Aktivität, der durch den Austausch des α-Untereinheit Lys51 durch Cystein oder Alanin hervorgerufen wurde, auszugleichen, die Interuntereinheit-Disulfidbindung stellte ein Teil der Signaltransduktion wieder her (24).
CFC101-114 hatte wesentliche Aktiväten in FSH-Untersuchungen. Jedoch hatten die benötigten Cystein-Substitutionen, um die Sitzgurt α-Untereinheitschleife Disulfidverbindung zu erzeugen, eine größere Auswirkung auf die FSH-Aktivität von CFC101-114, als auf seine LH-Aktivität (26, 27, und 28) und es war nicht möglich, den Einfluss der Disulfidbindung an sich zu unterscheiden. Somit verloren Analoga, in welchen nur das α-Untereinheit Lys51 oder das β-Untereinheit Asp99 verändert worden sind, den Großteil ihrer FSH-Aktivitäten.
Das Ergebnis, dass Mutationen des β-Untereinheit Asp99 einen größeren Einfluss auf die FSH-Aktivität hatte, als auf die LH Aktivität, unterstützt frühere Beobachtungen über die Rolle des Sitzgurtes bei der LH und FSH Aktivität (Han et al, 1996; Baird et al, 1993). Diese Berichte weisen darauf hin, dass die Region des Sitzgurtes, die die LH-Rezeptorbindung beeinflusst, in der Nähe der Aminosäuren 94-96 sind, wohingegen die, welche die FSH-Rezeptorbindung beeinflusst in der Nähe der Aminosäuren 101-109 sind.
Beispiel 5: hCG durch Disulfide aus Beispielen 1 und 3 stabilisiert
Um in Erfahrung zu bringen, wie die Einführung von mehreren Disulfiden in das Glycoproteinhormon, ihre biologischen Aktivitäten beeinflussen würde, wurden Analoga von hCG hergestellt, die, die in Beispiel 1 und 3 gezeigten Disulfide, enthalten. Diese Analoga wurden durch Austauschen von Abschnitten der Expressionssektoren, die in den Beispielen 1 und 3 beschrieben wurden, hergestellt. pCI-α (C7S, K51C) wurde durch Verdau von pSVL-αC7S und pSVL-αK51C mit BsmI, Trennen der kleinen und großen Fragmente die bei jedem Verdau erzeugt wurden, durch Agrose Elektrophorese, und Ligieren des großen Fragments von pSVL-αC7S an das kleine Fragment, welches von pSVL-αK51C erhalten wurde, hergestellt. Das resultierende Konstrukt wurde mit XhoI und BamHI verdaut und in pCI ligiert, welcher eine modifizierten Polylinker aufweist, und welcher in Beispiel 1 beschrieben wurde. pCI-hCGβ' (Y31C, D99C) wurde durch Verdauen von pSVL-hCGβ'D99C und pCI-hCGβ'Y37C mit AocI (einem Isochizamer von Bsu36I) und BamHI, Trennen der kleinen und großen Stücke durch Agarose Elektorphorese, und Ligieren des kleinen Stückes, welches von pSVL-hCGβ'D99C abgeleitet ist, mit dem großen Stück, welches von pCI-hCGβ'Y37C abgeleitet ist, hergestellt. Die Aminosäuresequenzen der Analoga, die durch diese Vektoren kodiert sind, sind in 31 dargestellt.
pCI-α (C7S, K51C) und pCI-hCGβ' (Y31C, D99C) wurden in COS-7 Zellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, co-exprimiert. Das in das Kulturmedium sezernierte Protein wurde konzentriert und durch Sandwich-Immunountersuchung überwacht, ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Ausnahme, dass der radioiodinierte B112 anstelle von B105 verwendet wurde. Die Gegenwart von mehreren Disulfidbindungen verhinderte nicht, dass das Glycoproteinhormon faltete oder von den Zellen sezerniert wurde, wie durch die Gegenwart des Analogons in dem Kulturmedium gezeigt wird (Tabelle 8). hCG (α31-β37, α51-β99) wurde in Sandwich-Immunountersuchungen in Bezug auf einen hCG Standard unter Verwendung von Antikörper gegen die α-Untereinheit (A113) für den Einfang und radioiodinierte Antikörper gegen die β-Untereinheit (B112) für die Detektion gemessen. Das Analogon wurde nicht gut durch Antikörper A407 erkannt, einer wahrscheinlichen Folge der Mutation in der Nähe des N-Terminus der α-Untereinheit. Da diese Region des Proteins nicht für die Hormonaktivität benötigt wird, scheint das Fehlen dieses Epitops von geringer Auswirkung zu sein. Die Großbuchstaben in 31 beziehen sich auf die Lokalisationen der Mutationen, die eingeführt wurden, um die Disulfidbindungen zu bilden.
Tabelle 8 Herstellung von hCG und hCG (α31-β37, α51-β99) durch transfizierte COS-7 Zellen
Die Gegenwart von zwei Disulfidbindungen in hCG (α31-β37, α51-β99) erhöhte seine Stabilität im Bezug auf hCG in thermischen Denaturierungsuntersuchungen (8). Zusätzlich war hCG (α31-β37, α51-β99) stabiler als hCG gegenüber der Harnstoffdenaturierung (9). Dies weist darauf hin, dass die Gegenwart von mehr als einer Disulfidbindung das Molekül nicht destabilisierte.
hCG (α31-β37, α51-β99) war in der Lage, an LH-Rezeptoren zu binden, und die zyklische AMP Akkumulation zu stimulieren (29 und 30). Seine Aktivitäten in diesen Untersuchungen waren ähnlich zu jener von hCG (α51-β99), was wiederum zeigt, dass das Interuntereinheit-Disulfid zwischen dem α-Untereinheitresten 31 und dem β-Untereinheitrest 37 einen geringen, wenn überhaupt, schädigenden Einfluss auf die Rezeptorbindung oder Signaltransduktion hatte. Somit würde die α31-β37 Intercysteinknotenstellen für das Konstruieren einer Disulfidbindung bevorzugt werden, um Glycoproteinhormone zu stabilisieren, wenn die Aufrechterhaltung einer endokrinen Aktivität gewünscht ist.
