DE10158283A1 - Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher SensitivitätInfo
- Publication number
- DE10158283A1 DE10158283A1 DE10158283A DE10158283A DE10158283A1 DE 10158283 A1 DE10158283 A1 DE 10158283A1 DE 10158283 A DE10158283 A DE 10158283A DE 10158283 A DE10158283 A DE 10158283A DE 10158283 A1 DE10158283 A1 DE 10158283A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- dna
- methylation
- amplification
- examined
- dinucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 44
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 7
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 82
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 43
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 129
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 30
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 23
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 claims description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 22
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 8
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 7
- WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L disulfite Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])(=O)=O WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 6
- 238000003491 array Methods 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 6
- 229940079826 hydrogen sulfite Drugs 0.000 claims description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims description 5
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 5
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 3
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 claims description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 claims description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000022821 personality disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 claims 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007368 endocrine function Effects 0.000 claims 1
- 230000003818 metabolic dysfunction Effects 0.000 claims 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 218
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 67
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 1-[(2r,5s)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101000796998 Bacillus subtilis (strain 168) Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase, inducible Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- -1 Phosphorothioate nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102100030306 TBC1 domain family member 9 Human genes 0.000 description 2
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-(benzimidazol-1-yl)propan-2-ol Chemical compound C1=CC=C2N(CC(O)CN)C=NC2=C1 AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- WJSVJNDMOQTICG-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-[(2-methyl-4-methylidene-5-oxooxolan-2-yl)methyl]-7h-purin-6-one Chemical compound NC1=NC=2N=CNC=2C(=O)N1CC1(C)CC(=C)C(=O)O1 WJSVJNDMOQTICG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091030081 DNA N(4)-methylcytosine Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000007118 DNA alkylation Effects 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006429 DNA hypomethylation Effects 0.000 description 1
- 108010063593 DNA modification methylase SssI Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100031612 Hypermethylated in cancer 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710133850 Hypermethylated in cancer 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 101150066553 MDR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-PRJDIBJQSA-N [[(5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CCC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-PRJDIBJQSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011365 genetic imprinting Effects 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000015380 snRNP Core Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039827 snRNP Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, das aus den folgenden Schritten besteht: Zuerst wird eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA umfasst, chemisch derart behandelt, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben. Dann wird die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase amplifiziert, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird, und im letzten Schritt werden die Amplifikate analysiert und aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylisierungsstatus in der zu untersuchenden DNA geschlossen.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben.
- Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
- 5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
- Eine relativ neu und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
- Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15; 26(10): 2255-64.
- Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov.; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer- Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
- Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit- Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26(21): 5009-10).
- Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind:
Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S. Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560. - Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte methylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S. Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93(18): 9821-6). Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position unmethylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position unmethylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder unmethylierten Position in der Probe liefern, an welche die Primer binden.
- Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl Light bekannt geworden ist (WO 00/70090). Mit diesem Verfahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Produkte erübrigt.
- Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonucleotide bei vermindertem nichtspezifischen Hintergrundsignal entnehmen.
- Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoresziert markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
- Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
- MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird.
- Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
- Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
- Es sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylierungsanalyse Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung soll jedoch das Problem lösen, dass die gängigen Verfahren nicht in der Lage sind, eine in einer Körperflüssigkeit oder Serum befindliche zu untersuchende DNA gezielt zu amplifizieren, wenn zugleich andere, sequenzhomologe DNA-Abschnitte anderen Ursprungs zugegen sind.
- Die zu untersuchende DNA sowie die ansonsten vorhandenen, im folgenden Hintergrund-DNA genannten Nukleinsäuren, werden in aller Regel gleichermaßen amplifiziert, da die verwendeten Primer auch nicht in der Lage sind, zwischen zu untersuchender DNA und Hintergrund-DNA zu unterscheiden. Eine Möglichkeit zur Unterscheidung dieser DNAs ergibt sich jedoch durch das unterschiedliche Methylierungsmuster. Ein gängiges Verfahren ist die methylierungssensitive PCR, kurz MSP (Herman JG, Graff JR, Myohanen S. Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93(18): 9821-6). Dieses Verfahren besteht aus mehreren Teilschritten. Zunächst wird eine dem Stand der Technik entsprechende Bisulfit-Behandlung durchgeführt, welche wiederum dazu führt, dass alle Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die methylierten Cytosinbasen (5-Methylcytosin) unverändert bleiben. Im nächsten Schritt verwendet man nun Primer, welche vollständig komplementär zu einer methylierten, mit Bisulfit umgewandelten DNA sind, nicht jedoch zu einer entsprechenden DNA welche ursprünglich nicht methyliert vorlag. Das führt bei der Durchführung einer PCR mit einem solchen Primer dazu, dass ausschließlich die ursprünglich methylierte DNA amplifiziert wird. Entsprechend ist es möglich, einen Primer zu verwenden, der im Gegenzug nur die unmethylierte DNA amplifiziert. Auf diese Art und Weise können, wenn zu analysierende DNA sowie Hintergrund DNA zugegen sind, ausschließlich die zu untersuchenden DNA Fragmente selektiv erzeugt werden, sofern sich diese hinsichtlich ihres Methylierungsstatus in einer CpG Position von der Hintergrund DNA unterscheiden. Stand der Technik ist es nun, aus dem Nachweis eines solchen zu untersuchenden DNA-Moleküls auf den Methylierungszustand oder das Vorliegen einer zu untersuchenden DNA rückzuschließen, was wiederum eine Diagnose beispielsweise einer Tumorerkrankung in Patienten prinzipiell erlaubt, da es bekannt ist, das beispielsweise die Serum DNA-Konzentration sich in Tumorpatienten zum Teil drastisch erhöht. Nur die von den Tumoren stammende DNA soll dann neben der Hintergrund-DNA nachgewiesen werden. Prinzipiell vergleichbar ist die Analyse von DNA in anderen Körperflüssigkeiten.
- Das hier geschilderte Verfahren, was als der nächstliegende Stand der Technik zu betrachten ist, hat jedoch einige Nachteile. Es ist beispielsweise nicht möglich, aus der Nachweisbarkeit eines amplifizierten Fragmentes zu untersuchender DNA auf die im Serum vorhandene Menge zu schließen. Schon geringste Mengen solcher DNA reichen aus, um ein positives Resultat zu erzielen, was zum einen ein Vorteil ist, sich aber auch sehr nachteilig auswirken kann, wenn man zum Beispiel den Effekt einer Tumorresektion auf die Serum DNA beurteilen will. Der größte Nachteil ist jedoch, dass es viele Methylierungspositionen gibt, in welchen sich zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nur graduell unterscheiden. Es ist offensichtlich, dass das existierenden MSP Verfahren nur dann durchgeführt werden kann, wenn man weiß, dass sich die Hintergund-DNA von der zu untersuchenden DNA in der betreffenden CpG Position definitiv und zu 100% unterscheidet, will man nicht falsche positive Ergebnisse riskieren. Ist es dagegen in einem Tumorgewebe typisch, dass in z. B. 95% der Tumorzellen eine bestimmte Position methyliert vorliegt, in der ansonsten vorhandenen Hintergrund-DNA jedoch nur maximal 5% methyliert vorliegen, so ist es mit der MSP Methode nicht möglich, aussagekräftige Ergebnisse zu produzieren, da eine Quantifizierung der Templat-DNA mittels PCR prinzipiell nicht oder nur mit erhöhtem Aufwand möglich ist. Zudem liegt dieser Erfindung die Erkenntnis zugrunde, dass es oft Muster von Methylierungszuständen in einem DNA-Fragment sind, die typisch für einen bestimmten Typ von Zellen, zum Beispiel einer Tumorzelle, sind.
- Stand der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG Positionen durch Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ mittels Mini Sequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methylierungspositionen erhält, d. h. es erfolgt die Bestimmung des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positionen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung ermöglicht. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass sie in den Fällen, in denen die Hintergrund-DNA stark überwiegt, keine genau Aussage liefern kann, da diese ja genau wie die zu untersuchende DNA amplifiziert wird und beide im Gemisch analysiert werden. Dieses Problem existiert nicht bei der Analyse von soliden Tumoren, wo man das zu untersuchende Material gezielt auswählen kann, es kann jedoch die Analyse von beispielsweise Serum-DNA erschweren.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es nun, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und die Vorteile beider Verfahren für die Detektion von Körperflüssigkeiten und Serum zu kombinieren.
- Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben geschaffen wird bei dem dass man die folgenden Schritte ausführt:
man behandelt eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA DNA umfasst, chemisch derart, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5- Methylcytosinbasen unverändert bleiben,
man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird und
man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA. - Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt.
- Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
- Es ist ganz besonders erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt. Bevorzugt ist es auch, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt. Es ist auch und weiterhin bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
- Bevorzugt ist es, dass man die Amplifikation im zweiten Schritt in Gegenwart mindestens eines weiteren Oligonukleotids durchführt, welches an ein 5'-CG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5-CA- 3'-Dinukleotid bindet, wobei das weitere Oligonukleotid bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt.
- Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemisch behandelte DNA-Probe im zweiten Schritt unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden und einem weiteren Oligonukleotid, welches an ein 5-CG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-CA- 3'-Dinukleotid hybridisiert, und mindestens einem Reporteroligonukleotid, welches an ein 5'-CG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-CA- 3'-Dinukleotid hybridisiert, sowie einer Polymerase amplifiziert; wobei das weitere Oligonukleotid bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt, und wobei das Reporteroligonukleotid bevorzugt an die zu untersuchende DNA bindet und deren Amplifikation anzeigt. Dabei ist es vorteilhaft, dass man zusätzlich zu dem Reporteroligonukleotid ein weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes Oligomer verwendet, welches unmittelbar benachbart zu dem Reporteroligonukleotid hybridisiert und sich diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz Resonanz Energietransfer nachweisen lässt. Weiterhin vorteilhaft ist es, dass ein Taqman-Assay durchgeführt wird. Bevorzugt ist es auch, dass ein Lightcycler Assay durchgeführt wird.
- Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass die zusätzlich zu den Primern verwendeten Oligonukleotide nicht über eine 3'-OH Funktion verfügen. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Reporteroligonukleotide mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Ferner ist auch bevorzugt, dass die Reportermoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand der zu analysierenden DNA schließt.
- Bevorzugt ist es erfindungsgemäß ferner, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt.
- Bevorzugt ist es ferner, dass die Analyse, oder gegebenenfalls die weitere Analyse mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können.
- Vorteilhaft ist es erfindungsgemäß auch, dass die Oligomere über einen 12-22 Basen langen Abschnitt an die zu analysierende DNA hybridisieren und sie ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen.
- Es ist bevorzugt, dass der Methylierungsstatus von mehr als 20 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
- Weiterhin ist bevorzugt, dass der Methylierungsstatus von mehr als 60 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
- Auch ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Analyse, oder gegebenenfalls die weitere Analyse durch Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z. B. HPLC), Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen. Vorteilhaft ist es dabei auch, dass Methoden zur Sequenzierung die Sanger- Methode, Maxam-Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen.
- Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei man die Sequenzierung für jede oder eine kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroligonukleotid ausführt und die Verlängerung der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und man aus der Art der Primerverlängerung auf den Methylierungsstatus der betreffenden Positionen in der zu untersuchenden DNA schließt.
- Weiterhin ist bevorzugt, dass man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt. Vorteilhaft ist es, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind. Weiterhin vorteilhaft ist es, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind, oder/und dass die Markierungen Radionuklide sind oder/und dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
- Bevorzugt ist ferner, dass bei der Amplifikation einer der Primer an eine Festphase gebunden ist.
- Erfindungsgemäß ist es auch, dass die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
- Vorteilhaft ist dabei die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern und weiteren Oligonuleotiden ohne 3'-OH Funktion zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben. Im Gegensatz zu bislang bekannten Verfahren wird der Methylierungsgrad eines Satzes von CpG Positionen in einer ausgewählten Untergruppe von DNA-Fragmenten z. B. in Serum bestimmt, so dass eine Analyse auch in Gegenwart eines Überschusses an diagnostisch nicht relevanter Hintergrund-DNA möglich ist.
- Dabei besteht das bevorzugte Verfahren wiederum aus mehreren Schritten, die sich wie folgt zusammenfassen lassen:
Zuerst werden dem Patienten Serum und/oder andere Körperflüssigkeiten entnommen und die darin befindliche DNA wenn erforderlich isoliert. Anschliessend wird im zweiten Schritt eine chemische Behandlung, bevorzugt mit einem Bisulfit (= Hydrogensulfit, Disulfit) durchgeführt, wobei beispielsweise alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, die methylierten Cytosinbasen (5-Methylcytosin) jedoch unverändert bleiben. Im dritten Verfahrensschritt wird nun eine Amplifikation durchgeführt, bei der bevorzugt die zu untersuchende DNA amplifiziert wird, nicht aber oder nur in geringerem Maße die Hintergrund-DNA. Im folgenden, vierten Schritt werden nun die amplifizierten Fragmente auf Ihre Methlylierungssignatur hin analysiert und der Methylierungsgrad mehrerer ehemaliger CpG Positionen in den Amplifikaten bestimmt. Im fünften Verfahrensschritt wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten geschlossen. - Das Wesen der vorliegenden Erfindung ist es nun, dass zwei Arten von CpG Positionen eine Rolle spielen und gleichermaßen zur Analyse beitragen und die nachfolgend als "Qualifier"-Positionen und "Classifier"-Positionen benannt werden sollen. Die Qualifier-Positionen dienen dazu, in der Amplifikation die zu analysierende DNA von der Hintergrund-DNA zu unterscheiden. Dies kann technisch, wie im folgenden detailliert dargelegt, auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Eigenschaft dieser Positionen ist es jedoch, dass ihr Methylierungsgrad in zu untersuchender DNA möglichst verschieden ist von dem in der Hintergrund-DNA und die zu einer Bevorzugung der zu untersuchenden DNA in der Amplifikation führt. Die Classifier-Positionen dienen im Gegensatz dazu, aus dem Amplifikat, erzeugt überwiegend aus der zu untersuchenden DNA, über den jeweiligen Methlierungsgrad die für die Diagnose bedeutende Information zu extrahieren. Es können bis zu einigen 100 solcher Classifier Positionen für eine Analyse verwendet werden, erfolgt die Analyse beipielsweise auf Oligomer- Arrays, auch wenn dies oftmals nicht erforderlich sein wird. Es ist jedoch in diesem Fall nicht das Entstehen eines bestimmten Amplifikates, das für das Untersuchungsergebnis von Bedeutung ist, sondern vielmehr die Analyse der CpG-Positionen in selbigem Amplifikat. In einigen Fällen ist es jedoch sicher möglich und sinnvoll, die aus dem Entstehen eines Amplifikates abzuleitende Information in die Analyse mit einzubeziehen, in diesem Fall sind einige Positionen dann zugleich Classifier und Qualifier.
- Der erste Schritt des Verfahrens, die Gewinnung von Proben, erfolgt bevorzugt durch Entnahme von Köperflüssigkeiten wie z. B. Sputum oder aber Serum, jedoch ist es offenkundig dass das Verfahren mit vielerlei Proben aus unterschiedlichen Quellen durchführbar ist, die hier ohne Anspruch auf Vollständigkeit aufgeführt sind.
- Bevorzugt wird die in dem Verfahren eingesetzte genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten, wobei Quellen für DNA z. B. Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.
- Es erfolgt in einigen Fällen vor der Bisulfit-Behandlung eine Aufreinigung oder Aufkonzentration der DNA, um eine Störung der Bisulfit-Reaktion und/oder der nachfolgenden PCR durch ein zu hohes Maß an Verunreinigungen zu vermeiden. Es ist jedoch bekannt, dass beipielsweise eine PCR aus Gewebe nach Behandlung beispielsweise mit Proteinase K ohne weitere Aufreinigung erfolgen kann, und dies gilt sinngemäß auch für die Bisulfit-Behandlung und nachfolgende PCR.
- Die chemische Behandlung wird bevorzugt durch Behandlung mit einem Bisulfit (= Hydrogensulft, Disulfit), wiederum bevorzugt Natriumbisulfit (weniger geeignet ist Ammoniumbisulfit) durchgeführt. Entweder erfolgt die Reaktion nach einer publizierten Variante, bevorzugt ist hier die Einbettung der DNA in Agarose, um die DNA während der Behandlung in einzelsträngigen Zustand zu halten, oder aber nach einer neuen Variante durch Behandlung in Gegenwart eines Radikalfängers und eines denaturierenden Reagenzes, bevorzugt ein Oligeothylenglykoldialkylether oder beipielsweise Dioxan. Vor der PCR Reaktion werden die Reagenzien entweder durch Waschen im Falle der Agarosemethode oder einem DNA- Aufreinigungsverfahren (Stand der Technik, Fällung oder Bindung an eine Festphase, Membran) entfernt oder aber einfach durch Verdünnung in einen Konzentrationsbereich gebracht, der die PCR nicht mehr signifikant beeinflusst.
