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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Inhibition von mutagenen Effekten von Karzinogenen
und insbesondere die Verwendung der Verbindung 6,6'-Dithiodinicotinsäure in der
Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Aktivität des Enzyms
Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
zum Inhibieren des Auftretens von mutationsverursachtem Krebs in
einem Menschen.
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2. Hintergrund
der Erfindung
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Mutationen
finden in zellulärer
DNA unter dem Effekt von Ultraviolettlicht, Infrarotlicht, Röntgenstrahlen,
ionisierender Strahlung und Chemikalien statt. Es wird allgemein
anerkannt, dass die meisten Mutationen zu Krebs führen.
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Das
Enzym Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (ADPRP) stand im Verdacht, eine
regulatorische Rolle bei vielen zellulären Aktivitäten zu spielen, einschließlich DNA-Reparatur,
Differenzierung und maligner Transformation. Untersuchungen von
Inhibitoren von ADPRP haben Beweise für die Bedeutung von ADPRP in
diesen zellulären
Aktivitäten
erbracht (M.J. Suto et al., 1991, Drugs of the Future, 16: 723 – 739).
Viele Analoge von Nicotinamid, ein Produkt der Wirkung von ADPRP
auf NAD, sind untersucht worden, in der Hoffnung, eine Verbindung
zu finden, welche die Aktivität
von ADPRP modulieren könnte.
Es wäre
wünschenswert,
einen selektiven Inhibitor von ADPRP zu finden, welcher die maligne
Transformation von humanen Zellen inhibieren könnte (ebenda).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist festgestellt worden, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure einen antimutagenen Effekt
besitzt. Die Anwendung der Erfindung basiert auf der Feststellung,
dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure ein
nützliches
Mittel für
die Verhinderung von Mutationen ist, von denen die meisten zu Krebs
führen.
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Die
Anwendung der Erfindung umfasst das Behandeln eines menschlichen
Subjekts zum Inhibieren der mutagenen Effekte von Karzinogenen.
Die Anwendung beinhaltet die Verabreichung einer Zusammensetzung
an das Subjekt, welche eine ausreichen de Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure umfasst,
um die Aktivität von
Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
zu inhibieren, um dadurch die mutagenen Effekte, und insbesondere
ihre karzinogenen Effekte, zu inhibieren. In einem anderen Aspekt
beinhaltet die Erfindung ein Medikament zum Inhibieren des Auftretens
von Mutationen und von Mutationen abgeleiteten Krebsarten, und beinhaltet
die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche eine ausreichende
Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure umfasst, an
ein Subjekt.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Allgemeine Beschreibung
und Definitionen
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Die
Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird, es sei denn, es ist anderweitig
angegeben, herkömmliche
Molekular- und Zellbiologie, Zellkultur, Biochemie und organische
und medizinisch-chemische Synthese innerhalb des Kenntnisstands
auf dem Gebiet anwenden. Derartige Techniken sind in der Literatur
vollständig
erläutert;
siehe Cancer Chemotherapy: Principles and Practice, Hrsg.: B.A.
Chabner, J.M. Collins, Phil., Lippincott Publ., 1990; Cancer: Principles
and Practice of Oncology; Hrsg.: de Vita, Jr., V.T., Hellman, S., und
Rosenberg, S.A., Lippincott Co., Philadelphia, 1993; The Chemotherapy
Source Book, Hrsg.: Perry, M.C., Williams and Wilkins Publ., Baltimore,
1991). Silverman, Richard B., The Organic Chemistry of Drug Design and
Drug Action, Academic Press, Inc. NY (1992); Smith, Michael B.,
Organic Synthesis, McGraw Hill, Inc., NY, (1994)).
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Im
Fachgebiet sind Verfahren zum Bestimmen therapeutisch wirksamer
Mengen der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen
allgemein bekannt. Derartige Verfahren beinhalten die Analyse der
pharmazeutischen/pharmakokinetischen Parameter in einer Anti-Krebs-
oder Antitumor-Therapie, d.h. zum Inhibieren des Wachstums von kanzerösen Tumoren
(Wedge, S.R., Porteus, J.K., Newlands, E.S., Cancer Chemother. Pharmacol.
(1997) 40: 266 – 272;
Legha, S.S., Seminar in Oncology, (1997) 24: 54-24-31; Motzer, R.J.,
Vogelzang, N.J., Chemotherapy for Renal Cell Carcinoma, In: Raghaven,
D., Scher, H.I., Leibel, S.A., et al. (Hrsg.) Principles and Practice
of Genitourinary Oncology, Lippincott-Raven Publ., Philadelphia,
S. 885 – 96,
1997; Bloom, H.J.; Medroxyprogesterone acetate (Provera) in the
treatment of metastatic renal cancer, Br. J. Cancer (1971) 25: 250 – 65).
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass in Gegenwart von 6,6'-Dithiodinicotinsäure der
mutagene Effekt von karzinogenen Chemikalien, welche beispielhaft
veranschaulicht werden durch Benzo-[a]-pyren, 2-Aflatoxin und 2-Aminofluoren,
in großem
Maße vermindert
wird.
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6,6'-Dithiodinicotinsäure (Carboxypyridindisulfid
(CPDS) (D.R. Grassetti, 1986, Drugs of the Future, 11(7): 559 – 61) verhindert
bekanntermaßen
Metastasen in Mäusen
(Grassetti, D.R., 1970, Nature 228: 282).
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Die
Beispiele 1, 2 und 3 führen
Experimente auf, in welchen die antimutagenen Effekte von 6,6'-Dithiodinicotinsäure beobachtet
wurden. Diese Experimente wurden mit einem mutanten Stamm von Salmonella typhimurium-Bakterien
T-100 ausgeführt.
Als die Zellen an variierende Mengen an Benzo-[a]-pyren, 2-Aflatoxin oder
2-Aminofluoren exponiert
wurden, wurde eine Anzahl von Kolonien (mutant) gebildet. Als 6,6'-Dithiodinicotinsäure in der
Kultur, vor der Zugabe von Karzinogen, vorhanden war, verringerte
sich die Anzahl von Mutanten um etwa 70 %.
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Wie
im nachstehenden Beispiel 4 gezeigt, basiert die Anwendung der vorliegenden
Erfindung auf der Feststellung, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure die Aktivität von Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
(ADPRP) inhibierte. Die Inhibition von ADPRP ist nützlich zum
Blockieren der mutagenen Effekte von Karzinogenen (Suto und Suto
(1991), Drugs of the Future, 16(8): 723 – 739). Es versteht sich, dass
6,6'-Dithiodinicotinsäure Alkalimetallsalze
und Alkylester einschließt.
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Die
vorliegende Erfindung sieht eine pharmazeutische Zusammensetzung
vor, welche eine wirksame Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure in reiner Form oder als
ein pharmazeutisch annehmbares Rohkonzentrat in Assoziation mit
einem pharmazeutischen Träger
oder Verdünnungsmittel
umfasst. Solche Zusammensetzungen enthalten zweckmäßigerweise
weniger als 1 Gew.-% und vorzugsweise 0,2 Gew.-% an 6,6'-Dithiodinicotinsäure und beinhalten die Verabreichung
von wenigstens 0,1 mg/Kilo Körpergewicht
an 6,6'-Dithiodinicotinsäure. Die
Zusammensetzungen können
durch herkömmliche
Techniken hergestellt werden, so dass sie in herkömmlichen
Formen vorliegen, beispielsweise Kapseln, Tabletten, Suppositorien,
dispergierbare Pulver, Sirupe, Elixiere, Suspensionen oder Lösungen für eine enterale
oder parenterale Verabreichung. Geeignete pharmazeutische Verdünnungsmittel
oder Träger
schließen,
zum Beispiel Wasser, Alkohole, natürliche oder gehärtete Öle und Wachse,
Calcium- und Natriumcarbonate, Kalziumphosphat, Kaolin, Talkum und
Laktose sowie geeignete Konservierungsmittel, wie Ethyl-p-hydroxybenzoat,
Suspendiermittel wie Methylzellulose, Traganth und Natriumalginat,
Benetzungsmittel wie Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitanmonooleat,
Granulierungs- und Zerfalls mittel, wie Stärke und Alginsäure, Bindemittel
wie Stärke,
Gelatine und Akazia und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure und
Talkum ein, um eine elegante und schmackhafte pharmazeutische Präparation
bereitzustellen. Zusammensetzungen in Tablettenform können durch
herkömmliche
Techniken beschichtet werden, um die Zersetzung der Tablette und
Absorption des aktiven Bestandteils im Magen-Darm-Trakt zu verzögern und dadurch eine anhaltende
Wirkung über
eine lange Zeitperiode bereitzustellen. Andere Verbindungen und
Verfahren, welche im Fachgebiet zum Verzögern der Zersetzung oder für die zeitverzögerte oder
zeitabgemessene Zuführung
der aktiven Bestandteile bekannt sind, finden ebenfalls Verwendung
bei der Formulierung der aktiven Bestandteile zur Verwendung in
den Verfahren der Erfindung. Zum Beispiel kann 6,6'-Dithiodinicotinsäure auch
mit Liposomen oder anderen Trägermitteln
mit verzögerter
Freisetzung kombiniert werden, um die Verbindungen vor Zersetzung
zu schützen,
bis sie ihre Ziele erreichen, und/oder die Bewegung der Verbindungen
durch Gewebebarrieren zu erleichtern.
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Die
bevorzugten Zusammensetzungen vom Standpunkt der Einfachheit der
Verabreichung sind feste Zusammensetzungen, insbesondere Feststoff-gefüllte Gelatinekapseln
oder Tabletten.
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Die
hier getesteten Karzinogene sind stellvertretend für die Karzinogene,
welche einen hauptsächlichen
Teil von Luftverschmutzungsstoffen bilden, die durch Tabakrauch,
die Auspuffrauchgase von Verbrennungsmotoren, neben anderen Quellen,
verursacht werden.
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Es
ist beobachtet worden, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure keine
toxische Verbindung ist. Sie kann in Dosen von wenigstens ungefähr 0,1 Gramm
je Tag für
unbegrenzte Zeitdauern eingenommen werden. Dies erfüllt die
Anforderungen für
ein nichttoxisches, kostengünstiges
chemopräventives
Mittel, welches oral verabreicht werden könnte.
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Legenden zu den Tabellen
1, 2, 3
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Der
Effekt von 6,6'-Dithiodinicotinsäure (0,3
mg/Platte, in 0,2 M Natriumbicarbonat), welches jeder Platte im
Ames-Test zugegeben wurde, bei welchem es sich um einen reversen
Mutationsassay handelt (Ames, B.N., et al., 1975, Mutation Research
31: 347), mit Salmonella typhimurium-Bakterien T-100, wurde untersucht.
Die 6,6'-Dithiodinicotinsäure wurde
jeder Platte eine Stunde vor der Zugabe des Karzinogens zugesetzt.
Die in den Tabellen berichteten Ergebnisse repräsentieren die Durchschnittswerte
(Anzahl von Kolonien je Platte) von 3 einzelnen Bestimmungen.
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BEISPIEL
1 EFFEKTE
VON 6,6'-DITHIODINICOTINSÄURE AUF
MUTAGENESE DURCH BENZO-[a]-PYREN Anzahl
von Kolonien je Platte
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BEISPIEL
2 EFFEKTE
VON 6,6'-DITHIODINICOTINSÄURE AUF
DIE MUTAGENESE DURCH 2-AMINOFLUOREN Anzahl
von Kolonien je Platte
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BEISPIEL
3 EFFEKTE
VON 6,6'-DITHIODINICOTINSÄURE AUF
DIE MUTAGENESE DURCH 2-AFLATOXIN Anzahl
von Kolonien je Platte
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BEISPIEL 4
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INHIBITION VON ADPRP DURCH
6,6'-DITHIODINICOTINSÄURE
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ADPRP
wurde unter Anwendung des Verfahrens von Khan und Shall (Biochem.
Soc. Transactions 4: 778 (1976)) mit verschiedenen Modifikationen
aus Schweine-Thymus hergestellt. Die Enzymaktivität war ungefähr linear
bis zu 15 – 20
Minuten mit einer NAD-Substrat-Konzentration von 25 μM. Die typische
Maximum-Enzymaktivität
betrug ungefähr
0,003 nMol gebildetes Produkt/Minute in dem Assay (d. h. ungefähr 0,1 %
verwertetes Substrat). Die KM belief sich
ungefähr
auf 25 μM.
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Unter
Anwendung einer Standard-Assay-Mischung, welche 2 mM Dithiothreitol
(DTT) und 100 μM
Rohenzym/ml Inkubation enthielt, wurden drei Experimente durchgeführt, wobei
6,6'-Dithiodinicotinsäure bei
Konzentrationen zugegeben wurde, variierend von 5 μg/ml bis
600 μg/ml
(d.h. 1/60stel Mol-Äquivalent
an DTT zu 2 Mol-Äquivalenten).
Eine signifikante und spezifische Inhibition von ADPRP durch 6,6'-Dithiodinicotinsäure wurde bei 50 μg/ml bei
einer nahezu vollständigen
Inhibition bei 150 μg/ml
und darüber
(d. h. 0,5 Mol-Äquivalente
an DTT und darüber)
beobachtet. Keine Inhibition wurde bei 5 und 25 μg/ml beobachtet. Die Zugabe
von überschüssigem DTT
zu einer Inkubation, welche 150 μg/ml
6,6'-Dithiodinicotinsäure enthielt,
erhöhte
nicht das Ausmaß der
Umwandlung von Substrat zu gebundenem Produkt.
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INHIBITION
IN % DER KONTROLLEN
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Dieses
sind die Werte für
individuelle Inkubationen, welche bei entweder 7,5, 15 oder 20 Minuten
gestoppt wurden. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure ein effektiver Inhibitor
von ADPRP ist, was die Basis der Zusammensetzung der Erfindung zur
Behandlung eines menschlichen Subjekts bildet, um mutagene Effekte
von Karzinogenen zu inhibieren, wobei die Zusammensetzung eine ausreichende Menge
an 6,6'-Dithiodinicotinsäure (oder
Derivate davon) umfasst, um die Aktivität von ADPRP in den Subjekten
zu inhibieren, damit die mutagenen Effekte der Karzinogene inhibiert
werden.