Beispiel 6: Ein Analogon von hFSH, welches durch ein Intercysteinknotendisulfid zwischen seinen α- und β-Untereinheiten stabilisiert ist
Die Entdeckung, dass hCG und CFC101-114 durch ein Interuntereinheitdisulfid zwischen ihren Cysteinknoten ohne Zerstören ihrer LH und/oder FSH Aktivitäten stabilisiert werden könnten, weist stark darauf hin, dass diese Region nicht für die hormonale Aktivität erforderlich ist. Es wird somit erwartet, dass das Konstruieren eines ähnlichen Disulfids in FSH in einem hFSH Analogon mit erhöhter Stabilität und wirksamer FSH Aktivität resultieren würde. Es würde von diesem Analogon ebenfalls zu erwarten sein, dass es Antikörper, die hCG und hFSH α-Untereinheiten, wie A113, erkennen binden.
Es würde von diesem ebenfalls erwarten werden, dass es Antikörper bindet, die eine Region von hFSH β-Untereinheitschleife 1 und/oder 3, die von der Stelle der Mutation entfernt sind, wie B602, erkennen.
Die Sequenz eines α-Untereinheit Analogons, welches benötigt wurde, um ein hFSH Analogon, welches zwischen dem α-Untereinheitrest 31 und dem β-Untereinheitrest 31 vernetzt ist, herzustellen, ist in 3 beschrieben worden. Die Aminosäuresequenz einer weniger polaren α-Untereinheit, die ebenfalls für das Herstellen dieses Analogons (αC7A) nützlich sein sollte, ist in 32 dargestellt. Die Aminosäuresequenz von hFSH βY31C, von der erwartet wird, dass sie ein InterCysteinknoten Disulfid mit αC7A oder αC7S bildet, in 32 gezeigt. Nukleinsäuresequenzen, die benötigt werden, um Vektoren, die diese Proteine kodieren, herzustellen, könnten von der human α-Untereinheit und der hFSH β-Untereinheit cDNA durch einen Fachmann auf dem Gebiet des Klonierens unter Verwendung des in 33 dargestellten genetischen Kodes hergestellt werden. Diese Sequenzen könnten auf von einem der in Beispiel 1 aufgelisteten Lieferant gekauft werden.
Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von αC7S und hFSHβY31C oder αC7A und hFSHβY31C vorübergehend oder stabil anzutreiben, würden in COS-7 oder andere eukaryotische Zellen durch jedes Mittel, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, wie jene die in Beispiel 1 referenziert wird, eingeführt werden.
Das erzeugte Protein würde in einer Sandwich-Untersuchung unter Verwendung von hFSH als ein Standard und Einfang-Antikörper, die Epitope auf hFSH, die von dem α-Untereinheit N-Terminus entfernt sind, erkennen, um Detektionsantikörper, die Epitope auf hFSH an Stellen in den β-Untereinheitschleifen 1 und/oder 3 erkennen, gemessen.
Es wird erwartet, dass das vernetzte Analogon von hFSH stabiler als hFSH in thermischen oder Harnstoff-Denaturierungsuntersuchungen ist, wie für vernetzte hCG Analoga in Beispiel 1 durchgeführt ist. Es wird ebenfalls erwartet, dass das vernetzte FSH Analogon mit radioiodiniertem hFS um die Bindung an CHO-Zellen, die mit humanen FSH-Rezeptoren transfiziert wurden, konkurrenzieren. Es wird ebenfalls erwartet, dass es zyklische AMP-Akkumulation in diesen Zellen stimuliert. In vitro Untersuchungen können die biologischen Aktivitäten von vollkommen glycoslierten Glycoproteinhormonanaloga in vivo voraussagen. Da von der Mutation, die eingeführt werden, um die Glycoproteinhormonanaloga zu vernetzen, nicht erwartet werden würde, ihr gesamtes Glycosylierungsmuster in Bezug auf rekombinante Glycoproteinhormone zu ändern, wurde ebenfalls erwartet werden, dass das vernetzte FSH-Analogon in vivo aktiv ist.
Beispiel 7: Ein Analogon von hCG, das durch ein Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert ist.
Die Beispiele 1-4 lehren, dass eine einzelne Interuntereinheit-Disulfidbindung zwischen den Untereinheiten von Glycoproteinhormonen und ihren Analoga, ihre Stabilität erhöhen kann. Diese Beispiele zeigen auch, dass die Auswirkungen der Disulfidbindung auf die Rezeptorbindung und die Signaltransduktionsaktivitäten der Moleküle gering sein werden, unter der Voraussetzung, dass keine Reste eingebunden sind, die für die Rezeptorbindung, Rezeptorbindungsspezifität wichtig sind, oder das Protein in eine unpassende Konformation verdrehen. Die N-terminalen Abschnitte von sowohl der α- als auch β-Untereinheiten können im Wesentlich ohne Zerstören der hormonalen Aktivität verändert werden, ein Hinweis darauf, dass dieser Teil des Proteins an keinen Schlüsselrezeptorkontakten teilnimmt. Es wird deshalb erwartet, dass die Einführung einer Disulfidbindung an den N-Termini der Glycoproteinhormone an Stellen, die als günstig in Tabelle 1B gezeigt ist, sie stabilisieren werden, ohne ernsthaft ihre biologischen Aktivitäten zu stören.
Tabelle 1B zeigt, dass das α-Untereinheit Gln5 und hCG β-Untereinheit Arg8 günstig positioniert sind, sodass das Austauschen von jedem mit einem Cysteinrest, zu der Bildung eines Disulfid-vernetzten Analogons führen würde. Es wird von diesem Analogon erwartet, dass es eine erhöhte Stabilität in Bezug auf hCG hat und die Fähigkeit beibehält, LH-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren.
Die benötigten Aminosäuresequenzen, um Vektoren herzustellen, die für das Exprimieren dieses Analogons nützlich sein würden, sind in den 34A und 34B dargestellt.
Beispiel 8: Ein Analogon von hFSH, das durch ein Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert ist.
Wie schon erwähnt ist, lehren die Beispiele 1-4, dass eine Interuntereinheit-Disulfidbindung zwischen Untereinheiten von Glycoproteinhormonen und ihren Analoga ihre Stabilität erhöhen kann. Diese Beispiele zeigen auch, dass die Wirkung der Disulfidbindung auf die Rezeptorbindung und Signaltransduktion, vorausgesetzt, dass keine Reste eingebunden sind, die für die Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität wichtig sind. Es wird deshalb gemäß der vorliegenden Erfindung erwartet, dass die Einführung einer Disulfidbindung an den N-Termini von hFSH, es stabilisieren wird, und zu einem Analogon führt, welches nützliche therapeutische Eigenschaften aufweisen wird.
