DE69827317T2

DE69827317T2 - C3-Pflanzen, welche photosynthetische Enzyme von C4-Pflanzen exprimieren

Info

Publication number: DE69827317T2
Application number: DE69827317T
Authority: DE
Inventors: Makoto Nagoya-shi Matsuoka; Mitsue Tokutomi; Seiichi Toki; Maurice Sun-Ben Pullman Ku
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 1997-03-11
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2018-01-21
Also published as: CA2219962A1; AU693754B1; CN1193047A; DE69827317D1; KR19980079629A; KR100275200B1; US6831217B1; HK1015824A1; JPH10248419A; NZ329550A; US20040197915A1; EP0874056B1; CA2219962C; JP3210960B2; EP0874056A1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine C3-Pflanze, welche ein Gen für ein Enzym enthält, das in einen C4-Photosyntheseweg verwickelt ist (auf das hierin anschließend Bezug genommen wird als ein C4-Photosynthesegen), und die das C4-Photosynthesegen in einem hohen Maße exprimiert.
2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK
Pflanzen sind in C3-Pflanzen, C4-Pflanzen und Pflanzen mit einem Crassulaceen-Säuremetabolismus (CAM-Pflanzen) klassifiziert, basierend auf der Art der anfänglich fixierten Produkte in der photosynthetischen Fixierung von CO₂. 90 % oder mehr der Pflanzen auf der Erde gehören zu den C3-Pflanzen, welche z. B. landwirtschaftlich wichtige Pflanzen wie Reis und Gerste enthalten. Der Photosyntheseweg von C3-Pflanzen wird auch als der Calvin-Weg bezeichnet und ein Enzym, das bei der photosynthetischen Fixierung von CO₂ in diesem Weg involviert ist, ist Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase. Dieses Enzym hat eine niedrige Affinität für CO₂ und eine hohe Affinität für O₂. Deswegen ist die Effizienz einer Photosynthesereaktion ebenso wie die photosynthetische Fixierung von CO₂ bei dem C3-Photosyntheseweg niedrig.
Die C4-Pflanzen sind jene, die sich so entwickelt haben, dass sie die ineffiziente photosynthetische Fixierung von CO₂ überwunden haben. Die C4-Pflanzen besitzen einen Mechanismus für die Konzentrierung von CO₂ und eine hohe Photosynthesekapazität. Ein Enzym, das bei der photosynthetischen Fixierung von CO₂ im Photosyntheseweg der C4- Pflanzen involviert ist, ist die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase. Dieses Enzym hat eine hohe Kapazität der photosynthetischen Fixierung von CO₂, ohne dass seine Aktivität durch O₂ inhibiert wird.
CAM-Pflanzen haben ein Photosynthesesystem, das für eine trockene Umgebung geeignet ist, und das Photosynthesesystem wird als eine Art entwickelter Form des C3-Photosynthesesystems betrachtet.
Es wird erwartet, dass die Photosynthesekapazität und -produktivität landwirtschaftlich wichtiger C3-Pflanzen (z. B. Reis) merklich durch die Bereitstellung einer C3-Pflanze mit der photosynthetischen Funktion einer C4-Pflanze verbessert werden wird. Etliche Versuche wurden gemacht, ein C4-Photosynthesegen in eine C3-Pflanze einzuführen.
Um ein Photosynthesegen einer C4-Pflanze zu exprimieren, wurde ein Promotor für ein Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein oder ein Blumenkohlmosaikvirus-(CaMV)-35S-Promotor, der an dieses gekoppelt war, verwendet. Zum Beispiel gibt es einen Bereicht von Kogami et al., Transgenic Research 3: 287-296 (1994): Der (CaMV)-35S-Promotor, der in einem hohen Maße in einem Blattgewebe einer C3-Pflanze exprimiert werden kann, wurde mit einem Photosynthesegen einer C4-Pflanze (das Phosphoenylpyruvat-Carboxylase-(PEPC)-Gen) gekoppelt, um rekombinante DNS zu produzieren, und dann wurde die rekombinante DNS in eine C3-Pflanze, Tabak, eingeführt; die PEPC-Aktivität in der C3-Pflanze stiegt jedoch geringfügig höchstens auf das 2- bis 3fache an. Es gibt einen anderen Bericht von Matsuoka et al., Plant Physiol. 111: 949-957 (1996): Für die Zwecke der Untersuchung der Funktion eines Promotors des C4-Photosynthesegens wurde ein Fusionsgen des β-Glucuronidase-(GUS)-Gens von E. coli und eine 5'-flankierende Region (Promotorregion) des PEPC-Gens in Tabak eingeführt, wodurch das GUS-Gen in einem hohen Maße exprimiert wurde. Es gibt auch einen Bericht von Hudspeth et al., Plant Physiol. 98: 458-464 (1992): Als ein C4-Photosynthesegen wurde das genomische PEPC-Gen aus Mais, enthaltend die Expressionskontrollregion (Promotorregion), in Tabak eingeführt; die PEPC-Aktivität stieg jedoch nur auf das 2- bis 3fache.
Folglich gab es zu dem Ausmaß, zu dem es den Erfindern gegenwärtig ist, vor dem Einreichen der japanischen Patentanmeldung Nr. 9-56742, von der die vorliegende Anmeldung die Priorität beansprucht, keine Berichte von Beispielen, wo ein Enzym, das in die Photosynthese involviert ist, in einem hohen Maß exprimiert worden war. Demgemäß gab es einen Bedarf für Techniken, ein Photosynthesegen einer C4-Pflanze in einer C3-Pflanze in einem hohen Maß zu exprimieren, wodurch die photosynthetische Kapazität der C3-Pflanze erhöht wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, die oben genannten Probleme zu überwinden, und ihre Aufgabe ist es, ein Photosynthesegen einer C4-Pflanze in einer C3-Pflanze in einem hohen Maße zu exprimieren.
Wie oben beschrieben, gibt es ein Beispiel, in welchem Versuche gemacht worden waren, ein genomisches PEPC-Gen, das in einem Photosyntheseweg einer C4-Pflanze, Mais (Poaceae), verwickelt ist, in eine C3-Pflanze, Tabak (Solanaceae), einzuführen, was in einer niedrigen Expressionseffizienz resultierte. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden heraus, dass durch Einführen eines Gens, das (a) eine Expressionskontrollregion eines Enzyms, das in einen C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze verwickelt ist, welche phylogenetisch mit einer C3-Pflanze verwandt ist, enthält, und das (b) ein Strukturgen für dieses Enzym enthält, das in den C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze verwickelt ist, die phylogenetisch mit einer C3-Pflanze verwandt ist, in die C3-Pflanze die Expressionseffizienz des Enzyms, welches in den C4-Photosyntheseweg verwickelt ist, merklich erhöht ist, wodurch die vorliegende Erfindung erzielt wurde.
Eine C3-Pflanze, die ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt DNS ein, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das Strukturgen ein genomisches Gen ist, enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung einer C3-Pflanze, die ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt die folgenden Schritte ein: Transformieren von Zellen der C3-Pflanze mit DNS, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das Strukturgen ein genomisches Gen ist, enthält; und Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zu der C3-Pflanze.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und die C3-Pflanze ist eine monokotyle Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und die C3-Pflanze ist eine dikotyle Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die DNS ein genomisches Gen der C4-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-Poaceen-Pflanze und die C3-Pflanze ist eine C3-Poaceen-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Poaceen-Pflanze ein genomisches Gen für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais und die C3-Poaceen-Pflanze ist Reis.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine C3-Pflanze, die durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, und auf einen Teil der C3-Pflanze.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Teil einer C3-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung ein Gemüse.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Teil einer C3-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung eine Frucht.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Teil einer C3-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung eine Blüte.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Teil einer C3-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung ein Samen.
Ein C3-Pflanzengewebe, das ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt DNS ein, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das Strukturgen ein genomisches Gen ist, enthält.
Ein Verfahren für die Herstellung eines C3-Pflanzengewebes, das ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt die folgenden Schritte ein: Transformieren von Zellen der C3-Pflanze mit DNS, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze enthält, wobei das Strukturgen ein genomisches Gen ist; und Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zu dem C3-Pflanzengewebe.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und das C3-Pflanzengewebe ist ein Gewebe einer monokotylen Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und das C3-Pflanzengewebe ist ein Gewebe einer dikotylen Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die DNS ein genomisches Gen der C4-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-Poaceen-Pflanze und das C3-Pflanzengewebe ist ein Gewebe einer C3-Poaceen-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Poaceen-Pflanze ein genomisches Gen für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais und die C3-Poaceen-Pflanze ist Reis.
Ein C3-Pflanzensamen, der ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt DNS ein, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze enthält, worin das Strukturgen ein genomisches Gen ist, und worin der C3-Pflanzensame wenigstens nach der Keimung und dem Wachsen das durch das Strukturgen kodierte Enzym in einem hohen Maß exprimiert.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines C3-Pflanzensamens, welcher ein Gen einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, schließt die folgenden Schritte ein: Transformieren von Zellen der C3-Pflanze mit DNS, die (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer phylogenetisch verwandten C4-Pflanze und (b) ein Strukturgen für dieses Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze enthält, worin das Strukturgen ein genomisches Gen ist; Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zu der C3-Pflanze; und Gewinnen eines Samens aus der C3-Pflanze; worin der C3-Pflanzensamen wenigstens nach der Keimung und nach dem Wachsen das durch das Strukturgen kodierte Gen in einem hohen Maß exprimiert.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und der C3-Pflanzensamen ist ein Samen einer monokotylen Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und der C3-Pflanzensamen ist ein Samen einer dikotylen Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die DNS ein genomisches Gen der C4-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-Poaceen-Pflanze und die C3-Pflanze ist eine C3-Poaceen-Pflanze.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das genomische Gen der C4-Poaceen-Pflanze ein genomisches Gen für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais und die C3-Poaceen-Pflanze ist Reis.
Folglich macht die hierin beschriebene Erfindung die folgenden Vorteile möglich: (1) Bereitstellen einer C3-Pflanze ebenso wie Gewebe und Samen davon, welche ein C4-Photosynthesegen wirksam exprimiert, und (2) darüber hinaus Bereitstellen einer technischen Basis für die Erhöhung der Photosynthesekapazität einer C3-Pflanze durch Übertragen der Photosynthesekapazität auf die C3-Pflanze.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten nach dem Lesen und Verstehen der folgenden detaillierten Beschreibung mit Bezugnahme auf die begleitenden Figuren offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das eine Restriktionsenzymkarte eines DNS-Fragmentes, das das PEPC-Gen einschließt, zeigt, wo breitere Teile der Linien Exons darstellen.
2 ist ein Diagramm, das eine Basensequenz von ungefähr 8 kb eines DNS-Fragments, das das PEPC-Gen einschließt, zeigt.
3 ist eine Fortsetzung der 2.
4 ist eine Fortsetzung der 3.
5 ist ein Diagramm, das den binären Vektor pIG121-Hm zeigt.
6 ist ein Diagramm, das eine Struktur des Expressionsvektors PEPCgenome/pBIH2 zeigt.
7 ist ein Diagramm, das PEPC-Aktivitäten transgener Reispflanzen zeigt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird im Wege erläuternder Beispiele mit Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben werden.
(Definitionen)
Der hierin verwendete Begriff "phylogenetisch verwandt" bezieht sich auf das Besitzen einer gewissen phylogenetischen Verwandtheit, das heißt das Angehören zu derselben Familie.
Der Begriff "Pflanzen", wie er hierin verwendet wird, schließt, soweit nicht anderweitig angezeigt, Pflanzenkörper, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen und Samen ein. Ein Beispiel einer Pflanzenzelle schließt einen Kallus ein. Ein Beispiel eines Pflanzenorgans schließt eine Wurzel, ein Blatt, eine Blüte und Ähnliches ein.
Der Begriff "C3-Pflanze" bezieht sich auf Pflanzen, die CO₂ in einem C3-Photosyntheseweg fixieren, einschließlich monokotyler Pflanzen wie Reis, Weizen und Gerste, ebenso wie dikotyler Pflanzen wie Sojabohnen, Kartoffeln und Süßkartoffeln.
Der Begriff "C4-Pflanzen" bezieht sich auf Pflanzen, die CO₂ im C4-Photosyntheseweg fixieren, einschließlich monokotyler Pflanzen wie Mais, Rohrzucker und Hirse, ebenso wie dikotyler Pflanzen wie Flaveria und Amaranthus.
Der Begriff "Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist", bezieht sich auf ein Enzym, das in die Photosynthese von C4-Pflanzen involviert ist. Obwohl nicht darauf beschränkt, schließen die Enzyme z. B. Carboanhydrase (CA), Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC), Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase (PPDK), Malatdehydrogenase (MDH), Malat-Enzym, Alanin-Oxalacetat-Aminotransferase, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) ein. Expressionskontrollregionen von Genen für diese Enzyme und Strukturgene für diese Enzyme können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im Zusammenhang mit der Expression eines Enzyms bezieht sich der Begriff "in einem hohen Maß", wie er hierin verwendet wird, auf die spezifische Aktivität (Aktivität pro Einheit Proteinmasse) eines Enzyms in einem Rohextrakt eines grünen Blattes der C3-Pflanze nach der Einführung eines Gens für das Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, in eine C3-Pflanze; sie ist wenigstens 7mal so hoch wie die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor dem Einführen des Gens. Die spezifische Aktivität beträgt vorzugsweise das 10fache, bevorzugter wenigstens das 40fache, noch bevorzugter wenigstens das 75fache und am bevorzugtesten wenigstens das 100fache.
Der Begriff "Expressionskontrollregion", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Region, die eine Sequenz enthält, welche die Expression eines Strukturgens kontrolliert. Obwohl nicht darauf beschränkt, schließt die Expressionskontrollregion z. B. eine Transkriptionskontrollsequenz, eine Post-Transkriptionskontrollsequenz und/oder eine Transkriptionsterminationssequenz ein. Introns entsprechen ebenfalls der Expressionskontrollregion.
Beispiele der "Transkriptionskontrollsequenz" schließen gewisse Sequenzen wie einen Promotor, einen Repressor, einen Aktivator und einen Enhancer ein. Die "Post-Transkriptionskontrollsequenz" schließt Elemente ein, die dann involviert sind, wenn ein primäres Transkript post-transkriptioneller Verarbeitung (z. B. das Anhängen von Poly-A, der Erzeugung einer Kappenstruktur, Splicing etc.) ausgesetzt wird. Die "Transkriptionsterminationssequenz" schließt Elemente ein, die in die Termination der Transkription verwickelt sind, wie ein Terminator. Diese Expressionskontrollregionen könnten getrennt stromaufwärts oder stromabwärts eines Strukturgens positioniert sein, in Abhängigkeit von dessen Eigenschaften.
Der Begriff "DNS, die eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg verwickelt ist, und die ein Strukturgen für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg verwickelt ist, enthält" bezieht sich auf eine rekombinante DNS-Sequenz, die eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen für ein Enzym, eine genomische Gensequenz, die eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen für ein Enzym enthält, auf eine genomische Gensequenz, die eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen für ein Enzym enthält, oder auf einen Expressionsvektor, der die rekombinante DNS-Sequenz oder die genomische Gensequenz enthält. Diese DNS schließt auch chemisch synthetisierte DNS ein.
Das Strukturgen schließt DNS (die Introns einschließen kann) ein, welche den Proteinteil eines Enzyms kodiert.
Der Expressionsvektor bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, in welcher die "DNS, die eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, und ein Strukturgen für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, enthält" eingeführt und gekoppelt wird, um in einer Wirtszelle operabel zu sein. Der Expressionsvektor kann eine Expressionskontrollsequenz (z. B. zahlreiche Regulatorelemente wie einen Promotor, einen Enhancer und einen Terminator) einschließen, die eine andere ist als die Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist. Die Expressions kontrollsequenz kann für das Kontrollieren einer Expression des Strukturgens verwendet werden.
(Isolierung einer Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, und eines Strukturgens für ein Enzym, das in einem C4-Photosyntheseweg involviert ist)
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine C4-Pflanze und eine C3-Pflanze, die miteinander phylogenetisch verwandt sind, verwendet. Vorzugsweise wird in dem Fall der Verwendung eines Gens einer C4-monokotylen Pflanze, das Gen in eine C3-monokotyle Pflanze eingeführt, und in dem Falle der Verwendung eines Gens einer C4-dikotylen Pflanze wird das Gen in eine C3-dikotyle Pflanze eingeführt. Bevorzugter gehören die C4-Pflanze und die C3-Pflanze derselben Familie an.
Das Strukturgen für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, kann durch ein wohl bekanntes Verfahren isoliert werden. Es wird mRNS, die ein Transkript des Strukturgens für das Enzym ist, isoliert und cDNS wird unter Verwendung der isolierten mRNS erzeugt. Genomische DNS wird unter Verwendung der cDNS gescreent, wodurch eine Expressionskontrollregion des Enzyms erhalten werden kann. Ungefähr 8 kb eines Fragmentes eines genomischen Gens, welches das PEPC-Gen von Mais enthält, wurden bereits isoliert (Eur. J. Biochem. 181: 593-598, 1989). Das genomische Genfragment schließt stromaufwärts und stromabwärts gelegene Regionen des PEPC-Strukturgens und Introns (das heißt eine Expressionskontrollregion) ein, so dass es so verwendet werden kann, wie es ist.
Ein weiteres Gen, das in den C4-Photosyntheseweg involviert ist, das genomische PPDK-Gen (Mais), wurde ebenfalls isoliert (Matsuoka et al., J. Biol. Chem. 265: 16772-16777 (1990)), welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Eine Expressionskontrollregion des genomischen PPDK-Gens hat Ähnlichkeit mit jener des genomischen PEPC-Gens und diese Expressionskontrollregion kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Weiterhin wurde auch ein genomisches Gen für das NADP-Maleinsäureenzym isoliert (Rothermel et. al., J. Biol. Chem. 264: 19587-19592 (1989)) und eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen dieses genomischen Gens können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Unter Verwendung einer Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einem C4-Photosyntheseweg involviert ist, kann ein Strukturgen für irgendein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, exprimiert werden. Das Enzym schließt Carboanhydrase (CA), Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC), Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase (PPDK), Malatdehydrogenase (MDH), Malat-Enzym, Alanin-Oxalacetat-Aminotransferase, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und Ähnliche ein.
Strukturgene der Malatdehydrogenase oder der Alanin-Oxalacetat-Aminotransferase können durch das folgende, Fachleuten wohl bekannte Verfahren isoliert werden, umfassend die folgenden Schritte: Isolieren und Aufreinigen irgendeines dieser Enzyme; Sequenzieren eines Teils einer Aminosäuresequenz des Enzyms; Zubereiten einer Sonde, basierend auf einer abgeleiteten Nucleotidsequenz der bestimmten Aminosäuresequenz; und Screenen einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Sonde. Expressionskontrollregionen dieser Enzyme können auch bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Falls das resultierende genomische Gen, das ein Enzym kodiert, eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen einschließt, kann das genomische Gen so verwendet werden, wie es ist. Die Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in den C4-Photosyntheseweg involviert ist, kann im Vergleich mit der Sequenz einer Expressionsregion eines anderen Pflanzengens bestimmt werden.
Ein rekombinantes Gen, das eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen für ein Enzym, das in den C4-Photosyntheseweg involviert ist, enthält, kann durch Fachleuten wohl bekannte Verfahren erzeugt werden. Das rekombinante Gen kann eine Vielzahl an Expressionskontrollregionen und/oder Strukturgenen haben.
Das resultierende genomische Gen für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, oder die, wie oben beschrieben erhaltene, rekombinante DNS-Sequenz können für die Transformation der C3-Pflanze, so wie es ist, oder in der Form eines Ex pressionsvektors verwendet werden. Zwei oder mehr rekombinante DNS-Sequenzen oder genomische Gene können in die C3-Pflanze eingebaut werden. Durch das Einführen von zwei oder mehr Genen, die in einen C4-Photosyntheseweg involviert sind, in eine C3-Pflanze wird erwartet werden, dass eine Photosynthesekapazität weiter erhöht wird.
(Konstruktion eines Expressionsvektors)
Es ist Fachleuten bekannt, dass ein Vektor für die Konstruktion eines Expressionsvektors in Abhängigkeit von dem Zweck der Expression und der Wirtszelle ausgewählt werden kann. Ein Startvektor kann vorzugsweise einen Promotor, einen Enhancer, eine T-DNS-Region und ein Arzneimittelresistenzgen einschließen.
Der für die Konstruktion des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor benötigt nicht notwendigerweise einen zusätzlichen Promotor für die Expression eines Strukturgens der C4-Pflanze. Dies liegt daran, dass gedacht wird, dass eine Expressionskontrollregion (z. B. Promotor) der phylogenetisch verwandten C4-Pflanze in einem Expressionskontrollsystem der C3-Pflanze funktioniert. Es kann jedoch wünschenswert sein, dass der in der vorliegenden Erfindung verwendete Expressionsvektor eine Expressionskontrollregion hat. Obwohl sie nicht darauf beschränkt sind, können Beispiele des Promotors in diesem Fall einen Promotor einschließen, dessen Expression durch einen gewissen Stress wie durch ein infektionsspezifisches Protein PR1a aus Tabak, einen CaMV-35S-Promotor und einen Promotor der Nopalinsynthase (NOS) induziert wird.
Es kann ein Enhancer für die Expression in einem hohen Maß verwendet werden. Als der Enhancer wird eine Enhancerregion, die eine Sequenz stromaufwärts des oben genannten CaMV-35S-Promotors enthält bevorzugt. Eine Vielzahl von Enhancern können verwendet werden.
Es kann auch ein Terminator verwendet werden. Obwohl nicht darauf beschränkt, schließen Beispiele des Terminators einen CaMV-35S-Terminator, einen Terminator der Nopalinsynthase (TNOS) und einen Terminator des Tabak-PR1a-Gens ein.
Es ist wünschenswert, ein Arzneimittelresistenzgen zu verwenden, welches es ermöglicht, eine transformierte Pflanze leicht zu selektieren. Das Neomycinphosphotransferase-II-(NPTII-)Gen, das Hygromycinphosphotransferase-(HPT-)Gen und Ähnliche können vorzugsweise verwendet werden. Obwohl nicht darauf beschränkt, schließen Beispiele des Promotors, der das Arzneimittelresistenzgen exprimiert, die oben genannten Pflanzengenpromotoren ein. Vorzugsweise kann der CaMV-35S-Promotor, der konstitutiv in einem hohen Maß exprimiert wird, verwendet werden. Das NPTII-Gen ist nützlich, um Transformanten oder transformierte Zellen nachzuweisen. Das HPT-Gen wird exprimiert, wenn es in ein nucleäres Genom einer Pflanze eingeführt wird, und die Pflanze wird resistent gegen Hygromycin, wodurch die Einführung des Gens in das nucleäre Genom bestätigt wird.
Als ein in der vorliegenden Erfindung verwendeter Startvektor für die Konstruktion eines Expressionsvektors können ein Vektor vom pBI-Typ, ein Vektor vom pUC-Typ oder ein Vektor vom pTRA-Typ vorzugsweise verwendet werden. Der binäre Vektor vom pBI-Typ kann bevorzugter verwendet werden. Dieser Vektor enthält ein Gen in einer Region (T-Region), die in eine Pflanze eingeführt werden soll, und das NPTII-Gen (welches eine Kanamycinresistenz bereitstellt), das unter der Kontrolle eines Pflanzenpromotors wie ein Markergen exprimiert wird. Der Vektor von pBI-Typ kann das Gen von Interesse in eine Pflanze mittels Agrobacterium einführen. Beispiele des Vektors vom pBI-Typ schließen pBI121, pBI101, pBI101.2 und pBI101.3 ein. Vorzugsweise können pBI101 und ein davon abgeleiteter Vektor verwendet werden.
Beispiele des Vektors vom pUC-Typ schließen pUC18, pUC19 und pUC9 ein.
DNS, die eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, und ein Strukturgen für ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, enthält wird in einen Vektor durch ein Fachleuten bekanntes Verfahren gekoppelt. Zum Beispiel wird in dem Falle der Verwendung des pBI-Vektors, der Vektor mit irgendeinem der geeigneten Restriktionsenzyme an einer Multiklonierungsstelle verdaut, DNS von Interesse wird in den Vektor an der Spaltstelle inseriert und der resultierende Vektor wird in einen geeigneten E.-coli-Stamm transformiert, eine Transformante wird ausgewählt und dann wird ein Expressionsvektor von Interesse wiedergewonnen.
(Einführen einer rekombinanten DNS-Sequenz oder eines Expressionsvektors in C3-Pflanzenzellen)
Obwohl nicht darauf beschränkt, schließen Beispiele der zu transformierenden C3-Pflanze Reis, Weizen, Gerste, Sojabohnen und Kartoffeln ein. Pflanzenzellen aus diesen Pflanzen können durch ein Fachleuten bekanntes Verfahren zubereitet werden.
Die rekombinante DNS-Sequenz oder der Expressionsvektor wird mittels Agrobacterium oder direkt in eine vorbereitete Pflanzenzelle eingeführt. Als das Verfahren, das Agrobacterium nutzt, kann z. B. ein Verfahren von Nagel et al. (FEMS Microbiol. Lett., 67, 325 (1990)) verwendet werden. Gemäß diesem Verfahren wird z. B. Agrobacterium als Erstes mit einem Expressionsvektor durch Elektroporation transformiert und dann wird das transformierte Agrobacterium in eine Pflanzenzelle durch ein Verfahren eingeführt, das in Plant Molecular Biology Manual (S.B. Gelvin et al., Academic Press Publishers) beschrieben ist. Als das Verfahren für das direkte Einführen eines Expressionsvektors in Zellen können ein Elektroporationsverfahren und ein Genkanonenverfahren geeignet verwendet werden.
(Regeneration transgener Pflanzenzellen in eine Pflanze oder in ein Pflanzengewebe)
C3-Pflanzenzellen, in welchen ein rekombinantes Gen oder ein Expressionsvektor eingeführt worden sind, werden einem Selektionsvorgang, basierend auf Arzneimittelresistenz wie Kanamycinresistenz, ausgesetzt. Danach können die Zellen als ein Pflanzengewebe oder als eine Pflanze durch ein gewöhnliches Verfahren regeneriert werden und Samen können von der Pflanze gewonnen werden. Die Samen selber können das Enzym exprimieren. Alternativ können die Samen ein Enzym, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, nur exprimieren, nachdem sie gekeimt haben und begonnen haben, zu wachsen.
Um die Expression eines Enzyms, das in einen C4-Photosyntheseweg involviert ist, in der transgenen C3-Pflanze zu bestätigen, kann ein Fachleuten wohl bekanntes Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann die Transformation und Expression in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren durch Southern Hybridisierung gegen DNS, die aus einem Pflanzengewebe oder einem Pflanzenblatt extrahiert worden ist, unter Verwendung einer Teilsequenz des eingeführten C4-Photosynthesegens als eine Sonde oder durch Extrahieren eines Proteins und Messen der Aktivität des extrahierten Proteins aus einem Pflanzengewebe oder Pflanzenblatt oder durch Aussetzen des extrahierten Proteins an Elektrophorese und Aussetzen eines demzufolge erhaltenen Gels an Aktivitätsfärbung bestätigt werden.
(CO₂-Kompensationspunktmessungen)
Die Photosyntheseaktivität (CO₂-Kompensationspunkt) einer transgenen Pflanze kann z. B. unter Verwendung eines ADC-Infrarotgasanalysegerätes gemessen werden, in Übereinstimmung mit der Beschreibung von Hudspeth et al., Plant Physiol. 98: 458-464 (1992). Genauer wird ein neu ausgebreitetes Blatt in einer Plexiglaskammer versiegelt. Die Temperatur in der Kammer wird auf 30 °C gehalten. Die CO₂-Konzentration wird kontinuierlich durch Zirkulieren der Luft durch die Kammer unter Beleuchtung bei einer photosynthetisch aktiven Photonenfluxdichte von 1000 μmol/m²/s gemessen. Der Kompensationspunkt wird bestimmt, wenn die CO₂-Konzentration innerhalb der Kammer ein Äquilibrium erreicht.
Hiernach wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben werden durch die beispielhafte Erläuterung eines genomischen PEPC-Maisgens als DNS, die eine Expressionskontrollregion und ein Strukturgen für ein Enzym enthält, das in einen Photosyntheseweg einer C4-Pflanze involviert ist, und Reis als eine C3-Pflanze. Man muss einsehen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist. Restriktionsenzym, Plasmid und Ähnliches, die in den Beispielen verwendet werden, sind von Takara Shuzo Co., Ltd. und Toyobo Co., Ltd. erhältlich.
Beispiel 1: Isolation eines genomischen PEPC-Maisgens
Ein genomisches PEPC-Maisgen wurde durch ein in der Literatur beschriebenes Verfahren isoliert (Eur. J. Biochem. 181: 593-598, 1989). Mais (Zea mays L. cv. Golden Cross Bantam) wurde in Vermiculit gepflanzt. Der gepflanzte Mais wurde in einer Kulturkammer in Dunkelheit bei 30 °C für 4 Tage kultiviert. Genomische DNS wurde aus den etiolierten Blättern in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Matsuoka et al., Plant Physiol. 85: 942-946 (1987) isoliert. Diese genomische DNS wurde mit XbaI verdaut und durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit 10 % bis 40 % Sucrose fraktioniert. Das gewonnene XbaI-Fragment wurde in die XbaI-Arme des Phagen λong C (Stratagene, CA) ligiert und die ligierte DNS wurde in vitro verpackt. Die genomische Bibliothek wurde unter Verwendung der verpackten DNS konstruiert. Dann wurden die Phagenplaques durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung der Sequenz 5'-GTCCACGAGAAGATCCAGGG-3', beschrieben in Matsuoka et al., Plant Cell Physiol. 30: 479-486 (1989), als eine Sonde gescreent. Der unter Verwendung dieser Sonde isolierte cDNS-Klon (pPEP3055) kann ebenfalls als eine Sonde verwendet werden. Ein positiver Klon wurde isoliert und die Nucleotidsequenz des genomischen Klons wurde durch ein Didesoxyverfahren bestimmt. Es wurden ungefähr 8 kb des XbaI-XbaI-Fragments, enthaltend das PEPC-Strukturgen in voller Länge, gewonnen. 1 zeigt eine Restriktionskarte eines DNS-Fragments, das das erhaltene PEPC enthält, und die 2 bis 4 zeigen die Nucleotidsequenz davon.
Die Sequenz von ungefähr 8 kb des XbaI-XbaI-Fragments wurde analysiert, um eine Expressionskontrollregion zu erhalten, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 2: Konstruktion eines Expressionsvektors
Es wurde der binäre Vektor pIG121-Hm (5) unter Verwendung von pBI101 (Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)), pIG221 (Ohta et al., Plant Cell Physiol. 31: 805-813 (1990)), und pLAN101MHYG (bereitgestellt von Dr. K. Shimamoto) konstruiert. Dieser Vektor enthält das NPTII-Gen, kontrolliert von dem NOS-Promotor und -Terminator, Multiklonierungsstellen, das β-GUS-Gen, erhalten aus E. coli, und das HPT-Gen mit TNOS unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors.
Dieser Vektor pIG121-Hm wurde zuerst mit HindIII und SstI verdaut und ein großes Fragment wurde wiedergewonnen. Ungefähr 8 kb eines XbaI-XbaI-Fragments des PEPC-Maisgens, oben erhalten, wurden mit dem verdauten Vektor gekoppelt, gefolgt von dem eingeführt werden in E. coli JM109. Ein kanamaycin-resistenter Stamm wurde wiedergewonnen und ein Expressionsvektor PEPCgenome/pBIH2, in welchem das PEPC-Maisgen in einer korrekten Richtung eingeführt worden war, wurde durch Restriktionsenzymanalyse als gewonnen gefunden (6).
Beispiel 3: Einführen des Expressionsvektors PEPCgenome/pBIH2 in Reis
(Transformation von Agrobacterium tumefaciens)
Agrobacterium tumefaciens EHA101 (erhalten von Dr. Nester der University of Washington) wurde bei 28 °C in einem Kulturmedium, das 50 μg/ml Kanamycin und 100 μg/ml Hygromycin enthielt, kultiviert. Eine Zellsuspensionskultur wurde zubereitet, der Expressionsvektor PEPCgenome/pBIH2 wurde in das oben genannte Bakterium durch Elektroporation eingeführt und hygromycin-resistente Stämme wurden in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Nagel et al. (FEMS Microbiol. Lett., 67, 325 (1990)) selektiert.
(Transformation von Reiszellen und Regeneration von Reis)
Agrobacterium, das mit einem Expressionsvektor PEPCgenome/pBIH2 transformiert worden war, wurde erhalten. Kolonien wurden auf einem AB-Agarmedium (Chilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 3672-3676 (1974)) gebildet. Die resultierenden Kolonien wurden mit AAM-Medium (Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)) verdünnt und mit einem Reiskallus (Oryza sativa) für 3 Tage co-kultiviert. Danach wurde das Bakterium von einem Kulturmedium, das 50 μg/ml Hygromycin enthielt, entfernt. Die Kolonien wurden auf einem Hygromycin-Selektionskulturmedium alle 2 Wochen subkultiviert. Die transgenen Reiszellen wurden selektiert und durch ein gewöhnliches Verfahren regeneriert. Als ein Ergebnis wurden 38 unabhängige transgene Reisindividuen erhalten.
Beispiel 4: Detektion der Expression des PEPC-Gens in transgenem Reis
Das Expressionsmaß von PEPC in 38 demzufolge erhaltenen transgenen Reisindividuen, nicht-transgenem Reis und Mais wurde wie folgt untersucht. Die PEPC-Aktivität wurde durch ein Verfahren gemessen, das beschrieben wurde in Edwards et al., Aust. J. Plant Physiol. 15: 385-395 (1988). Das PEPC-Enzym wurde in Übereinstimmung mit der Beschreibung von Hudspeth et al., Plant Physiol. 98: 458-464 (1992), zubereitet. Genauer wurden ungefähr 0,5 g grüne Blätter geerntet, schnell mit flüssigem Stickstoff gefroren und zu feinem Puder vermahlen. Ein 10-faches Volumen an Extraktionspuffer wurde zu den Pudern hinzugefügt und die Puder wurden weiter gemahlen. Der Extraktionspuffer enthielt 50 mM Hepes-KOH (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 % (w/v) unlösliches PVP, 12,5 % (v/v) Glycerol, 10 μM Leupeptin und 1 mM PMSF. Der Rohextrakt wurde mit Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) filtriert. Das Filtrat wurde bei 4 °C und 15.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde mit Sephadex (RTM) G-25, das mit einem PVP-freien Extraktionspuffer vor-äquilibriert worden war, entsalzt. Das Eluat wurde vereinigt und die Enzymaktivität und die Proteinmasse wurden gemessen.
7 zeigt Ergebnisse. In 7 steht WT für einen Wildtyp-Reis, das heißt nicht-transgenen Reis, und Corn steht für Mais. Die PEPC-Aktivität wurde relativ dargestellt, wobei die spezifische Aktivität von PEPC in dem Rohextrakt aus den grünen Blättern des nicht-transgenen Reises 1 ist. Mais zeigt eine PEPC-Aktivität, die ungefähr 40-mal so hoch war wie jene des nicht-transgenen Reises. 4 von 38 transgenen Reispflanzen zeigten eine PEPC-Aktivität, die höher war als jene von Mais. Transgene Reispflanzen mit einer PEPC-Aktivität, die ungefähr 115-mal so hoch war wie jene des nicht-transgenen Reises, konnten durch Transformation erhalten werden (die transgenen Reispflanzen hatten eine PEPC-Aktivität, die ungefähr 3-mal so hoch war wie jene von Mais). Es ist überraschend, dass die C3-Poaceen-Pflanze mit einem darin eingeführten genomischen Gen der C4-Pflanze eine PEPC-Aktivität zeigt, die höher war als jene der C4-Pflanze.
Beispiel 5: CO₂-Kompensationspunktmessungen
Der photosynthetische CO₂-Kompensationspunkt wurde unter Verwendung des nicht-transgenen Reises und des transgenen Reises mit einer PEPC-Aktivität, die ungefähr 75-mal und ungefähr 7-mal höher war als jene des nicht-transgenen Reises, erhalten in Beispiel 4, gemessen. Tabelle 2 zeigt Ergebnisse.
Tabelle 2
Der transgene Reis mit einer PEPC-Aktivität, die ungefähr 75-mal so hoch war wie jene des nicht-transgenen Reises, hatte ihren CO₂-Kompensationspunkt um ungefähr 10 % erniedrigt. Die weitere Verbesserung photosynthetischer Kapazität wird erwartet.

Claims

C3-Pflanze, welche die Gene einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für das Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist.
C3-Pflanze nach Anspruch 1, worin die C3-Pflanze das strukturelle Gen auf einem höheren Level als der Expression des strukturellen Genes in der C4-Pflanze exprimiert.
C3-Pflanze nach Anspruch 1, worin die C3-Pflanze das strukturelle Gen für das Enzym exprimiert, um ein Enzymaktivitätsniveau zu ergeben, das mindestens sieben mal höher als die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens ist.
C3-Pflanze nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und die C3-Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
C3-Pflanze nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und die C3-Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
C3-Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die DNA ein genomisches Gen der C4-Pflanze ist.
C3-Pflanze nach Anspruch 6, worin das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und die C3-Pflanze eine C3-poaceae Pflanze ist.
C3-Pflanze nach Anspruch 7, worin das genomische Gen der C4-poaceaen Pflanze ein genomisches Gen für Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceae Pflanze Reis ist.
Verfahren für das Herstellen einer C3-Pflanze, die ein Gen einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend die Schritte: Transformieren von Zellen der C3-Pflanze mit DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrolkegion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für besagtes Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist; und Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zur C3-Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die C3-Pflanze das strukturelle Gen auf einem höheren Level als bei der Expression des strukturellen Gens in der C4-Pflanze exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die C3-Pflanze das strukturelle Gen für das Enzym exprimiert, um ein Enzymaktivitätsniveau zu ergeben, das mindestens sieben mal höher als die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens ist.
Verfahren zum Herstellen einer C3-Pflanze nach den Ansprüchen 9 bis 11, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und die C3-Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen einer C3-Pflanze nach den Ansprüchen 9 bis 11, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und die C3-Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen einer C3-Pflanze nach einem der Ansprüche 9 bis 13, worin die DNA ein genomisches Gen der C4-Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen einer C3-Pflanze nach Anspruch 14, worin das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und die C3-Pflanze eine C3-poaceae Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen einer C3-Pflanze nach Anspruch 15, worin das genomische Gen der C4-poaceaen Pflanze ein genomisches Gen für Phosphoenolpyurvat Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceaene Pflanze Reis ist.
C3-Pflanze, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 9.
Teil einer Pflanze nach Anspruch 17, worin der Teil der Pflanze ein Gemüse ist.
Teil einer Pflanze nach Anspruch 17, worin der Teil eine Frucht ist.
Teil einer Pflanze nach Anspruch 17, worin der Teil eine Blüte ist.
Teil einer Pflanze nach Anspruch 17, worin der Teil ein Same ist und worin der Same ein Gen der C4-Pflanze exprimiert.
C3-Pflanzengewebe, das ein Gen einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für das Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist.
C3-Pflanzengewebe nach Anspruch 22, worin das C3-Pflanzengewebe das strukturelle Gen auf einem höheren Level als bei der Expression des strukturellen Gens in der C4-Pflanze exprimiert.
C3-Pflanzengewebe nach Anspruch 22, worin das C3-Pflanzengewebe das strukturelle Gen für ein Enzym exprimiert, um ein Niveau an Enzymaktivität zu ergeben, das mindestens sieben mal höher als die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens ist.
C3-Pflanzengewebe nach den Ansprüchen 22 bis 24, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und das C3-Pflanzengewebe ein Gewebe einer monokotylen Pflanze ist.
C3-Pflanzengewebe nach den Ansprüchen 22 bis 24, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze ist und das C3-Pflanzengewebe ein Gewebe einer dikotylen Pflanze ist.
C3-Pflanzengewebe nach den Ansprüchen 22 bis 26, worin die DNA ein genomisches Gen einer C4-Pflanze ist.
C3-Pflanzengewebe nach Anspruch 27, worin das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und das C3-Pflanzengewebe das Gewebe einer C3-poaceaen Pflanze ist.
C3-Pflanzengewebe nach Anspruch 28, worin das genomische Gen der C4-poaceaen Pflanze ein genomisches Gen für Phosphoenolpyruvat Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceaene Pflanze Reis ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes, das ein Gen einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend die Schritte von: Transformieren von Zellen einer C3-Pflanze mit DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für besagtes Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist; und Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zum C3-Pflanzengewebe.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach Anspruch 30, worin das C3-Pflanzengewebe das strukturelle Gen auf einem höheren Level als die Expression des strukturellen Gens in der C4-Pflanze exprimiert.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach Anspruch 30, worin das C3-Pflanzengewebe das strukturelle Gen für das Enzym exprimiert, um ein Niveau der Enzymaktivität zu ergeben, das mindestens sieben mal höher als die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach den Ansprüchen 30 und 32, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze und das C3-Pflanzengewebe ein Gewebe einer monokotylen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach den Ansprüchen 30 und 32, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze und das C3-Pflanzengewebe das Gewebe eine dikotylen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach den Ansprüchen 30 bis 34, worin die DNA ein genomisches Gen einer C4-Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach Anspruch 35, worin das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und das C3-Pflanzengewebe das Gewebe einer C3-poaceaen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzengewebes nach Anspruch 36, worin das genomische Gen der C4-poaceaen Pflanze das genomische Gen für die Phosphoenolpyruvat Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceaen Pflanze Reis ist.
C3-Pflanzensamen, der das Gen einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für besagtes Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist, worin der C3-Pflanzensamen mindestens beim Keimen und Wachsen das durch das strukturelle Gen kodierte Enzym auf einem hohen Niveau exprimiert.
C3-Pflanzensamen nach Anspruch 38, worin der C3-Pflanzensamen das strukturelle Gen auf einem höheren Level als die Expression des strukturellen Gens in der C4-Pflanze exprimiert.
C3-Pflanzensamen nach Anspruch 38, worin der C3-Pflanzensamen das strukturelle Gen für das Enzym exprimiert, um ein mindestens sieben mal höheres Enzymaktivitätsniveau zu ergeben als bei der spezifischen Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens.
C3-Pflanzensamen nach den Ansprüchen 38 bis 40, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer monokotylen Pflanze ist.
C3-Pflanzensamen nach einem der Ansprüche 38 bis 40, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer dikotylen Pflanze ist.
C3-Pflanzensamen nach einem der Ansprüche 38 bis 42, worin die DNA, enthaltend die Expressionskontrollregion eines Gens für das Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze und das strukturelle Gen für das Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, ein genomisches Gen der C4-Pflanze ist.
C3-Pflanzensamen nach Anspruch 43, worin das genomische Gen der C4-Pflanze das genomische Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer C3-poaceaen Pflanze ist.
C3-Pflanzensamen nach Anspruch 44, worin das genomische Gen der C4-poaceaen Pflanze das genomische Gen für die Phosphoenolpyruvat Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceaen Pflanze Reis ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens, der ein Gen einer C4-Pflanze derselben Familie exprimiert, umfassend die Schritte von: Transformieren der Zellen der C3-Pflanze mit DNA, enthaltend (a) eine Expressionskontrollregion eines Gens für ein Enzym in einem C4-Photosyntheseweg einer C4-Pflanze derselben Familie und (b) ein strukturelles Gen für besagtes Enzym in dem C4-Photosyntheseweg der C4-Pflanze, worin das strukturelle Gen ein genomisches Gen ist; Regenerieren der transformierten Zellen der C3-Pflanze zur C3-Pflanze; und Erhalten eines Samens aus der C3-Pflanze; worin der C3-Pflanzensamen mindestens beim Keimen und Wachsen das durch das strukturelle Gen kodierte Enzym auf einem hohen Niveau kodierte Enzym.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach Anspruch 46, worin der C3-Pflanzensamen das strukturelle Gen auf einem höheren Niveau exprimiert als bei der Expression des strukturellen Gens in der C4-Pflanze.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach Anspruch 46, worin der C3-Pflanzensamen das strukturelle Gen für das Enzym exprimiert, um ein Niveau der Enzymaktivität zu ergeben, das mindestens sieben mal höher als die spezifische Aktivität des Enzyms in der C3-Pflanze vor der Einführung des strukturellen Gens ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach den Ansprüchen 46 bis 48, worin die C4-Pflanze eine monokotyle Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer monokotylen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach den Ansprüchen 46 bis 48, worin die C4-Pflanze eine dikotyle Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer dikotylen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach einem der Ansprüche 46 bis 50, worin die DNA ein genomisches Gen der C4-Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach Anspruch 51, worin das genomische Gen der C4-Pflanze das genomische Gen einer C4-poaceaen Pflanze ist und der C3-Pflanzensamen der Same einer C3-poaceaen Pflanze ist.
Verfahren zum Herstellen eines C3-Pflanzensamens nach Anspruch 52, worin das genomische Gen der C4-Pflanze ein genomisches Gen für Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais ist und die C3-poaceaen Pflanze Reis ist.