DE69230881T2

DE69230881T2 - Corticotropinauslösefaktor-bindendes protein

Info

Publication number: DE69230881T2
Application number: DE69230881T
Authority: DE
Inventors: P. Behan; H. Fischer; A. Linton; J. Lowry; Ellen Potter; Walker Vale
Original assignee: University of Reading; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: University of Reading; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1991-01-15
Filing date: 1992-01-13
Publication date: 2000-11-16
Anticipated expiration: 2012-01-14
Also published as: ATE191502T1; JPH06504445A; CA2097424A1; WO1992013074A1; JP3090684B2; EP0568622A1; DE69230881D1; EP0568622B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Steuerung der biologischen Wirkung von CRF in Säugern und genauer gesagt CRFbindende Proteine, die zur Komplexbildung mit CRF eingesetzt werden können und dadurch die Wirkungsweie von CRF in Säugern modulieren, sowie Antikörper gegen solche Bindungsproteine.
Der Corticotropin-Freisetzungsfaktor CRF ist ein sehr potenter Stimulator der Synthese und Sekretion verschiedener Peptide im menschlichen Körper. Zwar ist der CRF-Gehalt im peripheren Blutkreislauf des Menschen normalerweise niedrig, doch kommt es oftmals zu erhöhten CRF-Gehalten im maternalen Kreislauf, die während der gesamten Schwangerschaft progressiv ansteigen. Man glaubt, dass dieser CRF im maternalen Plasma sehr wahrscheinlich seinen Ursprung in der Placenta hat, wobei er eine parakrine Rolle spielt. Es zeigte sich, dass Placentazellen auf CRF reagieren und CRF und dessen mRNA produzieren. Auch wenn die in maternalem Plasma im Spätstadium einer Schwangerschaft gemessenen CRF-Konzentrationen ähnlich jenen Gehalten sind, die im Pfortaderblut des Hypothalamus der Ratte befundet werden, welche Gehalte die ACTH-Freisetzung in vitro stimulieren können, scheint es nicht, dass normalerweise während der Schwangerschaft eine Überproduktion von ACTH stattfindet. Maternale Plasma-ACTH- Konzentrationen steigen jedoch geringfügig mit fortschreitender Schwangerschaft.
Es gibt Berichte von Proteinen (CRF-BPs) in menschlichem Plasma, die in der Lage sind, CRF biologisch zu inaktivieren, wie Linton, E.A. et al., Clin. Endo. 28, 315-324 (1988) und Behan, D.P. et al., J. Endo. 122, 23-31 (1989), wobei in letzterem ein Teilreinigungsverfahren geoffenbart ist, bei welchem die Reinheit des isolierten Proteins wesentlich höher geschätzt wird als später bestimmt wurde. Es liegt nahe, dass die Aufgabe dieser Proteinsubstanz in der Verhinderung von unangebrachter Hypophysen-Nebennieren-Stimulation während der Schwangerschaft liegt.
Menschliches CRF-BP (CRF-bindendes Procein) wurde bis zur Homogenität gereinigt und dann wurde das Protein (hCRF-BP) mittels Aminosäuresequenz-Analyse teilweise charakterisiert. Danach wurden Oligo-Primer hergestellt und die dem hCRF-BP entsprechende cDNA isoliert und kloniert und die DNA-Sequenz vollständig charakterisiert, u. zw. aus menschlicher Leber.
Ratten-CRF-BP-(rCRF-BP)-cDNA wurde aus dem Gehirn von Ratten kloniert. Die rekombinanten Moleküle wurden in COS-Zellen exprimiert, und es zeigte sich, dass sie CRF mit hoher Affinität binden. Die rekombinanten Proteine können CRF daran hindern, an CRF-Antikörper zu binden, und sie können die CRF-induzierte Freisetzung von ACTH in vitro durch Hypophysezellen inhibieren.
Diese Ratten- und Human-Proteine binden an das 41-Reste- Peptid, das Ratten/Human-CRF (r/h-CRF) darstellt, wobei Ratten und Menschen das gleiche CRF-Molekül aufweisen, dessen Struktur in der US-PS Nr. 4,489,163 dargelegt ist. Infolgedessen können diese Ratten- und Menschen-CRF-BPs zur Senkung von durch überschüssiges CRF verursachten hohen ACTH-Gehalten in Säugern verabreicht und zur Behandlung der Cushingschen Krankheit und dgl. verwendet werden. Diese CRF-BPs sind auch nützlich bei der Bekämpfung von Hypophysentumoren, die CRF produzieren. Darüber hinaus können sie zur Verringerung der ACTH-Sekretion durch die Hypophyse und damit zur Reduktion von Cortisolspiegeln unter Bedingungen jeglicher Art, unter denen diese abnormal hoch sind, beispielsweise unter chronischem Stress oder bei Patienten, die an nervöser Anorexie oder Alkoholismus leiden, verwendet werden. Es wurde gefunden, dass CRF-BPs bei intravenöser Verabreichung (i.v.) sich auch als wirksam bei der Präention von CRFinduzierter ACTH-Freisetzung erwiesen haben. Weiters wird erwogen, die i.v.-Verabreichung von CRF-BPs zur Erhöhung des Blutdrucks und auf diese Weise Bekämpfung von Hypotonie einzusetzen. Die gentechnische Produktion von CRF-BPs macht deren Verwendung auf die vorbeschriebene Weise möglich. Es wurden Antikörper gegen diese Proteine hergestellt, und diese Antikörper sind für diagnostische Untersuchungen zur Bestimmung von CRF-BP-Konzentrationen nützlich und können auch zur Reinigung des Proteins herangezogen werden. Daneben werden diese Antikörper als nützlich bei der Bekämpfung der biologischen Wirkung von CRF-BPs in vivo erachtet.
Durch Klonieren des menschliches CRF-BP codierenden Gens wird die rekombinante Expression dieses Proteins möglich gemacht, und es können in der Folge Behandlungsverfahren durch die periphere Verabreichung des rekombinanten Proteins durchgeführt werden. Die Klonierung menschlicher DNA wurde unter Verwendung der Aminosäuresequenz-Daten bewerkstelligt, die durch Isolieren des 37-kD-Proteins aus menschlichem Plasma in gereinigter Form unter Verwendung von mikropräparativer SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophoses (PAGE) erhalten wurden. Diese Abtrennung lieferte eine Hauptbande der erwarteten Größe von etwa 37 kD und eine Anzahl von Banden mit Verunreinigungen höherer und niedrigerer Molekulargewichte. Nach Übertragen der abgetrennten Proteine auf Nitrocellulose-Filtermaterial wurde die Bande ausgewählt und herausgeschnitten. Das daran gebundene gereinigte Protein wurde trypsiniert und die resultierenden Trypsinfragmente wurden unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC voneinander getrennt. Diese Fragmente wurden dann einzeln einem Edman-Abbau unterzogen, und Sequenzinformationen wurden aus sieben separaten Trypsinfragmenten erhalten, welche aus dem 37- kD-menschlichen Protein erhalten wurden. Im Anschluss an die vollständige Charakterisierung des Klons als einer, der ein Vorläuferprotein mit 322 Resten codiert, wurde ermittelt, dass diese sieben Trypsinfragmente, die als erste sequenziert wurden, die Reste 30-45, die Reste 47-55, die Reste 112-119, die Reste 123-135, die Reste 152-162, die Reste 163-175 und die Reste 294- 299 darstellen.
Ganz allgemein wurden als erster Schritt beim Klonieren Oligonucleotide auf Basis der Reste 30-45 und der Reste 152-162 gebildet. DNA aus einer menschliche-Erwachsenenleber-cDNA- Bibliothek wurde als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung verschiedener Kombinationen dieser Oligonucleotide als Primer verwendet. Eine Leber-cDNA-Bibliothek wurde deswegen gewählt, weil allgemein bekannt ist, dass eine Anzahl von Serum-bindenden Proteinen von der Leber synthetisiert werden.