Basierend auf den Daten in Tabelle 1B, welche die günstigen Positionen des α-Untereinheit Gln5 und des hCG β-Untereinheit Arg8 zeigen und den Daten in Tabelle 2, welche „äquivalente" Reste in hCG und hFSH zeigen, würde erwartet werden, dass das Austauschen des α-Untereinheit Gln5 und des hFSH β-Untereinheit Ser2 mit Cyteinresten, Disulfid-vernetzte hFSH Analoga erzeugt. Es würde von diesen Analoga erwartet werden, eine erhöhte Stabilität in Bezug auf hFSH zu haben und die Fähigkeit beibehalten würden, FSH-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren. Die benötigten Aminosäuresequenzen, um einen Vektor herzustellen, der für das Exprimieren dieses Analogons nützlich sein würde, sind in 35 dargestellt.
Beispiel 9: Ein Analogon von hLH, das durch ein Intercysteinknoten Disulfid zwischen den α- und β-Untereinheiten oder einem Inter-Untereinheit Disulfid zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert ist.
Die am engsten verwandten humanen Lutropine sind hCG und hLH. Es wird somit erwartet, dass Mutationen, die benötigt werden, um aktive Disulfid-vernetzte hCG-Analoga herzustellen, ebenfalls für die Herstellung von aktiven Disulfid-vernetzten hLH-Analoga nützlich sein würden. hLH ist das am wenigsten stabile der Gonadotropine und es wird auch erwartet, dass die Interuntereinheit-Disulfide, die Stabilität von hLH signifikant erhöhen werden. Die Aminosäuresequenzen der β-Untereinheit, die benötigt werden, um ein Intercysteinknoten Disulfid-vernetztes hLH herzustellen und hLH, das in der Nähe seines N-Terminus vernetzt ist, sind in den 36 bzw. 37 dargestellt.
Beispiel 10: hTSHβY30C, ein β-Untereinheit Analogon, von welchem erwartet wird, für die Herstellung von hTFH-Analoga, die durch ein Intercysteinknoten-Disulfid zwischen den α- und β-Untereinheiten oder einem Interuntereinheit zwischen den N-terminalen Abschnitten der α- und β-Untereinheiten stabilisiert sind, nützlich zu sein.
Wie zuvor erwähnt ist, lehren die Beispiele 1-4, dass eine Interuntereinheit Disulfidbindung zwischen den Untereinheiten der Glycoproteinhormone und ihren Analoga, ihre Stabilität erhöhen kann. Diese Beispiele zeigen ebenfalls, dass die Wirkung der Disulfidbindung auf die Rezeptorbindung und Signaltransduktion, unter der Voraussetzung, dass keine Reste eingebunden sind, die für die Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität wichtig sind. Es wird deshalb erwartet, dass die Einführung einer Disulfidbindung zwischen den Resten in den Cysteinknoten der hTSH α- und β-Untereinheiten oder in den N-Termini von hTSH α- und β-Untereinheiten, das Heterodimer stabilisieren werden, was zu einem Analogon führt, das nützliche therapeutische Eigenschaften, wie das Stimulieren der Schilddrüse vor der Radioiod-Ablationstherapie, aufweisen wird.
Basierend auf den Daten in Tabelle 1B, welche die günstigen Positionen des α- Untereinheit Cys31 und des hCG β-Untereinheit Tyr37 zeigen, und den Daten in Tabelle 2, die „äquivalente" Reste in hCG und hTSH zeigen, würde von Zellen, die αC7S oder αC7A und ein hTSH β-Untereinheit Analogon exprimiren, in welchem Tyr30 durch ein Cysteinrest ersetzt ist, erwartet werden, Disulfid-vernetzte hTSH Analoga zu erzeugen. Basierend auf den Daten in Tabelle 1B, die die günstigen Positionen des α-Untereinheit Gln5 und hTSH β-Untereinheit Arg8 zeigen, und den Daten in Tabelle 2, die „äquivalente" Reste in hCG und hCSH zeigen, würde auf ähnliche Weise erwartet werden, dass der Austausch des α-Untereinheit Gln5 und hTSH β-Untereinheit Phe1 mit Cysteinresten, Disulfid-vernetzte hTSH Analoga zu erzeugen. Es würde von diesen Analoga erwartet werden, eine erhöhte Stabilität in Bezug auf hTSH zu haben und ihre Fähigkeit TSH-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren, beibehalten werden.
Die benötigten Aminosäuresequenzen, um einen Vektor herzustellen, der für das Exprimieren dieser Analoga nützlich sein würde, sind in den 38 und 39 illustriert.
Beispiel 11: Herstellung von Disulfid-vernetzten Hormon-Antagonisten
Es ist bekannt, dass die Deglycosylierung der Glycoproteinhormone, ihre Fähigkeiten, ein biologisches Signal auszulösen, reduziert (Moyle et al, 1975; Matzuk et al, 1989). Die deglycosylierten Hormone sind jedoch aufgrund ihrer Instabilität, therapeutisch nicht nützlich. Es wird erwartet, dass die Einführung einer Disulfidbindung in genetischdeglycosylierte Hormone, ihren Nutzen als Hormon-Antagonisten erhöhen wird. Ein Antagonist von LH oder von hCG würde sowohl Profertilität- und Antivertilität-Verwendungen haben.
Somit würde ein LH-Antagonist, wenn er an Frauen verabreicht, die unfruchtbar sind, da sie unangemessen hohe LH-Konzentrationen haben, die Fruchtbarkeit verstärken. Wenn verabreicht an Frauen, die in frühen Stadien der Schwangerschaft waren, würde ein hCG-Antagonist die Schwangerschaft abbrechen. Ein Antagonist eines bifunktionalen LH/FSH-Moleküls, wie CFC101-114 oder CFC101-109 (Moyle et al, 1994) würde ebenfalls nützlich sein. Die vorübergehende Verwendung eines solchen Antagonistes könnte verwendet werden, um eine unangemessene Eierstockfunktion zu beendigen, wodurch das Zurücksetzen des Menstruationszykluses hervorgerufen wird. Dies würde eine potentielle Profertilität-Wirkung haben. Die Verwendung eines solchen Antagonisten während der frühen Schwangerschaft würde erwartet werden, die Produktion von sowohl Progesteron und Estradiol zu unterdrücken und die Schwangerschaft zu beendigen.