- Wesentlich für den dritten Schritt ist es nun, dass die Qualifier Positionen ausgewählt werden und eine geeignete Methode gewählt wird, die die selektive Amplifikation der zu untersuchenden DNA erlaubt. Die Auswahl der Positionen erfolgt nach der Prämisse, dass sie sich zwischen Hintergrund-DNA und zu untersuchender DNA hinsichtlich ihrer Methylierung so sehr wie möglich unterscheiden sollten. Dazu werden zunächst die Methylierungsprofile der jeweils in Frage kommenden Abschnitte eines Gens sowohl für die zu untersuchenden Tumore als auch für die Hintergrund-DNA aus gesunden Individuen bestimmt. Diejenigen Positionen, die die größten Unterschiede zwischen Tumor DNA und Hintergrund-DNA (beispielsweise im Serum) aufweisen, werden als Qualifier Positionen ausgewählt. Solche Positionen sind für eine Vielzahl von Genen bereits bekannt, beipielsweise für GSTpi, für HIC-1 und MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S. Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts. Oncol Res.; 4(4-5): 167-74; Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000), Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis. Cancer Res. May 1; 60(9): 2368-71). Es gibt nun mehrere Methoden, die allesamt bevorzugt sind, mit denen man die zu untersuchende DNA unter Verwendung dieser Qualifier-Positionen bevorzugt amplifizieren kann.
- Zum einen ist es möglich, wiederum eine der MSP entsprechende Reaktion durchzuführen, indem man Primer verwendet, die vollständig an die Sequenz hybridisieren, die der zu untersuchenden DNA nach Bisulfit-Behandlung entspricht, nicht aber an die analog behandelte Hintergrund-DNA. Mit anderen Worten, die Primer hybridisieren an einen DNA-Abschnitt, in dem sich eine oder mehrere Qualifier Positionen befinden, und nur wenn deren Methylierungsstatus in der ursprünglichen DNA dem der für die zu untersuchende DNA charakteristischen entspricht, kann eine Amplifikation in signifikantem Ausmass stattfinden. Dies ist eine prinzipiell einfache Variante, die hat jedoch den Nachteil, dass die Qualifier-Positionen jeweils an einem oder an beiden Enden des DNA-Fragmentes liegen müssen, d. h. die Classifier-Positionen müssen zwischen den Qualifier- Positionen liegen (oder aber, bei nur einer Qualifier Position, darf diese nicht inmitten der Classifier- Positionen liegen). Auch wenn es erfindungsgemäß bevorzugt ist, eine solche MSP-Variante durchzuführen, ist daher davon auszugehen, dass sie nur in vergleichsweise wenigen Fällen zur Anwendung kommen kann, da die Verteilung von Qualifier und Classifier-Positionen nur in wenigen Fällen so ideal sein wird. Da prinzipiell jedoch einfach durchzuführen, ist sie hier dennoch als bevorzugt aufgeführt.
- Besonders bevorzugt ist jedoch eine Variante, bei der die Primer nicht mit einer Qualifier-Position überlappen oder mit dieser hybridisieren, sondern die PCR-Amplifikation vielmehr durch mindestens ein weiteres Oligonukleotid, welches nicht als Primer fungieren kann und welches an eine Qualifier-Position bindet, beeinflusst wird.
- Das heißt, dass die chemisch behandelte DNA im Prinzip, wie es Stand der Technik ist, mittels zweier Primer amplifiziert wird. Innerhalb des von den beiden Primern eingegrenzten DNA-Abschnittes befinden sich eine oder mehrere Qualifier-Positionen. Es werden nun im Gegensatz zur normalen PCR weitere Oligonukleotide zugesetzt, welche an diese Qualifier-Positionen binden, und zwar selektiv dann, wenn diese vor der Bisulfit-Behandlung entweder methyliert oder nicht methyliert vorlagen. Die zu untersuchende DNA wird demnach bevorzugt dann amplifiziert, wenn die zugesetzten Oligonukleotide weniger effektiv an ihre Qualifier Positionen binden als bei der Hintergrund-DNA. Mit anderen Worten blockieren die zugesetzten Oligonukleotide selektiv die Amplifikation der Hintergrund-DNA.
- Bevorzugt enthalten diese zugesezten Oligonukleotide entweder mindestens ein CG, ein TG oder ein CA Dinukleotid. Sie müssen weiterhin die Eigenschaft haben, dass sie von der in der PCR-Reaktion eingesetzten Polymerase nicht selbst verlängert werden können. Dies geschieht bevorzugt durch den Einsatz von 3'- Desoxyoligonukleotiden oder aber an der 3'-Position anderweitig funktionalisierten Oligonukleotiden, beipielsweise 3'-O-Acetyloligonukleotiden. Weiterhin muss der Abbau dieser Oligonukleotide durch die Polymerase verhindert werden. Dies erfolgt bevorzugt entweder durch die Verwendung einer Polymerase ohne Nukleaseaktivität oder bevorzugt durch Verwendung modifizierter Oligonukleotide, die beipielsweise am 5'-Ende Thioatbrücken aufweisen und daher gegen einen Abbau resistent sind.
- Eine weitere besonders bevorzugte Variante ist die Verwendung von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren, die sinngemäß wie die Oligonukleotide in diesem Experiment eingesetzt werden. Die PNA-Oligomere werden weder von der Polymerase abgebaut und noch können sie von dieser verlängert werden, so dass diese für diese Verfahrensvariante ideal geeignet sind. Verfahren zum Design und der Synthese von DNA-Oligomeren sind Stand der Technik.
- Wie oben angesprochen, können mehrere Qualifier- Positionen und auch demnach mehrere, jeweils für einen in der Hintergrund-DNA vorliegenden Methylierungsstatus spezifische Oligonukeotide in einem solchen Verfahren verwendet werden.
- Nach der selektiven Amplifikation der zu untersuchenden DNA können nun bevorzugt, nach an sich bekannten Verfahren, der Methylierungsstatus mehrerer Classifier- Positionen bestimmt werden.
- Es ist jedoch offensichtlich, dass auch in diesem Fall das Entstehen eines PCR Fragmentes selbst im Einzelfall von hinreichender Aussagekraft sein kann, sofern man, wie auch bei der MSP, die Situation vorliegen hat, dass die Qualifier-Position praktisch zu 100% beispielsweise in der Hintergrund-DNA unmethyliert vorliegt, jedoch in der zu untersuchenden DNA aufmethyliert vorliegt. Verwendet man nun in der PCR ein Oligonukleotid, das bevorzugt an die Sequenz bindet, welche in der Bisulfit-Behandlung aus nicht methylierter Hintergrund-DNA entsteht, so entsteht in der PCR nur dann ein Produkt, wenn wenigstens eine geringe Menge an zu untersuchender DNA überhaupt vorhanden ist. Dies kann im Einzelfall bereits hinreichend für eine Diagnose sein, und es würde sich hierbei um ein Verfahren handeln, dass ähnliche Eigenschaften aufweist wie MSP. Obgleich eine solche Durchführung nicht direkt bevorzugt ist, ist ein solches Verfahren bislang nicht bekannt und wird demzufolge ebenfalls als zugehörig zum Gegenstand dieser Erfindung betrachtet.
- Bevorzugt ist es, dass in einer PCR-Reaktion mehrere Fragmente gleichzeitig erzeugt werden, d. h. dass eine Multiplex-PCR durchgeführt wird. Bei deren Design muss darauf geachtet werden, dass nicht nur die Primer, sondern auch die weiteren eingesetzten Oligonukleotide nicht zueinander komplementär sein dürfen, so dass eine hochgradige Multiplexierung in diesem Fall schwieriger ist als in üblich. Jedoch hat man bei bisulfitbehandelter DNA den Vorteil, dass aufgrund des unterschiedlichen G und C-Gehaltes der beiden DNA-Stränge ein Forward-Primer niemals auch als Reverse-Primer fungieren kann, was die Multiplexierung wiederum erleichtert und diesen Nachteil im wesentlichen ausgleicht.
- Im einfachsten Fall werden nun wiederum die entstandenen Fragmente nachgewiesen. Dazu kommen alle möglichen bekannten molekularbiologischen Verfahren in Frage, wie Gelelektrophorese, Sequenzierung, Flüssigchromatographie oder Hybridisierungen, ohne dass dabei die Classifier Oligonukleotide analysiert werden. Dies wäre auch zur Qualitätskontrolle der vorangehenden Verfahrensschritte denkbar. Wie oben ausgeführt, ist jedoch die nachfolgende Analyse des Methlylierungsgrades der Classifier- Positionen besonders bevorzugt.
- Es gibt zahlreiche Möglichkeiten die bevorzugte Amplifikation der zu untersuchenden DNA mittels der oben beschriebenen Verfahren vorteilhaft mit Detektionstechniken für die Classifier-Oligonukleotide zu kombinieren.
