DE69805627T2

DE69805627T2 - Verbesserte stämme für die protein-expression

Info

Publication number: DE69805627T2
Application number: DE69805627T
Authority: DE
Inventors: Darrell Sleep
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2018-06-27
Also published as: EP1002095B1; CA2295190A1; GB9713412D0; GB2343184B; KR100490190B1; DK1002095T3; AU8123098A; WO1999000504A1; JP2002512529A; GB2343184A; ATE218161T1; US6379924B1; EP1002095A1; CA2295190C; GB9930019D0; PT1002095E; JP4282771B2; DE69805627D1; AU736404B2; KR20010020482A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich primär auf die Entwicklung von Pilzstämmen, die Proteine auf einem Niveau expressivieren, das wesentlich höher ist als dasjenige des Ausgangsstamms.

Hintergrund und Stand der Technik

Seit etwa 20 Jahren werden gewünschte Fremdproteine in Mikroorganismen erzeugt. Wenn die notwendige codierende Sequenz eingeführt und die Expression erreicht worden ist, bleibt jedoch viel zu tun, um den Prozess für die kommerzielle Produktion zu optimieren. Ein Gebiet von Interesse betrifft die Stammverbesserung, d. h. das Herausfinden oder Herstellen von Stämmen des Wirtsorganismus, die es beispielsweise ermöglichen, das Protein mit höherer Ausbeute oder besserer Reinheit herzustellen.
Um die Ausbeute zu erhöhen, könnte man, nachdem ein gutes Expressionssystem (beispielsweise ein Transkriptionspromotor) konzipiert wurde, sich vorstellen, zu versuchen, die Kopieanzahl der codierenden Sequenz zu erhöhen (obwohl dies nur dann den gewünschten Effekt haben wird, falls die DNA-Transkription der limitierende Faktor war) oder die Stabilität der mRNA zu erhöhen oder den Abbau des Proteins herabzusetzen. So sind als Beispiel für den letzten Ansatz Hefestämme (beispielsweise pep4-3), denen es an bestimmten Proteasen mangelt, zur Herstellung von gewünschten Fremdproteinen verwendet worden. In einem anderen Ansatz ist die Anzahl der 2 um-basierten Plasmide in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch Einführen eines FLP-Gens in das Genom unter der Steuerung eines regulierten Promotors, beispielsweise GAL, erhöht worden. Beim Umstellen auf ein Wachstumsmedium, das Galaktose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, steigt die Plasmidkopieanzahl (11), aber der Anstieg der Plasmidkopieanzahl ist unkontrolliert, da der GAL-Promotor durch REP1/REP2 nicht unterdrückt wird. Dies führt zu einer reduzierten Wachstumsrate und deswegen zu einer klonalen Selektion von cirº- Derivaten des ursprünglichen cir&spplus;-Stamms (11, 20).
Wir haben Hefestämme durch Anwendung von mutagenen Substanzen mutiert, um Mutanten zufällig zu erzeugen und dadurch hoffentlich Mutantenstämme zu finden, die heterologe Proteine in besserer Ausbeute erzeugen (16, 21). Wir haben jetzt solch einen zufällig erzeugten Mutanten charakterisiert, der eine höhere Anzahl von Kopien des Plasmids, das das gewünschte Protein expressiviert, beibehält, und herausgefunden, dass die Mutation in einem der Gene auftrat, die Ubiquitin-konjugierende Enzyme codieren, nämlich in UBC4. Das UBC4-codierte Enzym (und das nahe verwandte UBC5-codierte Enzym) ist an dem Abbau anomaler und kurzlebiger Proteine beteiligt, und es gab keinen Grund sich vorzustellen, dass es die Beseitigung von einem von ihnen ermöglicht haben würde, eine erhöhte Ausbeute an normalem, gewünschten Protein zu erhalten.
Verschiedene Gene, die Ubiquitin-konjugierende Enzyme codieren (UBC), sind in den Abbau von Großproteinen verwickelt und in die Stressantwort von Hefe. UBC1, UBC4 und UBC5 wirken zusammen, um wichtige Funktionen für das Zellwachstum und die Zellentwicklung zu vermitteln (2, 3). Hefestämme mit einer Mutation in einem einzigen Gen sind entwicklungsfähig und haben ähnliche Wachstumsraten wie die Ausgangsstämme, ubc4/ubc5-Doppelmutanten haben aber nur reduzierte Wachstumsraten und sind empfindlich gegenüber Aminosäurenanalogen, während ein Dreifachmutant nicht entwicklungsfähig ist, was anzeigt, dass sich ihre Aktivitäten überlappen. Die UBC4- und UBC5-Gene sind eng verwandt, und die zwei kodierenden DNA-Sequenzen teilen 77% identische Reste, während die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der zwei Proteine 92 % identische Reste zeigen (3). Wegen dieser Nahezuidentität der Ubc4- und Ubc5-Proteine (im Folgenden als Ubc4p und Ubc5p abgekürzt) ist gemutmaßt worden, dass UBC4 den Verlust an Funktion des ubc5-Mutanten und umgekehrt ausgleichen könnte (3). Dies würde erklären, warum die dramatische Reduktion in der Wachstumsrate nur bei ubc4/ubc5- Doppelmutanten beobachtet wurde. Pulsverfolgungsexperimente haben angezeigt, dass Ubc4p und Ubc5p für den Abbau von kurzlebigen und abnormalen Proteinen verantwortlich sind, dass aber der Umsatz dieser Proteine nur in Stämmen mit der ubc4/ubc5- Doppelmutation reduziert war. In Stämmen mit einfacher ubc4- oder ubc5-Mutation war er nicht reduziert (3). Diese Literaturquelle schließt daraus, dass die Verwendung von Pilzstämmen mit einfacher ubc4- und ubc5-Mutation nicht vorteilhaft wäre.
Strukturell betrachtet, codieren alle bekannten UBC-Gene eine konservierte Domain (bekannt als die UBC-Domain) von ungefähr 16 kDa, welche das konservieirte konjugierende Cystein (1, 22) enthält. Die Übertragung des aktivierten Ubiquitins resultiert in eine kovalente Anbindung des C-Endbereichs des Ubiquitins über eine Thioester-Bindung an den Cysteinrest. UBC-Gene sind in verschiedene Klassen aufgeteilt worden (Übersicht in 22).
UBC-Gene der Klasse I bestehen nahezu ausschließlich aus der konservierten UBC- Domain; UBC-Gene der Klassen 11 und III weisen Erweiterungen des C-Endbereichs bzw. des N-Endbereichs auf; während UBC-Gene der Klasse IV sowohl Erweiterungen des C- Endbereichs als auch des N-Endbereichs aufweisen (22).
Das Pilzgenom setzt sich aus Chromosomen, extrachromosomalen Kopien von chromosomalen Genen, beispielsweise Nukleosomen, und gelegentlich stabilen extrachromosomalen Elementen zusammen. Diese extrachromosomalen Elemente haben eine gutartige parasitäre Relativbeziehung zu ihrem Wirt entwickelt, wobei sie erfolgreich den Diebstahl von zellulären Resourcen für die Replikation und die Segregation des Elements ausbalancieren und gleichzeitig nicht die Gesundheit des Wirts beeinträchtigen. Allgemeine Übersichten über extrachromosomale Elemente von Pilzen werden durch die Literaturquellen 5 und 6 abgedeckt, während die DNA- Plasmide der Saccharomyces-Hefespezies durch die Literaturquellen 7 und 8 und der Kluyveromyces-Spezies durch die Literaturquelle 9 abgedeckt werden.
Die 2 um Plasmide der Saccharomyces-Spezies sind extrachromosomale DNA- Spezies, die einen Mechanismus entwickelt haben, um ihr langfristiges autonomes Überleben ohne irgendeinen zugeordneten Phenotyp zu ermöglichen. Das 2 um Plasmid befindet sich im Kern und ist in Chromatin verpackt. Der Plasmidursprung der Replikation wirkt als eine sich autonom replizierende Sequenz, während andere Sequenzen die. Aufrechterhaltung einer kontrollierten hohen Kopieanzahl sicherstellen und es dem Plasmid erlauben, sich bei der Mitose gleichmäßig auf die Tochterzellen zu verteilen. Das Plasmid ist für das normale Mitosewachstum nicht erforderlich, und es ergibt keinen Selektionsvorteil für den Wirt, da Saccharomyces- Spezies ohne das 2 um Plasmid, die als cirº bezeichnet werden, nur wenig schneller wachsen als ihre das 2 um Plasmid enthaltenden bzw. cir&spplus;-Ausgangsspezies.
Das 2 um Plasmid ist ein Doppelstrangringplasmid von ungefähr 6.318 bp, das zwei eigenständige Regionen von 2.774 und 2.346 bp aufweist, welche durch ein Paar von exakt invertierten Wiederholungen, jede 599 bp lang, getrennt sind (10). In vivo existiert das monomere Plasmid als eine Mischung von gleichen Teilen der Inversionsisomere (A und B), die sich nach der platzspezifischen Rekombination zwischen den zwei invertierten Wiederholungen ausbilden. Das 2 um Plasmid hat vier offene Leserahmen, die als FLP (auch als A bekannt), REP1 (auch als B bekannt), REP2 (auch als C bekannt) und RAF (auch als D bekannt) bekannt sind. Das Plasmid enthält auch eine Region; welche zwischen RAF und dem Ursprung der Replikation angeordnet ist, welche ST8 oder REP3 bezeichnet wird und die aus einer Reihe von nicht perfekten 62 bp Wiederholungselementen zusammengesetzt ist. Dieses Element ist bei cis zusammen mit den trans-agierenden Elementen, REP1 und REP2, erforderlich, um eine effiziente Aufteilung des Plasmids zwischen der Mutterzelle und der Tochterzelle zu ermöglichen.
Die Kopieanzahl der 2 um Plasmids steht außerdem indirekt unter der Kontrolle der chromosomalen Gene, da es bekannt ist, dass die Kopieanzahl des 2 um Plasmids über unterschiedliche Saccharomyces cerevisiae-Stämme variiert, und weil die chromosomale rezessive Mutation, bekannt als nib1, in eine klonale Sterblichkeit aufgrund einer unkontrollierten Verstärkung der Kopieanzahl des 2 um Plasmids resultiert (39). Hefestämme, die die nib1-Mutation tragen, gleichen konstruierten Hefestämmen, bei denen die Expression des FLP-Gens Galaktose-induziert ist. Die Verwicklung des Proteins des ATP-abhängigen Ubiquitinproteinabbauwegs bei Pilzen in die Regulierung der Kopieanzahfdes Pilzplasmids ist im Stand der Technik nicht beschrieben. Noch ist beschrieben, dass Gene des ATP-abhängigen Ubiquitinproteinabbauwegs bei Pilzen manipuliert werden können, um die Kopieanzahl des Pilzplasmids zu manipulieren.
Obwohl das 2 um Plasmid eine ganz allgemeine genetische Komponente von Saccharomyces cerevisiae ist, ist von anderen Hefestämmen bekannt, dass sie identifizierbare DNA-Plasmide enthalten, nämlich die pSR1- und pSR3-Plasmide (6.251 bp und 6.615 bp) von Zygosaccharomyces rouxii, die pSB1- und pSB2- Plasmide (6.550 bp und 5.415 bp) von Zygosaccharomyces bailii, das pSM1-Plasmid (5.416) von Zygosaccharomyces fermentati und das pKD1-Plasmid (4,757 bp) von Kluyveromyces drosophilarum (9). Das erstaunlichste Merkmal all dieser Plasmide ist ihre Ähnlichkeit zu dem 2 um Plasmid von Saccharomyces cerevisiae. Jedes Plasmid ist eine ringförmige Doppelstrang-DNA und besteht aus zwei ungefähr gleich großen Hälften, die durch invertierte Wiederholungssequenzen getrennt sind. Jedes Plasmid enthält eine einzige autonome Replikationssequenz (ARS) nahe einer der invertierten Wiederholungssequenzen und drei oder vier offene Leserahmen, von denen einer eine Rekombinase codiert, welche die Rekombination zwischen den invertierten Wiederholungen katalysiert.
Von einem Saccharomyces cerevisiae-Plasmid wird angenommen, dass es "2 um- basiert" ist, falls es mindestens eines der 2 um Plasmidelemente (ARS, invetierte Wiederholungssequenzen oder 2 um offene Leserahmen) enthält, insbesondere dis ARS.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Erzeugen eines Pilzzellen-abgeleiteten Produkts mit den Schritten bereit: (i) Bereitstellen einer Pilzzelle mit einem Plasmid, wobei das Plasmid eine funktionale, codierende Sequenz für ein Protein aufweist und wobei die Pilzzelle ein modifiziertes Niveau an Ubc4p oder Ubc5p (im Folgenden allgemein als Ubcp-Aktivität bezeichnet) aufweist, und (ii) Kultivieren der Zelle, um das Pilzzellen-abgeleitete Produkt zu erzeugen.
Vorzugsweise ist das Pilzzellen-abgeleitete Produkt ein gewünschtes Protein, das durch die codierende Sequenz codiert ist, und das modifizierte Niveau an Ubcp- Aktivität ist vorzugsweise kleiner als für die Zelle normal. Dies kann durch Ermitteln der Umsatzrate an abnormalem Protein in vivo getestet werden (3). Das Niveau an Ubcp- (Ubc4p und/oder Ubc5p)-Aktivität kann auf höchstens 50%, 40%, 30%, 20%, 10% oder 1% des Wildtypniveaus reduziert werden. Vorzugsweise hat die Zelle eine minimale Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität. Die Zelle sollte jedoch nicht ein niedriges Niveau sowohl von Ubc4p und Ubc5p haben, da ihre Wachstumsrate dann im Allgemeinen kleiner als sinnvoll sein wird.
Die Reduktion von Ubcp-Aktivität kann auf mehreren verschiedenen Wegen erreicht werden. Zuerst einmal kann die Zelle eine Verbindung erzeugen, die die Bindung des UBC-codierten Produkts an seinen Rezeptor stört. So kann ein Konstrukt in der Zelle bereitgestellt werden, um ein Polypeptid zu expressivieren, das mit der Bindung von Ubc4p oder Ubc5p an sein Target konkurriert. Dies wird eine Reduktion in der effektiven Ubc4p- oder Ube5p-Aktivität erleichtern. Dies kann durch Über- Expressivieren der oben beschriebenen UBC-Domain, die durch UBC4 oder UBC5 codiert ist, erfolgen. Es wird wichtig sein, sicherzustellen, dass die überexpressivierte UBC-Domain, die durch UBC4 oder UBC5 codiert ist, nicht ihrerseits irgendeine intrinsische Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist, da diese tatsächlich zu der gesamten Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität beitragen kann. Dies kann durch platzgerichtete Mutagenierung, durch Entfernen oder Ersetzen des Cysteins, welches als der Akzeptorplatz für das Ubiquitin innerhalb der UBC-Domain von UBC4 (oder 5) dient, (z. B. durch ein Alanin) oder anderer konservierter Aminosäuren innerhalb der UBC-Domain erreicht werden. Die Über-Expression der inaktiven UBC-Domain von UBC4 (oder 5) kann durch ihren eigenen endogenen Promotor erreicht werden oder durch jeden anderen geeigneten Promotor. Das Konstrukt kann in das Chromosom oder episomal integriert werden.
Alternativ kann, um ein reduziertes Niveau an Ubcp-Aktivität zu erreichen, das endogene UBC-Gen so modifiziert werden, dass dieses im Wesentlichen kein Protein produziert oder dass jegliches davon produziertes Protein ein reduziertes Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist. So kann beispielsweise das UBC-Gen ausgelöscht werden (entweder in einer regulatorischen Region oder in der codierenden Region oder beiden), so dass kein Polypeptid produziert wird oder dass ein mutiertes (defektes) Polypeptidprodukt produziert wird. (In "regulatorische Region" schließen wir Teile des Genoms ein, die indirekt auf das UBC-Gen einwirken, beispielsweise ein Gen, das einen UBC-Genaktivator produziert.) Die Auslöschung von allen oder einem Teil der offenen UBC-Leserahmen (14) ist bevorzugt, weil dies die Ubcp-Aktivität reduzieren oder beseitigen wird und einen nicht zurückkehrenden mutierten Pilzstamm erzeugt. Alternativ kann die Aktivität durch klassische Mutagenierungsverfahren reduziert oder beseitigt werden, wobei die DNA-Sequenz des UBC-Gens in solcher Weise mutiert wird, dass Punktmutationen oder -auslöschungen erzeugt werden, welche die normale Aminosäurenfrequenz des Ubcp modifizieren und/oder unterbrechen. Falls ein mutiertes Ubcp-Polypeptid erzeugt wird, kann es instabil sein (d. h. einem erhöhten Proteinumsatz bezogen auf das native Protein unterworfen sein) oder unfähig sein, Ubiquitin zu konjugieren, oder unfähig sein, gebundenes Ubiquitin an sein Substrat zu liefern.
Zum Beispiel kann das UBC-Gen so modifiziert werden, dass das Ubiquitinakzeptierende Cystein bei jedem davon erzeugten Protein abwesend oder von reduzierter Ubiquitin-akzeptierender Aktivität ist, beispielsweise durch Veränderungen bei den Aminosäureresten, die das Cystein umgeben oder anderweitig mit ihm wechselwirken, wie oben im Kontext mit der Erzeugung von konkurrierendem (aber inaktivem) Polypeptid angemerkt wurde. Alternativ kann das UBC-Gen so modifiziert werden, dass die Kapazität von jeglichem davon produzierten mutierten Protein unfähig ist, mit dem E1-Ubiquitindonator (Produkt der UBA9 oder UBA2-Gene) zu wechselwirken oder hierfür eine reduzierte Affinität aufweist. Alternativ kann das UBC-Gen so modifiziert werden, dass die Kapazität jedes davon erzeugten mutierten Proteins, mit dem letztendlichen Ubiquitinakzeptor und/oder dem Ubiquitinligase (E3)-Enzym wechselzuwirken, fehlt oder reduziert ist. Speziell sind Mutationen (Weglassungen, Einsetzungen oder Substitutionen) innerhalb der ersten 21 Aminosäuren der primären Sequenz und der ersten α-Helix (Reste 3-13) von Ubc4p und Ubc5p (29) bevorzugt, weil die letzteren in die Bindung von Ube2p, einem verwandten Protein, an die Ubiquitinproteinligase Ubrlp verwickelt sind (33). Besonders bevorzugt sind Mutationen, die die Glutaminsäure an Position 10 (Glu-10) innerhalb der Primärsequenz von Ubc4p und Ubc5p betreffen, insbesondere eine Ersetzung durch Lysin (Glu10Lys) oder Arginin (Glu10Arg).
Alternativ kann ein unterschiedlicher Promotor verwendet werden, um die Expression des UBC-Gens zu steuern, ein solcher Promotor kann regulierbar sein. Zum Beispiel kann er induzierbar sein, wie es die Promotoren des Gafaktoseverwendungswegs sind, oder es kann durch Entfernung eines Inhibitors seine Unterdrückung aufgehoben werden, wie es bei den Promotoren der sauren Phospatasegruppe möglich ist.
Platzgerichtete Mutagenierung oder andere bekannte Techniken können verwendet werden, um einzelne oder mehrfache Mutationen, wie Ersetzungen, Einsetzungen, Auslassungen und Transpositionen zu erzeugen, wie in der Literaturquelle 23 beschrieben ist. Geeignete Mutationen umfassen Kettenendbereichsmutationen (eindeutige Stopcodons, welche nahe dem 3'-Ende eingeführt werden, mögen einen unzureichenden Effekt auf das Genprodukt haben, um nützlich zu sein; der Fachmann wird leicht in der Lage sein, um eine Mutation beispielsweise in den 5' drei Vierteln der codierenden Sequenz zu erzeugen), Punktmutationen, die den Leserahmen ändern, kleine bis große Auslöschungen der codierenden Sequenz, Mutationen bei dem Promotor oder Terminator, die die Expression beeinflussen, und Mutationen, die die mRNA destabilisieren. Spezifische Mutationen können durch eine Ausweitung der Genunterbrechungstechnik eingeführt werden, welche als Gentransplacement bekannt ist (24).
Im Allgemeinen verwendet man einen selektierbaren Marker, um eine Gensequenz zu unterbrechen, doch ist dies nicht notwendigerweise der Fall, insbesondere wenn man das Unterbrechungsereignis phenotypisch erkennen kann. In vielen Fällen der Einsetzung der eingreifenden Sequenz wird es so sein, dass ein Stopcodon in dem Rahmen mit der UBC-Sequenz vorliegt und die eingesetzte codierende Sequenz nicht umgesetzt wird. Alternativ kann die eingesetzte Sequenz in einem anderen Leserahmen als UBC vorliegen.
Ein dritter prinzipieller Weg, eine Reduktion der Ubcp-Aktivität zu erreichen, liegt für die Zelle darin, UBC-antisense-mRNA zu produzieren. Dies kann durch Einfügen eines Expressionskonstrukts für eine geeignete Sequenz in die Zelle auf konventionellen Wegen erreicht werden. UBC-antisense-mRNA kann aus einem konstitutiven oder regulierten Promotorsystem (beispielsweise Promotoren des galaktosekatabolitischen Wegs) erzeugt werden, wodurch eine Reduktion von umsetzbarer UBC-mRNA erleichtert wird. Die Verwendung von regulierter UBCantisense-mRNA erlaubt auch die Kontrolle des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbauwegs durch Hinzufügung oder Entfernung des Aktivators.
Pilzzellen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, umfassen die Gattungen Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomices, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula (jetzt neu klassifiziert als Pichia), Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Aspergillus, Metschunikowia, Rhodoporidum, Leucosporidum, Botryoascus, Endomycopis, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora und dergleichen. Bevorzugte Gattungen sind Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces und Kluyveromyces. Beispiele für Saccharomyces-Spezies sind Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces itallcus, Saccharomyces diastaticus und Zygosaccharomyces rouxii Beispiele für Kluyveromyces-Spezies sind Kluyveromyces fragilis und Kluyveromyces lactis. Beispiele für Hansenula-Spezies sind Hansenula polymorpha (jetzt Pichle angusta), Hansenula anomala (jetzt Pichle anomala) und Pichia capsulata. Ein Beispiel für eine Pichia Spezies ist Pichle pastoris. Beispiele für Aspergillus-Spezies sind Aspergillus niger und Aspergillus nidulans. Yarrowia lipolytica ist ein Beispiel für eine geeignete Yarrowia-Spezies.
Bevorzugt sind Hefestämme, und von diesen ist Saccharomyces cerevisiae der besonders bevorzugte Wirt. Die verwendeten Hefestämme können jeder haploide oder diploide Stamm von Saccharomyces cerevisiae sein, aber im Fall eines diploiden Stamms ist es bevorzugt, dass die Aktivität des Ubcp-Enzyms von beiden Kopien des UBC-Gens reduziert oder beseitigt ist.
Von einer Anzahl von Spezies ist gezeigt worden, dass sie Homologe von Saccharomyces cerevisiae-UBC4- und UBC5-Genen aufweisen. UBC4- und UBC5- Homologe sind beschrieben worden in Homo sapiens (34), Drosophila melanogaster (35), Caenorhabdifis elegans (36), Arabidopsis thaliana (37), Schizosaccharomyces pompe und Candida albicans (38). Von den Drosophila melanogaster und Caenorhabdifis elegans-Homologen, UbcD1 bzw. ubc-2, ist auch gezeigt worden, dass sie Ubcp-Aktivität aufweisen. Es kann gesehen werden, dass ein Homolog nicht UBC4 oder UBC5 bezeichnet werden muss; in gleicher Weise muss ein Gen, welches UBC4 oder UBC5 bezeichnet wird, kein Homolog sein.
Von dem bekannten UBC4/UBC5-Homologen in der Literatur kann die Ähnlichkeit der verschiedenen Proteine durch aufeinander Ausrichten der primären Aminosäuresequenzen berechnet werden. Ein geeignetes Programm ist das Megalign Program, Lasergene, DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, USA. Unter Verwendung solch eines Programms reicht die berechnete prozentuale Ähnlichkeit von 75,7 bis 97,3%. Diese Werte sind sehr hoch und geben die hochkonservierte Natur des Ubc-Proteins wieder. Der hochkonservierte Cysteinrest an dem aktiven Platz tritt an Position 193 in der Übereinstimmungssequenz auf.
Bei den anderen Ubc-Proteinen liegt die berechnete prozentuale Ähnlichkeit zwischen ihnen und Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p und -Ubc5p in dem Bereich von 24,2 bis 63,5%. Proteinhomologe zu Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p und - Ubc5p können deshalb als irgendein Ubiquitin-konjugierendes Enzym der Klasse I (wie von Jentsch, 1992, Quelle 22 definiert) definiert werden, welches eine 66,7%ige oder größere primäre Aminosäurensequenzähnlichkeit zu Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p oder -Ubc5p besitzt, wie sie durch das Megalign Programm definiert wird. Ein Gen wird als Homolog zu S. cerevisiae-UBC4 oder -UBC5 angesehen, falls es ein solches Enzym codiert.
Von einer Anzahl von Spezies ist auch gezeigt worden, dass sie Ubcp-Aktivität aufweist. Wie kürzlich angemerkt wurde, weisen ubc4/ubc5-Doppelmutanten von Saccharomyces cerevisiae eine vergrößerte Verdopplungszeit, eine reduzierte Resistenz gegenüber Aminosäurenanalogen und eine reduzierte Beständigkeit gegenüber Hitzeschocks auf. Es ist bekannt, dass Drosophlla-UBC1-Protein, das durch das UbcD 1-Gen codiert ist und das zu 79,6% und 80,3% ähnlich zu Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p bzw. -Ubc5p ist, die Phenotypen einer Hefe ohne Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität umkehren kann, wenn es stromab des UBC4-Promotors angeordnet wird (35). In gleicher Weise ist es auch bekannt, dass das Caenorhabditis-Protein ubc-2, das durch das ubc-2-Gen codiert ist und das zu 78,2 % und 78,9% zu Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p bzw. -Ubc5p ähnlich ist, dieselben Eigenschaften aufweist (36). Dies ist deshalb ein funktionaler Test, ob ein Protein aus einer unbekannten Quelle Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist. Es kann auch gesehen werden, dass für die Beispiele der Verdopplungszeit und der Überlebensrate nach 24 Stunden bei 38ºC, die einfach ubc4- oder ubc5-mutierten Stämme, welche von Seufert und Jentsch (3,36) beschrieben wurden, ähnliche Eigenschaften wie der Wildtypstamm haben. Die Ubcp-Aktivität eines unbekannten Ubc-Proteins oder einer mutierten Form eines bekannten Ubc-Proteins kann relativ zu natürlichem Saccharomyces cerevisiae-Ubc4p oder -Ubc5p bestimmt werden durch seine relative Fähigkeit, die Verdopplungszeit oder Überlebensrate nach 24 Stunden bei 38ºC (wie in den Quellen 3 oder 36 beschrieben) eines doppelt ubc4/ubc5-mutierten Stamms auf das normale Maß für einen Wildtyp oder einfach ubc4- oder ubc5-mutierten Saccharomyces cerevisiae-Stamm zurückzuführen, sobald das unbekannte oder mutierte Ubc-Protein in das Saccharomyces cerevisiae- Genom unter der Kontrolle des endogenen UBC4- oder UBC5-Promotors integriert worden ist, vorzugsweise als eine Einfachkopieintegration an dem endogenen UBC4- oder UBC5-Ort durch Verfahren, welche bereits in der Literatur (36) beschrieben wurden.
In einem bevorzügten Aspekt der Erfindung ist das Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p- Aktivität reduziert. Es ist herausgefunden worden, dass dies die Anzahl der Kopien eines Expressionsplasmids in der Zelle erhöht und ein erhöhtes Niveau der Expression eines gewünschten Proteins verursacht, welches von dem Plasmid expressiviert wird. Umgekehrt wird ein Ansteigen des Niveaus an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität das Niveau der Expression des Proteins reduzieren, was unter bestimmten Umständen wünschenswert sein kann, z. B. wenn das Plasmid-codierte Protein die Produktion des gewünschten Proteins behindert.
Der Begriff "gewünschtes Protein" wird hier in dem normalen Sinn verwendet, um ein Protein (oder ein anderes Polypeptid) zu bezeichnen, welches in einem gegebenen Verfahren auf einem höheren Niveau gewünscht wird als demjenigen, auf dem die Pilzzelle es ohne menschlichen Eingriff produzieren würde. Das gewünschte Protein kann bezüglich der fraglichen Spezies endogen sein, z. B. kann es ein Enzym sein, das von der Wirtszelle normalerweise produziert wird. Üblicherweise jedoch ist das Protein heterolog zu der Wirtszelle. Das Protein kann seine gewünschte Aufgabe in der Wirtszelle oder der Wirtszellenkultur erfüllen, ohne extrahiert zu werden. Üblicherweise jedoch wird das Protein für eine anderweitige Verwendung von der Zellkultur extrahiert und in gewissem Umfang aufgereinigt. Das Protein kann ein virales, mikrobisches, Pilz-, pflanzliches oder tierisches Protein sein, z. B. ein Säugetierprotein. Vorzugsweise ist es ein humanes Protein, beispielsweise ein Albumin, Immunglobulin oder ein Fragment davon (wie beispielsweise ein Fab- Fragment oder ein Einzelkettenantikörper), (Haemo-)Globin, Blutgerinnungsfaktor (wie beispielsweise Faktoren II, VII, VIII, IX), Interferon, Interleukin, α1-Antitrypsin, Insulin, Calcitonin, Zelloberflächenrezeptor, Fibronectin, Pro-Urokinase, (Pre-pro)- Chymosin, Antigen für Impfstoffe, t-PA, Tumornekrosefaktor, Erythropoietin, G-CSF, GM-CSF Wachstumshormon, Blutplättchen-abgeleiteter Endothelialzellwachstumsfaktor oder Emzym im Allgemeinen, wie beispielsweise Glukoseoxidase und Superoxiddismutase. Das Protein ist selbstverständlich nicht Ubc4p oder Ubc5p selbst oder eine Fusion von Ubc4p oder Ubc5p, in der das Ubc4p bzw. Ubc5p seine natürlichen Funktionen aufweist.
Das gewünschte Protein kann, wenn es von der Pilzzellkultur aufzureinigen ist, durch jegliche Technik erhalten werden, die für das Protein geeignet ist. Zum Beispiel kann Albumin von einer Saccharomyces-, Kluyveromyces- oder Pichia-Zellkultur gemäß den Techniken aufgereinigt werden, die in der WO 96137515, EP-625 202 bzw. EP- 464 590 offenbart sind.
Unsere Arbeit hat hauptsächlich humanes Albumin betroffen, obwohl es keinen Grund gibt, sich vorzustellen, dass das Verfahren der Erfindung nur auf dieses Protein anwendbar ist, insbesondere da von der Erfindung auch gezeigt worden ist, dass sie vorteilhaft bei der Expression von Humanhämoglobin ist.
Der Begriff "humanes Albumin" wird hier verwendet, um ein Material zu bezeichnen, das von humanem Serumalbumin nicht unterscheidbar ist oder das eine Variante oder ein Fragment davon ist. Mit "Variante" schließen wir Einsetzungen, Weglassungen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht konservativ, ein, wobei solche Änderungen nicht die onkotischen, nützlichen ligandenbindenden oder immunogenen Eigenschaften von Albumin wesentlich verändern. Zum Beispiel schließen wir natürlich auftretende polymorphe Varianten von humanem Albumin oder Homologe von humanem Albumin ein, wie sie in der EP-A-322 094 offenbart sind, fm Allgemeinen werden Varianten oder Fragmente von humanem Albumin mindestens 50% (vorzugsweise mindesten 80%, 90% oder 95%) der Ligandenbindungsaktivität (z. B. Bilirubinbindung) von humanem Serumalbumin und mindestens 50% (vorzugsweise mindestens 80%, 90% oder 95%) der onkotischen Aktivität von humanem Serumalbumin aufweisen, jeweils in Gewichtsprozent.
Die das gewünschte Protein codierende Region ist vorzugsweise innerhalb eines Hybridplasmids enthalten, das eine Promotorsequenz, eine DNA-codierende Sequenz, welche unter der Transkriptionskonfrolle des Promotors steht, eine Leader- Sequenz, die die Sekretion des Proteins anführt, und eine DNA-Sequenz, welche ein eukaryotisches Transkriptionsterminierungssignal enthält, aufweist, wobei das Plasmid dann als eine extrachromosomale DNA-Sequenz aufrecht erhalten wird oder in ein oder mehrere Chromosomen des Wirtsorganismus integriert wird.
Geeignete Promotoren für die Expression des Proteins umfassen solche, die mit dem Phosphorglyceratkinase-(PGK1)-Gen, den Galaktokinase-(GAL1)- und Uridindiphosphorglukose-4-epimerase-(GAL90)-Genen, den Iso-1-cytochrom-c-(CYC)-, saure Phosphatase-(PHO5)-, Alkoholdehydrogenasegenen (ADH9 und ADH2) und MFα-1 assoziiert sind. Die bevorzugten Promotoren sind der Glycerol-3- phosphatdehydrogenase-(GPDI)-Promotor, der in der EP 424 117 beschrieben ist, und der Protease-B-(PRB9)-Promotor, der in der EP-431 880 B1 beschrieben ist.
Geeignete Transkriptionsterminierungssequenzen können die 3'-flankierende Sequenz des eukaryotischen Gens sein, die die richtigen Signale für die Transkriptionsterminierung und die Polyadenylation in dem Pilzwirt umfasst, oder solche von Genen, die natürlich mit der Expressionssteuersequenz verbunden sind, oder solche, die mit dem Phosphorglyceratkinase-(PGKI)- oder dem Iso-1- cytochrom-c-(CYC9)-Gen assoziiert sind. Die bevorzugte Transkriptionsterminierungssequenz ist diejenige des Alkoholdehydrogenasegens (ADH9).
Geeignete Sekretionsleadersequenzen sind z. B. die natürliche Humanserumalbuminleadersequenz, die Leadersequenz der Saccharomyces cerevisiae-MFα-1- Leadersequenz, der Kluyveromyces lactis-Killertoxinleader, eine Fusion zwischen dem natürlichen Humanserumalbuminleader und der Saccharomyces cerevisiae- MFα-1-Leadersequenz oder eine Fusion zwischen dem Kluyveromyces lactis- Killertoxinleader und der Saccharomyces cerevisiae-MFα-1-Leadersequenz oder konservativ modifizierte Variationen dieser Sequenzen, wie sie in der WO 90/01063 beschrieben sind.
Hybridplasmide können auch verwendet werden, welche neben der Expressionssteuersequenz, der heterologen Gensequenz und der Transkriptionsterminierungssequenz zusätzliche Sequenzen enthalten, die nicht wesentlich oder weniger wichtig für die Funktion des Promotors sind, beispielsweise für die Expression des gewünschten Polypeptids, die aber wichtige Funktionen beispielsweise in der Fortpflanzung der mit den Hybridplasmiden transformierten Zellen ausführen. Die zusätzlichen DNA-Sequenzen können von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen erhalten werden und können chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Sequenzen umfassen. Zum Beispiel können die zusätzlichen DNA-Sequenzen von Plasmid-DNA, wie beispielsweise bakterieller, Hefe- oder höherer eukaryotischer chromosomaler DNA, abstammen (oder daraus bestehen). Bevorzugte Hybridplasmide enthalten zusätzliche DNA-Sequenzen, die von bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, insbesondere Escherichia coli-Plasmid pBR322 oder verwandte Plasmide, Bakteriophage, 2 um Hefeplasmid und/oder chromosomale Hefe-DNA.
Bei den bevorzugten Hybridplasmiden für die Expression des heterologen Polypeptids tragen die zusätzlichen DNA-Sequenzen einen Hefereplikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridplasmide, die einen Hefereplikationsursprung, beispielsweise ein autonomes replizierendes Segment (ARS), enthalten, werden nach der Transformation extrachromosomal innerhalb der Hefezellen gehalten und werden bei der Mitose autonom repliziert. Hybridplasmide, die homologe Sequenzen zu der 2 um Hefeplasmid-DNA enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Diese Hybridplasmide können durch Rekombination in 2 um Hefeplasmide integriert werden, welche in der Zelle bereits vorliegen, oder sie können autonom replizieren. Die Integrationsvektoren der EP-A-251 744 oder die "Desintegrations"-Vektoren der EP-A-286 424 können verwendet werden.
Vorteilhafterweise enthalten die zusätzlichen DNA-Sequenzen, die in den Hybridplasmiden vorliegen, auch einen Replikationsursprung und einen selektiven Marker für den bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli, und einen selektierbaren Marker für den letztendlichen Pilzwirt. Es gibt nützliche Merkmale, die mit der Anwesenheit eines Escherichle coli-Replikationsursprungs und eines Escherichia coli-Markers in einem Hefehybridplasmid verbunden sind. Als Erstes können große Mengen an Hybridplasmid-DNA durch Wachstum und Verstärkung in Escherichia coli erhalten werden, und als Zweites wird die Konstruktion des Hybridplasmids unter Verwendung des gesamten Repertoirs von Klonungstechnologie, das auf Escherichia coli basiert, einfacher Weise in Escherichia coli ausgeführt. Escherichia coli-Plasmide, wie beispielsweise pBR322 und dergleichen, enthalten sowohl den Escherichia coli-Replikationsursprung als auch genetische Escherichia coli-Marker, die zu der Widerstandsfähigkeit gegenüber Antibiotika, beispielsweise Tetracyclin und Ampicillin, beitragen, und werden vorteilhafter Weise als Teil des Hefehybridvektors verwendet. Die selektiven Pilzmarker können jedes Gen sein, das die Selektion von Transformanten aufgrund der phenotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind insbesondere jene, welche antibiotische Beständigkeit zum Ausdruck bringen, oder, wie in dem Fall von auxotrophischen Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen kompensieren. Entsprechende Gene tragen z. B. zur Resistenz gegenüber dem antibiotischen Cycloheximid bei oder sorgen für die Prototrophie bei einem auxotrophischen Hefemutanten, wie z. B. die URA1, URA3, LEU2, H183, HIS4, TRPS, TRP9 und LYS2-Gene).
Es ist gezeigt worden, dass Pilzzellen der Gattungen Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula durch enzymatischen Aufschluss der Zellwandungen transformiert werden können, um Spheroplaste zu ergeben; die Spheroplaste werden dann mit der transformierenden DNA vermischt und in der Anwesenheit von Kalziumionen und Polyethylenglykol inkubiert; DNA-transformierte Spheroplaste werden in einem Regenerationsmedium regeneriert. Das Regenerationsmedium wird in solcher Weise präpariert, dass gleichzeitig eine Regeneration und eine Selektion der transformierten Zellen ermöglicht wird.
Da die Hefegene, die Enzyme von biosynthetischen Nukleinsäure- oder Aminosäurewegen codieren, im Allgemeinen als Selektionsmarker verwendet werden, wird die Regeneration vorzugsweise in Hefeminimalmedium durchgeführt. Verfahren für die Transformation von Saccharomyces cerevisiae werden allgemein in der EP 251 744, der EP 258 067, der WO 90/01063 und von Hinnen ef al (4) gelehrt, die hier alle durch Bezugnahme eingeführt werden.
So stellt die Erfindung in ihrem breitesten Aspekt die Verwendung eines Mittels bereit, um die UBC4- oder UBC5-Funktion in einer Pilzzelle zu variieren, um die Kopieanzahl eines Plasmids in der Zelle zu steuern.
Bevorzugte, nicht-limitierende Ausführungsformen der Erfindung werden jetzt beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
Fig. 1 eine Plasmidkarte von pDB2277 ist;
Fig. 2 eine Fotografie eines Immunelektrophoreserocketgels ist, die die erhöhte rHA-Produktivität der ubc5-unterbrochenen Hefe zeigt. Die Stämme waren die folgenden: Probe 1, DS569-ura3 [pAYE329/Ycplac33]; Probe 2-17, DS569-ura3 [pAYE329/pDB2276]-Transformanten 1-16; Proben 18-33, DS1101-ura3 [pAYE329/pDB2276]-Transformanten 1-16; Proben 34-38, HSA-Standards 100, 75, 50, 30 und 20 ug/ml HSA;
Fig. 3 die genomische DNA-Sequenz des Saccharomyces cerevisiae- Hefegens UBC4 ist; die 2,066 kb Sequenz erstreckt sich von dem PstI-Platz 0,95 kb stromauf von dem Start des offenen UBC4-Leserahmens zu dem PstI-Platz 0,58 kb stromab des Translationsstopcodons;
Fig. 4 ist eine Plasmidkarte von pAYE399;
Fig. 5 ist eine Plasmidkarte von pAYE400;
Fig. 6 ist eine Plasmidkarte von pUBT1;
Fig. 7 ist eine Plasmidkarte von pUBT2;
Fig. 8 ist eine Plasmidkarte von pHbD2-1;
Fig. 9 ist eine Plasmidkarte von pAYE792;
Fig. 10 ist eine Plasmidkarte von pBST+;
Fig. 11 ist eine Plasmidkarte von pDB2258;
Fig. 12 ist eine Plasmidkarte von pDB2259;
Fig. 13 ist eine Plasmidkarte von pDB2260;
Fig. 14 ist eine Plasmidkarte von pDB2261;
Fig. 15 ist die genomische DNA-Sequenz des Saccharomyces cerevisiae- UBC5-Gens; die 1,2 kb Sequenz erstreckt sich von dem BglII-Platz 0,55 kb stromauf des Starts des offenen UBC5-Leserahmens zu dem BclI-Platz 0,12 kb stromab des Translationsstopcodons;
Fig. 16 ist eine Plasmidkarte von pDB2262;
Fig. 17 ist eine Plasmidkarte von pDB2264;
Fig. 18 ist eine Plasmidkarte von pDB2275; und
Fig. 19 ist eine Plasmidkarte von pDB2276.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Alle Standardverfahren zu rekombinanter DNA sind in der Quelle 13 beschrieben, soweit nicht anderweitig angegeben.

Beispiel 1: Unterbrechung des Saccharomyces cerevlsiae-UBC4-Gens

Das Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gen ist auf dem Chromosom 11 angeordnet. Die DNA-Sequenz des UBC4-Gens ist in Fig. 3 gezeigt.
Das UBC4-Gen wurde durch das Verfahren der Genunterbrechung (14) mutiert, welches den gesamten offenen UBC4-Leserahmen zerstörte, wodurch die Produktion von aktivem Ubc4-Protein verhindert wurde. Dies wurde erreicht durch zuerst Verstärken eines geeigneten Markergens (URA3) mit einem mutagenen Einfachstrang-DNA-Primer, der die 5'- und 3'-Enden des URA3-Gens modifizierte, so dass sie DNA-Sequenzen umfassten, die den 5'- und 3'-Regionen des offenen UBC4-Leserahmens identisch waren, mittels PCR und dann Umwandeln eines -auxotrophischen ura3-Hefestamms zur Uracilprototrophie.
Zwei Einfachstrangoligonukleotidprimer (UBC4URA1 und UBC4URA2), die für die PCR-Verstärkung der 5'- und 3'-Enden des URA3-Gens, welches UBC4-Sequenzen in seinen Endbereichen aufweist, geeignet sind, wurden unter Verwendung eines ABI 380B-DNA-Synthetisierers synthetisiert.
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um das URA3-Gen von dem Plasmid Yep24 zu verstärken (15). Die Bedingungen waren wie folgt: 1 ug/ml Plasmid Yep24-DNA, 2 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 30 Sekunden, lasse an bei 45ºC für 40 Sekunden, weite aus bei 72ºC für 120 Sekunden für 20 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 Sekunden, gefolgt von einer 4ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer- Cetus PCR-Kits, unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA-Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ui, gemäß den Herstelleranweisungen. Alternative Bedingungen waren: 2 ng/ml Plasmid Yep24-DNA, 0,1 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 30 Sekunden, lasse an bei 55ºC für 40 Sekunden, weite aus bei 72ºC für 120 Sekunden für 30 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 Sekunden, gefolgt von einer 4ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin- Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus PCR-Kits unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA-Polymerase, Gesamtreaktionsvoiumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das Produkt, 5'-UBC4-URA3-UBC4-3', wurde durch Gelelektrophorese analysiert, und es wurde herausgefunden, dass es von der erwarteten Größe von ungefähr 1,2 kb war. Die verstärkten PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines Promega Wizard PCR DNA-Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen aufgereinigt.
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm DS569 cirº (16) wurde mit dem rekombinanten Humanalbumin-(rHA)-Sekretionsplasmid pAYE329 zur Leucinprototrophie transformiert (19). Die Promotorsequenz in diesem Plasmid entspricht derjenigen des Saccharomyces cerevisiae-NAD-verknüpften Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase- (GPDI)-Gens statt demjenigen des FAD-verknüpften Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase-(GUT2)-Gens, wie es ursprünglich beschrieben wurde (19).
Das auxotrophische ura3-Derivat des Saccharomyces cerevisiae-Stamms D5569 [pAYE329] wurde durch Mutieren des URA3-Gens durch das Verfahren Prozess der Genunterbrechnung (14) mutiert, das einen Teil der URA3-codierenden Sequenz zerstörte, wodurch die Produktion von aktivem Ura3-Protein verhindert wurde. Das Plasmid Yep24 (15) wurde zur Vervollständigung mit HindIII aufgeschlossen, und die Produkte wurden durch Gelelektrophorese aufgelöst. Das 1,17 kb HindIII-URA3- Genfragement wurde isoliert und in den einmaligen HindIII-Platz von pACYC184 (17) ligatiert, um das Plasmid pAYE399 zu erzeugen, Fig. 4. Das Plasmid pAYE339 wurde zur Vervollständig mit PstI aufgeschlossen und teilweise mit Ncol aufgeschlossen, die Produkte wurden durch Gelelektrophorese aufgelöst, und das 5,41 kbNcol-PstI-DNA-Fragment, dem es an dem zentralen Teil des URA3-Gens fehlte, wurde isoliert, stumpfendig mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase aufgefüllt und zurück ligatiert. Das resultierende Plasmid pAYE400, Fig. 5, besitzt eine Auslassung innerhalb des offenen URA3-Leserahmens und einen Ncol-Platz an dem Auslassungsort. Das Auslassungsderivat des URA3-Gens (ΔURA3) wurde als ein 0,94 kbHindIII-Fragment des Plasmids pAYE400 isoliert. Ein auxotrophischer ura3-Mutant von DS569 [pAYE329] wurde durch Transformieren von DS569 [pAYE329] mit dem 0,94 kb ΔURA3-HindIII-Fragment und Auswählen von Ura-Hefe nach ihrer Beständigkeit gegenüber 5-Fluororotsäure transformiert (18). Kolonien, die auf diesem Medium wachstumsfähig waren, wurden gereinigt und darauf getestet, dass sie unfähig waren, in der Abwesenheit einer Uracilzugabe zu wachsen und dass der Defekt durch Einführen des URA3-Gens durch Transformation ausgeglichen werden konnte.
Ein solcher Stamm, DS569-ura3 [pAYE329], wurde mit den 5'-UBC4-URA3-UBC4-3'- PCR-Produkt zur Uracilprototrophie transformiert. Ein Southern Blot der aufgeschlossenen genomischen DNA einer Anzahl von Transformanten wurde mit dem UBC4-Gen als Sonde als ein 2,07 kbPstI-DNA-Fragment bestimmt, was die Unterbrechug des UBC4-Gens bestätigte. Der neue Stamm wurde UB05 [pAYE329] bezeichnet.
Diese Verfahren waren in gleicher Weise anwendbar auf die Unterbrechung von UBC4 in jedem haploiden Saccharomyces cerevisiae-Stamm. Falls der gewünschte Wirt bereits eine auxotrophische ura3-Mutation trägt, kann die Unterbrechung von UBC4 mit den oben beschriebenen 5'-UBC4-URA3-UBC4-3'-PCR-Produkt durchgeführt werden. Wenn der gewünschte haploide Wirt keine auxotrophische ura3-Mutation trägt, kann die Unterbrechnung von UBC4 durchgeführt werden, nachdem der Stamm durch Transformation mit dem 0,94 kb ΔURA3-HindIII- Fragment von pAYE400 und Auswählen von Ura-Hefe durch Resistenz gegenüber 5- Fluororotsäure, wie oben beschrieben wurde, ura3 gemacht wurde. Im Falle eines diploiden Wirts ist es notwendig, beide UBC4-Gene zu unterbrechen. Dies kann durch Unterbrechen des UBC4-Gens in jedem der zwei haploiden Ausgangsstämme zu Beginn vor der Diploidisierung erreicht werden.

Beispiel 2: Die Unterbrechung des Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gens erhöhte die Produktion von rekombinantem humanem Albumin.

Die rHA-Produktivität des Hefestamms DS569 [pAYE329] (der keine UBC4- Unterbrechung aufweist) und zweier unabhängiger Isolate von UB05 [pAYE329], UB05-1 [pAE329] und UB05-6 [pAYE329] genannt (von denen beide eine UBC4- Unterbrechung aufwiesen), wurde in 10 ml Schüttelkolbenkulturen ermittelt. Die Hefe wurde in YNB-(Hefestickstoffbasis, Difco)-Minimalmedium, das mit Natriumphosphat/-zitrat auf pH 6,0 gepuffert war und 2% Gewicht/Volumen Glukose enthielt, geimpft und bei 30ºC, 200 Umdrehungen pro Minute für drei Tage inkubiert. Die rHA-Produktivität wurde durch Rocket-Immunelektrophorese gegen HSA-Standards (25 bis 150 ug/ml) abgeschätzt. Die rHA-Produktivität von DS569 [pAYE329] wurde unter diesen Bedingungen zu 45 mg/l berechnet, während die rHA-Produktivität der beiden UB05 [pAYE329]-Isolate, die unter identischen Bedingungen gemessen wurde, zu 77 bzw. 75 mg/l berechnet wurde.

Beispiel 3: Die Unterbrechung des Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gens erhöht die 2 um Hybridplasmidkopieanzahl.

Die Plasmidkopieanzahl des 2urn Hybridplasmids des Hefestamms DS569 [pAYE329] und zweier unabhängiger Isolate von UB05 [pAYE329], UB05-1 [pAYE329] und UB05-6 [pAYE329] genannt, wurde in 100 ml Schüttelkolbenkulturen ermittelt. Die Hefe wurde in YNB-Minimalmedium geimpft, das mit Natriumphosphat/- zitrat auf pH 6,0 gepuffert war und 2% Gewicht/Volumen Glukose enthielt, und bei 30ºC, 200 Umdrehungen pro Minute für eine ausreichende Zeit, üblicherweise 1 bis 2 Tage, inkubiert, um es der Kulturdichte zu erlauben, 5 AU/ml zu überschreiten, was einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase entsprach. Die gesamte genomische DNA wurde durch Glaszerstörung der Hefezellen extrahiert, gefolgt von Lösungsmittelextraktion, Dialyse und Ethanolpräzipitation. Die gesamte genomische DNA wurde zur Vervollständigung mit HindIII aufgeschlossen, und die Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Die Ethidiumbromidfärbung des plasmidspezifischen DNA-Bands wuchs relativ zu der Ethidiumbromidfärbung des ribosomalen DNA-(rDNA)-Bands an, was anzeigt, dass die Plasmidkopieanzahl des 2 um Hybridplasmids angewachsen war. Die Quantifizierung der 2 um Hybridplasmidkopieanzahl relativ zu der Kopieanzahl der rDNA wurde durch Southern Blot-Analyse mit einer kombinierten rDNAIHSAcDNA-Sonde durchgeführt. Dies zeigte, dass die Plasmidkopieanzahl des 2 um Hybridplasmids pAYE329 von 48,9 ± 9.2 Kopien pro Haploidgenom in DS569 [pAYE329] auf 83,1 ± 12,5 und 116,8 ± 29,0 Kopien pro Haploidgenom in UB05-1 [pAYE329] bzw. UV05-6 [pAYE329] angestiegen war.

Beispiel 4: Antisense UBC4-mRNA-Expression.

Ein Weg, die Expression des U8C4-Gens zu unterbrechen, ist es, für die Expression eines Antisense-Polynucleotids zu sorgen.
Das Antisense-Transkript kann von einer Kopie oder von Kopien der Antisense- Expressionskassette expressiviert werden, die in das oder die Chromosom(e) integriert worden ist/sind, oder es kann von einem Vektor mit niedriger Plasmidkopieanzahl expressiviert werden, beispielsweise einem centromeren Vektor, wie YCp50 (25) oder YCplac1111, YCplac33, YCplac22 (26), oder von Plasmiden p413 bis p416, die die GAL9-, GALLI- oder GALS-Promotoren enhalten (27). Das Antisense-Transkript kann auch von einem Vektor mit hoher Plasmidkopieanzahl expressiviert werden, wie pJDB 207 (12), YEp13 oder YEp24 (15). Alle diese Expressionsplasmide oder integrierenden Kassetten erfordern einen selektierbaren Nefemarker, beispielsweise URA3, HIS3 oder TRp1, um die Auswahl während der Transformation der Hefe zu erleichtern, die die/den geeigneten auxotrophischen Marker aufweist.
Der Promotor, der verwendet wird, um die Expression des Anisense-UBC4 oder des Antisense-UBC5 anzutreiben, kann der native Promotor oder ein verwandter Promotor sein. Dies hat den Vorteil, dass die Expression des Antisense-Transkripts zur selben Zeit aktiviert wird, wie das Sense-Transkript auftritt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Antisense-Expressionskassette auf einem Plasmid mit hoher Plasmidkopieanzahl vorgesehen, um einen Überschuss des Antisense-Transkripts über das Sense-Transkript sicherzustellen. Alternative Promotoren umfassen stark konstituente Promotoren, so wie die glykolytischen Promotoren, beispielsweise PGKI, PYK9, TDH2/TDH3 und EN01/EN02. Die Verwendung von stark regulierten Promotoren hat den Vorteil, dass die Plasmidkopieanzahl nach dem Wunsch des Bedieners reguliert werden kann. Beispiele solcher Promotoren sind die GAL9-, GALL- und GALS-Promotoren (Mumberg et al., 27). Diese Galaktose-induzierten Promotoren sind sowohl in Vektoren mit hoher als auch mit niedriger Plasmidkopieanzahl eingebaut worden, getrennt von den CYC1-Terminator durch einen mehrfachen Klonungsplatz. Die unten beschriebenen Beispiele verwenden ein Plasmid, das p426-GAL1 genannt wird (Mumberg et al., 27). Das Antisense-UBC4-Transkript kann nur dann bei der Inaktivierung des Sense-UBC4-Transkripts wirksam sein, wenn der Pilzwirtsstamm ein wirksames UBC4-Gen umfasst. Die Expression eines Antisense-UBC4- Transkripts in einem ubc4-Pilzstamm kann jedoch nützlich sein, um andere UBC4- artige Transkripte abzufangen, so ist dies auch eine Möglichkeit.
Zwei Einzelstrangoligonukleotidprimer (UBC43 und UBC44) welche für die PCR- Verstärkung des offenen UBC4-Leserahmens geeignet waren, wurden unter Verwendung eines ABI 380B-DNA-Synthetisierers synthetisiert.
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um das UBC4-Gen von genomischer DNA zu verstärken, welche von dem Hefestamm S288C präpariert worden war. Die Bedingungen waren wie folgt: 5 ug/ml genomische DNA S288C, 2 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 30 sec., lasse an bei 45ºC für 70 sec., weite aus bei 72ºC für 120 sec. für 35 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 sec., gefolgt von einer 4ºC-Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus PCR-Kits, unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das Produkt, -5'-(HindIII)-UBC4-(HindIII)-3', wurde durch Gelelektrophorese analysiert, und es wurde herausgefunden, dass es von der erwarteten Größe von ungefähr 0,58 kb war. Die verstärkten PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines Promega Wizard PCR DNA Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Die Verwendung dieser zwei Primer, UBC43 und UBC4, führte HindIII-Plätze 5' und 3' in den offenen UBC4-Leserahmen ein.
Das gereinigte PCR-Produkt, 5'-(HindIII)-UBC4-(HindIII)-3' wurde zur Vervollständigung mit HindIII aufgeschlossen und in den einmaligen HindIII-Platz ligatiert, der zwischen dem GAL1-Promotor und dem CYC1-Terminator des Plasmid p426 GAL1 angeordnet ist (Mumberg et al., 27), was zwei Plamide pUBT1 und pUBT2 erzeugte (Fig. 6 und 7). Das Plasmid pUBT1 enthielt den offenen UBC4- Leserahmen in einer solchen Orientiertung, dass er ein Antisense-UBC4-Transkript von dem GAL1-Promotor erzeugte, während das Plasmid pUBT2 den offenen UBC4- Leserahmen in einer solchen Orientierung enthielt, dass ein Sense-UBC4-Transkript von dem GAL1-Promotor erzeugte.
Hefestämme, mit Defekten bei der Uracilbiosynthese aufgrund der Anwesenheit eines nicht funktionsfähigen ura3-Gens, so wie DS569-ura3 [pAYE329] (Beispiel 1), wurden mit dem Plasmid pUBT1 zur Uracilprototrophie transformiert. Antisense- UBC4-Transkriptproduktion wurde durch Umstellen von einem Hefewachstumsmedium, das Glukose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, auf ein Medium, das Galaktose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, induziert. Umgekehrt wurde Antisense-UBC4-Transkriptproduktion durch Umstellen von einem Hefewachstumsmedium, das Glaktose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, auf ein Medium, das Glukose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, unterdrückt.

Beispiel 5: Sense-UBC4-mRNA Expression von dem GFAL1-Promotor.

Das Plasmid pUBT2 (Fig. 7) erlaubt die Überexpression des UBC4-Transkripts. In einem ubc4-defizitären Pilzstamm, der mit dem Plasmid pUBT2 transformiert wurde, wird die UBC4-mRNA-Expression ansteigen und die Plasmidkopieanzahl herunterzwingen, wenn die Kohlenstoffquelle von Glukose auf Galaktose umgestellt wird. Dies ist noch ein anderer Weg, um die Steuerung der Plasmidkopieanzahl durch Umstellen zwischen unterdrückenden und aktivierenden Kohlenstoffquellen zu erleichtern. Erneut kann dies sowohl vor einem ubc4- als auch einen UBC4- Hintergrund getan werden.
Hefestämme, die bei der Uracilbiosynthese aufgrund der Anwesenheit eines nicht funktionierenden ura3-Gens defizitär sind, wie beispielsweise DS569-ura3 [pAYE329] (16) oder ein ura3-Derivat von UB05 [pAYE329] (Beispiel 1) wurden mit dem Plasmid pUBT2 zur Uracilprototrophie transformiert. Sense-UBC4-Transkriptproduktion wurde durch Umstellen von einem Hefewachstumsmedium, das Glukose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, auf ein Medium, das Galaktose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, induziert. Umgekehrt wurde eine Sense-UBC4- Transkriptproduktion von pUBT2 durch Umstellen von Hefewachstumsmedium, das Galaktose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, auf eine Medium, das Glukose als die einzige Kohlenstoffquelle enthielt, umgestellt.

Beispiel 6: Die Unterbrechung des Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gens erhöht die Produktion von anderen rekombinanten humanen Proteinen.

Die Beseitigung des ubc4-Gens wird die Expression von anderen heterologen Proteinen erhöhen. Dies wurde beispielhaft durch Analyse des Expressionsniveaus von rekombinantem Humanhämoglobin (rHb) in DS569 und DS1101 (später in Beispiel 7 beschrieben) belegt, welche eine Mutation innerhalb des offenen UBC4- Leserahmens besitzen. Das Humanhämoglobinexpressionsplasmid, pHbD2-1 genannt (Fig. 8), basierte auf den gesamten 2 um des Integrationsvektor pSAC35 (16). Die Transkription der Human-α-globinkette wurde durch den GPD1-Promotor (19) angeführt und durch den PGKI-Terminator abgeschlossen. Die Transkription der Human-β-globinkette wurde von dem PRB9-Promotor angeführt und von den ADH1- Terminator abgeschlossen (16).
Die rHb-Produktivität der Hefestämme DS 569 und DS1101, die mit pHbD2-1 zur Leucinprototrophie transformiert worden waren, wurde in 10 ml Schüttelkolbenkultur ermittelt. Hefe wurde in YNB-Minimalmedium geimpft, das mit Natriumphosphat/- zitrat auf pH 6,0 gepuffert war und 2% (Gewicht/Volumen) Glukose enthielt, und bei 30ºC, 200 Umdrehungen pro Minute für drei Tage inkubiert. Die rHb-Produktivität in löslichen Hefezellenextrakten wurde durch eine spektrophotometrische Messung aus der Höhe des Sorefi-Peaks in einem zweiten Derivatspektrum durch Vergleich mit Standard-HbA von bekannter Konzentration quantifiziert (28). Die absolute Konzentration an löslichen Proteinen wurde durch Coomassie Protein Assay Reagent gemäß den Herstelleranweisungen (Pierce) quantifiziert. Das Expressionsniveau von löslichem rHb in DS569 [pHbD2-1] wurde als äquivalent zu 0,4% (GewichtNolumen) des gesamten löslichen Proteins berechnet. Das Expressionsniveau von löslichem rHb stieg auf 0,8% (Gewicht/Volumen) bei dem Stamm DS1101 [pHbD2-1] an, der die ubc4-Entfernung trägt.

Beispiel 7: Mutation des Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gens

Wie oben beschrieben wurde, wurde die ursprüngliche Mutation durch zufällige chemische Mutagenisierung erzeugt. Der Ausgangsstamm für diesen Prozess war DS569 [pAYE329] (16). DS569 [pAYE329] wurde chemischer Mutagenisierung durch N-Methyl-N'-nitro-N'-nitrosoguanidin (NTG) unterworfen und potentielle rHAüberexpressivierende Mutantenstämme wurden durch ein Plattenscreeningverfahren selektiert, das in der EP 431 880 beschrieben ist. Ein solcher Mutantenstamm wurde DS1101[pAYE329] bezeichnet. Eine Analyse der rHA-Produktivität von DS569 [pAYE329] DS1101 [pAYE329] wurde in 10 ml Schüttelkolbenkulturen durchgeführt, wie bei Beispiel 2 beschrieben wurde. Die rHA-Produktivität wurde durch Rocket- Irnmunefektrophorese gegen HSA-Standards (25 bis 150 ug/ml) abgeschätzt. Die rHA-Produktivität von DS569 [pAYE329] unter diesen Bedingungen wurde zu ungefähr 45 mg/l berechnet, während die rHA-Produktivität von DS1101 [pAYE329], die unter identischen Bedingungen gemessen wurde, zu 78 mg/l berechnet wurde.
Die Plasmidkopieanzahl des 2 um Hybridplasmids der Hefestämme DS569 [pAYE329] und DS1101 [pAYE329] wurde in 100 ml Schüttelkolbenkulturen ermittelt, wie in Beispiel 3 beschrieben wurde. Die Quantifizierung der Kopieanzahl des 2 um Hybridplasmids relativ zu der Kopieanzahl der rDNA wurde durch Southern Blot- Analyse mit einer verknüpften rDNA/HSAcDNA-Sonde durchgeführt. Dies zeigte, dass die Plasmidkopieanzahl des 2 um Hybridplasmids pAYE329 von 18,9 ± 9,2 Kopien pro Haploidgenom bei DS569 [pAYE329] auf 70,5 ± 15,9 Kopien pro Haploidgenom bei DS1101 [pAYE329] angestiegen war.
Um die Identifikation der Natur der ursprünglichen Mutation zu ermöglichen, die für die erhöhte Plasmidkopieanzahl und rHA-Produktivität verantwortlich war, welche bei DS1101 [pAYE329] beobachtet wurde, wurde ein partielles Archiv genomischer Sau3A-DNA von höher molekulargewichtiger genomischer DS569-DNA in dem centromeren Vektor Ycp50 erstellt (30). Ein neuer Hefestamm DSIIOI-URA3 [pAYE329] wurde aus DS1101 [pAYE329] durch das Verfahren, welches in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt. DS1101-URA3 [pAYE329] wurde mit DNA aus dem DS569-Ycp50-Genomarchiv zur Uracilprototrophie transformiert. Die Transformanten wurden auf reduzierte rHA-Expressionen durch ein anti-HSA-Antikörper abhängiges Plattenscreeningverfahren getestet, das in der EP 431 880 beschrieben ist. Ein Isolat, DS1101-ura3 [pAYE329/pAYE792], wurde identifiziert, welche eine reduzierte rHA-Produktivität hatte, wenn es in 10 ml Schüttelkolbenkulturen getestet wurde. Hefe wurde in YNB-(Difco)-Minimalmedium geimpft, das mit Natriumphosphatl-citrat auf pH 6,0 gepuffert war und 2% Gewicht/Volumen Glukose enthielt, und bei 30ºC, 200 Umdrehungen pro Minute für drei Tage inkubiert. Die rHA-Produktivtät wurde durch Rocket-Immunelektrophorese gegen HSA-Standards abgeschätzt, und es wurde gezeigt, dass sie verglichen mit der DS1101-ura3 [pAYE329IYCp50]-Kontrolle reduziert aber ähnlich derjenigen der DS569-ura3 [pAYE329JYcp50]-Kontrolle war. Die Plamidkontrollanzahl des 2 um Hybridplasmids der Hefestämme DS569-ura3 [pAYE329/Ycp50], DS569-ura3 [pAYE329/pAYE792], DS1101-ura3 [pAYE329/Ycp50] und DS1101-ura3 [pAYE329/pAYE792] wurde in 100 ml Schüttelkolbenkulturen bestimmt, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Quantifizierung der Kopieanzahl des 2 um Hybridplasmids relativ zu der Kopieanzahl der rDNA wurde durch Southern Blot-Analyse mit einer verknüpften rDNAIHSAcDNA-Sonde durchgeführt. Dies zeigte, dass die Plasmidkopieanzahl des 2 um Hybridplaxmids pAYE329 von 59,4 ± 6,0 Kopien pro Haploidgenom in DS1101-ura3 [pAYE329/Ycp50] auf 38,3 ± 1,3 Kopien pro Haploidgenom in DS1101-ura3 [pAYE329/pAYE792] herabgesetzt war, aber bei DS569-ura3 [pAYE329/Ycp50] und bei DS569-ura3 [pAYE329/pAYE792] mit 33,0 ± 5,3 bzw. 27,5 ± 4,5 Kopien pro Haploidgenom unverändert geblieben war.
Die DNA des centromeren Plasmids pAYE792 wurde von dem Stamm DS1101-ura3 [pAYE329/pAYE792] (31) in E.coli isoliert und DNA-sequenziert (Fig. 9). Dies ergab, dass das Plamid pAYE792 einen durchgehenden genomischen 9,05 kb Einsatz von dem Chromosom 11 von Saccharomyces cerevisiae enthält (32), der die Region überspannt, welche die UBC4-, TEC1- und MIS 1-Gene einschließt. Anschließendes Subklonen der drei individuellen Gene zeigte, dass das UBC4-Gen verantwortlich für die reduzierte rHA-Produktivität und die reduzierte Plasmidkopieanzahl war, die mit pAYE792 bei dem Stamm DS1101-ura3 [pAYE329/pAYE792] verbunden sind.
Um die Natur der in DS1101 durch die NTG-Mutagenierung von DS569 eingeführten Mutation zu erforschen, wurde das UBC4-Gen von DS1101 durch PCR isoliert. Zwei Einzelstrangoligonucleotidprimer (UBC4A und UBC4B), welche für die PCR- Verstärkung des 2,1 kb UBC4-Genom-PstI-Fragments (Fig. 3) geeignet sind, wurden unter Verwendung eines ABI 38DB DNA-Synthetisierers hergestellt.
PCR-Reaktionen wurden durchgefühert, um das UBC4-Gen von hochmolekulargewichtiger genomischer DNA zu verstärken, welche von DS1101 gemäß Literaturquelle 30 präpariert worden war. Die Bedingungen waren wie folgt: 50 ng/ml auf 0,5 ng/ml genomischer DS110-DNA, 2 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 30 sec., lasse an bei 50ºC für 40 sec., weite aus bei 72ºC für 120 sec. für 40 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 sec, gefolgt von einer 4ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus PCR-Kits unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA- Polymerase, Gesamtreakfionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das verstärkte 2,1 kb DNA-Produkt wurde durch TAE-Agarosegelelektrophorese mit einem Genclean III DNA-Extraktionskit (Bio191 Inc., 1070 Joshua Way, Vista, CA 92083, USA) gereinigt und zur Vervollständigung mit PstI aufgeschlossen. Das Plasmid pBST+ (Fig. 10) wurde von dem Phagemid pBS+ (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA) durch Aufschließen von pBS+ mit EcoRI und HindIII hergestellt. Der isolierte linearisierte Vektor wurde mit einem Doppelstrangoligonukleotidverbinder mit der folgenden Sequenz ligatiert:
Das Plasmid pBST+ wurde mit PstI linearisiert und mit dem Psfl-aufgeschlossenen, PCR-verstärkten 2,1 kb UBC4-DNA-Produkt ligatiert, um vier separate Plasmidisolate zu erzeugen, die pDB2258, pDB2259, pDB2260 und pDB2261 bezeichnet werden (Fig. 11 bis 14). Die PstI-Einsätze bei allen vier Plasmiden (von DS1101 abstammend) und das UBC4-Gen, welches von pAYE792 (von DS569 abstammend) isoliert wurde, wurden DNA-sequenziert. Die DNA-Sequenzanalyse ergab eine Mutation innerhalb des DS1101-UBC4-Gens. Diese Mutation, eine G-für-A- Substitution, wurde in dem 10. Codon lokalisiert und hatte die DNA-Sequenz:
Die Mutation war derart, dass sie die 10. Aminosäure von einer Glutaminsäure zu einem Lysin ändern würde, bezeichnet als Glu10Lys.
Diese Mutationsform bzw. tatsächlich jede Mutationsform des UBC4-Gens kann in jeden Stamm, bei dem das UBC4-Gen bereits durch URA3 unterbrochen wurde, wie bereits in Beispiel 1 beschrieben wurde, durch Verfahren ähnlich denjenigen eingeführt werden, welche bereits in der Literatur für die Austauschung des endogenen Saccharomyces cerevisiae-UBC4-Gens durch das Caenorhabditis elegans-ubc-2-Gen beschrieben wurden (36). Der Hefestamm UB05 (Beispiel 1) wurde mit dem 2,1 kb PstI-Fragment von einem der Plasmide pDB2258, pDB2259, pDB2260 oder pDB2261 (Fig. 11 bis 14) nach ura3 (Ura-) transformiert und aufgrund der Beständigkeit gegen 5-Fluororotsäure nach Ura-Hefe selektiert (18). Kolonien, die auf diesem Medium wachstumsfähig waren, wurden gereinigt und darauf getestet, dass sie unfähig waren, in der Abwesenheit einer Uracilzugabe zu wachsen und dass dieser Defekt durch Einführen des URA3-Gens durch Transformation, ausgeglichen werden konnte. Die Entfernung des URA3-Gens von dem UBC4-Ort in UB05 und sein Austausch durch die Glu10Lys-Mutationsform des UBC4-Gens wurde durch einen Southern Blot bestätigt.

Beispiel 8: Unterbrechung des Saccharomyces cerevisiae UBC5-Gens

Das Saccharomyces cerevisiae-UBC5-Gen ist auf dem Chromosom IV angeordnet. Die DNA-Sequenz des UBC5-Gens ist in Fig. 15 gezeigt.
Das UBC5-Gen wurde durch das Verfahren der Genunterbrechung (14) mutiert, das den gesamten offenen UBC5-Leserahmen zerstörte und dadurch die Produktion von aktivem Ubc5-Protein verhinderte. Dies wurde durch zunächst Verstärken eines geeigneten Markergens (URA3) durch PCR mit einem mutagenen Einfachstrang- DNA-Primer, der die 5'- und 3'-Enden des URA3-Gens so modifizierte, dass sie DNA-Sequenzen identisch den Regionen 5' und 3' des offenen UBC5-Leserahmens umfassten, und anschließendes Transformieren eines auxotrophischen ura3- Hefestamms zur Uracilprototrophie erreicht.
Zwei Einfachstrangoligonukleotidprimer (UBC5URA1 und UBCSURA2), die für die PCR-Verstärkung der 5'-und 3'-Enden des URA3-Gens geeignet sind und die UBC5- Sequenzen an ihren Enden aufweisen, wurden unter Verwendung eines ABI 380B- DNA-Synthetisierers synthetisiert.
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um das URA3-Gen von dem Plasmid YEp24 zu verstärken (15). Die Konditionen waren wie folgt: 1 ug/ml YEp24-Plasmid-DNA, 2 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 30 sec., lasse an bei 45ºC für 40 sec., weite aus bei 72ºC für 120 sec. für 20 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 sec., gefolgt von einer 40ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer- Cetus Thermal Gyclers und eines Percin-Elmer-Cetus PCR-Kits unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA-Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Alternative Bedingungen waren: 2 ng/ml YEp24- Plasmid-DNA, 0,1 uM jedes Primers, denaturiere bei 94ºC für 35 sec., lasse an bei 55ºC für 40 sec., weite aus bei 72ºC für 120 sec. für 30 Zyklen, gefolgt von einer 72 ºC Quellung für 600 sec., gefolgt von einer 4ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus PCR-Kits unter Einsatz von AmpliTaq Thermal Stable DNA-Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das Produkt, 5'-UBC5-URA3-UBC5-3' wurde durch Gelelektrophorese analysiert, und es wurde herausgefunden, dass es von der erwarteten Größe von ungefähr 1,2 kb war. Das verstärkte PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines Promega Wizard PCR DNA-Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt.
DS569-ura3 [pAYE329] wurde mit dem 5'-UBC5-URA3-UBC5-3'-PCR-Produkt zur Uracilprototrophie transformiert. Ein Southern Blot von aufgeschlossener genomischer DNA einer Anzahl von Transformanden ergab mit dem UBC5-Gen als Sonde als ein 0,5 kbM/ul-Asp718-DNA-Fragment und bestätigte die Unterbrechung des UBC5-Gens. Der neue Stamm wurde UB1 [pAYE329] bezeichnet.
Bei einem alternativen Verfahren zum Unterbrechen des UBC5-Gens wurden Bereiche, die den 5'-und 3'-Enden des UBC5-Gens entsprechen, durch PCR geklont. Zwei Paare von Einfachstrangoligonukleotidprimern, die für die PGR-Verstärkung des 5'-Endes des UBC5-Gens (DS101 und DS102) und des 3'-Endes des UBC5-Gens (DS103 und DS104) geeignet waren, wurden unter Verwendung eines ABl 380B- DNA-Synthetisierers synthetisiert.
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um das 5'-Ende des UBC5-Gens zu verstärken. Die Bedingungen waren wie folgt: 1000-10 ng/ml genomische S288C- DNA, 2 uM DS101-Primer, 2 uM DS102-Primer, denaturiere bei 94ºC für 30 Sekunden, lasse an bei 37ºC für 30 Sekunden, weite aus bei 72ºC für 60 Sekunden für 30 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 Sekunden, gefolgt von einer 40ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus PCR-Kits unter Einsatz von AmliTaq Thermal Stable DNA- Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das Produkt, 5'-UBC5, wurde durch Gelelektrophorese analysiert und es wurde herausgefunden, dass es von der erwarteten Größe von 229 bp war. Das verstärkte PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines Promega Wizard PCR-DNA- Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt.
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um das 3'-Ende des UBC5-Gens zu verstärken. Die Bedingungen waren wie folgt: 1000-10 ng/ml genomische S288C- DNA, 2 uM DS103-Primer, 2 uM DS104-Primer, denaturiere bei 94ºC für 30 Sekunden, lasse an bei 37ºC für 30 Sekunden, weite aus bei 72ºC für 60 Sekunden für 30 Zyklen, gefolgt von einer 72ºC Quellung für 600 Sekunden, gefolgt von einer 4 ºC Quellung, unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyclers und eines Perkin-Elmer-Cetus-PCR-Kits unter Einsatz von AmliTaq Thermal Stable DNA- Polymerase, Gesamtreaktionsvolumen 50 ul, gemäß den Herstelleranweisungen. Das Produkt, 3'-UBC5, wurde durch Gelelektrophorese analysiert und es wurde herausgefunden, dass es von der erwarteten Größe von 327 bp war.
Das 5'-UBC5-DNA-Fragment wurde zur Vervollständigung mit NotI und SaII aufgeschlossen, Phenol/Chloroform-extrahiert und in NotI/SalI-linearisiertes pBST+ geklont, um ein Plasmid pDB2262 (Fig. 16) zu erzeugen. Das 3'-UBC5-DNA- Fragment wurde zur Vervollständigung mit NheI und NindIII aufgeschlossen, Phenol/Choroform-extrahiert und in NheI/HindIII-linearisiertes und phosphatasiertes pBST+ geklont, um ein Plasmid pDB2264 (Fig. 17) zu erzeugen. Die DNA-Einsätze von pDB2262 und pDB2264 wurden sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen. Das Plasmid pDB2264 wurde zur Vervollständigung mit HindIII/NheI aufgeschlossen, und das dem 3'-Ende von UBC5 entsprechend 327 bp Fragment wurde isoliert und in pDB2262 geklont, welches mit HindIII/NheI linearisiert und phosphatisiert war. Das resultierende, pDB2275 bezeichnete Plasmid enthielt die 5'- und 3'-Enden des UBC5-Gens, welche durch einen einzigen Hindlll-Platz getrennt waren(Fig. 18). Das gesamte genomische URA3-Gen, welches als ein 1,2 kb HindIII-Fragment isoliert wurde, wurde mit HindIII in linearisiertes pDB2275 geklont und phosphatisiert, was die Plasmide pDB2276 (Fig. 19) und pDB2277 (Fig. 1) ergab, die sich voneinander nur durch die Orientierung des URA3-Markergens unterscheiden.
DS569-ura3 [pAYE329] wurde zur Uracilprototrophie mit dem unterbrechenden 5'- UBC5-URA3-UBC5-3'-Fragment transformiert, welches entweder von pDB2276 oder pDB2277 als 1,7 kb MluI-XbaI-Fragment isoliert worden war. Die rHA-Produktivität dieses Hefetransformanten wurde in 10 ml Schüttelkolbenkultur bestimmt. Die Hefe wurde in YNB-(Difco)-Minimalmedium geimpft, das mit Natriumphosphatl-citrat auf pH 6,0 gepuffert war und 2% Gewicht/Volumen Glukose enthielt, und bei 30ºC, 200 Umdrehungen pro Minute für 3 Tage inkubiert. Die rHA-Produktivität wurde durch Rocket-Immunelektrophorese gegen HSA-Standard (25-150 ug/ml) abgeschätzt. Die rHA-Produktivität von DS569 [pAYE329] wurde unter diesen Bedingungen zu ungefähr 40 mg/l berechnet, während die rHA-Produktivität von einigen der pDB2276 oder pDB2277-Transformanten, welche zur selben Zeit gemessen wurde, auf ein Niveau größer als das von DS569 [pAYE329] gestiegen war, welches zu ungefähr 60 mg/f berechnet wurde (Fig. 2).

LITERATURQUELLENLISTE

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Claims

1. Verfahren zum Erhöhen der Ausbeute eines Pilzzellen-abgeleiteten Produkts, das heterolog zu den Zelle ist, mit den Schritten:

(i) Bereitstellen einer Pilzzelle mit einem Plasmid, wobei das Plasmid eine funktionale, codierende Sequenz für ein Protein aufweist und wobei die Pilzzelle ein modifiziertes Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist, und

(ii) Kultivieren der Zelle, um das Pilzzellen-abgeleitete Produkt zu erzeugen.

2. Verfahren zum Erhöhen der Ausbeute eines Pilzzellen-abgeleiteten Produkts mit den Schritten:

(i) Bereitstellen einer Pilzzelle mit einem Plasmid, wobei das Plasmid eine funktionale, codierende Sequenz für ein Protein aufweist und wobei die Pilzzelle ein modifiziertes Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist,

(ii) Kultivieren der Zelle, um das Pilzzellen-abgeleitete Produkt zu erzeugen, und

(iii) Aufreinigen des Produkts zur anderweitigen Verwendung.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pilzzellen-abgeleitete Produkt ein gewünschtes Protein ist, das durch die codierende Sequenz codiert ist, wobei das modifizierte Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität niedriger als normal für die Zelle ist und wobei die Vervielfältigungsanzahl des Plasmids erhöht ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine Ubc4p- bzw. Ubc5p-Aktivität im wesentlichen von null aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, Wobei die Zelle eine Verbindung produziert, die mit der Bindung des Ubc4p- oder Ubc5p-codierten Produkts an sein Targetprotein wechselwirkt.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das UBC-Gen modifiziert wird, so dass im wesentlichen kein Protein davon erzeugt wird oder so dass jegliches davon erzeugte Protein ein reduziertes Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei mindestens ein Teil des UBC4- oder UBC5-Gens zerstört wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das UBC4- oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass das Ubiquitin-akzeptierende Cystein in jedem Protein, das von dem Gen erzeugt wird, fehlt oder von reduzierter Ubiquitin-akzeptierender Aktivität ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das UBC4- oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass jedes Protein, das von dem Gen erzeugt wird, von reduzierter Ubiquitin-Donatoraktivität ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das UBC4- oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass jedes Protein, das von dem Gen produziert wird, als Ergebnis einer Mutation von einer oder mehreren der ersten 21 Aminosäuren an dem N-Terminus des Proteins von reduzierter Aktivität ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das UBC4- oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass jedes Protein, das von dem Gen produziert wird, als Ergebnis einer Mutation in der ersten α-Helix (Reste 3-13) des Proteins von reduzierter Aktivität ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das UBC4-oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass jedes Protein, das von dem Gen produziert wird, als Ergebnis einer Mutation der Glutaminsäure an der Position 10 in der Primärsequenz von reduzierter Aktivität ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das UBC4- oder UBC5-Gen modifiziert wird, so dass jedes Protein, das von dem Gen produziert wird, als ein Ergebnis einer Lysin- oder Argininaminosäurensubstitution an der Position 10 in der Primärsequenz von reduzierter Aktivität ist.

14. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Zelle UBC4- oder UBC5-Antisense- mRNA produziert.

15. Verfahren nach einer der vorangehenden Ansprüche, wobei das Protein von der Zellkultur isoliert wird.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das gewünschte Protein ein pflanzliches oder ein tierisches Protein ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das gewünschte Protein ein humanes Protein ist.

18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pilzzelle Saccharomyces cerevisiae ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Plasmid ein 2 um-basiertes Plasmid ist.

20. Verwendung eines Mittels zum Variieren der Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität in einer Pilzzelle, um die Vervielfältigungsanzahl eines Plasmids in der Zelle zu steuern.

21. Pilzzelle mit einem reduzierten Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität und mit einem Plasmid, wobei das Plasmid eine funktionale, codierende Sequenz für ein Protein aufweist, welches Albumin, lmmunglobulin oder ein Fragment davon, (Hämo-)globin, ein Blutgerinnungsfaktor, ein Interferon, ein Interleukin, α&sub1;-Antitrypsin, Insulin, Calcitonin, ein Zelloberflächenrezeptor, Fibronectin, Pro-Urokinase, (Prae-Pro)-Chymosin, ein Antigen für ein Vaccin, t-PA, Tumornekrosefaktor, Erythropoietin, G-CSF, GM-CSF, Wachstumshormon, Blutplättchen-abgeleiteter Endothelialzellenwachstumsfaktor, Glukoseoxidase oder Superoxiddismutase ist.

22. Pilzzelle nach Anspruch 21, wobei das Protein Albumin ist.

23. Pilzzelle nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p- Aktivität auf nicht mehr als 50% des Wildtypniveaus reduziert ist.

24. Pilzzelle nach Anspruch 23, wobei das Niveau an Ubc4p- oder Ubc5p-Aktivität im wesentlichen null ist.

25. Pilzzelle nach Anspruch 24, wobei die S. cerevisiae-Zelle cirº ist.