Genauer gesagt wurde das menschliche Protein als Teil der ursprünglichen Analyse unter Verwendung einer hCRF-Sepharose- Affinitätssäule mit anschließender Gelfiltration teilweise aus Plasma gereinigt. Der abschließende Schritt der mikropräparativen SDS-Gel-Elektrophorese wurde dann unter Standardbedingungen für eine solche mikropräparative Reinigung durchgeführt, und die resultierenden Banden wurden auf Nitrocellulose transferiert. Die Haupt-Proteinbande, die dem Bindungsprotein entsprach, wurde herausgeschnitten und dann mit Trypsin in situ behandelt, wie allgemein auf diesem Gebiet bekannt ist, siehe P.N.A.S. 84, 6970-6974 (1987). Die Verschiedenen Trypsinfragmente wurden aus dem Überstand gewonnen und mittels RP-HPLC aufgelöst; dann wurden sie einzeln einem Edman-Abbau unterzogen, um die Aminosäuresequenzen davon zu erhalten. Zusätzlich erfolgte die N-Terminus-Sequenzanalyse des Gesamtproteins im Anschluss an dessen Reinigung mittels des SDS-Gel-Elektrophoreseschritts durch Binden der abgetrennten Bande an Polwinylidendifluorid-Filtermaterial, Herausschneiden der entsprechenden Bande und dann direkte Sequenzierung des reinen Materials.
Nach der Sequenzierung der sieben Trypsinfragmente wurden zwei Gruppen von degenerierten Oligonucleotid-Primern entsprechend dem Trypsinfragment 30-45 und dem Trypsinfragment 152-162 hergestellt. Ein erster degenerierter Oligonucleotid-Primer wurde basierend auf den Resten 33-43 im ersten Trypsinfragment gebildet,
GA(T/C)TA(T/C)GATCCNTT(T/C)(C/T)TN(C/T)TNTT(T/C)(T/A)(C/G)NGCNAA C.
Ein zweiter degenerierter Oligo-Primer wurde basierend auf den Resten 154-161 des anderen Trypsinfragments, das ausgewählt wurde, gebildet, CA(A/G)AA(T/C)GTNGCNATGATNTT(C/T)TTC.
DNA aus einer menschliche-Erwachsenenleber-cDNA-Bibliothek wurde als Matrize in 25 PCR-Zyklen mit 1-minütigem Denaturieren bei 94ºC, 2-minütigem Reassoziieren bei 45ºC und 3-minütigem Verlängern bei 72ºC verwendet. Die PCR-Produkte wurden auf 1- %igem (w/v) TBE-Agarosegel analysiert; ein 387-bp-Fragment wurde in eine 12 M Ammoniumacetatlösung unter Verwendung eines IBI- Bio-Rad-Elektroeluters, Modell UEA, elektroeluiert. Das 387-PCR- Fragment wurde in die Sma-I-Stelle des Bluescript-KS-Vektors subkloniert, und dann erfolgte die Nucleotidsequenzierung bei Anwendung des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens nach Sanger unter Verwendung von Sequenase (USB). Das sequenzierte DNA- Fragment enthielt einen offenen Leserahmen, der auch die Trypsinfragmente 47-55, 112-119 und 123-135 codierte, zusammen mit Peptiden, die den beiden obigen Oligonucleotid-Primern am 5'- und am 3'-Ende entsprachen.
Der codierende Bereich aus diesem PCR-Subklon wurde willkürlich Primer-unterstützt und dann zum Durchmustern der ursprünglichen Erwachsenenleber-cDNA-Bibliothek verwendet.
Zweifache Nitrocellulosefilter wurden in 50-%igem Formamid, S Teilen SSC-Puffer, 1 Teil Denhardtscher Lösung, 0,1% SDS, 100 (g/ml zerkleinerter Lachssperma-DNA und ³²P-markiertem Insert (1 · 10&sup6; cpm/ml) bei 42ºC 18 Stunden lang hybridisiert. Die Filter wurden bei 60ºC in 2 · SSC gewaschen. Es wurden zwei partielle überlappende Klone für den hCRF-BP-codierenden Bereich isoliert, die die Inserts 650 bp bzw. 570 bp enthielten. Die Inserts wurden subkloniert, sequenziert und enthielten nachgewiesenermaßen partielle cDNA-Sequenzen für Human-CRF-BP.
Eine neue Bibliothek wurde unter Verwendung von menschliche- Erwachsenenleber-RNA konstruiert, um cDNA-Klone voller Länge zu erhalten. mRNA wurde mittels des Guanidiumisothiocyanat- Cäsiumchlorid-Verfahrens und Oligo-dT-Chromatographie isoliert. 10 (g mRNA wurde für das (-Zap-II-Kloniersystem (Stratagen) verwendet, das eine Bibliothek mit 5 · 10&sup6; Basen bildete. 1 · 10&sup6; Plaques wurden mit Inserts aus den beiden partiellen überlappenden Klonen gescreent. Es wurden sieben Klone identifiziert, von denen einer ein 1,8-kb-Insert mit einem offenen Leserahmen enthielt, das für ein 322-Aminosäuren-Protein codierte, welches sämtliche Aminosäuresequenzen aus den Trypsinfragmenten des gereinigten hCRF-BP enthielt und dessen abgeleitete AA-Sequenz nachstehend als SEQ ID No: 1 angeführt ist. Wie nachstehend angemerkt, glaubt man, dass diese Aminosäuresequenz aus 322 Resten eine Signalsequenz am Rest 24 enthält:
Die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons ist nachstehend als SEQ ID N0: 2 angeführt (wobei die codierte Aminosäurensequenz unmittelbar unter jedem Codon angegeben ist):
Basierend auf der N-terminalen Sequenzierung des gereinigten hCRF-BP wird ermittelt, dass das reife Protein beim Rest 25 beginnt und dass, wie oben bemerkt, ein N-terminaler Rest 24 eine Signalsequenz bildet wie sie oben dargestellt ist. In der vorhergesagten Sequenz wird beim Rest 180 (basierend auf der Rest-298-Sequenz) eine vermeintliche N-Glycosylierungsstelle gefunden, die mit der Anwesenheit von Asparagin-gekoppelten Zuckerkomponenten im nativen hCRF-BP übereinstimmt. Durch eine Analyse der Sequenz voller Länge auf Hydrophobizität unter Verwendung des Kyte-und-Doolittle-Programms wurde ein Muster von willkürlich dispergierten hydrophoben und hydrophilen Abschnitten nachgewiesen, die charakteristisch für ein lösliches Protein sind. Es gibt 10 dazwischen dispergierte Cysteinreste (ausgenommen die Rest-24-Signalsequenz), was auf die mögliche Anwesenheit von fünf intramolekularen Disulfidbindungen hindeutet. Dies stimmt überein mit den experimentellen Daten, dass die reduzierte Form des gereinigten hCRF-BP bei Laufen über SDS- Gel ein höheres scheinbares Molekulargewicht aufweist als die nicht reduzierte Form - ein Merkmal eines Proteins, das Disulfidbindungen enthält.
Wie zuvor ausgeführt, hat das CRF-Protein der Art Mensch genau die gleiche Sequenz mit 41 Aminosäuren wie das CRF-Protein der Art Ratte, aufgrund welcher Tatsache eine Homologie zwischen den kritischen Regionen der Bindungsproteine recht gut vorhergesagt werden kann. mRNA aus Rattenhirn wurde auf mRNA für CRF-BP gescreent und es wurde die Target-mRNA nachgewiesen. Danach wurde eine Ratten-Cortex-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von menschlicher cDNA, die dem zuvor genannten gereinigten hCRF- BP entsprach, als Hybridisierungssonde durchgemustert, und es wurden mehrere Klone isoliert. Ein Klon enthielt ein 1,85-kb- Insert, das sequenziert wurde; es prophezeite ein Vorläuferprotein mit 322 Äminosäuren, das zu 84% identisch mit Human- CRF-BP ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Ratte ist nachstehend als SEQ ID N0: 3 angeführt:
Die Nucleotidsequenz des Klons, von welchem die Sequenz abgeleitet wurde, ist nachstehend als SEQ ID N0: 4 angeführt, wobei die codierte Aminosäuresequenz unmittelbar unter jedem Codon dargestellt ist:
Die Anmelder definieren ihre Erfindung als DNA-codierendes CRF-bindendes Protein (CRF-BP), wobei die DNA wie nachfolgend in A, B, C oder D definiert ist:
A. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines Human-CRF-(hCRF)-bindenden Proteins (hCRF-BP) codiert, welches zur Inaktivierung von hCRF an hCRF bindet, wobei die DNA-Sequenz an die folgend in B definierte DNA hybridisierbar und durch die folgenden spezifischen Arbeitsgänge erhältlich ist:
(i) Reinigen von hCRF-BP aus Humanplasma mittels eines Reinigungsverfahrens umfassend:
(a) Elution des menschlichen Plasmas durch eine hCRF- Sepharose-Affinitätssäule,
(b) Gelfiltration der eluierenden Fraktion,
(c) mikropräparative SDS-Gelelektrophorese,
(d) Übertragung der resultierenden Banden auf Nitrocellulose und
(e) Excision der Haupt-Proteinbande;
(ii) Erhalten zweier durch die nachfolgend in (iii) dargelegten AA-Sequenzen identifizierter Trypsinfragmente aus der ausgeschnittenen Proteinbande durch ein Verfahren umfassend:
(a) Trypsinieren der ausgeschnittenen Proteinbande durch Behandeln mit Trypsin und
(b) Gewinnen einer die zwei vorgenannten Trypsinfragmente umfassenden Fraktion aus dem bei der Trypsinisierungsbehandlung gebildeten Überstand, gefolgt von RP-HPLC-Auflösung derselben
(iii) Weiterleiten zweier die jeweilige nachfolgend dargelegte AA-Sequenz aufweisender Polypeptide zu einer Oligonucleotidprimer-Herstellungsstufe, wobei die Polypeptide die aus obigem Schritt (ii) (b) erhaltenen aufgelösten Trypsinfragmente sind:
Glu-Ala-Ala-Asp-Tyr-Asp-Pro-Phe-Leu-Leu-Phe-Ser-Ala-Asn-Leu-Lys bzw.
Ser-Ser-Gln-Asn-Val-Ala-Met-Ile-Phe-Phe-Arg
(iv) Bilden der beiden nachstehend definierten Gruppen von degenerierten Oligonucleotidprimern, die Teilen der vorgenannten AA-Sequenzen der Trypsinfragmente entsprechen:
und
(v) Ausführen von mehrfachen PCR-Zyklen unter Verwendung von DNA aus einer menschliche-Erwachsenenleber-cDNA-Bibliothek als Matrize, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das ein die beiden AA-Sequenzen enthaltendes Peptid codiert, und
(vi) Verwenden des DNA-Fragments als Sonde zum Durchmustern der menschliche-Leber-cDNA-Bibliothek, um eine DNA zu erhalten, die das die beiden AA-Sequenzen enthaltende menschliche CRF-BP codiert;
B. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines Ratten-CRF-(rCRF)-bindenden Proteins (rCRF-BP) codiert, welches zur Inaktivierung des hCRF an hCRF bindet, wobei das rCRF-BP AA SEQ ID N0: 3 aufweist;
C. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines hCRF-BP-Homologs oder eines rCRF-BP-Homologs codiert, welches Homolog für eine andere Säugerart nativ ist und zur Inaktivierung des hCRF an hCRF bindet; und
D. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines CRF-bindenden AA-Fragments von hCRF-BP, rCRF-BP oder eines hCRF-BP- oder rCRF-BP-Homologs wie zuvor in C definiert codiert.
In den Rahmen der Erfindung fällt auch ein rekombinantes Protein mit den folgenden Merkmalen:
(i) es komplexiert zum Corticotropin-Freisetzungsfaktor;
(ii) es enthält eine AA-Sequenz wie nachstehend definiert:
(a) eine AA-Sequenz wie von der unter A. von oben definierten hCRF-BP-DNA codiert;
(b) eine AA-Sequenz von rCRF-BP wie unter B. von oben definiert, nämlich AA SEQ ID N0: 3;
(c) eine AA-Sequenz eines hCRF-BP- oder rCRF-BP- Homologs wie unter C. von oben definiert; oder
(d) eine AA-Sequenz eines CRF-bindenden AA-Fragments wie unter D von oben definiert;
(iii) es hat eine Reinheit von zumindest etwa 98%; und
(iv) es bindet an hCRF, um die biologische Inaktivität desselben zu bewirken.
Alle zehn in den oben dargelegten AA-Sequenzen gezeigten Cysteinreste und die genannte vermeintliche N-Glycosylierungsstelle scheinen sowohl in der Ratten-Sequenz als auch in der Human-Sequenz an genau denselben Resten auf; diese Konservierung zwischen Human- und Ratten-CRF-BPs deutet darauf hin, dass diese Reste eine bedeutende Rolle bei der Struktur/Funktion von CRF-BP spielen können.
Da der rCRF-BP-Klon voller Länge aus einer Okayama-Berg- Bibliothek isoliert wurde, enthielt er somit einen SV40-Promotor und ein Polyadenylierungssignal, weshalb er sich für die Transfektion in COS-Zellen eignet, siehe Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 (1982). Das cDNA-Insert voller Länge des hCRF-BP wurde in einen ähnlichen Vektor, nämlich pSGS (Stratagen), der einen SV40-Promotor, eine (-Globulin-Spleißstelle und ein SP40- Polyadenylierungssignal enthält, inseriert. Die Expressionskonstrukte sowohl für Ratten- als auch für Human-CRF-BP wurden in COS-Zellen transfiziert und die Medien aus den Zellen wurden gesammelt. Zellen, die mit cDNAs entweder für hCRF-BP oder für rCRF-BP transfiziert wurden, schieden Proteine aus, die wirksam waren bei der Inhibition von CRF, an einen anti-CRF-Antikörper zu binden. Genauer gesagt wurde das 1,8-kb-Insert, das die für das Human-Protein codierende Nucleotidseguenz enthält, mit XhoI- (gefülltem)-Bam-HI ausgeschnitten und in die Bgl-II-(gefüllte)- Bam-Stelle des pSGS-Vektors (Stratagen) subkloniert. COS7-Zellen wurden unter Verwendung von DEAE-Dextran vorübergehend transfiziert, wobei die SV40-Expressionsvektoren cDNA-Inserts für Human- und Ratten-CRF-BP enthielten. 72 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gesammelt. Verschiedene Verdünnungen von konditioniertem Medium wurden mit einer Spur von ¹²&sup5;I-rCRF und einer 1 : 6000-Verdünnung von Kaninchen-anti-CRF- Antikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Proben wurden mit Schaf-anti-Kaninchen-Gammaglobulin und 10%-igem Polyethylenglycol (PEG) ausgefällt. Im Anschluss an das Waschen mit SPEA-Puffer (50 mM Natriumphosphat, 100 mM Natriumchlorid, 25 mM EDTA, 0,1% Natriumazid) wurden die Niederschläge zentrifugiert und die Pellets radioaktiv gezählt.
Die von den Medien aus den COS-Zellen gewonnenen CRF-BP- Proteine zeigten eine Bioaktivität bei der Inhibition von CRF- inäuzierter ACTH-Freisetzung aus primären Ratten-Hypophysezellen auf kompetitive Weise. Die Ergebnis dieser Versuchsdaten zeigen, dass das Ratten-CRF-BP und das Human-CRF-BP im wesentlichen gleich wirksam bei der Inhibition von CRF- induzierter ACTH-Freisetzung sind, was insofern nicht unerwartet kommt, als die beiden nativen CRF-Proteine die exakte Aminosäuresequenz aufweisen. Bei diesen Versuchen wurde konditioniertes Medium auf primäre und auf Träger-Hypophysezellkulturen platziert, u. zw. unter Anwendung bekannter Methoden wie sie bereits in Vale, W. et al., Methods in Enzymology - Hormone Action: Neurooeotides (Academic Press) 124, 389-401 (1986) beschrieben wurden. Unterschiedliche rCRF-Konzentrationen wurden dem Medium zugesetzt und die Kulturen 3 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und mittels Doppel-Antikörper-RIA (Diagnostic Products Corp.) auf ACTH untersucht. Als Ergebnis dieser Tests ist man zur Ansicht gelangt, dass die Bioaktivität von CRF infolge der Bindung zwischen CRF und CRF-BPs ausgeschaltet wird, und es wird daher in Betracht gezogen, CRF-BPs zur Behandlung von Hypertonie zu verwenden, von der man annimmt, dass sie durch erhöhte CRF-Konzentrationen verursacht wird, wie im Fall von Schwangerschaft-inäuzierter Hypertonie. Die i.v.- Verabreichung von 50 (g CRF-BP an männliche Ratten, gefolgt von 5 (g r/h-CRF nach einer Minute, zeigten keinerlei Anstieg beim Plasma-ACTH während 30 Minuten, was die Wirksamkeit der CRF-BP- Verabreichung in vivo beweist.
Analysen von Human- und Ratten-CRF-BPs zeigen, dass gentechnisch hergestellte Bindungsproteine die gleiche hohe Affinität für Human/Ratten-CRF haben wie gereinigtes Human CRF- BP (Kd = 0,1 ± 0,2 nM). Die Versuchsdaten zeigen jedoch, dass rekombinante CRF-BPs Schaf-CRF mit einer viel schwächeren Affinität binden. Dies deutet auf einen Unterschied zwischen dem Bindungsprotein und dem Hypophysen-CRF-Rezeptor, der keinen signifikanten Unterschied zwischen der Bindung an h/rCRF und der Bindung an oCRF macht. Darüber hinaus scheint es, dass CRF-BPs eine gleich hohe oder höhere Affinität für h/rCRF haben als CRF- Rezeptoren. CRF und seine Targetzellen-Rezeptoren sind über das Zentralnervensystem und in einer Anzahl von peripheren Geweben, einschließlich der Placenta, der Nebenniere, den sympathischen Ganglien, den Lymphozyten, dem Magen-Darm-Trakt, der Bauchspeicheldrüse und den Gonaden, weit verstreut. Im allgemeinen wird CRF auf transsynaptische, paracine oder neuroendokrine Weise erzeugt und wirkt auch so. Es scheint, dass Plasma-CRF-BP einen Mechanismus zum Schutz des Menschen vor hormonell signifikanten CRF-Konzentrationen schafft und dadurch die Integrität dieses eingeschränkten Systems insbesondere während der Schwangerschaft schützt. Die Anwesenheit von mRNA für CRF-BP im Gehirn von Primaten und Ratten weist darauf hin, dass sich dieses Protein an manche CRF-Pfade co-lokalisiert und die neurale Rolle des Neuropeptid-CRF moduliert.
Antikörper gegen diese CRF-BP-Proteine entweder monoklonaler oder polyklonaler Form können unter Verwendung von bekannten Methoden des derzeitigen Standes der Technik hergestellt werden, und Antikörper, die bei der Bekämpfung der Wirkungen von CRF-BP wirksam sind, können einfach unter Verwendung des synthetischen N-terminalen Segments des Human- oder Rattenproteins erhalten werden. Beispielsweise erkennen Antikörper, die in Kaninchen gegen ein die aminoterminale Sequenz von Buman-CRF-BP darstellendes synthetisches Peptid gezüchtet werden, das synthetische Peptid und das CRF-BP auf äquimolarer Basis und sind in der Lage, die Aktivität des nativen Proteins in vitro zu inhibieren. Gegen das Aminoende gerichtete CRF-BP-Antikörper können durch Immunisieren von drei Monate alten männlichen und weiblichen weißen New-Zealand-Kaninchen mit dem synthetischen Peptid, an dessen C-Terminus Tyr angefügt wurde, um es als Antigen über eine bisdiazotisierte Benzidin-(BDB)-Bindung durch Umsetzung bei 4ºC während 2 Stunden an BSA zu koppeln. Die Reaktionsmischung wird zur Entfernung von Material mit niedrigem Molekulargewicht dialysiert und das Retentat in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20ºC aufbewahrt. Die Tiere werden mit dem Äquivalent von 1 mg des Peptid-Antigens gemäß dem Verfahren von Benoit et al., P.N.A.S. USA, 79, 917-921 (1982) immunisiert. In vierwöchigen Intervallen werden die Tiere durch Injektionen von 200 (g des Antigens nachgeimpft, und zehn bis vierzehn Tage später wird ihnen Blut abgenommen. Nach der dritten Auffrischungsimpfung wird das Antiserum auf seine Fähigkeit untersucht, radioiodiertes Antigen-Peptid zu binden, das durch das Chloramin-T-Verfahren hergestellt und dann mittels CMC-Ionenaustausch-Säulenchromatografie gereinigt wurde.
Mit den Antiseren und dem Serum aus anschließenden Blutabnahmen von denselben Kaninchen wird ein Radioimmunoassay erstellt. Das native Protein wird vor den Antikörpern auf äquimolarer Basis im Vergleich zum synthetischen Peptid-Antigen erkannt. Diese Antikörper werden als fähig angesehen, die biologische Aktivität von CRF-BP zumindest teilweise zu neutralisieren, und es kann wahrscheinlich im wesentlichen die gesamte derartige Aktivität neutralisiert werden, wenn größere Antikörpermengen eingesetzt werden. Man glaubt, dass auch Immunaffinität oder Affinitätschromatografie angewendet werden kann, um die Reinigung von CRF-BP aus Serum oder aus anderen biologischen Substanzen zu bewerkstelligen.
Diese Antikörper können für Untersuchungen zum Nachweis der CRF-BP-Gehalte in Säugern, insbesondere Menschen, verwendet werden. Die Antikörper können auch für die Behandlung zur Neutralisierung der Wirkung von CRF-BP in Säugern eingesetzt werden und sollten sich auch als recht nützlich für Diagnose- Testkits und dgl. erweisen.
Wie zuvor ausgeführt, ist es sehr wahrscheinlich, dass eine interne Disulfidbindung zwischen Cysteinresten der Kette besteht. Säuger-CRF-BP-Polypeptide, die mittels gentechnischer DNA-Methoden hergestellt werden, sind von sich aus biologisch aktiv, möglicherweise weil die dreidimensionale Struktur, die das CRF-BP innerhalb der Zellen annimmt, jene Struktur ist, die an natives CRF-Protein binden kann. Die dreidimensionale Struktur, die das Molekül durch natürliches Falten und durch hydrophobe und hydrophile Wechselwirkungen mit wässerigen Medien annimmt, kann die gewünschte Bindung oder Nicht-Bindung zwischen Cysteinresten fördern. Auch können enzymatische Regulationsmechanismen innerhalb von Zellen dazu beitragen, die gewünschte Disulfidbindung oder -Nicht-Bindung zu gewährleisten, entweder indem sie die Bindung verhindern oder die Disulfidbindung zwischen bestimmte Cysteinreste lenken. Enzyme könnten auch eine "inkorrekte" Bindung spalten, um dem Molekül die Möglichkeit zu geben, sich selbst neu zu orientieren und die korrekte natürliche Struktur anzunehmen. Cysteinreste, die nicht intern gebunden sind, können an freie Cysteinteile mittels Disulfid gebunden werden. Die dreidimensionale Struktur des Moleküls kann auch derart sein, dass eine willkürliche Bindung oder Nicht- Bindung von Cysteinresten entweder aneinander oder an freie Cysteine die biologische Struktur des Proteinmoleküls nicht wesentlich beeinflusst.
Zur Synthetisierung eines Proteins mit der Säuger-CRF-BP- Aminosäurerestsequenz mittels rekombinanter DNA könnte eine doppelstrangige DNA-Kette, die CRF-BP codiert, synthetisch konstruiert werden. Auch wenn man heutzutage das Gefühl hat, dass PCR-Methoden nach Belieben zur Herstellung von DNA-Ketten gewählt werden können, könnte eine CRF-BP codierende DNA-Kette unter Verwendung gewisser spezieller Codons gebildet werden, die bei einem bestimmten Typ von Organismus wirksamer für Polypeptidexpression sind, d. h. die Auswahl könnte jene Codons betreffen, die für die Expression in dem Typ von Organismus, der als Wirt für den rekombinanten Vektor dienen soll, am wirksamsten sind. Jede korrekte Gruppe von Codons codiert jedoch ein gewünschtes Produkt, wenn auch vielleicht etwas weniger wirkungsvoll. Die Codon-Selektion kann auch von Überlegungen hinsichtlich der Vektorkonstruktion abhängen; beispielsweise kann es notwendig sein, die Anordnung einer bestimmten Restriktionsstelle in der DNA-Kette zu vermeiden, wenn im Anschluss an die Insertion der synthetischen DNA-Kette der Vektor unter Verwendung des Restriktionsenzyms, das an einer solchen Stelle spaltet, manipuliert werden soll. Auch sollte vermieden werden, Restriktionsstellen in der DNA-Kette vorzusehen, wenn man weiß, dass der Wirtsorganismus, der mit dem die DNA-Kette enthaltenden rekombinanten Vektor transformiert werden soll, ein Restriktionsenzym erzeugt, das an einer solchen Stelle innerhalb der DNA-Kette eine Spaltung bewirken würde.
