DE3015462C2

DE3015462C2 -

Info

Publication number: DE3015462C2
Application number: DE3015462A
Authority: DE
Inventors: Michel Rehovot Il Revel; Adi Raanana Il Kimchi; Lester Shulman; David Rehovot Il Wallach
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1979-04-22
Filing date: 1980-04-22
Publication date: 1992-07-02
Also published as: FR2455082A1; SE447486B; US4302533A; DE3015462A1; FR2455082B1; IL57108A0; JPH0152000B2; IT8021525A0; GB2048472A; IT1141293B; GB2048472B; IL57108A; JPS55144898A; SE8002595L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Be stimmung von Interferonen in z. B. Körperflüssigkeiten, Körper geweben, Zellkulturen und Züchtungsmedien.

Interferone sind Glycoproteine, die in Zellkulturen zu einer verringerten Virusvermehrung führen. Auf Grund dieser anti viralen Aktivität sind Interferone wertvolle Wirkstoffe bei der Behandlung von viralen Erkrankungen beim Menschen. Inter ferone gelten auch als mögliche Wirkstoffe zur Krebsbekämpfung. Interferonbestimmungen werden z. Zt. so durchgeführt, daß man die Verringerung des Wachstums von bestimmten Viren in Zellen, die einer Interferoneinwirkung ausgesetzt worden sind, mißt. Diese Bestimmungen sind sehr zeitraubend und müssen stark variiert werden, da eine Infektion durch Viren er forderlich ist.

Herkömmliche Interferonbestimmungen beruhen auf einer 10- bis 20stündigen Vorbehandlung der Zellen mit Interferon und einer anschließenden mindestens 8- bis 10stündigen und im allgemeinen 24- bis 48stündigen Infektion mit einem Test virus. Hierauf wird ein virales Produkt oder eine zytopathi sche Wirkung gemessen. Die Infektion der Zellen stellt einen Unsicherheitsfaktor dar und macht zusätzliche Kontrollen beim Test erforderlich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Interferon durch Einwirkung von Interferon auf Zellen oder Gewebe menschlichen oder tierischen Ursprungs zur Verfügung zu stellen, bei dem eine Virusinfektion entfällt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, bei dem man die Zellen oder das Gewebe anschließend mit einem Extraktionsmittel extrahiert und im Extrakt die Menge eines Enzyms mißt, dessen Gehalt in den Zellen oder in dem Gewebe eine Funktion der Interferon menge ist, der die Zelle oder das Gewebe vorher ausgesetzt worden ist.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß bei Zusatz von Interferon zu Zellkulturen der Gehalt an spezifischen Enzymen zunimmt. Diese Zunahme stellt unter kontrollierten Bedingungen ein Maß für die Interferonmenge dar. Die Bestimmung kann auch an Zellen, wie weißen Blutkörperchen und insbesondere menschlichen Leukozyten, durchgeführt werden. Der Gehalt an bestimmten Enzymen ist ein Maß für die vorherige Inter feroneinwirkung, denen die Zellen im menschlichen Körper aus gesetzt waren.

Die erfindungsgemäße Bestimmung wird mit sehr geringen Enzym mengen durchgeführt. Das Bestimmungsverfahren ist sehr empfind lich und genau.

Es gibt eine Reihe von Enzymen, deren Menge eine Funktion der Interferoneinwirkung auf Zellen ist. In Anwesenheit von Interferon nimmt die Menge dieser Enzyme zu. Diese Zunahme erfolgt allmählich und beginnt nach einer Induktionszeit von einigen Stunden. Nach etwa 3 Stunden läßt sich unter physio logischen Bedingungen eine Zunahme messen. Die Zunahme er reicht nach etwa 12 bis 24 Stunden ihr Maximum. Bei Durch führung der Bestimmung unter kontrollierten Bedingungen ist es vorteilhaft, die Enzymmenge nach etwa 8 Stunden zu messen. Es können aber auch andere Zeitspannen gewählt werden. Die Anwesenheit von Interferon bewirkt eine mengenmäßige Zu nahme folgender Enzyme:

1. Proteinkinase, die spezifisch die kleine Untereinheit des Initiationsfaktors eIF₂ phosphoryliert,
2. Oligoisodenylatsynthetase, die aus ATP ein spezifisches Oligonucleotid, (2′,5′) pppApApA, bildet,
3. Phosphodiesterase, die (2′,5′)-Dinucleosidmonophosphate, wie (2′,5′) ApA, abbaut.

Wird Interferon oder ein Interferon enthaltendes Medium zu einer Zellkultur gegeben, so nimmt der Gehalt an diesen En zymen in den Zellen zu. Es kann auch der Gehalt an anderen Enzymen, deren Menge durch Interferoneinwirkung zunimmt, für die Bestimmung herangezogen werden.

