DE2048375A1 - Wirksammachung von Antibiotika - Google Patents

Description

Patentanwälte

Dr. Ina.Walter Abitz " ' ^X' ^Oktober

Dr. Dieiar F. Morf
Dr. H*.ns-A. Brauns"

8 München 86, Plenameuerstr.28

MERCK & CO.,INC., Hahway, New' Jersey, V. St.A.

wirksammachung von Antibiotika

Die Aktivität von Antibiotika wird durch Verbindungen wirk-.sam gemacht, welche die Biosynthese des Transportmechanismuo stimulieren, der den Eintritt des Antibiotikums in die Zelle vermittelt. Verfahren zur Auffindung derartiger Verbindungen und zu ihrer Verwendung zur Wirksamraachung der anfcibiotischen Aktivität sind vorgesehen. So werden'Phosphonomycin, dessen Analoge und Derivate durch Verbindungen wirksam.gemacht, die das a-Glycerinphosphat- oder das Hexose-6-phosphat-Transportsystem von Bakterien direkt oder ' nach dem Stoffwechsel auslösen können.

Diβ.'Beseitigung bakterieller Infektionen durch die Antibiotikatherapie wird häufig durch praktische Schwierigkeiten hinsichtlich der Erzielung ausreichend hoher Werte des . Antibiotikums an der Stelle der Infektion durchkreuzt. In den Füllen, da lediglich am Hände wirksame Konzentrationen angewendet werden, ergeben sich häufig gegen Antibiotika

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beständige Organismen aus dem ursprünglichen, infizierenden Bestand. Dieses- Problem ist im Pall des neuen Antibiotikums Phosphonomycin-^-)-(cis-1^-EpoxypropyO-phosphonsäuro/ wesentlich, da es rasch ausgeschieden wird und seiner Wirkung durch übliche Bestandteile des Plasmas und Urins, z. B. Glucose bzw. Phosphat, entgegengewirkt wird. Ferner wurde festgestellt, dass das Antibiotikum gelegentlich gegenüber den vorher vorliegenden Mutanten, die gegenüber diesem Antibiotikum relativ beständig sind und in vielen bakteriellen Beständen auftreten, unwirksam ist. Demzufolge wurde nach Verfahren zur Beseitigung dieser Schwierigkeiten bei der antibiotischen !Therapie gesucht.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Steigerung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika, um eine Therapie bei Gewebswerten zu ermöglichen, die bei angemessener Dosierung erhältlich sind. Eine andere Aufgabe besteht darin, das Auftreten von resistenten Bakterienorganismen während der antibiotischen Therapie zu verhindern. Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Erteilung von Empfindlichkeit an Bakterienbestände, die sonst entweder durch frühere Erlangung von Beständigkeit gegenüber dem Antibiotikum oder durch innere Unempfindlichkeit gegenüber dem Antibiotikum nicht zu behandeln sind. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren, unter Anwendung geeigneter Auslöser zur Hervorbringung neuer Wege und/oder zur Steigerung der Wirksamkeit bereits vorliegender Wege' zur Aufnahme von Antibiotika durch Verwendung geeigneter Auslöser oder Induziermittel. Ferner sollen nach dem erfindungsgemässen Verfahren Verbindungen ermittelt werden, die als Induziermittel wirken, welche bisher unerwartete Wege zur • Aufnahme von Antibiotika durch Bakterien erschliessen. Femer besteht eine Aufgabe in einem Verfahren zur Steigerung des a-Glycerinphosphat-Transportwegs, der für die Aufnahme von

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Antibiotika verantwortlich ist und zur Erschliessung des Glucose-ö-phosphat-Transportweges. Weitere Aufgaben ergeben sich aus der nachfolgenden Erfindungsbeschreibung.

Gemäss der 'Erfindung wurde gefunden, dass die Aktivität von Antibiotika· in hohem Masse durch Verbindungen wirksam gemacht werden kann, die dahingehend wirken, dass ein bestehender Weg gefördert wird oder neue Transportwege bei Bakterien erschlossen werden. Verbindungen, welche die Aktivität des a-Glycerinphosphat-Transportsystems steigern oder de novo ein Hexose-phosphatsystem in Bakterien hervorrufen, können somit entweder vor der Behandlung mit einem Antibiotikum oder gleichzeitig mit einem Antibiotikum zur Virksammachung dessen Aktivität verwendet werden. Beispielsweise werden Mikroorganismen, welche kein Zeichen von Empfindlichkeit gegenüber-einem speziellen Antibiotikum Entweder auf Grund der Abwesenheit eines Transportweges oder weil lediglieh ein geringes Ausmass an geeigneten Transportwegen vorhanden ist, gegenüber dem Antibiotikum durch Aussetzung gegenüber Induziermitteln empfindlich gemacht werden, um einen geeigneten Weg herbeizuführen oder eine Steigerung des bestehenden Veges hervorzubringen. Mit dem hier verwendeten Ausdruck "Induziermittel" wird eine verwendete Verbindung bezeichnet,, die entweder direkt oder nach Stoffwechsel durch Wirt oder Bakterium mit dem regulierenden Mechanismus der Zelle zusammenwirkt, der die Biosynthese spezifischer Transportwege regelt. In solchen Fällen, wo weniger als die maximalen Synthesegeschwindigkeiten des aufnahmefähigen Transportsystems vor Einführung, des Induzierungsmitteis in das Medium auftreten, wird letzteres als die Synthesegeschwindigkeit steigernd und somit die Aktivität je Zelle des Transportsystems erhöhend bezeichnet. In solchen Fällen, v/o die Synthesegeschwindigkeit einer speziellen Klasse in Abwesen-

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heit von Induzierungsmitteln praktisch Null ist, worden diese Verbindungen als das latente Potential der Zelle unter Erzeugung des Transportweges erschliessend bezeichnet. Das Induziermittel muss nicht, ist jedoch häufig ein Substrat für eine der Gruppe von Proteinen, die es steigert oder erschliesst.

Gemäss einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wurde ■ gefunden, dass bestimmte Verbindungen als Induziernittel mit Bakterien entweder vor oder gleichzeitig, mit Phosphonomycin, dessen Analogen und Derivaten wirkt und dadurch die Aktivität dieser antiobiotischen Substanzen wirksam macht. Diese .Verbindungen, die als Induziermittel wirken, erhöhen entweder die Wirksamkeit des a-Glycerinphosphat-Transportweges oder erschliessen einen neuen Transportweg, z. B. ein Hexosephosphat-Transportsystem. Auf Grund der Wirksamkeit dieser Induziermittel für diese Transportsysteme wurde Gefunden, dass auf diese Weise angeregte Organismen höhere Werte toi Phosphonomycin ansammeln und somit durch relativ geringe Dosierungen des Antibiotikums getötet werden. Organismen, die kein Zeichen von Empfindlichkeit gegenüber Phosphonomycin entweder auf Grund geringer Mengen an vorliegendem a-Glycorinphosphat-Systcm oder dessen Abwesenheit in dem Organismus ein Ergebnis einer Mutation zu Phosphonomycin Resistenz zeicen, werden gegenüber diesem Antibiotikum durch Ercchliossung des zweiten Hexose-phosphat-Transportweges empfindlich gemacht. Ein anderer Vorteil' der Erfindung besteht darin, dcss derartige Organismen, die zwei oder mehr unabhängige Transportsysteme besitzen, ein geringeres Auftreten an antibiotischer Resistenz zeigen, da der.gleichzeitige Verlust durch Mutation zweier Wege bei Mikroorganismen selten ist. Es sind auch Verfahren zur Auffindung von Verbindungen vorgesehen, die als Induziermittel für diese und andere Transportsysteme, welche Zugang zu Phosphonomycin-Antibiotika zu den Zellen

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herbeiführen, wirken können. Ferner wird die Auslösung eines dritten Phosphonomycin-Transportweges durch Eiboflavin>-5-phosphat dargetan-. Es sei betont, dass die hier becchriebenen Induziermittel keine Antibiotika oder Antimetabolite sind, sondern die Biosynthese natürlicher Nährstoff-Transportmechanismen stimulieren, welche den Eintritt in die Zelle des Phosphonomycin-Antibiotikums vermitteln. Dieses Phänomen gilt einzig für die Phosphonomycin-Antibiotika, da festgestellt wurde, dass auf diese Weise induzierte Brücterienstämme keine Steigerung hinsichtlich, der Empfindlichkeit gegenüber anderen getesteten Antibiotika zeigen. Eine wichtige, vorteilhafte Folgerung der Verwendung der 'als Induziermittel dienenden Verbindungen besteht darin,-dass das Induziermittel nicht vorliegen muss, wenn die Transportsyateme den Eintritt des Antibiotikums in das Bakterium vermitteln. Somit können Induziermittel, welche dem Transport des Phosphonomycin-Antibiotikums, wenn sie gleichzeitig mit diesem Antibiotikum vorliegen, in Konkurrenz mit den Transportproteinen entgegenwirken können, gut vor der Verabreichung des Antibiotikums zugegeben werden, v/obei Gelegenheit gegeben wird, sich in dem Wirt zu verteilen. ., ■ Ferner erfordert das erfindungsgemässe . Verfahren im Gegensatz zu der üblichen Synergie durch Verabreichung von zwei Antibiotika· nicht, dass der Blutspiegel und die Aussehe!- dungsgeschwindigkeit von zwei oder mehr Bestandteilen aufeinander abgestimmt sind. Daher ist die bisher angetroffene Schwierigkeit von sich tatsächlich ergebenden wirksamen Werten von zwei verschiedenen synergistisch wirkenden Arzneimitteln auf Grund der vorliegenden Erfindung aur.geschaltet, da die verwendeten Induziermittel lediglich das Bakterium induzieren müssen und dann verschwinden; die erzeugten Transportproteine bleiben und liefern dadurch ein Eintrittsmittel des Antibiotikums in die Bakterienzelle.

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Gemäss einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde nun gefunden, dass bestimmte mehrwertige Alkohole und deren Derivate als Induziermittel entweder unter Steigerung der Aktivität des a-Glycerinphosphat-Transportsystems oder unter Auslösung eines Hexose-6-phosphat-Transportsystems wirken und daher mit Phosphonomycin-Antibiotika hinsichtlich der Bekämpfung derartiger Bakterien zusammenwirken. Somit wurde * gefunden, dass Glycerin, ein Phosphatid und Zuckerphosphate als Induziermittel geeignet sind. Zu erwähnende Zuckerphos^ phate, welche bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, sind Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat, Mannose-6-phosphat, Glucose-1-phosphat, 2-Desoxy-Elucose-6-phosphat, 2-Aniino-2-deso:jcy-glucose-6-phosphat, Glucose-1,6-diphosphat, Galactose-6-phosphat, Bibose-^-phosphat und dgl. Venn also empfindliche Bakterien mit diesen. Zuckerphosphaten entweder vor oder gleichzeitig mit einem Phosphonomycin- Antibiotikum in Berührung gebracht werden, machen diese Phosphate oder ein davon abgeleiteter Metabolit die Aktivität des Antibiotikums wirksam, und es ist dann möglich, geringere Mengen des Antibiotikums zu verwenden als sonst zur Bekämpfung des Pathogens notwendig wäre. Diese beobachtete Zusammenwirkung bei der Induzierung eines Hexose-6-phosphat-Transportsystems zur Wirkeammachung der Wirksamkeit des Phosphonomyein-Antibiotikums ist tatsächlich bemerkenswert und völlig unerwartet. Beispielsweise wurde bei Versuchen mit Mäusen gegen E. coli gefunden, dass bei Verwendung einer Kombination von Glucose-6-phosphat und dem Antibiotikum die zum Schutz der Hälfte der Mäuse notwendige Dosis an Phosphonomycin-Antibiotikum weniger als ein Zehntel der Menge beträgt, die an Antibiotikum allein erforderlich, ist.

