DE69803193T2

DE69803193T2 - Verfahren zum Screenen von Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und Koaktivatoren

Info

Publication number: DE69803193T2
Application number: DE69803193T
Authority: DE
Inventors: J. Kushner; M. Uht; Paul Webb
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: JP2004154142A; ATE212053T1; AU735834B2; EP1007649B1; ES2166598T3; CA2284500A1; AU6943598A; WO1998045423A1; DK1007649T3; EP1007649A4; US6117638A; EP1007649A1; JP2001517087A; DE69803193D1

Description

ERKLÄRUNG BEZÜGLICH DER STAATLICH GEFÖRDERTEN FORSCHUNG

Die Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter der Bewilligungsnummer DK51083, zuerkannt von den National Institutes of Health und Bewilligungsnummer AIBS 562 zuerkannt von der US Army gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an diese Erfindung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Modulation der Genexpression auf der Transcriptions-Ebene. Die Verfahren umfassen das Anbinden eines Transcriptions- Coactivators an eine DNA-Bindungsdomäne, die spezifisch ist für ein Antwortelement, und Zusammenbringen des Coaktivators mit einem Transcriptionsfaktor.

Hintergrund

Die Expression von vielen Genen wird vermittelt durch Signale, die die Transcription des Gens erhöhen oder verringern. Z. B. kann das Vorhandensein oder Nicht- Vorhandensein eines Hormons oder einer anderen Verbindung in oder nahe an einer Zelle die Expression eines bestimmten Gens oder einer Familie von Genen innerhalb der Zelle ein- oder ausschalten. Die Regulierung der Genexpression als Antwort auf einen intrazellulären oder interzellulären Stimulus ist häufig erwünscht, so wie wenn eine solche Modulation zur Entwicklung des Organismus oder wegen der Möglichkeit des Organismus, sich an Veränderungen seiner Umgebung anzupassen, erforderlich ist. In einigen Fällen wird die Genexpression jedoch in unerwünschter Weise ein- oder ausgeschaltet. Z. B. legen gewisse Anzeichen nahe, daß die östrogen-vermittelte Genexpression an einigen Arten von Brust- oder Eierstockkrebs beteiligt ist.
Der Mechanismus, durch den Östrogen und andere Modulatoren der Transcription ihre Wirkung auf die Genexpression ausüben, ist komplex und noch nicht vollständig verstanden. Im Falle von Östrogen und anderen Steroid-Hormonen bindet das Hormon z. B. an einen Kernrezeptor, der für das Hormon spezifisch ist. Es wird angenommen, daß das Binden des Hormons an den Rezeptor zu einer Veränderung der Konformation führt, die es dem Rezeptor erlaubt, an bestimmte Zielstellen zu binden, die häufig als "Antwortelemente" bezeichnet werden, die sich stromaufwärts von Genen befinden, die durch das Hormon reguliert werden. Weitere Proteine sind an der Regulierung der durch die Kern-Hormon-Rezeptoren vermittelten Transcription beteiligt. Der Östrogen- Rezeptor (ER) bindet z. B. zwei Klassen von Coaktivatoren. Die erste Klasse, die als P160s bezeichnet wird, umfaßt SRC-1a und GRIP-1/TIF-2. Diese Proteine treten mit der Liganden-Bindungsdomäne (LBD) des Kernrezeptors in einer Weise in Wechselwirkung, die von dem Hormon und der Intaktheit der LBD-Transaktivierungsfuktion, AF2, abhängt. Onate et al., Science, 270: 1354-135 (1995); Voegel et al., EMBO J. 15: 3667- 367 5 (1996); Hong et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 93: 4948-4952 (1996); Halachmi et al., Science 264: 1455-1458 (1994); Cavailles et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91: - 10009-10013 (1994). Die zweite Klasse besteht aus CBP und dem nahe verwandten Protein P300, die erforderlich sind für die Transcriptions-Aktivierung durch CREB, Jun/Fos und eine wachsende Liste von Transcriptionsfaktoren. Kamei et al., Cell 85: 403-414 (1996); Chakravarti et al., Nature 383: 99-103 (1996); Smith et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93: 8884-8888 (1996); Hanstein et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93: 11540-11545 (1996); Janknecht und Hunter, Nature 383: 22-23 (1996). Die beiden Arten von Coaktivatoren sind wesentlich für ER-vermittelte Transcriptions-Aktivierung. Eine Überexpression von Gliedern der p160 Familie verstärkt die Kernrezeptor- Wirkung, während dominantes SRC-1a und GRIP-1 die Kernrezeptor-Wirkung blockieren. Onate et al., a.a.O.; Hong et al., a.a.O. Ähnlich potenziert eine Überexpression von CBR oder p300 die ER-Wirkung, während mikroinjizierte Antikörper gegen CBP die Kernrezeptor-Wirkung blockieren. Kamei et al., a.a.O.; Chakravarti et al., a.a.O. Da die p160s in vivo dicht an CBP und p300 gebunden sind (Kamei et al., a.a.O., Hanstein et al., a a.0.), und SRC-1a und CBP in vitro sowohl an TBP als auch an TFIIB binden (Swope et al., J. Biol. Chem, 271: 28138-28145 (1996); Kwok et al., Nature 370: 223- 226 (1994)), wurde hypothetisch ein Modell angenommen, bei dem ER wirkt, indem es den p160/CBP-Komplex dem Promotor anfügt und dieser Komplex eine Brücke zu der Grund-Transcriptions-"Maschinerie" (BTM) bildet.
Diese früheren Hypothesen erklären jedoch nicht alle Beobachtungen bezüglich der Regulation der Genexpression durch Hormone. Z. B. binden Tamoxifen und verwandte Anti-Östrogene, die angewandt werden, um hormon-abhängigen Brustkrebs zu behandeln, an das ER und blockieren seine Aktivierung durch Östrogen. Tamoxifen hat jedoch die unerwünschte Nebenwirkung, daß es östrogen-gesteuerte Gene in bestimmten Zellarten, wie Uteruszellen, eher aktiviert als reprimiert. Webb et al., Mol. Endocrinol. 9: 443-456. Es hat sich gezeigt, daß Promotor-Bereiche der durch diese Anti- Östrogene aktivierten Gene ein AP-1-Antwortelement aufweisen, anstelle eines Östrogen-Antwortelements, aber der Mechanismus, durch den Anti-Östrogene die paradoxe Wirkung der Repression der ER-vermittelten Transcription, aber Aktivierung der AP-1- vermittelten Transcription ausüben könnten, bleibt unbekannt. Andere Östrogen nachahmende Substanzen, wie bestimmte Pestizide und andere chemische Substanzen, können ein unangebrachtes Signal für bestimmte Gene liefern, die in unerwünschter Weise exprimiert oder reprimiert werden, was zu einer "Verweiblichung" von männlichen Lebewesen führt. Diese Östrogen nachahmenden Verbindungen können wie Östrogen wirken, auch wenn die nachahmenden Verbindungen chemisch mit Östrogen nicht verwandt zu sein scheinen. Andere chemische Verbindungen können die Wirkungen von anderen Arten von Signalmolekülen, wie Neurotransmittern oder Wachstumsfaktoren, in unangemessener Weise stimulieren oder unterdrücken.
Obwohl Methoden zum Modulieren der Genexpression zur Behandlung vieler Zustände sehr wertvoll wären, ist die Entwicklung derartiger Methoden bisher dadurch behindert worden, daß die Mechanismen, durch die Einheiten, wie Kern-Hormon- Rezeptoren, ihre Wirkung auf die Genexpression ausüben, noch nicht aufgeklärt sind. Daher besteht Bedarf an Methoden zum Modulieren der Genexpression und zum Identifizieren von Verbindungen, die in der Lage sind, Signal-vermittelte Veränderungen der Genexpression zu stimulieren oder zu unterdrücken. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Anforderungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung liefert Methoden zum Stimulieren der Expression eines Gens, das durch einen Transcriptionsfaktor reguliert wird. Die Methoden umfassen das Zusammenbringen einer Nucleinsäure, die das Gen von Interesse operabel an ein Antwortelement gebunden enthält, mit einem gebundenen Coaktivator. Der gebundene Coaktivator besteht aus Polypeptid, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptions-Coaktivator abgeleitet ist, und einer DNA-Bindungseinheit, die in der Lage ist, spezifisch an das Antwortelement zu binden. Der gebundene Cofaktor wird mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid in Kontakt gebracht, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist. Das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit dem aktivierten Transcriptionsfaktor- Polypeptid stimuliert die Expression des Gens. Der Transcriptionsfaktor kann z. B. ein Kernhormon-Rezeptor, wie der Östrogen-Rezeptor oder der Östrogen-Rezeptor-β oder ein AP1 Transcriptionsfaktor sein.
Nach einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung Methoden zur Repression der Expression eines Gens durch Zusammenbringen einer Nucleinsäure, die das Gen von Interesse operabel an ein Antwortelement gebunden enthält, mit einem gebundenen Coaktivator. Der gebundene Coaktivator enthält eine Aktivierungsfunktion, die von einem Transcriptions-Cofaktor abgeleitet ist, und eine DNA-Bindungseinheit, die in der Lage ist, spezifisch an das Antwortelement zu binden. Der gebundene Coaktivator wird voraktiviert und mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid in Kontakt gebracht, das eine Repressor-Funktion umfaßt, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist. Das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit dem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid unterdrückt (reprimiert) die Expression des Gens.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung liefert Methoden zum Identifizieren einer Testverbindung, die in der Lage ist, die Transcription eines Gens von Interesse zu modulieren. Die Methoden umfassen das Bereitstellen einer Nucleinsäure, die ein Reportergen umfaßt, das operabel an ein Antwortelement gebunden ist, und Zusammenbringen der Nucleinsäure mit einem gebundenen Coaktivator. Der gebundene Coaktivator umfaßt ein Polypeptid, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptions-Coaktivator abgeleitet ist, und eine DNA-Bindungseinheit, die in der Lage ist, spezifisch an das Antwortelement zu binden. Der gebundene Cofaktor wird mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid in Kontakt gebracht, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist, der an der Modulation der Expression des Gens von Interesse in seinem natürlichen Milieu beteiligt ist. Vor dem Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators wird das Transcriptionsfaktor- Polypeptid mit der Testverbindung in Kontakt gebracht. Die Expression des Reportergens wird nachgewiesen, um zu bestimmen, ob die Testverbindung eine Wirkung auf die Transcription hat.
Bei einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung Methoden zum Absuchen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, eine indirekte Östrogen-Antwort zu stimulieren oder zu unterdrücken. Die Methoden umfassen das Bereitstellen einer Zelle, die einen Östrogen-Rezeptor und ein Reportergen enthält, das durch eine AP1-Stelle reguliert wird. Ein gebundener Coaktivator wird so in die Zelle eingesetzt, daß er mit den Polypeptiden in Kontakt kommt, die mit der AP1 Stelle verbunden sind. Die Zelle wird auch mit der Testverbindung in Kontakt gebracht und die Expression des Reportergens wird nachgewiesen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1A-1B stellen Daten dar, die zeigen, daß das ER die Aktivität seiner eigenen Coaktivatoren potenziert. Fig. 1A: Coaktivatoren haben keine Wirkung auf die Transcription, wenn sie an DNA gebunden sind. Ein auf GAL4-DBD ansprechendes Reportergen wurde in HeLa Zellen transfiziert, zusammen mit Expressionsvektoren für GAL4- DBD, GAL4-DBD-Coaktivator-Fusionen oder ein GAL4 ER-LBD zum Vergleich. Expressionsfaktoren für freies SRC-1a und CBP wurden, wo angegeben, eingeschlossen. Die rechte Tafel zeigt den Einfluß von freien Coaktivatoren auf die ER-LBD getriebene Expression. Fig. 1B: ER potenziert die Aktivität von gebundenen Coaktivatoren. Die Transcriptionsaktivität von GAL4-DBD oder GAL4-Coaktivator-Fusionsproteine wurden in Zellen gemessen, die mit ER transfiziert und entweder mit Tamoxifen oder Östrogen behandelt worden waren. Schematische Diagramme der GAL4-Coaktivator-Fusionsproteine sind am oberen Rand des Diagramms angegeben. Die gestreiften und schraffierten Kästchen von CBP geben die ungefähren Stellungen von latenten Aktivierungs- Funktionen an.
Fig. 2A-2C stellen Daten dar, die zeigen, daß die ER Aktivierung von CBP p160s umfaßt. Fig. 2A: Die ER-Aktivierung von GAL-CBP wird weiter potenziert durch transfizierte p160s. Die Transcriptionsaktivität von GAL4-CBP wurde in Zellen aufgezeichnet, die mit ER und Expressionsvektoren für verschiedene native Coaktivatoren transfiziert und mit Hormonen behandelt worden waren, wie in Fig. 1B. Fig. 2B: ER aktiviert CBP durch die zu untersuchende p160-Bindungsstelle in der carboxy-terminalen CBP Domäne. Die Wirkung von ER auf die Transcriptions-Aktivierungsfähigkeit von GAL4-CBP Fusionsproteinen wurde bestimmt. Die linke Tafel zeigt ER-Wirkungen auf GAL4-CBP- Fusionen (Aminosäuren 1-460, 227-460 oder 1678-2441). Die Daten sind angegeben als Mehrfaches der Induktion gegen Aktivitäten, die in Abwesenheit von ER und Hormon erhalten wurden. Fig. 2C, rechte Tafel zeigt eine feinere Aufzeichnung, bei der die ER Induktion von GAL4-CBP1679-2441 mit der ER Induktion von GAL4-CBP-Fusionen mit kürzeren Bereiche des CBP Carboxy-Terminus verglichen wurde. Die Daten sind als korrigierte Lichteinheiten angegeben.
Fig. 3A-3B stellen Daten dar, die zeigen, daß ER-Transaktivierungsfunktionen erforderlich sind, um Coaktivatoren zu potenzieren. Fig. 3A: Expressionsvektoren für ER voller Länge (mit oder ohne die Valin-Substitution in Stellung 400), das isolierte LBD (Aminosäuren 282-595), ein LBD mit Alanin-Substitutionen in den Stellungen 543 und 544 (ursprünglich Methionin und Leucin) und einen Bereich, der die AB-Domäne und DBD (Aminosäuren 1-281) überspannt, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, GAL- SRC-1a und GAL-CBP zu potenzieren. Das Sternsymbol zeigt ER Expressionsvektoren, die den Wildtyp-Glycinrest in Stellung 400 enthalten. Die Aktivität der ER Aktivierungsfunktionen war auf den GAL4 Promotor gerichtet. Die Aktivität des auf das GAL4 ansprechenden Reportergens in Gegenwart von Expressionsvektoren für das GAL4- DBD, ein ER bei dem das GAL4-DBD das ER-DBD (E-GAL-E) ersetzt, und GAL4-Fusionen mit den LBD und AB Regionen von ER, die AF2 oder AF1 enthalten.
Fig. 4A-4B stellen Daten dar, die die Wechselwirkung von ER-Aktivierungsfunktionen mit p160s und CBP zeigen. Fig. 4A: Bindung von Coaktivatoren an ER. Die GST-Fusionsproteine waren p-GEX (Elternvektor, im Handel erhältlich von Pharmacia Biotech), GST-LBD oder GST-LBD mit einer Mutation in AF2, beide in Gegenwart von Ethanol als Träger, Tamoxifen bzw. Östrogen, und GST-AB (Aminosäuren 1-184). Die eingesetzten radioaktiv markierten Proteine waren SRC-1a voller Länge und GRIP-1, der Amino-Terminus war zwei Drittel des CBP und der Carboxy-Terminus ein Drittel des CBP. Die AF2-Mutation veränderte Aminosäuren 547 und 548 von Methionin bzw. Leucin in Alanin. Fig. 4B: SRC-1 a/GRIP-1 und ER binden getrennte Stellen auf dem C- Terminus von CBP. In vitro translatierte p160s und ER voller Länge wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, an die Fragmente von CBP, exprimiert als GST-Fusionsproteine, zu binden, die am oberen Rand angegeben sind. Der Bereich, von dem es sich gezeigt hat, daß sie bei Transfektions-Untersuchungen die stärkste Reaktion die auf ER ergibt (s. Fig. 2B, rechte Tafel) ist angegeben.
Fig. 5A-5B zeigen, daß die AP-1 Proteine Jun und Fos die CBP-Aktivität potenzieren. Fig. 5A: Die Wirkung von transfiziertem leerem von RSV getriebenem Expressionsvektor, c-Jun, c-Fos, Jun/Fos oder Jun ser63,73a1a wurden auf ihre Transcriptionsaktivität von GAL-CBP untersucht. Fig. 5B: Liganden, die zweite Botenwege einleiten, die die Jun Aktivierungsfunktion stimulieren, verstärken auch die jun Aktivierung von CBP. Der Versuch wurde wie bei Fig. 5A durchgeführt. Wo angegeben wurden transfizierte Zellen mit TNFα (10 ng/ml), EGF (10 ng/ml) oder PMA (100nM) oder entsprechenden Trägern behandelt.
Fig. 6A-6B stellen ein Modell für die ER Wechselwirkung mit dem Coaktivator- Komplex dar. ER bindet an DNA und die ER Transaktivierungsfunktionen wirken synergistisch auf Verstärkungen und lösen dann die Transaktivierungsaktivität des Coaktivator-Komplexes (CBP + p160) aus. Fig. 6B: Wenn der Coaktivator vorher DNA zugefügt worden ist, wird die Rolle des ER bei der Verstärkung umgangen und die Wirkung der ER Transaktivierungsfunktionen beim Auslösen der Transcriptionsaktivität von Coaktivatoren wird angezeigt..
Fig. 7 stellt Daten dar, die zeigen, daß Dexamethason den Glucocorticoid- Rezeptor aktiviert, um die Transcription zu unterdrücken, die durch gebundenes CBP, das durch Östrogen und seinen Rezeptor voraktiviert worden ist stimuliert wird.
Fig. 8 stellt Daten dar, die zeigen, daß Dexamethason die Transcription hemmt, die durch cyclisches 8-Brom-AMP und GAL-CBP in GT1 Zellen stimuliert wird.
Fig. 9 stellt Daten dar, die zeigen, daß das Anbinden eines Coaktivators an den Promotor ausreichend ist, um es der ER AF-1-Domäne zu erlauben, die Transcription stark zu stimulieren. Ein CAT-Reportergen mit einzelnen angrenzenden ERE- und GALRE-Stellen stromaufwärts einer TATA-Box wurde zusammen mit Expressionsfaktoren für ER, ER und GAL-GRIP1 oder ER und GAL-CBP in Gegenwart von Hormonen wie angegeben, transfiziert.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG

Definitionen:

Wie er hier verwendet wird umfaßt der Ausdruck "Transcriptionsfaktor" ein Polypeptid, das an der Stimulierung oder Unterdrückung der Genexpression beteiligt ist. Transcriptionsfaktoren sind allgemein angegeben in Barnes und Adcock, Clin. Exp. Allergy 25 Suppl. 2: 46-49 (1995) und Roeder, Methods Enzymol. 273: 165-171 (1996). Ein Transcriptionsfaktor ist in der Lage, an DNA in dem Regulations-Bereich eines Gens, das zumindest teilweise unter der Kontrolle des Transcriptionsfaktors exprimiert wird, zu binden.
Eine "von einem Transcriptionsfaktor abgeleitete Aktivierungsfunktion" bezieht sich auf den Teil eines Transcriptionsfaktors, der in der Lage ist, die Transcription zu stimulieren oder zu unterdrücken, wenn der Teil mit einem Coaktivator in Kontakt kommt.
Ein Transcriptionsfaktor-Polypeptid wird als "aktiviert" bzw. "stumm gemacht" bezeichnet, wenn es mit einem Liganden in Kontakt gebracht worden ist, der das Transcriptionsfaktor-Polypeptid so modifiziert, daß es imstande ist, die Transcription eines Gens zu stimulieren oder zu unterdrücken, das durch den speziellen Transcriptionsfaktor gesteuert wird.
Ein "Coaktivator" oder "Transcriptions-Coaktivator", wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfaßt ein Polypeptid, das erforderlich ist, um Transcriptionsaktivierung zu vermitteln. Coaktivatoren sind für die Grund-Transcription nicht erforderlich, aber sie sind beteiligt an der Stimulation der Expression eines Gens als Reaktion auf ein Signal. Coaktivatoren umfassen in ihrem nativen Zustand keine DNA bindende Domäne.
Ein Transcriptionsfaktor, Coaktivator oder sonstiger Transcriptionsvermittler wird als an der Modulation der Expression eines Gens in seinem natürlichen Milieu beteiligt, bezeichnet, wenn der Transcriptionsvermittler die Expression des Gens in seinem natürlich vorkommenden Zustand moduliert. Z. B. enthält das Gen das/die Antwortelemente und den Promotor, die die Expression des Gens, so wie es natürlich vorkommt, steuern.
Der Ausdruck "Ziel-Nucleinsäure" bezeichnet eine Nucleinsäure-Sequenz, an die ein Polypeptid oder eine komplementäre Nucleinsäure spezifisch binden kann. Wie hier verwendet, bedeutet "spezifisch binden an", wenn es sich auf das Binden eines Polypeptids oder einer komplementären Nucleinsäure an eine Ziel-Nucleinsäure bezieht, die Fähigkeit des Polypeptids oder der komplementären Nucleinsäure, an die spezielle Nucleotidsequenz unter Bedingungen, die nicht zu einer nennenswerten unspezifischen Bindung des Polypeptids an die Ziel-Nucleinsäure führen, zu binden "Untersequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nucleinsäuren oder Aminosäuren, die einen Teil einer längeren Sequenz von Nucleinsäuren bzw. Aminosäuren (z. B. Polypeptid) umfassen.
Der Ausdruck "im wesentlichen identisch" oder "im wesentlichen ähnlich" im Zusammenhang mit einem Polypeptid gibt an, daß ein Polypeptid eine Sequenz umfaßt, bei der mindestens 70% der Sequenz identisch sind mit einer Bezugssequenz oder vorzugsweise 80%, oder insbesondere 85% mit der Bezugssequenz identisch sind, vor allem sind 90% mit einem Vergleichsfenster von etwa 10-20 Aminosäureresten identisch. Ein Hinweis, daß zwei Polypeptidsequenzen im wesentlichen identisch sind, ist, daß ein Peptid immunologisch mit Antikörpern reagiert, die gegen das zweite Peptid gebildet worden sind. So ist z. B. ein Polypeptid mit einem zweiten Polypeptid im wesentlichen identisch, wenn die beiden Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Der Ausdruck "Rekombination" gibt, wenn er im Zusammenhang mit einer Zelle verwendet wird an, daß die Zelle eine heterologe Nucleinsäure repliziert, oder ein Peptid oder Protein exprimiert, das durch eine heterologe Nucleinsäure kodiert wird. Rekombinationszellen können Gene exprimieren, die sich nicht in der nativen (nichtrekombinanten) Form der Zelle finden. Rekombinationszellen können auch Gene exprimieren, die sich in der nativen Form der Zelle finden, wobei die Gene durch künstliche Maßnahmen modifiziert und wieder in die Zelle eingeführt werden.
Eine "Rekombinations-Nucleinsäure" umfaßt oder wird kodiert durch eine oder mehrere Nucleinsäuren, die von einer Nucleinsäure abgeleitet sind, die künstlich aufgebaut worden ist z. B. kann die Nucleinsäure eine geklonte Nucleinsäure umfassen oder von ihr kodiert werden, die gebildet worden ist durch Verbinden von heterologen Nucleinsäuren, wie es angegeben ist von Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology, Bd. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) und von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2.Aufl.) Bd. 1-3 (Sambrook) und in Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc. Wiley-Interscience, NY, NY, (1992). Wahlweise kann die Nucleinsäure chemisch synthetisiert sein.
Eine "heterologe Sequenz" oder eine "heterologe Nucleinsäure", wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist eine, die von einer fremden Quelle (oder Art) stammt, oder, wenn sie von der gleichen Quelle stammt, gegenüber ihrer ursprünglichen Form modifiziert ist. So stammt eine heterologe Nucleinsäure, die operabel an einen Promotor gebunden ist, von einer Quelle, die von derjenigen verschieden ist, von der der Promotor abgeleitet ist, oder, wenn sie von der gleichen Quelle stammt, ist sie gegenüber ihrer ursprünglichen Form modifiziert. Z. B. bezeichnet ein "heterologes Gen, das einen Transcriptionsfaktor kodiert", ein Transcriptionsfaktor-Gen, das in der speziellen Zelle normalerweise nicht vorhanden ist. Der Aufbau einer heterologen Sequenz kann z. B. das Behandeln der DNA mit einem Restriktionsenzym umfassen, um ein DNA- Fragment zu erzeugen, das operabel an den Promotor gebunden werden kann. Die Modifikation kann durch Techniken, wie ortsgesteuerte Mutagenese, auftreten.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung liefert Methoden zum Modulieren der Expression eines Gens oder einer Gruppe von Genen, in Transcriptions-Stärke. Sie liefert auch Methoden zum Identifizieren von Verbindungen, die in der Lage sind, die Expression eines Gens von Interesse zu modulieren. Diese Methoden beruhen auf der Feststellung, daß ein Transcriptions-Coaktivator, wenn er künstlich an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden ist, die für ein Antwortelement spezifisch ist, die Expression eines Gens, unter der Kontrolle des Antwortelements stimulieren oder unterdrücken, wenn der gebundene Coaktivator mit dem Transcriptionsfaktor in Kontakt gebracht wird. Überraschender Weise ist eine Bindung des Transcriptionsfaktors an die DNA direkt nicht erforderlich zur Modulation der Genexpression. Darüber hinaus kann der Grad, in dem die Expression des Gens moduliert wird, stark denjenigen übersteigen, der beobachtet wird, wenn die Modulation versucht wird durch Erhöhen der Menge an vorhandenem Transcriptionsfaktor. Das erleichtert die Verwendung der gebundenen Coaktivatoren bei hoch empfindlichen Assays zum Identifizieren von Verbindungen, die in der Lage sind, die Genexpression in Transcriptionsstärke zu modulieren.

A. Gebundene Coaktivatoren

Die bei den Methoden nach der Erfindung verwendeten gebundenen Coaktivatoren umfassen eine DNA-Bindungseinheit, die an eine Aktivierungsfunktion gebunden ist, die von einem Transcriptions-Coaktivator abgeleitet ist. Transcriptionsfaktoren, wie der Ausdruck hier verwendet wird, sind für die Grund-Transcription nicht erforderlich und können selbst nicht als Transcriptions-Aktivatoren wirken, teilweise auf Grund ihres Mangels an DNA-Bindungsdomänen. Coaktivatoren sind in der Lage, die Einleitung oder Unterdrückung (Repression) die durch andere Peptide, wie Transcriptionsfaktoren, hervorgerufen wird, die in der Lage sind, DNA zu binden, zu vermitteln. Coaktivatoren, von denen einer einen gebundenen Coaktivator bilden kann, umfassen sind aber nicht beschränkt auf solche, der p160-Familie und der p300-Familie. Die p160-Coaktivatoren, die SRC-1a und GRIP-1/TIF-2 umfassen, treten mit der Liganden-Bindungsdomäne (LBD) des Kernrezeptors in Wechselwirkung. Die p300 Familie von Coaktivatoren umfaßt CBP und das nahe verwandte Protein p300, die erforderlich sind für die Transcriptionsaktivierung durch CREB, Jun/Fos. Weitere Coaktivatoren, die an eine DNA- Bindungsdomäne gebunden und bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind z. B. angegeben von Gill und Tjian (1992) Curr. Op. Genet. Devel. 2: 236-242; Dynlacht et al. (1991) Cell 66: 563-576; Hong et al. (1996) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93: 4948-4952 und Janknecht und Hunter (1996) Nature 383: 22-23.
Gebundene Coaktivatoren, die für die erfindungsgemäßen Methoden geeignet sind, umfassen ein Coaktivator-Polypeptid voller Länge oder einen kleineren Teil des Coaktivators, der eine Domäne umfaßt, die für die durch den Coaktivator vermittelte Aktivierung (die "Aktivierungsfunktion") oder Repression (die "Repressionsfunktion") verantwortlich ist. Homologe von Coaktivatoren sind ebenfalls geeignet, um gebundene Coaktivatoren zu erzeugen. Aktive Teile der Transcriptions-Coaktivatoren, die zur funktionellen und/oder strukturellen Wechselwirkung mit Transcriptionsfaktor-Polypeptiden in der Lage und anderen Proteinen, die an der Einleitung der Transcription beteiligt sind, können mit Hilfe von hier beschriebenen Methoden identifiziert werden. Ein "Teil" eines gegebenen Coaktivators ist ein Peptid, das mindestens etwa zwanzig, vorzugsweise mindestens etwa 40 und insbesondere mindestens etwa 60, Aminosäuren des nativen Coaktivator-Polypeptids umfaßt. Um weitere Coaktivatoren und Teile von Coaktivatoren zu identifizieren, die für die erfindungsgemäßen Methoden geeignet sind, kann man den Coaktivator von Interesse oder einen Teil davon an eine DNA-Bindungsdomäne binden und die Fähigkeit eines Transcriptionsfaktors untersuchen, die durch den gebundenen Coaktivator vermittelte Transcription auszulösen oder zu unterdrücken.
Die gebundenen Coaktivatoren umfassen, neben einem Coaktivator-Polypeptid, eine DNA-Bindungsdomäne, die in der Lage ist, spezifisch an eine Ziel-Nucleinsäure zu binden. Die Zielstelle befindet sich typischerweise stromaufwärts von einem zu exprimierenden Gen. Die Zielstelle kann eine erkannte Stelle sein, an die ein die Transcription steuerndes Mittel binden kann, oder die Zielstelle kann einfach auf Grund ihrer Nähe zu dem Promotor des Gens ausgewählt werden. Verstärker, die ein Beispiel für eine Zielstelle sind, finden sich allgemein in verschiedenen Abständen stromaufwärts von den die Transcription einleitenden Stellen. S. z. B. US-PS 5 512 483, Mitchel und Tjian (1989) Science 245: 371; Ptashne und Gann (1990) Nature 346: 329 und Lewin (1990) Cell 61: 1161. Bei einer Ausführungsform ist die DNA-Bindungsdomäne spezifisch für ein Antwortelement, wie ein solches für ein Hormon, wobei in diesem Falle die DNA- Bindungsdomäne typischerweise den Teil eines Rezeptorproteins umfaßt, der an Hormon-Antwortelemente (HRE) auf der Chromatin DNA bindet. Die Grenzen für diese DNA-Bindungsdomänen sind identifiziert und charakterisiert worden für die Oberfamilie der Steroid-Hormone. S. z. B. Giguere et al. (1986) Cell 46: 645-652; Hollenberg et al. (1987) Cell 49: 39-46; Green und Chambon (1987) Nature 325: 74-78; Miesfield et al. (1987) Science 236: 423-427 und Evans (1988) Science 240: 889-895. Antwortelemente; einschließlich Glucocorticoid-Antwortelementen (GRE) und Östrogen- Antwortelementen (ERE), sind ebenfalls beschrieben, z. B. von Jantzen et al. (1987) Cell 49: 29; Martinez et al. (1987) EMBO J. 6: 3719 und Burch et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 1123. Zum Modulieren der Expression eines viralen Gens kann die Ziel- Nucleinsäure die Bindungsstelle für einen Transcriptionsfaktor sein, der an der Regulierung der Transcription des Gens beteiligt ist.
Während ein vollständiges Protein als eine DNA-Bindungsdomäne angewandt werden kann, sind Teile dieser Moleküle, die in der Lage sind, direkt oder indirekt an Nucleinsäuren zu binden, ebenfalls geeignet als DNA-Bindungsdomänen in den chimären gebundenen Coaktivatoren. Um derartige DNA-Bindungsdomänen zu identifizieren, kann man Assays durchführen, wie ein elektrophoretisches Mobilitäts-Verschiebungs- Assay (EMSA) (Scott et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 19848-19858), bei dem sich eine Nucleinsäuresequenz von Interesse mit verschiedenen Fragmenten eines Moleküls, das in der Lage ist, an die DNA-Sequenz zu binden, assoziieren kann. Die Assoziierung eines Teils des Proteins mit der Nucleinsäure führt zu einer Verlangsamung der elektrophoretischen Mobilität der Nucleinsäure. Ein anderes Verfahren, durch das man DNA-Bindungseinheiten identifizieren kann, die zur Verwendung als Leitdomänen geeignet sind, ist das DNasel-Footprint-Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist.
Für bestimmte Anwendungen hat ein gebundener Coaktivator eine DNA-Bindungsdomäne, die speziell an eine Ziel-Nucleinsäure bindet, die ein Gen reguliert, das üblicherweise nicht von dem speziellen Coaktivator kontrolliert wird. Z. B. kann die DNA- Bindungsdomäne von dem Hefe GAL4 Transcriptionsfaktor verwendet werden, um ein chimäres Protein zu erzeugen, das auch den ganzen oder einen aktiven Teil eines Coaktivators enthält, der an einer Hormon-regulierten Transcription beteiligt ist (z. B. GAL4DBD, gebunden an CBP, SRC-1a oder GRIP-1). Die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 ist z. B. beschrieben von Carey et al. (19989) J. Mol. Biol. 209: 423-432. Ein Vorteil der Anwendung einer DNA-Bindungsdomäne und eines entsprechenden Antwortelements, die normalerweise nicht Teil des Systems sind, an dem der Coaktivator beteiligt ist, liegt darin, daß der erhaltene gebundene Coaktivator mit einer heterologen DNA- Bindungsdomäne die Analyse der Aktivierungsfunktion getrennt von der DNA-Bindungsfunktion ermöglicht.
Die DNA-Bindungsdomäne kann entweder ein Polypeptid oder eine Nucleinsäure sein. Wenn die DNA-Bindungsdomäne eine Nucleinsäure ist, ist die Nucleinsäure in der Lage, spezifisch mit einer Ziel-Nucleinsäure-Stelle, wie einem Antwortelement, zu hybridisieren. Die Hybridisierung der Nucleinsäure mit der Zielstelle plaziert das Coaktivator-Polypeptid in eine geeignete Stellung zum Aktivieren oder Unterdrücken der Expression eines gebundenen Gens. Ein Beispiel für ein Oligonucleotid, das durch chemisches Kuppeln chemisch an ein Protein gebunden ist, ist angegeben von Corey et al. (1998) Biochemistry 28: 8277-8286.
Die Coaktivator-Domäne und die DNA-Bindungsdomäne sind miteinander verbunden unter Bildung eines gebundenen Coaktivators z. B. kann ein Cysteinrest an jedes Ende einer Domäne plaziert werden, so daß die Domäne z. B. durch eine Sulfidbindung gebunden werden kann. Die Modifizierung kann durchgeführt werden entweder durch Rekombinations- oder durch chemische Verfahren. Typischer werden die Coaktivator-Domänen und die DNA-Bindungsdomänen über Linker-Domänen miteinander verbunden, die typischerweise Polypeptidsequenzen sind, wie Polyglycin-Sequenzen mit zwischen etwa 5 und 200 Aminosäuren, wobei zwischen etwa 10 und 100 Aminosäuren typisch sind. Bei einigen Ausführungsformen sind Prolinreste in den Linker eingebaut, um die Bildung ion nennenswerten sekundären Strukturelementen durch den Linker zu vermeiden. Bevorzugte Linker sind häufig flexible Aminosäure-Untersequenzen, die als Teil eines Rekombinations-Fusionproteins synthetisiert werden. Bei einer Ausführungsform ist der flexible Linker eine Aminosäure-Untersequenz, umfassend ein Prolin, wie Gly(x)-Pro-Gly(x), wobei x eine Zahl zwischen etwa 3 und etwa 100 ist. Ein Linker kann auch eine einzelne Peptidbindung sein, oder ein oder mehrere Aminosäurereste. Bei anderen Ausführungsformen wird ein chemischer Linker verwendet, um synthetisch oder durch Rekombination hergestellten Coaktivator und DNA-Bindungsdomänen-Untersequenzen zu verbinden. Derartige flexible Linker sind dem Fachmann bekannt. Z. B. sind Poly(ethylenglykol)-Linker erhältlich von Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Diese Linker haben gegebenenfalls Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen oder heterofunktionelle Bindungen.
Die gebundenen Coaktivatoren werden üblicherweise hergestellt durch Rekombinations-Expression in einer Wirtszelle. Z. B. kann eine Nucleinsäure den gebundenen Coaktivator kodieren, oder entweder die DNA-Bindungsdomäne oder die Coaktivierungsdomäne können gebildet werden durch Verbinden von heterologen Nucleinsäuren, wie z. B. angegeben von Berger und Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) und von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2.Aufl.) Bd. 1-3 (Sambrook). Wahlweise kann die Nucleinsäure chemisch synthetisiert werden. Das spezielle Verfahren, das angewandt wird, um die Nucleinsäuren zur Expression des gebundenen Coaktivators in eine Wirtszelle einzuführen, ist nicht kritisch. Es kann irgendeines der bekannten Verfahren zum Einführen von fremden Nucleinsäuresequenzen in Wirtszellen angewandt werden. Die umfassen die Anwendung von Calciumphosphat-Transfektion, Späroplaste Elektroporese, Liposome, Mikroinjektion, Plasmavektoren, virale Vektoren und irgendeine von bekannten Methoden zum Einführen von geklonter genomen DNA, cDNA, synthetischer DNA oder anderem fremden genetischen Material in eine Wirtszelle (s. Berger, Ausubel und Sambrook, alle a.a.O.).

B. Modulation der Genexpression

Die Erfindung liefert Verfahren zum Modulieren der Expression eines Gens durch Zusammenbringen eines Antwortelementes, das operabel an das Gen gebunden ist, mit einem gebundenen Coaktivator. Der gebundene Coaktivator wird auch mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid in Kontakt gebracht, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist. Der bei diesen Verfahren verwendete gebundene Coaktivator umfaßt eine DNA-Bindungsdomäne, die in der Lage ist, spezifisch an eine Ziel-DNA-Sequenz in der 5'-flankierenden Region des zu exprimierenden Gens zu binden, allgemein eine Region, die sich unmittelbar stromaufwärts des Promotors befindet, der normalerweise die Expression des Gens antreibt. Die Ziel-DNA-Sequenz kann ein Antwortelement oder ein anderes erkanntes die Transcription steuerndes Element, das an der Regulierung der Expression des Gens beteiligt ist, sein oder nicht. Die DNA-Bindungsdomäne wirkt so, daß sie den Coaktivator in dem Promotor/Verstärker-Bereich des Gens positioniert, wo der Coaktivator nach Kontakt mit dem Transcriptionsfaktor-Polypeptid mit dem Grund-Transcriptionsmechanismus und/oder einem anderen Faktor, der an der Transcription beteiligt ist, in wechselwirkung tritt. Durch Auswahl einer Nucleotidsequenz, die in den 5'-flankierenden Regionen jedes Mitglieds einer Genfamilie vorhanden ist, als Zielstelle kann man eine einzige Art von gebundenem Coaktivator verwenden, um die Expression von mehreren Genen einer Familie zu modulieren.
Das Coaktivator-Polypeptid, das für eine spezielle Anwendung bevorzugt ist, kann zum Teil davon abhängen, welcher Weg der Transcriptions-Regulierung moduliert werden soll. Z. B. sind CBP/p300 und p160 Coaktivatoren, einschließlich SRC-1a und GRIP-1/TIF-2 geeignet, wenn ein Gen von Interesse durch einen Kern-Hormonrezeptor reguliert wird. Gebundene Coaktivatoren, die ein Coaktivator-Polypeptid umfassen, das von einem CBP/p300 Coaktivator abgeleitet ist, sind geeignet zur Modulierung der Expression von Genen, die durch verschiedene Transcriptionsfaktoren neben den Kern- Hormonrezeptoren reguliert werden, einschließlich den AP-1 Transcriptionsfaktoren (z. B. Jun, Fos), Sap-1a, MyoD und YY1. S. z. B. Janknecht a.a.O. Gene unter der Kontrolle von viral kodierten Transcriptionsfaktoren (z. B. VP16 von Herpesvirus, Protein X von Hepatitisvirus u. ä.) können auch moduliert werden unter Verwendung dieser gebundenen Coaktivatoren.
Wenn eine Modulation der Genexpression in vivo erwünscht ist, kann der gebundene Coaktivator in Form seines Polypeptids verabreicht werden oder er kann in der Zelle mit Hilfe eines Expressionsvektors exprimiert werden, der ein Gen umfaßt, das den gebundenen Coaktivator kodiert. Das Gen ist operabel an einen Promotor gebunden, der in den Zellen von Interesse exprimiert ist. Der Promotor kann konstitutiv in den Zellen exprimiert sein oder er kann induzierbar sein. Wenn z. B. ein gebundener Coaktivator in Zellen eines speziellen Gewebes erwünscht ist, wird ein gewebe-spezifischer Promotor verwendet, um die Expression des gebundenen Coaktivatorgens anzutreiben. Ähnlich kann, wenn es erwünscht ist, die Expression eines Gens in einem speziellen Entwicklungszustand zu modulieren, das gebundene Coaktivatorgen unter die Kontrolle einer durch die Entwicklung regulierten Promotor-Region gebracht werden. Alternativ kann das gebundene Coaktivatorgen unter die Kontrolle eines Promotors gestellt werden, der durch einen Stimulus induziert werden kann, der auf die Zelle ausgeübt wird wenn die Expression des gebundenen Coaktivatorgens erwünscht ist. Z. B. kann die Expression durch Verabreichung einer Verbindung eingeleitet werden, die den Promotor aktiviert.
Es sind vier Übergruppen von Transcriptionsfaktoren von denen man ein Transcriptionsfaktor-Polypeptid erhalten kann, bekannt: Die Übergruppe der Grunddomänen, die Familie der Zink-koordinierenden DNA-Bindungsdomänen, die Übergruppe der Helixgedrehten Helix und die Übergruppe der β-Gerüste (S. z. B. TRANSFAC Database, Wingender et al., Nucleic Acids Res. 24: 238-241 (1996). Z. B. kann das Transcriptionsfaktor-Polypeptid von einem Mitglied der Leucin-Zipper-Klasse, der Untergruppe der "Grunddomäne" erhalten werden z. B. von einem Mitglied der AP-1 Familie, das u. a. die jun und fos Unterfamilien einschließt. Die Cys4 Zink-Finger-Klasse der Überklasse der Zink-koordinierenden DNA-Bindungsdomänen, die Kern-Hormonrezeptoren umfaßt, ist ein anderes Beispiel für eine geeignete Quelle für Transcriptionsfaktor-Polypeptide. Dies Klasse umfaßt die Familie der Steroid-Hormonrezeptoren und die Thyroid- Hormonrezeptor-artige Familie von Transcriptionsfaktoren. Kern-Hormonrezeptoren sind Transcriptionsfaktoren, die die primär intrazellulären Ziele für kleine lipidlösliche Liganden, wie Steroid- und Thyroid-Hormone, Retinoide, Vitamin D3, Prostaglandine u. ä. darstellen. Die Bindung von Hormon oder einem Analogen an den Hormonrezeptor kann die Transcription von Genen induzieren, die durch Antwortelemente für den Hormonrezeptor reguliert wird.
Transcriptionsfaktor-Polypeptide umfassen eine Aktivierungsfunktion, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist. Die Kernrezeptoren bestehen z. B. aus verschiedenen konservierten Domänen, wie es gezeigt wird durch einen Sequenzvergleich (Krust et al. (1986) EMBO J. 5: 891) und Struktur/Funktions-Analysen (Giguere et al. (1986) Cell 46: 645; Kumar et al. (1987) Cell 51: 941, Kumar und Chambon (1988) Cell 55: 145 und Green und Chambon (1987) Nature 325: 75). Die DNA-Bindungsdomäne (DBD) die die am stärksten konservierte Domäne ist, ist in der Zentralregion lokalisiert und enthält einen 66-68 Aminosäure-Kern, bestehend aus zwei Zinkfingern. Eine Liganden-Bindungsdomäne (LBD, auch als Hormon-Bindungsdomäne (HBD) bezeichnet) ist an dem Carboxyl- Terminus vorhanden und der Amino-Terminus umfaßt eine Transcriptions-Aktivierungs-Domäne (AD). Diese Domäne, die innerhalb der Hormonrezeptoren weniger stark konserviert ist, enthält eine durch einen Liganden induzierbare die Transcription einleitende Funktion. Aktivierungs-Domänen können definiert werden als Polypeptid-Regionen, die, wenn sie mit der funktionellen DNA-Bindungsdomäne kombiniert werden, die Einleitung der produktiven Transcription durch RNA-Polymerasen erhöhen. Die gering konservierten N-terminalen A/B-Regionen der Glucocorticoid- und Östrogen-Rezeptoren enthalten auch die Transcription aktivierende Domänen. S. Hager und Archer in Nuclear Hormone Receptors: Molcular Mechanisms, Cellular functions and Clinical Abnormalities (Parker, M. G. Hrsg.), Academic Press Ltd. 217, 1991) und US-PS 5 512 483 für eine Übersicht von Kern-Hormonrezeptoren und ihre Strukturen. Im Falle des Östrogen-Rezeptors kann das Transcriptionsfaktor-Polypeptid AF1 und/oder AF2 enthalten.
Das Transcriptionsfaktor-Polypeptid, das den gebundenen Coaktivator auslöst oder unterdrückt kann für die Zelle exogen oder endogen sein; ein "exogenes" Transcriptionsfaktor-Polypeptid bezeichnet ein solches, das normalerweise nicht in der Zelle vorhanden ist, sondern zu der Zelle zugefügt worden ist, entweder als ein Polypeptid oder als das Expressions-Produkt eines heterologen Gens durch Anwendung eines Expressionsvektors. Wie oben für die Expression des gebundenen Coaktivators diskutiert, kann man durch entsprechende Auswahl eines Promotors die Expression des Transcriptionsfaktor-Polypeptids erreichen, wann und/oder wo es erwünscht ist.
Das Transcriptionsfaktor-Polypeptid kann zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren aktiviert werden. Die Aktivierung umfaßt das Zusammenbringen das Transcriptionsfaktor-Polypeptids mit einem Hormon oder Hormon-Analogen für das das Transcriptionsfaktor-Polypeptid eine Hormon-Bindungsdomäne hat. Andere Möglichkeiten Transcriptionsfaktor-Polypeptide zu aktivieren, umfassen z. B. die Stimulierung von Phosphorylierungs-Kaskaden (z. B. der MAP-Kinase- oder Proteinkinase A Kaskaden u. ä.) nach bekannten Methoden, wie der Verabreichung von Arzneimitteln oder Peptid-Hormonen (z. B. EGF u. ä.). Das Transcriptionsfaktor-Polypeptid kann vor, während oder nachdem der gebundenen Coaktivator an das Antwortelement bindet, aktiviert werden. Z. B. können ER und ERß aktiviert werden durch Verabreichen von Östrogen oder einem Östrogen-Analogen an den Rezeptor. Der Glucocorticoid-Rezeptor kann z. B. aktiviert werden durch Behandeln mit Glucocorticoid oder einem Glucocorticoid-Analogen, wie Dexamethason.
Bei einer Ausführungsform stimuliert das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einem Transcriptionsfaktor-Polypeptid die Expression des Gens. Dieses Verfahren ist geeignet, um z. B. die Expression eines Gens zu verstärken, für das eine stärkere Expression erwünscht ist, wie bei Krankheitszuständen, bei denen ein Gen in einer Zelle vorhanden aber gar nicht exprimiert ist oder nicht in ausreichendem Maße exprimiert ist. Zur Aktivierung der Genexpression wird bei einer bevorzugten Ausführungsform ein gebundener Coaktivator verwendet, der von einem Coaktivator der p160- oder CBP/p300-Familie abgeleitet ist, und das entsprechenden Transcriptionsfaktor-Polypeptid ist abgeleitet von einem Östrogen-Rezeptor (ER), einem Östrogen-β-Rezeptor (ERβ) oder einem AP-1 Transcriptionsfaktor, wie jun oder fos.
Bei einer anderen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet zur Unterdrückung (Repression) der Expression eines Gens. Dieses Verfahren ist geeignet in Situationen, in denen die Expression eines speziellen Gens unerwünscht ist, wie bei Krankheiten, die die Überexpression eines Gens oder die Expression eines speziellen Gens zu einem unpassenden Zeitpunkt umfassen. Zur Unterdrückung der Genexpression werden bei einer bevorzugten Ausführungsform ein gebundener CBP- Coaktivator und ein aktiviertes Transcriptionsfaktor-Polypeptid, das von einem Glucocorticoid-Rezeptor abgeleitet ist, verwendet. Die Verabreichung eines aktivierten Glucocorticoid-Rezeptor-Polypeptids an eine Zelle, die einen CBP-Coaktivator enthält, der an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden ist, kann die Fähigkeit des Östrogen-Rezeptors und von Östrogen unterdrücken, die Transcription des Gens zu stimulieren.
Diese Verfahren sind z. B. geeignet, die Transcription von zellulären oder viralen Genen zu stimulieren oder zu unterdrücken. Zur Behandlung eines Menschen oder eines Tiers können der gebundene Coaktivator und, soweit erforderlich, exogener Transcriptionsfaktor, als Polypeptide nach dem Fachmann bekannten Verfahren verabreicht werden. Z. B. kann das Polypeptid (können die Polypeptide) als pharmazeutische Zusammensetzungen zubereitet werden, die geeignet sind zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung, wie als Aerosol oder transdermal zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Vielfalt von Dosierungseinheiten verabreicht werden, abhängig von der Art der Verabreichung. Z. B. umfassen Dosierungseinheiten, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln und Pastillen. Es ist bekannt, daß die gebundenen Coaktivator-Polpeptide und Transcriptionsfaktor-Polypeptide, wenn sie oral verabreicht werden, gegenüber der Verdauung geschützt werden müssen. Das wird typischerweise erreicht, entweder durch Komplexieren des Proteins mit einer Zusammensetzung, um es gegen saure und enzymatische Hydrolyse beständig zu machen, oder durch Verpacken des Proteins in einen geeigneten beständigen Träger, wie ein Liposom. Mittel zum Schutz von Proteinen gegenüber der Verdauung sind bekannt.
Bei einer anderen Ausführungsform sind die Zusammensetzungen geeignet zur parenteralen Verabreichung, wie zur intravenösen Verabreichung oder zur Verabreichung in eine Körperhöhle oder in das Lumen eines Organs. Die Zusammensetzungen zur Verabreichung umfassen im allgemeinen eine Lösung des gebundenen Coaktivators, mit oder ohne Transcriptionsfaktor-Polypeptid, gelöst in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger. Es kann eine Vielfalt von wäßrigen Trägern verwendet werden, z. B. gepufferte Salzlösung u. ä. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von unerwünschten Substanzen. Diese Zusammensetzungen können nach üblichen bekannten Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch einen Wirkstoff enthalten, der das Transcriptionsfaktor-Polypeptid aktivieren kann, alternativ kann das Aktivierungsmittel getrennt verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um physiologischen Bedingungen nahezukommen, wie pH-einstellende und Puffermittel, die Toxizität einstellende Mittel u. ä., z. B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat u. ä. Die Konzentration des gebundenen Coaktivators in diesen Zubereitungen kann in weiten Grenzen variieren und wird ausgewählt in erster Linie bezogen auf die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, Körpergewicht u. ä., entsprechend der gewählten Verabreichungsart und dem Bedarf des Patienten.
So würde eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung etwa 0,1 bis 10 mg pro Patient und Tag betragen. Dosen von 0,1 bis zu etwa 100 mg pro Patient und Tag können angewandt werden, speziell wenn das Arzneimittel an eine abgeschlossene Stelle, wie eine Körperhöhle oder das Lumen eines Organs, und nicht in den Blutstrom verabreicht wird. Bei topischer Verabreichung sind wesentlich höhere Dosen möglich. Tatsächliche Methoden zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt oder offensichtlich und sind mehr im Detail beschrieben in Veröffentlichungen, wie Remington's Pharmaceutical Science, 15. Aufl. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)
Die Zusammensetzungen, die den gebundenen Coaktivator oder ein Gemisch davon (d. h. mit anderen Proteinen, wie einem Transcriptionsfaktor-Polypeptid) enthalten, können für therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Mittel an einen Patienten verabreicht, der an einer Krankheit oder einem anderen Zustand leidet, der durch eine Unterexpression oder Überexpression eines speziellen Gens oder einer Gruppe von Genen gekennzeichnet ist, in einer Menge, die ausreicht, die Krankheit und ihre Komplikationen zu heilen oder mindestens teilweise zum Stillstand zu bringen. Eine angemessene Menge, um dies zu erreichen, ist definiert als eine "therapeutisch wirksame Dosis". Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen ab von der Schwere der Krankheit und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten. Einmalige oder mehrfache Verabreichungen der Mittel können angewandt werden, abhängig von der Dosierung und Häufigkeit, wie es der Patient erfordert und verträgt. In jedem Falle sollte die Zusammensetzung eine ausreichende Menge der erfindungsgemäßen Proteine liefern, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Gentherapie kann auch angewandt werden, um Nucleinsäuren einzuführen, die den gebundenen Coaktivator und den Transcriptionsfaktor kodieren. Derartige Gentherapie-Verfahren wurden angewandt, um erworbene und ererbte genetische Defekte, Krebs und virale Infektionen in einer Vielzahl von Zusammenhängen zu korrigieren. Die Möglichkeit, künstliche Gene bei Menschen zu exprimieren, erleichtert die Verhütung und/oder Heilung von vielen wichtigen menschlichen Krankheiten, einschließlich vielen Krankheiten, die der Behandlung mit Hilfe anderer Therapien nicht zugänglich sind. Z. B. verbessert die in vivo Expression von Cholesterin regulierenden Genen, Genen, die selektiv die Replikation von HIV blockieren, und Tumor-unterdrückenden Genen bei menschlichen Patienten drastisch die Behandlung von Herzkrankheiten, AIDS bzw. Krebs. Eine Übersicht über Gentherapie-Verfahren findet sich bei Anderson, Science (1992) 256: 808-813, Nabel und Felger (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani und Caskey (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science 926-932; Dillon (1993) TIB- TECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer und Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiolgy and Immunology Doerfler und Böhm (Hrsg.) Springer Verlag, Heidelberg, Deutschland und Yu et al. Gene Therapy (1994) 1: 13-26.
Die Abgabe von Genen oder genetischem Material an die Zelle ist der erste kritische Schritt bei der Behandlung von Krankheiten durch Gentherapie. Dem Fachmann ist eine große Anzahl von Abgabemethoden bekannt. Derartige Methoden umfassen z. B. die Abgabe von reiner DNA durch Injektion oder durch Anwendung einer Teilchen- Bombardement-Vorrichtung (Felgner, US-PS 5 580 859), Genabgabe auf Liposom- Basis (Debs und Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino und Gould-Fogerite (1988) Bio Techniques 6(7): 682-691; Rose US-PS 5 279 833; Brigham (1991) WO 91/06309 und Felgner et al. (1987) Proc Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) sowie replikationsdefekte retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotid-Sequenz als Teil des Retrovirus-Genoms enthalten (s. z. B. Miller et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10: 4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43 und Cornetta et al. Hum. Gene Ther. 2: 215 (1991)). Verbreitet angewandte retrovirale Vektoren umfassen solche auf Basis von Mäuse- Leukämie-Virus (MuLV), Gibbonaffen-Leukämie-Virus (GaLV), Affen-Immun-Mangel- Virus (SIV), menschlichem Immun-Mangel-Virus (HIV) und Kombinationen davon. S. z. B. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66(5): 1 635-1640 (1992); Sommerfelt et al. (1990) Virol. 176: 58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63: 2374-2378; Miller et al. J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); Wong-Staal et al. PCT/US94/05700 und Rosenburg und Fauci (1993) in Fundamental Immunology, 3. Aufl. Paul (Hrsg.) Raven Press, Ltd., New York und die darin angegebenen Literaturstellen sowie Yu et al. Gene Therapy (1994) a.a.O.
Vektoren auf der Basis von Adenoviren werden ebenfalls verwendet, um Zellen mit Ziel-Nucleinsäuren zu transduzieren, z. B. bei der in vitro Produktion von Nucleinsäuren und Peptiden und in vivo und ex vivo Gentherapie-Verfahren. S. West et al. (1987) Virology 160: 38-47; Carter et al. (1989) US-PS 4 797 368; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94: 1351 und Samulski (a.a.O.) bezüglich einer Übersicht von AAV-Vektoren. Der Aufbau von Rekombinations-AAV-Vektoren ist in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich Lebkowski, US-PS 5 173 414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5(11): 3251-3260; Tratschin et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2072-2081; Hermonat und Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466-6470; McLaughlin et al. (1988) und Samulski et al. (1989) J. Virol., 63: 03822-3828. Zellinien, die durch rAAV transformiert werden können, umfassen solche, wie sie angegeben sind von Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell Biol., 8: 3988-3996.
Die Erfindung liefert auch Methoden zum Identifizieren von bisher unbekannten Coaktivatoren, die an der Kernrezeptor-vermitteleten Transcriptions-Regulation beteiligt sind. Eine Expressions-Bibliothek von cDNA-Molekülen wird erzeugt aus mRNA, die erhalten worden ist von einer Zelle, in der ein interessierendes Gen exprimiert ist. Das Expressions-Screening ist z. B. beschrieben von Ausubel a.a.O. Der für die Bibliothek verwendete Expressionsvektor umfaßt eine eine DNA-Bindungsdomäne kodierende Region, die an die Insertionsstelle für die cDNA-Klone angrenzt. Die DNAs der Expressions-Bibliothek werden zusammen mit einem Transcriptionsfaktor-Polypeptid, das auch durch Expression eines heterologen Gens geliefert werden kann, in eine Wirtszelle eingeführt. Ein Hormon oder ein Analoges, das an das Transcriptionsfaktor- Polypeptid bindet, wird ebenfalls in die Zellen eingeführt, wodurch das Transcriptionsfaktor-Polypeptid aktiviert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Wirtszellen auch ein Reportergen, das operabel an ein Antwortelement gebunden ist, das der DNA-Bindungsdomäne entspricht, die durch den Expressionsvektor kodiert wird. Klone, die eine Aktivierungsdomäne eines Coaktivators kodieren, lösen die Expression von Genen aus, die operabel an das Antwortelement gebunden sind.

C. Assay mit hohem Durchsatz auf die Transcription modulierende Verbindungen

Die Erfindung liefert auch Methoden und Zusammensetzungen zum Identifizieren von Mitteln, die geeignet sind zum Modulieren der Gentranscription. Diese Mittel sind geeignet zur Diagnose und Behandlung von Krankheitszuständen, die gekennzeichnet sind durch eine unerwünschte Transcription von einem oder mehreren Genen oder das Fehlen einer erwünschten Transcription. Derartige Krankheiten umfassen mikrobielle, durch Pilze und Viren verursachte Infektionen, Krebs, entzündliche Erkrankungen, Krebs, Immunerkrankungen u. ä. Die erfindungsgemäßen Methoden liefern Assays zum schnellen Identifizieren von Testverbindungen, die in der Lage sind, die Transcription eines interessierenden Gens zu modulieren.
Die durch die Erfindung gelieferten Assays zum Identifizieren von die Transcription modulierenden Verbindungen umfassen das Zusammenbringen eines Reportergens, das von einem Antwortelement kontrolliert wird, das stromaufwärts von einer Promotor- Sequenz lokalisiert ist, mit einem gebundenen Coaktivator und einem Transcriptionsfaktor-Polypeptid. Das Transcriptionsfaktor-Polypeptid wird mit der Testverbindung zusammengebracht, im allgemeinen vor dem Zusammenbringen des Transcriptionsfaktor- Polypeptids mit dem gebundenen Coaktivator und dem Antwortelement. Die Expression des Reportergens wird nachgewiesen, um zu bestimmen, ob die Transcription verglichen mit einem Vergleich erhöht, verringert oder unverändert ist,.
Bei einer Ausführungsform ist das Transcriptionsfaktor-Polypeptid abgeleitet von einem Transcriptionsfaktor, der an der Modulation der Expression eines interessierenden Gens in seinem natürlichen Milieu beteiligt ist. So hat eine Testverbindung, die die Fähigkeit des Transcriptionsfaktors beeinflußt, die durch den gebundenen Coaktivator vermittelte Transcription auszulösen oder zu unterdrücken, wahrscheinlich die gleiche Wirkung auf die Transcription des Gens in vivo.
Um zu bestimmen, ob eine spezielle Verbindung bei diesen Assays eine Wirkung auf die Transcription hat, wird günstigerweise ein Reportergen verwendet. Das Reportergen umfaßt typischerweise eine minimale Promotor-Sequenz, die operabel an ein Strukturgen gebunden ist, für das das Genprodukt, wenn es vorhanden ist, leicht nachgewiesen werden kann. Ein minimaler Promotor bezeichnet z. B. eine TATA-Box und ein Initiator-Element, enthaltend eine Transcriptions-Initiierungs-Stelle (Smale und Baltimore (1989) Cell 57: 103), die sich etwa 20 bis 50 Basen stromabwärts von der TATA- Box befindet. Typischerweise sind keine anderen Elemente stromaufwärts vorhanden. Der minimale Promotor kann von einem Säugetier oder von Viren stammen. Günstigerweise ist der minimale Promotor in einem Vektor vorhanden, der Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstellen stromaufwärts von dem Promotor zum Einfügen eines Antwortelements und stromabwärts von dem Promotor zum Einfügen des Reporter- Strukturgens umfaßt. Es ist eine Mehrzahl von Reportergen-Plasmid-Systemen bekannt, wie die gemeinsamen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)- und β- Galactosidase- (z. B. bakterielles lacZ-Gen) Reportersysteme, das Leuchtkäfer- Luciferase-Gen (s. z. B. Cara et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5393-5397), das grüne Fluoreszenz-Protein (s. z. B. Chalfie et al. (1994) Science 263: 802) und viele andere. Selektierbare Marker, die das Klonieren der Vektoren nach der Erfindung erleichtern, können gegebenenfalls mit vorhanden sein. Sambrook und Ausubel, beide a.a.O., geben eine Übersicht über selektierbare Marker.
Diese Assays werden typischerweise in vivo durchgeführt, wobei das Transcriptionsfaktor-Polypeptid und der gebundene Coaktivator in der Zelle von einem oder mehreren Expressionsvektoren gebildet werden. Ein Vektor, der das Reportergen trägt, kann auch in entsprechende Wirtszellen transfiziert werden. Alternativ können das Transcriptionsfaktor-Polypeptid und der gebundene Coaktivator als Polypeptide nach dem Fachmann bekannten Verfahren in die Wirtszelle übertragen werden. Das Transcriptionsfaktor-Polypeptid kann aktiviert (oder unterdrückt) werden durch Zusammenbringen mit einem Mittel, das für das spezielle Transcriptionsfaktor-Polypeptid geeignet ist. Die Expression des Reportergens wird nachgewiesen, um zu bestimmen, ob die Verbindung die Fähigkeit von aktiviertem Transcriptionsfaktor-Polypeptid, die Transcription zu stimulieren, hemmt oder die reprimierende Wirkung eines inaktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptids überwindet.
Die speziellen in den Screening-Assays angewandten Zellen sind nicht kritisch, so lange die Zellen die zusätzlichen Transcriptions-Komponenten, einschließlich dem Grund-Transcriptions-Mechanismus (BTM), die für die Transcription erforderlich sind, enthalten. Z. B. sind eukaryontische Zellen, einschließlich Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, als Wirtszellen geeignet.
Von besonderem Interesse sind Verbindungen, die die Stimulierung der Transcription von Genen, die an Krankheiten beteiligt sind, blockieren. Z. B. ist die Überexpression von Genen, die durch Östrogen und den Östrogen-Rezeptor reguliert werden, mit Brustkrebs verbunden. Ähnlich könnten Verbindungen, die in der Lage sind, die Coaktivator-vermittelte Expression von pathogenen Genen, einschließlich viralen Genen, zu blockieren, eine wirksame Behandlung von Krankheiten darstellen, die durch das Pathogen hervorgerufen werden. Derartige Gene, für die die Erfindung ein Screening- Verfahren für Inhibitoren liefert, umfassen solche unter der Kontrolle von einem viralen Promotor, wie einem HIV-1 oder HIV-2 LTRs, HTLV-LTRs, einem Herpesvirus tk Promotor, einem Vaccine-Promotor, einem Pockenvirus-Promotor, einem Influenzavirus- Promotor, einem Adenovirus Promotor usw.. Die Screening-Methoden sind auch geeignet zum Identifizieren von Verbindungen, die in der Lage sind, die Transcription von Oncognen, einschließlich viralen Oncogenen, wie dem E7 Gen von menschlichem Papillomavirus und dem E1A Gen von Adenovirus, sowie zellulären Oncogenen, wie Rb, E2F, myc, abl u. ä. zu modulieren. Bevorzugte Testverbindungen modulieren, vorzugsweise zerstören, die Wechselwirkung zwischen dem gebundenen Coaktivator und dem Transcriptionsfaktor-Polypeptid oder zwischen dem Transcriptionsfaktor-Polypeptid und seinem zugehörigen Liganden.
Die Erfindung liefert auch eine Methode zum Identifizieren von Verbindungen, die Hormone und andere Liganden bezüglich ihrer Wirkung auf die Transcription "nachahmen". Z. B. binden Tamoxifen und verwandte Anti-Östrogene, die zur Behandlung von hormonabhängigem Brustkrebs verwendet werden, an den ER und blockieren seine Aktivierung durch Östrogen. Tamoxifen hat jedoch die unerwünschte Nebenwirkung, daß es durch Östrogen gesteuerte Gene in bestimmten Zellarten, wie Uterus-Zellen aktiviert und nicht reprimiert. Webb et al., Mol. Endocrinol. 9: 443-456. Die Transcriptionsfaktoren jun und fos, die an AP1-DNA-Sequenzen binden, binden auch an den Coaktivator CBP. Im Rahmen der Erfindung wurde gezeigt, daß Östrogen und der Östrogen-Rezeptor jun/fos-gebundenes CBP anregen können, die Transcription von Genen zu stimulieren, die durch AP1 Stellen reguliert werden. Überraschenderweise ist ein Binden des ER an ein ER-Antwortelement für diese Aktivität nicht erforderlich.
Diese Feststellung ermöglicht ein Verfahren zum Screening einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit, diese sogenannte "indirekte" Östrogen-Antwort zu modulieren. Diese Methode umfaßt das Bereitstellen einer Zelle, die einen aktivierten Östrogen-Rezeptor und ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors und eine AP1 Stelle umfaßt. Die Zelle wird mit einem chimären Protein zusammengebracht, das eine DNA-Bindungseinheit umfaßt, die in der Lage ist, spezifisch an die AP1 Stelle zu binden, und ein Polypeptid, das eine Aktivierungsfunktion umfaßt, die von einem Transcriptions-Coaktivator abgeleitet ist. Die Zelle wird vor, währen oder nach dem Zusammenbringen mit dem chimären Protein mit der Testverbindung zusammengebracht. Die Expression des Reportergens wird nachgewiesen. Wenn die Expression in Gegenwart einer Testverbindung verringert ist, verringert die Verbindung die indirekte Östrogen-Antwort.
Andere Verbindungen, von denen angenommen wird, daß sie Östrogen "nachahmen", können auch zu einer unerwünschten Stimulierung von östrogen-regulierten Genen führen. Die Identifizierung von derartigen Verbindungen kann schwierig sein, da die Verbindungen manchmal nur eine geringe strukturelle Ähnlichkeit mit Östrogen haben. Die Erfindung liefert ein einfaches Mittel zum Bestimmen, ob eine spezielle Verbindung tatsächlich die Transcription von östrogen-regulierten Genen stimuliert.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind angegeben, um die vorliegende Erfindung zu erläutern und nicht, um sie einzuschränken.

Beispiel 1: Östrogen-Rezeptor löst die durch gebundenen p160-CBP-Coaktivator- Komplex vermittelte Expression aus

A. Materialien und Methoden

1. Plasmide

Es wurde ein Reportergen aufgebaut, indem ein Luziferase-Strukturgen unter die Kontrolle des Adenovirus E1b Minimal-Promotors gebracht wurde. Fünf GAL4 17-mer Antwortelemente wurden stromaufwärts des E1b Promotors angeordnet. Zum Zwecke dieser Untersuchungen wurde das Vektor-Grundgerüst modifiziert, um eine in pUC natürlich vorhandene AP-1 Stelle zu entfernen (Kushner et al., Mol. Endocrinol. 8: 405-407 (1994)).
Ein Gen, das ein Fusionsprotein kodiert, das von dem Östrogen-Rezeptor (ER) abgeleitet ist (E-GAL-E, Fig. 3B), bei dem die GAL4 DNA-Bindungsdomäne (GAL4- DBD) die Östrogen-Rezeptor DNA-Bindungsdomäne (ER-DBD) ersetze. E-GAL-E wurde aufgebaut nach Standard-Spleißen durch überlappende Extensions PCR Verfahren und enthält Sequenzen für ER-AB (Aminosäuren 1-184), GAL4-DBD (Aminosäuren 1- 147) und die ER-Gelenk/LBD (Aminosäuren 250-595). Expressionsvektoren für die Wildtyp ER-LBD und die ER-LBD AF2 Mutante wurden aufgebaut durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung des Vektors HE-14 (Chambon). Alle anderen ER- Expressionsvektoren wurden früher beschrieben von Webb et al., Mol. Endocrinol. 9: 443-456 (1995).
Ein von CMV angetriebener Expressionsvektor für SRC-1a (Aminosäuren 1- 1462) und GAL-SCR-1a wurden ebenfalls hergestellt. GRIP-1-1 cDNA voller Länge wurde von einem Hefe Expressionsvektor als ein EcoRI Fragment isoliert und wieder in den SV-40 getriebenen Expressionsvektor SG5 kloniert. GAL4-CBP Fusionen wurden früher beschrieben (Swope et al., J. Bio. Chem. 271: 28138-28145 (1996); Kwok et al., Nature 370: 223-226 (1994)). Der CBP Expressionsvektor voller Länge ist beschrieben von Kamei et al., Cell 85: 403-414 (1996).
Glutathion-S-transferase (GST)-Fusionsproteine für Mäuse ER-LBD (Aminosäuren 313-599) und die ER-LBD-AF2 Mutante (Umwandlung der Aminosäuren 547 und 548 von Methionin bzw. Leucin in Alanin) und GST-AB sind beschrieben (Webb et al. a.a.O.; Cavailles et al. EMBO J. 14: 3741-3751 (1995)). GST-CBP Fusionsproteine wurden früher beschrieben von Yang et al., Nature 382: 319-324 (1996). Das Aminoterminale CBP Protein wurde erzeugt durch Klonen von CBP cDNA voller Länge in SG5 als ein BamHI-Fragment. Wie früher gezeigt, führt dies zu einem Protein von etwa 170 kD, das Amino-terminalen zwei Drittel des CBP Moleküls enthält (Chakravarti et al., Nature 383: 99-103 (1996)). In vitro translatierter CBP C-terminaler Expressionsvektor (1678-2441) wurde früher beschrieben Kwok et al., Nature 370: 223-226 (1994)),

2. Transfektionen

HeLa Zellen wurden wie von Webb et al. a.a.O. beschrieben transfiziert. Die Transfektionen umfaßten 5 ug des GAL4 Antwort-Reportergens, 1 ug GAL4-DBD/- Coaktivator-Expressionsvektoren, 1 ug pJ3-b-GAL Vektor zur Normalisierung der Transfektions-Effizienz, 5 ug ER und 5 ug native Coaktivator-Expressionsvektoren. Wo angegeben, wurden für die Transfektionen 3 ug jun oder fos Expressionsvektoren verwendet. Östrogen wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 nM zugegeben und Tarnoxifen auf 5 mM.

3. In vitro Bindungsassays

In vitro Bindungsassays wurden wie früher von Webb et al., a.a.O. beschrieben durchgeführt.

B. Ergebnisse und Diskussion

Vor den hier beschriebenen Versuchen hat ein hypothetisches Modell nahegelegt, daß Coaktivatoren als Brücken zwischen einem DNA gebunden Transcriptionsfaktor und dem Grund-Transcriptions-Mechanismus (BTM) wirken. Dieses Modell besagte, daß, wenn der Coaktivator einmal zu einem Promotor zugefügt worden ist, der Transcriptionsfaktor verzichtbar wird und der Coaktivator in der Lage sein sollte, die Transcription selbst zu aktivieren. Um diese Vorstellung zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von ER-LBD und seinem Coaktivator untersucht, die Transcription zu aktivieren, wenn er direkt an DNA gebunden ist (Fig. 1A). Während das mit der Hefe GAL4 DNA- Bindungsdomäne (GAL-LBD) verschmolzene ER-LBD einen GAL4 Antwort-Ziel-Promotor in Gegenwart von Östrogen wirksam aktivierte, waren weder GAL-SRC-1a noch GAL-CBP in der Lage, die Transcription einzuleiten. Eine Überprexpression von Kombinationen von Coaktivatoren, entweder frei oder als GAL4 Fusionsproteine, aktivierte die GAL4 Antwort-Transcription auch nicht. Das stimmt mit den früheren Ergebnissen überein, die zeigen, daß sowohl SRC-1a als auch CBP (Swope et al., Kwok et al., beide a.a.O.) starke latente Transaktivierungsfunktionen besitzen, aber die Transcription in ihrer vollen Länge nur schwach aktivieren. Freies SRC-1a, GRIP-1 und CBP waren imstande, die Transcriptionsaktivität von ER-LBD zu potenzieren. So nehmen SRC-1a und CBP an der Transcriptions-Akivierung durch ER-LBD teil, sind jedoch nicht ausreichend, um die Transcription zu vermitteln, wenn sie direkt einem Promotor zugefügt worden sind.
Eine Erklärung für das scheinbar paradoxe Verhalten der ER Coaktivatoren ist, daß ein ER Kontakt erforderlich sein könnte, um die Aktivität des p160-CBP-Komplexes auszulösen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde die übliche Konfiguration des Transcriptionsfaktors und Coaktivators an einem Promotor umgekehrt. Es wurde untersucht, ob ER in Abwesenheit seiner zugehörigen DNA-Bindungsstelle die Aktivität von entweder p160s oder CBP potenzieren würde, wenn der Coaktivator an DNA gebunden wäre. Fig. 1 B zeigt, daß ein GAL4-SRC-1a Fusionsprotein die Transcription in Abwesenheit von Östrogen nur schwach aktivierte aber stark entweder in Gegenwart von Östrogen oder dem gemischten Agonisten/Antagonisten Tamoxifen. ER war auch in der Lage, die mäßige Aktivität einer GAL4 Fusion mit GRIP-1 und die Aktivität von GAL- CBP zu potenzieren. Sowohl Östrogen als auch Tamoxifen induzierten die Promotor- Aktivität nicht, wenn das isolierte GAL4-DBD als Aktivator verwendet wurde oder wenn ER bei der Transfektion weggelassen wurde. ER potenzierte auch andere transcriptionsaktive GAL4 Fusionsproteine, wie GAL4-SP1 nicht. ER ist daher spezifisch in der Lage, die Transcriptions-Aktivität seiner Coaktivatoren SRC-1a, GRIP-1 und CBP zu potenzieren.
Da es bekannt ist, daß die p106 s in vivo mit CBP in Wechselwirkung treten, hat man sich gefragt, ob entweder SRC-1a oder GRIP-1 an der ER-Wirkung auf GAL-CBP beteiligt sein könnten. Es wurde zunächst untersucht, ob die Überexpression der p160s die Wirkung von ER auf CBP beeinflussen würde. Fig. 2A zeigt, daß transfiziertes SRC-1a und GRIP-1 beide die Tamoxifen- und Östrogen-Wirkung auf GAL-CBP potenzierten. Eine kürzere Version von GRIP-1 (Aminosäuren 322-1141), die als dominant negativer Inhibitor der Kernrezeptor-Wirkung wirkt (Hong et al. a.a.O.) hemmte die ER- Wirkung auf CBP. Eine Überexpression von CBP (oder p300, nicht gezeigt) verringerte ebenfalls die ER-abhängige Aktivierung von GAL-CBP um etwa 70%. Das beruhte vermutlich nicht auf den unspezifischen Wirkungen auf die Transcription, da die Überexpression von CBP die Aktivität des GAL4/ER-LBD Fusionsproteins verstärkte (Fig. 1A), und beruhte wahrscheinlicher auf der Titration eines begrenzenden Coaktivators. So wird die ER-Wirkung bei GAL4-CBP spezifisch verstärkt durch SRC-1a und GRIP-1, was nahelegt, daß die p160s an der ER-Potenzierung der CBP-Aktivität beteiligt sind.
Anschließend wurde untersucht, ob die ER-Regulation der CBP-Aktivität in dem Bereich innerhalb des CBP Carboxy-Terminus kartiert ist, der an der SRC-1a Bindung beteiligt ist (Fig. 2B). ER war in der Lage, die Aktivität der Carboxy-terminalen Domäne (Aminosäuren 1678-2441), die mit GAL4 verschmolzen waren, stark zu potenzieren. Im Gegensatz dazu zeigten die verbliebenen Teile von CBP höchstens eine mäßige Antwort auf ER-Liganden. Ferner zeigte eine Kartierung innerhalb des CBP C-Terminus, daß die stärkste ER Regulation der Transcriptions-Aktivität mit einem Fragment von CBP erhalten wurde, das die Aminosäuren 2060-2174 überspannte. Das stimmt überein mit der Lokalisierung der latenten Carboxy-terminalen CBP Aktivierungs-Funktion (Swope et al., a.a.O.) und ebenso mit der Stelle für die SRC-1a- (Kamei et al., a.a.O.) und die GRIP-1 Bindung (s.u.). Die Tatsache, daß die Stelle für die ER-Wirkung auf CBP auf die Stelle der p160 Bindung fällt, stimmt mit der Rolle von p160s bei der ER- Regulation der CBP-Aktivität überein.
ER besitzt, wie andere Kenrezeptoren, eine Carboxy-terminale LBD, die starke Liganden-induzierte Transcriptions-Aktivierungs-Funktion AF2, eine zentral lokalisierte DBD und eine Amino-terminale (AB) Domäne enthält, die eine schwache konstitutive Aktivierungs-Funktion AF1 enthält (Tora et al., Cell 59: 477-487 (1989); Berry et al., EMBO J. 9: 2811-2818 (1990); Kumar et al., Cell 51: 941-951 (1987) und Lees et al., Nucl. Acids Res. 17: 5477-5488 (1989)). Es wurde untersucht, ob diese üblichen Transaktivierungs-Funktionen für die ER-Potenzierung der SRC-1a- und CBP-Aktivität erforderlich waren (Fig. 3). Bemerkenswerter Weise potenzierte das isolierte ER-LBD die Aktivität von beiden Coaktivatoren in östrogenabhänger Weise, selbst in Abwesenheit von ER-DBD. Eine Mutation, die AF2 zerstörte (L543, M544A) vernichtete die östrogenabhängige Aktivierung. So ist AF2 erforderlich für die LBD, um eine Östrogen-Antwort sowohl an SRC-1a als auch an CBP zu vermitteln. Die ER AB-DBD Region potenzierte auch stark die Aktivität von GAL-SRC-1a und GAL-CBP auf Niveaus, die denjenigen ähnlich waren, die mit Tamoxifen-Liganden ER erhalten wurden. Das Weglassen der AB-Domäne löschte sowohl die konstitutive Aktivierung durch die AB-DBD Region als auch die Tamoxifen-Aktivierung durch ER voller Länge (nicht gezeigt) aus. So aktiviert AF1, das in der AB Domäne vorhanden ist, sowohl gebundenes SRC-1 y als auch CBP. Es kann gefolgert werden, daß die ER-Wirkung auf Coaktivatoren, wie die ER-Wirkung auf klassische Östrogen-Antwortelemente AF1 und AF2 umfaßt.
Da AF1 allgemein schwach ist, wenn ER an DNA gebunden ist, aber noch stark ist in der Potenzierung von gebundenen Coaktivatoren, wurde bestätigt, daß AF1 und AF2 sich normal verhielten, wenn sie direkt dem GAL4 Antwort-Promotor zugefügt worden waren im Zusammenhang mit einer ER Fusion, bei der das GAL4-DBD das ER- DBD ersetzte (E-GAL-E, Fig. 3B). So ist AF1 schwach, wenn es an DNA gebunden ist, aber stark in der Potenzierung von gebundenen Coaktivatoren, selbst im Zusammenhang mit dem gleichen Promotor. Die relative Stärke von AF1 bei der Aktivierung von gebundenen Coaktivatoren erklärt, warum Tamoxifen-Liganden-ER, dessen Aktivität AF1 reflektiert (Berry et al., a.a.O.) sowohl SRC-1a als auch CBP stark aktiviert.
Anschließend wurde untersucht, ob die beiden biologisch aktiven Regionen des ER-Moleküls, die LBD und AB Domäne, in der Lage waren, entweder die p160s oder CBP in vitro zu binden. Wie erwartet, trat das ER-LBD sowohl mit SRC-1a als auch mit GRIP-1 in östrogenabhängiger, AF2 empfindlicher Weise in Wechselwirkung (Fig. 4A). Im Unterschied zu anderen Kernrezeptoren (Kamei et al., Chakravarti et al., beide a.a.O.) band das ER-LBD nicht an den CBP Amino-Terminus. Das LBD band an den Carboxy-Terminus von CBP aber schwach und in einer Liganden- und AF2- unabhängigen Weise. So bindet das ER-LBD p160s und nicht CBP in einer Weise, die parallel ist zu der Östrogen- und AF2-abhängigen Fähigkeit des ER-LBD, gebundene Coaktivatoren zu stimulieren (Fig. 3A).
Da AF1 in der Lage war, die SRC-1a- und CBP-Wirkung zu potenzieren, wurde untersucht, ob die AB Domäne, die AF1 enthält, auch mit Gliedern des Coaktivator- Komplexes in Wechselwirkung treten kann (Fig. 4A). Die ER-AB-Domäne bindet sowohl an SRC-1a als auch an GRIP-1, obwohl weniger stark als das LBD. Die AB-Domäne trat weder mit dem CBP Amino-Terminus noch mit dem CBP-Carboxy-Terminus in Wechselwirkung. So haben beide ER-Aktivierungsfunktionen, AF1 und AF2, das Potential. funktionell mit dem Coaktivator-Komplex durch Binden von p160 Proteinen in Wechselwirkung zu treten.
Anschließend wurden die relativen Positionen der Bindungsstellen sowohl für die p160s als auch ER innerhalb des CBP Carboxy-Terminus kartiert. Fig. 4B zeigt, daß SRC-1a hauptsächlich mit einem Fragment (D) in Wechselwirkung trat, das sich von Aminosäuren 2041-2240 erstreckte, was mit anderen Berichten übereinstimmt, die die SRC-1a Bindungsstelle in diesen Bereich gelegt haben (Kamel et al., a.a.O.^). GRIP-1 trat auch mit diesem Fragment von CBP in Wechselwirkung, wenn auch stärker als SRC-1a. Im Gegensatz dazu band das ER spezifisch an zwei Fragmente des CBP-C- Terminus, der sich von Aminosäuren 1678-2000 erstreckte (A und B) und überlappte nur von Aminosäuren 1801-1880. Weder SRC-1a noch GRIP-1 oder ER traten mit dem Amino-terminalen Teil von CBP in Wechselwirkung (Daten nicht gezeigt). So bindet der Bereich des C-Terminus von CBP, der am stärksten von ER beeinflußt wird, (Fig. 2C) SRC-1a und GRIP-1, aber nicht ER. Es wird daraus geschlossen, daß die ER- Wechselwirkungen mit endogenen p160s der Fähigkeit von ER unterliegen, gebundenes CBP zu aktivieren, wie in Fig. 2A gezeigt. Das zeigt eine zentrale Rolle von ERIp160 Kontakten bei der Potenzierung der Coaktivator-Funktion.
Um zu untersuchen, ob andere Transcriptionsfaktoren die Coaktivator-Funktion ebenfalls potenzieren könnten, wurde untersucht, ob die AP-1 Protein Jun und Fos, die beide CBP binden (Arias et al., Nature 370: 226-229 (1994); Bannister et al., Oncogene 11: 2509-2514 (1995); Bannister et al., EMBO J. 14: 4758-4762 (1995)) in der Lage wären, die CBP-Wirkung zu regulieren. Fig. 5A zeigt, daß sowohl Jun als auch Jun/Fos die Aktivität von CBP voller Länge potenzierten. Die Fähigkeit von AP-1-Proteinen, CBP zu aktivieren, hängt ab von Transcriptions-Aktivierungs-Funktionen, da eine Mutation (ser63,73 ala), die die Transcription Aktivität von Jun verringert, auch die Fähigkeit von Jun verringert, die CBP Aktivität zu potenzieren (Bannister et al., Oncogene, a.a.O.). Die Jun-Aktivierung von CBP voller Länge wurde ferner auch induziert durch Behandlungen mit TNFα, EGF oder PMA, von denen jedes die Aktivität der c-Jun-Transaktivierungs-Funktion verstärkt durch einen Mechanismus, der einen CBP Kontakt erfordert (Arias et al., Bannister et al., a.a.O.). Die Tatsache, daß zwei verschiedene Arten von Transcriptionsfaktoren, ER und Jun/Fos, die Aktivität ihrer Coaktivator-Proteine potenzieren können, legt nahe, aaß die Fähigkeit von Transcriptionsfaktoren, Coaktivatoren zu regulieren, weit verbreitet sein kann.
Zusammenfassend wird vorgeschlagen, daß, wenn Transcriptionsfaktoren, wie ER, an DNA gebunden sind, sie mit Coaktivatoren in zwei Stufen in Wechselwirkung treten (Fig. 6A). Zunächst verstärkt ER den Coaktivator-Komplex. Als Zweites löst ER in einer bisher unbekannten Stufe die Aktivität des Coaktivator-Komplexes aus. Wenn der Coaktivator künstlich an DNA gebunden ist, was die Rolle des ER bei der Verstärkung umgeht, zeigt sich die Rolle des ER beim Auslösen (Fig. 6B). Während die Arbeiten nicht darauf gerichtet sind, wie ER die Aktivität des Coaktivator-Komplexes auslösen kann, konnte ER im Grunde getrennte Kontakte mit Grund-Transcriptionsfaktoren ausnutzen, um den allgemeinen Transcriptions-Mechanismus an dem Promotor zu stabilisieren, dazu beizutragen, den Coaktivator-Komplex aufzubauen, oder einzelne Coaktivatoren von einem inaktiven in einen aktiven Zustand zu überführen. Unabhängige Beweisführungen zeigen auch, daß Aktivatoren getrennte Verstärkungs- und Auslöse- Funktionen für die Transcription haben. Z. B. bindet der Aktivator CREB CBP nach Stimulierung mit cyclischem AMP, aber eine Mutation in der Aktivierungs-Domäne.
Ser142Asp, die eine normale, durch cyclisches AMP induzierte Bindung der CREB Aktivierungsfunktion an CBP erlaubt, hebt trotzdem die Transcriptions-Aktivierung auf (Sun & Maurer, J. Biol. Chem. 270: 7041-7044 (1995)). Das stimmt überein mit der Vorstellung, daß die CREB-Mutante verstärken aber nicht auslösen kann. Ähnlich kann, wenn der ER AB-DBD Bereich an DNA gebunden ist, das freie LBD die Transcription in Gegenwart von Östrogen weiter stimulieren (McInerney et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93: 10069-10073 (1996); Kraus et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 12314- 12318 (1995)). Dieses überraschende Ergebnis kann erklärt werden durch die Feststellung, daß die AB-DBD Region den Coaktivator-Komplex verstärken würde und das freie LBD in der Lage ist, ihn auszulösen.
Die Tatsache, daß ER Coaktivatoren wie CBP die vorher künstlich an DNA angefügt worden sind (Fig. 6B) auslösen kann, beinhaltet auch, daß ER CBP, das durch andere Transcriptionsfaktoren verstärkt worden ist, auslösen könnte. In zusätzlich durchgeführten Versuchen verstärkte ER, das die AP-1 Aktivität stimuliert (Gaub et al., Cell 63: 1267-1276; Webb et al., Mol. Endocrinol. 9: 443-456 (1995); Umayahara et al., J. Biol. Chem. 269. 16433-16442 (1994) und Philips et al. J. Biol. Chem. 268: 14103- 14108 (1993)), die Aktivität von CBP, das an die Aktivierungs-Funktionen von Jun, Fos und Elk-1 gebunden ist. So hat ER neben dem bekannten klassischen Weg, bei dem ER an DNA bindet und Coaktivatoren verstärkt, um die Genexpression zu stimulieren, ein weitreichendes Potential, die Genexpression durch Transcriptionsfaktoren, die CBP als Coaktivator verwenden, zu regulieren.
Schließlich erfordert das kombinierte Verfahren des Verstärkens und Auslösens, wenn ER DNA bindet (Fig. 6A), die synergistische Aktivität von AF1 und AF2, von denen keines isoliert gut wirkt ((Tora et al., Berry et al., Kumar et al., Lees et al. und McInerney et al., jeweils a.a.O., und Danielian et al. EMBO J. 11: 1025-1033 (1992) (s. auch Fig. 3B). Im Gegensatz dazu erfordert das ER-abhängige Auslösen, wenn der Coaktivator-Komplex vorher DNA zugefügt worden ist (Fig. 6B), entweder AF1 oder AF2 die unabhängig und stark wirken (Fig. 3). Folglich löst Tamoxifen, dessen Aktivität isoliertes AF1 reflektiert, stark vor-verstärkte Coaktivator-Komplexe aus. Es ist allgemein bekannt, daß Tamoxifen in vivo unterschiedliche und verwirrende östrogenartige Wirkungen auf die Genexpression zeigt (Webb et al. a.a.O.; Norris et al., Molecular Endocrinology 10: 1605-1616 (1996)). Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, daß viele dieser Fälle von Tamoxifen-Antagonismus bestätigen, daß sie durch ER-abhängiges Auslösen von Genen mit vor-verstärkten Coaktivator-Komplexen entstanden sind.

C. Zusammenfassung und Schlußfolgerungen

Der Östrogen-Rezeptor ER aktiviert die Genexpression durch einen Mechanismus, der Coaktivatoren der p160 Familie und CBP/p300 umfaßt (Onate et al., Kamei et al., Hong et al., Chakravarti et al. und Hanstein et al., jeweils a.a.O. und Voegel et al. EMBO J. 15: 3667-3675 (1996); Smith et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93: 8884-8888 (1996)). Frühere Modelle zur Erklärung der Funktion von Coaktivatoren legen nahe, daß Coaktivatoren als Brücken zwischen DNA-gebundenen Transcriptionsfaktoren und dem Grund-Transcriptions-Mechanismus (BTM) wirken (Janknecht und Hunter, Nature 383: 22-23 (1996)). Dieses Modell besagt, daß der Steroid-Rezeptor als eine inerte Plattform für die Verstärkung des Coaktivators wirkt und daß Coaktivatoren der wahre Effektor für die Genexpression sind. Hier wurde gezeigt, daß SRC-1a und CBP die Transcription nicht wirksam aktivieren, wenn sie in Abwesenheit von Rezeptor direkt an DNA gebunden sind. Die Zufuhr von ER erhöht jedoch die Fähigkeit von beiden Coaktivatoren, die Transcription zu aktivieren, selbst in Abwesenheit einer ER-DNA-Bindung. Die AP-1 Proteine Jun und Fos erhöhen auch die Aktivität ihres Coaktivators CBP. So benötigen Coaktivatoren Transcriptionsfaktoren, um die Genexpression zu aktivieren. Die Ergebnisse zeigen, daß Transcriptionsfaktoren Coaktivatoren zu dem Promotor zufügen und dann anschließend die Aktivität des Coaktivator-Komplexes auslösen.

Beispiel 2: Glucocorticoid-Rezeptor reprimiert die durch CBP vermittelte durch Östrogen stimulierte Transcription.

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung des Human-Glucocorticoid-Rezeptors auf die Fähigkeit von Östrogen und dem Östrogen-Rezeptor, die Transcription zu stimulieren, die durch ein CBP-Coaktivator-Polypeptid vermittelt wird, das an eine GAL4 DNA- Bindungsdomäne gebunden ist. Bei diesen Versuchen wurde ein Reportergen verwendet, das aus fünf Bindungsstellen für das GAL4 Hefeprotein unmittelbar stromaufwärts vorn einem minimalen Promotor (TATA-Box) bestand, der die Expression eines Luziferase-Strukturgens antreibt. Das Strukturgen wurde in HeLa-Zellen transfiziert, zusammen mit Expressionsvektoren für eine Fusion der GAL4 DNA-Bindungsdomäne mit dem C-Terminus von CBP (Aminosäuren 1678-2441), für den Human-Östrogen-Rezeptor und für den Human-Glucocorticoid-Rezeptor.
Die Ergebnisse dieses Versuchs, die in Fig. 7 angegeben sind, zeigen, daß das Vorhandensein von Östrogen (Östradiol) die Expression des Reportergens stimuliert. Diese Stimulation wird gehemmt durch das Vorhandensein von Dexamethason, einem synthetischen Glucocorticoid-Agonisten. Die Repression ist eine Funktion der Menge an transfiziertem Glucocorticoid-Rezeptor. Eine gewisse Repression trat ein aufgrund des endogenen Glucocorticoid-Rezeptors, der sich in HeLa-Zellen findet.
Bei einem weiteren Versuch wurde das Reportergen in GT1-Zellen, eine Hypothalamus-Zellinie, transfiziert, zusammen mit Expressionsvektoren für eine Fusion der GAL4 DNA-Bindungsdomäne mit CBP voller Länge für den Human-Östrogen-Rezeptor und für den Human-Glucocorticoid-Rezeptor. Wie in fig. 8 gezeigt, unterdrückte das synthetische Glucocorticoid Dexamethason die Genexpression wenn das Reportergen durch Behandlung mit cyclischem AMP voraktiviert war. In diesem Falle reichten die endogenen Glucocorticoid-Rezeptoren in GT1 Zellen für die Repression aus.

Beispiel 3: Weitere Illustration des Auslösungs-Konzepts: Binden des Transaktivators und Coaktivators in cis-Stellung

Man hat sich auch gefragt, ob das Zufügen sowohl eines Transaktivators als auch eines Coaktivators an den gleichen Promotor ein Auslösen ermöglicht. Es wurde ein Reportergen verwendet, das ein klassisches Östrogen-Antwortelement (ERE) und ein einziges GAL-RE in Tandemanordnung stromaufwärts von der minimalen Collagenase TATA Box enthielt. Dieser Reporter erlaubt ER und dem gebundenen Coaktivator gleichzeitig an den Promotor zu binden. Fig. 9 zeigt, daß mit transfiziertem ER Östrogen aber nicht Tamoxifen eine schwache Antwort auf das Reportergen zeigte. Dies stimmt mit früheren Ergebnissen überein, die zeigen, daß aktiviertes AF-1 die Transcription von einem einfachen Promotor nicht aktivieren kann. Transfiziertes GAL-GRIP1 ergab wieder eine geringe Aktivität. In Kombination wirkten jedoch ER und GAL-GRIP1 stark synergistisch in einer Weise, die abhängig war entweder von Östrogen oder von Tamoxifen. So wirken ER und GAL-GRIP1 synergistisch, wenn sie in Kombination an dem gleichen Promotor angeordnet werden, und diese Kombination reicht aus, um das Verhalten von Tamoxifen von einem reinen Antagonisten zu einem starken Agonisten zu verändern.

Claims

1. Verfahren zur stimulierenden Expression eines Gens, wobei das Verfahren die Durchführung der folgenden Schritte ex vivo umfaßt:

i. Zusammenbringen einer Nucleinsäure, umfassend ein Antwortelement das operabel an das Gen gebunden ist, mit einem (daran) gebundenen Coaktivator, umfassend

a) ein Polypeptid, das eine Aktivierungs-Funktion umfaßt, die von einem Transcriptions-Coaktivator abgeleitet ist, und

b) eine DNA bindende Einheit, die in der Lage ist, spezifisch an das Antwortelement zu binden,

ii. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid, umfassend eine Aktivierungs-Funktion, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist, wobei das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit dem aktivierten Transcriptionsfaktor- Polypeptid die Expression des Gens stimuliert.

2. Verwendung eines gebundenen Coaktivators umfassend

b) eine DNA-Bindungseinheit, die in der Lage ist, spezifisch an ein Antwortelement zu binden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung der Expression eines Gens in vivo, durch

i. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einer Nucleinsäure, umfassend das Antwortelement, das operabel an das Gen gebunden ist, und

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Transcriptionsfaktor-Polypeptid für die Zelle, in der die Expression des Gens stimuliert wird, exogen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen ein virales Gen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Transcriptionsfaktor ein Kern-Homonrezeptor ist.

6. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Kern- Homonrezeptor ausgewählt ist aus einem Steroid-Rezeptor, einem Thyroid-Rezeptor, einem Retinoid-Rezeptor und einem Vitamin D-Rezeptor.

7. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Kern- Homonrezeptor ein Steroid-Rezeptor ist

8. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Transcriptionsfaktor- Polypeptid aktiviert wird durch Zusammenbringen des Polypeptids mit einem Steroid.

9. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Steroid-Rezeptor ein Östrogen-Rezeptor ist.

10. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Antwortelement eine AP1-Stelle ist.

11. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Transcriptionsfaktor-Polypeptid AF1 oder AF2 umfaßt.

12. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Kern- Hormonrezeptor ein Retinoid X-Rezeptor ist.

13. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Transcriptions- Coaktivator p300 oder p160 ist.

14. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Transcriptions- Coaktivator ausgewählt ist aus SRC-1a und GRIP/TIF-2 und Homologen davon.

15. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Transcriptions- Coaktivator ausgewählt ist aus CBP und p300 und Homologen davon.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Transcriptionsfaktor ein AP1-Transcriptionsfaktor ist.

17. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Transcriptionsfaktor jun oder fos oder ein Homologes davon ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei die DNA bindende Einheit ein Oligonucleotid ist, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Antwortelement zu hybridisieren.

19. Verfahren zum Unterdrücken der Expression eines Gens, wobei das Verfahren die Durchführung der folgenden Schritte ex vivo umfaßt:

i. Zusammenbringen einer Nucleinsäure, umfassend ein Antwortelement, das operabel an das Gen gebunden ist, mit einem gebundenen Coaktivator, umfassend

ii. Voraktivieren des gebundenen Coaktivators und

iii. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid, umfassend eine Repressor-Funktion, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist, wobei das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit dem Transcriptionsfaktor-Polypeptid die Expression des Gens unterdrückt

20 Verwendung eines gebundenen Coaktivators umfassend:

b) eine DNA bindende Einheit, die in der Lage ist, spezifisch an ein Antwortelement zu binden,

zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung der Expression eines Gens in vivo durch

i. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einer Nucleinsäure, umfassend ein Antwortelement, das operabel an das Gen gebunden ist,

ii Voraktivieren des gebundenen Coaktivators und

iii. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einem aktivierten Transcriptionsfaktor-Polypeptid, umfassend eine Repressor- Funktion, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist, wobei das Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit dem Transcriptionsfaktor-Polypeptid die Expression des Gens unterdrückt.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Transcriptionsfaktor ein Glucocorticoid-Rezeptor ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19 oder Verwendung nach Anspruch 20, wobei der gebundene Coaktivator vorher durch Stimulieren eines zweiten Botenweges voraktiviert worden ist.

23. Verfahren zum Identifizieren von Testverbindungen, die in der Lage sind, die Transcription eines interessierenden Gens zu modulieren, wobei das Verfahren die Durchführung der folgenden Schritte ex vivo umfaßt:

i. Bereitstellen einer Nucleinsäure, umfassend ein Reportergen, das operabel an ein Antwortelement gebunden ist,

ii. Zusammenbringen der Nucleinsäure mit einem gebundenen Coaktivator, umfassend

a) ein Polypeptid, das eine Aktivierungs-Funktion umfaßt, abgeleitet von einem Transcriptions-Coaktivator, und

iii. Zusammenbringen des gebundenen Coaktivators mit einem Transcriptionsfaktor-Polypeptid, umfassend eine Aktivierungs-Funktion, die von einem Transcriptionsfaktor abgeleitet ist, der an der modulierenden Expression des interessierenden Gens in seiner natürlichen Umgebung beteiligt ist, wobei das Transcriptionsfaktor-Polypeptid vor dem Zusammenbringen mit dem gebundenen Coaktivator mit der Testverbindung zusammengebracht wird, und

iv. Nachweisen der Expression des Reportergens.

24. Verfahren nach Anspruch 23, das in einer Zelle durchgeführt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Transcriptionsfaktor-Polypeptid geliefert wird durch Expression eines heterologen Gens, das das Transcriptionsfaktor- Polypeptid in der Zelle codiert.

26. Verfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25, wobei die Modulation eine Aktivierung ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei das Antwortelement zu dem interessierenden Gen heterolog ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei der Transcriptionsfaktor ein Kern-Hormonrezeptor ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Testverbindung die Fähigkeit des Kern-Hormonrezeptors, sich mit seinem natürlichen Hormon zu verbinden, stört.

30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Testverbindung die Fähigkeit eines natürlichen Hormons, die Aktivität des Kern-Hormonrezeptors zu modulieren, nachahmt.

31. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Transcriptionsfaktor der Östrogen- Rezeptor ist.

32. Verfahren zum Absuchen einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit, eine indirekte Östrogenantwort, zu modulieren, wobei das Verfahren die Durchführung der folgenden Schritte ex vivo umfaßt:

i. Bereitstellen einer Zelle, umfassend einen Östrogen-Rezeptor und einen Promotor, umfassend eine AP1 Stelle, die die Expression eines Reportergens reguliert,

ii. Zusammenbringen der Zelle mit einem gebundenen Coaktivator, umfassend

b) eine DNA bindende Einheit, die in der Lage ist, spezifisch an die AP1 Stelle zu binden,

iii. Zusammenbringen der Zelle mit der Testverbindung und

iv. Nachweisen der Expression des Reportergens.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zelle vor dem Zusammenbringen der Zelle mit dem gebundenen Coaktivator mit der Testverbindung zusammengebracht wird.