DE69735894T2

DE69735894T2 - Spezifische bestimmung der methylierung

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Publication number: DE69735894T2
Application number: DE69735894T
Authority: DE
Inventors: G. James Timontown HERMAN; B. Stephen Baltimore BAYLIN
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: EP0954608B1; JP2004290200A; WO1997046705A1; DK0954608T3; JP3612080B2; ATE326549T1; IL127342A0; PT954608E; EP1690948A2; CA2257104A1; DE69735894D1; JP3725535B2; EP1690948A3; JP2000511776A; ES2264165T3; CA2257104C; EP0954608A1; US6265171B1; EP0954608A4; IL127342A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression und genauer ein Verfahren zur Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus von CpG-Stellen an einem bestimmten Locus.
Hintergrund der Erfindung
In Eukaryonten höherer Ordnung ist die DNA nur an Cytosinresten methyliert, welche 5' zu Guanosin in dem CpG-Dinucleotid vorliegen. Diese Modifikation hat wichtige regulatorische Effekte auf die Genexpression, insbesondere wenn CpG-reiche Bereiche, bekannt als CpG-Inseln, beteiligt sind, die in den Promotorregionen vieler Gene vorkommen. Obwohl praktisch alle Gen-assoziierten Inseln auf autosomalen Chromosomen vor einer Methylierung geschützt sind, ist eine übermäßige Methylierung von CpG-Inseln mit der transkriptionellen Inaktivierung von ausgewählten geprägten Genen und Genen auf dem inaktiven X-Chromosom von Frauen in Verbindung gebracht worden. Eine anomale Methylierung von normalerweise unmethylierten CpG-Inseln ist als ein häufiges Ereignis bei immortalisierten und transformierten Zellen beschrieben worden und ist mit der transkriptionellen Inaktivierung von bestimmten Tumorsuppressorgenen bei menschlichen Krebserkrankungen in Verbindung gebracht worden.
Menschliche Krebszellen enthalten typischerweise somatisch veränderte Genome, welche durch die Mutation, Amplifikation oder Deletion wichtiger Gene gekennzeichnet sind. Außerdem weist die DNA-Matrize menschlicher Krebszellen häufig somatische Veränderungen hinsichtlich der DNA-Methylierung auf (Fearon E. R. et al., Cell 61 (1990), 759; Jones P. A. et al., Cancer Res. 46 (1986), 461; Holliday R., Science 238 (1987), 163; De Bustros A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5693; Jones P. A. et al., Adv. Cancer Res. 54 (1990), 1; Baylin S. B. et al., Cancer Cells 3 (1991), 383; Makos M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1929; Ohtani-Fujita N. et al., Oncogene 8 (1993), 1063). Jedoch ist die genaue Rolle einer anomalen DNA-Methylierung bei der Tumorgenese beim Menschen nicht ermittelt worden. DNA-Methylasen übertragen Methylgruppen von dem universellen Methylgruppen-Donor S-Adenosylmethionin auf spezifische Stellen auf der DNA. Mehrere biologische Funktionen sind den methylierten Basen in der DNA zugeordnet worden. Die am häufigsten ermittelte biologische Funktion ist der Schutz der DNA vor einer Spaltung durch entsprechende Restriktionsenzyme. Das Phänomen der Modifikation durch Restriktion ist bisher nur bei Bakterien beobachtet worden. Säugerzellen besitzen jedoch eine andere Methylase, die ausschließlich Cytosinreste, welche 5'-Nachbarn von Guanin (CpG) sind, in der DNA methyliert. Durch mehrere Beweisführungen ist gezeigt worden, dass diese Methylierung eine Rolle bei der Genaktivität, Zelldifferenzierung, Tumorgenese, X-Chromosomen-Inaktivierung, genomischen Prägung und anderen wesentlichen biologische Prozessen spielt (Razin A. H. und Riggs R. D., Hrsg., in DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, New York, 1984).
Vor kurzem ist eine CpG-reiche Region oder "CpG-Insel" bei 17p13.3 identifiziert worden, welche bei mehreren häufigen Typen menschlicher Krebsarten anomal hypermethyliert ist (Makos M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1929; Makos M. et al., Cancer Res. 53 (1993), 2715; Makos M. et al., Cancer Res. 53 (1993), 2719). Diese Hypermethylierung stimmt mit dem zeitlichen Verlauf und der Häufigkeit von 17p-Verlusten und p53-Mutationen bei Hirn-, Colon- und Nierenkrebs überein. Eine abgeschaltete Gentranskription in Verbindung mit einer Hypermethylierung der normalerweise unmethylierten CpG-Inseln in Promotorregionen ist als ein alternativer Mechanismus zu Mutationen der codierenden Regionen für die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen impliziert worden (Baylin S. B. et al., Cancer Cells 3 (1991), 383; Jones P. A. und Buckley J. D., Adv. Cancer Res. 54 (1990), 1–23). Diese Veränderung ist nun mit dem Verlust der Expression von VHL, einem Nierenkrebs-Tumorsuppressorgen auf 3p (Herman J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9700–9704), dem Östrogenrezeptor-Gen auf 6q (Ottaviano Y. L. et al., Cancer Res. 54 (1994), 2552) und dem H19-Gen auf 11p (Steenman M. J. C. et al., Nature Genetics 7 (1994), 433) in Verbindung gebracht worden.
In Eukaryontenzellen erfolgt die Methylierung von Cytosinresten, welche unmittelbar 5' zu einem Guanosin vorliegen, überwiegend in CG-armen Regionen (Bird A., Nature 321 (1986), 209). Im Gegensatz dazu bleiben einzelne Regionen von CG-Dinucleotiden, bezeichnet als CpG-Inseln, in normalen Zellen unmethyliert, außer während der X-Chromosomen-Inaktivierung (Migeon et al., vorstehend) und der elterlichen spezifischen Prägung (Li et al., Nature 366 (1993), 362), wobei die Methylierung von regulatorischen 5'-Regionen eine transkriptionelle Repression zur Folge haben kann. In einer kleinen Fraktion von Retinoblastomen ist die de novo-Methylierung des Rb-Gens nachgewiesen worden (Sakai et al., Am. J. Hum. Genet. 48 (1991), 880), und vor kurzem zeigte eine genauere Analyse des VHL-Gens eine anomale Methylierung in einer Untergruppe von sporadischen Nierenzellkarzinomen auf (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9700). Die Expression eines Tumorsuppressorgens kann ebenfalls durch eine de novo-DNA-Methylierung einer normalerweise 5' unmethylierten CpG-Insel unterbunden werden (Issa et al., Nature Genet. 7 (1994), 536; Herman et al., vorstehend; Merlo et al., Nature Med. 1 (1995), 686; Herman et al., Cancer Res. 56 (1996), 722; Graff et al., Cancer Res. 55 (1995), 5195; Herman et al., Cancer Res. 55 (1995), 4525).
Die meisten der Verfahren, die bis heute zum Nachweis eines methylierten Cytosins entwickelt wurden, beruhen auf der Spaltung der Phosphodiesterbindung entlang von Cytosinresten mit Hilfe von entweder methylierungssensitiven Restriktionsenzymen oder reaktiven Chemikalien wie Hydrazin, welche zwischen Cytosin und dem 5-Methyl-Derivat davon unterscheiden. Die Verwendung von methylierungssensitiven Enzymen hat den Nachteil, dass sie nicht generell anwendbar ist, da nur ein begrenzter Teil der möglicherweise methylierten Stellen in dem Genom analysiert werden kann. Protokolle für eine genomische Sequenzierung, welche einen 5-MeC-Rest in einer genomischen DNA als eine Stelle identifizieren, die nicht durch eine der Maxam-Gilbert-Sequenzierungsreaktionen gespalten werden kann, stellen eine wesentliche Verbesserung gegenüber der ursprünglichen genomischen Sequenzierungsmethode dar, aber weisen noch immer Nachteile auf, wie zum Beispiel die Voraussetzung des Vorhandenseins einer großen Menge der genomischen DNA und die Schwierigkeit beim Nachweis einer Lücke in einer Sequenzierungsleiter, die Banden unterschiedlicher Intensität enthalten kann.
Die Kartierung von methylierten Regionen in der DNA beruhte überwiegend auf Southern-Hybridisierungsansätzen, basierend auf der Unfähigkeit von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen, Sequenzen zu spalten, die eine oder mehrere methylierte CpG-Stellen enthalten. Diese Methode ermöglicht eine Einschätzung des allgemeinen Methylierungsstatus von CpG-Inseln, einschließlich eine quantitative Analyse, aber ist relativ unempfindlich, erfordert große Mengen einer DNA mit hohem Molekulargewicht und kann nur Informationen über solche CpG-Stellen vorsehen, welche innerhalb von Sequenzen vorkommen, die durch methylierungssensitive Restriktionsenzyme erkannt werden. Eine empfindlichere Methode zum Nachweis von Methylierungsmustern kombiniert die Verwendung von methylierungssensitiven Enzymen und die Polymerasekettenreaktion (PCR). Nach Spaltung der DNA mit dem Enzym erfolgt die Amplifikation mittels PCR unter Verwendung von Primern, welche die Restriktionsstelle umgeben, nur dann, wenn die Spaltung der DNA durch eine Methylierung verhindert wurde. Ähnlich wie bei den auf Southern-Verfahren basierenden Ansätzen kann diese Methode lediglich die CpG-Methylierung an methylierungssensitiven Restriktionsstellen überprüfen. Außerdem muss die Restriktion der unmethylierten DNA vollständig sein, da eine ungespaltene DNA durch die PCR amplifiziert wird, wodurch ein falsch positives Ergebnis für die Methylierung erhalten wird. Dieser Ansatz ist bei der Untersuchung von Proben, worin ein hoher Prozentsatz der Allele von Interesse methyliert ist, wie bei der Untersuchung von geprägten Genen und inaktivierten Genen auf dem X-Chromosom, nützlich gewesen. Jedoch machen die Schwierigkeiten im Hinblick auf die Unterscheidung zwischen einer unvollständigen Restriktion und einer geringen Zahl von methylierten Allelen diesen Ansatz für den Nachweis einer Tumorsuppresssorgen-Hypermethylierung in kleinen Proben, in denen die methylierten Allele eine kleine Fraktion der Population darstellen, unzuverlässig.
Eine andere Methode, welche die Verwendung von Restriktionsendonucleasen vermeidet, benutzt eine Bisulfitbehandlung der DNA, um alle unmethylierten Cytosine zu Uracil umzuwandeln. Die veränderte DNA wird amplifiziert und sequenziert, um den Methylierungsstatus aller CpG-Stellen nachzuweisen. Jedoch ist diese Methode technisch schwierig, arbeitsintensiv, beinhaltet keine Clonierung der amplifizierten Produkte, ist weniger empfindlich als eine Southern-Analyse und erfordert, dass für einen Nachweis etwa 10% der Allele methyliert sind.
Die Identifizierung der genetischen Veränderungen in einem frühesten Stadium der Tumorgenese ist ein wichtiger Gesichtspunkt in der molekularen Krebsforschung. Diagnostische Ansätze auf der Basis der Identifizierung dieser Veränderungen ermöglichen voraussichtlich die Realisierung früher Nachweisstrategien und neuer Therapieansätze, wobei der Nachweis dieser frühen Veränderungen eine wirksamere Krebsbehandlung zur Folge haben könnte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die genaue Kartierung von DNA-Methylierungsmustern in CpG-Inseln ist für das Verständnis von verschiedenen biologischen Prozesse wie der Regulation von geprägten Genen, der X-Chromosomen-Inaktivierung und der Tumorsupressorgen-Abschaltung bei einer menschlichen Krebserkrankung unerläßlich geworden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur schnellen Einschätzung des Methylierungsstatus irgendeiner Gruppe von CpG-Stellen innerhalb einer CpG-Insel unabhängig von der Verwendung von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen bereit. Trotz der Erkenntnisse der Fachleute im Hinblick auf die Anwendung der PCR und die Anwendung der Bisulfitmodifikation in einer unabhängigen Weise hat bis zu der vorliegenden Erfindung noch niemand Primer hergestellt, welche für die Bisulfitreaktion spezifisch waren, so dass die PCR-Reaktion selbst verwendet wurde, um zwischen der chemisch modifizierten, methylierten und unmethylierten DNA zu unterscheiden.
Das Verfahren der Erfindung beinhaltet die Modifikation der DNA durch Natriumbisulfit oder ein vergleichbares Reagens, welches alle unmethylierten, aber nicht methylierte Cytosine zu Uracil umwandelt, und die nachfolgende Amplifikation mit Primern, welche für methylierte DNA gegenüber unmethylierter DNA spezifisch sind. Dieses Verfahren einer "methylierungsspezifischen PCR" oder MSP benötigt lediglich kleine DNA-Mengen, ist empfindlich für 0,1% methylierte Allele eines bestimmten CpG-Insel-Locus und kann mit DNA, die zum Beispiel aus in Paraffin eingebetteten Proben extrahiert wurde, durchgeführt werden. Die MSP eliminiert die falsch positiven Ergebnisse, welche den vorherigen Ansätzen auf PCR-Basis innewohnen, die auf einer unterschiedlichen Restriktionsenzymspaltung beruhten, um methylierte DNA von unmethylierter DNA zu unterscheiden.