Wird eine geringe Menge an Zellen einer Zellkultur, die vor her einer Interferoneinwirkung ausgesetzt worden ist, nach einer vorbestimmten Zeit mit einem entsprechenden Extrak tionsmittel extrahiert, so kann im Extrakt der Enzymgehalt der Zellen ermittelt werden. Die Menge von einem oder mehreren Enzymen ist ein Maß für die Interferonmenge, der die Zellen ausgesetzt worden sind. Die Bestimmung kann auch mit Leukozyten, die einer Extraktionsbehandlung unterzogen worden sind, durchgeführt werden. Der Enzymgehalt der Zellen wird durch das erfindungsgemäße Verfahren, das zur Messung äußerst ge ringer Enzymmengen geeignet ist, bestimmt. Der Enzymgehalt ist, wie bereits erwähnt, ein Maß für die Menge an Inter feronen, denen die Zellen im Körper ausgesetzt worden sind. Dies erlaubt Rückschlüsse auf den Krankheitszustand von Patienten.

Die zu bestimmenden Zellen werden mit einem geeigneten Ex traktionsmittel, beispielsweise einem nicht-ionogenen grenz flächenaktiven Mittel extrahiert. Ein Beispiel für ein ent sprechendes grenzflächenaktives Mittel ist Nonidet P40, der Firma Paz Company, Israel. Die Extraktion kann auch auf an dere Weise vorgenommen werden. Die Zunahme der Enzymmenge in den der Interferoneinwirkung ausgesetzten Zellkulturen ist ausgeprägt. Für die drei vorstehend aufgeführten Enzyme er geben sich folgende Zunahmen: Für das Enzym (1) um den Faktor 10, für das Enzym (2) um einen Faktor von 20 bis 100 und um den Faktor 3 beim Enzym (3).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der Enzymgehalt (von Enzymen, deren Menge durch Einwirkung von Interferonen auf die entsprechenden Zellen zunimmt) in der Probe ermittelt. Aus der Enzymmenge wird auf die Interferonmenge, der die Zellen ausgesetzt waren, geschlossen.

Die Beispiele erläutern die Bestimmung von Interferonen durch Messung eines der drei vorstehend genannten Enzyme, deren Gehalt nach Interferoneinwirkung auf die Zellen zunimmt.

Wie vorstehend erwähnt, verläuft die Zunahme des Enzymgehalts von Zellen, die einer Interferoneinwirkung ausgesetzt sind, allmählich. Eine merkliche Zunahme läßt sich nach etwa 3stündiger Einwirkung nachweisen. Eine Bestimmung nach 8stündiger Einwirkung erweist sich als besonders zufriedenstellend, da zu diesem Zeitpunkt eine wesentliche Zunahme stattgefunden hat. Der Enzymgehalt erreicht je nach dem Enzym sein Maximum nach 12 bis 24 Stunden. Bei einer Bestimmung nach 8stündiger Ein wirkung kann der erhaltene Wert zur Bestimmung der Interferon menge herangezogen werden, indem man sich einer unter gleichen Bedingungen erstellten Eichtabelle bedient.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Bestimmung von Interferon durch Messen von Proteinkinase (PK-i)

In den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff (96 Vertiefungen) werden Interferon-Reihenverdünnungen von 0 bis 50 Einheiten/ml hergestellt, wobei in 5 aufeinander folgenden Verdünnungsschritten mit dem Faktor 1 : 5 jeweils mit Gewebekulturmedium mit einem Gehalt an 10 Prozent Kälber serum verdünnt wird. Sodann wird eine frisch trypsinierte Suspension von Mäuse-L-Zellen oder menschlichen diploiden Filbroblasten zugesetzt. In jede Vertiefung gelangen etwa 25 000 Zellen. Das Endvolumen beträgt 0,1 ml. Nach 8 Stunden wird das Medium von der Mikrotiterplatte entfernt. Sodann werden 0,025 ml einer Lösung von 0,5%, Nonidet P40 in 20 mM, Hepes-Puffer vom pH-Wert 7,5 (5 mM, MgCl₂, 120 mM, KCl, 1 mM, Dithiothreitol und 10% Glycerin) zugesetzt. Nach 6 bis 9 Minuten wird die Platte 5 Minuten bei 4000 U/min in einem mit einem ent sprechenden Adapter versehenen Zentrifugenrotor zentrifugiert. Von jeder Vertiefung wird ein Volumen von 0,015 ml entfernt und jeweils mit 0,5 µg/ml doppelsträngiger Polyinosin-Poly cytildylsäure (poly(rI) : (rC)) mit 0,5 mM ATP versetzt. Das Endvolumen beträgt 0,02 ml. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 30°C inkubiert. Sodann werden 5 µg des als eukaryotischer Initiationsfaktor 2 (eIF₂) bzeichneten Proteins (gereinigt aus Kaninchen-Retikulozyten gemäß Benne u. Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 7675 bis 7681) sowie 0,075 mM [³²P]-γ-ATP (16 Ci/mMol) zugesetzt. Die Inkubation wird 15 Minuten bei 30°C fortgesetzt. Die in das Protein eIF₂ eingebaute Radioaktivität wird nach Säure fällung oder vorzugsweise nach Elektrophorese des Gemisches in einem 12% Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an 0,1% Natriumdodecylsulfat gemessen. Anschließend wird ein Röntgenfilm mehrere Stunden dem getrockneten Gel ausgesetzt. Nach der Entwicklung zeigt der Film eine einem Molekulargewicht von 35 000 entsprechende Bande. Die Banden intensität wird densitometrisch bei 600 nm in einem auf zeichnenden Spektrophotometer gemessen. Die Intensität der 35 000 Mr-Bande stellt ein direktes Maß für die Menge des in das Protein eIF₂ eingebauten ³²P-Phosphats und ein Maß für die Aktivität der Proteinkinase PK-i dar. In entsprechen der Weise kann auch eine Elektrophorese auf Celluloseacetat durchgeführt werden.

In Tabelle I ist die Zunahme der PK-i-Aktivität bei einer Interferonmenge von 2 Einheiten pro ml im Vergleich zu unbe handelten Zellen wiedergegeben. Die niedrigste Interferon konzentration, die die Vermehrung von vesikulärem Stomatitis virus auf den Zellen zu mehr als 90 Prozent hemmt, erzeugt die maximale Zunahme der Aktivität von Proteinkinase Pk-i. In Tabelle II ist der zeitliche Verlauf der PK-i-Zunahme bei Mäuse-L-Zellen erläutert. Die Zunahme beginnt 3 Stunden nach der Interferoneinwirkung auf die Zellen und erreicht nach 24 Stunden ihr Maximum. Nach 8stündiger Interferonbehandlung ist die halbmaximale Zunahme erreicht.

Beispiel 2 Interferonbestimmungen durch Messung von Oligoisodenylat synthetase und Phosphodiesterase

Die Zunahme der Mengen von zwei weiteren Enzymen wird in den gleichen Nonidet-P40-Extrakten von mit Interferon behandelten Zellen bestimmt: Oligoisodenylatsynthetase und 2′-Phospho diesterase. Als Beispiel wird die Zunahme der Oligoisoadeny latsynthetase E nach Interferonbehandlung erläutert. Die Zellen werden gemäß Beispiel 1 mit Nonidet P40 lysiert und mit Polyinosin-Polycytidylsäure (doppelsträngig) (poly-(rI) : (rC)), gebunden an Sepharose-Kügelchen (gemäß dem Verfahren von Wagner u. Mitarb., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 45 (1971), S. 184 bis 189), versetzt. Die Kügelchen werden ge waschen und in einem gleichen Volumen (25 µl) an Nonidet P40- Zellextrakten suspendiert. Das nicht-adsorbierte Material wird entfernt. Das Kügelchen-Pellet wird 20 Stunden bei 30°C in 1 mM [³²P]α-ATP (3 Ci/mMol) und 1 mM Dithiothreitol inkubiert. Der Überstand (10 µl) wird 60 Minuten bei 37°C mit 0,35 Einheiten bakterieller alkalischer Phos phatase in 30 mM, Tris-Base behandelt. Das Produkt wird 4 Stunden bei 3000 V der Papierelektrophorese an Whatman 3MM-Papier oder vorzugsweise der Dünnschichtchromatographie an Polyäthylenimin-Cellulose unter Verwendung von Essigsäure unterzogen. Die (2′,5′) ApA und (2′,5′) ApApA entsprechenden Flecken werden ausgeschnitten und der Szintillationszählung unterzogen. Die Zunahme an Oligoisoadenylatsynthetase wird angegeben als die Menge des in das (2′,5′) Diadenylatmonophos phat und/oder (2′,5′) Triadenylatdiphosphat aus dem [³²P]- α-ATP eingebauten radioaktiven Phosphats.

Ein schnelleres und einfacheres Verfahren besteht darin, daß das der Phosphatasebehandlung unterzogene Produkt auf kleine Einweg-Aluminiumoxidsäulen (Säulenvolumen 0,3 ml), die vor her mit 1 M Glycin 0,75 N HCl-Puffer vom pH-Wert 2 äquili briert worden sind, aufzusetzen. Hierauf werden 3 ml des gleichen Puffers über die Säule gegeben. Das Eluat wird in für die Szintillationszählung zur Messung der Radioaktivität bestimmten Flächen aufgefangen.

Die gleichen Ergebnisse erhält man bei menschlichen diploiden Vorhaut-Fibroblasten, die mit menschlichem Fibroblasten-Inter feron behandelt worden sind. Die Hauptvorteile des erfin dungsgemäßen Bestimmungsverfahrens sind:

(1) Das Verfahren ist nicht von einer Virusinfektion der der Interferonbehandlung unterzogenen Zellen abhängig.
(2) Das Verfahren verläuft genau, reproduzierbar und rasch.
(3) Das Verfahren kann nicht nur zur Messung von Interferon mengen in unbekannten Lösungen, sondern auch zur Prüfung der Frage, ob Zellen eines bestimmten Gewebes auf Interferon reagiert haben, angewendet werden.

Wird beispielsweise Interferon einem Patienten injiziert, kann in einer Blutprobe bestimmt werden, ob die weißen Blutkörperchen (Lymphozyten) erhöhte Mengen an Proteinkinase PK-i enthalten. Die gleiche Bestimmung kann an kleinen Biopsie proben von der Konjunktiva oder von Haut, die einer topischen Interferonbehandlung ausgesetzt worden sind, durchgeführt werden. Ähnliche Messungen mit Phosphodiesterase führen zu ana logen Ergebnissen. Die Phosphodiesterase wird unter Ver wendung von 1 mM (2′,5′) ApA als Substrat und 10 µl Zellextrakten gemessen. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C wird das Reaktionsgemisch der Dünnschichtchromatographie an Polyäthylenimin-Cellulose unter Verwendung von 0,32 M LiCl unterzogen. Die Menge an gebildetem 5′-AMP ist ein Maß für die Phosphodiesterasemenge 5′-AMP wird mit 0,7 M MgCl₂ von der Cellulose eluiert und durch Bestimmung der Absorption bei 250 nm (mµ) gemessen.

Die Messungen können an den gleichen Zellen, wie in Beispiel 1 für die Messung von Proteinkinase angegeben, durchge führt werden.

Beispiel 3 Konzentration an Oligoisoadenylatsynthetase in menschlichen Blutzellen

Die Bestimmung von durch Interferon induzierten Enzymen er möglicht ein neues und zweckmäßiges Verfahren zur Bestimmung der biologischen Reaktion von Zellen oder Geweben menschlichen oder tierischen Ursprungs auf Interferon. Beispielsweise werden Messungen der Oligoisoadenylatsynthetase an Blut zellen von menschlichen Spendern oder Patienten mit ver schiedenen pathologischen Zuständen durchgeführt. Durch Venen punktion wird eine 2 ml-Blutprobe entnommen. Die weißen Blutkörperchen werden von den übrigen Blutbestandteilen ab getrennt. Beispielsweise wird Ficoll-Paque der Firma Pharmacia zur Gewinnung von Blut-Lymphozyten und anderen einkernigen Zellen verwendet. Die Zellen werden in einer Konzentration von 10⁷ Zellen/ml suspendiert und mit dem in Beispiel 1 angegebenen Nonidet P40 enthaltenden Puffer lysiert. Ali quotmengen (5 bis 10 µl) des Lysats werden mit poly-(rI) : (rC)-Agarose- oder -Sepharose-Kügelchen vermischt und gemäß Beispiel 2 mit [³²P]-ATP inkubiert. Die Menge an gebildetem (2′,5′)-Oligoisoadenylat wird durch Hochspannungselektro phorese oder oder durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxid gemäß Beispiel 2 gemessen.

Die in Tabelle III zusammengestellten Daten zeigen die unter schiedlichen Konzentrationen an Oligoisoadenylatsynthe tase, die in menschlichen weißen Blutkörperchen unter ver schiedenen pathologischen Zuständen beobachtet worden sind. Daraus geht klar hervor, daß bei zwei verschiedenen Formen von akuter Leukämie die erhaltenen Werte 10fach niedriger als in normalem Blut sind. Bei einer dritten Form von akuter Leukämie liegen die Werte nur geringfügig unter dem Normal wert. Bei chronischer lymphatischer Leukämie ergeben sich niedrige Werte, die aber höher als bei akuter lymphatischer Leukämie sind. Bei einer Art einer Autoimmunerkrankung, nämlich Lupus erythematodes, ergibt sich eine erhöhte Enzym konzentration.

