DE69728925T2

DE69728925T2 - Verfahren zur Analyse vom Zellzyklus von Zellsubpopulationen aus heterogenen Zellproben

Info

Publication number: DE69728925T2
Application number: DE69728925T
Authority: DE
Inventors: Jose Alberto 37194 Santa Maria de Tormes Orfao de Matos Correia e Vale
Original assignee: Universidad de Salamanca
Current assignee: Universidad de Salamanca
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: EP0798386A1; DE69728925D1; EP0798386B1; ES2112211A1; ES2112211B1; ATE266100T1

Description

Diese Erfindung behandelt hauptsächlich, obwohl nicht ausschließlich, ein Verfahren für die schnelle, kosteneffektive, empfindliche und spezifische Durchflusszytometrieanalyse des Zellzyklus von in heterogenen Zellproben vorhandenen Tumor- und Normalzell-Subpopulationen, um das Wissen über die Zellbiologie für diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke und die Forschung zu erweitern.
Der Zellzyklus bezieht sich auf die Phasen, welche eine Zelle zu durchlaufen hat, um sich selbst zu vervielfachen und zwei theoretisch identische Tochterzellen zu ergeben. Während dieses Zeitabschnitts und in einer aufeinanderfolgenden Art und Weise beginnen die ruhenden Zellen (G0-Phase) unter bestimmten Umständen oder nach Erhalt spezifischer Stimuli die Synthese von RNA und Proteinen (G1-Phase), welche notwendig sind, um effektiv die Vervielfachung ihrer DNA und die Teilung der Zelle in zwei Tochterzellen durchzuführen. Nachfolgend beginnt die DNA-Synthese (S-Phase); wenn die Zelle ihre DNA einmal dupliziert hat, beginnt ein zweiter Spätprotein-Synthesezeitabschnitt (G2-Phase), welcher die Zelle für die Teilung vorbereitet (M-Phase). Die Zellzyklusanalyse, hauptsächlich durch die Untersuchung der Verteilung von Zellen auf die G0/G1-, S- und G2-M-Zellzyklusphasen, wurde als nützlich für die Analyse von Tumorproben und im Studium der proliferativen Antwort auf verschiedene Stimuli als auch in anderen Bereichen nachgewiesen. Im Allgemeinen ist das Verfahren von außerordentlichem Wert, nicht nur um Einblicke in den Bereich der Zellbiologie zu erhalten, sondern ebenfalls für diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke. Von den verschiedenen, heutzutage verwendeten Methoden, basiert die am meisten eingesetzte auf der Färbung der Zellen mit DNA-spezifischen Fluorochromen. Aus der erhaltenen Menge von Fluoreszenz/DNA und unter Verwendung mathematischer Modelle wird der Anteil der Zellen aus einer bestimmten Probe berechnet, welche in den G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen sind. Einer der größten Fallstricke für die Analyse des Zellzyklus von in vivo erhaltenen Proben ist die häufige Abwesenheit von reinen Zellpopulationen. Häufig (d. h. in Tumorproben oder anderen biologischen Proben) ist eine Mischung verschiedener Zelltypen in schwankenden Anteilen vorhanden, welche eine verschiedene Verteilung über die distinkten Zellzyklusphasen aufweist. Daher ergibt die allgemeine Analyse des Zellzyklus keine direkte Information über die Proliferation jeder der verschiedenen in der Probe vorhandenen Subpopulationen. Vor kurzem durchgeführte Untersuchungen haben die Möglichkeit der Durchführung der Färbung mit monoklonalen Antikörpern und einem DNA-Fluorochrom gezeigt, um spezifisch die Verteilung von Tumorzellen über die verschiedenen Zellzyklusphasen zu analysieren (DOLBEARE FRANK A ET AL; CELL TISSUE KINET 22(3)). Jedoch machen es verschiedene Faktoren schwieriger, die Zellen für die spezifische Identifikation von den verbleibenden Zellen zu unterscheiden, um ihre Zellzyklusverteilung zu analysieren. Diese Faktoren enthalten: die Heterogenität der Tumorzellen in Bezug auf die Expression eines individuellen Markers (entweder innerhalb der Tumorprobe oder zwischen verschiedenen Tumorproben von verschiedenen Patienten mit der gleichen Diagnose), die Verwendung von Fluorochromen, die spezifisch an die DNA binden, welche einen Teil der mit den verwendeten monoklonalen assoziierten Fluoreszenz absorbieren, und die Notwendigkeit von permeabilisierenden Substanzen in den meisten dieser Verfahren, welche zu einem bestimmten Ausmaß die Zellmembran und die Bindung des monoklonalen Antikörpers verändern (BECTON DICKINSON CO).
Demgemäß wurde bisher über kein Verfahren berichtet, in welchem innerhalb einer Probe, in der die Zellzyklusverteilung unter Verwendung der Färbung mit für Nukleinsäuren spezifischen Fluorochromen zu analysieren ist, wobei das gleiche Fluorochrom für einen Pool verschiedener monoklonaler Antikörpern verwendet wird, um eine Zellpopulation zu identifizieren.
Daher ist es eine Absicht dieser Erfindung, eine Lösung für die spezifische Untersuchung des Zellzyklus einer in einer Probe vorhandenen Population von Zellen zur Verfügung zu stellen, in welchem eine optimale Unterscheidung zwischen den interessierenden Zellen und den restlichen Zellelementen der Probe erhalten werden kann.
Zusätzlich ist es eine weitere Absicht der Erfindung, die Verteilung der restlichen Zellen (Zellen, welche negativ für den Pool der verwendeten monoklonalen Antikörper sind) über die verschiedenen Zellzyklusphasen zu bestimmen.
Das Verfahren dieser Erfindung besteht in der Verwendung eines Pools von monoklonalen Antikörpern, konjugiert mit dem gleichen Fluorochrom (FL1), wie etwa Fluoresceinisothiocyanat (FITC), um alle in der Probe vorhandenen Zellen zu identifizieren, um sie spezifisch zu identifizieren, und ein für Nukleinsäuren spezifisches Fluorochrom (FL2), wie etwa Propidiumiodid oder Ethidiumbromid.
Sowohl die Probenvorbereitung, die Zellfärbung mit monoklonalen Antikörpern und mit für Nukleinsäure spezifischen Fluorochromen, die Auswahl der zu untersuchenden Zellen als auch die Kalibrierung und die Einstellung des Durchflusszytometers werden den vorbeschriebenen und empfohlenen Verfahren folgend durchgeführt (BECTON DICKINSON CO).
Für die Analyse der Ergebnisse als auch für die exakte Quantifizierung der Verteilung jeder untersuchten Zellpopulation über die Zellzyklusphasen, können kommerziell erhältliche Software-Programme verwendet werden. Während der Analyse muss, neben der Auswahl der Untergruppe der interessierenden Zellen für die Untersuchung aus der Probe, jedes Ereignis, das Zell-Multipletts als auch Zelltrümmern entspricht, ausgeschlossen werden.
Die Erfindung kann sowohl in normalen als auch in pathologischen Proben aus humanen oder tierexperimentellen Modellen, aus Pflanzen, Bakterien und anderen Mikroorganismen und für alle Zwecke verwendet werden, bei denen eine Analyse der Verteilung einer in einer Probe vorhandenen Untergruppe von Zellen über die G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen für die Forschung und für diagnostische, prognostische und therapeutische Untersuchungen erforderlich ist.
Wie aus dem vorher beschriebenen abgeleitet werden kann, können die verwendeten monoklonalen Antikörper, im Wesentlichen abhängig von dem zu identifizierenden Zelltyp variieren. Überdies sollte erkannt werden, dass in dieser Erfindung Variationen, in welchen eine andere Art von Fluorochrom verwendet wird, oder in welchen die Anzahl der monoklonalen Antikörper mehr als 2 ist, eingeschlossen sind. Schließlich sind ebenso alle Variationen eingeschlossen, in welchen mehr als ein Pool von monoklonalen Antikörpern verwendet werden, in welchen sie mit verschiedenen Fluorochromen für die spezifische und simultane Identifikation in der gleichen Probe von zwei oder von mehreren unterschiedlichen Zellpopulationen gefärbt werden.
Mit dieser Erfindung optimieren wir auf eine signifikante Art und Weise die Untersuchung des Zellzyklus in biologischen Proben, und wir verbessern die Auswahl der interessierenden Zellen als auch die Geschwindigkeit ihrer Untersuchung.
Es sollte ebenfalls herausgestellt werden, dass die Möglichkeit der Verwendung eines Pools von mit dem gleichen Fluorochrom gefärbten monoklonalen Antikörpern für die Untersuchung des Zellzyklus ausführliche Informationen über die Proliferation der untersuchten Zellen zur Verfügung stellt, welche helfen würde, systematisch ihre Lokalisierung und ihre Rolle in verschiedenen normalen und pathologischen Zuständen zu identifizieren.
Ohne eine Grenze für das Potential der Erfindung zu ziehen, werden im Folgenden zwei Beispiele beschrieben, welche ihre Verwendung veranschaulichen.
BEISPIEL 1
1. Material und Methoden
Peripheres Blut (PB) wurde durch Venenpunktion von 10 Patienten erhalten, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie an chronischen B-Zell-lymphoproliferativen Störungen litten, in flüssiges EDTA (K3) gegeben und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis die Probenvorbereitung begonnen wurde. Die Zellzyklusanalyse wurde innerhalb der nächsten 5 Stunden unter Verwendung einer direkten Immunfluoreszenztechnik und Färben mit Propidiumiodid gemessen durch Durchflusszytometrie durchgeführt.
2. Probenvorbereitung
Ein Röhrchen mit 100 μL PB mit 0,5 bis 1 × 10⁶ weißen Blutzellen wurde für jede der Proben vorbereitet. Die Probe wurde mit vier, mit FITC konjugierten monoklonalen Antikörpern inkubiert.
Die Spezifität der Kombinationen der verwendeten monoklonalen Antikörper und ihre Herkunft waren wie folgt:

1) FMC63-FITC(CD19); pan-B Marker (Serotec, UK)
2) Leu14-FITC(CD22); pan-B Marker (Becton/Dickinson, USA)
3) Leu16-FITC(CD20); pan-B Marker (Becton/Dickinson, USA)
4) WR17-FITC(CD37); pan-B Marker (Serotec, UK).

Die Röhrchen wurden behutsam gevortext und in der Dunkelheit für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Unmittelbar nach diesem Inkubationszeitabschnitt wurden 2 mL einer Ammoniumchlorid-Lysierungslösung hinzugegeben, gefolgt durch 4–5 Sekunden Vortex. Danach wurden die Zellen für weitere 10 Minuten in der Dunkelheit inkubiert (Raumtemperatur). Danach wurden die Proben bei 300 g für 5 Minuten (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das von roten Blutzellen freie Zellpellet wurde durch kräftiges Vortexen (1–2 Sekunden) resuspendiert. In jedem Röhrchen wurden 1 mL einer Phosphatpuffersalinelösung (PBS), die 1 g/L bovines Serumalbumin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) enthält, zugegeben. Eine weitere Zentrifugation (300 g, 5 Minuten) wurde durchgeführt und die Zellen wurden schließlich in 1 mL PBS-Lösung mit 0,5% Tween-20 (Sigma), 100 mg/mL de RNAse (Sigma Chemicals) und 5 μg/mL Propidiumiodid (Sigma Chemicals) resuspendiert. Die Zellen wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur in dieser Lösung inkubiert und bei 4°C in der Dunkelheit gelagert, bis sie in dem Durchflusszytometer analysiert wurden.
3. Datenerhebung und Analyse
Die Messungen erfolgten mit einem FACSort-Durchflusszytometer (Becton/Dickinson), ausgestattet mit einem Argonionenlaser, eingestellt auf 488 nm und 15 m Watt. Das Instrument wurde unter Verwendung des DNA-QC Reagenz (Becton/Dickinson) kalibriert. Die Fluoreszenzkompensation zwischen FITC und Propidiumiodid wurde unter Verwendung von CALIBRITE beads (Becton/Dickinson) und von roten Zellen vom Huhn, gefärbt mit Propidiumiodid, durchgeführt.
Die Datenanalyse erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wählten wir die interessierenden Zellen aus (FITC positiv), die neoplastischen B-Zellen entsprechen, und schlossen nicht nur die Nicht-B-Zellen, sondern auch Zelltrümmer und Zellaggregate aus. Für diesen Zweck wurde das PAINT-A-GATE PLUS-(Becton/Dickinson), Softwareprogramm verwendet. Danach wurde das RFIT mathematische Modell, enthalten in dem CELLFIT-Softwareprogramm (Becton/Dickinson) für die Analyse der DNA-Histogramme verwendet, um den Anteil der Zellen aus der ausgewählten Zellpopulation zu berechnen, die in den G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen sind.
BEISPIEL 2
1. Material und Methoden
Peripheres Blut (PB) wurde durch Venenpunktion von 15 Patienten erhalten, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie an multiplen Myelomen leiden, in flüssiges EDTA (K3) gegeben und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis die Probenvorbereitung begonnen wurde. Die Zellzyklusanalyse wurde innerhalb der nächsten 5 Stunden unter Verwendung einer indirekten Immunfluoreszenztechnik und Färbung mit Propidiumiodid, gemessen durch Durchflusszytometrie, durchgeführt.
2. Probenvorbereitung
Ein Röhrchen mit 100 μL PB mit 0,5 bis 1 × 10⁶ weißen Blutzellen wurde für jede der Proben vorbereitet. Die Probe wurde mit zwei monoklonalen Antikörpern inkubiert.
Die Spezifität der Kombinationen der verwendeten monoklonalen Antikörper und ihre Herkunft war wie folgt:

1) BB4; Plasmazellmarker (Serotec, UK)
2) GR7A4(CD38); stark und charakteristisch durch Plasmazellen exprimierter Marker (Universidad de Granada, Spanien)

Die Röhrchen wurden behutsam gevortext und in der Dunkelheit für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Unmittelbar nach diesem Inkubationszeitabschnitt wurden 2 mL PBS-Lösung hinzugegeben, gefolgt durch 4–5 Sekunden Vortex. Danach wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 200 μL der gleichen Lösung resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurde ein gegen Maus-Immunglobulin gerichteter, monoklonaler Antikörper vom Kaninchen in einer Endverdünnung von 1/100 gegeben und eine zweite Inkubation bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für 10–15 Minuten durchgeführt. Nachdem diese Inkubation beendet war, wurden 2 mL einer Ammoniumchlorid-Lysierungslösung zugegeben, gefolgt durch vier bis fünf Sekunden Vortex. Danach wurden die Zellen für weitere 10 Minuten in der Dunkelheit inkubiert (Raumtemperatur). Danach wurden die Proben bei 300 g für 5 Minuten (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das von roten Blutzellen freie Zellpellet wurde durch kraftvolles Vortexen (1–2 Sekunden) resuspendiert. In jedes Röhrchen wurden 1 mL einer Phosphatpuffer-Salinelösung (PBS) mit 1 g/L bovines Serumalbumin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) zugegeben. Eine weitere Zentrifugation (300 g, 5 Minuten) wurde durchgeführt und die Zellen wurden schließlich in 1 mL einer PBS-Lösung mit 0,5% Tween-20 (Sigma) resuspendiert, 100 mg/mL de RNAse (Signal Chemicals) und 5 μg/mL Propidiumiodid (Sigma Chemicals) resuspendiert. Die Zellen wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur in dieser Lösung inkubiert und wurden bei 4°C in der Dunkelheit gelagert, bis sie in dem Durchflusszytometer analysiert wurden.
3. Datenerhebung und Analyse
Die Messungen erfolgten mit einem FACSort-Durchflusszytometer (Becton/Dickinson), ausgestattet mit einem Argonionenlaser, eingestellt auf 488 nm und 15 m Watt. Das Instrument wurde unter Verwendung des DNA-QC Reagents (Becton/Dickinson) kalibriert. Die Fluoreszenzkompensation zwischen FITC und Propidiumiodid wurde unter Verwendung von CALIBRITE beads (Becton/Dickinson) und von roten Zellen vom Huhn, gefärbt mit Propidiumiodid, durchgeführt.
Die Datenanalyse erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wählten wir die Plasma-Zellen entsprechenden, interessierenden Zellen aus (FITC positiv) und schlossen nicht nur die übrigen Zellen, sondern auch Zelltrümmer und Zellaggregate aus. Für diesen Zweck wurde das PAINT-A-GATE PLUS-(Becton/Dickinson)Softwareprogramm verwendet. Danach wurde das RFIT mathematische Modell, enthalten in dem CELLFIT-Softwareprogramm (Becton/Dickinson) für die Analyse der DNA-Histogramme verwendet, um den Anteil der Zellen aus der ausgewählten Zellpopulation zu berechnen, die in den G0/G1, S und G2/M-Zellzyklusphasen sind.

Claims

Verfahren für die Analyse des Zellzyklus von in heterogenen Zellproben vorhandenen Tumorzellsubpopulationen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) sequentielle Inkubation der Probe mit einem Pool von CD38 und CD138 oder einem Pool von CD19 und CD22 und CD20 und CD37 monoklonalen Antikörpern gefärbt mit dem gleichen Fluorochrom, und wobei alle für die spezifische und empfindliche Identifizierung der interessierenden Zellen ausgelegt sind, und mit einem nukleinsäurespezifischen Fluorchrom; b) Messung der Fluoreszenzemissionen der zwei Fluorochrome durch Flusszytometrie; c) Analyse der erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung einer Multiparameteranalyse für den Nachweis der zu untersuchenden Zellsubpopulation, und Analyse ihrer Verteilung über die G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) normale und pathologische in vivo erhaltene, in vitro gelagerte oder behandelte Proben verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten monoklonalen Antikörper und ihre Anzahl in Abhängigkeit von dem zu identifizierenden genauen Tumorzelltyp, seinem Phänotyp oder der Probenart variieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jede Kombination von Fluorochromen verwendet werden kann, wenn sie technisch kompatibel sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig mehr als ein Pool monoklonaler Antikörper gerichtet gegen mehr als eine unterschiedliche Zellpopulation verwendet werden kann, wobei jeder der Pools der monoklonalen Antikörper mit einem unterschiedlichen Fluorochrom gefärbt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei neben der Färbung der zu untersuchenden Zellsubpopulation und der Nukleinsäuren andere Marker einschließlich Onkoproteinen, mit dem Zellzyklus verbundene Proteine, Zellapoptose, Aktivierungs- oder Differenzierungsmarker nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Nachweis der Zellen auf der Grundlage der Anwesenheit der Färbung des Pools der verwendeten monoklonalen Antikörper oder durch die Intensität der für sie erhaltenen Positivität durchgeführt wird.