Gemäß einem bestimmten Aspekt der Erfindung ist die MSP zur Identifizierung von Hypermethylierungs-Veränderungen einer Promotorregion, welche mit der transkriptionellen Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, zum Beispiel p16, p15, E-Cadherin und VHL, bei einer Neoplasie beim Menschen assoziiert ist, nützlich. Andere Gene, für die gezeigt wurde, dass sie methyliert sind, schließen den Östrogenrezeptor, MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin B-Rezeptor, TIMP-2, 06-MGMT, MLH1, MSH2 und GFAP ein. Von diesen ist für den Östrogenrezeptor, MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin-B-Rezeptor, TIMP-2, 06-MGMT und MLH1 mit Hilfe der MSP gezeigt worden, dass sie in neoplastischem Gewebe verglichen mit normalem Gewebe hypermethyliert sind. Zum ersten Male liefert die Erfindung den Beweis, dass TIMP-2, ein Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen, in neoplastischem Gewebe verglichen mit normalem Gewebe hypermethyliert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die genomische Sequenzierung von p16. Die gezeigte Sequenz besitzt am unteren Ende des Gels den größten Teil der 5'-Region, beginnend bei +175 in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt (Hara et al., Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859). Alle Cytosine in der unmethylierten Zelllinie H249 sind zu Thymidin umgewandelt worden, während alle Cs in den CpG-Dinucleotiden in der methylierten Zelllinie H157 als C verbleiben, was eine Methylierung anzeigt. ] schließt eine BstUI-Stelle ein, die bei -59 in Bezug auf den Transnationalstartpunkt in der Genbank-Sequenz U12818 angeordnet ist (Hussussian et al., Nat. Genet. 8 (1994), 15), welche aber unrichtigerweise als CGCA in der Sequenz X94154 identifiziert ist (Hara et al., vorstehend). Diese CGCG-Stelle kennzeichnet die 3'-Stelle des Sense-Primers, welcher für die p16-MSP verwendet wurde.
2, Tafel A–E, zeigt Polyacrylamidgele mit den methylierungsspezifischen PCR-Produkten von p16. Die für die Amplifikation verwendeten Primersätze sind bezeichnet als unmethyliert (U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W). * kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322. Tafel A zeigt die Amplifikation einer bisulfitbehandelten DNA aus Krebszelllinien und normalen Lymphocyten und einer unbehandelten DNA (aus der Zelllinie H249). Tafel B zeigt die Vermischung einer unterschiedlichen Menge von H157-DNA mit 1 μg H249-DNA vor der Bisulfitbehandlung zur Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit der MSP für methylierte Allele. Die modifizierte DNA einer Probe eines primären Lungenkarzinoms und einer normalen Lunge sind ebenfalls gezeigt. Tafel C zeigt die Amplifikation mit den in Tabelle 1 beschriebenen Primern p16-U2 (U) und p16-M2 (M). Tafel D zeigt die amplifizierten p16-Produkte von Tafel C, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel E zeigt die Ergebnisse einer Überprüfung der regionalen Methylierung von CpG-Inseln mit Hilfe der MSP unter Verwendung der Sense-Primer p16-U2 (U) und p16-M2 (M), welche methylierungsspezifisch sind, und eines Antisense-Primers, welcher nicht methylierungsspezifisch ist.
3, Tafel A–E, zeigt Polyacrylamidgele von MSP-Produkten einer Analyse von mehreren Genen. Die für die Amplifikation verwendeten Primersätze sind nicht als unmethyliert (U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W) bezeichnet. * kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322, und ** kennzeichnet den 123 bp-Molekulargewichtsmarker. Alle DNA-Proben wurden mit Bisulfit behandelt, ausgenommen diejenigen, welche als unbehandelt gekennzeichnet sind. Tafel A zeigt die Ergebnisse der MSP für p15. Tafel B zeigt die p15-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel C zeigt die MSP-Produkte für VHL. Tafel D zeigt die VHL-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel E zeigt die MSP-Produkte für E-Cadherin.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt eine methylierungsspezifische PCR (MSP) für die Identifizierung von DNA-Methylierungsmustern bereit. Bei der MSP wird die PCR-Reaktion selbst dazu verwendet, um zwischen einer modifizierten methylierten und unmethylierten DNA zu unterscheiden, wodurch die Empfindlichkeit des Methylierungsnachweises erhöht wird.
Im Unterschied zu vorherigen genomischen Sequenzierungsmethoden zur Identifizierung einer Methylierung unter Verwendung von Amplifikationsprimern, die so konstruiert sind, dass sie die CpG-Sequenzen spezifisch umgehen, sind die MSP-Primer selbst derart konstruiert, dass sie CpG-Stellen spezifisch erkennen, wobei sie sich die Unterschiede bezüglich der Methylierung zunutze machen, um spezifische Produkte zu amplifizieren, welche durch den erfindungsgemäßen Test identifiziert werden.
Wie in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, bietet die MSP wesentliche Vorteile gegenüber einer vorherigen PCR oder anderen Verfahren, welche zum Nachweis einer Methylierung angewendet wurden. Die MSP ist deutlich empfindlicher als Southern-Analysen, wodurch der Nachweis einer geringen Zahl von methylierten Allelen und die Untersuchung der DNA von kleinen Proben erleichtert wird. Die MSP ermöglicht die Untersuchung von in Paraffin eingebetteten Materialien, welche vorher nicht durch eine Southern-Analyse untersucht werden konnten. Die MSP erlaubt auch die Überprüfung aller CpG-Stellen, nicht nur solcher innerhalb der Sequenzen, welche durch methylierungssensitive Restriktionsenzyme erkannt werden. Auf diese Weise wird die Zahl der Stellen, welche beurteilt werden können, deutlich erhöht, wodurch eine schnelle Feinkartierung von Methylierungsmustern in CpG-reichen Regionen ermöglicht wird. Die MSP eliminiert auch die häufigen falsch positiven Ergebnisse aufgrund einer partiellen Spaltung durch methylierungssensitive Enzyme, welche vorherigen PCR-Methoden zum Nachweis der Methylierung eigen sind. Außerdem wird mit Hilfe der MSP durch den gleichzeitigen Nachweis von unmethylierten und methylierten Produkten in einer einzigen Probe die Integrität der DNA als eine Matrize für die PCR bestätigt und eine halbquantitative Beurteilung der Allel-Typen ermöglicht, welche mit Ergebnissen einer Southern-Analyse korreliert. Ein weiterer Vorteil ist schließlich, dass das amplifizierte Produkt durch unterschiedliche Restriktionsmuster bestätigt werden kann.
Die einzige Technik, welche eine direktere Analyse als die MSP für die meisten CpG-Stellen innerhalb einer definierten Region vorsehen kann, ist die genomische Sequenzierung. Jedoch kann die MSP ähnliche Informationen bereitstellen und besitzt die folgenden Vorteile. Erstens ist die MSP viel einfacher und setzt weniger voraus als eine genomische Sequenzierung, wobei eine typische PCR- und Gel-Analyse 4 bis 6 Stunden erfordert. Im Gegensatz dazu kann die genomische Sequenzierung, Amplifikation, Clonierung und nachfolgende Sequenzierung Tage in Anspruch nehmen. Die MSP umgeht auch die Verwendung teuerer Sequenzierungsreagenzien und den Einsatz von Radioaktivität. Diese beiden Faktoren machen die MSP für die Analyse einer großen Zahl von Proben besser geeignet. Drittens ermöglicht die Verwendung einer PCR als Schritt für die Unterscheidung einer methylierten DNA von einer unmethylierten DNA bei der MSP eine wesentliche Erhöhung der Empfindlichkeit des Methylierungsnachweises. Falls beispielsweise keine Clonierung vor der genomischen Sequenzierung der DNA durchgeführt wird, können weniger als 10% methylierte DNA nicht vor dem Hintergrund einer unmethylierten DNA nachgewiesen werden (Myohanen et al., vorstehend). Die Verwendung einer PCR und einer Clonierung ermöglicht einen empfindlichen Nachweis von Methylierungsmustern in sehr kleinen DNA-Mengen mit Hilfe der genomischen Sequenzierung (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1827; Clark et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 2990). Dies bedeutet jedoch in der Praxis, dass eine Analyse mittels Sequenzierung von 10 Clonen zum Nachweis einer Methylierung von 10% und von 100 Clonen zum Nachweis einer Methylierung von 1% erforderlich wäre, und zum Erreichen des Empfindlichkeitswerts, welcher durch die Erfinder mit Hilfe der MSP nachgewiesen wurde (1:1000), wäre die Sequenzierung von 1000 einzelnen Clonen erforderlich.
In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Nucleinsäure enthaltenden Probe mit einem Agens, welches unmethyliertes Cytosin modifiziert, das Amplifizieren der CpG-enthaltenden Nucleinsäure in der Probe mit Hilfe von CpG-spezifischen Oligonucleotidprimern, wobei die Oligonucleotidprimer zwischen einer modifizierten methylierten und einer nicht-methylierten Nucleinsäure unterscheiden, und den Nachweis der methylierten Nucleinsäure umfasst. Es ist selbstverständlich, dass der Amplifikationsschritt, obwohl wahlweise, in dem bevorzugten Verfahren der Erfindung bevorzugt wird. Das Verfahren der Erfindung basiert auf der PCR-Reaktion selbst, um zwischen einer modifizierten (z.B. chemisch modifizierten) methylierten DNA und einer unmethylierten DNA zu unterscheiden.
Der Begriff "modifiziert", wie hierin verwendet, bedeutet die Umwandlung eines unmethylierten Cytosins in ein anderes Nucleotid, wodurch das unmethylierte von dem methylierten Cytosin unterschieden wird. Vorzugsweise modifiziert das Agens unmethyliertes Cytosin zu Uracil. Vorzugsweise ist das Agens, welches zur Modifikation von unmethyliertem Cytosin verwendet wird, Natriumbisulfit; jedoch können andere Mittel, welche in ähnlicher Weise unmethyliertes Cytosin, aber nicht methyliertes Cytosin modifizieren, ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Natriumbisulfit (NaHSO₃) reagiert leicht mit der 5,6-Doppelbindung von Cytosin, aber kaum mit methyliertem Cytosin. Cytosin reagiert mit dem Bisulfition unter Bildung eines sulfonierten Cytosin-Reaktionszwischenprodukts, welches für eine Desaminierung empfindlich ist, wobei ein sulfoniertes Uracil erzeugt wird. Die Sulfonatgruppe kann unter alkalischen Bedingungen eliminiert werden, woraus die Bildung von Uracil resultiert. Uracil wird durch die Taq-Polymerase und daher bei der PCR als ein Thymin erkannt, wobei das erhaltene Produkt nur an der Position, an der ein 5-Methylcytosin in der DNA-Ausgangsmatrize vorkommt, ein Cytosin enthält.
Die in der Erfindung verwendeten Primer für die Amplifikation der CpG-enthaltenden Nucleinsäure in der Probe nach der Bisulfitmodifikation unterscheiden spezifisch zwischen unbehandelter oder unmodifizierter DNA, methylierter und nicht-methylierter DNA. Die MSP-Primer für die nicht-methylierte DNA besitzen vorzugsweise ein T in dem 3'-CG-Paar, um dieses von dem C zu unterscheiden, das in einer methylierten DNA verbleibt, und das Komplement davon ist als Antisense-Primer gedacht. Die MSP-Primer enthalten üblicherweise relativ wenige Cs oder Gs in der Sequenz, da in dem Sense-Primer keine Cs vorkommen und in dem Antisense-Primer keine Gs vorhanden sind (C wird zu U (Uracil) modifiziert, welches als T (Thymidin) in dem Amplifikationsprodukt amplifiziert wird).
Die erfindungsgemäßen Primer umfassen Oligonucleotide mit einer ausreichenden Länge und geeigneten Sequenz, um die spezifische Initiation der Polymerisation bei einer wesentlichen Zahl von Nucleinsäuren an dem polymorphen Locus vorzusehen. Genauer verweist der Begriff "Primer", wie hierin verwendet, auf eine Sequenz, umfassend zwei oder mehrere Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide, vorzugsweise mehr als drei und am meisten bevorzugt mehr als acht, wobei die Sequenz fähig ist, die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das im Wesentlichen komplementär zu einem Strang an dem polymorphen Locus ist, zu initiieren. Die Umgebungsbedingungen, welche die Synthese begünstigen, schließen das Vorhandensein von Nucleosidtriphosphaten und eines Mittels für die Polymerisation wie einer DNA-Polymerase und eine(n) geeignete(n) Temperatur und pH-Wert ein. Der Primer ist für eine optimale Wirksamkeit bei der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, aber kann auch doppelsträngig sein. Falls doppelsträngig, wird der Primer zuerst behandelt, um die Stränge davon zu trennen, bevor er verwendet wird, um Verlängerungsprodukte herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Anwesenheit des induzierenden Agens für die Polymeri sation zu initiieren. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren einschließlich Temperatur, Puffer und Nucleotidzusammensetzung ab. Der Oligonucleotidprimer enthält typischerweise 12–20 oder mehr Nucleotide, obwohl er auch weniger Nucleotide enthalten kann.
Die Primer der Erfindung sind so konstruiert, dass sie zu jedem Strang des zu amplifizierenden genomischen Locus "im Wesentlichen" komplementär sind und die geeigneten G- oder C-Nucleotide, wie vorstehend besprochen, einschließen. Das bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, damit sie mit ihren jeweiligen Strängen unter Bedingungen, welche erlauben, dass das Agens für die Polymerisation wirksam ist, hybridisieren. Mit anderen Worten sollten die Primer eine ausreichende Komplementarität mit den umgebenden 5'- und 3'-Sequenzen aufweisen, um damit zu hybridisieren und die Amplifikation des genomischen Locus zu erlauben. Obwohl beispielhafte Primer in SEQ ID NO: 105–208 bereitgestellt werden, ist es selbstverständlich, dass jeder Primer, der mit den Zielsequenzen in SEQ ID NO: 1–104 hybridisiert, in der Erfindung eingeschlossen ist und in dem Verfahren der Erfindung zum Nachweis von methylierter Nucleinsäure, wie beschrieben, nützlich ist.
Die Oligonucleotidprimer der Erfindung werden in dem Amplifikationsprozess verwendet, welcher eine enzymatische Kettenreaktion ist, die exponentielle Mengen des Ziellocus im Verhältnis zur Anzahl der beteiligten Reaktionsschritte erzeugt. Typischerweise ist ein Primer zu dem negativen (–) Strang des Locus komplementär und ist der andere zu dem positiven (+) Strang komplementär. Die Anlagerung der Primer an eine denaturierte Nucleinsäure, gefolgt durch die Verlängerung mittels eines Enzyms wie dem großen Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Nucleotiden, resultiert in neu synthetisierten (+)- und (–)-Strängen, welche die Ziellocus-Sequenz enthalten. Da diese neu synthetisierten Sequenzen auch Matrizen sind, resultieren wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primeranlagerung und Verlängerung in einer exponentiellen Herstellung der Region (d.h., der Ziellocus-Sequenz), welche durch den Primer definiert wird. Das Produkt der Kettenreaktion ist ein einzelnes Nucleinsäureduplexmolekül mit Termini, welche den Enden der spezifischen Primer, welche verwendet wurden, entsprechen.
Die Oligonucleotidprimer der Erfindung können mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens wie herkömmlichen Phosphotriester- und Phosphodiestermethoden oder automatisierten Ausführungsformen davon hergestellt werden. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können nach der Beschreibung von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859–1862) hergestellt werden. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten, festen Träger wird in US-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben.
Jede Nucleinsäureprobe in gereinigter oder ungereinigter Form kann als die Ausgangsnucleinsäure oder -säuren verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die spezifische Nucleinsäuresequenz, welche den Ziellocus (z.B. CpG) enthält, umfasst, oder im Verdacht steht, diese Sequenz zu enthalten. So kann in dem Verfahren zum Beispiel eine DNA oder RNA einschließlich Boten-RNA, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, verwendet werden. Falls eine RNA als Matrize verwendet wird, werden Enzyme und/oder Bedingungen verwendet, welche für die reverse Transkription der Matrize in DNA optimal sind. Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid, welches jeweils einen Strang davon enthält, verwendet werden. Ein Gemisch von Nucleinsäuren kann ebenfalls verwendet werden, oder es können die Nucleinsäuren, welche in einer vorherigen Amplifikationsreaktion hierin unter Verwendung derselben oder unterschiedlicher Primer hergestellt wurden, in gleicher Weise verwendet werden. Die spezifische Nucleinsäuresequenz, welche amplifiziert werden soll, d.h. der Ziellocus, kann eine Fraktion eines größeren Moleküls sein oder kann anfänglich als ein einzelnes Molekül vorliegen, so dass die spezifische Sequenz aus der gesamten Nucleinsäure besteht. Es ist nicht erforderlich, dass die Sequenz, welche amplifiziert werden soll, anfänglich in einer reinen Form vorliegt; wobei sie eine kleine Fraktion eines komplexen Gemisches, wie es in der gesamten menschlichen DNA enthalten ist, sein kann.
Die Nucleinsäure enthaltende Probe, welche zum Nachweis von methyliertem CpG verwendet wird, kann aus einer beliebigen Quelle stammen, einschließlich Gehirn-, Colon-, Urogenital-, hämopoetisches, Thymus-, Hoden-, Eierstock-, Gebärmutter-, Prostata-, Brust-, Colon-, Lungen- und Nierengewebe, und kann durch eine Vielzahl von Techniken, wie die durch Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, S. 280, 281, 1982) beschriebenen, extrahiert werden.
Falls die extrahierte Probe unrein ist (z.B. Plasma, Serum, Stuhl, Ejakulat, Sputum, Speichel, Liquor cerebrospinalis oder Blut oder eine in Paraffin eingebettete Probe), kann sie vor der Amplifikation mit einer Menge eines Reagens, welches wirksam ist, um die Zellen, Flüssigkeiten, Gewebe oder tierische Zellmembranen der Probe aufzuschließen und um den Strang oder die Stränge der Nucleinsäure(n) freizulegen und/oder zu trennen, behandelt werden. Durch diesen Lyse- und Nucleinsäure-Denaturierungsschritt zur Exposition und Trennung der Stränge wird ermöglicht, dass die Amplifikation sehr viel schneller abläuft.
Falls die Nucleinsäure-Zielsequenz der Probe zwei Stränge enthält, ist es erforderlich, die Stränge der Nucleinsäure zu trennen, bevor sie als Matrize verwendet werden kann. Die Strangtrennung kann entweder als ein separater Schritt oder gleichzeitig mit der Synthese der Primerverlängerungsprodukte durchgeführt werden. Diese Strangtrennung kann unter Verwendung von verschiedenen geeigneten, denaturierenden Bedingungen, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, herbeigeführt werden, wobei das Wort "denaturierend" alle solche Mittel einschließt. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen beinhaltet das Erwärmen der Nucleinsäure, bis sie denaturiert ist. Eine typische Wärmedenaturierung kann Temperaturen im Bereich von etwa 80°C bis 105°C für Zeiträume im Bereich von etwa 1 bis 10 Minuten einschließen. Die Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Klasse von Enzymen oder durch das Enzym RecA, welches eine Helicaseaktivität besitzt, und in Anwesenheit von RiboATP, welches bekanntermaßen DNA denaturiert, induziert werden. Die für die Strangtrennung von Nucleinsäuren mit Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen sind bei Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology 43 (1978), 63) beschrieben, und Techniken zur Verwendung von RecA werden bei C. Radding (Ann. Rev. Genetics 16 (1982), 405–437) besprochen.
Wenn komplementäre Stränge von Nucleinsäure oder -säuren getrennt werden, unabhängig davon, ob die Nucleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig war, sind die getrennten Stränge zur Verwendung als eine Matrize für die Synthese von weiteren Nucleinsäuresträngen einsatzfähig. Diese Synthese wird unter Bedingungen durchgeführt, welche die Hybridisierung der Primer mit den Matrizen erlauben. Im Allgemeinen findet die Synthese in einer gepufferten wässrigen Lösung vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, am meisten bevorzugt etwa 8, statt. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für genomische Nucleinsäure üblicherweise etwa 10⁸:1 Primer:Matrize) der zwei Oligonucleotidprimer zu dem die getrennten Matrizenstränge enthaltenden Puffer zugegeben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die Menge des komplementären Strangs unbekannt sein kann, falls das Verfahren der Erfindung für diagnostische Anwendungen verwendet wird, so dass die Menge des Primers im Verhältnis zu der Menge des komplementären Strangs nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Praktischerweise jedoch umfasst die Menge des zugegebenen Primers im Allgemeinen einen molaren Überschuß im Vergleich zu der Menge des komplementären Strangs (Matrize), wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplexen langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
Die Desoxyribonucleosidtriphosphate dATG, dCTG, dGTG und dTTG werden entweder getrennt oder zusammen mit den Primern in ausreichenden Mengen zu dem Synthesegemisch zugegeben, und die erhaltene Lösung wird auf etwa 90–100°C für etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten, erwärmt. Nach diesem Erwärmungszeitraum läßt man die Lösung auf Raumtemperatur, die zur Primerhybridisierung bevorzugt wird, abkühlen. Zu dem abgekühlten Gemisch wird ein geeignetes Agens zum Herbeiführen der Primerverlängerungsreaktion (hierin bezeichnet als "Agens für die Polymerisation") zugegeben, und man läßt die Reaktion unter Bedingungen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, ablaufen. Das Agens für die Polymerisation kann auch zusammen mit den anderen Reagenzien zugegeben werden, falls es hitzestabil ist. Diese Synthesereaktion (oder Amplifikationsreaktion) kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, oberhalb welcher das Agens für die Polymerisation nicht länger wirksam ist, durchgeführt werden. So ist zum Beispiel, falls eine DNA-Polymerase für das Agens verwendet wird, die Temperatur im Allgemeinen nicht höher als etwa 40°C. Am geeignetsten erfolgt die Umsetzung bei Raumtemperatur.
Das Agens für die Polymerisation kann eine Verbindung oder ein System sein, welche(s) wirksam ist, um die Synthese von Primerverlängerungsprodukten zu bewirken, einschließlich Enzyme. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen zum Beispiel E. coli-DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere erhältliche DNA-Polymerasen, Polyme rase-Muteine, reverse Transkriptase und andere Enzyme einschließlich hitzestabiler Enzyme (d.h. solcher Enzyme, welche die Primerverlängerung bewirken, nachdem sie ausreichend erhöhten Temperaturen unterworfen werden, um eine Denaturierung hervorzurufen) ein. Geeignete Enzyme erlauben die Kombination der Nucleotide in der geeigneten Weise, um die Primerverlängerungsprodukte zu bilden, die zu jedem Locus-Nucleinsäurestrang komplementär sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in der 5'-Richtung entlang des Matrizenstrangs fort, bis die Synthese abbricht, wobei Moleküle unterschiedlicher Länge erzeugt werden. Jedoch können Agenzien für die Polymerisation anwesend sein, welche die Synthese mit Hilfe des gleichen Prozesses, wie vorstehend beschrieben, am 5'-Ende initiieren und in die andere Richtung voranschreiten.
Bei Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktionen variieren die verwendeten Bedingungen, um einen bestimmten Grad an Stringenz zu erzielen, abhängig von der Art der Nucleinsäuren, welche hybridisiert werden. Zum Beispiel können die Länge, der Grad der Komplementarität, die Nucleotidsequenzzusammensetzung (z.B. GC- vs. AT-Gehalt) und der Nucleinsäuretyp (z.B. RNA vs. DNA) der hybridisierenden Regionen der Nucleinsäuren bei der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen berücksichtigt werden. Von weiterer Bedeutung ist, ob eine der Nucleinsäuren zum Beispiel an einen Filter immobilisiert ist.
Ein Beispiel für Bedingungen mit einer zunehmend höheren Stringenz ist wie folgt: 2 × SSC/0,1% SDS bei etwa Raumtemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2 × SSC/0,1% SDS bei etwa Raumtemperatur (Bedingungen niedriger Stringenz); 0,2 × SSC/0,1% SDS bei etwa 42°C (Bedingungen mittlerer Stringenz); und 0,1 × SSC bei etwa 68°C (Bedingungen hoher Stringenz). Das Waschen kann nur unter einer dieser Bedingungen, z.B. Bedingungen hoher Stringenz, durchgeführt werden, oder jede der Bedingungen kann in der vorstehend angeführten Reihenfolge, z.B. für jeweils 10–15 Minuten, verwendet werden, wobei einer oder alle der aufgeführten Schritte wiederholt werden. Jedoch, wie vorstehend erwähnt, variieren die optimalen Bedingungen abhängig von der einzelnen beteiligten Hybridisierungsreaktion und können empirisch ermittelt werden.
Vorzugsweise wird das Verfahren zur Amplifizierung mit Hilfe der PCR, wie hierin beschrieben und wie im Allgemeinen durch Fachleute angewendet, durchgeführt. Andere Verfahren zur Amplifikation sind beschrieben worden und können ebenfalls angewendet werden, solange die methylierten und nicht-methylierten Loci, welche mit Hilfe der PCR unter Verwendung der Primer der Erfindung amplifiziert werden, durch die anderen Mittel in ähnlicher Weise amplifiziert werden.
Die amplifizierten Produkte werden vorzugsweise durch Sequenzierung als methyliert oder nicht-methyliert identifiziert. Sequenzen, welche durch die Verfahren der Erfindung amplifiziert werden, können entweder in Lösung oder nach Bindung an einen festen Träger durch ein beliebiges Verfahren, welches üblicherweise zum Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz angewendet wird, wie PCR, Oligomer-Restriktion (Saiki et al., Bio/Technology 3 (1985), 1008–1012), allelspezifische Oligonucleotid (ASO)-Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 278), Oligonucleotid-Ligierungstests (OLAs) (Landegren et al., Science 241 (1988), 1077) und dergleichen, weiterhin beurteilt, identifiziert, cloniert, sequenziert und dergleichen werden. Molekulare Techniken zur DNA-Analyse sind besprochen worden (Landegren et al., Science 242 (1988), 229–237).
Wahlweise kann das Methylierungsmuster der Nucleinsäure durch eine Restriktionsenzymspaltung und Southern-Blot-Analyse bestätigt werden. Beispiele für methylierungssensitive Restriktionsendonucleasen, welche zum Nachweis einer 5'-CpG-Methylierung verwendet werden können, schließen zum Beispiel SmaI, SacII, EagI, MspI, HpaII, BstUI und BssHII ein.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Zelle, welche eine methylierte CpG-Insel aufweist, oder einer Zellproliferationsstörung, welche mit einem methylierten CpG assoziiert ist, in einem Gewebe oder einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums bereit, welches das Inkontaktbringen einer Zielzellkomponente, die im Verdacht steht, ein Gen zu exprimieren, das ein methyliertes CpG besitzt oder eine CpG-assoziierte Störung aufweist, mit einem Agens, welches an die Komponente bindet, umfasst. Die Zielzellkomponente kann eine Nucleinsäure wie DNA oder RNA oder ein Protein sein. Wenn die Komponente eine Nucleinsäure ist, ist das Reagens eine Nucleinsäuresonde oder ein PCR-Primer. Wenn die Zellkomponente ein Protein ist, ist das Reagens eine Antikörpersonde. Die Sonden können zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym nachweisbar markiert sein. Den Fachleuten sind andere geeignete Marker zur Bindung an den Antikörper bekannt oder sie können solche mittels Routineversuchen ermitteln.
Aktiv transkribierte Gene enthalten im Allgemeinen weniger methylierte CGs als die durchschnittliche Anzahl in der DNA. Eine Hypermethylierung kann mit Hilfe einer Restriktionsendonuclease-Behandlung und einer Southern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Daher wird in einem Verfahren der Erfindung, falls die nachgewiesene Zellkomponente eine DNA ist, eine Restriktionsendonuclease-Analyse bevorzugt, um zum Beispiel eine Hypermethylierung des Promotors nachzuweisen. Jede Restriktionsendonuclease, welche CG als Teil ihrer Erkennungsstelle umfasst und welche inhibiert wird, wenn das C methyliert ist, kann verwendet werden. Vorzugsweise ist die methylierungssensitive Restriktionsendonuclease BssHII, MspI oder HpaII, welche allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Andere methylierungssensitive Restriktionsendonucleasen sind den Fachleuten bekannt.
Für die Zwecke der Erfindung kann ein Antikörper oder eine Nucleinsäuresonde, welche für ein Gen oder Genprodukt spezifisch sind, zum Nachweis der Anwesenheit einer Methylierung, entweder durch den Nachweis der Menge des Polypeptids (unter Verwendung eines Antikörpers) oder der Methylierung des Polynucleotids (unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde) in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, verwendet werden. Für den Nachweis auf Antikörper-Basis wird die Menge des Polypeptids mit der Menge des Polypeptids, welche in einem entsprechenden "normalen" Gewebe vorhanden ist, verglichen. Oligonucleotidprimer, welche zum Beispiel auf einer codierenden Sequenzregion des Promotors in der TIMP-2-, Östrogenrezeptor-, GST-pi-, Calcitonin-, HIC-1- oder MLH1-Sequenz basieren, sind zur Amplifikation einer DNA, zum Beispiel mit Hilfe der PCR, geeignet. Diese Gene werden lediglich als Beispiele angeführt und sollen keine Begrenzung darstellen. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge eines Polynucleotids oder Antigens enthält, kann verwendet werden. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.
Die vorliegende Erfindung stellt das Ergebnis vor, dass TIMP-2 in Krebsgewebe im Vergleich zu normalem Gewebe methyliert ist. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass TIMP-2 in Colonkrebsgewebe, aber nicht in normalem Colongewebe methyliert ist. Das Verfahren zum Nachweis einer Zelle, welche ein Gen wie TIMP-2 exprimiert, oder einer Zellproliferationsstörung, welche mit der Methylierung von CpG-enthaltendem TIMP-2 assoziiert ist, oder eines Gens, einschließlich der vorstehend beschriebenen, kann zum Nachweis einer residualen Krebserkrankung oder anderer Malignitäten in einem Individuum in einem Zustand der klinischen Remission angewendet werden. Außerdem ist das Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids in Zellen zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung durch Messen der Menge des Polypeptids in Zellen, welche das Polypeptid exprimieren, in einem verdächtigen Gewebe im Vergleich zu dem Polypeptid, das in normalen Zellen oder Geweben exprimiert wird, nützlich. Unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Expression eines Gens wie TIMP-2 in einer Zelle identifiziert werden, und der geeignete Behandlungsverlauf kann ermittelt werden (z.B. eine Sense-Gentherapie oder Arzneistofftherapie). Das Expressionsmuster des Gens, z.B. TIMP-2, kann mit dem Status der Malignität einer Zelle variieren, daher kann eine Probe wie Brust- oder Colongewebe mit einer Reihe von Gen- oder Genprodukt-spezifischen Reagenzien (d.h. Nucleinsäuresonden oder Antikörpern) abgesucht werden, um eine Genexpression, z.B. TIMP-2, nachzuweisen und den Status der Malignität der Zelle zu diagnostizieren.
Monoclonale Antikörper können in dem Verfahren der Erfindung zum Beispiel in Immuntests in einer flüssigen Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden. Außerdem können die monoclonalen Antikörper in diesen Immuntests in unterschiedlicher Weise nachweisbar markiert sein. Beispiele für Typen von Immuntests, in denen erfindungsgemäße monoclonale Antikörper verwendet werden können, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immuntests in entweder einer direkten oder indirekten Anordnung. Beispiele solcher Immuntests sind der Radioimmuntest (RIA) und der Sandwich (immunometrische)-Test. Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper kann mit Hilfe von Immuntests, welche in entweder einem Vorwärts-, umgekehrten oder gleichzeitigen Modus durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischer Tests mit physiologischen Proben, erfolgen. Den Fachleuten sind andere Immuntestanordnungen bekannt oder sie können solche ohne übermäßiges Experimentieren leicht ermitteln.
Der Begriff "immunometrischer Test" oder "Sandwich-Immuntest" schließt gleichzeitige Sandwich-, Vorwärts-Sandwich- und umgekehrte Sandwich-Immuntests ein. Diese Begriffe sind den Fachleuten hinreichend bekannt. Den Fachleuten ist auch bewußt, dass die erfindungsgemäßen Antikörper in anderen Abwandlungen und Formen von Tests, welche gegenwärtig bekannt sind oder welche in Zukunft entwickelt werden, nützlich sind. Diese sollen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
Monoclonale Antikörper können an viele verschiedene Träger gebunden und zum Nachweis der Anwesenheit von TIMP-2 verwendet werden. Beispiele für hinreichend bekannte Träger schließen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit ein. Die Art des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Den Fachleuten sind andere geeignete Träger zur Bindung von monoclonalen Antikörpern bekannt oder sie können solche mittels Routineversuchen ermitteln.
Für die Zwecke der Erfindung kann TIMP-2, falls in biologischen Flüssigkeiten und Geweben vorhanden, durch die monoclonalen Antikörper nachgewiesen werden. Jede Probe, welche eine nachweisbare Menge an TIMP-2 enthält, kann verwendet werden. Eine Probe kann eine Flüssigkeit wie Ejakulat, Urin, Speichel, Liquor cerebrospinalis, Blut, Serum und dergleichen oder ein Feststoff oder Halbfeststoff wie Gewebe, Fäkalien und dergleichen oder alternativ ein Gewebe von fester Beschaffenheit, wie solche, welche gewöhnlich bei der histologischen Diagnose verwendet werden, sein.
Bei der Durchführung der Tests kann es wünschenswert sein, bestimmte "Blocker" in das Inkubationsmedium einzuschließen (üblicherweise zugegeben zusammen mit dem markierten löslichen Antikörper). Die "Blocker" werden zugegeben, um sicherzustellen, dass unspezifische Proteine, Proteasen oder anti-heterophile Immunglobuline gegen anti-TIMP-2-Immunglobuline, welche in der Versuchsprobe vorhanden sind, die Antikörper auf dem Festphasenträger oder den radioaktiv markierten Indikatorantikörper nicht vernetzen oder zerstören, wodurch falsch positive oder falsch negative Ergebnisse erhalten werden. Die Wahl von "Blockern" kann daher wesentlich zur Spezifität der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Tests beitragen.
Bei der Verwendung eines monoclonalen Antikörpers für den in-vivo-Nachweis eines Antigens wird der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper in einer diagnostisch wirksamen Dosis verabreicht. Der Begriff "diagnostisch wirksam" bedeutet, dass die Menge des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers in einer ausreichenden Quantität verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle mit dem TIMP-2-Antigen, für das die monoclonalen Antikörper spezifisch sind, zu ermöglichen.
Die Konzentration des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers, welche verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an solche Zellen, welche TIMP-2 aufweisen, im Vergleich zu dem Hintergrund nachweisbar ist. Ferner ist es wünschenswert, dass der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper schnell aus dem Blutkreislauf ausgeschieden wird, um ein optimales Ziel-zu-Hintergrund-Signalverhältnis zu erhalten.
In der Regel variiert die Dosierung des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers für die in-vivo-Diagnose abhängig von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung des Individuums. Die Dosierung des monoclonalen Antikörpers kann von etwa 0,001 mg/m² bis etwa 500 mg/m², vorzugsweise 0,1 mg/m² bis etwa 200 mg/m², am meisten bevorzugt etwa 0,1 mg/m² bis etwa 10 mg/m², variieren. Solche Dosierungen können zum Beispiel abhängig davon, ob mehrere Injektionen verabreicht werden, der Tumorbelastung und anderen Faktoren, welche den Fachleuten bekannt sind, variieren.
Für die in-vivo-Diagnoseabbildung ist der Typ des verfügbaren Nachweisinstruments ein wichtiger Faktor bei der Auswahl eines bestimmten Radioisotops. Das gewählte Radioisotop muss einen Zerfallstyp aufweisen, welcher für einen bestimmten Instrumententyp nachweisbar ist. Ein noch anderer wichtiger Faktor bei der Auswahl eines Radioisotops für die in-vivo-Diagnose ist, dass die Halbwertszeit des Radioisotops ausreichend lang ist, so dass es noch zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Zielobjekt nachweisbar ist, aber ausreichend kurz ist, so dass die schädliche Strahlung im Hinblick auf den Wirt auf ein Minimum verringert wird. Idealerweise zeigt ein Radioisotop, welches für die in-vivo-Abbildung verwendet wird, keine Partikelemission, aber erzeugt eine große Zahl von Photonen im Bereich von 140–250 keV, welcher durch herkömmliche Gammakameras ohne weiteres nachgewiesen werden kann.
Ein monoclonaler Antikörper, der in dem Verfahren der Erfindung nützlich ist, kann für die Zwecke der in-vivo-Diagnose auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden, wie bei der Magnetresonanzabbildung (MRI) oder Elektronenspinresonanz (ESR). Im Allgemeinen kann irgendein geeignetes Verfahren zum Sichtbarmachen einer Diagnoseabbildung angewendet werden. Für die Kameraabbildung werden herkömmliche Gammastrahlen und Positronen emittierende Radioisotope verwendet, und für die MRI werden paramagnetische Isotope verwendet. Elemente, welche bei solchen Techniken besonders nützlich sind, schließen ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe ein.
Monoclonale Antikörper, welche in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, können benutzt werden, um den Verlauf der Besserung einer TIMP-2-assoziierten Zellproliferationsstörung zu überwachen. Demnach wäre es möglich, durch Messung der Zunahme oder Abnahme der Zahl der Zellen, welche TIMP-2 exprimieren, oder von vorhandenen Veränderungen im Hinblick auf TIMP-2 in verschiedenen Körperflüssigkeiten zu bestimmen, ob ein bestimmtes Therapieschema, welches das Ziel hat, die Störung zu bessern, wirksam ist.
Der Begriff "modulieren" umfasst die Suppression der Methylierung von TIMP-2 (z.B. des Promotors) oder die Erhöhung der TIMP-2-Genexpression, wenn TIMP-2 unterexprimiert wird. Wenn eine Zellproliferationsstörung mit der TIMP-2-Expression assoziiert ist, können solche die Methylierung unterdrückenden Reagenzien wie 5-Azacytadin in eine Zelle eingebracht werden. Alternativ, falls eine Zellproliferationsstörung mit der Unterexpression des TIMP-2-Polypeptids assoziiert ist, kann eine Sense-Polynucleotidsequenz (der DNA codierende Strang), welche die Promotorregion oder den Promotor, funktionell verbunden mit dem Strukturgen, oder das TIMP-2-Polypeptid codiert, in die Zelle eingebracht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Gentherapie zur Behandlung von Zellproliferationsstörungen, welche durch TIMP-2 vermittelt werden, bereit. Bei einer solchen Therapie würde die therapeutische Wirkung davon durch das Einbringen des geeigneten TIMP-2-Polynucleotids, welches entweder eine normale TIMP-2-Promotorregion allein oder in Kombination mit einem TIMP-2-Strukturgen (Sinnstrang) enthält, in Zellen von Individuen, welche an der Zellproliferationsstörung leiden, erreicht werden. Alternativ könnte das TIMP-2-Strukturgen, mit einem heterologen Promotor funktionell verbunden, eingeführt werden. Die Abgabe von Sinnstrang-TIMP-2-Promotor-Polynucleotid-Konstrukten kann unter Verwendung eines rekombi nanten Expressionsvektors wie eines chimären Virus oder eines kolloidalen Dispersionssystems erreicht werden.
Die Promotor-Polynucleotid-Sequenzen, welche in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, können native unmethylierte Sequenzen sein oder können alternativ eine Sequenz einschließen, in welcher ein nicht-methylierbares Analogon innerhalb der Sequenz substituiert ist. Vorzugsweise ist das Analogon ein nicht-methylierbares Analogon von Cytidin wie 5-Azacytadin. Andere Analoga sind den Fachleuten bekannt. Alternativ können solche nicht-methylierbaren Analoga allein oder gleichzeitig mit einem Sinnstrang-Promotor für TIMP-2 oder einem Sinnstrang-Promotor, welcher mit dem Strukturgen für das entsprechende Gen funktionell verbunden ist (z.B. der TIMP-2-Promotor mit dem TIMP-2-Strukturgen), als Arzneistofftherapie an ein Individuum verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Medikament oder ein Arzneimittel, umfassend ein TIMP-2-Promotor-Polynucleotid bzw. ein TIMP-2-Promotor-Polynucleotid, das mit dem TIMP-2-Strukturgen funktionell verbunden ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Medium, wobei das Medikament zur Therapie von TIMP-2-assoziierten Zellproliferationsstörungen verwendet wird.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung der MSP zur in-situ-Methylierungsanalyse bereit. Zum Beispiel kann die MSP angewendet werden, um eine Methylierung der DNA im Kern einer intakten Zelle nachzuweisen. Ein Gewebeschnitt, eine Zelle oder eine Population von Zellen wird auf einen festen Träger (z.B. einen Objektträger) aufgebracht oder darauf immobilisiert, und die MSP-Primer werden direkt auf der Zelle zur Amplifizierung der geeigneten Sequenzen verwendet. Die Primer sind typischerweise mit einem Reporter, z.B. einem fluoreszierenden Marker, nachweisbar markiert. Alternativ wird eine Sonde, welche die mit Hilfe der MSP amplifizierten Sequenzen nachweist oder damit hybridisiert, zum Nachweis der Amplifikation von methylierten Sequenzen verwendet. Die in-situ-Methylierungsanalyse mit Hilfe der MSP ist zum Beispiel beim Nachweis einer Nucleinsäure mit einer mutierten Nucleotidsequenz in Assoziation mit einem Primärtumor in den benachbarten histopathologischen Operationsrändern und weiter entfernten Geweben wie den regionalen Lymphknoten, welche bei der Untersuchung durch herkömmliche histologische Techniken anscheinend "normal" sind, nützlich. Mit Hilfe der MSP ist es möglich, Zielnucleinsäuren, welche bereits mit einer großen Zahl von Krankheitszuständen assoziiert wurden, von Zellen, welche in einem Gewebe vorhanden sind, das normal erscheint, nachzuweisen. Eine MSP in situ kann als ein Hilfsmittel zur Cytophathologie verwendet werden, um Hochrisikopopulationen zu durchmustern und um Hochrisikopatienten, welche sich einer Chemoprävention oder Chemotherapie unterziehen, zu überwachen.
Beispielhafte Zielpolynucleotidsequenzen, mit welchen der Primer der Erfindung hybridisiert, weisen die nachstehend aufgeführten Sequenzen auf:
In der Erfindung eingeschlossene beispielhafte Primerpaare, welche mit den vorstehenden Sequenzen hybridisieren, schließen ein:

* Ebenfalls eingeschlossen sind Modifikationen der vorstehenden Sequenzen, einschließlich SEQ ID NO: 107 mit der Sequenz TCAC am 5'-Ende (SEQ ID NO: 214); SEQ ID NO: 107 mit der am 5'-Ende angehängten Sequenz CC (SEQ ID NO: 215); SEQ ID NO: 107 mit der Sequenz 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'; SEQ ID NO: 108 mit der Sequenz 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'; SEQ ID NO: 110 mit der am 5'-Ende angehängten Sequenz TGG (SEQ ID NO: 216); und SEQ ID NO: 107 mit der am 5'-Ende angehängten Sequenz TACC (SEQ ID NO: 111). Alle diese modifizierten Primer hybridisieren bei 65 DEG C.

Typischerweise liegt die CpG-enthaltende Nucleinsäure innerhalb der Region des Promotors eines Strukturgens. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass die Promotorregion von Tumorsuppressorgenen eine methylierte CpG-Insel enthält. Die Promotorregion von Tumorsuppressorgenen, einschließlich p16, p15, VHL und E-Cadherin, ist typischerweise die Sequenz, welche in dem Verfahren der Erfindung mit Hilfe der PCR amplifiziert wird. Andere Gene, für welche mit Hilfe der MSP gezeigt worden ist, dass sie methyliertes CpG in neoplastischem vs. normalem Gewebe enthalten, schließen den Östrogenrezeptor, MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin-B-Rezeptor, TIMP-2, 06-MGMT und MLH1 ein. Gene, für welche mit Hilfe der MSP festgestellt wurde, dass sie methyliert sind, schließen auch den Androgenrezeptor (z.B. methyliert als X-Chromosomen-Inaktivierung), GFAP (methyliert in einigen Gliablastomzelllinien, aber auch in normalem Gewebe) und MSH2 ein.
Andere Gene, für welche gezeigt wurde, dass ein MSP-Primer zwischen normaler unmethylierter und methylierter DNA unterscheidet, schließen TGF-β1, TGF-β2, p130, BRCA2, NF1, NF2 und TSG101 ein.
Der Nachweis und die Identifizierung einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure in der Probe kann auf eine Zellproliferationsstörung oder Neoplasie hindeuten. Solche Störungen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Astrocytom geringen Grades, anaplastisches Astrocytom, Glioblastom, Medulloblastom, Colonkrebs, Lungenkrebs, Nierenkrebs, Leukämie, Brustkrebs, Prostatakrebs, Endometriumkarzinom und Neuroblastom ein. Die Feststellung des methylierten CpG-Status ist auch für den Nachweis und die Diagnose einer Genprägung, des fragilen-X-Syndroms und einer X-Chromosomen-Inaktivierung nützlich.
Mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung wurde gezeigt, dass das TIMP-2-Gen mit neoplastischen vs. normalen Geweben assoziiert oder darin methyliert ist.
Das Verfahren der Erfindung bildet nun die Grundlage für einen Kit, welcher zum Nachweis einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure nützlich ist. Der Kit beinhaltet ein Trägermittel, das in Kompartimente aufgeteilt ist, um auf engem Raum einen oder mehrere Behälter darin aufzunehmen. Zum Beispiel enthält ein erster Behälter ein Reagens, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, wie Natriumbisulfit. Ein zweiter Behälter enthält Primer für die Amplifikation der CpG-enthaltenden Nucleinsäure, zum Beispiel die vorstehend als SEQ ID NO: 105–208 aufgeführten Primer.
Die Erfindung stellt auch einen Kit für den Nachweis einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure bereit, wobei der Kit beinhaltet: a) ein Reagens, welches unmethylierte Cytosinnucleotide modifiziert; b) eine Kontrollnucleinsäure; c) Primer für die Amplifikation einer unmethyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure; d) Primer für die Amplifikation einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure; und e) Primer für die Amplifikation der Kontrollnucleinsäure. Der Kit kann ferner einen Nucleinsäure-Amplifikationspuffer einschließen. Vorzugsweise ist das Reagens, welches unmethyliertes Cytosin modifiziert, Bisulfit.
Der Kit der Erfindung soll die Reagenzien bereitstellen, welche erforderlich sind, um die chemische Modifikation und die PCR-Amplifikation von DNA-Proben zur Bestimmung ihres Methylierungsstatus durchzuführen. Die in dem Kit eingeschlossenen Primersätze schließen einen Satz, welcher mit unmethylierter DNA, die einer chemischen Modifikation unterworfen war, hybridisiert; einen Satz, welcher mit methylierter DNA, die einer chemischen Modifikation unterworfen war, hybridisiert; und einen Primersatz, welcher als eine Kontrolle für die Wirksamkeit der chemischen Modifikation dient, ein. Der Kontroll-Primersatz sollte mit jeder DNA (unmethyliert oder methyliert) hybridisieren, welche einer chemischen Methylierung unterworfen war. Im Falle einer unvollständigen chemischen Modifikation (bis zu etwa 50%) kann die Dateninterpretation noch Fortschritte machen.
Die vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, welche hierin lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden und den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen sollen, kann ein besseres Verständnis erreicht werden.
Beispiel 1
DNA und Zelllinien
Die genomische DNA wurde, wie beschrieben (Merlo et al., Nature Medicine 1 (1995), 686; Herman et al., Cancer Research 56 (1996), 722; Graff et al., Cancer Research 55 (1995), 5195), von Zellinien, Primärtumoren und normalem Gewebe erhalten. Die Nierenkarzinomzelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Michael Lehrman vom National Cancer Institute, Bethesda, MD, bereitgestellt.
Bisulfitmodifikation
1 μg DNA in einem Volumen von 50 μl wurde durch NaOH (Endkonzentration 0,2 M) für 10 Minuten bei 37°C denaturiert. Für Proben mit Mengen von menschlicher DNA im Nanogrammbereich wurde 1 μg Lachssperma-DNA (Sigma) als Träger vor der Modifikation zugegeben. 30 μl von 10 mM Hydrochinon (Sigma) und 520 μl von 3 M Natriumbisulfit (Sigma), pH 5, beides frisch hergestellt, wurden zugegeben und eingemischt, und die Proben wurden unter Mineralöl bei 50°C für 16 Stunden inkubiert. Die modifizierte DNA wurde unter Verwendung des Wizard^TM-DNA-Reinigungsharzes gemäß dem Hersteller (Promega) aufgereinigt und in 50 μl Wasser eluiert. Die Modifikation wurde durch eine NaOH-Behandlung (Endkonzentration 0,3 M) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt durch eine Ethanolfällung, beendet.
Genomische Sequenzierung
Die genomische Sequenzierung der Bisulfit-modifizierten DNA wurde nach dem Festphasen-DNA-Sequenzierungsansatz (Myohanen et al., DNA Seq. 5 (1994), 1) durchgeführt. 100 ng der Bisulfit-modifizierten DNA wurden mit dem p16-Genspezifischen Primer 5'-TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG-3' (Sense) (SEQ ID NO: 209) und 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (Antisense) (SEQ ID NO: 210) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 96°C für 3 Minuten, 80°C für 3 Minuten, Zugabe von 1 E Taq-Polymerase (BRL), gefolgt von 35 Zyklen bei 96°C für 20 Sekunden, 56°C für 20 Sekunden, 72°C für 90 Sekunden, gefolgt von 5 Minuten bei 72°C. Das PCR-Gemisch enthielt 1 × Puffer (BRL) mit 1,5 mM MgCl₂, 20 pMol jedes Primers und 0,2 mM dNTPs. Um Produkte für die Sequenzierung zu erhalten, wurde ein zweite PCR-Runde mit 5 pMol ineinandergeschachtelter Primer durchgeführt. Bei dieser Reaktion enthält der Sense-Primer,
die M13-40-Sequenz (unterstrichen), welche als eine Stelle eingeführt wurde, um die Sequenzierung zu initiieren, und ist der Antisense-Primer
biotinyliert, um die Reinigung des Produkts vor der Sequenzierung zu erleichtern. Die PCR wurde wie vorstehend über 32 Zyklen mit 2,5 mM MgCl₂ durchgeführt. Alle Primer für die genomische Sequenzierung wurden so konstruiert, dass irgendwelche CpGs in der Sequenz vermieden wurden. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen (Dynal AB, Norwegen) gereinigt, und die Sequenzierungsreaktionen wurden mit Sequenase^TM und dem M13-40-Sequenzierungsprimer unter den durch den Hersteller (USB) angegebenen Bedingungen durchgeführt.
PCR-Amplifikation
Die in Tabelle 1 beschriebenen Primerpaare wurden von Life Technologies bezogen. Das PCR-Gemisch enthielt 1 × PCR-Puffer (16,6 mM Ammoniumsulfat, 67 mM Tris, pH 8,8, 6,7 mM MgCl₂ und 10 mM β-Mercaptoethanol), dNTPs (jeweils zu 1,25 mM), Primer (jeweils 300 ng/Reaktion) und Bisulfit-modifizierte DNA (~50 ng) oder unmodifizierte DNA (50–100 ng) in einem Endvolumen von 50 μl. Die für unmodifizierte DNA spezifische PCR umfasste auch 5% Dimethylsulfoxid. Die Reaktionen wurden bei 95°C für 5 Minuten heiß gestartet, bevor 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (BRL) zugegeben wurden. Die Amplifikation wurde mit einer Hybaid OmniGene-Temperature-Cyclervorrichtung für 35 Zyklen (30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei der in Tabelle 1 angegebenen Anlagerungstemperatur und 30 Sekunden bei 72°C), gefolgt durch eine abschließende Verlängerung von 4 Minuten bei 72°C, ausgeführt. Für jeden Satz der PCR-Reaktionen wurden Kontrollen ohne DNA durchgeführt. 10 μl jeder PCR-Reaktion wurden direkt auf nicht-denaturierende 6–8%ige Polyacrylamidgele aufgetragen, mit Ethidiumbromid gefärbt, und mittels UV-Belichtung direkt sichtbar gemacht.
Restriktionsanalyse
10 μl der 50 μl-PCR-Reaktion wurden mit 10 Einheiten BstUI (New England Biolabs) für 4 Stunden unter den durch den Hersteller angegebenen Bedingungen gespalten. Die Restriktionsspaltprodukte wurden vor einer Gelanalyse mit Ethanol gefällt.
Beispiel 2
Eine erste Studie war erforderlich, um die Strategie für die MSP zur Ermöglichung einer Einschätzung des Methylierungsstatus von CpG-Inseln zu überprüfen. Der p16-Tumorsuppressor (Merlo et al., vorstehend; Herman et al., Cancer Research 55 (1995), 4525; Gonzalez-Zulueta et al., Cancer Res. 55 (1995), 4531, 27), für den offenbart worden ist, dass er eine Hypermethylierung einer 5'-CpG-Insel aufweist, welche mit dem vollständigen Verlust der Genexpression bei vielen Krebsarten assoziiert ist, wurde als ein beispielhaftes Gen verwendet, um zu bestimmen, ob die Methylierungsdichte in den zu testenden Schlüsselregionen ausreichend hoch war, um die hierin offenbarte Primerkonstruktion zu ermöglichen. Mit Ausnahme von CpG-Stellen, welche innerhalb der Erkennungssequenzen für methylierungssensitive Enzyme liegen, sind die Methylierungsdichte und deren Korrelation mit der Abschaltung der Transkription bisher noch nicht festgelegt worden. Daher wurde die Technik der genomischen Sequenzierung angewendet, um diese Beziehung zu untersuchen.
1 zeigt die genomische Sequenzierung von p16. Die gezeigte Sequenz besitzt am unteren Ende des Gels den größten Teil der 5'-Region, beginnend bei +175 in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt (Hara et al., Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859). Alle Cytosine in der unmethylierten Zelllinie H249 sind zu Thymidin umgewandelt worden, während alle Cs in den CpG-Dinucleotiden in der methylierten Zelllinie H157 als C verbleiben, was auf eine Methylierung hindeutet.] schließt eine BstUI-Stelle ein, die bei -59 in Bezug auf den Transnationalstartpunkt in der Genbank-Sequenz U12818 angeordnet ist (Hussussian et al., Nat. Genet. 8 (1994), 15), welche aber unrichtigerweise als CGCA in der Sequenz X94154 identifiziert ist (Hara et al., vorstehend). Diese CGCG-Stelle kennzeichnet die 3'-Stelle des Sense-Primers, welcher für die p16-MSP verwendet wurde.
Wie für andere CpG-Inseln gezeigt worden ist, welche auf diese Weise untersucht wurden (Myohanen et al., vorstehend; Park et al., Mol. Cell Biol. 14 (1994), 7975; Reeben et al., Gene 157 (1995), 325), war die CpG-Insel von p16 in solchen Zelllinien und in normalen Geweben, für die vorher durch eine Southern-Analyse gezeigt wurde, dass sie unmethyliert sind, vollständig unmethyliert (1) (Merlo et al., vorstehend; Herman et al., vorstehend). Jedoch war sie in Krebszelllinien, für die die durch eine Southern-Analyse gezeigt wurde, dass sie methyliert sind, weitgehend methyliert (1). In der Tat waren alle Cytosine innerhalb der CpG-Dinucleotide in dieser Region in den Krebsarten, welche keine Transkription von 16 zeigen, vollständig methyliert. Dieser merkliche Unterschied zwischen den Sequenzen nach der Bisulfitbehandlung legt nahe, dass das Verfahren der Erfindung zur spezifischen Amplifikation von entweder methylierten oder unmethylierten Allelen zur Identifizierung von Methylierungsmustern in einer DNA-Probe nützlich war.
Die Primer wurden so konstruiert, dass sie zwischen methylierten und unmethylierten Allelen nach der Bisulfitbehandlung und zwischen einer durch Bisulfit modifizierten DNA und derjenigen, die nicht modifiziert worden ist, unterscheiden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Primersequenzen für Regionen ausgewählt, welche häufig Cytosine (um eine unmodifizierte DNA von einer modifizierten DNA zu unterscheiden) sowie CpG-Paare nahe dem 3'-Ende der Primer (um eine maximale Unterscheidung zwischen methylierter und unmethylierter DNA in der PCR-Reaktion vorzusehen) enthalten. Da die zwei DNA-Stränge nach der Bisulfitbehandlung nicht länger komplementär sind, können Primer für jeden modifizierten Strang konstruiert werden. Der Einfachheit halber wurden Primer für den Sinnstrang konstruiert. Das zu amplifizierende DNA-Fragment war absichtlich klein, um die Einschätzung der Methy lierungsmuster in einer begrenzten Region zu erlauben und die Verwendung dieser Techniken für Proben wie Paraffinblöcke, bei denen die Amplifikation von größeren Fragmenten nicht möglich ist, zu ermöglichen. In Tabelle 1 sind die Primersequenzen für alle getesteten Gene gezeigt, wobei die Sequenzunterschiede zwischen den drei DNA-Typen, welche der Spezifität der MSP wegen verwendet wurden, hervorgehoben sind. Die zahlreichen Fehlpaarungen in diesen Primern, welche für diese unterschiedlichen DNA-Typen spezifisch sind, legen nahe, dass jeder Primersatz lediglich die Amplifikation der gewünschten Matrize vorsehen sollte.
Die für p16 konstruierten Primer wurden mit DNA von Krebszelllinien und normalen Geweben, für die vorher der Methylierungsstatus durch eine Southern-Analyse ermittelt worden ist, getestet (Merlo et al., vorstehend; Herman et al., vorstehend).
2, Tafel A–D, zeigt Polyacrylamidgele mit den methylierungsspezifischen PCR-Produkten von p16. Die für die Amplifikation verwendeten Primersätze sind bezeichnet als unmethyliert (U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W). * kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322. Tafel A zeigt die Amplifikation einer bisulfitbehandelten DNA aus Krebszelllinien und normalen Lymphocyten und einer unbehandelten DNA (aus der Zelllinie H249). Tafel B zeigt die Vermischung einer unterschiedlichen Menge von H157-DNA mit 1 μg H249-DNA vor der Bisulfitbehandlung zur Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit der MSP für methylierte Allele. Die modifizierte DNA einer Probe eines primären Lungenkarzinoms und einer normalen Lunge sind ebenfalls gezeigt. Tafel C zeigt die Amplifikation mit den in Tabelle 1 beschriebenen Primern p16-U2 (U) und p16-M2 (M). Tafel D zeigt die amplifizierten p16-Produkte von Tafel C, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–).
In allen Fällen bestätigte der verwendete Primersatz den durch die Southern-Analyse ermittelten Methylierungsstatus. Zum Beispiel amplifizierten die Lungenkrebszelllinien U1752 und H157 sowie andere bei p16 methylierte Zelllinien nur mit den methylierten Primern (2, Tafel A). Die DNA aus normalen Geweben (Lymphocyten, Lunge, Niere, Brust und Colon) und den unmethylierten Lungenkrebszelllinien H209 und H249 amplifizierte nur mit unmethylierten Primern (Beispiele in 2, Tafel A). Die PCR mit diesen Primern konnte mit oder ohne 5% DMSO durchgeführt werden. Nicht mit Bisulfit behandelte DNA (unmodifiziert) amplifizierte weder mit einem Satz von methylierten noch unmethylierten spezifischen Primern, aber amplifizierte ohne weiteres mit Primern, welche vor der Modifikation für die Sequenz spezifisch waren (2, Tafel A). Die DNA aus der Zelllinie H157 rief nach der Bisulfitbehandlung ebenfalls eine schwächere Amplifikation mit unmodifizierten Primern hervor, was auf eine unvollständige Bisulfitreaktion hindeutet. Jedoch wird diese unmodifizierte DNA im Gegensatz zu einer teilweise gespaltenen DNA in vorhergehenden PCR-Tests basierend auf methylierungssensitiven Enzymen durch die Primer, welche für methylierte DNA spezifisch sind, nicht erkannt. Auf diese Weise wird kein falsch positives Ergebnis erhalten oder die Fähigkeit, zwischen methylierten und unmethylierten Allelen zu unterscheiden, beeinträchtigt.
Die Empfindlichkeit der MSP für den Nachweis von methylierten p16-Allelen wurde abgeschätzt. Die DNA aus methylierten Zelllinien wurde vor der Bisulfitbehandlung mit unmethylierter DNA vermischt. 0,1% methylierte DNA (etwa 50 pg) wurden in einer sonst unmethylierten Probe durchgängig nachgewiesen (2, Tafel B). Für die Empfindlichkeitsgrenze der Menge der eingesetzten DNA, welche mit Hilfe der MSP nachweisbar ist, wurde ein Wert von so wenig wie 1 ng menschliche DNA, gemischt mit Lachssperma-DNA als Träger, ermittelt.
Frische menschliche Tumorproben enthalten häufig normales Gewebe und Tumorgewebe, wodurch der Nachweis von Veränderungen, welche für den Tumor spezifisch sind, erschwert wird. Jedoch deutet die Empfindlichkeit der MSP darauf hin, dass sie auch für Primärtumore nützlich sein könnte, wodurch der Nachweis von anomal methylierten Allelen ermöglicht wird, selbst wenn sie einen relativ kleinen Teil der gesamten DNA in einer Probe ausmachen. Obwohl normale Gewebe vollständig unmethyliert waren, enthielten Tumore, für die durch eine Southern-Analyse gezeigt wurde, dass sie bei p16 methyliert sind, in jedem Fall auch methylierte DNA, welche mit Hilfe der MSP nachgewiesen wurde, zusätzlich zu einigen unmethylierten Allelen (Beispiele in 2, Tafel B). Die DNA von in Paraffin eingebetteten Tumoren wurde ebenfalls verwendet und erlaubte den Nachweis von methylierten und unmethylierten Allelen in diesen Proben (2, Tafel B). Um zu bestätigen, dass diese Ergebnisse für diesen Primersatz nicht einmalig waren, wurde ein zweiter Stromabwärtsprimer für p16 verwendet, welcher ein etwas größeres Fragment amplifiziert würde (Tabelle 1). Dieser zweite Satz von Primern reproduzierte die vorstehend beschriebenen Ergebnisse (2, Tafel C), wodurch der Methylierungsstatus, welcher durch eine Southern-Blot-Analyse definiert wurde, bestätigt wurde.
Um die Spezifität der Primer für die methylierten Allelen weiter zu bestätigen und um spezifische Cytosine auf eine Methylierung innerhalb der amplifizierten Region zu überprüfen, wurden die Sequenzunterschiede zwischen der methylierten/modifizierten DNA und unmethylierten/modifizierten DNA ausgenutzt. Insbesondere behält die BstUI-Erkennungsstelle, CGCG, die Sequenz CGCG bei, wenn beide Cs nach der Bisulfitbehandlung und der Amplifikation methyliert sind, aber wird zu TGTG modifiziert, falls sie unmethyliert sind. Die Spaltung der amplifizierten Produkte mit BstUI unterscheidet zwischen diesen zwei Produkten. Die Restriktion von p16-amplifizierten Produkten veranschaulicht dies. Lediglich unmodifizierte Produkte und methylierte/modifizierte Produkte, die beide die CGCG-Stelle beibehalten, wurden durch BstUI gespalten, während Produkte, welche mit unmethylierten/modifizierten Primern amplifiziert wurden, nicht gespalten wurden (2, Tafel D).
Die vorstehend besprochenen Primersätze wurden konstruiert, um stark methylierte CpG-Inseln von unmethylierten Allelen zu unterscheiden. Um dieses Ziel zu erreichen, enthielten sowohl die oberen (Sense) als auch die unteren (Antisense) Primer CpG-Stellen, die methylierungsabhängige Sequenzunterschiede nach der Bisulfitbehandlung hervorrufen können. Die MSP kann verwendet werden, um regionalere Aspekte einer CpG-Insel-Methylierung zu untersuchen. Um diese zu überprüfen, wurden methylierungsabhängige Unterschiede in der Sequenz von nur einem Primer untersucht, um zu bestimmen, ob er immer noch eine Unterscheidung zwischen unmethylierten und methylierten p16-Allelen erlauben würde. Der für die genomische Sequenzierung verwendete Antisense-Primer, 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (SEQ ID NO: 123), wurde ebenfalls als Antisense-Primer verwendet, da die Region, die durch den Primer erkannt wird, keine CpG-Stellen enthielt und mit entweder einem methylierten oder unmethylierten Sense-Primer gepaart wurde (Tabelle 1). Die Amplifikation des 313 bp großen PCR-Produkts erfolgte nur mit dem unmethylierten Sense-Primer bei H209 und H249 (unmethyliert nach Southern) und dem methylierten Sense-Primer bei H157 und U1752 (methyliert nach Southern), was zeigt, dass die Methylierung von CpG-Stellen innerhalb einer definierten Region durch spezifische Primer erkannt werden kann, wobei zwischen methylierten und unmethylierten Allelen unterschieden werden kann (2, Tafel E). Tafel E zeigt die Ergebnisse einer Überprüfung der regionalen Methylierung von CpG-Inseln mit Hilfe der MSP unter Verwendung der Sense-Primer p16-U2 (U) und p16-M2 (M), welche methylierungsspezifisch sind, und eines Antisense-Primers, welcher nicht methylierungsspezifisch ist.
Beispiel 3
Die vorstehenden Experimente mit p16 wurden auf drei weitere Gene ausgedehnt, deren Transkription in menschlichen Krebsarten durch eine anomale Hypermethylierung von 5'-CpG-Inseln abgeschaltet ist.
3, Tafel A–E, zeigt Polyacrylamidgele von MSP-Produkten einer Analyse von mehreren Genen. Die für die Amplifikation verwendeten Primersätze sind nicht als unmethyliert (U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W) bezeichnet. * kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322, und ** kennzeichnet den 123 bp-Molekulargewichtsmarker. Alle DNA-Proben wurden mit Bisulfit behandelt, ausgenommen diejenigen, welche als unbehandelt gekennzeichnet sind. Tafel A zeigt die Ergebnisse einer MSP für p15. Tafel B zeigt die p15-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel C zeigt die MSP-Produkte für VHL. Tafel D zeigt die VHL-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel E zeigt die MSP-Produkte für E-Cadherin.
Der Cyclin-abhängige Kinaseinhibitor p15 ist in vielen Leukämiezelllinien und primären Leukämien anomal methyliert (Herman et al., vorstehend). Wiederum wurde mit Hilfe der MSP der durch eine Southern-Analyse ermittelte Methylierungsstatus für p15 bestätigt. So amplifizierten normale Lymphocyten und die Krebszelllinien SW48 und U1752, die alle nach einer Southern-Analyse unmethyliert sind (Herman et al., vorstehend), nur mit dem unmethylierten Satz von Primern, während die Lungenkrebszelllinie H1618 und die Leukämiezelllinie KG1A nur mit dem methylierten Satz von Primern amplifizierten (3, Tafel A), was mit den vorherigen Ergebnissen durch eine Southern-Analyse übereinstimmt (Herman et al., vorstehend). Die Zelllinie Raji erzeugte ein starkes PCR-Produkt mit methylierten Primern und ein schwächere Bande mit unmethylierten Primern. Dies war das gleiche Ergebnis für die Methylierung, welches vorher durch eine Southern-Analyse erhalten wurde (Herman et al., vorstehend). Nichtkultivierte Leukämieproben zeigten ähnlich wie die auf p16 untersuchten Primärtumore eine Amplifikation mit dem methylierten Primersatz sowie dem unmethylierten Satz. Diese Heterogenität stimmte ebenfalls mit der Southern-Analyse überein (Herman et al., vorstehend). Wiederum wurde wie für p16 die unterschiedliche Modifikation von BstUI-Restriktionsstellen in dem amplifizierten Produkt von p15 verwendet, um die spezifische Amplifikation mit Hilfe der MSP zu bestätigen (3, Tafel B). Die amplifizierten Produkte, welche unter Verwendung der methylierten Primersätze von den Zelllinien H1618 und Raij oder der unmethylierten Primersätzen erhalten wurden, wurden durch BstUI vollständig gespalten, während unmethylierte amplifizierte Produkte nicht gespalten wurden. Primäre AML-Proben, welche wiederum nur eine Spaltung des methylierten Produkts zeigten, zeigten eine geringere Gesamtspaltung. Dies deutet auf eine Heterogenität in der Methylierung hin, welche daraus resultiert, dass in einigen Allelen viele CpG-Stellen innerhalb des Bereiches der Primersequenzen ausreichend methyliert sind, um zu ermöglichen, dass die methylierungsspezifischen Primer diese Region amplifizieren, während andere CpG-Stellen nicht vollständig methyliert sind.
Eine anomale Methylierung der CpG-Insel-Promotorregion ist in etwa 20% der eindeutigen Nierenkarzinome mit einer Inaktivierung des VHL-Tumorsuppressorgens assoziiert (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9700). Dieses Ereignis ist ähnlich wie Mutationen von VHL (Gnarra et al., Nature Genetics 7 (1994), 85) auf eindeutige Nierenkarzinome begrenzt (Herman et al., vorstehend). Primer, welche für die VHL-Sequenz konstruiert wurden, wurden verwendet, um die DNA der Nierenkrebszelllinie RFX393, welche nach einer Southern-Analyse bei VHL methyliert ist, und der Lungenkrebszelllinie U1752, welche an diesem Locus unmethyliert ist (Herman et al., vorstehend), zu untersuchen. In jedem Fall wurde mit Hilfe der MSP der durch eine Southern-Analyse ermittelte Methylierungsstatus von VHL bestätigt (3, Tafel C), und die BstUI-Restriktionsstellen-Analyse bestätigte die PCR-Produkt-Spezifität (3, Tafel D).
Die Expression des Invasions/Metastasierungs-Suppressorgens E-Cadherin ist durch eine anomale Methylierung des 5'-Promotors in Brust-, Prostata- und vielen anderen Karzinomen häufig abgeschaltet (Graff et al., vorstehend; Yoshira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7416). Es wurden Primer für die E-Cadherin-Promotorregion konstruiert, um den Nutzen einer MSP für dieses Gen zu untersuchen. In jedem Fall stimmte die MSP-Analyse mit der Southern-Blot-Analyse im Hinblick auf den Methylierungsstatus des Gens überein (Graff et al., vorstehend). Die Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und HS578t sowie die Prostatakrebszelllinien DuPro und TSUPrI, welche alle nach Southern stark methyliert sind, zeigten eine deutliche Methylierung. MCF7, T47D, PC-3 und LNCaP, welche alle nach Southern unmethyliert sind, zeigten in dem empfindlichen MSP-Test keinen Hinweis auf eine Methylierung (3, Tafel E). Die MSP-Analyse zeigte die Anwesenheit von unmethylierten Allelen in Hs578t, TSUPrI und DuPro auf, was mit einem geringen Prozentsatz an unmethylierten Allelen in diesen Zelllinien übereinstimmt, der vorher durch eine Southern-Analyse nachgewiesen wurde (Graff et al., vorstehend). Die BstUI-Restriktionsanalyse bestätigte wiederum die Spezifität der PCR-Amplifikation.

* Sequenzunterschiede zwischen modifizierten Primern und unmodifizierter DNA sind fett gedruckt hervorgehoben, und Unterschiede zwischen methyliert/modifiziert und unmethyliert/modifiziert sind unterstrichen.

✝: Die Primer wurden nahe des Transkriptionsstartpunkts platziert. Die genomische Position entspricht der Lage des 5'-Nucleotids des Sense-Primers in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt, welcher in den folgenden Referenzen und Genbank-Hinterlegungsnummern definiert ist: p16 (die äußerste 3'-Stelle) X94154 (Hara E. et al., Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859); p15 S79756 (Jo J., Cancer Res. 54 (1994), 6353); VHL U19763 (Kuzmin I. et al., Oncogene 10 (1995), 2185); und E-Cadherin L34545 (Bussemakers M. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 203 (1994), 1284).
✝W: bedeutet unmodifizierte oder Wildtyp-Primer; M bedeutet methylierungsspezifische Primer; und U bedeutet unmethyliert-spezifische Primer (SEQ ID NO: 105–128).

Beispiel 4
Indirekte in-situ-p16-Methylierung
Indirekte in-situ-PCR (indirekte-IS-PCR) beschreibt eine Technik, wodurch das Amplicon durch einen zyklischen Temperaturwechsel ohne Einbau eines Markers hergestellt wird. Am Ende der zyklischen Reaktion wird das amplifizierte Produkt durch eine herkömmliche in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde nachgewiesen.
Probenherstellung und Vorbehandlung
Paraffineingebettete, formalinfixierte HN12-Zellen wurden für 5 Minuten in Xylol deparaffiniert, gefolgt durch zweimaliges Spülen für 5 Minuten in 100% Ethanol. Die Objektträger wurden luftgetrocknet und dann mit Proteinase K (10 μg/ml in 50 mM Tris) für 30 Minuten bei 37°C unter einem Deckglas behandelt. Die Objektträger wurden in destilliertem Wasser gespült und für 10 Minuten bei 37°C in 0,2 N NaOH gelegt und anschließend in 3 M Natriumbisulfit, enthaltend Hydroxychinon, eingebracht. Die Lösung wurde mit Mineralöl überschichtet und bei 50°C für 16 Stunden stehen gelassen. Das Öl wurde entfernt, und die Objektträger wurden in Wasser gespült und für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 0,3 M NaOH gelegt. Die Objektträger wurden dann in 70%, 80% und 100% Ethanol dehydratisiert und an der Luft getrocknet.
Indirekte-IS-PCR-Protokoll
Das PCR-Gemisch enthielt 1 × PCR-Puffer (16,6 mM Ammoniumsulfat/67 mM Tris, pH 8,8/6,7 mM MgCl₂/10 mM 2-Mercaptoethanol), dNTPs (2,5 lambda eines 25 mM Gemisches), 300 ng jedes Primers und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase pro 50 μl-Reaktion. Dieses Gemisch wurde bei 95°C für 5 Minuten "heiß gestartet", dann direkt auf die Objektträger aufgebracht, welche mit einer GeneComb-Vorrichtung vor Ort auf 80°C vorgewärmt wurden. Die PCR wurde mit einer Hybaid OmniGene-Cyclervorrichtung mit einem in-situ-Modul durchgeführt. 30 Zyklen von 90°C für 30 Sekunden, 58°C für 45 Sekunden und 70°C für 45 Sekunden wurden mit einer Kalibrierungszahl von 50 durchgeführt. Nach der PCR wurden die Objektträger sofort einmal in destilliertem Wasser gespült, gefolgt durch eine Dehydratisierung in 70%, 80% und 100% Ethanol, und an der Luft getrocknet.
Indirekte-IS-PCR-in-situ-Hybridisierung und Fluoreszenznachweis
Im Anschluß an die PCR wurde die Probe kurz fixiert, um die Stelle des PCR-Produkts beizubehalten. Dies erfolgte durch Fixieren der Schnitte in 100% Ethanol für 15 Minuten und dann Trocknenlassen davon an der Luft, bevor die Sonde aufgebracht wurde. Ein methyliertes p16-PCR-Produkt wurde hergestellt und mit Digoxigenin markiert und als eine markierte Sonde für die in-situ-Hybridisierung verwendet. Die Digoxigenin-markierte Sonde wurde in einem Hybridisierungspuffer, enthaltend 2 × SSC/10% Dextransulfat/50% Formamid, bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/μl suspendiert. 10,0 μl des Hybridisierungsgemisches (100,0 ng der Sonde) wurden auf jede Probe aufgebracht, mit einem Deckglas bedeckt und mit Gummilösung abgedichtet. Die Zellpräparationen wurden dann bei 95° für 5 Minuten inkubiert und bei 37°C über Nacht in einer feuchten Kammer hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurden die HN12-Proben noch einmal in 2 × SSC (Natriumcitratsalz) bei Raumtemperatur für 5 Minuten gewaschen und in 1 × PBD (phosphatgepuffertes Detergens) bei Raumtemperatur gelegt, bevor die Immunnachweise durchgeführt wurden.
Alle hybridisierten HN12-Zellproben wurden immuncytochemisch mit Fluorescein-markiertem Avidin (Vector Laboratories, CA) gefärbt. 60 μl Nachweisreagens, bestehend aus Fluorescein-markiertem Avidin (10 μg/ml), 1 × PBS, 5% Trockenmilchpulver und 0,02% Natriumazid, wurden auf den Objektträger unter einem Plastikdeckplättchen aufgebracht und bei 37°C für 5 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger wurden in 1 × PBD mehrmals gewaschen und mit Propidiumjodid (0,3 μg/ml) in Antifade-Lösung gegengefärbt.
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde ein Zeiss-Axiophot 20-Epifluoreszenz-Mikroskop (Zeiss, Westdeutschland), ausgerüstet mit einer 100 Watt-Quecksilberdampflampe, einem 100 × Plan-Neofluar-Ölimmersion-Objektiv (Zeiss, Westdeutschland), einer Zeiss-MC-100-Kamera (Zeiss, Westdeutschland) und den geeigneten Filtersätzen für Fluorescein (FITC)/PI-Fluoreszenz (Chroma, VT), verwendet. Die Bildanalyse und die Aufnahmespeicherung erfolgte unter Verwendung eines OIS (Oncor Instrument Systems) 3CCD Cooled Camera System und der OIS 2.01 Image Analysis Software.
Die HN12-Zellprobe für die negative PCR-Kontrolle wurde durch eine erste Bisulfitreaktion behandelt, um die DNA zu modifizieren, gefolgt durch eine PCR- Amplifikation unter Verwendung von Primern, welche für die methylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch sind, und einer in-situ-Hybridisierung. Die negative Kontrolle zeigte, wie erwartet, kein sichtbares Signal, da die PCR-Reaktion unvollständig war.
p16-methylierte HN12-Zellen wurden der Bisulfitmodifikation, der PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, welche für die methylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch sind, und der in-situ-Hybridisierung unter Verwendung der markierten Sonde unterworfen. In den Zellen waren Fluoreszenzsignale erkennbar, welche für das amplifizierte, lokalisierte Produkt der methylierten p16-Promotorregionen spezifisch waren.
p16-methylierte HN12-Zellen wurden der Bisulfitmodifikation, der PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, welche für die unmethylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch sind, und der in-situ-Hybridisierung unter Verwendung der markierten Sonde unterworfen. In den Zellen waren keine Fluoreszenzsignale erkennbar.
Beispiel 5
Untersuchung des Nutzens der MSP für Methylierungsveränderungen in Sputumproben
Die MSP ist auf den Nachweis von Methylierungsveränderungen in der DNA von Sputumproben untersucht worden. Die getesteten Proben schlossen die Primer für p16 (Tabelle 1; SEQ ID NO: 105–110) und die aus Sputumproben extrahierte DNA von zwei Patienten mit einer nachgewiesenen Lungenkrebserkrankung ein. Die unmethylierten Allele für p16 wurden nachgewiesen, jedoch wurden keine methylierten Allele nachgewiesen. Es scheint, da die MSP im Hinblick auf die nicht-methylierten Allele wirksam war, dass die Tumore der Patienten kein methyliertes p16 aufwiesen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Sputumprobe mit Zellen der etablierten Lungenkrebszelllinie Calu3, welche ein hypermethyliertes p16-Gen aufweist, versetzt. Diese methylierten p16-Allele wurden ohne weiteres in diesem DNA-Gemisch nachgewiesen.
Beispiel 6
Verwendung der MSP zum Nachweis einer hMLH1- und hMSH2-Hypermethylierung
Die hMLH1- und hMSH2-Gene codieren Fehlpaarungs-Reparaturproteine, und Mutationen in jedem der Gene können vererbte Formen von Colonkrebs, welche durch eine Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet sind, hervorrufen. Etwa 20% der Patienten mit einer nicht-vererbten Colonkrebserkrankung weisen auch Tumore mit dem Mikrosatelliteninstabilitäts-Phänotyp auf. Der genaue Mechanismus, durch den diese letzteren Tumore hervorgerufen werden, ist unklar. Kane et al. (Cancer Research 57 (1997), 808) haben in einer kleinen Schriftenreihe berichtet, dass Tumore von Patienten mit der sporadischen Form von Colonkrebserkrankungen mit einer Mikrosatelliteninstabilität eine Hypermethylierung des Promotors des hMLH1-Gens aufweisen. Eine MSP unter Verwendung des Primersatzes und der Bedingungen für hMSH2 und hMLH1 (Tabelle 2; SEQ ID NO: 161–172) wurde dazu verwendet, diese Beobachtung in einer größeren Reihe von Tumoren zu verfolgen. Von 14 Patienten mit solchen Tumoren zeigten 85% eine Hypermethylierung von hMLH1, während nur 5% von 21 Colontumoren ohne eine Mikrosatelliteninstabilität diese Veränderung zeigten. In beiden Gruppen wurde keine Hypermethylierung von hMSH2 beobachtet. Die Daten zeigen, dass etwa 15% aller Patienten mit Colonkrebs, welche bekanntermaßen Tumore mit einer Mikrosatelliteninstabilität aufweisen, eine Hypermethylierung des hMLH1-Gens in der Tumor-DNA aufweisen und dass die mit dieser Veränderung assoziierte Abschaltung der Transkription in dieser Situation die Ursache der genetischen Instabilität ist.
Beispiel 7
MSP-Untersuchungen des Gewebeinhibitors des Metalloproteinase II (TIMP-2)-Gens
TIMP-2 ist ein Mitglied der Familie der Metalloproteinase-Inhibitoren, welche notwendig sind, um das invasive Potenzial mehrerer Zelltypen einzuschränken. Unter Verwendung der MSP-Primer und der Bedingungen für dieses Gen (Tabelle 2; SEQ ID NO: 157–160) wurde eine Hypermethylierung des TIMP-2-Promotors in etwa 50% der primären Colonkrebsarten nachgewiesen. Diese Veränderung und der damit verbundene Verlust der Expression dieses Gens könnten ein Schlüsselfaktor bei der Erhöhung des invasiven Potenzials für die involvierten Colonkrebsarten sein.
Beispiel 8
MSP-Untersuchungen der TGF-beta-Rezeptor-I- und -II-Gene
Die vorstehend angegebenen MSP-Primer und Bedingungen (Tabelle 2; SEQ ID NO: 177–184) sind erfolgreich auf die TGF-beta-Rezeptor-I- und -II-Gene angewendet worden, und bis heute ist kein Hinweis auf eine Promotor-Hypermethylierung in Tumoren gefunden worden.
Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Nachweis einer methylierten CpG-enthaltenden Nucleinsäure, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Nucleinsäure-enthaltenden Probe mit einem Agens, das nicht-methyliertes Cytosin modifiziert, (b) Amplifizieren der CpG-enthaltenden Nucleinsäure in der Probe mit Hilfe von spezifischen Oligonucleotidprimern, die so konstruiert sind, dass sie die CpG-Stellen spezifisch erkennen, wobei die Oligonucleotidprimer zwischen modifizierter methylierter und nicht-methylierter Nucleinsäure unterscheiden, und (c) Nachweis der methylierten Nucleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Amplifizierungsschritt die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das modifizierende Agens Bisulfit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Cytosin zu Uracil modifiziert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend das Inkontaktbringen der Nucleinsäure mit einer methylierungssensitiven Restriktionsendonuclease.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Restriktionsendonuclease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MspI, HpaII, BssHII, BstUI und NotI.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sich die CpG-enthaltende Nucleinsäure in einer Promotorregion befindet.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Promotor ein Tumorsuppressorgen-Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Tumorsuppressorgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus p16, p15, E-Cadherin und VHL.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die CpG-enhaltende Nucleinsäure ein Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Androgenrezeptor, Östrogenrezeptor, TGF-beta1, TGF-beta2, p130, BRCA2, NF1, NF2, TSG101, MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin B-Rezeptor, TIMP-2, 06-MGMT, MLH1, MSH2 und GFAP.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gehirn-, Dickdarm-, Urogenital-, Lungen-, Nieren-, hämopoetischem, Brust-, Thymus-, Hoden-, Eierstock- und Gebärmuttergewebe oder Serum, Urin, Speichel, Liquor cerebrospinalis, Auswurf, Ejakulat, Blut und Stuhl.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Anwesenheit von methylierter CpG-enthaltender Nucleinsäure in der Probe eine Zellproliferationsstörung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Störung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus low grade-Astrozytom, anaplastischem Astrozytom, Glioblastom, Medulloblastom, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Nierenkrebs, Leukämie, Brustkrebs, Prostatakrebs, endometrischem Krebs und Neuroblastom.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Primer mit einer Zielpolynucleotidsequenz mit der Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–103 und SEQ ID NO: 104 hybridisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Primer ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 105–207 und SEQ ID NO: 208.
Kit zum Nachweis von methylierter CpG-enthaltender Nucleinsäure aus einer Probe, umfassend: (a) ein Reagens, das nicht-methylierte Cytosinnucleotide modifiziert; (b) Kontrollnucleinsäure; (c) Oligonucleotidprimer, die so konstruiert sind, dass sie CpG-Stellen spezifisch erkennen, wobei die Oligonucleotidprimer zwischen methylierter und nicht-methylierter Nucleinsäure unterscheiden und nicht-methylierte Nucleinsäure amplifizieren; (d) Oligonucleotidprimer, die so konstruiert sind, dass sie CpG-Stellen spezifisch erkennen, wobei die Oligonucleotidprimer zwischen methylierter und nicht-methylierter Nucleinsäure unterscheiden und methylierte Nucleinsäure amplifizieren; und (e) Primer für das Amplifizieren von Kontrollnucleinsäure.
Kit nach Anspruch 16, wobei Cytosin zu Uracil modifiziert ist.
Kit nach Anspruch 16 oder 17, weiter umfassend Nucleinsäureamplifizierungspuffer.
Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das Reagens, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, Bisulfit ist.
Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei Primer mit einer Zielpolynucleotidsequenz mit der Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–103 und SEQ ID NO: 104 hybridisieren.
Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Primer ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 105–207 und SEQ ID NO: 208.
Oligonucleotidprimerpaare zum Nachweis von methylierter CpG-enthaltender Nucleinsäure, wobei jeder Primer des Primerpaares mit einer Zielpolynucleotidsequenz mit der Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–104 hybridisiert; wobei die Zielsequenz zuvor wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert behandelt wurde; und wobei das Primerpaar zwischen methylierter und nicht-methylierter Nucleinsäure bei Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifizierungsproduktes, das unter Verwendung des Primerpaares erzeugt wurde, unterscheidet; und wobei (a) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 3 und 4 entspricht, SEQ ID NO: 107 und 108 das Primerpaar bilden; (b) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 5 und 6 entspricht, SEQ ID NO: 109 und 110 das Primerpaar bilden; (c) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 7 und 8 entspricht, SEQ ID NO: 111 und 112 das Primerpaar bilden; (d) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 9 und 10 entspricht, SEQ ID NO: 113 und 114 das Primerpaar bilden; (e) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 13 und 14 entspricht, SEQ ID NO: 117 und 118 das Primerpaar bilden; (f) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 15 und 16 entspricht, SEQ ID NO: 119 und 120 das Primerpaar bilden; (g) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 17 und 18 entspricht, SEQ ID NO: 121 und 122 das Primerpaar bilden; (h) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 19 und 20 entspricht, SEQ ID NO: 123 und 124 das Primerpaar bilden; (i) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 21 und 22 entspricht, SEQ ID NO: 125 und 126 das Primerpaar bilden; (j) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 23 und 24 entspricht, SEQ ID NO: 127 und 128 das Primerpaar bilden; (l) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 25 und 26 entspricht, SEQ ID NO: 129 und 130 das Primerpaar bilden; (m) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 27 und 28 entspricht, SEQ ID NO: 131 und 132 das Primerpaar bilden; (n) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 29 und 30 entspricht, SEQ ID NO: 133 und 134 das Primerpaar bilden; (o) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 31 und 32 entspricht, SEQ ID NO: 135 und 136 das Primerpaar bilden; (p) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 33 und 34 entspricht, SEQ ID NO: 137 und 138 das Primerpaar bilden; (q) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 35 und 36 entspricht, SEQ ID NO: 139 und 140 das Primerpaar bilden; (r) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 37 und 38 entspricht, SEQ ID NO: 141 und 142 das Primerpaar bilden; (s) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 39 und 40 entspricht, SEQ ID NO: 143 und 144 das Primerpaar bilden; (t) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 41 und 42 entspricht, SEQ ID NO: 145 und 146 das Primerpaar bilden; (u) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 43 und 44 entspricht, SEQ ID NO: 147 und 148 das Primerpaar bilden; (v) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 45 und 46 entspricht, SEQ ID NO: 149 und 150 das Primerpaar bilden; (w) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 47 und 48 entspricht, SEQ ID NO: 151 und 152 das Primerpaar bilden; (x) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 49 und 50 entspricht, SEQ ID NO: 153 und 154 das Primerpaar bilden; (y) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 51 und 52 entspricht, SEQ ID NO: 155 und 156 das Primerpaar bilden; (z) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 53 und 54 entspricht, SEQ ID NO: 157 und 158 das Primerpaar bilden; (aa) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 55 und 56 entspricht, SEQ ID NO: 159 und 160 das Primerpaar bilden; (bb) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 57 und 58 entspricht, SEQ ID NO: 161 und 162 das Primerpaar bilden; (cc) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 59 und 60 entspricht, SEQ ID NO: 163 und 164 das Primerpaar bilden; (dd) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 61 und 62 entspricht, SEQ ID NO: 165 und 166 das Primerpaar bilden; (ee) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 63 und 64 entspricht, SEQ ID NO: 167 und 168 das Primerpaar bilden; (ff) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 65 und 66 entspricht, SEQ ID NO: 169 und 170 das Primerpaar bilden; (gg) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 67 und 68 entspricht, SEQ ID NO: 171 und 172 das Primerpaar bilden; (hh) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 69 und 70 entspricht, SEQ ID NO: 173 und 174 das Primerpaar bilden; (ii) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 71 und 72 entspricht, SEQ ID NO: 175 und 176 das Primerpaar bilden; (jj) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 73 und 74 entspricht, SEQ ID NO: 177 und 178 das Primerpaar bilden; (kk) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 75 und 76 entspricht, SEQ ID NO: 179 und 180 das Primerpaar bilden; (ll) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 77 und 78 entspricht, SEQ ID NO: 181 und 182 das Primerpaar bilden; (mm) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 79 und 80 entspricht, SEQ ID NO: 183 und 184 das Primerpaar bilden; (nn) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 81 und 82 entspricht, SEQ ID NO: 185 und 186 das Primerpaar bilden; (oo) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 83 und 84 entspricht, SEQ ID NO: 187 und 188 das Primerpaar bilden; (pp) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 85 und 86 entspricht, SEQ ID NO: 189 und 190 das Primerpaar bilden; (qq) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 87 und 88 entspricht, SEQ ID NO: 191 und 192 das Primerpaar bilden; (rr) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 89 und 90 entspricht, SEQ ID NO: 193 und 194 das Primerpaar bilden; (ss) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 91 und 92 entspricht, SEQ ID NO: 195 und 196 das Primerpaar bilden; (tt) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 93 und 94 entspricht, SEQ ID NO: 197 und 198 das Primerpaar bilden; (uu) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 95 und 96 entspricht, SEQ ID NO: 199 und 200 das Primerpaar bilden; (vv) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 97 und 98 entspricht, SEQ ID NO: 201 und 202 das Primerpaar bilden; (ww) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 99 und 100 entspricht, SEQ ID NO: 203 und 204 das Primerpaar bilden; (xx) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 101 und 102 entspricht, SEQ ID NO: 205 und 206 das Primerpaar bilden; (yy) wenn die Zielsequenz SEQ ID NO: 103 und 104 entspricht, SEQ ID NO: 207 und 208 das Primerpaar bilden.
Primerpaar nach Anspruch 22, wobei SEQ ID NO: 105–207 und SEQ ID NO: 208 die Primerpaare in aufeinander folgenden Paaren bilden.
Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 16 bis 19 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.