Zum Aneinanderfügen einer synthetischen CRF-BP-codierenden DNA-Kette können Oligonucleotide mittels herkömmlicher Verfahren wie den in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) (im folgenden MCLM) beschriebenen konstruiert werden. Oligonucleotidketten in der einen und anderen Richtung, die bis zu etwa 70 Nucleotidreste lang sind, werden vorzugsweise auf automatischen Synthetisierern wie dem DNA-Synthetisierer von Applied Biosystem Inc., Modell 380A, synthetisiert. Die Oligonucleotidketten werden so konstruiert, dass Teile der Oligonucleotide in der einen und der anderen Richtung einander überlappen und sich durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenpaaren miteinander assoziieren und dabei doppelsträngige Ketten meist mit Lücken in den Strängen bilden. In der Folge werden die Lücken in den Strängen gefüllt und Oligonucleotide jedes Strangs in Gegenwart geeigneter DNA- Polymerasen und/oder mit Ligasen Ende an Ende mit Nucleotidtriphosphaten verbunden.
Als Alternative für eine derartige schrittweise Konstruktion einer synthetischen DNA-Kette wird die cDNA verwendet, die dem CRF-BP, welches zur Ableitung der vollständigen CRF-BP Struktur kloniert wurde, entspricht. Wie wohl bekannt ist, wird eine cDNA-Bibliothek oder eine Expressionsbibliothek auf herkömmliche Weise durch umgekehrte Transkription aus Nessenger-RNA (mRNA) aus einer geeigneten CRF-BP-produzierenden Zelllinie oder Gewebe für die gewünschte Säugerart hergestellt. Zwecks Selektion von die CRF-BP-Sequenzen enthaltenden Klonen wird die mittels PCR- Technik erhaltene Hybridisierungssonde (oder es werden gemischte Sonden erzeugt, die die Entartung des genetischen Codes aufnehmen und einem ausgewählten Teil des CRF-BP-Proteins entsprechen) zur Identifikation von Klonen, die derartige Sequenzen enthalten, verwendet. Auch ist die Durchmusterung einer solchen Expressionsbibliothek mit CRF-BP-Antikörpern möglich, u.zw. entweder allein oder in Verbindung mit Kybriäisierungssondieren, um die Anwesenheit von CRF-BP-codierenden DNA-Sequenzen in cDNA- Bibliotheksklonen, die CRF-BP exprimieren, zu identifizieren oder zu bestätigen. Derartige Methoden werden beispielsweise in MCLM, siehe oben, gelehrt.
Abgesehen von den CRF-BP-codierenden Sequenzen sollte eine DNA-Kette in Abhängigkeit von Vektorkonstruktionsüberlegungen weitere Sequenzen enthalten. Typischerweise besitzt eine synthetisierte DNA-Kette Linker an ihren Enden, um die Insertion in Restriktionsstellen innerhalb eines Klonierungsvektors zu vereinfachen. Eine DNA-Kette kann so aufgebaut werden, dass sie die CRF-BP-Aminosäuresequenzen als Teil eines Fusionspolypeptids codiert; ist dies der Fall, enthält sie im allgemeinen terminale Sequenzen, die Aminosäurerestsequenzen codieren, welche als proteolytische Verarbeitungsstellen dienen, wodurch das CRF-BP- Polypeptid vom restlichen Fusionspolypeptid proteolytisch abgespaltet werden kann. Die terminalen Teile der synthetischen DNA- Kette können auch entsprechende Start- und Stopp-Signale enthalten.
Dementsprechend wird eine doppelsträngige CRF-BP-codierende DNA-Kette mit entsprechenden Linkem für deren Insertion in einen speziellen, geeigneten Klonierungsvektor konstruiert oder modifiziert. Der Klonierungsvektor, der für die Inkorporierung der DNA-Kette rekombiniert werden muss, wird nach seiner Brauchbarkeit und Expression in einem Wirtsorganismus oder eine Wirtszelllinie ausgewählt, und die Art und Weise der Insertion der DNA-Kette hängt von wirtsspezifischen Faktoren ab. Wenn die DNA-Kette beispielsweise in einen Vektor zur Insertion in eine Prokarvontenzelle wie E. coli inseriert werden soll, so wird die DNA-Kette 3' von einer Promotor-Sequenz, nämlich einer Shine- Delgarno-Sequenz (oder Ribosomen-bindenden Stelle), die innerhalb eines 5'-untranslatierten Teils und eines ATG-Start- Codons liegt, inseriert. Das ATG-Start-Codon liegt in einem entsprechenden Abstand von der Shine-Delgarno-Sequenz und die codierende Sequenz wird im richtigen Leserahmen mit dem ATG- Start-Codon platziert. Der Klonierungsvektor schafft auch einen 3'-untranslatierten Bereich und eine Translations-Endstelle. Zur Insertion in eine Eukaryontenzelle wie eine Hefezelle oder eine Zelllinie aus einem höheren Lebewesen wird die CRF-BP-codierende Oligonucleotidsequenz in einem entsprechenden Abstand von einer mit Cap versehenen Stelle und im richtigen Leserahmen mit einem ATG-Startsignal angeordnet. Der Klonierungsvektor schafft auch einen 3'-untranslatierten Bereich und eine Translations- Endstelle.
Prokaryonten-Transformationsvektoren wie pBR322, pMB9, Col E1, pCR1, RP4 und Lambda-Phage stehen zur Insertion einer DNA- Kette einer Länge, die CRF-EP unter wesentlicher Gewährleistung von zumindest einer gewissen Expression des codierten Polypeptids codiert, zur Verfügung. Typischerweise werden solche Vektoren so konstruiert oder modifiziert, dass sie eine oder mehr nur einmal vorhandene Restriktionsstelle(n) aufweisen, die in Bezug auf einen Promotor wie dem lac-Promotor entsprechend positioniert sind. Die DNA-Kette kann mit entsprechenden Linkem in eine derartige Restriktionsstelle inseriert werden, wobei die Produktion von CRF-BP in einer mit dem rekombinanten Vektor transformierten Prokaryonten-Zelllinie im wesentlichen gewährleistet ist. Zur Gewährleistung des richtigen Leserahmens können Linker verschiedener Länge an den Enden der CRF-BP-codierenden Sequenzen vorgesehen sein. Alternativ stehen Kassetten, die Sequenzen wie den 5'-Bereich des lac-Z-Gens (einschließlich des Operators, Promotors, der Transkriptions-Startstelle, der Shine- Delgarno-Sequenz und des Translationsstartsignals), den Regulationsbereich aus dem Tryptophan-Gen (trp-Operator, Promotor, Ribisomen-Bindungsstelle und Translationsstarter) und ein Fusionsgen, das die beiden Promotoren, genannt trp-lac oder allgemein Tac-Promotor, enthalten, zur Verfügung, in die die synthetische DNA-Kette bequem inseriert und dann die Kassette in einen Klonierungsvektor nach Wahl inseriert werden kann.
Desgleichen stehen Eukaryonten-Transformationsvektoren wie das klonierte Rinder-Papillomavirusgenom, die klonierten Genome der Mäuse-Retroviren und Eukaryonten-Kassetten wie das pSV-2- gpt-System (das von Mulligan und Berg, Nature 277, 108-114, 1979 beschrieben ist), das Okayama-Berg-Kloniersystem (Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982) und der kürzlich von Genetics Institute (Science 228, 810-815, 1985) beschriebene Expressions- Klonierungsvektor zur Verfügung, die eine wesentliche Sicherheit für zumindest eine gewisse Expression von CRF-BP in der transformierten Eukaryonten-Zelllinie bieten.
Wie zuvor erwähnt, besteht ein bequemer Weg zur Sicherung der Produktion von CRF-BP oder eines Proteins ähnlicher Länge darin, zuerst das Protein als Segment eines Gen-codierenden Fusionsproteins zu erzeugen. In diesem Fall wird die DNA-Kette so konstruiert, dass das exprimierte Protein enzymatische Verarbeitungsstellen besitzt, die die CRF-BP-Aminosäurerestsequenzen flankieren. Eine CRF-BP-codierende DNA-Kette kann beispielsweise in das Beta-Galactosidase-Gen zur Insertion in E. coli inseriert werden, in welchem Fall das exprimierte Fusionsprotein anschließend mit proteolytischen Enzymen gespalten wird, um CRF-BP aus Beta-Galactosidase-Peptidsequenzen frei zu setzen.
Ein Vorteil der Insertion der CRf-BP-codierenden Sequenz zwecks Exprimierung der CRF-BP-Sequenz als abspaltbares Segment eines Fusionsproteins, z. B. als innerhalb der Beta- Galactosidase-Peptidsequenz verschmolzene CRF-BP-Sequenz, besteht darin, dass das endogene Protein, in welches die CRF-BP- Sequenz inseriert wird, im allgemeinen nicht funktionell gemacht wird, wodurch die Auswahl von Vektoren, die das Fusionsprotein codieren, erleichtert wird.