Außer dem Einführen einer Inter-Untereinheit Disulfidverbindung, würde die Herstellung von vernetzten Antagonisten, das Ändern des N-gebundene Glycosylierungssignale auf der α-Untereinheit oder auf der α- und der β-Untereinheit der Analoga, die beschrieben wurden, oder die unter Bezugnahmen auf Tabelle 1B hergestellt werden könnten, einschließen. Dies würde das Ändern der Sequenz Asn-X-Ser/Thr, die in den α- und β-Untereinheiten der Glyoproteinhormone gefunden werden, um entweder das Asn mit einer anderen Aminosäure zu Ersätzen, Ändern der Ser oder Thr zu einer anderen Aminosäure, oder Ändern der Aminosäure zwischen Asn oder Ser/Thr (dargestellt als X) zu Prolin, einbinden.
Beispiel 12: Andere Disulfid-vernetze Analoga der Gonadotropine, die erwartet werden, stabiler zu sein, als die parentalen Hormone, sind in den Tabellen 9-15 dargestellt. Diese würden durch kotransfiszieren von Zellen mit Vektoren, die die α-Untereinheit und β-Untereinheit Konstrukte, wie in dem Beispiel 1-5 angegeben, exprimieren können, hergestellt werden.
Tabelle 9
Zusätzliche Analoga der humanen α-Untereinheit, die verwendet werden können, um Disulfid-vernetzte Analoga von hCG, hLH, hFSH und hTSH
(Bemerkung: Mutation ist in Großbuchstaben)
Tabelle 10
Zusätzliche Analoga der hFSH β-Untereinheit, die für das Herstellen von Disulfid-vernetzten Analoga von hFSH, wenn sie mit den entsprechenden α-Untereinheit Analoga kombiniert sind, nützlich sind.
(Bemerkung: Mutation ist in Großbuchstaben)
Tabelle 11
Zusätzliche Analoga der hCG β-Untereinheit, die für das Herstellen von Disulfid-vernetzten Analoga von hCG, wenn sie mit den entsprechenden α-Untereinheit Analoga kombiniert sind, nützlich sind.
(Bemerkung: Mutation ist in Großbuchstaben)
Tabelle 12
Zusätzliche Analoga der hLH β-Untereinheit, die für das Herstellen von Disulfid-vernetzten Analoga von hLH, wenn sie mit den entsprechenden α-Untereinheit Analoga kombiniert sind, nützlich sind.
(Bemerkung: Mutation ist in Großbuchstaben)
Tabelle 13
Heterodimere von hFSH, die Inter-Untereinheit-Disulfidbindungen enthalten, die ihre Stabilität erhöhen
Bemerkung: Jene von denen erwartet wird, dass sie eine beachtliche biologische Aktivität beibehalten, sind durch einen Asterisk angezeigt. Dies wird basierend auf der Funktion der Reste, die in die Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität, wie in den Beispielen 1-4 gezeigt ist, eingebunden sind, berechnet. Die vernetzten Heterodimere würde durch co-Transfektion der angegebenen α- und α-Untereinheit-Analogon cDNA in Säugetierzellen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt werden.
Tabelle 14
Heterodimere von hCG, die Inter-Untereinheit-Disulfidbindungen enthalten, die ihre Stabilität erhöhen
Bemerkung: Jene von denen erwartet wird, dass sie eine beachtliche biologische Aktivität beibehalten, sind durch einen Asterisk " angezeigt. Dies wird basierend auf der Funktion der Reste, die in die Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität, wie in den " Beispielen 1-4 gezeigt ist, eingebunden sind, berechnet. Die vernetzten Heterodimere würde durch co-Transfektion der " angegebenen α- und β-Untereinheit-Analogon cDNA in Säugetierzellen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt werden.
Tabelle 15
Heterodimere von hLH, die Inter-Unter-einheit-Disulfidbindungen enthalten, die ihre Stabilität erhöhen
Bemerkung: Jene von denen erwartet wird, dass sie eine beachtliche biologische Aktivität beibehalten, sind durch einen Asterisk angezeigt. Dies wird basierend auf der Funktion der Reste, die in die Rezeptorbindung oder Rezeptorbindungsspezifität, wie in den Beispielen 1-4 gezeigt ist, eingebunden sind, berechnet. Die vernetzten Heterodimere würde durch co-Transfektion der angegebenen α- und β-Untereinheit-Analogon cDNA in Säugetierzellen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt werden.
Beispiel 13: Ein hCG-Analogon, welches ein Disulfid zwischen der β-Untereinheitschleife 2 und der α-Untereinheitschleife 3 enthält.
Die Reste, die dieses Disulfid erzeugen, sind in einer Region von hCG, von welcher angenommen wird, dass sie in den Hochaffinität-Rezeptorkontakten nicht beteiligt ist (Moyle et al, 1995). Weder die zweite β-Untereinheitschleife noch die dritte β-Untereinheitsschleife von hCG werden für die Lutropinaktivität benötigt und aktive Analoga von hCG können hergestellt werden, in welchen Beide entfernt wurden (Moyle et al, 1998). Zusätzlich wurden Analoga von hCG, die eine volle Aktivität aufweisen, hergestellt, in welchen die β-Untereinheitsschleife 2 mit ihrem hFSH-Gegenstück ersetzt wurde (Campbell et al, 1991). Es würde somit durch die vorliegenden Erfinder nicht erwartet werden, dass die Addition eines Intrauntereinheit-Disulfids zwischen diesen Abschnitten des Proteins, seine biologische Aktivität zerstört. Dieses Analogon würde durch Modifizieren von Vektoren, die die α- und β-Untereinheiten von hCG kodieren und co-exprimiren dieser in Säugetierzellen, herstellt werden. Das α-Untereinheitkonstrukt kodierte ein Protein mit der Aminosäuresequenz, die αV76C genannt wird, wie in Tabelle 9 gezeigt ist. Dieses Konstrukt wurde durch PCR-Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide 1131 und 1132 als Primer (Tabelle 5) und pMB589 als eine Matrize hergestellt. Das Plasmid pMB589 ist ein Konstrukt in pCI', das ein Analogon der menschlichen α-Untereinheit kodiert, in welcher das Kodon für Asn52 gegen ein Asparaginsäure geändert wurde und in welchem die Kodons für Arg42 und Ser43 verändert wurden, um eine stille BglII Stelle zu erzeugen. pMB589 wurde durch Subklonieren des XhoI-BamHI Inserts von pMB532 in den pCI' Vektor zwischen die XhoI-BamHI Stellen hergestellt, und pMB532 wurde aus pMB507, einem Konstrukt, welches früher beschrieben wurde, durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 850 und 851 als Primer (Tabelle 5) und pMB507 als Matrize hergestellt. Das PCR-Produkt wurde mit BglII und SpeI verdaut und in die BglII und SpeI Stellen von pMB507 subkloniert und sequenziert, um pMB532 zu ergeben.