- Detektionstechniken, die sich besonders eignen, sind die Hybridisierung an Oligomerarrays und beispielsweise Primer-Extension (MiniSequenzierung) Reaktionen. Die Hybridisierung an Oligomerarrays kann ohne weitere Veränderung von Protokollen gegenüber dem nächstliegenden Stand der Technik verwendet werden (Olek A, Olek S. Walter J; WO-Patent 9928498). Jedoch ist es bevorzugt, die Amplifikate an einen Array von Oligomeren zu hybridisieren, der aus Paaren von an einer Festphase immobilisierten Oligonukleotiden besteht, von denen eines jeweils stark bevorzugt an einen ein ursprünglich unmethyliertes CpG (Classifier-Position) enthaltenden DNA-Abschnitt hybridisiert und das andere wiederum stark bevorzugt an den entsprechenden Abschnitt, in dem ursprünglich ein methyliertes CpG enthalten war, jeweils vor der Bisulfit-Behandlung und Amplifikation. Besonders bevorzugt ist in diesem Fall das Amplifikat oder die Amplifikate fluoreszent oder radioaktiv oder mit ablösbaren Massentags markiert, so dass sich nach der Hybridisierung die an die beiden Oligonukleotide eines Paares gebundenen Fragmente anhand dieser Markierung nachweisen und Quantifizieren lassen. Man erhält ein Intensitätsverhältnis, aus dem man beispielsweise nach Eichung des Experimentes mit vollständig methylierter und unmethylierter DNA den Methylierungsgrad an der jeweiligen Classifier-Position bestimmen kann. Auf einem solchen Oligomer-Array (Fig. 1) lassen sich eine Vielzahl von Fragmenten und Classifier-Positionen gleichzeitig nachweisen. Es ist sinnvoll und bevorzugt, dass der Array auch Qualifier-Positionen detektierende Oligomere zur Kontrolle des Experimentes enthält, da so das Verhältnis der in die Analyse eingehenden zu untersuchenden DNA zur Hintergrund-DNA bestimmt werden kann.
- Primerextensionsreaktionen können ebenfalls an auf einer Festphase immobilisierten Oligonukleotide ausgeführt werden. Obgleich nicht zwingend erforderlich, ist die Immobilisierung dieser Primer bevorzugt, da in der Regel eine Vielzahl von Classifier-Positionen aus mehreren Amplifikaten untersucht werden soll und dies auf einer Festphase, also an einem Oligomerarrays, bedeutend leichter und in einem Experiment durchführbar ist. Es ist besonders bevorzugt, dass die Primer sich unmittelbar neben einer Classifier-Position befinden und dass die Verlängerung nur um ein Nukleotid erfolgt. Es ist besonders bevorzugt, dass lediglich Didesoxythymidin und Didesoxycytidin als Nukleotide zugesetzt werden und dass diese jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, wobei allerdings auch andere, unterscheidbare Markierungen wie Massentags denkbar und bevorzugt sind. Nach einer Bisulfit- Behandlung und Amplifikation liegen ehemalige methylierte CG als CG und nicht methylierte CG nunmehr als TG vor. Die Primerextensionsreaktion führt daher entweder zum Einbau eines Didesoxycytidins oder Didesoxythymidins. Aus dem Verhältnis der für diese beiden Terminatoren jeweils detektierten Fluoreszenzmarkierungen lässt sich auf den Methylierungsgrad der jeweiligen Position schließen. Es ist auch möglich und bevorzugt, in diesem Fall die Primerextension mit Desoxycytidin und Desoxythymidin durchzuführen, wenn man kein Guaninderivat zugibt und demzufolge bei einer TG oder CG Sequenz bereits nach einer Base die Primerextension ohnehin endet. Zudem ist es ebenfalls bevorzugt, die Analyse auf dem Gegenstrang durch Unterscheidung von CA und CG analog durchzuführen, dann entsprechend mit Didesoxy-ATP und Didesoxy-GTP oder deren Derivaten.
- Eine besonders bevorzugte Variante des Verfahrens ist jedoch die gleichzeitige Detektion von Qualifier- Positionen und Classifier-Positionen in einem Experiment, was sich durch Verwendung von Taqman oder Lightcycler- Technologievarianten erzielen lässt. Dabei werden zusätzlich zu den Oligonukleotiden, die für eine bevorzugte Amplifikation der zu untersuchenden DNA sorgen, weitere fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide zugesetzt, und die Änderung der Fluoreszenz während der PCR-Reaktion gemessen. Dabei erhält man überwiegend, weil ja hauptsächlich die zu untersuchende DNA amplifiziert wird, auch aus dieser Fluoreszenzänderung unmittelbar Information über den Methylierungsstatus verschiedener Classifier CpG Positionen. Da verschiedene Oligonukleotide bevorzugt jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen versehen werden, ist auch eine Unterscheidung der Fluoreszenzänderung während der PCR getrennt für verschiedene Positionen möglich.
- Diese vom Methylierungsstatus abhängige Fluoreszenzänderung kann durch zahlreiche Methoden erzielt werden, von denen hier beispielhaft zwei aufgeführt werden sollen.
- Zum einen können Oligonukleotid Sonden verwendet werden, die spezifisch entweder an eine Sequenz binden, die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position unmethylierten DNA hervorgegangen ist, oder aber entsprechend an einer Sequenz, die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position methylierten DNA hervorgegangen ist. Diese Sonden sind besonders bevorzugt mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen versehen, einem Quencherfarbstoff und einem als Marker dienenden Fluoreszenzfarbstoff. Beide sind mit der gleichen Oligonukleotidsonde verknüpft. Findet nun eine PCR-Reaktion mit der zu untersuchenden DNA als Templat statt, so wird die PCR Reaktion diesmal durch die fluoreszent markierte Oligomersonde blockiert. Da diese jedoch nicht gegen die Nukleaseaktivität der Polymerase resistent ist, findet ein Abbau der an die Templat-DNA gebundenen Sonde während der PCR-Reaktion statt, der mit der Bindungseffizienz der Sonde an das Templat korreliert, da die nicht gebundene Sonde von der Polymerase nicht abgebaut wird. Der Abbau der Sonde wird nun dadurch, dass dabei der Quencherfarbstoff und der als Marker dienende Fluoreszenzfarbstoff voneinander getrennt werden, durch eine Zunahme der Fluoreszenz des Markerfarbstoffs unmittelbar sichtbar. Im Prinzip handelt es sich hierbei um eine Variante des sogenannten Taqman Assays.
- Was man demnach misst, ist das Entstehen eines PCR Produktes aus der zu untersuchenden DNA, jedoch nur dann wenn die untersuchte Classifier-Position auch in dem Methylierungszustand vorliegt, den die Sonde durch Hybridisieren an die chemisch behandelte DNA detektieren kann. Eine Gegenprobe mit einer Sonde, die entsprechend an die Classifier Position im anderen Methylierungszustand binden würde, ist daher zweckmäßig und bevorzugt.
- Bevorzugt werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen an mehreren Sonden zusammen mit dem Quencher eingesetzt, um eine Unterscheidbarkeit der Sonden und damit eine Multiplexierung zu erreichen.
- Auch bei einem solchen Assay werden an die Qualifier Position bindende Oligonukleotide eingesetzt, die eine signifikante Amplifikation der Hintergrund-DNA verhindern. Die Amplifikation der zu untersuchenden DNA kann auch derart analysiert werden, dass man die gleiche Position auch mit einer Sonde wie oben beschrieben untersucht und die Amplifikation demnach durch eine an eine Qualifier-Position bindende Sonde nachweist. In diesem Fall ist es besonders bevorzugt, dass das nicht abbaubare Oligonukleotid selektiv an die Hintergrund-DNA bindet, während die fluoreszenzmarkierte Sonde an die zu untersuchende DNA bindet. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens weisen dabei die Sonde und das nicht abbaubare Oligonukleotid bis auf bevorzugt eine, nicht aber mehr als zwei Nukleobasen die gleiche Sequenz auf.
- Besonders bevorzugt ist zudem eine Variante, bei der mehrere methylierbare Positionen als Qualifier-Positionen definiert werden und für diese Positionen je mindestens ein, an die Hintergrund-DNA bevorzugt bindendes Oligonukeotid sowie eine Sonde verwendet werden. Da die Amplifikation der Hintergrund-DNA in diesem Falle durch mehrere Oligonukleotide unterdrückt wird, eignet sich dieses Verfahren besonders in Fällen, in denen der Überschuss an Hintergrund-DNA gegenüber der zu untersuchenden DNA besonders groß ist. In vielen Fällen wird sich bei dieser Variante und dem Vorliegen mehrerer Qualifier-Positionen in einem Fragment die weitere Untersuchung von Classifier-Positionen erübrigen, da mit den heute verfügbaren Geräten auch nicht beliebig viele unterschiedliche Farbstoffe (meistens sind es 4-5) gleichzeitig detektiert werden können. Die Untersuchung weiterer Classifier-Positionen wird dann bevorzugt mit einer der anderen, oben erwähnten Detektionstechniken durchgeführt.