Anstelle der Verwendung eines Zuckerphosphats ist es auch möglich, Indusiermittel in situ durch Injektion geeigneter

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Enzyme oder Substrate in den Wirt zu erzeugen. Beispielsweise kann die Hexokinase mikrobieller Herkunft, aus Hefe, tierischem oder menschlichem Ursprung die in Gewebsflüssigkeiten angetroffene freie ATP und Glucose zur Erzeugung von Glucose-6-phosphat .verwerten« Vorzugsweise wird menschliche Hexokinase, Glycerokinase oder Glucokinase verwendet, um mögliche Probleme der Antigenizität herabzusetzen. Es ist auch möglich, die gleichzeitige Injektion eines geeigneten, energiereichen Phosphatdonators, wie beispielsweise Adenosin-5'-triphosphat oder Phosphoenolpyruvat mit diesen Enzymen und die Einnahme oder Injektion geeigneter Zucker akz ep tor en, wie beispielsweise Fructose, Mannose, Glucosamin, die in ihrer f phosphorylierten Form Induziermittel der Transport'systeme sind, zu verwenden. Es können auch Gruppen von Enzymen verabreicht werden, die schliesslich die aufgeführten Induzier-" mittel, z- B. Glykogen-phosphorylase ergeben, die bei Einwirkung entweder auf vom Wirt herstammendem oder indiziertem Glykogen zunächst Glucose-1-phosphat erzeugen, das durch Einwirkung der endogenen oder zugefügten Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat überführt wird. Die Brauchbarkeit irgendeiner Kombination von Enzymen und Substraten kann dadurch ermittelt werden (als eine praktische Alternative gegenüber dem direkten Test in infizierten Tieren oder Menschen) , indem diese Substanzen tierischem oder menschlichem J Plasma zugesetzt werden, bei Körpertemperatur während verschiedener Zeiträume inkubiert werden und dann das Inkubationsgemisch (nach Inaktivierung des Enzyms)' hinsichtlich seiner Fähigkeit, phosphonomycinresistenten Mikroorganismen gegenüber Phosphonomycin empfindlich zu machen,zu testen. Ein derartiges, hochempfindliches Testsystem v.drd im folgenden beschrieben. Ein Alternativsystem zur Untersuchung von Enzymen öder Substraten oder Kombinationen von beiden, das hinsichtlich der Erzeugung von Induziermitteln des Phosphonomycin-Transportes in si tu/best ent in der Injizie-

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rung dieser Substanzen in gesunde Tiere oder Menschen und anschliessender Entnahme von Blutproben zur Prüfung der Wirksamkeit in dem im folgenden beschriebenen Testsystem. Bei der Untersuchung dieser Proben ist es wesentlich, zunächst die Blutzellen zu entfernen und das Plasma durch Hitzo zu inaktivieren, um sämtliche Enzyme natürlichen oder injizierten Ursprungs zu beseitigen, die Induziermittel auf der Testplatte selbst anstelle in dem injizierten Wirt erzeugen. Verfahren und Systeme zur Bestimmung und Klassifizierung von Induziermitteln der beiden berücksichtigten Wege des Phoßphonomycin-Eintritts in Bakterien (das a-Glycerinphosphat-Transportsystem und ein Hexose-6-phosphat-Transportsystem) werden im einzelnen aufgeführt. Diese Verfahren un'd Systeme können leicht zur Verwendung bei der Bestimmung weiterer, brauchbarer Induziermittel dieser und bisher nicht ermittel-" ter Transportwege verallgemeinert werden mit irgendeinem Bakterienstamm,der mit Phosphonomycin, dessen Analogen und Derivaten behandelt werden soll. Diese allgemeine Methode besteht in der Isolierung eines phosphonomycinresißtenten Mutantenjätammsaus einem empfindlichen Beispiel des zu behandelnden Stamms und in' der Peststellung, dass die Resistenz tatsächlich auf einem Versagen des Phosphonomycins beruht, das in adäquaten Mengen in die Zelle eindringen soll. Dieser Verlust an wildem Transport kann dadurch festgestellt werden, dass entweder der gleichzeitige Verlust der a-Glycerinphpsphat-Stoffwechselkapazität des Mutantenstammes nachgewiesen wird oder ein verringertes 'Ausrnass; an Phosphonomycin selbst in diesen Mutanten nachgewieren wird, wenn sie dem arzneimittelhaltigen Medium ausgesetzt werden. Diese Mutanten werden dann entweder in ein flüsciges oder festes Medium gebracht, das wesentlich höhere Phosphono- . mycinmengen fenthält als ein Medium* in dem der Aus^angsetamm überleben würde, jedoch eine solche Menge aufweist, die noch ein Wachstum dee Mutantenstammes erlaubt. Unter

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diesen Bedingungen wird jedes beliebige Induktionsiusmass zusätzlicher Eindringwege für Phosphonomycin als Inhibierung des Bakteri umwachs turns aiif Grund der hohen Antibiotikumwerte, welche die Mutante umgeben, empfindlich ermittelt. Die Induktion kann entweder durch Einschluss des potentiellen Induziermittels zusammen mit Phosphonomycin in empfindliche Scheiben oder durch Verteilung des Induziermittels durch den Agar oder das flüssige Medium erreicht werden. In solchen Fällen, wo zu erwarten ist, dass das Induziermittel selbst mit dem Arzneimittel zur Verwendung des neuen Eintrittsverfahrens konkurriert (z. B. im Fall eines a-Glycerinphosphatsselbst), kann man auch den Impfstoff aus Mutanten-organismen dem Induziermitt.el vor deren Kombination mit Phosphonomycin aussetzen, wobei dann das konkurrierende Induziermittel durch irgendeine Zeiltrenntechnik (Filtration, Zentrifugeerung undagl.) ausgewaschen wird, und diese vorinduzierten Zellen mit Phosphonomycin in flüssigem Medium kombiniert werden können. Indem neue Vorbindungen ermittelt worden sind, welche eine Wachstumsinhibierung ergeben können, kann leicht nachgewiesen werden, ob die verwendete Verbindung selbst die Wachstumshemmung in Medien ergibt, welche kein zugesetzte^ Phosphonomycin enthalten.

Das Zusammenwirken der hier beschriebenen Induziermittel, mit dem Phosphonomycin-Antibiotikum liefert ein wertvolles Mittel zur Bekämpfung und Beseitigung von Bakterien, die ' sonst gegenüber der Einwirkung eines Phosphonomycin-Antibiotikums red atent sind. Es kann also eine Kombination des Induziermittels und des Antibiotikums in einem geeigneten Träger, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden kann, zur Behandlung von Infektionen topisch verwendet werden. Das Induziermittel und das Antibiotikum können auch parenteral oder oral an einen infizierten tierischen odor mensch-

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lichen Wirt entweder getrennt oder in Kombination in einem geeigneten pharmazeutischen Träger verabreicht werden, oder einen kann parenteral und das zweite kann oral verabreicht werden. Diese pharmazeutischen Formen des Antibiotikums und/oder der induzierenden Verbindung können nach bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer fester oder flüssiger Verdünnungsmittel hergestellt werden. Die Massen können in Form von Tabletten, Pulvern, Granulaten, Kapseln, Suspensionen, Lösungen, Elixieren, Sirupen oder in anderen Dosierungsformen, die sich inabesondere für die orale Verabreichung eignen, vorliegen. Die Masse kann auch in Form sterilisierter Lösungen oder Suspensionen zur parenteral en Verabreichung vorliegen. In diesen Produkten kann der sterile Träger eine sterile Lösung oder Suspension sein. Die das Antibiotikum, enthaltenden Zubereitungen können mit festen Verdünnungsmitteln und/oder Tablettierhilfsmitteln, z. B. Maisstärke, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Gummi art en und dgl., vermischt werden. Die üblichen ELnkapselungs- oder Tablettiermaterialien, welche zur Herstellung pharmazeutischer Produkte geeignet sind, können verwendet werden, so lange sie nicht mit dem Antibiotikum oder den induzierenden Verbindungen unverträglich sind. Diese Dosierungsformen können 25 bis 500 mg der aktiven Substanz enthalten und können in Dosierungen verabreicht werden, die 1 bis 6 mal je Tag gegeben werden, je nach dem Alter und Zustand des Patienten, der Infektion und der Art der Verabreichung. . ·

Der hier verwendete Ausdruck "Phosphonomyein-Antibiotikum" schlieset Phosphonomyein und dessen Derivate der Formel

CH-—OH P^

(I)

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und die entsprechenden Analogen der Formel

CH₂-C P< (II)

ein, worin A Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest, X. Sauerstoff oder Schwefel, X und Z, die gleich oder verschieden sein können, die Beste

OH, OR, -HR-Bp, -HR-CH-COOH, -MOB, -HRHB^B,,, NR XX.

-NB-C-NR_nB₂, -BHC-XB, HH-C-HB^B₂, -N-C-X, oder -N₃ bedeuten, worin X Sauerstoff oder Schwefel, B ein Wasserstoff atom, eine Kohlenwasserstoffgruppe Qder substituierte Kohlenwasser stoff gruppe und B₁* und B₂ Wasserstoff, einen Acyl- oder einen Kohlenwasserstoff rest oder .substituierten Kohlenwasserstoffrest darstellen. In die Formeln I und II sind gleichfalls die anorganischen und organischen Salze solcher Verbindungen eingeschlossen, in denen Y und/oder Z eine QH-Gruppe darstellen, und die cyclischen Derivate ,'in denen Y und Z über einen Best einer polyfunktionellen Kohlenwasserstoff verbindung verbunden sind, z. B. einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkyl en-, Aralkylen- und Aryl enpolyamin- und Aminöalkoholrest und dgl., z. B. Äthylendinmin, Monoäthanolamin, Phenylendiamin, Haphthalindiamin, o-Aminophenol und dgl., und solche cyclische Derivate, in denen die Gruppierung R..Ra den Rest eines cyclischen primären oder sekundären* Amins bedeutet, z. B. Horpholin, Piperidin oder Pyrrolidin.

Wenn R, B^. oder B₂ in den Formeln I und II einen Kohlenwasserstoffrest oder einen substituierten Xohlenwaseerstoff-

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rest darstellen, kann dieser Rest ein aliphatischer, cycloaliphatischer, araliphatischer, aromatischer oder heterocyclischer Rest sein, der gegebenenfalls weiter substituiert sein kann. Somit kann er'beispielsweise ein aliphatischer Rest sein, z. B. ein substituierter oder unsubstituierter Alkyl-. Alkenyl- oder Alkinylrest. Beispiele für R, JL und Rp, die einen araliphatisehen iiest darstellen, sind solche Fälle, in denen der Rest ein Aralkyl- oder substituierter Aralkylrest ist, beispielsweise Benzyl-, Phenäthyl-, · Phenylpropyl-, p-Halogenbenzyl- und o-, m- oder p-Alkoxybenzyl-, Nitrobenzyl-, Amiiiophenäthyl-, Pyridylathy 1- , Nitrofurylmethyl-, Thienylpropylrest und dgl.

R, R^ und R₂ stellen auch einen Arylrest oder substituierten Arylrest dar, z. B. Phenyl-, Naphthyl- oder substituierten Phenylrest. · ,

Gemäss den vorstehenden Ausführungen kann also die Amidgruppe oder können die Amidgruppen von Verbindungen hergeleitet werden, die selbst antibakteriell sind. Als Beispiele für derartige Verbindungen können 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, Sulfa-Verbindungen, wie beispielsweise SuIf anil amid, Siilfadiazin, Sulfamerizin, Sulfamethazin, Sulfadimetin, ßulfapyridin, Sulfathiazol, Sulfisoxazol, Thiodiazol, SuIfacetamid, Sulfaguanidin, Sulfachinoxalin, und p-Aminophenylßulfonamid und p-Aminobenzonculfonsäure, antibiotische Mittel, wie beispielsweise Ampicillin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Cycloserin, Cephaloglycin, Cephalixin und dgl., genannt werden.

Solche Verbindungen der Formeln I und II, die sauer sind, d. h. die freien Säuren, können Salze bilden, und diese Salze stellen eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung

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dar, da sie stabiler sind als die freie Säure. Wie sich dem Fachmann ergibt, bilden die Verbindungen der Formeln I und II, wo wenigstens einer der Reste Y und Z eine OH-Gruppe bedeutet, organische und anorganische Salze, und beide werden . von der Erfindung in Betracht gezogen. Beispiele für diese' Salze sind anorganische Metallsalze, z. B. die Natrium-, Aluminium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-i SilberundEisensalze. Zu organischen Salzen, die als Beispiele erwähnt werden können, gehören die Salze mit primären, sekundären oder'tertiären Aminen, beispielsweise Monoalkyl- · amine, Dialkylamine, Trialkylamine und stickstoffhaltige heterocyclische Amine. Typische Beispiele sind SalzeÄnit ' Aminen, z. B. oc-Phenäthylamin, Diäthylamin, Chinin, Brucin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Diethanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin, Ester der Aminosäuren und N-Methylglucamin· Gegebenenfalls kann der basische Anteil des Salzes ein biologisch-aktives Amin, z. B. Erythromycin, Gleandomycin oder Novobiocin·,'sein.

Die Monoamid-monoester-Derivate und insbesondere solche Verbindungen, die einen labilen Estersubstituenten aufweisen, sind besonders wertvolle Derivate. Mit dem hier ver- f[ wendeten Ausdruck "labiler Ester" wird eine Gruppe, umfasst, die leicht biologisch-hydrolysiert werden kann, z· B. durch Enzyme in den Körperflüssigkeiten von Lebewesen einschliess-. lieh Menschen, um die freie Säure oder ein Salz davon zu erzeugen, das wirksamer als ein antibiotisches· Mittel ist. Die Amidgruppe oder substituierte Amidgruppe, die in den Amidester-Derivaten vorliegen, können auch leicht in den Körperflüssigkeiten biologisch hydrolysiert werden, und daher sind die Amid-labilen Ester-Derivate bei der Antibiotikatherapie geeignet.

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Die Ester, die zur Verwendung als antibiotische Mittel ausreichend labil sind* werden in einfacher Weise experimentell ermittelt, z. B. durch Inkubation mit Körperflüssickeiten, um festzustellen, ob unter diesen Bedingungen die Estergruppe abgespalten wird oder nicht. Es können auch andere Methoden, einschliesslich chemischer Tests, -verwendet werden, um festzustellen, ob spezielle Estergruppen ausreichend labil sind. Die Ester, die nachweisbare antibiotische Aktivität nach Erhitzen in einem wässrigen Medium v.ährenxi 2 Stunden bei 37° C und einem pH-Wert von 2,2 oder in einem wässrigen Medium während 80 Stunden bei pH 9 ergeben, können als labile Ester angesehen werden. Zu erwähnende geeignete labile Estergruppen sind Xther der Formel -CHpOH₁ eine Phenacyloxymethylgruppe, Acyloxymethylgruppe der Formel -CIL)OA, worin A eine Acylgruppe darstellt, die einen von , einer organischen Saure durch Entfernung der Hydroxygruppe hergeleiteten organischen Rest aufweist, Amid- und substituierte Amid-Derivate dieser Acyloxymethyl-Substituenten, Acylaminomethylgruppen der Formel -CBUMHA, worin A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, Thiomethylither. der Formel -CHpSH, eine Athinyloxygruppe der Formel -CHpOCeCH, substituierte Äthinyloxygruppen der Formel -CH₂OC=CR, eine Vinyloxymethylgruppe der Formel substituierte Vinyloxymethylgruppen der Formeln -₂ oder -CH₂OCHbCRR oder eine Nitrooxygruppe der Formel -CH₀ONO₀. R ist in jeder der vorstehend genannten Formeln ein Kohlenwasserstoffrest oder ein/vorstehend definierter substituierter Kohlenwasserstoffrest.

Als spezifische Beispiele derartiger labiler Estergruppen βeien folgende genannt: Methoxymethyl-, Tetrahydropyranyl oxomethyl-, Phenacyloxymethyl-,,Acetoxymethyl-, Butyryloxymethyl-, Isobutyryloxymethyl-, Pivaloyloxymethyl-,

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Benzoyloxymethyl-, 2-Methylbenzoyloxymethyl-, 2,6-Dime thy 1-benzoyloxymethyl-, 2-Methyl-6-chlorbenzoyloxymethyl-, 3-Trifluoromethylbenzoyloxymethyl-, 2-Nitrobenzoyloxymethyl-, 2-Methylthiobenzoyloxymethyl-, 2-Thienylcarbonyloxyiaethyl-, '2-Furylcnrbonyloxymethyl-, J-Pyridylcarbonyloxymethyl-, Pyrazinylcarbonyloxymethyl-, 2-Methylcyclopentylcarbonyloxymethyl-, I-Adamantylcarbonyloxymethyl-, Phenylsulfonylmethyl-, Phosphonoxymethyl-", Diäthylphosphonoxymethyl-, Carbäthoxyoaqnaethyl-, Carbamoyloxymethyl-, N-Methylcarbamoyloxymethyl-, Ν,Ν-Dimethylearbamoyloxymethyl-, Plienylsulfamoyloxymetliyl-, Acetaminomethyl-, Benzoyl&minomethyl-, Methylthiomethy1-, Phenylthiomethyl-, Vinyloxymethyl-, i

I-Methylvinyloxymethyl- und Nitrooacymethylgruppen.

Die folgenden Beispiele erläutern.Ausführungsfoxmen der Erfindung.

Beispiel 1

Einfluss der Kombination von Glycerin oder DL-cc-Glycerinphosphat mit Phosphonomycin auf dessen Inhibierung verschiedener Bakterienstämme

tJbernacht-Kulturen der angegebenen Stämme in Nährlösung (Difco) wurden 10Ofach verdünnt, und eine aliquote Menge ύ von 0,05 ml wurde über die Oberfläche einer 2 mm tiefen Schicht des angegebenen festen Wuchsmediums in 50 cm'" Petri-Schalen gewischt. Empfindliche Scheiben aus einem Filterpapierkreis von 7 mm Durchmesser, der entweder 5 oder 50 Mg Phosphonomycin mit einer zusätzlichen Menge Glycerin oder Binatrium-DL-a-gLycerinphosphat enthielt, wurden auf die Oberfläche des beimpften Agars gebracht.

Nach I8stündiger Inkubierung bei 37° C wurden Inhibierungszonen gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

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1^ Ύ£(	Medium	/i	•	P	A	Zonenpreise mm Durchmesser BCD	10	0
Stamm	Nähragar	/ε P	11	45	40	13	0
E;coli MB. 2489	Nähragar	VJl	13	13	12	10	0
E. coli MB. 2498	Nähragar	30	8	47	43	16	0
E. coli MB. 2489 A2	Nähragar	. 5	12	29	26	15	0
E. coli MB. 2017	Nähragar	5	15	40	18	16	0
Pseudo, aeruginoea T 9	Nähragar	5	18	31	29	23	23
Pseudo, aeroginofia T 19	Mueller Hinton Agar	30	21	25	23	16
Pr. mirabilis T 10	Nähragar'+ 10 5 Pferdeserum	5	10	15	—	15
D. pneumoniae I 37	Gehirn-Herz- Infusion + 10 S Pferdeserum	30	12	14		14
D. pneumoniae I 37	Gehirn-Herz- Infusion + 10 ? Pferdeserum	ό 30	10	13		18	0
D. pneumoniae I 2483	Gehirn-Herz- Infusion + 10 J Pferdeserum'	30	15	19		13	0
Strep. Pyoge- nes 3009 '	Gehirn-Herz- Infusion + 10 5 Pferdeser-um	έ 30	14	17		12	mm
Strep, pyoge- nes 1685	Gehirn-Herz- Infusion	i 30	11	19		15	mm
SaI. schott- muelleri 1814	Gehirn-Herz- Infusion	30	15.	19		19
SaI. typhimur- ium MB 1995	Gehirn-Herz- Infusion	30	19	22
Sal· typhöse. 2866	30

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14127 lh

Schlüssel hinsichtlich der Identität und Menge des zu der Scheibe in Kombination mit Phosphonomycin zugesetzten Potentiators: ' '·

P -■ Phosphonomycin (Dinatriumsalz) (Mengender Spalte links angegeben) .

A - Glycerin, 10 mg

B - Glycerin, 1 mg

C - DL-a-Glycerinphosphat, Dinatriumsalz, 10 ag D - DL-a-Glycerinphosphat, D^natriumsalz, 100 ug

Es ist ersichtlich, dass Glycerin über ein breites Spektrum λ von Stämmen synergetisch wirkt und lediglich im Pail von E. coli 2498 (einem Mutanten-Derivat von MB 2489), das be-.kenntlich keine a-Glycerinphosphat-Transportwirksamkeit aufweist, und Proteus mirabilis (T 10) versagt'. Der letztere Stamm hat gemeinsam mit allen geprüften, empfindlichen Proteus-Arten ein sehr wirksames a-Glycerinphosphat-Transportsystem, das mit grösster Vahscheinlichkeit konstitutiv, d. h. kein Gegenstand weiterer Induktion ist.

Einige bedeutende Beispiele erhöhter Empfindlichkeit werden bei dem geringen Wert an zugesetztem Dinatrium-DL-ccglycerinphosphat beobachtet, selbst obgleich es ein bekannten. "Induziermittel des Transportsystems wenigstens in % MB 2489 ist. Etwas Antagonismiis ist bei dem zu der Scheibe zugesetzten hohen Wert (100 ug) nachweisbar. Dieses Phänomen stellt vermutlich die erwartete Konkurrenz zwischen Phosphonomycin und a-Glycerinphosphat für ihr übliches Transportsystem dar. Im Gegensatz dazu ist Glycerin, obgleich ein Induziermittel, kein Substrat, und besetzt daher vorher nicht das Transportsystem, dessen Aktivität es angeregt hat.

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Beispiel 2

Einwirkung von Glucose-6-phosphat auf die Empfindlichkeit von Escherichia coli und Staphylococcus aureus gegenüber Phosphonomycin in flüssigem Hedium verschiedener Zusammensetzung . .

Ubernacht-Flüssigkeitskulturen wurden auf 1 : 10 000 (1CK Zellen/ml) in dem angegebenen Hedium verdünnt und mit einem gleichen Volumen eines Mediums vereinigt, das verschiedene Mengen an Dinatriumphosphonomycin enthielt. Me minimale Inhibierungskonzentration (H.I.C.) war die Endkonzentration an Phosphonomycin,unterhalb der nach einer 24stündigen Inkubierung bei 55° C Trübung beobachtet wurde.

Medium	M.I.C. jag/ml	Phosphonomycin
	Staphylococ	Escherichia coli
	cus aureus	HB 2017
	MB 29^9
Mueller Hinton-Flüssig	50	3,12*
keit (Difco)
Mueller Hinton-Flüssig	3/I2	0,78
keit plus Dinatrium-
gluc ο s e-6-phosphat,
25 /ig/ml
Fahrlösung (Difco)	25	12,5
Nährlösung (Difco)	1,5	0,39
plus Dinatriumglucose-
6-phosphat

Nährlösung (Difco) plus 5 % V/V defibriniertes Schafblut ()

3,12

0,39

Bei beiden Mediän wurde festgestellt, dass Glucose-ö-phosphat mit einem Faktor von 4 bis 40 die Empfindlichkeit von gram-positiven und gram-negativen Pathogenen wirksaä macht. In Nährflüssigkeit wird der mit Glucose-6-phosphat beob-

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achtete Effekt dem mit Schafblat beobachteten nachgeahmt. Beispiel 3

Einfluss von Glucose-6-phosphat auf die Fraktion von Bakterienbeständen, die bei einem gegebenen Phoephonomy'cinwert überlebt..

Es wurden verschiedene Verdünnungen von Übernacht-KuItur-r lösungen der bezeichneten Bakterienstämme über die Oberfläche von Petri-Schalen gewischt, welche Mueller Hinton-Medium, 1,5 % Agar (Difco) enthielten und mit den angege- λ benen Werten an Dinatriumphosphonomycin mit oder ohne 25 liß/ml Dinatriumglucose-6-phosphat ergänzt waren. Aus der Anzahl der bei einer speziellen Verdünnung an aufgegebenem Organismus vorliegenden Kolonien wird die Anzahl der überlebenden, zugeführten Zellen bei einem gegebenen Phosphonomycinwert mit und ohne Glucose-6-phosphat berechnet, wobei die Werte in der folgenden Tabelle wiedergegeben sind:

109817/2048.

%o

Stamm	iig/ml Phos- ' 'phonomycin	Anzahl der überlebenden Kolo nienbildner je ml Mueller Hinton Mueller Hinton Agar allein Agar plus 25 /its/ml GIu- cose-6-phosphat	10? 10?	3 χ 1o2 5 χ 10
Escherichia coli MB 2017	0 10	3 x 3 x	10^'	50
	30 100 ·	3 x 3 x	10? 10?	3 χ 10^ . 3 χ 10? <- 100 <· 10
Staphylo coccus aureus MB 294-9	0 10 50 100 .	3 χ 3 x 3 x 3 x	10^ 10? 10? · ·	• Ji. f VJ £· 1 χ 10? 5 χ 10p 5 χ iod
Aerobacter aerogenes MB 3287	0 10 30 100	7 χ 3 x 5 χ 3 χ	10^ ;io	2 χ 10^ 1 χ 10$ 1 χ 10? <;io '
Staphylo coccus .aureus MB 3036	0 10 30 100	2 χ 2 χ 2 χ <	10Z io£	P ν 10 C-i Jv 1 V-* -» 1 χ 10? 1 x 10? 6 χ 10
Shigella sp. MB 3298	0 10 30 100	2 χ 3 x 3 χ 1 χ

In allen Fällen überlebt ein geringerer Anteil des zugeführten Bakterienbestandes unter Bildung von Kolonien auf der Platte, die Glucose-6-phosphat enthält, als auf der Platte, die diese Virksammachung ni'cht enthält. In den meisten Fällen wird der wesentliche verbleibende Bestand ( in der Grössenordnung von 1 in 10^ bis 1 in 10 ), der hohe Ausmasse an Phosphonomycin überlebt, ausgerottet oder weitgehend reduziert, wenn Glucose-6-phosphat gleichfalls vorliegt. Eine Empfindlichmachung der Bestandmasse und eine Beseitigung von resistentem Bestand sind offensichtlich,

te

wenn dieses Induziermittel vorliegt.

- 20 -

109817/2040

Beispiel 4

Einfluss von Glucose-6-phosphat auf die Grosse der Inhibierung sz one, welche die empfindlichen Scheiben umgibt, die dieses Zuckerphosphat in Kombination mit Phosphonomyein enthalten

Ubernacht-Kulturen der angegebenen Stämme, die in Difco-Nährlösung gezüchtet waren,· wurden 10Ofach verdünnt, und eine aliquote Menge von 0,05 ml wurde über die Fläche einer Petri-Schale gewischt, die 10 ml Mueller Hinton Agar (Difco) enthielt. Empfindlichkeitsscheiben, die aus' !filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 7 nm bestanden und entweder 5 oder 30 iig Dinatriumphosphonomycin mit oder ohne zusätzlichem 5 P-S Dinatriumglucose-6-phosphat enthielten, wurden auf die Oberfläche des beimpften Agars gebracht. Inhibierungszonen wurden nach I8stündiger Inkubierung bei 37° C gemessen.

- 21 -

109817/2040

14127 it

Bakterienstamm Durchmesser der Inhibierunftszone in mm

5 ug - 50/« 5 PS - 30 yig

Pnosphonomycin* Pnosphonomycin plus

ohne Glucose-6- Glucose-6-phosphat phosphat -

Escherichia 11 16 20 24

coli MB 2017

Staphylococcus O 11 13 20 aureus MB 2949

Aerobacter _# 0 0 16 26

aerogenes

MB 3287

Staphylococcus. 0 30 .27 40 aureus MB 3036

Shigella sp. O 10 24 37

MB 3298 "

Die in dem früheren Beispiel vermerkte Bmpfindlichmachung von Zellen durch Glucose-6-phosphat zeigt sich hier durch eine wesentliche Steigerung der Inhibierungszone, welche die Scheiben umgibt, die ein Gemisch aus Phosphonomycin und Glucos-e-6-phosphat enthalten.' Es ist ferner bemerkenswert, dass in sämtlichen Fällen, in denen Zonenvergrösserung in Gegenwart von Glucose-6-phosphat beobachtet wird, festgestellt wurde, dass der inhibierte Bereich relativ frei von den unzähligen arzneimittelbeständigen Kolonien ist, welche eine Scheibe aus Phosphonomycin selbst .umgeben. Diese Beobachtungen stehen in Obereinstimmung mit der Erschliessung eines wechselnden Weges für den Eintritt von Phosphonomycin ■ in Zellen, welche ihren normal ausgedrückten a-Glycerinphosphat-Transportweg verloren haben, durch Glucose-6-phosphat. . * .

- 22 -

109817/20ΑΘ

Beispiel 5

Beispiel einer Methode zum Sieben von Phosphatestein als Induziermittel für latente Transportsysterne von Phosphonomycin'in Escherichia coli

Der Stamm Escherichia coli MB 2498 ist einoin Tabelle I des Journal of Molecular Biology, _21, 371 (1968) beschriebene Subkultur der Mutante 6. Ihm fehlt die Fähigkeit, &.uf L-a-Glycerinphosphat zu wachsen oder sich dort anzusammeln, und er ist beständig gegenüber Plhosphonomycinwerten bis zu 70/Ug/ml in Nährlösung. (Der wilde Ausgangs ε tamm ist durch 10 ug/ml Dinatriumphosphonomycin vollständig gehemmt.) * KB 2498 besitzt auch keine alkalische Phosphatasewirksaakeit und zersetzt exogene Phosphatester zu einem minimalen Ausmass.

Bei der Suche nach Induziermitteln für zusätzliche Transport-. systeme für Phosphonomycin wurden' 0,05 ml eines Suspension

1 2

von 10' Zellen/ml über die Oberfläche einer 50' cm -Petrischale geschmiert, die 10 ml Bohrflüssigkeit, 1,5 % Agar (Difco) und 25 iig/ml Dinatriumphosphonomycin enthielt. Papierscheiben von 7 ™& Durchmesser, und welche 0,25 nal Lösungsmittel absorbieren konnten, wurden mit Lösungen verschiedener Phosphatester behandelt und auf die Agar-Ober- -gj fläche aufgebracht. Inhibierungszonen wurden nach I8etündi* ger Inkubierung bei 37° G genessen.

- 23 -

109817/20/< 8

14127

Getestete Verbindung

keine
Dinatrium-glucose-6-phosphat

Din atri um-fruc tο s e-6-pho sphat Dinatrium-mannose-6-phosphat

Dinatrium-2-desoxy-glucose-6-phosphat

Dinatrium-2-amino-2-desoxyglucose-6-phosphat

Dinatrium-ribose-5-phosphat-monohydrat Phosphat!dyl-äthanolamin

Tetrakalium-glucose-ii' ,ö'-dipho-sphatpentahydrat ,

Dinatrium-glucose-1-phosphat

Dimagnesium-5-phosphoryl-ribose-ipyrophosphat-dihydrat

Dinatrium-riboflavin-5-phosphat.

	.2048375
jag in der 'Scheibe	Inhibie- nuigazone ma Durch
	messer
-	0
1,0 0,5 0,1	31 27 18
10,0	42
6,0	31
1,0	27
25,0	"34
it 25	' 35
30	29
25	34
25	31
25	25
25	14

Unter den Verbindungen des obigen Versuchs, die keine Wirksamkeit bei einem Wert von 25 jag Je Scheibe zeigten,, waren: Inosit-phosphat, Adenosin-5¹-phosphat, Galactoee-1-phosphat, 2'-Desoxyribose-1'-phosphat, a-D-Ribose-1-phosphat, ß-D-Ribose-1-phosphat, a-D-Xylopyranose-1-phosphat, Giucon-6-phosphat, Hannose-1-phosphat, Erythrose-4-phosphat, Pyridoxin-phosphat, Thiamin-monophosphat, D-Galactose-6-phoophat, D-Fructose-1-phosphat, Fructose-1,6-diphosphrt, Phosphoserin, Phosphatidyl-cholin, KjN-Dimethyl-L-phosphatidyläthanolamin sowie eine grosse Anzahl nicht-phosphorylielfter Tetrosen, Pentosen und Hexosen. Die Potentiationcerscheinung zeigt also einen Grad an Spezifität, der im' Fall der Hexosephosphate in erster Linie solche Verbindungen einzu-

- 24 -

BAD ΟΠ-C-NAL

109817/2048

14127

schliessen scheint, die durch Hexokinase erzeugt werden, • und zu denen solche Hexosephosphate gehören, die bekanntlich das Glucose-ö-phosphat-Transportsystem (Verbindungen 1, 2, 3» 4· und 9) induzieren.

Keine der wirksammachenden Verbindungen erzeugte bei den getesteten Werten Inhibierungszonen bei mit MB 24-98 beimpften Platten, die aus Nährlösung/Agar ohne MK 955 bestanden.

Beispiel 6

Einfluss der Kombination verschiedener Phosphatester auf die Inhibierung verschiedener Bakterienstämme

Ijbernacht-Kulturen der angegebenen Stämme in Nährlösung (Difco) wurden 10Ofach verdünnt, und es wurde eine aliquote Menge von 0,05 ml über die Oberfläche einer 2 mm tiefen Schicht des angegebenen festen Wuchsmediums gewischt. Etnpfindlichkeitsscheiben, bestehend aus kreisförmigen Filterpapierscheiben von 7 mm Durchmesser die entweder 5 oder 30 lag Dinatriumphosphonomycin mit einer zusätzlichen Menge der angegebenen Phosphatester enthielten, wurden/auf die Oberfläche des beimpften Agars gebracht. Inhibierungszonen wurden nach I8stündiger Inkubierung bei 37° C gemessen.

- 25 -

109817/20Λ3

14127	P	U	25	25	20	30	22	21	18	chme züge H "	ss e set I
Stamm	v, I		10	10	10	10	21	10	11	15	22
MB 2489	VJl		33	33	26	24	21	31	26	10	10
MB 2489 A2	30		12	10.	10	12	14	10	11	21	#)
MB 2498	30	Zonengrösse mm Dur (vergleiche Schlüssel für die phatester) ^PABCDEPG	23	22	20	17	16	21	19	11	12
MB 24980	5	V	13	15	0	0	0	12	0	17	19
MB 2017	5	8	20	20	0-	0	01	.18	13	0	O
0? 14	.30	13	16	15	15	15	12	15	16	0	14
T 27	5	11	23	23	23'	23	22	22	22	16	16
T9	5	12	17	17	17	15	18	15	17	23	23
T 10	30	0		17	15
T 19		. 0
		15
	21
	18

Scüüssel hinsichtlich der Art und Menge der zu den Scheiben zusammen mit Phosphonomycin zugegebenen Phosphatester:

P - Dinatriumsalz des Phosphonomycins (Menge in der linken Spalte angegeben)

A - Glucose -6-phosphat, 5 J*g

B - 2'-Desoxy-glucose-6-phosphat, 5 J*g

C - Ribose-5-phosphat, 26 ng D - Thosphatidyl-äthanolamin, 25 WS E - Riboflavin-5-phosphat, 50 ug P - Fructose-6-phosphat, 5 >Ug G - Mannose-6-phosphat, 5 Pg H - 2-Amino-2-desoxy-glucqse-6-phosphat, 25 W5 I - Glucose-1-phosphat, 25 ^g

Der Stamm MB 2489 ist ein Escherichia coli-Stamm, der gut •auf α-Glycerinphosphat und D-Glucose-6-phosphat wächst. Er ergibt /^hrflüssigkeit Agar massige Empfindlichkeit gegenüber Phosphonomycin, die durch die ganze Beine der Hexosephosphateeter (A, B, P, G₁ I), von denen bekannt ist,dass

, — 26 —

109817/2048

sie den Glucose-ö-phosphat-Transportweg induzieren, wesentlich gesteigert wird.

Der Stamm MB 2489 A2 wurde von der Peripherie der gesteigerten Inhibierungszone, welche eine Phosphonomycin (5 Με) und Glucose-6-phosphat (25 J*g) enthaltende Scheibe umgibt, isoliert. Es wurde gefunden, dass er auf oc-Glycerinphosphat gut wächst, jedoch keine Stimulierung des Wachstums durch Glucose-6-phosphat ergibt. Obgleich dieser Stamm ebenso empfindlich gegenüber Phosphonomycin allein wie der Ausgangsstnmm MB 2489 ist "( wie erwartet, da sein a-Glycerinphosphat-Transportsystem wirksam ist), versagt er hinsichtlich ^ der Anregung des Mährlösungsagar durch irgendeinen der Hexosephosphat-Induziermittel des' Glucose-ö-phosphat-Transportsystems. Ferner ergibt.sich aus dem Versagen des Ribose-5-phosphats und Phosphatidyl-äthanolamins hinsichtlich einer synergistischen Wirkung, .dass diese Ester auch das Glucose-6-phosphat-Transportsystem induzieren. Jedoch deutet die noch durch Hiboflavin-5-phosphat hervorgerufene Wirksamkeit auf 4as Vorliegen noch eines dritten induzierbaren Weges, der einen gesteigerten Phosphonomycin-Transport vermittelt.

Der Stamm HB 2498 ist eine Mutante von MB 2489, der keinen a-Glycerinphosphatweg besitzt (d. h., er wächst nicht auf ™ ^a -Glycerinphosphat, behält jedoch das induzierbare Glucose-6-phosphat- Sy stern bei). Obgleich er weniger empfindlich auf Agar-Hährlösung gegenüber Phosphonomycin ist wie MB 2489, behält er die Fähigkeit bei, durch die Phosphatester-Induzieraittel angeregt zu werden.

Der Stamm MB 24980 wurde als eine resistente Kolonie von einer Platte isoliert, die 25 iig/ml Phosphonomycin und 25 jug/ml Glucose-6-phosphat enthielt. In Übereinstimmung

- 27 - -

.109817/20/4 8

mit den obigen Ergebnissen wurde seine Empfindlichkeit auf Agar-Nährlösung gegenüber Phosphonomycin einzig durch Riboflavin- 5-phosphat gesteigert.

Der Stamm MB 2017 ist ein für Mäuse pathogener·Escherichia coli. Er ergibt weitgehende Sensibilisierung auf Agar-' Nährlösung durch die gesamte Klasse der Phosphatester-Induziermittel.

Der Stamm T 14 ist eine Klebsiella Species, die aus dem Urin' eines Patienten unmittelbar vor Aufnahme der Phosphonomycin-Therapie isoliert worden war; T 27 ist eine Klebsiella Species, die aus dem Urin eines Patienten isoliert wurde, der seit 7 Tagen einer oralen Phosphonomycinr-Therapie unterzogen worden war. Beide Stämme sind auf Agar-Nährflüssigkeit gegenüber Phosphonomycin selbst resistent, zeigen Jedoch in Anwesenheit einer Vielzahl von Induziermitteln des Glucose-6-phosphat-Veges mittlere Sensibilisierung.

Die Stämme T 9 und T 19 sind Stämme von Pseudoinonns aoruginosa, die auf dem Urin infizierter Menschen isoliert wurden. Die Stämme zeigten keine merkliche .Empfindlichkeit auf Agar-Nährlösung gegenüber den obigen Phosphatestern.

Der Stamm T 10 ist ein Proteus mirabilis-Stamm, der aua dem Urin eines infizierten Menschen isoliert worden war und zeigte keine merkliche Empfindlichkeit auf Mueller Hinton Agar gegenüber irgendeinem der obigen Phosphatester.

- 28 -

10981 7/2049

Beippiel 7

Aufgetretener Einfluß in verschiedenen Wuchr.medien von . Glucose-6-phonphat auf die Größe der Inhibiorungrjzorie, welche die Erapfindlichkeitsscheiben, die dieses «uckerphoRphat in Kombination mit Phosphonomycin enthalten, ausüben

Eine übernacht-Kultur von Escherichia coli, MB 2489, die auf Nährlösung wuchs, wurde 10Ofach verdünnt, und eine aliquote Menge von 0,05 ml wurde über die Oberfläche eines 2 mm tiefen Agar-Mediums aufgewischt, das entweder aus Nährlösung, 1,5 '$> Agar (Difco), Gehirn-Herz-Infusion, 1»5 i» Agar (Difco), Mueller Hinton Agar (Difco), Trypticase-So,ja Agar (BBIi) oder einem "menschlichen Urin-Agar" bestand. I)a3 letztere Medium wurde hergestellt, indem unmittelbar nach dem Schlaf gesammelter Urin von erwachsenen I-Iännern zentrifugiert wurde· , das überstehende Material aur Erzielung von »Sterilität durch eine Membran filtriert wurde und daß Filtra mit einem Zehntel Volumen autoklaviertem 15?'iß-3n. Eoble-Agar (Difoo) in Wasser zur Erzeugung eines festen Mediumr· kombiniert wurde. Erapfindlichkeitsscheiben aus einer rilterpapierccheibe von 7 mm Durchmesser, die 5 oder 30 /Ug ' Dinntriumphosphonoraycin mit und ohne Dinatrium-glucose-6phonphat enthielt, wurden auf die Oberfläche des beimpften Agars gebracht. Inhibierungszonen wurden nach 18otündiger Inkubierung.bei 37 ⁰C gemessen.

- 29 -

':■■"· Cr.;GiNAL

10 9.8 1 7/204 S

14-127 30

Verwendetes Medium Durchmesser der Inhibierunßzone

(mm)

	5 »g 30 /ig Püosphonomycin allein	24	•	12	5 /g 30 wc PhOsphonomycin plus Glucose-6-phosphat (25 ^g)	33
Nährlösung.	12	15	28	26
Mueller Hinton- Lösung	O »	19	20 .	• 20
Gehirn-Herz- Infusion	O	16	24
Trypticase-Soja- Lösung	O	18 -	26
Menschlicher Urin	9	14

Der Aktivität von Phosphonomycin allein wird in Bezug auf die Nährlösung in dem. anderen verwendeten Medium eindeutig entgegengewirkt. Dieser Antagonismus kann zu einem über-

η Vi "F*

wiegenden Ausmass aie. hohen Werten an Natriumchlorid in Mueller Hinton-Lösung, Glucose und Phosphat in Gehirn-Herz-Infusion und Trypticase-Soja und Phosphationen im menschlichen Urin zurückzuführen sein. Dieses nachteilige Phänomen wird im wesentlichen durch den Einschluss von Glucose-6-phosphat in die Empfindlichkeitescheibe beseitigt.

Beispiel 8

Einwirkung von Glucose-6-phosphat auf die Empfindlichkeit von Escherichia coli-Stämmen auf verschiedene. Phosphonomycinanaloge

.Ub ernacht-Kul türen von Escherichia coli, Stamm MB 2489 (der sowohl das oc-Glycerinphosphat-Transportsystem als das Glucose-o-phosphat-Transportsystem besitzt) und MB 2498 ( der lediglich den Glucoaiß-6-phosphat-Weg aufweist und daher gegenüber Phosphonomycin allein relativ

109817/2048

beständig ist) wurden lOQfach verdünnt, und eine aliquote Menge von 0,05 ml wurde über die Oberfläche·einer 2 mm Nährlösung aus 1,5 % Agar (Difco) aufgewischt. Ernpfindlichkeitsscheiben aus einer Papierscheibe von 7 Bim Durchmesser, 'welche Dinatrium-phosphonomyein oder eines der angegebenen Analogen in den angegebenen Mengen zusammen mit weiteren 5 Jig Dinatriumglucose-6-phosphat, wo angegeben, enthielt, wurden auf die Oberfläche des beimpften Agars gebracht. Inhibierungszonen wurden nach 18stündiger Inkubierung bei 37° C gemessen.

, I

Wirksame Substanz

Menge	5"	MB 2489	+ G-	MB	24^8
ng	2,5.	kein G-	6-P	kein G-	+ G-
Γ	1,0	6-P	28	6-P	6-P
0,3	14	25	0	30
500	12	20	0	24
50	0	18	0	24
5	0	38	0	• 15
500	20	32	9	42
• 50	0	13	0	36·
5	0	35	0	16
16	26	8	38
0	10	0	29
0	0	12

Phosphonomycin

Monodi eye1ohexylaminsalz der 1-Methyl-1',2-epoxyä thy lpho sphonsäure

Di eye lohexyl ammoniumsalz der 1,2-Epoxyä thy lpho sphonsäure

Es wurde festgestellt, dass Glucose-6-phosphat die Empfindlichkeit von Phosphonomycin-empfendlichen und -rer.istenten Stämmen wirksam macht, so dass sie nun auf schwache Analoge von Pho sphonomy ein zum gleichen Ausmasjs wie auf Phosphonomycin selbst ansprechen. ·

- 31 -

109817/2048

o g-:-:g:.\'al

Beispiel 9

Einwirkung von Phosphonomycin und Glucose-6-phosph;t und deren Kombinationen bei der Behandlung von infizierten Mäusen '

Weibliche C.D.l'.-Mäuse eines mittleren Molekulargewichts von 22,5 g wurden intraperitoneal mit 16stündigen Kulturflüesigkeiten, die in Gehirn-Herz-Infusion entsprechend verdünnt waren, infiziert. Pur E. coli enthielt der An-

sprechwert 2,5 x 10' Zellen oder Dosierungen von 7 ^ für Shigella 2,3 χ 10 Zellen oder Dosierungen von 3 Zum Zeitpunkt der Infektion wurden das Dinatriumsala des Phosphonomycins und Natriumglucose-6-phosphat getrennt in 0,25 ml subkutan an einer gesonderten Stelle verabreicht, eine auf jeder Seite der RückAache. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Test-Organismus ^ED

50

G-6-P Dinatrium- DSP + DSP+0,1 mg

/ig phosphonomycin 1,0 mg G-6-P

' (DSP) G-6-P

yUg % yUg %

Escherichia coli	>4000	155	100	12	8	91	58
2017
Shigella (118-57)	>4000	1000	100	82	8	15OO	150
3303

- 32 -

BAD OHIGiNAL

10981 7/20A8

14127 33

Beispiel 10

Einfluss von Phosphonomycin und Glucose-6-phorpha.t sowie deren Kombinationen bei der Behandlung infizierter Hause

Bei weiteren Mädsetests, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme durchgeführt wurden, dass das Antibiotikum mit dem Natriumglucose-6-phosphat kombiniert wurde und in einer Injektion verabreicht wurde, wurden die folgenden Ergebnisse bei infizierten Mäusen mit Aerobacter aerogenes und Staphylococcus aureus erhalten:

f ·

Dinatriumphosphonomycin (DSP) s.c. Test-Organismus . 50

ττ?

ISP". ng zu DSP zugesetztes G-6-P allein WOO 1000 500 100 allein

verwendet

aerogenes 3148 10 000+ 287 3 000 7 700 10 000 >4

Staphylococcus

eureus

Smith 2949 96 22 50 >4

Beispiel 11 -

Einfluss von Fructose-6-phosphat bei der Virksammachung von Phosphonomycin in Mäusen

Die .Wirkung von Fructose-6-phosphat bei der Wirksammachung der Bekämpfung experimenteller' Bakterieninfektionen durch Phosphonomycin· in Mäusen wurde mit der von Gluoose-6-phosphat in Versuchen gemäss dem Ablauf nach Beispiel 10 verglichen. Das Antibiotikum wurde wieder mit'dem Zuckerphosphat kombiniert in einer einzigen subkutanen Injektion zum

-35 -

109817/2048

14127 '

Zeitpunkt der intraperitonealen Beimpfung mit Escherichia coli HB 2017 verabreicht. ·

Wirksammachendes Mittel Dosis Cug) ED₅₀, ng Phospho

nomycin

Kein " - 2000

Dinatriumglucose-6- . · 1000 17

phosphat 600 31

300 69 *

100 470

Dinatriumfructose-6- 1000 17

phosphat 600 - 57

3OO 202

100 534

Es ist ersichtlich, dass Fructose-6-phosphat ein Ausmass an Wirksammachung gegenüber Phosphonomycin ausübt, das. mit demjenigen vergleichbar ist, das vorher in den Parallelversuchen mit Glucose-6-phosphat beobachtet wurde. Diese Äquivalenz wurde sowohl aus der gleichen Steigerung der in vitro beobachteten Inhibierung in Beispiel 5 erwartet, wenn eines dieser Zuckerphosphate mit Phosphonomycin kombiniert wurde, als aus der Sicherheit ihrer Umwandlung dUrch die im Plasma vorliegende ausreichende Phosphoglucose-isomerase-Aktivität.

Beispiel 12

Therapeutische Wirkung von Phosphonomycin, das oral an infizierte Mäuse verabreicht wurde, die Glucose-6-phosphat entweder auf oralem oder subkutanem Weg aufnehmen

Das Vorgehen nach Beispiel 9 wurde für den Pail von Escherichia coli 2017 mit der Ausnahme wiederholt, dass unmittelbar nach der Infektion das Dinatriumsalz des Phosphonomycins oral verabreicht wurde, während Dinatriumglucose-6-

' 109817/2048-

phosphat, wo angegeben, entweder oral oder auf subkutanem Wege verabreicht wurde. In keinem Fall wurde ein Schutz beobachtet, wenn Glucose-6-phosphat allein bei dem Wert von 4000 u.g oral oder subkutan in Abwesenheit von Phosphonomycin verabreicht wurde.

Glücose-6- Weg Dosis an oral verabreichtem phosphat Phosphonomycin (ug), die 50 %

lag der Tiere schüWt {ED)

O - 2000

1000 . oral . 2000 100 subkutan 37 .

Glucose-6-phosphat ist ein wirksamer Therapiepotentiator für oral verabreichtes Phosphonomycin (25fache Sensibilisierung), wenn Zuckerphosphat subkutan verabreicht wird. Es wird keine Sensitiv!erung beobachtet, wenn das Zuckerphosphat oral mit diesem Wert verabreicht wird.

Beispiel 15

Therapeutische Wirksamkeit von Phosphonomycin, das parenteral an infizierte Mäuse,-die oral Glucose-6-phosphatsalze aufnehmen, verabreicht wurde

Das Vorgehen nach Beispiel 9 wurde für den Fall von Escherichia coli 2017 lait der Ausnahme wiederholt, dass unmittelbar nach Infektion das Dinatriumsalz des Phosphonomycins subkutan verabreicht wurde, während Glucose-6-phosphat in der angegebenen Form oral durch Gabe in 0,25 ^l Wasser verabreicht, wurde. In keinem Fall wurde Schutz bei Verabreichung der Glucose-ö-phosphatsalze allein beobachtet, noch verursachte die orale Verabreichung allein von 2,5 mg n-Octylammoniumchlorid (ohne Glucose-6-phosphat) eine Ab-

- 35 -

109817/2048

14127

nähme des ED^Q-Wertes von gleichzeitig parenteral verabreichtem Phosphonomycin.- Die n-Octylammoniumsalze des Glucose-6-phosphats wurden durch überführung des Dinatriumsalzes in die freie Säure durch Hindurchleiten durch eine Kolonne, die einen 2Ofachen Überschuss an Dowex-50 (H⁺ enthielt, anschliessende Neutralisierung von Anteilen dee Eluats mit Je 0,7, 1,5 oder 2,0 molaren Äquivalenten der freien n-Octylaminbase und 1,5» 0»5 bzw. 0 molaren Äquivalenten NaOH unter Erzielung eines pH-Wertes von 7,5 in Jedem Fall hergestellt.

Glucose-6-phosphatsalz (mg)

Dosis an Phosphonomycin, welche 50 % der Tiere schützt ()

	Versuch I	kein	Versuch II	kein .	. 500	*	827
	100 50	5 ■	27 65	125
Dinatrium- salz	25	5	125	068
	12,5	I '■'	502	714
	6,25		551
	10 1	66 502
Natrium 0,5 + n-Octyl- ammonium 1,5
Di-n-octyl- ammonium
Natrium 0,5 "~ n-Octyl- ammonium 1,5 __
Natrium 1,5 ~~ n-Octyl- ammonium 0,7 _

109817/20 4 B

■ "-TED

Oral verabreichtes Glucose-6-phosphat macht die Phosphonomyein-Therapie wirksam und wird in dieser Richtung im Verhältnis zu dem Anteil an anorganischem Gegenion, das durch lipophiles Amin ersetzt ist, noch wirksamer gemacht.

Beispiel 14

Wirksammachung der Phosphonomycin-Therapie durch gleichzeitig verabreichtes Galactose-6-phosphat bei mit Staphy lococci infizierten Mäusen

Eine Untersuchung der Wirkung von Galactose-6-phosphat hinsichtlich der Wirksammachung der Bekämpfung experimentell in Mäusen erzeugter Staphylococtsen-Infektionen durch Phos-■ phonomyein' wurde durch die bei einer Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Methodologie auf diesem Stamm ermittelten Feststellung gerechtfertigt, dass 25 J*g dieses Zukkerphosphats, wenn es zu einer Eapfindlichkeitsscheibe, die 5yUg Phosphonomycin enthält, zugegeben wurde, eine Ihhibiefungszone von 21 mm erzeugt im Gegensatz zu der nicht mit Zusatz versetzten Scheibe mit einer Zone von 17 mm, wenn die Scheiben auf eine mit Staphylococcus aureus Smith 294-9' beimpfte Nähragarplatte gebracht wurden. In dem folgenden Therapieversuch wurde das Antibiotikum mit dem Zuckerphosphaf vereinigt in einer einzigen subkutanen injektion zum Zeitpunkt der intraperitonealen Injektion mit 10 Zellen je Maus (14 IjDcq)· verabreicht, wobei die Zellen 16 Stunden in. Gehirn-Herz-Infusion gewachsen waren.

- 37 -

109817/2048'

14127

^ED50

Potentiator	Bo si s (/β)
kein '	■ ■*
Binatrium-glucos e-6- phosphat	4000
Binatrium-galactose- 6-phosphat	4000

5 (ag .Phosphonomycin)

212 91 25

Sie Wirkung von Galactose-6-phosphat als ein Potentiator wird durch die nachgewiesene Existenz eines induzierbaren Galäctose-ö-phosphat-Transportsystems in Staphylococcus erklärt. Galactose-6-phosphat ist ein Metabolit der Lactosehydrolyse einzig zu gewissen gram-positiven Organismen, wird jedoch nicht durch E. coli erzeugt oder davon verwendet. Barauf ist das Versagen von Galactose-6-phosphat zur Wirksammachung der Phosphonomycin-Wirkung auf E. coli zurückzuführen (Beispiel 5)· '

Beispiel 15

Wirkung von Mannose-6-phosphat hinsichtlich der Wirks&nimachung von Phosphonomycin in Mäusen

Sie Wirkung von Mannose-6-phosphat hinsichtlich der Wi rksamraachung der Bekämpfung experimenteller Infektionen in Mäusen durch Phosphonomycin wurde mit der von Glucose-6-phosphat in Versuchen nach den Vorschriften des Beispiels 10 verglichen. Bas Antibiotikum,wurde wieder in Kombination mit einer Reihe feststehender Werte an Zuckerphosphaten titriert in einer einzigen subkutanen Injektion zum Zeitpunkt der intraperitonealen Beimpfung mit Escherichia coli MB 2017 verabreicht. ·

109817/2048

14127	Dosis (/6)
Potentiator	_
kein·	1000
Dinatrium-glucose- 6-phosphat	1000
Dinatri um-mannos e- 6-phosphat	500
Il	250
Il	125
Il

^ED

Gig Phosphononiycin)

1420 18

19

. 25

92

490

Mannose-6-phosphat übt ein Ausmass an Wirksammachung gegenüber Phosphonomycin äquivalent zu dem vergleichbarer Glucose-6-phosphat-Werte aus, selbst obgleich dessen Wirkung in vitro nur ein Zehntel derjenigen von Glucose-6-phosphat beträgt. Diese Dis-'krepanz kann auf die Umwandlung von Mannose-6-phosphat in Glucose-6-phosphat in vivo durch aufeinanderfolgende Einwirkung von Mannose-phosphat-lsomerace und Phosphoglucose-Isomerase zurückgeführt werden, Enzyme, deren Wirksamkeiten in Plasma und in den Wänden von Blutgefassen nachweisbar sind.

Beispiel 16

Wirksammachung der Phosphonomycin-Therapie in Mäusen durch Glucose-1-phosphat und Eibose-5-phosphat

Die Wirkung von Glucose-1-phosphat und Ribose-5-phosphat hinsichtlich der Wirksammachung der Bekämpfung experimenteller bakterieller Infektionen in Mäusen durch Phosphonomycin wurde mit derjenigen von Glucose-6-phosphat in Versuchen gemäss den Angaben nach Beispiel 10 verglichen. Das Antibiotikum wurde wiederum hinsichtlich seiner Heilwirksamkeit in Kombination mit den angegebenen feststehen-

- 39 -

1 0 9 8 1 7 / ? Π /♦ f.-

den Werten an Zackerphosphat titriert in einer einzigen Injektion zum Zeitpunkt der intraperitonealen Beimpfung mit E. coli MB 2017 verabreicht.

Potentiator	Dosis	_ '	#EDcq
	(/s)	1000 .	(ag Phosphonomycin)
kein	1000	940
Dinatrium-glucose- 6-phosphat	1000	' 5 ■
Dikalium-glucose- 1-phosphat	,9
Dinatrium-ribose- 5-phosphat *	158

* Bei dieser Probe wurde durch einen spezifischen Versuch mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase nachgewiesen, dass sie durch nicht mehr als einen Teil Je Tausend Glucose-6-phosphat verunreinigt war.

Die Potentierungsfähigkeit von 1000 lag Bibose-5-phosphat, obgleich bedeutsam, ist nur derjenigen äquivalent, die durch etwa 100 lag Glucose-6-phosphat erzeugt wird (vergleiche Beispiel 11). Dieses Ausmass an relativer Potenz wurde "durch das Gewichtsverhältnis von Ribose-5-phosphat zu Glucose-6-phosphat, das äquivalent erhöhte Inhibierungszonen in vitro erzeugt (Beispiel 5),verhindert. Die äquivalenten Wirksamkeiten von Glucose-1-phosphat und Glucose-6-phosphat in vivo, trotz der Unterschiede in vitro, gehen höchstwahrscheinlich auf die rasche Umwandlung des 1-Phosphats in das 6-Phosphat durch die Einwirkung von bekanntlich im Plasma vorliegender Phosphoglucomutase zurück.

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Beispiel 17

Wirksammachung der Phosphonomycin-Therapie in mit Streptococci infizierten Mäusen durch gleichzeitig verabreichte Lactose

Nach Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Methodologie auf Streptococci wurde festgestellt, dass 250 ug Lactose, die" zu einer Empfindlichkeitsscheibe zugegeben wurden, welche 30 /6 Phosphonomycin enthielt, eine Inhibierungszone von 27 mm Durchmesser im Vergleich mit einer Zone von 12 mm bei einer Scheibe ohne Zusatz erzeugt, wenn die Scheiben auf eine mit Streptococcus faecalis H. beimpfte Nähragarplatte gebracht wurden. Bei den folgenden Therapieversuchen wurden 14 Kolonien bildende Einheiten (7 LDc-q) des pathogenen Streptococcus pyogenes (1934-)» der in Gehirn-Herz-Lösung gewachsen und mit 105&Lgem Pferdeserum versetzt worden war, intraperitoneal beimpft. Gleichzeitig wurden 0,5 ml entweder einer Lactoselösung oder einer Salzvergleichslösung subkutan injiziert, woran sich in Versuch I eine einzelne orale Doses von*0,5 ml Phosphonomycin (durch Zwangsgabe) und in Versuch II vier aufeinanderfolgende orale 0,5 ml Dosen von Antibiotikum nach 0, 2, 4 und'6 Stunden nach der Infektion anschlossen.

Potentiator	Dosxs ' (mg)	(insgesamt verabreichtes Phosphonomycin, iig)
	. ' Versuch I
kein Lactose	4	3950· 1530
kein Lactose	Versuch II 4 .	2100 800

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Neutrale Saccharide können also die Phosphonomycin-Wirk^ung sowohl in vivo als auch in vitro wirksammachen bzw. potenzieren. Bestimmte Streptococci,, gemeinsam mit ßtaphylococci, zeigen auch induzierbaren Stoffwechsel von Lactose zu Galactose-6-phoBphat.

Beispiel 18

Wirkung von Phosphonomycin zum Schutz von Mäusen, die durch bakterielle Mutanten-Isolate, welche hohe Wert.e des L-a-Glyceriiiphosphat-Transportsystems in Abwesenheit eines Induziermittels ergeben, infiziert wurden ·—

Mutanten wurden aus E, coli 2017 unter Verwendung eines in Biochimica et Biophysica Acta, Band 60, Seite 422 bis 424, 1962, beschriebenen Mutagenese- und Mutantenbestimmungsgitters isoliert, und diese Mutanten zeigten hohe Werte an oc-Glycerinphosphat und Glycerinstoffwechsel ohne die Notwendigkeit des "vorherigen Wachstums in Anwesenheit dieser Induziermittel, wie sich beispielsweise bei den na- . türlichen Stämmen zeigt. Der Durchmesser der Inhibierungszonen rund um die Sensibilisierungsscheiben, welche 5 Mg Phosphonomycin aufweisen, die auf mit Mutanten C^, C₂ und dem Ausgangsstamm beimpften Nähragarplatten aufgebracht waren, betrugen 20, 24 bzw. 12 mm. Da gezeigt wurde' (Beispiel 1), dass die Zugabe von Glycerin zu diesen Scheiben auf dem Ausgangsstamm die Zonengrösse aus 26 bis 29 mm vergrösserte, ist daraus zu schliessen, dass die Mutantenstämme Ausmasse des Phosphonomycin-Transportsystems besitzen (d. h., das L-a-Glycerinphosphat-Transportsystem), die denen induzierter wilder Stämme vergleichbar sind. Daher sollte die Empfindlichkeit dieser Mutanten gegenüber der Phosphonomycin-Therapie aus der Empfindlichkeit induzierter wilder Stämme in anderen Situationen vorauszusagen sein. Mutanten Cy. und Cp des Ausgangsstamms wurden unter identischen Bedin-

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gungen (in Beispiel 9 beschrieben) kultiviert und intraperitoneal in Mäuse bei den angegebenen Ansprechwerten eingeimpft. Mäuse wurden subkutan mit Phosphonomycin unmittelbar nach Infektion injiziert.

•Bakterienstamm Anzahl geimpfter ED₁-Q

(Virulenz) ty^s Phosphonomycin;

E. coli 2017 4,2 χ 10⁶ 943

(Ausgangsstamm) (10 LD™)

Mutasite C. 4,7 x 10⁶ 12

^Ί (30 LD™)

(9

Mutante C₀ · 1,2 χ 1Ο⁷ 14

² C9 L)

Selbst obgleich die Mutanten volle Virulenz besitzen, werden sie durch ein bemerkenswert niedriges Ausmass an Phosphonomycin bekämpft*, was bedeutet, dass der nichtinduzierte wilde Stamm in vivo weit weniger entfaltet, als seine volle induzierbare Kapazität hinsichtlich der Ansprechbarlceit auf Phosphonomycin. Es ist daraus zu schliessen, dass es möglich ist, maximale Werte des L-a-Glycerinphosphat-'Iransportsystems herzustellen und eine entsprechend wirksaniere Therapie durch Phosphonomycin in irgendeiner beliebigen klinischen Situation (z. B. Hdrntrakt- oder Hautinfektionen), wo die Abwesenheit von Glucose eine wirksame Induktion durch gleichzeitig verabreichte Potentierungsmittel (z. B. Glycerin), welche solche Stellen erreichen, sicherstellt.

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Beispiel 19

Wirkung von gleichzeitig verabreichtem Glucose-6-phoopha't auf die Empfindlichkeit gegenüber Phosphonomycin, in vitro und in vivo einer bakteriellen Variante, die beim Menschen während der Therapie Resistenz gegenüber Phosphonomycin angenommen hatte

Die im folgenden verwendeten Stämme von Escherichia coli stellen im Fall von M 13 ein Isolat aus dem Urin eines infizierten weiblichen Tieres unmittelbar vor sedner Behandlung mit Phosphonomycin dar und im Fall von M 21 -ein Isolat aus den arzneimlttelresistenten Organismen, die in dem Urin dieses Lebewesens nach 7tägiger Therapie mit dem Antibiotikum vorliegen. Die in vitro durchgeführten Empfindlichkeitstests erfolgten in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise. Der· in vivo.durchgeführte Mausschutzversuch erfolgte wie in Beispiel 9 beschrieben' nach intraperitonealer Versetzung mit der angegebenen Anzahl an Organismen.

Empfindlichkeitstests· in vitro

Inhibierungszonen (mm), welche die Scheiben umgeben, die 30 Jf¹S Phosphonomycin allein oder in Kombination ndt 5 J*S Glucose-6-phosphat enthalten '

Phosphonomycin allein plus Glucose-6-

phosphat

E. coli M 13 19 · 28

E. coli Μ 21 0 (weniger als 20

7 mm;

- 44- -

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14127

Heilwirkung von Phosphonomycin bei infizierten Mäusen . (ED₅₀ in mg)

Phosphonomycin allein

E. coli M 13.
3,7 χ 10' Zellen

0,25 ·

Phosphonomycin gleichzeitig mit 1 mg Dinatriumglucose-6-phosphat verabreicht

. 0,035

E. coli M 21
1,2 χ 10' Zellen
- 10 LD₅₀

17,5

2,5

* Bei dem höchsten an diese Gruppe verabreichten Arzneimittelwert, 20 mg je Maus, wurden nur 3 eier fünf infizierten Tiere geschützt. In den anderen drei Gruppen wurde vollständiger Schutz bei nicht mehr als dem zwei fachen, mittleren angegebenen Wert beobachtet.

Da der resistente Stamm die Fähigkeit, auf Phosphonomycin nach gleichzeitiger Zugabe von Glucose-6-phosphat anzusprechen, beibehält, wird gefolgert, dass der Hexose-6-phosphat-Transportweg nicht merklich durch endogene Substanzen bei den natürlichen Harninfektionen des Menschen induziert wird. Wenn Transport durch die absichtliche gleichzeitige Verabreichung von Induzierungsmitteln hervorgerufen wird, sollte die Besistenz gegenüber Phosphonomycin verhindert oder beseitigt sein, und die therapeutische Be seitigung derartiger Stämme würde ermöglicht werden.

-45 -

' 109817/204 8·

Beispiel 20

Wirkung gleichzeitiger Verabreichung von Glueοse-6-phosphat auf die Empfindlichkeit eines wilden, induzierbaren Bakterienatommes und einer davon abgeleiteten nichtinduzierbaren Mutant© gegenüber Phosphonomycin in vitr£> und in vivo

Eine mit 201? A bezeichnete Mutante, welche keine zusätzliche Bnpfindlichkeit in vitro.gegenüber Phosphonomycin nach Zugabe von Glucose-6^-phosphat ergibt, wurde aus seinem Ausgangsstamm, dem natürlich vorkommenden pathogenen Eccherichia coli 2017 durch die in Beispiel 6 zur Isolierung des Stammes MB 2489 A2 aus seinem Ausgangsstamm MB 2489 beschriebenen Verfahren isoliert. Die Mutante 2017 A zeigte eine normale Fähigkeit, Glucose-6-phosphat umzuwandeln. Seine Empfindlichkeit in vitro gegenüber Phosphonomycin wurde -in vivo in Bezug auf den Ausgangsstamm zweimal in •den unten beschriebenen Mäuseschutzversuchen unter Verwendung des in Beispiel 9 aufgeführten Vorgehens bestimmt.

In vitro Empfindlichkeitstests

Inhibierungszonen (mm), welche die Scheiben umgeben, die JO »g Phosphonomycin allein oder in Komüination mit 5 /6 Dinatriumglucose-6-phosphat enthalten ^/

Phosphonomycin allein plus Glucose-6-

pho sphat ,

E. coli 2017 18. 27

E. ooli 2017 A 17,5 18

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14-127

Heilwirkung von Phosphonomycin bei infizierten Hausen

(₀ in mg)

Versuch I

E. coli 2017 1 χ 10⁶ Zellen

E. coli 2017 A 1 χ 10⁶ Zellen'

Versuch II E. coli 2017 5 χ 10⁶ Zellen·

Pho sphonomycin allein

0,250

0,166

0,821

Phosphonomycin gleichzeitig mit 1 mg Dinatriumglu cose-6-phosphat verabreicht

0,015

0,284 0,021

E. coli 2017 A 9 χ 10⁶ Zellen

- 55 LD₅₀ .

1,420

1,150

Der Unterschied der Mut ante 2017 A gegenüber der Kombination von Glucose-6-phosphat mit Phosphonomycin in vitro wird in vivo durch das Versagen des gleichzeitig verabreichten Glucose-6-phosphats zur Steigerung der Wirksamkeit von Phosphonomycin bei der Behandlung von durch diese Mutante infizierten Musen wiedergegeben. Somit ist die normale Wirksammachung der Heilwirkung von Phosphonomycin durch Glucose-6-phosphat auf seine direkte Wirkung auf induzierbare infizierende Bakterienstämme zurückzuführen und nicht durch jede beliebige Ansprechbarkeit des Wirtes, die vermu-

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109817/20

tet werden könnte (ζ. Β. erhöhte Arzneimittelabsorption oder immunes Ansprechen), wodurch die Mutante ebenso günstig beeinflusst würde wie der Ausgangsstamm. Die gleiche Wirksamkeit von Phosphonomycin allein gegenüber Infektionen auf Grund induzierbarer und nichtinduzierbarer Orgiinismen deutet darauf hin, dass endogene Induziermittel entweder abwesend sind oder in einem zu geringen Ausmass vorliegen (in solchen Bereichen des Körpers, der durch· Mikroorgfjrxismen befallen ist), um die Biosynthese des Hexose-6-phosphat-Transportsystems hervorzurufen. Die festgestellten Wirkixa,^- vorteile, die sich aus der Induktion dieses Systems ergebe,,, erfordern ausdrücklich die Verabreichung exogener Induziermittel durch den Therapeuten.

Gemäss der Erfindung können die bakteriellen Transportsysteine

in infizierten Tieren unter Verwendung geringer Dosierungen an wirksammachenden Mitteln, insbesondere auf oralem Wege herbeigeführt werden,, wenn Spaltung der Esterbindung entweder durch bakterielle intestinale, Leber-, Nieren-, Plasma- oder Harnphosphatasen vermieden wird. Die bevorzugten wirksammachenden Mittel sind Kohlehydratester der Formel:

Y' CH₀

ι tL

R¹

worin -CH₀- die eridständige Methylengruppe der Gruppierung R¹-CHp-OH, eine Pentose oder Hexose, wie beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, 2-Desoxy-glucose, 2-Amino-2-desoxyglucose, Galactose, Ribose, einen 1-substituierten Ribit, z. B. Riboflavin, ader Glycerin und Y' die folgenden Gruppierungen

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1 0 9 8 17 / 2 0 UB

14127 W

X „

Z X

-CH₂-]

-OSO₃H₂ -SO₃H

-CH₂SO₂NHR₁ oder

bedeuten, worin. X, Y, Z, R₁ und R₂ die vorstehend angegebene f Bedeutung besitzen und deren Salze·

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Claims (18)

W27 1. Oktober 1970 Patentansp r üch e

1. Verfahren zur Wirksammachung der Aktivität eines Phosphonomycin-Antibiotikums, dadurch gekennzeichneb, dacs Bakterien mit einem Induziermittel in Berührung gebracht werden, welches unter Steigerung eines bestehenden Weges oder unter Erschliessung eines neuen Transportweges für die Bakterien wirkt und die Bakterien spacer oder gleichzeitig mit einem Phosphonomycin-Antibiotikun in Berührung gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Induziermittel verwendet wird, das ein Hexosephosphat-Transportsystem herbeiführen kann.

J. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Induziermittel verwendet wird, das ein Glucose-6-phosphat-Transportsystem herbeiführen kann.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel ein Zuckerphosphat verwendet wird.

5· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, duss als Induziermittel ein Phosphatid verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Induziermittel verwendet wird, das das α,-Glycerinphosphat-System steigern kann.

7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel ein mehrwertiger Alkohol verwendet wird.

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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induzienaittel Glucose-6-phosphat verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel Mannose-6-phosphat verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induzienaittel Glucose-1-phosphat verwendet wird. .

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel Ribose-5-phosphat verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel Galactose-6-phosphat verwenden wird.

13· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Induziermittel Lactose verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Phosphonomycin-Antibiotikum ein Salz des Phosphonomycins verwendet wird.

15· Verfahren zur Ermittlung von Induziermitteln für den Eintritt eines Phosphonomycin-Antibiotikum-Transportsystems in Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass eine phosphonomyeinresistente Mutante in einem Medium gezüchtet wird, das ein Phosphonomycin-Antibiotikum und eine Testverbindung, enthält und solche Verbin-

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14127 η

düngen als Induziermittel gewählt werden, welche das Wachstum der Mutante inhibieren.

16. Verfahren zur Wirksainmachung der Aktivität eines Phosphonomyein-Antibiotikums bei der antibiotisehen Therapie, dadurch gekennzeichnet, dass ein Induziermittel eines Phosphonomycin-Transpqrtweges in das infizierte Bakterium vor oder gleichzeitig mit dem Phosphonomycin-Antibiotikum verabreicht wird.

17· Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Induziermittel gleichzeitig mit dem Phosphonomycin-Antibiotikum durch parenterale Verabreichung verabreicht wird.

18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Induziermittel parenteral und das Phosphonomy ein-Antibiotikum oral verabreicht werden.

Antibiotische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch ein Phosphonomyein-Antibiotikum, ein Induziermittel eines Phosphonomycin-Transportsystems in Bakterien und einen pharmazeutisch-annehmbaren Träger.

OPTIMAL JNSPECTED

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