Das PCR-Produkt wurde mit BglII und PstI verdaut, und das Insert wurde in die BglII und PstI Stellen von pMB507 kloniert, um pMB910 zu erzeugen. Positive Klone wurden durch das Vorhandensein einer extra DraI Stelle, die in das Konstrukt eingeführt wurde, identifiziert.
Nachdem die DNA Sequenz von pMB910 durch das Dideoxyverfahren bestätigt wurde, wurde das DNA-Fragment, das das gesamte α-Untereinheit-Analogon kodiert, aus pMB910 durch XhoI und BamHI Verdau entfernt und in die XhoI und BamHI Stellen des pCI' Vektors subkloniert, um pMB926 zu erzeugen. pMB926 kodiert αV76C.
Um den hCG β-Untereinheitspartner für αV76C zu erzeugen, wurden ein Vektor, der hCGβ'V44C kodiert, hergestellt. Dies ist ein Analogon der hCG β-Untereinheit, von dem erwartet wird, ein Disulfid-vernetztes Heterodimer mit αV76C zu bilden, wenn es in den selben Zellen wie pMB926 exprimiert wird. Die Oligonukleotide 1133 und 1134 (Tabelle 5) wurden synthetisiert und in die NgoMI-PstI Stelle von pKMB-β' ligiert, um pMB909 zu erzeugen. Das XhoI-BamHI Fragment von pMB909 wurde in pCI' transferiert, um pMB941 zu erzeugen. Die durch pMB941 kodierte hCGβV44C Aminosäuresequenz ist in Tabelle 11 gezeigt.
Beispiel 14: Ein hFSH Analogon, welches ein Disulfid zwischen der β-Untereinheitsschleife 2 und der α-Untereinheitsschleife 3 enthält.
Basierend auf den Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenz der hCG und hFSH β-Untereinheiten, insbesondere den Cysteinen (Tabelle 4), würde erwartet werden, dass beide Proteine eine ähnliche Architektur aufweisen. Die relativen Positionen von Val44 in der hCG β-Untereinheitsschleife 2 und Val 76 in der α-Untereinheitsschleife 2 weisen darauf hin, dass das Ändern dieser Reste zu Cystein ein Interuntereinheit-Disulfid zwischen der β-Untereinheitsschleife 2 und der α-Untereinheitsschleife 3 erzeugen würde. Val38 besetzt eine ähnliche Position in der hFSH β-Untereinheit wie Val44 der hCG β-Untereinheit. Es wurde deshalb gedacht, dass das Ändern des hFSHβVal38 zu Cystein und das Exprimieren des resultierenden Konstrukts mit αV76C zu einem Disulfid-vernetztem Heterodimer führen wird. Um Val38 in der hFSH β-Untereinheit zu Cystein zu ändern, begann der vorliegende Erfinder mit pMB603, einem Konstrukt, das die hFSHβ cDNA kodierende Sequenz minus den untranslatierten 3' und 5' Enden in dem pCI' Vektor zwischen den XhoI und BamHI Restriktionsstellen enthält. Das kleine DNA-Fragment zwischen den BstXI und PpuMI Stellen von pMB603 wurde durch eine Oligonukleotidkassette, die durch Anlagern der Oligonukleotide 1154 und 1155 (Tabelle 5) hergestellt wurde, hergestellt.
Das resultierende, als pMB920 bezeichnete Konstrukt wurde auf das Fehlen einer BstXI Stelle und das Vorhandensein einer PpuMI Stelle gescreent. Nachdem die DNA-Sequenzierung das Vorhandensein der gewünschten Änderungen bestätigte, wurde pMB920 in COS-7 Zellen mit pMB926 co-transfiziert, der Vektor, der die Expression von αV76C antreibt.
Die Zellen sezernierten ein Heterodimer in das Medium, welches leicht in einer Sandwich-Immunountersuchung unter Vewendung eines Anti-α-Untereinheit monoklonalen Antikörpers A113 für Einfang und eines radiomarkierten Anti-hFSHβ-Unteinheit monoklonalen Antikörpers B602 detektiert wurde. Die durch pMB920 kodierte hFSHβ38C Aminosäuresequenz ist in Tabelle 10 gezeigt. Das aus αV76C und hFSHβV38C zusammengesetzte Heterodimer stimulierte die zyklische AMP-Akkumulation in CHO-Zellen, die den humanen FSH-Rezeptor exprimieren (45).
Beispiel 15: Ein hCG Analogon, welches ein Disulfid zwischen dem N-Termini von jeder Untereinheit und zwischen den Cysteinknoten enthält.
Die vorangehenden Disulfid-vernetzten Heterodimere wurden durch Modifizieren jeder Untereinheit, um ein freies Thiol zu erzeugen, das in einem Interuntereinheit Disulfid beteiligt sein könnte, hergestellt. Es ist hier gezeigt, dass es möglich ist, ein Disulfid-vernetztes hCG Analogon durch Modifizieren nur der β-Untereinheit von hCG herzustellen. Die Kristallstruktur von hCG zeigte, dass das α-Untereinheit Cys31 in der Nähe des β-Untereinheit Tyr35 lokalisiert war, und die Seitenketten von beiden Untereinheiten zueinander gerichtet waren. Diese Beobachtung wurde zuvor verwendet, um eine Interuntereinheit-Disulfidbindung zwischen dem hCG α-Untereinheitsrest 31 und dem β-Untereinheitsrest 37 einzuführen. Die Kristallstruktur von hCG zeigt ebenfalls, dass der α-Untereinheitsrest Cys7 in der Nähe des hCGβ-Untereinheitsrestes Arg6 lokalisiert ist. Tatsächlich sind die α-Untereinheitsreste Cys7 und Cys31 in der Nähe der β-Untereinheitreste Arg6 und Tyr37 positioniert, sodass die Umwandlung von Arg6 und Tyr37 die Bildung eines Heterodimers, welches αCys7- αCys31 und βCys6-βCys37 Intrauntereinheit Disulfide enthält, eines Heterodimers, welches αCys7- βCys6 und aCys31-βCys37 Interuntereinheit Disulfide enthält, oder eines Heterodimers, welches αCys7-βCys37 und αCys31-βCys6 Interuntereinheit Disulfide enthält, fördern kann.
Computersimulationen zeigten, dass jede dieser Disulfidbindungen ohne unnötige Belastung auf" das Protein gebildet werden könnte. Die Bildung von multiplen Disulfiden sollten nützlich sein, um eine Gruppe von Isomeren oder Iso Formen zu erzeugen, die unterschiedliche Halbwertszeit haben. Diese könnten neuartige therapeutische Verwendungen, insbesondere wenn eine biologische Reaktion eine „Starthilfe" benötigt, haben. Bei Verwenden dieser, würde ein großer Bolus eines Analagons verabreicht werden, um eine hormonelle Reaktion auszulösen. Die Fraktion des Heterodimers, die nicht vernetzt wurde, würde erwartet werden, schneller als die des vernetzten Heterodimers geklärt zu werden. Als Folge davon wäre die große anfängliche Injektion ausreichend, um die Reaktion zu starten, jedoch würde seine Aktivität auf ein niedrigeres Niveau abflauen, welches für eine längere Zeit gehalten werden würde, um die Reaktion aufrecht zu erhalten. Es würde ebenfalls erwartet werden, dass dieses Analogon als ein Zwischenprodukt für die Herstellung von PEGylierten Analoga dient. Cysteinreste haben einzigartige Reaktivitäten, und es ist häufig wünschenswert, ein freies Cystein einer Proteinoberfläche hinzuzufügen. Es kann jedoch aufgrund der Reaktivität von Cystein schwierig sein, diese Art von Proteine herzustellen. Es ist bekannt, dass das α-Untereinheit Cys7-Cys31 Disulfid leicht in einen Zustand reduziert werden kann, der ein freies Cystein erzeugen würde. Es würde erwartet werden, dass die Einführung eines Cysteins in die β-Untereinheit zwischen den Resten 6 und 37 eine ähnliche Art von Disulfid erzeugt. Es wird erwartet, dass die Cysteine in diesen Disulfiden aktiver als andere in dem Protein sein würden, insbesondere da sie in einer Lokalisation sind, die den Disulfidaustausch erleichtern würde. Somit würde der vorliegende Erfinder erwarten, dass es möglich wäre, das existierende α-Untereinheit Cystein am Rest Cys7 und ein hinzugefügtes Cystein am β-Untereinheitrest Cys6 mit Mitteln, die das Protein modifizieren würden, zu reagieren. Diese könnten jene beinhalten, die in der Lage sind, das Protein zu PEGylieren und ihre biologische Halbwertszeit zu stabilisieren. Die Cysteine, die bei diesem Vorgang „freigesetzt" werden, würden in der Lage sein, ein Interuntereinheit Disulfid, welches das Protein stabilisieren würde, zu bilden. Die Herstellung dieses Analogons erfordert das Hinzufügen eines zweiten Cysteins zu dem als hCGβ'Y37C bekannten Analogons.
pMB940, ein Konstrukt, welches das Analogon hCGβ' kodiert, wurde durch PCR Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide 1161 und 1163 (Tabelle 5) als Primer und pCI'-hCGβ' als Matrize hergestellt. Das Oligonukleotid 1161 beginnt bei den Sequenzen, die im pCI' Vektor lokalisiert sind und Oligonukleotid 1163 kodiert die Mutation. Das PCR-Produkt wurde mit XhoI und BanI verdaut und mit dem BanI-BamHI Fragment, welches aus pSVL-hCGβ'Y37C erhalten wurde, in das große XhoI-BamHI Fragment von pCI' ligiert, um pMB941 zu erzeugen. Die DNA-Sequenz der kodierenden Sequenz von pMB941 wurde durch das Dideoxyverfahren bestätigt. pMB941 kodiert die unten gezeigte Aminosäuresequenz:
pMB940 und pSV2Neo wurden in CHO-Zellen co-transfiziert, und eine stabile Linie wurde durch ihre Resistenz gegen die toxische Droge G418 ausgewählt. Das aus dem Medium geerntete Protein wurde unter Verwendung einer Sandwich-Immunountersuchung, die ein α-Untereinheit Antikörper A113 für Einfang und radioiodiniertem Anti-β-Untereinheit Antikörper B112 für die Detektion verwendet, quantifiziert. Diese Untersuchung bestätigte das Vorhandensein eines Heterodimers in dem Kulturmedium. Die biologische Aktivität des Heterodimers wurde in einer zyklischen AMP-Akkumulationsuntersuchung unter Verwendung von CHO-Zellen, die den Ratten LH-Rezeptor exprimieren, gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in 46 dargestellt.
Beispiel 16: Ein hFSH Analogon, welches ein Disulfid zwischen den N-Termini jeder Untereinheit und zwischen den Cysteinknoten enthält.
Wie früher erwähnt, kann die Bildung von mehreren Disulfiden nützlich sein, um eine Gruppe von Protein Isoformen mit unterschiedlichen Halbwertszeiten zu erzeugen. Ein ähnliches Analogon würde einen verbesserten Ansatz bieten, um die Follikelentwicklung zu stimulieren. Die Fraktion des Heterodimers, welche kein Interuntereinheit Disulfid enthält und welche nicht vernetzt wurde, sollte schneller als die Fraktion des Heterodimers, welche eine Interuntereinheit-Vernetzung enthält, geklärt werden. Als Folge wäre eine größere anfängliche Injektion ausreichend, um die anfängliche Follikelentwicklung zu stimulieren, jedoch würde seine Aktivität auf ein niederes Niveau abflauen, welches für eine längere Zeit gehalten werden würde. Dies würde die Art der FSH-Stimulation, die während der follekulären Phase gesehen wird, genauer nachahmen und kann die Wahrscheinlichkeit einer Hyperstimulierung reduzieren. Es würde erwartet werden, dass die Addition eines Cysteins zu dem N-Terminus der hFSH β-Untereinheit oder dass die Addition des hCG β-Untereinheit Aminoterminus zu dem N-Terminus der hFSH β-Untereinheit die Bildung des Heterodimers und der Interuntereinheit-Vernetzung fördern würde. Ein hFSH β-Untereinheit Analogon, von dem erwartet wird, ein Heterodimer ähnlich zu jenem Analogon in Beispiel 15 zu bilden, würde die unten gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen:
Beispiel 17: Ein hCG Analogon mit wirksamer hFSH Aktivität, welches eine Disulfidanordnung ähnlich zu dem Analogon in Beispiel 15 enthält
hCG Analoga, in welchen die β-Untereinheit Aminosäuren 94-110 mit ihren hFSH Gegenstücken ersetzt sind, weisen eine hohe FSH-Aktivität auf. Von chimären von hCG und hFSH, die die hFSH β-Untereinheitsreste 95-103 anstelle der hCG β-Untereinheitsreste 101-109 enthalten und Cysteine an den β-Untereinheitsresten 6 und 37 aufweisen, würde erwarten werden, eine ähnliche Disulfidanordnung wie die in Beispiel 15 zu bilden. Von diesen würde ebenfalls erwartet werden, eine hohe FSH-Aktivität zu haben. Die Aminosäuresequenz der β-Untereinheit eines solchen Analagons würde sein:
Referenzen:

Adachi et al, J. Biol. Chem. 269:8537-41 (1989)
Alber et al, Biochemistry 26:3751-3758 (1987)
Ausubel et al, Current Protacols in Molecular Biology, Greene
Publications and Wiley Interscience (New York, 1987-1997)
Baenziger et al, Biochim. Biophys. Acta 947:287-306 (1988)
Baenziger et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 89:334-338 (1992)
Baird et al, Oxf. Rev. Reprod. Biol. 15:191-232 (1993)
Bedows et al, J. Biol. Chem. 268:11655-11662 (1993)
Berger et al; Molecular and Cellular Endocrinology 125:33-43 (1996)
Bernard et al, Mol. Cell. Endocrinol. 71:R19-R23 (1990)
Birken et al, J. Biol. Chem. 261:10719-10727 (1986)
Birken et al, Endacrinology 129:1551-1558 (1991)
Blithe et al, Endocrinology 129:2257-2259 (1991)
Blowmick et al, Mol. Endocrinol. 10:1147-1159 (1996)
Bo et al, J. Biol. Chem. 267:3179-3184 (1992)
Braun et al, EMBO. J. 10:1885-1890 (1991)
Braustein et al, Endocrinology 91:1030-1036 (1972)
Brooker et al, Adv. Cvclic Nucl. Res. 10:1-33 (1979)
Campbell et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:760-764 (1991)
Campbell et al, Mol. Cell. Endocrinol. 83:195-200 (1992)
Campbell et al, Nature Biotech. 15:439-443 (1997)
Chen et al, J. Biol. Chem. 266:19357-19361 (1991)
Cole et al, Cancer. Res. 41:1615-1619 (1981)
Cole et al, Endocrinology 129:1559-1567 (1991)
Cole et al, J. Biol. Med. 64:627-637 (1991)
Cole et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:704-710 (1993)
Cosowsky et al, J. Biol. Chem. 270:20011-20019 (1995)
Cosowsky et al, J. Biol. Chem. 272:3309-3314 (1997)
DeBeer et al, Eur. J. Biochem. 241:229-242 (1996)
Fiddes et al, in Recent Progress in Hormone Research, Vol 40; R. O. Greep, ed., Academic Press, New York (1984), pp. 43-78.
Fiete et al, Cell 67:1103-1110 (1991)
Forastieri et al, J. Biol. Chem. 257:7976-7981 (1982)
Furuhashi et al, J. Biol. Chem. 269:25543-25548 (1994)
Galway et al, Endocrinology 127:3023-3028 (1990)
Gast, M. J., Am. J. Obstet. Gynecol. 172:753-759 (1995)
Gennaro, A., Ed., Reminaton's Pharaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co. (Easton, PA, 1990)
Han et al, Mol. Cell. Endocrinol. 124:151-161 (1996)
Ho et al, Gene 77:51-59 (1989)
Huang et al, J. Biol. Chem. 268:9311-9315 (1993)
Imai et al, Bioconjug. Chem. 1:144-148 (1990)
Ji et al, Endocrinology 128:2648-2650 (1991)
Jia et al, Mol. Endocrinol. 5:759-768 (1991)
Jiang et al, Structure 3:1341-1353 (1995)
Kardana et al, Endocrinology 129:1541-1550 (1991)
Kobe et al, Nature 366:751-756 (1993)
Kobe et al, Nature 374:183-186 (1995)
Kriegler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York (1990)
Lapthorn et al, Nature 369:455-461 (1994)
Lim et al, Nature 339:31-36 (1989)
Lim et al, Biochemistry 31:4324-4333 (1992)
Loosfelt et al, Science 245:525-528 (1989)
Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)
Matsumura et al, Nature 342:291-293 (1989)
Matthews, B. W., Biochemistry 26:6885-6888 (1987)
Matzuk et al, J. Biol. Chem. 264:2409-2414 (1989)
McFarland et al, Science 245:494-499 (1989)
McIntosh et al, J. Biomolecular Structure and Dynamics 5:21-33 (1987)
Mise et al, J. Biol. Chem. 255:8516-8522 (1980)
Mise et al, J. Biol. Chem. 256:6587-6592 (1981)
Moudgal et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 32:579-581 (1971)
Moudgal et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 35:113-116 (1972)
Moudgal, N. R., in Immunization with Hormones in Reproduction Research, E. Nieschlag, ed., North-Holland, Amsterdam (1976), p. 233
Moudgal et al, Fertility & Sterility 30:223-229 (1978)
Moyle et al, J. Biol. Chem. 250:9163-9169 (1975)
Moyle et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79:2245-2249 (1982)
Moyle et al, J. Biol. Chem. 265:8511-8518 (1990)
Moyle et al, J. Biol. Chem. 266:10807-10812 (1991)
Moyle et al, Nature 368:251-255 (1994)
Moyle et al, Endocrinology, L. J. DeGroot, ed., Saunders, Philadelphia (1995), pp. 230-241.