Das CRF-BP-Protein kann unter Anwendung bekannter gentechnischer DNA-Methoden auch in Hefe reproduziert werden. Beispielsweise wird ein CRF-BP enthaltendes Plasmid (pCRF-BP) in einem pCRF-BP-produzierenden E.-coli-Klon amplifiziert, isoliert und dann mit Eco RI und Sal I gespaltet. Dieses verdaute Plasmid wird einer Elektrophorese auf Agarosegel unterzogen, wodurch die Abtrennung und Gewinnung des amplifizierten pCRF-BP-Inserts möglich wird. Das Insert wird in Plasma-pYEp, einen Shuttle- Vektor, der zur Transformation von sowohl E.-coli als auch Saccharomyces-cerevisiae-Hefen verwendet werden kann, inseriert. Die Insertion der synthetischen DNA-Kette an dieser Stelle gewährleistet, dass sich die DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors, im richtigen Leserahmen von einem ATG-Signal aus und in richtigem Abstand zu einer mit Cap versehenen Stelle befindet. Der Shuttle-Vektor wird zur Transformation von URA3, einem S. - cerevisiae-Hefestamm, von dem das Oratatmonophosphatdecarboxylase-Gen abgeleitet ist, verwendet.
Die transformierte Hefe wird in Medium kultiviert, um logarithmisches Wachstum zu erzielen. Die Hefe wird von ihrem Kulturmedium abgetrennt und Zelllysate werden hergestellt. An gepoolten Zelllysaten wird mittels RIA festgestellt, dass sie mit Antikörpern gegen CRF-BP reagieren, was beweist, dass ein proteinhaltiges CRF-BP-Proteinsegment in den Hefezellen exprimiert wird. Die Produktion von CRF-BP kann sowohl in Prokaryonten- als auch in Eukaryonten-Zelllinien durchgeführt werden, um Protein für biologischen und therapeutischen Gebrauch zu schaffen. Während die CRF-BP-Synthese unter Verwendung von entweder Bakterien- oder Hefe-Zelllinien leicht nachgewiesen wird, sollten die synthetischen Gene zur Expression in Zellen höherer Lebewesen wie Säugertumorzellen inserierbar sein. Solche Säugerzellen können beispielsweise als peritoneale Tumore in Wirtslebewesen gezüchtet werden, und CRF-BP kann aus der peritonealen Flüssigkeit geerntet werden.
Die obigen Beispiele zeigen zwar, dass CRF-BPs durch gentechnische DNA-Methoden synthetisiert werden können, die Beispiele erheben jedoch keinen Anspruch auf eine Maximierung der CRF-BP-Produktion. Es ist zu erwarten, dass bei späterer Selektion von effizienteren Klonierungsvektoren und Wirtszelllinien die CRF-BP-Ausbeuten ansteigen werden. Bekannte Gen- Amplifikationsmethoden sowohl für Eukaryonten- als auch für Prokaryontenzellen können ebenfalls zur Steigerung der Produktion von CRF-BP verwendet werden. Die Sekretion des Gencodierten Proteins aus der Wirtszelllinie in das Kulturmedium wird auch als bedeutender Faktor bei der Gewinnung von synthetischem CRF-BP in großen Mengen erachtet.
Die Verfügbarkeit solcher Säuger-CRF.-BP-Proteine gestattet deren Verwendung zur Komplexierung und Neutralisierung von CRF, und diese Proteine sollten bei der Behandlung von Zuständen nützlich sein, die durch einen Überschuss an CRF verursacht werden, beispielsweise unter chronischem Stress oder in Anwesenheit eines CRF-ausscheidenden Tumors. Weiters können CRF- BPS zur Bindung, Maskierung und/oder Detektion von CRF entweder durch sie selbst oder in Verbindung mit einem CRF-Antikörper unter Verwendung der "Zweistellen"-Methode verwendet werden. Die Bindungsfähigkeit von CRF-BPs macht es möglich, dass diese in einer Affinitätschromatografiesäule zur Reinigung von hCRF herangezogen werden können. Darüber hinaus bietet die Verabreichung von im wesentlichen reinen monoklonalen Antikörpern gegen CRF-BP therapeutische Anwendungsmöglichkeiten bei der Behandlung von Fällen, wo es wünschenswert ist, der Bindungswirkung von CRF-BPs entgegen zu wirken.
Im wesentlichen reines CRF-BP-Protein, das eine signifikant höhere Reinheit besitzt als in Rohextrakten aus Säugerserum vorhandenes CRF-BP, kann routinemäßig erhalten werden. CRF-BP- Proteine stellen nur geringfügige Bestandteile von normalem Säugerserum dar, da sie im Vergleich zu anderen nativen Proteinen, die ebenfalls anwesend sind, nur in sehr unreiner Form vorhanden sind. Aufgrund des damit verbundenen Arbeitsaufwands und der geringen Konzentration im Plasma wäre es unpraktisch, CRF-BP durch Reinigung aus natürlichen Quellen herzustellen. Gentechnische DNA-Methoden können beispielsweise zur Erzeugung von Organismen oder Zelllinien verwendet werden, die das heterologe Protein in signifikant höheren Mengen im Verhältnis zum Gesamtprotein im Zellmaterial und/oder den Sekreten aus diesem - verglichen zu den Mengen, in denen natives CRF-BP anwesend ist - produzieren. Da das Ausgangsmaterial, aus dem solche synthetischen CRF-BP-Proteine isoliert werden, eine wesentlich höhere Konzentration an heterologem Protein aufweist, können vorhandene Reinigungsmethoden recht einfach stärker gereinigte CRF-BP-Präparationen in verhältnismäßig reichlicher Menge liefern. Unter Anwendung geeigneter Isoliermethoden ist es möglich, routinemäßig CRF-BP-Proteine zu erhalten, die zu mindestens zu etwa 98% rein sind (gewichtsmäßig, bezogen auf die Gesamtproteine) und hierin als im wesentlichen rein bezeichnet werden.
Das Protein sollte unter der Leitung eines Arztes verabreicht werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten üblicherweise das Protein in Verbindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Zur Behandlung wird im wesentlichen reines synthetisches CRF-BP oder ein nicht toxisches Salz davon in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorzugsweise parenteral Säugern, einschließlich Menschen, entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, perkutan, z. B. intranasal, oder intrazerebroventrikulär verabreicht; mit einem entsprechenden Träger ist orale Verabreichung möglich. Die erforderliche Dosis variiert mit der jeweiligen Behandlung und der Dauer der gewünschten Behandlung; es wird jedoch davon ausgegangen, dass Dosierungen zwischen etwa 10 Mikrogramm und etwa 1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht und Tag für eine therapeutische Behandlung verwendet werden. Antikörper werden in Übereinstimmung mit einschlägig bekannten Praktiken in proportional entsprechenden Mengen verabreicht.
Beispiele für pharmazeutisch akzeptable nicht toxische Salze schließen Säureadditionssalze und Metallkomplexe z. B. mit Zink, Eisen od. dgl. (die für Zwecke der vorliegenden Anmeldung weitläufig als Salze angesehen werden) ein. Beispielhaft für solche Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dgl.
Es kann auch wünschenswert sein, CRF-BP über längere Zeiträume, beispielsweise einen Zeitraum von einer Woche bis zu einem Jahr, aus einer Einzelverabreichung freizusetzen, und es können Dosisformen mit langsamer Freisetzung, Depotwirkung oder in Form eines Implantats verwendet werden. Beispielsweise kann eine Dosisform ein pharmazeutisch akzeptables nicht toxisches Salz der Verbindung enthalten, die einen geringen Löslichkeitsgrad in Körperflüssigkeiten aufweist, beispielsweise ein Säureadditionssalz mit der mehrbasigen Säure, ein Salz mit einem mehrwertigen Metallkation oder eine Kombination der beiden Salze. Ein relativ unlösliches Salz kann auch in einem Gel, beispielsweise einem Aluminiumstearat-Gel formuliert werden. Eine geeignete Depotformulierung mit langsamer Freisetzung für Injektion kann auch CRF-BP oder ein Salz davon dispergiert oder eingekapselt in einem langsam abbauenden nicht toxischen oder nicht antigenen Polymer wie einem Polymilchsäure/Polyglycolsäure-Polymer, z. B. dem in der US-PS Nr. 3,773,919 beschriebenen, enthalten. Diese Verbindungen können auch in Implantate aus Silicongummi eingearbeitet werden.
Wie zuvor ausgeführt, ist die Verabreichung von CRF-BPs wirksam bei der Reduktion von durch eine CRF-Überproduktion verursachten hohen ACTH-Spiegeln in Säugern. So sind die CRF-BPs nützlich bei der Behandlung von hohen Cortisolkonzentrationen in Verbindung mit Hyperkortisolämie, Cushingscher Krankheit, Alkoholismus, nervöser Anorexie und ähnlichen Erkrankungen. Desgleichen werden diese CRF-BPs als nützlich bei der Bekämpfung von CRF produzierenden Hypophysentumoren erachtet - insbesondere bei Aufrechterhaltung eines Stabilitätszustands im Patienten, bis ein derartiger Tumor chirurgisch entfernt werden kann. Diese Proteine sind auch nützlich bei der Behandlung von Anomalien, die im Spätstadium von Schwangerschaften auftreten; beispielsweise können sie zur Reduktion von schwangerschaftsinduzierten Komplikationen und erhöhten CRF-Gehalten, die ansonsten zu einer übermäßigen ACTH-Freisetzung führen können, eingesetzt werden. Die i.v.-Verabreichung von CRF-BPs kann auch in bestimmten Fällen zur Modulation des Blutdrucks und damit Bekämpfung von Hypotonie verwendet werden. Berichten zufolge ist CRF im Plasma mancher Patientinnen mit Präeklampsie (Schwangerschaftstoxikose) erhöht. Ist dieser erhöhte CRF-Spiegel klinisch signifikant, könnte CRF-BP nützlich sein, Präeklampsie therapeutisch in den Griff zu bekommen. Genauer gesagt ist CRF ein bekannter Modulator des Immunsystems, und es wird angenommen, dass die Verabreichung des Proteins CRF-BP zur lokalen Behandlung von Arthritis und anderen ähnlichen Leiden nützlich sein kann. Man weiß, dass CRF eine Reihe biologischer Wirkungen auf die Hypophyse hat, und dementsprechend können CRF-BP-Proteine zur Modulation der Wirkung von CRF auf die Hypophyse eingesetzt werden. Weiters weiß man wohl, dass CRF eine Anzahl von biologischen Wirkungen im Gehirn zeigt; es wird daher angenommen, dass CRF-BP-Proteine wirksam zur Modulation der Wirkung von CRF auf das Gehirn verwendet werden kann, insbesondere zur Steuerung von Appetit, Fortpflanzung, Wachstum, Angstzuständen, Depression, Fieber und des Stoffwechsels, sowie zur Regulierung des Blutdrucks, der Pulszahl und des Blutstroms.
Abgesehen von der parenteralen oder anderweitigen Verabreichung an Säuger ist zu erwarten, dass CRF -BPs auch ein bedeutendes diagnostisches Werkzeug zur Überwachung von Veränderungen im Menschen sind. Da in bestimmten Fällen davon ausgegangen wird, dass sich der CRF-BP-Spiegel im Körper Hand in Hand mit einer Veränderung des CRF-Spiegels verändert, kann der Einsatz von CRF-BP-Antikörpern wirkungsvoll bei Untersuchungen zur Überwachung solcher Veränderungen angewendet werden. Auch können die Antikörper, wie früher aufgezeigt, bei in-vivo- Verabreichung zur Reinigung des Proteins sowie zur Bekämpfung der biologischen Wirkung von CRF-BPs verwendet werden. Die Verabreichung von Antikörpern für diesen Zweck würde gemäß den auf diesem Gebiet allgemein bekannten Richtlinien und Mengen, genauer gesagt entsprechend den hierin zuvor in Zusammenhang mit der Verabreichung des Proteins selbst dargelegten Richtlinien, erfolgen.
Für Zwecke der vorliegenden Anmeldung sollten Säuger-CRF-BP- Proteine so betrachtet werden, dass sie Proteine mit den hierin zuvor dargelegten Aminosäurerestsequenzen sowie natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz-Varianten anderer Säugerarten und Fragmente der Vorigen mit äquivalenter biologischer Aktivität darstellen. Wenn vorstehend nicht anders angegeben, verstehen sich alle Prozentangaben als Volumenprozent.
Auch wenn die Erfindung hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, die für die Erfinder die derzeit beste Art der Durchführung darstellt, können selbstverständlich verschiedene für den Fachmann auf diesem Gebiet naheliegende Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden, ohne vom Rahmen der in den angeschlossenen Ansprüchen dargelegten Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können biologisch aktive Fragmente solcher Proteine, die am C-Terminus oder am N- Terminus oder an beiden Termini verkürzt sind, anstelle des Gesamtproteins eingesetzt werden, um die gleiche biologische Wirkung der CRF-Inaktivierung zu erzielen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Informationen
(i) Anmelder: Potter, Ellen
Behan, Dominic P
Fischer, Wolfgang H
Linton, Elizabeth A
Lowry, Philip J
Vale Jr, Wylie LJ
(ii) Bezeichnung der Erfindung: ORF-bindendes Protein
(iii) Anzahl der Sequenzen: 4
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Fitch, Even, Tabin & Flannery
(B) Straße: 135 South LaSalle Street, Suite 900
(C) Stadt: Chicago
(D) Bundesstaat: Illinois
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 60603
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy-Disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.24
(vi) Aktuelle Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Einreichungsdatum:
(C) Klassifizierung:
(vii) Prioritätsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: US 07/641,341
(B) Einreichungsdatum: 15.01.1991
(viii) Informationen zum Anwalt/Vertreter:
(A) Name: Watt, Phillip H.
(B) Registrierungsnummer: 25.939
(C) Referenz/Aktennummer: 50843PCT
(ix) Informationen zur Telekommunikation:
(A) Telefon: (312)372-7842
(B) Telefax: (312)372-7848
(2) Angaben zu SEQ ID N0: 1:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 322 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(C) Topologie: linear
(ii) Molekülart: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Protein
(B) Lage: Verbindungsstelle(25..298)
(D) Weitere Informationen:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID N0: 1:
(2) Angaben zu SEQ ID N0: 2:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 1248 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: cDNA
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 47..1015
(D) Weitere Informationen:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: mat_Peptid
(B) Lage: 119..322
(D) Weitere Informationen:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID N0: 2:
(2) Angaben zu SEQ ID N0: 3:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 322 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Protein
(B) Lage: Verbindungsstelle(25..298)
(D) Weitere Informationen:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID N0: 3:
(2) Angaben zu SEQ ID N0: 4:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 1095 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: cDNA
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 118..1086
(D) Weitere Informationen:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: mat_Peptid.
(B) Lage: 190..1086
(D) Weitere Informationen:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID N0: 4:

Claims

1. DNA-codierendes CRF-bindendes Protein (CRF-BP), wobei die DNA wie nachfolgend in A, B, C oder D definiert ist:

A. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines Human-CRF-(hCRF)-bindenden Proteins (hCRF-BP) codiert, welches zur Inaktivierung von hCRF an hCRF bindet, wobei die DNA-Sequenz an die folgend in B definierte DNA hybridisierbar und durch die folgenden spezifischen Arbeitsgänge erhältlich ist:

(i) Reinigen von hCRF-BP aus Humanplasma mittels eines Reinigungsverfahrens umfassend:

(a) Elution des menschlichen Plasmas durch eine hCRF- Sepharose-Affinitätssäule,

(b) Gelfiltration der eluierenden Fraktion,

(c) mikropräparative SDS-Gelelektrophorese,

(d) Übertragung der resultierenden Banden auf Nitrocellulose, und

(e) Excision der Haupt-Proteinbande;

(ii) Erhalten zweier durch die nachfolgend in (iii) dargelegten AA-Sequenzen identifizierter Trypsinfragmente aus der ausgeschnittenen Proteinbande durch ein Verfahren umfassend:

(a) Trypsinieren der ausgeschnittenen Proteinbande durch Behandeln mit Trypsin und

(b) Gewinnen einer die zwei vorgenannten Trypsinfragmente umfassenden Fraktion aus dem bei der Trypsinierungsbehandlung gebildeten Überstand, gefolgt von RP-HPLC-Auflösung derselben

(iii) Weiterleiten zweier die jeweilige nachfolgend dargelegte AA-Sequenz aufweisender Polypeptide zu einer Oligonucleotidprimer-Herstellungsstufe, wobei die Polypeptide die aus obigem Schritt (ii) (b) erhaltenen aufgelösten Trypsinfragmente sind:

Glu-Ala-Ala-Asp-Tyr-Asp-Pro-Phe-Leu-Leu-Phe-Ser-Ala- Asn-Leu-Lys

bzw.

Ser-Ser-Gln-Asn-Val-Ala-Met-Ile-Phe-Phe-Arg

(iv) Bilden der beiden nachstehend definierten Gruppen von degenerierten Oligonucleotidprimern, die Teilen der vorgenannten AA-Sequenzen der Trypsinfragmente entsprechen:

und

(v) Ausführen von mehrfachen PCR-Zyklen unter Verwendung von DNA aus einer menschliche-Erwachsenen-Leber-cDNA- Bibliothek als Matrize, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das ein die beiden AA-Sequenzen enthaltendes Peptid codiert, und

(vi) Verwenden des DNA-Fragments als Sonde zum Durchmustern der menschliche-Leber-cDNA-Bibliothek, um eine DNA zu erhalten, die das die beiden AA-Sequenzen enthaltende menschliche CRF-BP codiert;

B. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines Ratten-CRF-(rCRF)-bindenden Proteins (rCRF-BP) codiert, welches zur Inaktivierung des hCRF an hCRF bindet, wobei das rCRF-BP AA SEQ ID N0: 3 aufweist;

C. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines hCRF-BP-Homologs oder eines rCRF-BP-Homologs codiert, welches Homolog für eine andere Säugerart nativ ist und zur Inaktivierung des hCRF an hCRF bindet; und

D. rekombinante DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die die AA- Sequenz eines CRF-bindenden AA-Fragments von hCRF-BP, rCRF-BP oder eines hCRF-BP- oder rCRF-BP-Homologs wie zuvor in C definiert codiert.

2. DNA nach Anspruch 1, worin es keine Unterbrechungen durch Introns gibt.

3. DNA nach Anspruch 1 mit der Nucleotidsequenz SEQ ID N0: 2 oder homologe natürlich vorkommenden Nucleotidsequenz einer anderen Säugerart, die daran hybridisierbar ist und ein CRF-bindendes Protein nach Anspruch 1 codiert.

4. Replizierbarer rekombinanter DNA-Expressionsvektor, der eine DNA nach Anspuch 1 enthält, welcher Vektor die DNA in einem Mikroorganismus oder in einer Zellkultur exprimieren kann, worin der Vektor inseriert ist, und worin nach der Expression ein Protein erzeugt wird, das ein Protein mit der Aminosäuresequenz ist, die eine Translation dieser DNA ist, oder das ein verkürztes Protein ist, dessen Aminosäuresequenz eine N-terminal verkürzte Version der erstgenannten Aminosäuresequenz ist, welches verkürzte Protein hCRF biologisch inaktiviert.

5. Rekombinante Wirtszellen, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert sind.

6. Verfahren zur Herstellung eines CRF-bindenden Proteins, welches Verfahren das Kultivieren von Wirtszellen nach Anspruch 5 unter Bedingungen umfasst, die die Expression der DNA und die Gewinnung des erzeugten Proteins gestatten, worin die Wirtszellen entweder Bakterien oder Säugerzellen sind.

7. Mikroorganismus, der mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist, welcher Mikroorganismus die das CRF-bindende Protein codierende DNA exprimieren kann.

8. Zellkultur, die die ein CRF-bindendes Protein codierende DNA exprimieren kann, welche Zellkultur durch Transformation einer Zelllinie mit einem Vektor nach Anspruch 4 erhalten wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines CRF-bindenden Proteins, welches Verfahren das Züchten einer Zellkultur nach Anspruch 8 unter Bedingungen umfaßt, die die Expression der DNA dieses Vektors und die Gewinnung des erzeugten Proteins gestatten.

10. Rekombinantes Protein mit den folgenden Merkmalen:

(i) es komplexiert zum Corticotropin-Freisetzungsfaktor;

(ii) es enthält eine AA-Sequenz wie nachstehend definiert:

(a) eine AA-Sequenz wie von der unter A. von Anspruch 1 definierten hCRF-BP-DNA codiert;

(b) eine AA-Sequenz von rCRF-BP wie unter B. von Anspruch 1 definiert, nämlich AA SEQ ID N0: 3;

(c) eine AA-Sequenz eines hCRF-BP- oder rCRF-BP- Homologs wie unter C. von Anspruch 1 definiert; oder

(d) eine AA-Sequenz eines CRF-bindenden AA-Fragments wie unter D. von Anspruch 1 definiert;

(iii) es hat eine Reinheit von zumindest etwa 98%; und

(iv) es bindet an hCRF, um die biologische Inaktivität desselben zu bewirken.

11. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von dadurch codiertem Protein.