Durch Inkubation von leukämischen Zellen mit Interferon kann die Konzentration an Oligoisoadenylat auf den Normalwert zurückgebracht werden (vgl. Tabelle III). Die erwähnten Enzyme stellen daher wertvolle Hilfsmittel zur Verfolgung der Reaktion von Leukämiepatienten auf eine Interferontherapie dar. Die Messungen können in geringen Blutmengen (weniger als 2 ml) innerhalb von weniger als 24 Stunden durchgeführt werden. Die Bestimmung eignet sich für verschiedene Arten von Blutzellen und für Gewebe. Beispiele für pathologische Zu stände, deren Untersuchung von Interesse ist, sind Krebser krankungen, infektiöse Erkrankungen und immunologische Stö rungen.

Beispiel 4 Testpackung zur Interferonbestimmung a) Bestimmung von Proteinkinase

Zur Durchführung des Tests sind folgende Reagentien erforderlich:

1) Lysis-Puffer (0,5% Nonidet P40, 20 mM Hepes-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5, 5 mM MgCl₂, 120 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol, 10% Glycerin) (Hepes=4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin äthansulfonsäure)
2) Poly-(rI) : (rC)-Adenosintriphosphat (ATP)-Gemisch (in konzentrierter Form)
3) gereinigtes Kaninchenprotein eIF₂ (mehr als 100 µg/ml)
4) [³²P]-γ-ATP (mehr als 10 Ci/mMol und 1 mCi/ml)

Diese Reagentien können in Form einer Testpackung zur Verfügung gestellt werden. Die Bestandteile liegen in gefriergetrockneter Form vor und können entsprechend den Angaben vor der Verwendung gelöst werden. Platten zur Zellzüchtung sind von der Firma Nunc Company erhältlich. Ferner können handels übliche Vorrichtungen zur Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Röntgenfilme verwendet werden. Die Testpackungen ent halten Interferon-Eichlösungen (beispielsweise von der Maus oder vom Menschen) für Eichzwecke.

b) Oligoisoadenylatsynthetase-Test

Folgende Reagentien sind erforderlich:

1) Lysis-Puffer
2) an Sepharose gebundene Poly-(rI) : (rC)
3) [³²P]-α-ATP (mehr als 3 Ci/mMol und 1 mCi/ml)
4) bakterielle alkalische Phosphatase
5) 2′,5′-Diadenosinmonophosphat, 2′,5′-Triadenosindi phosphat
6) kleine Einweg-Säulen mit einem Gehalt von 0,3 ml Alu miniumoxid
7) Elutionspuffer für das Aluminiumoxid: 1 M Glycin, 0,75 N HCl vom pH-Wert 2

Die Reagentien können in Form einer Testpackung zur Verfügung gestellt werden. Für die Papierelektrophorese und die Dünnschicht chromatographie werden handelsübliche Einrichtungen einge setzt.

Die Reagentienmenge kann je nach Art der durchzuführenden Bestimmungen variieren.

Tabelle I

Interferon-induzierte Enzyme und antiviraler Zustand in L-Zellen

Die Ergebnisse sind in Prozent der maximalen Aktivität angegeben. Die Messung der vesikulären Stomatitisvirus (VSV)-RNA- Synthese erfolgt gemäß Weißenbach und Mitarb., European J. Biochem., 197, 98, S. 1 bis 8.

Tabelle II

Kinetik der Enzyminduktion durch Interferon

Tabelle III

Änderungen der Oligoisoadenylatsynthetase-Konzentration in menschlichen weißen Blutkörperchen unter verschiedenen pathologischen Zuständen

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Interferon durch Einwirkung von Interferon auf Zellen oder Gewebe menschlichen oder tierischen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen oder das Gewebe anschließend mit einem Extraktionsmittel extrahiert und im Extrakt die Menge eines Enzyms mißt, dessen Gehalt in den Zellen oder in dem Gewebe eine Funktion der Interferonmenge ist, der die Zelle oder das Gewebe ausgesetzt worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Extraktionsmittel ein grenzflächenaktives Mittel verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht-ionogenes grenzflächenaktives Mittel verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Proteinkinase (Pk-i), Oligoisoadenylatsynthetase oder Phosphodiesterase bestimmt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zellen eine Kultur von Leukozyten, Lymphozyten, menschlichen Fibroblasten oder Mäuse-L-Zellen verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymbestimmung durch Einbau von radioaktiven Indikatoren und Bestimmung dieser Indikatoren durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen oder das Gewebe extrahiert, nachdem man sie bzw. es 3 bis 24 Stunden der Interferonwirkung ausgesetzt hat.