Moyle et al, J. Biol. Chem. 270:20020-20031 (1995)
Moyle et al, Chemistry & Biology 5:241-254 (1998)
Murphy et al, Endocr. Rev. 12:27-44 (1991)
Nagayama et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165-1184-1190 (1989)
Nagayama et al, Proc. Natl Acad. Sci., USA 88:902-905 (1991)
Pal et al, Am. J. Reprod. Immunol. 22:124-126 (1990)
Okayama, Mol. Cel. Biol. 3:280 (1983)
Olive, D. L., Am. J. Obstet. Gynecol. 172:759-765 (1995)
Overington et al, Protein Science 1:216-226 (1992)
Pierce et al, Ann. Rev. Biochem. 50:465-495 (1981)
Ravindranath et al, J. Reprod. Fertil. 88:25-30 (1990)
Reddy et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:3644-3648 (1985)
Remy et al, Molecular and Cellular Endocrinology, 125:79-91 (1996)
Rosa et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 59:1215-1219 (1984)
Segaloff et al, Recent Prog. Norm. Res. 46:261-301, disc. (1990)
Shoham et al, Fertil. Steril, 56:1048-1053 (1991)
Singh et al, Fertil. Steril. 52:739-744 (1989)
Smith et al, J. Biol. Chem. 268:795-802 (1993)
Sprengel et al, Mol. Endocrinol. 4:525-530.
Sugahara et al, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 92:2041-2045 (1995)
Suganuma et al, J. Biol. Chem. 264:19302-19307 (1989)
Sun et al, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:269-291 (1995)
Talwar et al, Fertil. Steril. 46:120-126 (1986)
Talwar et al, Indian. Journal. of Experimental. Biology. 30:947-950 (1992)
van Dijk et al, Endocrinology 132:534-538 (1993)
Wang et al, in Ovulation Induction: Basic Science and Clinical Advances, M. Filicori and C. Flamigni, editors, Excerpta. Medica. Int'1. Congr. Series 1046, Elsevier Science B.V. Amsterdam (1994), pp. 191-196
Weare et al, J. Biol. Chem. 254:6964-6971 (1979)
Weare et al, J. Biol. Chem. 254:6972-6979 (1979)
Wehmann et al, Ann. Endocrinol. (Paris) 45:291-295 (1984)
Wu et al, Structure 2:545-558 (1994)
Xie et al, J. Biol. Chem. 265:21411-21414 (1990)
Yanisch-Perron et al, Gene 33:103-119 (1985)

Claims

Analogon eines Glycoproteinhormons, wobei das Glycoproteinhormon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Choriongonatropin (hCG), humanem Luteinisierungshormon (hLH), humanem Follikel stimulierendem Hormon (hFSH), humanem Thyroid stimulierendem Hormon (hTSH) und funktionellen Muteinen davon, wobei die funktionellen Muteine modifizierte Formen der Glycoproteinhormone sind, wobei die Modifikationen keine Disulfidbindungen zwischen den Subeinheiten ausbilden, und wobei wenigstens 80% der funktionellen biologischen Aktivität der Originalhormone beibehalten ist, mit einer α-Subeinheit und einer β-Subeinheit, wobei die Aminosäuresequenzen der Glycoproteinhormon-Subeinheiten so modifiziert sind, dass sie Disulfidbindungen zwischen einem α-Subeinheit-Cystein und einem β-Subeinheit-Cystein ausbilden, welche Cysteine innerhalb zweier Reste von nativen Cysteinrestepositionen der genannten Glycoproteinhormone angeordnet sind und nicht außerhalb der äußersten Cysteineinheiten der entsprechenden nativen Subeinheit, zur Erzielung einer verbesserten Stabilität, wobei das Analogon wenigstens 25% der Affinität des entsprechenden Hormons für dessen nativen Glycoproteinhormonreceptor beibehält.
Analogon nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenzen der genannten Glycoproteinhormon-Subeinheiten so modifiziert sind, dass eine Disulfidbindung zwischen den Subeinheiten zwischen einem Cysteinrest innerhalb der Schlaufe 2 der α-Subeinheit und einem Cysteinrest innerhalb der Schlaufe 2 der β-Subeinheit ausgebildet wird.
Analogon nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenzen der genannten Glycoproteinhormon-Subeinheiten so modifiziert sind, dass eine Disulfidbindung zwischen den Subeinheiten zwischen einem Cysteinrest innerhalb von acht Resten des C-Terminus der α-Subeinheit und einem Cysteinrest innerhalb der Schlaufe 2 der β-Subeinheit ausgebildet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge des Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, welche eine Flüssigkeit ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, welche stabil ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit.
Verwendung eines Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung bei der Begrenzung der Fruchtbarkeit.
Verwendung eines Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung bei der Begrenzung der Fruchtbarkeit.
Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine Nucleotidsequenz aufweist, die eine α-Subeinheit des Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 11, welches ein Expressionsvektor ist.
Eukaryotische Wirtszelle, welche mit dem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 12 transformiert ist, wobei die genannte Wirtszelle tauglich ist, die α-Subeinheit eines Glycoproteinhormon-Analogons zu exprimieren.
Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine Nucleotidsequenz aufweist, die eine β-Subeinheit des Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 10, welches ein Expressionsvektor ist.
Eukaryotische Wirtszelle, welche mit dem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 14 transformiert ist, wobei die genannte Wirtszelle tauglich ist, die β-Subeinheit eines Glycoproteinhormon-Analogons zu exprimieren.
Verfahren zum Herstellen eines Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welches folgende Schritte aufweist: Züchten einer eukaryotischen Wirtszelle, die mit Nucleotidsequenzen der α- und β-Subeinheiten transformiert ist, welche auf dem gleichen oder auf getrennten Expressionsvektoren getragen werden; Exprimieren des Analogons; und Gewinnen des exprimierten Analogons.