- Bevorzugt ist es auch, dass mit einer Sonde mehrere Positionen gleichzeitig auf ihren Methylierungsgrad untersucht werden können.
- Ist eine genauere Quantifizierung des Methylierungsgrades der Classifier-Positionen wünschenswert, so können bevorzugt auch zwei mit einander konkurrierende Sonden mit unterschiedlichen Farbstoffen eingesetzt werden, wobei eine wiederum im Fall einer unmethylierten Position in der zu untersuchenden DNA, die andere umgekehrt im Falle einer methylierten Position bevorzugt bindet. Aus dem Verhältnis der Fluoreszenzzunahmen für die beiden Farbstoffe lässt sich dann wiederum auf den Methylierungsgrad der untersuchten Position schließen.
- Ein grundsätzlich anderes Verfahren, bei dem jedoch auch während der PCR eine Fluoreszenzänderung erfolgt, ist gegenwärtig als LightCyclertm Technologie bekannt. Dabei wird ausgenutzt, das ein Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) zwischen zwei Farbstoffen nur erfolgen kann, wenn diese sich in unmmittelbarer Nähe, das heißt 1-5 Nukleotide voneinander entfernt befinden.
- Nur dann kann der zweite Farbstoff von der Emission des ersten Farbstoffes angeregt werden und dann seinerseits Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, das dann detektiert wird.
- Im vorliegenden Fall der Methylierungsanalyse erfolgt eine Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an die betreffende chemisch behandelte DNA an einer Classifier-Position, und die Bindung dieser Sonde hängt wiederum davon ab, ob die zu untersuchende DNA an dieser Position methyliert oder unmethyliert vorlag. Unmittelbar benachbart zu dieser Sonde bindet eine weitere Sonde mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff. Diese Bindung erfolgt bevorzugt wiederum methylierungsabhängig, wenn in dem betreffenden Sequenzabschnitt eine weitere methylierbare Position vorliegt. Während der Amplifikation wird nun die DNA vermehrt, weshalb immer mehr fluoreszenzmarkierte Sonden benachbart an die betreffende Position binden, sofern diese den dafür erforderlichen Methylierungszustand aufwies, und daher sich ein zunehmender FRET gemessen wird.
- Auch bei diesem Verfahren erfolgt bevorzugt eine Multiplexierung mit mehreren verschieden fluoreszenzmarkierten Sonden.
- Auch hier ist es wiederum möglich und bevorzugt, dass eine Qualifier Position gemessen wird. Angenommen, dass die Hintergrund-DNA an der betreffenden Position unmethyliert vorliegt und nach chemischer Behandlung und Amplifikation ein TG Dinukleotid an dieser Position ergibt, und dass im Gegensatz die methylierte zu untersuchende DNA ein CG Dinukleotid ergibt, würde eine fluoreszenzmarkierte Sonde an die ein CG enthaltende Sequenz binden, während ein konkurrierendes Oligomer, welches nicht markiert ist, an die entsprechende TG Sequenz der Hintergund-DNA bindet. Dabei ist es wichtig, dass das unmethylierte Oligonukleotid die Amplifikation aufgrund seiner deutlich höheren Schmelztemperatur im Gegensatz zu den kürzeren Sondenolignukleotiden hemmt.
- Insofern sind in diesem Fall Sonden und an die chemisch behandelte Hintergrund-DNA bindende Oligomere nicht bis auf wenige Basen identisch, sondern sie sind wesentlich (um 5-15 Basen) länger. Auch ist es wiederum möglich und bevorzugt, modifizierte Oligonukeotide und/oder PNAs einzusetzen. Auch in diesem Fall sind alle Sonden und Oligonukleotide bis auf die Primer an ihrem 3'-Ende blockiert, um eine Verlängerung in der PCR zu vermeiden. Dies kann beispielsweise mit einer Phosphatgruppe erfolgen.
- Beide Verfahren unterscheiden sich im Ergebnis hauptsächlich darin, dass in einem Fall eine Abnahme, im anderen Fall eine Zunahme der Fluoreszenz gemessen wird. In beiden Fällen können sowohl Qualifier- als auch Classifier-Positionen gemessen werden.
- Zusammenfassend ist ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben besonders bevorzugt, bei welchem die folgenden Schritte ausgeführt werden:
Zurst wird eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA DNA umfasst, chemisch derart behandelt, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5- Methylcytosinbasen unverändert bleiben, dann wird die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase amplifiziert, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird und im nächsten Schritt werden die Amplifikate analysiert und aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA geschlossen. - In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Proben-DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewonnen. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass die Proben-DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewonnen wird.
- In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) durchgeführt. Bevorzugt ist es, die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose durchzuführen. Auch ist es bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
- In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Amplifikation im zweiten Schritt in Gegenwart mindestens eines weiteren Oligonukleotids durchgeführt, welches an ein 5'-CG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-CA-3'-Dinukleotid bindet, wobei das weitere Oligonukleotid bevorzugt an die Hintergrund- DNA bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt.
- Besonders bevorzugt ist es zudem, dass man die chemisch behandelte DNA-Probe im zweiten Schritt unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden und einem weiteren Oligonukleotid, welches an ein 5'-CG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5-CA- 3'-Dinukleotid hybridisiert, und mindestens einem Reporteroligonukleotid, welches an ein 5'-CG-3'- Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-CA- 3'-Dinukleotid hybridisiert, sowie einer Polymerase amplifiziert; wobei das weitere Oligonukleotid bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt und wobei das Reporteroligonukleotid bevorzugt an die zu untersuchende DNA bindet und deren Amplifikation anzeigt.
- Es ist auch bevorzugt, dass zusätzlich zu dem Reporteroligonukleotid ein weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes Oligomer verwendet wird, welches unmittelbar benachbart zu dem Reporteroligonukleotid hybridisiert und sich diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) nachweisen lässt.
- Besonders bevorzugt wird für die Analyse ein Taqman-Assay durchgeführt. Ebenso ist es bevorzugt, einen LightCycler Assay (wie oben beschrieben) durchzuführen.
- Besonders bevorzugt verfügen die zusätzlich zu den Primern verwendeten Oligonukleotide nicht über eine 3'-OH Funktion. Zudem tragen die Reporteroligonukleotide besonders bevorzugt mindestens eine Fluoreszenzmarkierung.
- Es ist besonders bevorzugt, dass die Reportermoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen und dass die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet wird und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand der zu analysierenden DNA geschlossen wird.
- In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante erfolgt die Analyse oder die weitere Analyse mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können. Bevorzugt hybridisieren die Oligomere über einen 12-22 Basen langen Abschnitt an die zu analysierende DNA und umfassen ein CG, TG oder CA Dinukleotid. Mit dieser Methode wird bevorzugt der Methylierungsstatus von mehr als 20 Methylierungspositionen der zu untersuchenden DNA in einem Experiment nachgewiesen, besonders bevorzugt sind es mehr als 60 Methylierungspositionen.
- Besonders bevorzugt ist auch ein Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z. B. HPLC), Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
- Besonders bevorzugt ist auch ein Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Sequenzierung erfolgt, wobei Methoden zur Sequenzierung die Sanger-Methode, Maxam- Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen. Wiederum bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Sequenzierung (nach Sanger) für jede oder eine kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroligonukleotid ausgeführt wird und die Verlängerung der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und aus der Art der Primerverlängerung auf den Methylierungsstatus der betreffenden Positionen in der zu untersuchenden DNA geschlossen wird.
- In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten geschlossen.
- Besonders bevorzugt sind auch die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen. Bei diesen Markierungen handelt es sich bevorzugt um Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
- Weiterhin ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem bei der Amplifikation einer der Primer an eine Festphase gebunden ist.
- Auch bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, wobei die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
- Zudem bevorzugt ist die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern und weiteren Oligonuleotiden ohne 3'-OH Funktion zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung zumindest einer der beschriebenen Verfahrensvarianten.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
- Zunächst wurden PCR-Bedingungen für Bisulfit-behandelte DNA definiert, unter denen ein allelspezifischer Einfluss der PNA blocking probe auf die PCR erkennbar ist. In diesem ersten Experiment überlappen die Bindungsstellen zwischen PNA und den Primern nicht.
- Zunächst wurde in einem Experiment der Einfluss einer 11mer PNA der Sequenz AAAATGTGTT in einer PCR mit den Primern TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG und TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC getestet. Ein Einfluss der PNA auf die PCR Reaktion ist unter PCR- Standardbedingungen bei einer Aneealingtemperatur von 55°C nicht messbar. Das für die Amplifikation des MDR1- Fragmentes verwendete Standard-Cyclerprogramm verwendet folgende Programmschritte:
Schritt 1: T = 96°C; 20 min
Schritt 2: T = 96°C; 30 s
Schritt 3: T = 56°C; 1,15 min
Schritt 4: T = 72°C; 2,00 min
Die Schritte 2 bis 4 werden als Zyklus 40 mal durchlaufen.
Schritt 5: T = 72°C; 15 min
Schritt 6: auf 4°C abkühlen und Temperatur halten - Demzufolge müssen die Primerlänge, die Annealingtemperatur und die PNA-Probelänge optimal angepasst werden, um eine allelspezifische Unterdrückung der Amplifikation zu erreichen.
- Um den Primern und der PNA ein optimales Annealing zu ermöglichen, wurden in einer PCR Reaktion kürzere 21mer Primer TAAGTATGTTGAAGAAAGATT und AATCCCCATAAACTTACCAAA mit einer längeren 13mer PNA AAAGACGTGTTAT getestet. Weitere Versuche wurden mit 18, 19 und 20mer Primern durchgeführt, welche sich von den obigen Sequenzen nur dadurch unterscheiden, dass Basen am 3'-Ende weggelassen wurden. Die 21mer Primer wurden mit einem Gradienten der Annealingtemperatur getestet. In einem Parallelansatz wurden die 13mer PNA AAAGACGTGTTAT respektive die für eine aus einem nicht methylierten Allel hervorgegangene Sequenz passende PNA AAAGATGTGTTAT in verschiedenen Konzentrationen von 20-100 pmol/µl zugegeben.
- Ein deutlicher Einfluss auf die PCR wurde bei Annealingtemperaturen von 49,4°C und 46,7°C bei Zugabe der PNA in einer Konzentration von 70 und 100 pmol/µl beobachtet. Der Effekt war bei der Verwendung eines 18mer Primers am deutlichsten.
- Untersucht wurde nun, inwieweit sich eine niedrigere Extensiontemperatur von 54°C auf den hemmenden Einfluss der PNAs auswirkt.
- Hierfür wurden zu einem PCR-Ansatz jeweils die oben genannten 13mer PNAs bzw. beide 13mer PNAs zusammen in einer Konzentration von 50 und 70 pmol/µl gegeben. Zu beobachten war eine deutliche Unterdrückung der PCR im Vergleich zur positiven Kontrolle ohne PNAs (Fig. 2, Agarose-Gelelektrophorese, Konzentrationen der PNAs für die verwendeten 13mer PNA Sonden; Annotation: MDR1-5FM: 13mer PNA AAAGACGTGTTAT; MDR1-5FU: 13mer PNA AAAGATGTGTTAT). Die Versuche legen nahe, dass die in den Versuchen verwendete DNA an den betreffenden Positionen überwiegend unmethyliert vorlag, was durch Bisulfit- Sequenzierung bestätigt werden konnte. Es kann also in diesem Experiment bereits eine deutliche Allelspezifität der PNA blocking probe gezeigt werden, die zu einer bevorzugten Amplifikation der nicht methylierten Fragmente führt.
- In obigen Experimenten waren die Primer so gewählt, dass die PNA-Zielsequenz ungefähr in der Mitte des zu amplifizierenden Bereichs lag. Als sensitiver wurde die Anordnung beschrieben, wenn Primer- und PNA-Sequenz aneinander angrenzen bzw. sich überlappen. Bei einer sequenzspezifischen Bindung der PNA müsste bei dieser Anordnung ein Effekt der PNA schon bei geringeren PNA- Konzentrationen zu beobachten sein.
- Für dieses Experiment wurde ein Primer mit der Sequenz TTATGTGAATTTTGAAAG so gewählt, dass er sich mit der PNA- Sequenz überlappt (primer exclusion). In einen Reaktionsansatz wurden beide 13mer PNAs AAAGACGTGTTAT und AAAGATGTGTTAT in 3 verschiedenen Konzentrationen zugegeben.
- Eine vollständige Unterdrückung der PCR Reaktion wurde schon mit einer Konzentration von 25 pmol/µl erzielt. Im vorangegangenen Experiment war eine vollständige Unterdrückung der PCR bei Zugabe beider PNAs erst in einer Konzentration von 70 pmol/µl erkennbar.
- Für den Nachweis einer sequenzspezifischen Bindung wurde in weiteren Experimenten die Wirkung der PNAs auf hinsichtlich des Methylierungsstatus gut charakterisierten Templaten untersucht. Die für dieses Experiment verwendete Templat DNA entsprach einer bisulfitbehandelten vollständig unmethylierten DNA. Diese wurde als Templat in eine PCR eingesetzt. Dafür wurden die folgenden Programmschritte eingesetzt:
Schritt 1: T = 96°C; 20 min
Schritt 2: T = 96°C; 30 s
Schritt 3: T = 49°C; 1,15 min
Schritt 4: T = 54°C; 2,00 min
Die Schritte 2 bis 4 werden als Zyklus 36 mal durchlaufen.
Schritt 5: T = 72°C; 15 min
Schritt 6: auf 4°C abkühlen und Temperatur halten - Zum Reaktionsansatz wurden die 13mer wie oben beschrieben in 3 verschiedenen Konzentrationen zugegeben. In diesem Fall des unmethylierten Templates würde man erwarten, dass die für dieses Templat passende PNA MDR1- 5-FU (3) einen deutlich stärkeren Einfluss als MDR1-5-FM (3) hat. In Fig. 3 (Annotation siehe Fig. 2) ist dargstellt, dass dies auch bei vergleichsweise niedrigen PNA Konzentrationen der Fall ist.
- Diese Ergebnisse zeigen, dass die Unterdrückung der PCR Reaktion durch spezifisch bindende PNAs methylierungsspezifische Amplifikationen ermöglicht. In Kontrollexperimenten mit nicht zu MDR-1 komplementären PNAs konnte gezeigt werden, dass diese keinen nennenswerten Einfluss auf die PCR bei den in Frage kommenden Konzentrationen ausüben (nicht gezeigt).
- Bestimmte CpG-Positionen des GSTPi-Genes wurden als Tumormarker für Prostatakrebs identifiziert.
- Bei dem für die Experimente ausgewählten Primerpaar GGAAAGAGGGAAAGGTTTT und TACTAAAAACTCTAAACCCCAT ist ein Primer so lokalisiert, das er genau an die PNA-Sequenz CCCCGAAAACGCG (bzw. CCCTGAAAATGTG) angrenzt. Die PNA- Sequenz umfasst im Unterschied zu den für das MDR1 Fragment verwendeten PNAs nun drei relevante CpG Positionen.
- Die zu untersuchenden relevanten CpGs des GSTPi Fragmentes liegen in "normaler", d. h. nicht von Tumorpatienten stammender DNA nicht methyliert vor. Die zum Reaktionsansatz gegebene PNA "GSTP-down" der Sequenz CCCTGAAAATGTG sollte daher einen erkennbaren Einfluss auf die PCR-Reaktion haben, jedoch nicht die entsprechende PNA "GSTP-up" CCCCGAAAACGCG.
- Zum Versuchsansatz wurde die PNA "GSTP-down" in drei verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Getestet wurde ein Gradient der Annealingtemperatur. Die Ergebnisse des Experimentes sind in Fig. 4 dargestellt. Die stärkste Unterdrückung der PCR durch Zugabe der PNA (GSTP-down) ist bei einer Annealingtemperatur von 55°C feststellbar. Im Vergleich mit der positiven Kontrolle (ohne Zugabe von PNA) ist erkennbar, dass die PCR Reaktion schon durch die Zugabe der PNA in einer Konzentration von 20 mol/µl signifikant unterdrückt werden konnte.
- Nachfolgend wurde, um eine sequenzspezifische (und damit letztlich methylierungsensitive) Bindung nachzuweisen, der Einfluss der PNAs "GSTP-up" und "GSTP-down" auf die Amplifikationen einer in der ursprünglichen Probe unmethylierten DNA und einer aus einem Prostatatumorgewebe stammenden methylierten DNA als Templat gegenübergestellt.
- Die unmethylierte DNA und die Prostata DNA wurden als Templat in eine PCR eingesetzt. Zum Reaktionsansatz wurden die PNAs "GSTP-up" bzw. "GSTP-down" in drei verschiedenen Konzentrationen zugegeben.
- Die Zugabe der PNA "GSTP-down" hat auf dem downmethyliertem Templat einen sichtbaren Einfluss: die PCR ist bei Zugabe der PNA in einer Konzentration von 70 pmol/µl vollständig unterdrückt. Bei Zugabe der PNA "GSTP-up" ist dagegen nur ein schwacher, hemmender Einfluss der PNA auf die PCR erkennbar.
- Die Zugabe der PNA "GSTP-up" zur Test-DNA aus Prostatagewebe hat einen erheblich hemmenden Einfluss auf die PCR (Fig. 5). Die Zugabe der PNA in einer Konzentration von 20 µmol/µl unterdrückt die PCR schon deutlich. Eine vollständige Unterdrückung der PCR ist bei einer Zugabe der PNA in einer Konzentration von 50 pmol/µl feststellbar. Im Gegensatz dazu hat die Zugabe der PNA "GSTP-down" zur Prostata DNA einen deutlich geringer Einfluss. Auch eine Zugabe der PNA in einer Konzentration von 70 pmol/µl unterdrückt die PCR nicht vollständig.
- Die Experimente zeigen, dass es möglich ist, mittels blockierender Oligomersonden selektiv die Amplifikation von an definierten Positionen methylierten oder unmethylierten Allelen zu unterdrücken. Im Sinne dieser Erfindung würden die betreffenden Positionen als Qualifier-Positionen dienen, d. h. man würde selektiv die Amplifikation unerwünscht methylierter Template der Hintergrund DNA unterdrücken.
- In Fig. 6 sind mehrere Möglichkeiten dargestellt, wie bei einer gegebenen Templatsequenz Primer im Sinne einer methylierungsensitiven Amplifikation anzuordnen sind. Zur Erläuterung zeigt Fig. 6a die nach der Bisulfitbehandlung vorliegenden Template, DNA 1 entsprechend einer ursprünglich methylierten DNA-Probe, DNA 2 entsprechend einer ursprünglich unmethylierten DNA- Probe.
- Fig. 6b zeigt die Anordnung eines der Primer im Sinne einer Allelspezifischen PCR bzw. einer Methylierungsspezifischen PCR (MSP). In diesem Fall würde nur die Amplifikation der methylierten DNA 1 unter Verwendung des gezeigten Primes stattfinden können.
- Fig. 6c und 6d zeigen, wie entsprechend nicht methylierungsspezifische Primer eingesetzt werden können, entweder durch Verwendung degenerierter Positionen (6c) oder aber universeller Basen (hier Inosin) in Fig. 6d.
- In Fig. 7 sind mehrere Möglichkeiten dargestellt, wie bei einer gegebenen Templatsequenz Primer und Sonden ("Blocker") im Sinne einer methylierungsensitiven Amplifikation anzuordnen sind. In diesen Beispielen sind die verwendeten Primer nicht selbst methylierungsspezifisch, Sonden die Methylierungsspezifität wird allein durch die Sonden ("Blocker") erreicht. Für DNA 1 und DNA 2 werden jeweils spezifische Sonden als Blocker eingesetzt.
- In Fig. 7a überlappen Primer und Sonde nicht, sondern die Sonde schliesst sich unmittelbar an das 3'-Ende des Primers an. Die dargestellte Sonde ist ein am 3'-Ende modifiziertes Oligonukleotid, das in der Amplifikation nicht selbst verlängert werden kann. Analog können auch PNAs verwendet werden, die in diesem Beispiel jedoch entsprechend ihrer Schmelztemperatur kürzer sein müssten. In Fig. 7b wird der gleiche Primer eingesetzt, jedoch überlappt hier die DNA-Sonde mit dem Primer (Primer Exclusion).
- In Fig. 7c und 7d überlappen ein mit degenerierten Positionen versehener Primer und die methylierungsspezifische Sonde. Analog sind auch universelle Basen in den Primern einsetzbar.
- In Fig. 8 ist analog ein Beispiel mit Foward und Reverse-Primer dargestellt, in dem eine Sonde verwendet wird, die mit keinem der Primer überlappt.
- Diese Beispiele sollen die zahlreichen Möglichkeiten veranschaulichen, wie Oligomersonden zur methylierungsspezifischen Amplifikation eingesetzt werden können, um Hintergrund DNA gegenüber der zu analysierenden DNA zu unterdrücken. Der Umfang der Erfindung soll sich jedoch nicht auf die hier beispielhaft angeführten Ausführungen beschränken.
- Für die Herstellung aufmethylierter DNA wurden humane genomische DNA mit S-Adenosylmethion und der CpG Methylase (SssI, New England Biolabs) nach Angaben des Herstellers behandelt. Für die Herstellung nichtmethylierter DNA wurde das Genfragment ELK-1 mit den Primern GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA (SEQ-ID: 1) und AGGTGGTGGTGGCGGTGG (SEQ-ID: 2) ausgehend von humaner genomischer DNA, mittels PCR amplifiziert. Die so hergestellte nicht- und aufmethylierte DNA, wie auch humane genomische DNA, wurde unter Verwendung von Bisulphit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 Mol und 6 Mol verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen.
- Ausgehend von den Bisulphit behandelten DNA Proben wird je ein definiertes Fragment der Länge 595 bp aus der Promotorregion des ELK-1 Gens amplifiziert. Die Amplifikation wird mit den Primeroligonukleotiden ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT (SEQ-ID: 3) und TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT (SEQ-ID: 4) durchgeführt. Durch Verwenden von Primeroligonukleotiden, die mit dem Fluoreszenfarbstoff Cy5 markiert sind, wird das Fragment direkt bei der PCR markiert. Als Matrix DNA wird Bisulphit (Hydrogensulfit, Disulfit) behandelte (1) nichtmethylierte, (2) aufmethylierte und (3) humane genomische DNA verwendet. Anschließend werden diese drei unterschiedlichen DNA-Fragmente in getrennten Hybridisierungen auf ihren Methylierungsgrad an einer spezifischen CpG Position untersucht.
- Durchführung der Hybridisierung und Auswertung eines hybridisierten DNA-"Chip"
- Die in Beispiel 5 hergestellten Gensonden werden auf einem DNA Chip hybridisiert. Auf dem Chip sind zuvor Oligonukleotide immobilisiert worden. Die Oligonukleotidesequenzen leiten sich von dem in Beispiel 2 genannten amplifizierten Fragment des Gens ELK-1 ab, und repräsentierten die CG Dinukleotide, die unmittelbare Umgebung einschließend. Die Länge der Oligonukleotide beträgt 14-22 Nukleotide, die Position des CG Dinukleotides innerhalb der Oligonukleotide ist variabel. Nach der Hybridisierung wird der DNA Chip gescannt (siehe Fig. 1) und die Hybridisierungssignale numerisch ausgewertet (Daten nicht gezeigt). Das Ergebnis der Hybridisierung für die Oligonukleotide CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5) und CTACTCAACAAAAACAAA (SEQ-ID: 6) wird in Fig. 1 gezeigt. Hierbei hybridisiert CTACTCAACGAAAACAAA (SEQ-ID: 5) bevorzugt, wenn das zu Cytosin des ELK-1 Fragments, welches sich an Position 103 des Amplifikates befindet, methyliert ist, CTACTCAACAAAAACAAA (SEQ-ID: 6) wenn dieses Cytosin nicht methyliert ist.
- In Fig. 1 ist ein DNA Chip nach Hybridisierung mit dem Promotor Fragment dargestellt. Dargestellt ist das Falschfarben-Bild wie es nach dem Scannen erzeugt wird. Entgegen der hier dargestellten schwarzweiß Abbildung wird von dem Scanner ein farbiges Bild erzeugt. Die Intensität der verschiedenen Farben repräsentiert den Grad der Hybridisierung, wobei der Hybridisierungsgrad von rot (in Fig. 1 als helle Spots zu erkennen) nach blau (in Fig. 1 als dunkle Spots zu erkennen) abnimmt. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (34)
1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in
DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man die
folgenden Schritte ausführt:
man behandelt eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA DNA umfasst, chemisch derart, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben,
man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund- DNA als Templat bevorzugt wird und
man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
man behandelt eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA DNA umfasst, chemisch derart, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben,
man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund- DNA als Templat bevorzugt wird und
man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen
Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum,
Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe
von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge,
Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und
allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische
Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit,
Hydrogensulfit) durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA
in Agarose erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex
denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger
zugegen ist.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man die Amplifikation im
zweiten Schritt in Gegenwart mindestens eines
weiteren Oligonukleotids oder eines PNA-Oligomers
durchführt, welches an ein 5'-CG-3'-Dinukleotid oder
ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-CA-3'-
Dinukleotid bindet, wobei das weitere Oligonukleotid
oder PNA-Oligomer bevorzugt an die Hintergrund-DNA
bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man die chemisch
behandelte DNA-Probe im zweiten Schritt unter
Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden
und einem weiteren Oligonukleotid oder PNA-Oligomer,
welches an ein 5'-CG-3'-Dinukleotid oder ein 5'-TG-
3'-Dinukleotid oder ein 5'-CA-3'-Dinukleotid
hybridisiert, und mindestens einem
Reporteroligonukleotid, welches an ein 5'-CG-3'-
Dinukleotid oder ein 5'-TG-3'-Dinukleotid oder ein
5'-CA-3'-Dinukleotid hybridisiert, sowie einer
Polymerase amplifiziert; wobei das weitere
Oligonukleotid oder PNA-Oligomer bevorzugt an die
Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation
beeinträchtigt, und wobei das Reporteroligonukleotid
bevorzugt an die zu untersuchende DNA bindet und
deren Amplifikation anzeigt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass man zusätzlich zu dem Reporteroligonukleotid ein
weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes
Oligomer verwendet, welches unmittelbar benachbart zu
dem Reporteroligonukleotid hybridisiert und sich
diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz Resonanz
Energietransfer nachweisen lässt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Taqman-Assay durchgeführt
wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Lightcycler Assay
durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass die zusätzlich zu den Primern
verwendeten Oligonukleotide nicht über eine 3'-OH
Funktion verfügen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass die Reporteroligonukleotide
mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die Reportermoleküle die
Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine
Abnahme der Fluoreszenz anzeigen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz
auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem
Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand der
zu analysierenden DNA schließt.
16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in
100 facher Konzentration im Vergleich zur zu
untersuchenden DNA vorliegt.
17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in
1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu
untersuchenden DNA vorliegt.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse, oder im
Falle eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis
11, die weitere Analyse mittels Hybridisierung an
Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere
Nukleinsäuren oder in ihren
Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie
PNAs sein können.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
dass die Oligomere über einen 12-22 Basen langen
Abschnitt an die zu analysierende DNA hybridisieren
und sie ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19,
dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungsstatus
von mehr als 20 Methylierungspositionen der zu
analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen
wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19,
dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungsstatus
von mehr als 60 Methylierungspositionen der zu
analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen
wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, dass die Analyse, oder im Falle der
Ansprüche 8 bis 12, die weitere Analyse durch
Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden
DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung
Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese,
Chromatographie (z. B. HPLC), Massenspektrometrie und
andere geeignete Methoden umfassen.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, dass die Analyse, oder im Falle der
Ansprüche 8 bis 12, die weitere Analyse durch
Seguenzierung erfolgt, wobei Methoden zur
Seguenzierung die Sanger-Methode, Maxam-Gilbert-
Methode und andere Methoden wie Sequencing by
Hybridisation (SBH) umfassen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Sequenzierung für jede oder eine kleine
Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten
Primeroligonukleotid ausführt und die Verlängerung
der Primer nur eine oder einige wenige Basen
ausmacht, und man aus der Art der Primerverlängerung
auf den Methylierungsstatus der betreffenden
Positionen in der zu untersuchenden DNA schließt.
25. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem
Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten
CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder
eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten
schließt.
26. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate selbst
für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung
versehen sind.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.
28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
dass die Markierungen Radionuklide sind.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen
sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden.
30. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass bei der Amplifikation
einer der Primer an eine Festphase gebunden ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, dass die Amplifikate insgesamt im
Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit
durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
32. Verwendung eines Verfahrens nach einem der
voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder
Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder
Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse
mindestens einer der folgenden Kategorien angehören:
unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
33. Verwendung eines Verfahrens nach einem der
voranstehenden Ansprüche zur Unterscheidung von
Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der
Zelldifferenzierung.
34. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen
Reagenz, Primern und weiteren Oligonuleotiden ohne
3'-OH Funktion zur Herstellung der Amplifikate, sowie
optional einer Anleitung zur Durchführung eines
Assays nach einem der Ansprüche 1-31.
Priority Applications (23)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10112515A DE10112515B4 (de) | 2001-03-09 | 2001-03-09 | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität |
| DE10158283A DE10158283A1 (de) | 2001-11-19 | 2001-11-19 | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität |
| EP06077160A EP1818414A3 (de) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität |
| NZ527350A NZ527350A (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Detecting cytosine methylation in genomic DNA samples in which all unmethylated cytosine bases are converted to uracil and the 5-methylcytosine bases remain unchanged |
| AT02722194T ATE362995T1 (de) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Verfahren zum nachweis von cytosinmethylierungsmustern mit hoher sensitivität |
| HK05102135.7A HK1069604B (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Method for detecting cytosine methylation patterns having high sensitivity |
| ES02722194T ES2287269T3 (es) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Procedimiento para la deteccion de modelos de metilacion de citosina, con alta sensibilidad. |
| JP2002571930A JP4484431B2 (ja) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | シトシンメチル化の高感度での検出方法 |
| AU2002253108A AU2002253108B2 (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Method for detecting cytosine methylation patterns having high sensitivity |
| PCT/EP2002/002572 WO2002072880A2 (de) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierungsmustern mit hoher sensitivität |
| DE50210199T DE50210199D1 (de) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Verfahren zum nachweis von cytosinmethylierungsmustern mit hoher sensitivität |
| IL15708002A IL157080A0 (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Method for detecting cytosine methylation patterns having high sensitivity |
| DK02722194T DK1370691T3 (da) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Fremgangsmåde til påvisning af cytosinmethyleringsmönstre med höj sensitivitet |
| RU2003126575/13A RU2332462C2 (ru) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Способ обнаружения метилирования цитозина в образцах днк |
| KR1020037011825A KR100839984B1 (ko) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | 시토신 메틸화 패턴의 탐지를 위한 고민감 방법 |
| CA2435917A CA2435917C (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns |
| CNB028055071A CN100347314C (zh) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | 探测胞嘧啶甲基化模式的高灵敏度方法 |
| EP02722194A EP1370691B1 (de) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Verfahren zum nachweis von cytosinmethylierungsmustern mit hoher sensitivität |
| NZ538608A NZ538608A (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Detecting cytosine methylation in genomic DNA samples in which all unmethylated cytosine bases are converted to uracil and the 5-methylcytosine bases remain unchanged |
| PT02722194T PT1370691E (pt) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Processo para a detecção de modelos de metilação de citosina com grande sensibilidade |
| US10/229,370 US7229759B2 (en) | 2001-03-09 | 2002-08-27 | Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns |
| IS6887A IS6887A (is) | 2001-03-09 | 2003-07-24 | Aðferð til að greina sýtósín metýleringarmynstur sem hafa mikla næmni |
| US12/287,668 US20120107807A1 (en) | 2001-03-09 | 2007-06-11 | Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10158283A DE10158283A1 (de) | 2001-11-19 | 2001-11-19 | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10158283A1 true DE10158283A1 (de) | 2003-05-28 |
Family
ID=7707207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10158283A Withdrawn DE10158283A1 (de) | 2001-03-09 | 2001-11-19 | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10158283A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10329240A1 (de) * | 2003-06-24 | 2005-01-20 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Analyse des Cytosin-Methylierungsstatus von Cancer-Testis-Antigenen für eine individualisierte Immuntherapie |
-
2001
- 2001-11-19 DE DE10158283A patent/DE10158283A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10329240A1 (de) * | 2003-06-24 | 2005-01-20 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Analyse des Cytosin-Methylierungsstatus von Cancer-Testis-Antigenen für eine individualisierte Immuntherapie |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE10112515B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität | |
| EP1423533B1 (de) | Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung mit hoher sensitivität | |
| EP1423528B1 (de) | Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3' | |
| DE10151055B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in CpG Inseln | |
| DE10201138A1 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern durch exponentielle Ligation hybridisierter Sondenoligonukleotide | |
| DE60305150T2 (de) | Quantitativer nachweis der methylierung in dna proben | |
| EP1654388B1 (de) | Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierungen in dna | |
| DE10132212B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten | |
| DE10154317B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in immobilisierten DNA Proben | |
| DE10128508A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren | |
| DE10304219B3 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität | |
| EP1339873B1 (de) | Diagnose von mit humos assoziierten krankheiten | |
| DE10132211A1 (de) | Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) | |
| EP1853724B1 (de) | Verfahren zur untersuchung von cytosin-methylierungen in dna | |
| DE10158283A1 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität | |
| EP1432827B1 (de) | Verfahren zum nachweis von dna-methylierung mittels markierten s-adenosylmethioninanaloga | |
| EP1711628B1 (de) | Verfahren zur kalibrierung und kontrolle von methylierungsanalyse-methoden mit hilfe von nicht-methylierter dna | |
| DE10044543C2 (de) | Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsgrades von bestimmten Cytosinen in genomischer DNA im Sequenzkontext 5'-CpG-3' | |
| DE10164501A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse einer Lymphoid-Zellteilungsstörung | |
| DE10255104A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen | |
| DE10065814A1 (de) | Verfahren für die simultane Amplifikation vieler Sequenzen in einer PCR-Reaktion und deren Markierung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |