[go: up one dir, main page]

DE19816894C1 - SREBP-2-defiziente Zellinien - Google Patents

SREBP-2-defiziente Zellinien

Info

Publication number
DE19816894C1
DE19816894C1 DE19816894A DE19816894A DE19816894C1 DE 19816894 C1 DE19816894 C1 DE 19816894C1 DE 19816894 A DE19816894 A DE 19816894A DE 19816894 A DE19816894 A DE 19816894A DE 19816894 C1 DE19816894 C1 DE 19816894C1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
seq
acid sequence
srebp
listed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19816894A
Other languages
English (en)
Inventor
Wilhelm Krone
Dirk Mueller-Wieland
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MUELLER WIELAND DIRK
Original Assignee
MUELLER WIELAND DIRK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MUELLER WIELAND DIRK filed Critical MUELLER WIELAND DIRK
Priority to DE19816894A priority Critical patent/DE19816894C1/de
Priority to AU44969/99A priority patent/AU4496999A/en
Priority to EP99927674A priority patent/EP1071778A2/de
Priority to PCT/DE1999/001143 priority patent/WO1999053052A2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19816894C1 publication Critical patent/DE19816894C1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft SREBP(sterol regulatory element binding protein)-2-negative eukaryotische Zellinien, die Verwendung dieser Zellinien zum Durchmustern und Testen von Substanzen sowie Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von z. B. Hypercholesterinämie, Arteriosklerose oder koronarer Herzerkrankung.

Description

Die Erfindung betrifft SREBP (sterol regulatory element binding protein)-2-negative eukaryotische Zellinien, die Verwendung dieser Zellinien zum Durchmustern und Testen von Substanzen sowie Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von z. B. Hypercholesterinämie, Arteriosklerose oder koronarer Herzerkrankung.
Cholesterin ist ein essentieller Bestandteil der Zellmembran und Ausgangsverbindung für die Synthese von Steroidhormonen und Gallensäuren. Es ist lebenswichtig, obwohl die Cholesterinablagerung in Arterien mit ihren Komplikationen (z. B. Herzinfarkt, Schlaganfall), die häufigste Todesursache beim Menschen ist.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß Veränderungen des zellulären Cholesterinstoffwechsels bei der Entstehung der Arteriosklerose bzw. koronaren Herzerkrankung eine bedeutende Rolle spielen. Erst kürzlich konnten umfangreiche Studien an weit über 20.000 Patienten zeigen, daß die medikamentöse Senkung des Cholesterins im Blut durch (medikamentös verabreichte) Cholesterinsynthesehemmer die kardiovaskuläre Letalität sowie Gesamtsterblichkeit signifikant reduziert.
Die Zellen decken ihren Bedarf an Cholesterin bevorzugt durch die Aufnahme von LDL- Cholesterin aus dem Blutplasma. Da Cholesterin wasserunlöslich ist, muß es für den Transport im Blutplasma in eine wasserlösliche Transportform gebracht werden. Zu diesen Zweck stehen dem Organismus verschiedene Lipidproteinkomplexe (auch Lipoproteine genannt) zur Verfügung, die als VLDL (Very Low Density Lipoproteins), IDL (Intermediate Density Lipoproteins), LDL (Low Density Lipoproteins) und HDL (High Density Lipoproteins) bezeichnet werden.
Das LDL-Cholesterin wird von den Zellen vorwiegend über den LDL-Rezeptor, der auf der Oberfläche vieler Zellen sitzt, in das Zellinnere mittels Endocytose eingeschleust. Das im LDL gebundene Cholesterin wird in der Zelle zu freiem Cholesterin abgebaut. Das freie Cholesterin bewirkt daraufhin die Reduzierung der Cholesterinbiosynthese über die Hemmung der Aktivität Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), dem Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Gleichzeitig hemmt freies Cholesterin die Expression des HMG-CoA- Reduktasegens als auch die Expression des LDL-Rezeptorgens. Wird die Zelle mit genügend LDL versorgt, wird sowohl weniger Cholesterin synthetisiert als auch weniger LDL-Rezeptor exprimiert. Die Konzentration des LDL und somit des Cholesterins im Blutplasma wird also vor allem durch die Aktivität des LDL-Rezeptors und der HMG-CoA-Reduktase reguliert.
Im Promotorbereich des LDL-Rezeptorgens gibt es ein Sterol-reguliertes cis-Element (sre-1; sterol regulatory element-1), welches zu potentiellen Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor SP1 benachbart ist. Zwei Transkriptionsfaktoren sind isoliert worden (SREBP-1 und -2), die an sre-1 binden; vgl. X. Wang et al. Cell 77: 53-62 (1994); J. Sakai et al. Cell 85: 1037-1046 (1996). "Sterol regulatory element binding proteins" (SREBP-1 und SREBP-2) sind Cholesterin-sensitive Transkriptionsfaktoren, die als Vorläufer-Protein von ca. 120 kDa im rauhen endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind und zur Familie der bHLH- Zip (basic Helix Loop Helix Leucine Zipper)-Proteine gehören. Durch Reduktion der intrazellulären Konzentration von Sterolen kommt es zur Aktivierung einer spezifischen Protease, die den ca. 68 kDa aminoterminalen transkriptionsaktiven Proteinteil abspaltet; vgl. G. P. Gasic Cell 77: 17-19 (1994). Der N-Terminus von SREBP wandert dann auf bisher unbekannte Weise in den Zellkern. bHLH-Zip-Proteine entfalten ihre transkriptionsregulierende Wirkung, indem sie als Homo- oder Heterodimere an die DNA binden. Dimerisierungspartner sind bisher bei den SREBPs nicht identifiziert worden. Verschiedene Gene sind identifiziert worden, die durch SREBPs reguliert werden.
Unter allen Risikoparametern einer Arteriosklerose bzw. koronaren Herzerkrankung erwies sich LDL-Cholesterin mit dem höchsten prädiktiven Wert, obgleich sich zeigt, daß bei gegebenem LDL-Spiegel zwar eine erhebliche Variabilität des Risikos in Abhängigkeit von der sonstigen Risikofaktorenbelastung besteht. Ist die LDL-Cholesterin-Konzentration im Blutplasma erhöht, führt dies zu einer erhöhten Aufnahme von LDL-Cholesterin in die Zellen der Blutgefäße, wodurch sich Gefäßverengungen und instabile Plaques (Ablagerungen) bilden, die schließlich zu dem erhöhten koronaren Herzerkrankungsrisiko führen.
Neben der durch eine fettreiche Nahrung bedingten erhöhten LDL-Konzentration können weitere Ursachen für eine krankhaft bedingte erhöhte LDL-Konzentration (Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie) im Blutplasma verantwortlich sein. Man unterscheidet bei der letzteren zwischen primärer und sekundärer Hyperlipidämie. Die sekundäre Hypercholesterinämie tritt bei Hypothyreose und Erkrankungen der Niere, Bauchspeicheldrüse oder Leber auf und wird nur in Ausnahmefällen mit Arzneimitteln behandelt, die den Stoffwechsel beeinflussen, da sie sich durch Therapie der Grundkrankheit bessern lassen. Den primären Hyperlipidämien liegen dagegen mono- und polygenetisch vererbte Defekte zugrunde. Die häufigste monogenetisch vererbte Hyperlipidämie ist die familiäre Hypercholesterinämie (FH), der eine Funktionsstörung des LDL-Rezeptors zugrunde liegt.
Die Hypercholesterinämien werden derzeit vorwiegend durch die Verabreichung von HMG- CoA-Reduktasehemmern, Ionenaustauscher oder u. a. auch Nikotinsäurederivaten behandelt. Die Therapie der ersten Wahl sind derzeit die HMG-CoA-Reduktase- bzw. Cholesterinsynthesehemmer. Ein Nachteil der Therapie mit HMG-CoA-Reduktasehemmern sowie auch Ionenaustauschern besteht darin, daß sie von der Expression des LDL-Rezeptors abhängig ist. Dementsprechend ist der Effekt bei Patienten mit Defekten in der Expression des LDL-Rezeptors bzw. seiner Strukturveränderung auch nicht vorhanden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Zellinien bereitzustellen, die zum Auffinden von Arzneimitteln zur Vorbeugung oder Behandlung von z. B. Hypercholesterinämie, Arteriosklerose oder koronarer Herzerkrankung verwendet werden. Der Erfindung liegt feiner die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel zur Vorbeugung oder Behandlung von
  • - Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit
  • - kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen
  • - genetischen Lebererkrankungen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel
  • - Alzheimersche Erkrankung bzw. neurodegenerative Störungen
bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche 1 bis 12 gelöst.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft eine eukaryotische Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid reduziert exprimiert wird, das von der Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 (SREBP-2) codiert wird. Ferner ist die eukaryotische Zellinie bevorzugt dadurch gekennzeichnet, daß eine stabil ins Genom der Zellinie integrierte Nucleinsäuresequenz, umfassend die Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 und einen Promotor, an dem die Transkription der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 initiiert wird, so transkribiert wird, daß eine Antisense-RNA zur endogenen Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 transkribiert wird und kein von der endogenen Nucleinsäuresequenz codiertes Polypeptid exprimiert wird. Dem Fachmann ist bewußt, daß zur Integration einer Nucleinsäure sowohl der Sense- als auch der komplementäre Antisense- Strang verwendet werden müssen. Daher umfaßt die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte Nucleinsäuresequenz beide Stränge. Besonders bevorzugt ist eine humane Zellinie. Insbesondere bevorzugt ist eine Leberzellinie.
In einer Ausführungsform wird die eukaryotische Zellinie zur Durchmusterung und zum Testen von Substanzen bereitgestellt, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit, kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetischen Lebererkrankungen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel, Alzheimersche Erkrankung oder neurodegenrative Störungen verwendet werden können.
Zum Testen von Substanzen werden grundsätzlich folgende Schritte, die z. B. dazu beitragen sollen, neue Cholesterin-regulierte Gene oder solche, die via SREBPs wirken bzw. durch letztere in ihrer Wirkung modifiziert werden, zu identifizieren. Die Zellen werden in An- und oder Abwesenheit von Cholesterin inkubiert und dann über einen Zeitraum mit einer Konzentration der vorstellend angeführten Substanzen inkubiert. Danach wird die Expression verschiedener Gene (z. B. "differential display"/PCR-SelectTM/Substraktions-Banken oder relative Promotoraktivität definierter Gene mittels Reportergen-Analysen) oder die Wirkung auf vorher definierte Endpunkte, wie z. B. Expression oder Promotoraktivität des LDL- Rezeptors, analysiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 oder eines Fragments davon zur Herstellung einer Zellinie verwendet, die ein Polypeptid reduziert exprimiert, das von der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 codiert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Antisense-Nucleinsäure der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 als Arzneimittel. Bevorzugt ist die Verwendung einer Antisense-Nucleinsäure der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit, kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetischen Lebererkrankungen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel, Alzheimersche Erkrankung oder neurodegenrative Störungen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Antisense-Nucleinsäure in Kombination mit Cholesterinsynthese-Hemmern.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 als Arbeitsmittel zur somatischen Gentherapie. Bevorzugt ist die Verwendung der Nucleinsäuresequenz bei der somatischen Gentherapie zur Behandlung von Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit, kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetischen Lebererkrankungen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel, Alzheimersche Erkrankung oder neurodegenrative Störungen.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Zeichnungen erläutert.
In Fig. 1 sind schematisch Promotor-Reportergen-Konstrukte des LDLR und ihre relative Promotoraktivität dargestellt. HepG2-Zellen wurden mittels Lipofektion mit verschiedenen 5' deletierten bzw. mutierten Konstrukten transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5% LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin bzw. 3,3 × 10-10 M PDGF stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden. Die cis-Elemente für die Transcriptionfaktoren SP1 (sp1), SREBP-1 bzw. -2 (sre-1) sowie für die RNA-Polymerase (tata) wie auch der Transcriptionsstartpunkt (TS) sind eingezeichnet.
In Fig. 2 ist schematisch die LDL-Rezeptor-Promotoraktivität (phLDL4) in SREBP1 (-) sowie SREBP2 (-)- Zellen dargestellt. HepG2 und SREBP1 (-) sowie SREBP2 (-)- Zellen wurden mit dem Promotor-Konstrukt phLDL4 transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5% LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin, 10-8 M IGF-1, 1,5 × 10-15 M EGF oder 3,3 × 10-10 M PDGF stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden.
In Fig. 3 ist schematisch der Einfluß spezifischer Inhibitoren auf die Wirkung von Insulin bzw. PDGF auf den LDLR dargestellt. HepG2 Zellen wurden mit dem Promotor-Konstrukt phLDL4 transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5% LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin oder 3,3 × 10-10 M PDGF mit und ohne Inhibitoren (75 µM PD98056 bzw. 50 nM Wortmaimin) stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Beispiele sind nicht einschränkend aufzufassen.
Beispiele
Bei Methoden ohne Referenzangaben handelt es sich um Standardmethoden, die nach Sambrook (Sambrook et al., 1987) durchgeführt wurden.
Beispiel 1: Klonierung der SREBPs
Die Aminosäuren bzw. Nukleotidsequenz der SREBPs ist bekannt; vgl. X. Wang et al. Cell 77: 53-62 (1994); J. Sakai et al. Cell 85: 1037-1046 (1996). Zur Klonierung der SREBPs in unserem Labor wurde RNA aus HeLa-Zellen isoliert. Die Nukleotidsequenz, die für den N- Terminus (Aminosäure 1 bis 460) von SREBP-1a kodiert, wurde nach reverser Transkription von 1 µg RNA mit den Primern SREBP-1a(NT1) sowie SREBP-1a(NT2) mittels PCR amplifiziert und dann in die BamHI/EcoRI-Schnittstelle des Klonierungsvektors pUC19 kloniert. Entsprechend wurde der N-Terminus (Aminosäure 1 bis 468) von SREBP-2 nach Amplifikation mit den Primern SREBP-2(NT1) sowie SREBP-2(NT2) kloniert. Das N- terminale Ende von SREBP-1c wurde durch Modifikation des SREBP-1a Klons erreicht. Der Vektor, der SREBP-1a enthält, wurde mit BamHI und HgaI (Nukleotid 230) geschnitten. Dann wurde hierauf mit den Primern SREBP-1c(NT1) sowie SREBP-1a(NT2) eine PCR durchgeführt, um SREBP-1c zu erhalten. Die Nukleotidsequenzen wurden mittels DNA- Sequenzierung verifiziert.
Folgende Primer für die Klonierung der SREBPs herangezogen:
Oligonukleotide wurden nach der Festphasen-Phosphoamidit-Methode mit dem Pharmacia Gene Assembler und Chemikalien der gleichen Firma erstellt. Die Oligonukleotide wurden über Nacht mit NH4OHkonz. vom Säulenmaterial entkoppelt, das Säulenmaterial durch Zentrifugation (15000 xg; 2 min; Raumtemperatur (RT)) entfernt und der Überstand im Vakuum (1 h) konzentriert. Die Oligonukleotide wurden mit 1/10 Vol. NaAc pH 4,0 und 3 Vol. EtOHabs. 30 min bei -20°C gefällt, zentrifugiert (15000 xg; 15 min; 4°C;) und m 100 µl H2Obidest. resuspendiert. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt (OD260 × Verdünnung × 50 × Bp-1 × MG-1 = µmol/ml). Für die Erstellung der spezifischen cDNA-Fragmente wurden folgende Oligonukleotide konstruiert.
Erst-Strang-Synthese
1 µg Hela Gesamt-RNA wurde mit H2Obidest. 5 min bei 70°C hitzedenaturiert. Anschließend wurde dNTP-Mix (0,5 mM), pd(N)6-Primer (0,2 µg), Mu-MLVRT (200 U) und 1x reverse Transkriptasepuffer (50 mM Tris/HCl; 40 mM KCl; 1 mM DTT; 6 mM MgCl2; 0,1 mg/ml BSA; pH 8,3) zugegeben und die Synthese für 1 h bei 37°C durchgeführt.
PCR-Bedingungen:
Zu 10 µl des Erst-Strang-Synthese Ansatzes wurde 1 × PCR-Puffer (10 mM Tris/HCl; 50 mM KCl; 0,1 mg/ml BSA pH 8,3), MgCl2 (1,5 mM), dNTP-Mix (0,2 mM), 3' Primer (0,1 µM), 5' Primer (0,1 µM) und 1,25 U Taq-Polymerase addiert. Die PCR wurde in einem Probenvolumen von 100 µl durchgeführt; als Verdunstungsschutz wurde Mineralöl eingesetzt. Zur Herstellung der SREBP-cDNA wurde in 32 Zyklen (94°C 1 min; 60°C 2 min; 72°C 3 min) amplifiziert und ein Elongationsschritt (72°C, 7 min) angeschlossen.
Beispiel 2: Klonierung der Anti-Sense-RNA-Konstrukte
Die Herstellung von SREBP-1-defizienten Zellen ist beschrieben; vgl. Streicher et al, 1996, J. Biol. Chem. 271, 7128-7133. Entsprechend wurden HepG2-Zellen hergestellt, die defizient für SREBP-2 sind. Für die Herstellung von SREBP-2-defizienten Zellen wurde mit den Primren SREBP-2(anti1) sowie SREBP-2(anti2) mittels PCR ein cDNA-Fragment von einer Länge von 421 bp generiert; als Matrize diente die cDNA der N-Terminalen Domäne von SREBP-2 (s. o.). Dieses Fragment wurde so in einen Expressionsvektor (pcDNA3) kloniert, daß SREBP- 2-Antisense RNA exprimiert wird (beschrieben für SREBP-1). Dieses Antisense-Konstrukt ist komplementär der SREBP-2-spezifischen Nukleotidsequenz 257 bis 678.
Für die Erstellung des spezifischen cDNA-Fragment wurden folgende Oligonukleotide konstruiert.
Beispiel 3: Transiente Transfektion von HepG2-Zellen
Die HepG2-Zellen (Knowles et al., 1980, Science 209, 497-499) wurden entweder wie mit der bereits beschriebenen Methode oder durch Elektroporation transfiziert. Bei der Elektroporation wurden die Zellen als Monolayer in RPMI-1640 (Sigma, Deutschland) komplementiert mit 10% (v/v) FCS (Gibco, Deutschland) und Antibiotika (Sigma, Deutschland, A9909, 1%-Lösung) kultiviert. Vor Elektroporation wurden die Zellen trypsiniert und gewaschen und in Opti-MEM (Gibco, Deutschland) suspendiert. Die Zellsuspensionen (2 × 105-Zellen pro well) wurden mit den entsprechenden nachstellenden Vektoren vermischt. Diese Proben wurden dann in einer Elektroporationscuvette (Interelektrode Distanz 0,4 cm) transferiert und für 18 msek. gepulst. Bevor diese gepulsten Zellsuspensionen auf Sechslochplatten ausgesät worden waren, wurden sie im o. a. Zellkulturmedium verdünnt. Für die Experimente mit den exogenen Stimuli, wie z. B. Hormone oder Wachstumsfaktoren, wurden die Zellen vor der Ernte zunächst für 16 Stunden auf serumfrei gezüchtet und dann für weitere 4 Std. inkubiert. Die Luziferaseaktivität wurde entsprechend des Herstellers (Promega, Deutschland) bestimmt. Die Transfektionseffizienz wurde durch gleichzeitige Kotransfektion mit dem β-Galaktosidase-Expressionsvektor pSVβGal kontrolliert. Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde durch den Galaktolight-assay (Tropix) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Die Daten zeigen die relative Luziferaseaktivität als x-fache Induktion, bedingt durch entweder endogene oder exogene Stimulation im Vergleich zu unstimulierten Zellen.
Die Expressionsvektoren (Stratagene), die regulative Domänen von Transkriptionsfaktoren, fusioniert zu heterologen DNA-Bindungsdomäne von Gal-4 (Aminosäure 1-147) unter Kontrolle eines MLV-Promotor enthalten, wurden zur Herstellung von Konstrukten mit den entsprechenden N-terminalen Domänen (s. o.) der SREBPs im offenen Leseraster (hierzu wurden die Vektoren mit BamHI/EcoRI subklonierten Fragmenten mit BamHI aufgeschnitten, aufgefüllt und "blunt-end in-frame" religiert) erstellt. Zur Bestimmung der Transaktivierung des Reporterplasmids wurde das Luziferasegen genommen, welches unter der Kontrolle von 5 Gal-4-bindenden Elementen steht (Stratagene, Deutschland).
Beispiel 4
Neuere Ergebnisse zeigen, daß Insulin die Aktivität des LDL-Rezeptors (LDLR) selbst unter substratreprimierten Konditionen induziert (5). Durch transiente Transfektionsexperimente mit 5'-deletierten und mutierten Promotorkonstrukten des LDLR konnte das cis-Element sre-1 als das Insulin-sensitive Element im LDLR-Promotor identifiziert werden (Fig. 1).
HepG2-Zellen wurden mittels Lipofektion mit verschiedenen 5' deletierten bzw. mutierten Konstrukten transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5 % LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin bzw. 3,3 × 10-10 M PDGF stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden. Die cis-Elemente für die Transcriptionfaktoren SP1 (sp1), SREBP-1 bzw. -2 (sre-1) sowie für die RNA-Polymerase (tata) wie auch der Transcriptionsstartpunkt (TS) sind eingezeichnet.
Beispiel 5
Um die Notwendigkeit von SREBP-1 in der Hormoninduzierten Transkriptionsaktivierung des LDLR weiter zu charakterisieren, wurden mittels stabiler Transfektion von pcSREBP-1(-) HepG2-Zellen generiert, deren Gehalt an SREBP-1 deutlich vermindert ist (SREBP-1(-)- Zellen). Eine transiente Transfektion dieser Zellen mit dem Promotorkonstrukt phLDL4 zeigte, daß der Transkriptions-aktivierende Effekt von Insulin respektive IGF-1 im Vergleich zu mock-transfizierten HepG2-Zellen aufgehoben war. Interessanterweise ist in SREBP-1(-)- Zellen auch die stimmulierende Wirkung von PDGF sowie EGF deutlich reduziert (Fig. 2). Die Regulation der sre-1 vermittelten Transkriptionsaktivierung scheint spezifisch von SREBP-1 mediiert zu werden. Ob dieser Effekt durch eine Homo- oder Heterodimerisierung von SREBP-1, eventuell mit SREBP-2, hervorgerufen wird, und welchen Einfluß Hormone in verschiedenen Geweben auf diese Protein-Protein Interaktion hat, wurde weiter untersucht. In Erweiterung zu den Experimenten mit SREBP-1 wurden durch stabile Transfektion mit pcSREBP-2(-) SREBP-2 defiziente HepG2-Zellen etabliert. Die transiente Transfektion dieser Zellen mit dem Promotorkonstrukt phLDL4 zeigte, daß die Transkriptionsaktivierung durch Insulin, IGF-1, PDGF sowie EGF im Vergleich zu mock-transfizierten HepG2-Zellen ebenfalls deutlich reduziert ist (Fig. 2).
HepG2 und SREBP1 (-) sowie SREBP2 (-)- Zellen wurden mit dem Promotor-Konstrukt phLDL4 transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5% LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin, 10-8 M IGF-1, 1,5 × 10-15 M EGF oder 3,3 × 10-10 M PDGF stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden.
Durch transiente Expression von SREBP-1a wie auch von SREBP1c in SREBP-1(-)-Zellen bzw. von SREBP-2 in SREBP-2(-) konnte die hormonelle Wirkung auf den LDLR-Promotor wiederhergestellt werden.
Der Einsatz von spezifischen Inhibitoren zeigte, daß die Wirkung von Insulin wie auch PDGF auf den LDLR-Promotor mit dem MAP-Kinasen-Kaskaden Weg gekoppelt ist (Fig. 3).
HepG2 Zellen wurden mit dem Promotor-Konstrukt phLDL4 transient transfiziert. Vor der Ernte wurden die Zellen für 16 h in Serum mit 0,5% LPDS kultiviert und anschließend entweder uninduziert (SF) oder 4 h mit 10-7 M Insulin oder 3,3 × 10-10 M PDGF mit und ohne Inhibitoren (75 µM PD98056 bzw. 50 nM Wortmannin) stimmuliert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert.
Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n = 4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (11)

1. Eukaryotische Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid reduziert exprimiert wird, das von der Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 (SREBP-2) codiert wird, wobei mittels homologer Rekombination die endogene Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 modifiziert oder deletiert ist und kein von der endogenen Nukleinsäuresequenz codiertes Polypeptid exprimiert wird, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
2. Eukaryotische Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid reduziert exprimiert wird, das von der Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 (SREBP-2) codiert wird, wobei eine stabil ins Genom der Zellinie integrierte Nucleinsäuresequenz, umfassend die Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 und einen Promotor, an dem die Transkription der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 initiiert wird, transkribiert wird und eine Antisense-RNA zur endogenen Nucleinsäuresequenz aufgeführt in SEQ ID NO: 1 transkribiert wird und kein von der endogenen Nukleinsäuresequenz codiertes Polypeptid exprimiert wird, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
3. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 2, die eine humane Zellinie ist.
4. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Leberzellinie ist.
5. Verwendung der Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Durchmusterung und zum Testen von Substanzen, die verwendet werden können zur Behandlung oder Vorbeugung von Arteriosklerose, Schlaganfall, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlußkrankheit, Glukoseintoleranz, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2- Mangel, Alzheimersche Erkrankung, neurodegenerative Störungen oder genetischer Lebererkrankung, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden kann.
6. Verwendung der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 zur Herstellung von Zellen, die reduziert Polypeptid exprimieren, das von der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 codiert wird, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
7. Arzneimittel enthaltend eine Antisense-Nucleinsäure der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
8. Verwendung einer Antisense-Nucleinsäure der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 zur Vorbeugung oder Behandlung von Arteriosklerose, Schlaganfall, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlußkrankheit, Glukoseintoleranz, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2- Mangel, Alzheimersche Erkrankung, neurodegenerative Störungen oder genetischer Lebererkrankung, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden kann.
9. Verwendung der Antisense-Nucleinsäure nach Anspruch 8 in Kombination mit Cholesterinsynthese-Hemmern.
10. Verwendung der Nucleinsäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 oder eines Fragments davon zur somatischen Gentherapie, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
11. Verwendung der Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 10 zur Behandlung von Arteriosklerose, Schlaganfall, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlußkrankheit, Glukoseintoleranz, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2- Mangel, Alzheimersche Erkrankung, neurodegenerative Störungen oder genetischer Lebererkrankung, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden kann.
DE19816894A 1998-04-16 1998-04-16 SREBP-2-defiziente Zellinien Expired - Fee Related DE19816894C1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19816894A DE19816894C1 (de) 1998-04-16 1998-04-16 SREBP-2-defiziente Zellinien
AU44969/99A AU4496999A (en) 1998-04-16 1999-04-15 Srebp-2-deficient cell lines
EP99927674A EP1071778A2 (de) 1998-04-16 1999-04-15 Srebp-2-defiziente zellinien
PCT/DE1999/001143 WO1999053052A2 (de) 1998-04-16 1999-04-15 Srebp-2-defiziente zellinien

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19816894A DE19816894C1 (de) 1998-04-16 1998-04-16 SREBP-2-defiziente Zellinien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19816894C1 true DE19816894C1 (de) 2000-03-02

Family

ID=7864731

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19816894A Expired - Fee Related DE19816894C1 (de) 1998-04-16 1998-04-16 SREBP-2-defiziente Zellinien

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1071778A2 (de)
AU (1) AU4496999A (de)
DE (1) DE19816894C1 (de)
WO (1) WO1999053052A2 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005295867A (ja) * 2004-04-09 2005-10-27 Japan Science & Technology Agency ２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5527690A (en) * 1987-03-30 1996-06-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to sterol regulatory element binding proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell. 77, S.53-62, 1994 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1071778A2 (de) 2001-01-31
WO1999053052A3 (de) 2000-01-20
WO1999053052A2 (de) 1999-10-21
AU4496999A (en) 1999-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69636936T2 (de) Faktor-1, induzierbar durch hypoxämie, und verfahren zur anwendung
DE69534733T2 (de) NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE
DE69930950T2 (de) Zinkfinger-bindungsdomänen für gnn
DE3884610T2 (de) Durch sterole regulierbare promoterelemente.
DE3750451T2 (de) Rekombinanter menschlicher endothelzellenwachstumsfaktor.
DE69535467T2 (de) Faktor aus pigmentiertem Epithel (PEDF): Charakterisierung, genomische Organisation und Sequenz des PEDF-Gens
DE69838905T2 (de) Transkriptionsfaktor islet-brain 1 (ib1)
DE69836139T2 (de) Verfahren zur behandlung von vaskulären proliferativen erkrankungen mit p27 und fusionen davon
DE69325180T2 (de) AKTIVIERUNG VON p53 PROTEIN
DE69325383T2 (de) Testreihenanalyse-Verfahren mit transkriptionsfaktor DP-1
DE69636072T2 (de) Varianten des p53-proteins und deren therapeutischen verwendungen
DE69635349T2 (de) Nukleotidsequenzen, proteine, medikamente und diagnoseagentien zur anwendung in krebsbehandlung
EP0926236A1 (de) Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie
EP1349933A2 (de) Proteine und den proteinen zugrundeliegende dna-sequenzen mit funktion bei entzündungsereignissen
DE69426121T2 (de) Gen grb3-3, variante und ihre verwendungen
EP0870024A2 (de) Nukleinsäuresequenzen von genen der high mobility group proteine sowie verwendungen derselben
DE19816894C1 (de) SREBP-2-defiziente Zellinien
US5744310A (en) Bax promoter sequence and screening assays for indentifying agents that regulate bax gene expression
DD297840A5 (de) Verfahren zur herstellung eines vektors mit einer dna-sequenz, die ein protein mit wirkung einer interferon-regulatorsequenz (irf-1) codiert und dessen verwendung
DE60126602T2 (de) Neue collectine
DE69734143T2 (de) Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert
DE60030587T2 (de) Mit bh4 fusionierte polypeptide
DE19816902A1 (de) SREBP-1 und SREBP-2 in phosphorylierter Form
DE69803193T2 (de) Verfahren zum Screenen von Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und Koaktivatoren
EP1220921B1 (de) Nukleinsäuresequenzen von hyperplasien und tumoren der schilddrüse

Legal Events

Date Code Title Description
8100 Publication of the examined application without publication of unexamined application
D1 Grant (no unexamined application published) patent law 81
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee