DE69725147T2

DE69725147T2 - Verfahren zur behandlung und vorbeugung von neurodegenerativen erkrankungen durch verabreichung von einem thiazolidin

Info

Publication number: DE69725147T2
Application number: DE69725147T
Authority: DE
Inventors: Thomas Richard CARROLL; Dennis Richard DYER; Jane Lillian ROBICHAUD; De Rae Brenda SHIVERS
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2017-07-02
Also published as: HRP970362A2; NZ332763A; AU726664B2; ZA976142B; ATE250416T1; DK0914122T3; BR9710467A; CO4940509A1; NO990076D0; IL127487A0; EP0914122B1; US5912259A; PL331049A1; WO1998002160A1; CA2255073A1; HK1020533A1; KR20000023683A; DE69725147D1; CN1145481C; TR199900040T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]methylen]-2-imino-4-thiazolidinon oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose und Alzheimer-Krankheit.
Neurodegenerative Erkrankungen werden mit einer älter werdenden Bevölkerung stärker vorherrschend. Die häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen umfassen chronische Erkrankungen, wie Multiple Sklerose und Alzheimer-Krankheit. Verschiedene Ursachen wurden für viele dieser Erkrankungen postuliert, jedoch wurde keine direkte Ursache der Neurodegeneration als solche identifiziert. Beispielsweise ist Alzheimer-Krankheit, eine Krankheit, an der Millionen von Personen leiden, und die mit der älter werdenden Bevölkerung häufiger wird, eine klinisch, genetisch, pathologisch und biochemisch heterogene Erkrankung. Die Diagnose beruht auf dem Ausschluss anderer möglicher Ursachen von Demenz, und sie ist in den frühen Stadien der Erkrankung schwieriger. Patienten mit Alzheimer-Krankheit zeigen eine fortschreitende Abnahme der kognitiven Funktion, die mit anscheinend gutartigen Gedächtnisfehlleistungen beginnt und in einer schweren Demenz, die alle Bereiche der kognitiven Funktion umfasst, kulminiert. Bisher wurde nur ein therapeutischer Ansatz zur klinischen Behandlung von Alzheimer-Krankheit zugelassen, wobei dies Acetylcholinesteraseinhibitoren sind. Deren klinische Wirksamkeit ist jedoch in gewisser Weise beschränkt.
Die EP-A-449216 der Anmelder beschreibt die Verbindung S-((3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxy-phenyl)methylen)-2-imino-4-thiazolidinon und deren Methansulfonat als zur Behandlung einer ischämieinduzierten Zellschädigung, insbesondere einer durch einen Schlaganfall verursachten Hirnschädigung verwendbar. Es wird keine Aktivität in Verbindung mit neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben. Die EP-A 587377 lehrt, dass bestimmte Rhodaninderivate zur Behandlung von Hyperglykämie und Alzheimer-Krankheit verwendet werden können. In Journal of Medicinal Chemistry, Band 37(2) 1994, S. 322–328 wird beschrieben, dass bestimmte Oxazol-, Thiazol- und Imidazolderivate, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung umfassen, eine zweifache 5-Lipoxygenase- und Cyclooxygenasehemmwirkung mit entzündungshemmender Aktivität zeigen, wobei derartige zweifache Wirkungen auch aus Acta Neurologica Scandinavica, Band 79(3) 1989, S. 223–226 bekannt sind. Die nicht-vor-veröffentlichte WO-A-9641626 zeigt ein Verfahren zur Behandlung von mit einer Entzündung in Verbindung stehenden Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Krankheit, mit einer Kombination von einem Cyclooxygenase-2-Inhibitor und einem 5-Lipoxygenase-Inhibitor, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst.
Keines der obigen Dokumente lehrt die Verwendbarkeit der Verbindung der vorliegenden Erfindung allein zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit oder Multiple Sklerose.
Wir fanden nun heraus, dass neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit und Multiple Sklerose, mit einem Thiazolidinon, genauer gesagt einer Verbindung, die als 5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]-methylen]-2-imino-4-thiazolidinon bekannt ist, oder einem phar mazeutisch akzeptablen Salz derselben behandelt werden können. Die Verbindung hemmt die Aktivitäten von sowohl Cyclooxygenase als auch 5-Lipoxygenase, und sie ist als entzündungshemmendes Mittel verwendbar. Im Hinblick auf die obigen Dokumente erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung der Verwendung von 5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]methylen]-2-imino-4-thiazolidinon oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz desselben zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe der neurodegenerativen Erkrankungen Multiple Sklerose und Alzheimer-Krankheit.
Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet das Methansulfonatsalz. Ebenfalls bevorzugt ist das geometrische Z-Isomer. Eine weitere Ausführungsform ist die obige Verwendung zur Prophylaxe oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit. In einer weiteren Ausführungsform ist die neurodegenerative Erkrankung Multiple Sklerose.
Der Ausdruck "Thiazolidinon" bedeutet die im Vorhergehenden genannte spezielle Verbindung, deren pharmazeutisch akzeptable Salze und deren individuelle geometrische Isomere. Das Thiazolidinon zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung wird wie in der US-A-5143928 hergestellt und formuliert.
Die spezielle Dosierung hängt zwar in gewisser Weise von der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem individuellen Patienten und dem Ermessen des behandelnden Arztes ab, doch beträgt eine im Allgemeinen zur Behandlung und Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen wirksame Dosierung 0,5–500 mg Thiazolidinon pro Tag der Behandlung. Üblicherweise verwendete Dosierungsprotokolle sind 1–50 mg, die ein- bis viermal pro Tag verabreicht werden.
Ein bevorzugter Verabreichungsweg ist oral, obwohl eine parenterale und transdermale Verabreichung ebenfalls in Betracht gezogen werden. Formulierungen mit gesteuerter Freisetzung, insbesondere in Form von Hautpflastern und dergleichen sind zur Behandlung von älteren Patienten besonders gut geeignet.
Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Thiazolidinon ist aus mehreren Gründen ideal geeignet. Erstens ist es gegenüber dem Magen-Darm-Trakt und den Nieren relativ gutmütig, was eine Langzeitverabreichung durchführbar macht. Zweitens hat es eine relative lange Halbwertszeit, wodurch eine wirksame Behandlung mit relativ wenigen Dosisgaben ermöglicht wird, was für ältere Patienten von wesentlicher Bedeutung ist. Drittens durchdringt das Thiazolidinon problemlos die Blut-Hirn-Schranke, wodurch es zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, die die Hirnfunktion beeinflussen, besonders gut geeignet ist. Das Thiazolidinon wurde in einer Zahl von biologischen Systemen, die dessen Wirksamkeit zur Behandlung und Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen feststellen, bewertet. Die im Folgenden angegebenen detaillierten Beispiele erläutern einige der biologischen Tests, die zur Feststellung der Wirksamkeit des Thiazolidinons verwendet wurden. In allen im Folgenden beschriebenen Untersuchungen war die verwendete spezielle Verbindung (Z-5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]methylen]-2-imino-4-thiazolidinonmethansulfonat, das auch als CI-1004 angegeben wird.
REFERENZBEISPIEL 1
Der folgende Test belegt, dass das Thiazolidinon zur Verbesserung der Neurodegeneration bei Tieren, die durch eine intrastriatale Injektion des Neurotoxins N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) induziert wurde, wirksam ist.
Intrastriatale Injektionen von NMDA (15 nmol/0,5 μl) wurden an männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Rattenjungen (Charles River Laboratory, Portage, Michigan) am 7. Tag nach der Geburt (PND) durchgeführt. Die Tiere wurden mit Äther anästhesiert und das Calvarium wurde durch einen Mittellinienschnitt durch die Haut freigelegt. Die Rattenjungen wurden in eine Gipsform, die an einem Stereotaxisinstrument für kleine Tiere (Kopf Instruments) befestigt war, gegeben. NMDA (Sigma) wurde in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt wurde, gelöst. Die Injektionen von NMDA (15 nmol/0,5 μl) wurden mit einer 26erHarnilton-Spritze in der Mitte des rechten hinteren Corpus striatum (Koordinaten relativ zu Bregma: AP –2,0 mm, ML 2,5 mm, mit einer Tiefe von 4,0 mm ausgehend von der Dura) gesetzt. Die Spritze wurde nach den Injektionen 2 min an Ort und Stelle belassen, um ein Auslaufen zu beschränken. Die Temperatur der Tiere wurde nach dem chirurgischen Eingriff in einer thermostatgesteuerten Umgebung (HovaBator Chick Incubator; BFG Corp., Savannah, Georgia), die auf 35°C. bis 36°C eingestellt war, 1 h nach der letzten Arzneimittel- oder Vehikelinjektion konstant gehalten. Arzneimittealösungen wurden in PBS hergestellt und 15 min und 2,25 h nach der intrastriatalen Injektion von NMDA intraperitoneal injiziert (0,05 ml Volumen). Kontrolltiere erhielten gleiche Volumina von PBS.
Nach dem chirurgischen Eingriff wurden alle Tiere 5 Tage zu den Müttern zurückgegeben und am 12. PND wurde der Kopf entfernt. Die Gehirne wurden entfernt, die Hirnhemisphären wurden getrennt und die Nassgewichte jeder Hemisphäre wurden individuell bestimmt. Die Unterschiede der Hemisphärengewichte wurden für jedes Tier verglichen, wobei die folgende Formel verwendet wurde: 100 × (C-I/C) = prozentuale Schädigung, ein Wert, der die Schwere der Schädigung der Hirnhemisphäre, in die injiziert wurde, (I) relativ zu der kontralateralen (C) Hemisphäre, in die nicht injiziert wurde, angibt. Der prozentuale Schutz wird verwendet, um den relativen Schutz der neuroprotektiven Verbindung im Vergleich zur Kontrolle anzugeben, und er wurde als: 100 × [1-(%-Schädigungbenag_behandelt/%-Schädigung_Kontrolle)] berechnet. Die Daten wurden als mittlere prozentuale Schädigung ± Standardabweichung in allen Gruppen ausgedrückt. Unabhängige t-Tests wurden zu statistischen Vergleichszwecken verwendet. Frühere Experimente zeigten, dass die Hemisphärengewichte stark mit der Verringerung sowohl der Cholinacetyltransferaseaktivität als auch histologisch inspizierten regionalen Schnittflächen korrelierten (α² = 0,99, p < 0,001, lineare Regression). Die gleiche Untersuchung zeigte auch, dass intrastriatale PBS-Injektionen keine signifikante Schädigung bewirken.
ERGEBNISSE
NMDA (15 nmol/0,5 μl), das in das hintere Striatum injiziert wurde, ergab eine Verringerung von 20,6 ± 1,8 (N = 10) des Nassgewichts der ipsilateralen Hirnhemisphäre im Vergleich zu Kontrolltieren, die eine intraperitoneale Injektion von PBS erhielten. Alle Kontrolltiere überlebten bis zum 12. PND. Das Thiazolidinon verhinderte mit den Dosen von 2 × 10 und 2 × 30 mg/kg eine NMDA-induzierte Ver letzung signifikant (28,1 ± 9,2% bzw. 49 ± 8,2%; p < 0,04 und p < 0,001). Ein Tier, das eine Dosis mit Thiazolidinon (2 × 30 mg/kg) erhalten hatte, überlebte nicht bis zum 12. PDN. Der Schutz mit der Dosis von (2 × 30 mg/kg) war vergleichbar mit dem durch 2 × 30 mg/kg Indomethacin gebotenen.
Eine Überaktivierung der Neurotransmission von exzitatorischen Aminosäuren, insbesondere der durch den NMDA-Rezeptor vermittelten, ist für einen großen Teil der neuronalen Schädigung, die aufgrund von Hirnischämie, die beispielsweise anschließend an einen Schlaganfall oder ein neurales Trauma gefunden wird, entsteht, verantwortlich. Die Tatsache, dass das Thiazolidinon eine NMDA-induzierte Verletzung bessert, belegt daher, dass es zur Behandlung einer von einer Hirnischämie herrührenden neuronalen Verletzung verwendbar ist.
BEISPIEL 1
Das Thiazolidinon wurde in ein Mausmodell von experimenteller Autoimmunencephalomyelitis (EAE) bewertet. Die Verbindung wurde oral an Mäuse verabreicht, die mit einem Fragment von basischem Mausmyelinprotein zum Auslösen von EAE sensibilisiert worden waren, verabreicht. Zwei Experimente wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls und der gleichen neurologischen Bewertungen durchgeführt. Testtiere erhielten Dosisgaben während 21 Tagen, wobei 4 h vor der Sensibilisierung am Tag 1 begonnen wurde. Die Wirkungen des Thiazolidinons wurden mit einer Kontrollgruppe von Mäusen, die in identischer Weise sensibilisiert worden waren und nur Vehikel als Dosisgabe erhielten, verglichen. Die neurologischen Bewertungen wurden nach dem Ende der Arzneimittelbehandlung fortgesetzt. Die in den folgenden Tabellen 1 und 2 angegebenen Werte umfassen nur die Reaktionen während der Arzneimittelbehandlung.
Arzneimittelherstellung und Behandlungen
Das Thiazolidinon wurde manuell mit einem Aliquot von warmem Vehikel (0,5% Hydroxypropylmethylcellulose mit 0,2 Tween 80 in Wasser) in Glasmörserröhren mit Homogenisierungspistill homogenisiert. Die gleichmäßige Arzneimittelpaste wurde in einem Vehikel allmählich suspendiert. Die Mäuse erhielten in Gruppen von 10 (Experiment 1) oder 20 (Experiment 2) eine Dosisgabe von Arzneimittel und/oder Vehikel von 10 mg/kg. Die Mäuse erhielten eine Dosisgabe von Versuchstag 1 bis Versuchstag 21. Eine mit einer Blindprobe sensibilisierte Gruppe erhielt in ähnlicher Weise eine Dosisgabe von Vehikel oder Thiazolidinon von 30 mg/kg (Experiment 1).
Sensibilisierung
Weibliche Mäuse, Stamm PL/J(F1) × SJL/J von Jackson Labs wurden s. c. (0,05 cm³ × 2) an der Schwanzbasis mit einer Emulsion, die gleiche Teile von basischem Mausmyelinprotein (MBP)-Fragment (die Aminosäuren 1–9 des N-Terminus von MBP) in Kochsalzlösung und Freundsches Volladjuvans von Difco (CFA) enthielt, die mit mit Wärme abgetöteten getrockneten Mycobacteria tuberculosis (MT) verstärkt war, sensibilisiert. Jede Maus erhielt 300 μg des MPB-Fragments (230 μg freie Base) und 200 μg MT und anschließend eine retrobulbäre (iv) Injektion von 200 ng B. Pertussis-Toxin in 0,2 cm³ Kochsalzlösung. 48 h später erhielten die Mäuse eine zweite Injektion von B. Pertussis-Toxin. Die Mäuse in Experiment 1 waren 8 bis 9 Wochen alt; Die Mäuse in Experiment 2 waren 11 Wochen alt.
Neurologische Tests
Die Tiere wurden vor der Sensibilisierung und während 21 Tagen häufig gewogen und hinsichtlich der Symptome von EAE bewertet. EAE-Punktezahl: (0,5 = leicht schlaffer Schwanz, 1 = schlaffer Schwanz oder langsames Aufrichten, 1,5 = leicht schlaffer Schwanz und langsames Aufrichten, 2 = Parese/milde Paralyse oder Inkontinenz, 2,5 = milde Paralyse und langsames Aufrichten oder vollständige Paralyse (eine Hinterpfote), 3 = Hinterpfotenparalyse (beide), 3,5 = Hinterpfotenparalyse (beide) und schlaffer Torso; 4 = zusätzlich Vorderpfotenparalyse, 4,5 = nur Bewegen des Kopfes, 5 = sterbend, Tod nach den vorherigen EAE-Symptomen). Die Auswertenden waren hinsichtlich der Arzneimittelbehandlungen und früherer Verhaltenspunktezahlen blind.
Die Krankheitssymptome wurden unter den Gruppen hinsichtlich der Schwere, des Auftretens, der Zeit des Einsetzens, der kumulativen Punktezahl, der Todesfälle von EAE und der Gewichtsabnahme verglichen. Spitzenwerte der Punktezahl von EAE: Mittelwert der höchsten Punktezahl jeder Maus in einer Gruppe unabhängig von der Dauer der Symptome; EAE-Fälle: mittlere Zahl der Mäuse, die die Symptome von EAE zeigen, die als solche mit EAE-Punktezahlen an drei aufeinander folgenden Tagen von insgesamt ≥ 3,0 definiert sind; EAE-Todesfälle: Ein Tier, das gestorben ist, muss zuvor Anzeichen einer EAE-Punktezahl von größer als 0,5 aufgewiesen haben; EAE-Einsetzen: Der erste Tag einer Reihe von drei Tagen, deren Punktezahl insgesamt ≥ 3,0 ist. Eine kumulative EAE-Punktezahl wird für jedes Tier berechnet. Der Mittelwert der kumulativen Punktezahl von allen Tieren wird dann für jeden Tag bestimmt. Maximale Gewichtsabnahme: Mittelwert des niedrigsten Gewichts für jedes Tier in einer Gruppe (Anmerkung: Die kumulative EAE-Punktezahl und die maximale Gewichtsabnahme können durch Tod beeinflusst werden, wobei schwerkranke Tiere entfernt werden. Die Zahl der Tage, an denen die Punktbewertung der Tiere erfolgt, beeinflusst auch die kumulative Punktezahl und kann nur "versuchsweise" in den Vergleich einbezogen werden.) Mäuse, die aufgrund eines Dosierungstraumas sterben oder ohne vorherige Symptome von EAE werden aus der Untersuchung herausgenommen. Die Versuchsgruppen wurden als ähnlich angenommen und hinsichtlich der statistischen Signifikanz durch einen zweiseitigen t-Test verglichen (p ≤ 0,05).
ERGEBNISSE
Experiment 1
Die sensibilisierten Vehikelkontrollen zeigten starke Symptome von EAE, die durch die tägliche EAE-Punktezahl und ein Spektrum neurologischer Kriterien angegeben sind (Tabelle 1). Die Kontrollgruppe hatte 3/10 EAE-Todesfälle, während die Gruppe von mit Vehikel oder 30 mg/kg Thiazolidinon behandelten blindprobensensibilisierten Mäusen geringe Symptome einer Erkrankung und keine Todesfälle zeigten (Tabelle 1). Mit 3 oder 10 mg/kg Thiazolidinon behandelte sensibilisierte Mäuse zeigten keine signifikant verringerten EAE-Punktezahlen (gegenüber Vehikelkontrollen) (Tabelle 1) bis zum Tag 21, obwohl die 10 mg/kg-Gruppe das Naheliegen einer Hemmung der täglichen EAE-Punktezahlen, ein verringertes Auftreten, verringerte kumulative EAE-Punktezahlen und eine verringerte Gewichtsabnahme zeigte.
Mit 30 mg/kg Thiazolidinon behandelte sensibilisierte Mäuse hatten am Tag ≤ 10 drei Todesfälle. Ihre einzigen zuvor gezeigten Symptome waren Mängel beim Aufrichtreflex (Punktezahl = 1,0). Die Daten für diese Gruppe wurden auf zwei Arten berechnet: (A) Todesfälle, die mit EAE bezeichnet wurden (n = 9) und (B) Todesfälle, die als nicht-EAEbezogen bezeichnet wurden, wobei diese Mäuse aus der Untersuchung herausgenommen wurden. Beide Berechnungsverfahren zeigten eine Tendenz zu verringerten täglichen EAE-Punktezahlen von Tag 10 bis 21, obwohl eine statistisch signifikante Verringerung nur am Tag 15 beobachtet wurde (p ≤ 0,05). Bei einer Berechnung unter Verwendung des Verfahrens A gab es keine signifikante Verringerung der Gesamt-EAE-Symptome (Tabelle 1), obwohl ein Naheliegen einer Hemmung ähnlich der Gruppe von 10 mg/kg beobachtet wurde. Bei der Berechnung unter Verwendung des Verfahrens B gab es eine signifikante Verringerung hinsichtlich der Spitzen-EAE-Punktezahl und der Gewichtsabnahme (Tabelle 1).
Experiment 2
Die vorhergehende Untersuchung wurde mit drei größeren Gruppen sensibilisierter Mäuse, die mit (1) Vehikel, (2) Thiazolidinon mit 10 mg/kg oder (3) Thiazolidinon mit 30 mg/kg behandelt wurden, wiederholt. Das Einsetzen von EAE bei den sensibilisierten Vehikelkontrollen war ähnlich zu Experiment 1, obwohl die täglichen EAE-Punktezahlen von Tag 13 bis 19 leicht höher mit weniger Abschwächungen von Tag 20 – 52 und schwereren gesamtneurologiachen Kriterien waren (Tabelle 1 gegenüber Tabelle 2).
Das Thiazolidinon mit 10 oder 30 mg/kg hatte keine Wirkung auf die tägliche EAE-Punktezahl oder die Gesamt-EAE-Reaktionen (Spitzenpunktezahl, Auftreten, Einsetzen, Todesfälle, kumulative Punktezahl oder Gewichtsabnahme) (Tabelle 2). Den Todesfällen gingen in allen Gruppen Symptome von EAE voraus.
Das EAE-Modell ergibt ein Syndrom, das ähnlich dem bei Multiple Sklerose beobachteten ist. Die mit Thiazolidinon erhaltenen Daten zeigen, dass es einige der neurologischen Symptome bei EAE verringert und daher zur Behandlung von an Multiple Sklerose leidenden Patienten verwendbar ist.
TABELLE 1. Experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) bei Mäusen
TABELLE 2. Experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) bei Mäusen
BEISPIEL 2
Weitere Tests des Thiazolidinons belegten, dass es die Stickoxidsynthaseaktivität in lipopolysaccharidstimulierten Microgliazellen und in gemischten Cortexzellkulturen hemmt. Die Abnahme der Stickoxidproduktion ist das Ergebnis der Hemmung der Stickoxidsynthaseinduktion und ein weiteres Anzeichen, dass das Thiazolidinon die Schädigung von Hirngewebe einschränkt.
BV-2 Microglia wurde in 6-Vertiefungen-Gewebekulturplatten in DMEM/F12-Medium, das mit 10% Kalbsfetusserum ergänzt war, gezüchtet. Vor der Aktivierung erhielten die Zellen frisches Medium, das verschiedene Mengen Thiazolidinon enthielt. 1 h nach der Arzneimittelbehandlung wurde die Microglia mit Lipopolysaccharid (LPS, 4 μg/ml) aktiviert und in einen Inkubator mit 37°C in eine 5% CO₂ enthaltende Atmosphäre gegeben. Nach 16 h wurden die Kulturen hinsichtlich der induzierbaren Stickoxidsynthase(iNOS)aktivität und -expression bewertet. Die iNOS-Aktivität wurde unter Verwendung der Griess-Reaktion bestimmt. Zellfreies Kulturmedium wurde mit einem gleichen Volumen Griess-Reagens (ein Volumen von 1,0% Sulfanilamid in 5% Phosphorsäure gemischt mit einem Volumen von 0,1% Naphthylendiamindihydrochlorid in Wasser) gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 560 nm gemessen und die Konzentration in einer Probe wurde unter Verwendung von Natriumnitrit als Standard bestimmt. Die iNOS-Expression wurde durch Extrahieren des zellulären Proteins und Durchfüllen von Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines für iNOS spezifischen monoclonalen Antikörpers bewertet.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Thiazolidinon die Bildung von Stickoxid in aktivierter BV-2 Microglia mit einem IC₅₀-Wert von 2,4 μM hemmte. Die Prüfung des iNOS-Enzyms durch Western-Blot-Analyse zeigte, dass die beobachtete Abnahme der Aktivität mit einer Abnahme der Proteinexpression korrelierte. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Thiazolidinon die Expression von iNOS in aktivierter Microglia verhindern kann, was die Menge von durch diese Zellen freigesetztem neurotoxischem Stickoxid verringert.
Experimente unter Verwendung von gemischten Cortex-Kulturen wurden wie im Vorhergehenden beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben gewonnen und kultiviert und in 6-Vertiefungen-Platten wachsen gelassen. In diesen Experimenten verhinderte das Thiazolidinon (10 μM) ebenfalls die Zunahme der Stickoxidsynthaseaktivität, die mit der LPS-Aktivierung der Kulturen verbunden ist. Wenn nicht-LPS-aktivierte Kulturen mit dem Thiazolidinon behandelt wurden, wurde eine signifikante Abnahme der basalen NO-Produktion ebenfalls beobachtet. Es wird angenommen, dass diese Abnahme der NO-Produktion auf der Hem mung der iNOS-Expression, die mit der normalen Gliaaktivierung in diesen Kulturen verbunden ist, beruht. Dies ist ein weiterer Beleg für die Verwendbarkeit des Thiazolidinons zur Verringerung der mit einer Nervenentzündung verbundenen Neurotoxizität.
REFERENZBEISPIEL 2
Das Thiazolidinon blockiert auch die Produktion des Cytokins IL-1β sowie die Zelloberflächenexpression von ICAM-1 und E-Selectin. Die Verbindung schützt auch vor einer Sauerstoff- und Glucoseverarmung in vitro.
Hirnischämie kann in vitro durch die Verringerung von Sauerstoff und Glucose im Medium von Cortexneuronen nachgebildet werden. Für diese Untersuchung wurden Cortexneuronen aus fetalen Sprague-Dawley-Rattenhirnen am Tag E18 isoliert. Cortexhemisphären wurden seziert, dissoziiert und in 0,1% Trypsin enthaltender Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) verrieben. Die Zellkonzentration wurde auf 620.000 Zellen/ml durch die Zugabe von nach Dulbecoo modifiziertem Eagles Medium (DME) und Ham's Nutrient Mixture F-12(F12), das 1 : 1 mit wärmeinaktiviertem 10% Pferdeserum und 6 Kalbsfetusserum ergänzt war, eingestellt. Ein-100-μl-Aliquot der Zellsuspension wurde in jede einzelne Vertiefung einer polyethyleniminbeschichteten 96-Vertiefungen-Kulturplatte pipettiert. Nach 4 Tagen in einem Inkubator mit 37°C in einer Atmosphäre von 8% CO₂ wurden 100 μl Medium von jeder Vertiefung abgezogen und durch 100 μl DME/F12 mit 10% Pferdeserum, dem 30 μg/ml 5-Fluor-2-desoxyuridin und 70 μg/ml Uridin zugesetzt wurden, um eine weitere Teilung der Gliazellen zu verhindern, ersetzt. Die Kulturen wurden danach alle 2 bis 3 Tage unter Ersetzen des halben Volumens (100 μl) durch DME/F12 (10% Pferdeserum) abgelesen.
Die Zellen wurden während unterschiedlicher Zeiten in 50 μl HBSS einer hypoxischen/hypoglykämischen Umgebung (91% N₂/8% CO₂/1% O₂, 1 mM Glucose, 37°C) ausgesetzt. Die Kulturen wurden dann in den Inkubator mit normalem Sauerstoffgehalt (21% O₂/8% CO₂/25 mM Glucose) zurückgegeben und die quantitative Feststellung von Zelltod erfolgte 24 h später durch Messung des intrazellulären Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH). Die Zellen wurden vor dem Auslösen von Hypoxie/Hypoglykämiae 1 h dem Thiazolidinon oder anderen Arzneimitteln ausgesetzt. Eine Konzentration von 1 μM des Thiazolidinons hatte keine Wirkung, jedoch erhöhten 10 μM die Dauer der Hypoxie/Hypoglykämiae signifikant bevor die Zellen die Lebensfähigkeit verloren. Beispielsweise tötete ein 4-stündiges Einwirken von Hypoxie/Hypoglykämiae etwa 50% der Neuronen unter Kontrollbedingungen, dagegen ergab dieses Einwirken auf mit 10 μM des Thiazolidinons behandelten Zellen kein Absterben von Neuronen. Ähnliche Wirkungen wurden mit 100 μM Indomethacin beobachtet. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu den mit NMDA-Antagonisten in diesem Modellsystem beobachteten. Da ähnliche Bedingungen im Hirn anschließend an einen Verschluss eines Blutgefäßes oder ein Trauma auftreten, belegen diese Ergebnisse, dass das Thiazolidinon zur Behandlung neurologischer Erkrankungen, die von einer Hirnischämie herrühren, verwendbar ist.
BEISPIEL 3
Es wurde gezeigt, dass das Thiazolidinon eine Neurodegeneration in Zellen der leptomeninegalen glatten Muskulatur von Hunden im folgenden Test verringert.
Glatte Gefäßmuskulaturzellen von Hunden wurden aus frisch erhaltenen Hirnhäuten von alten Hunden isoliert. Jeder Hund hatte zuvor als Vehikelkontrolle in toxikologischen Untersuchungen gedient und wurde mit einer Überdosis eines Barbiturats auf humane Weise getötet. Alte Hunde weisen eine Angiopathie ähnlich der humanen Erkrankung auf. Glatte Gefäßmuskulaturzellen sind der Ort der Hirngefäßmyopathie, die in der Holländischen Form der Alzheimer-Krankheit auftritt. Die Gefährdung dieser Zellen führt letztendlich zu einem cerebrovaskulären Ereignis und dem Tod einiger Menschen.
Zellen von den Hirnhäuten wurden disoziiert und in 10 Kalbsfetusserum und Minimal Essential Medium nach Dulbecoo mit Antibiotika während etwa einer Woche auf Gewebekulturplatten in Kultur gehalten, bevor sie in biochemischen Untersuchungen verwendet wurden oder für morphologische Untersuchungen auf unbeschichtete Mikroskopobjektträger gegeben wurden. Diese glatten Muskulaturzellen stellen Hirnblutgefäßzellen dar, und sie können mehrere Male durchlaufen werden. Zum Auslösen von Cytotoxizät wurden die Zellen in serumfreiem Medium mit 10 bis 20 μM eines Amyloid-β-Peptids, das 42 Aminosäuren lang war, behandelt. Dieses Peptid entspricht der humanen β-Peptid-Sequenz. Das Peptid wurde unmittelbar vor der Verwendung in Wasser gelöst. Es wird angenommen, dass diese kleine Proteinmenge näherungsweise die Proteinkonzentration ist, die in postmortalen Proben in den Hirnen von Personen, die mit Alzheimer-Demenz starben, beobachtet wurde.
Es wurde gezeigt, dass die Behandlung der glatten Muskulaturzellen mit der humanen Proteinsequenz 70 bis 85% der glatten Muskulaturzellen durch Apoptose über einen Zeitraum von einer Woche abtötete, was durch Anfärben der Zellkerne mit Bisbenzimid (Hoechst 33258) gezeigt wurde.
Die toten Zellen hatten Kerne, die kondensiert und fragmentiert waren. Die Prozentangaben wurden durch Zählen der normalen und Apoptose-Kerne in drei Feldern mit fünf unabhängigen Messungen in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Eine gewisse räumliche Abhängigkeit wurde insofern festgestellt, als Zellen, die als normal beurteilt wurden, eine geringe Amyloidansammlung aufwiesen, was durch Thioflavin-S-Anfärbung und Fluoreszenzmikroskopie bestimmt wurde. Die früheste statistisch signifikante Cytotoxizität wurde nach 24 h festgestellt.
Das Thiazolidinon (20/30 μM in 5% DMSO/Wasser V/V) wurde zu dem Kulturmedium gegeben und das Medium wurde 24 h bei 37°C aufbewahrt. Es zeigte sich, dass das Thiazolidinon den durch das Amyloid induzierten Zelltod signifikant verringert. Die Behandlung der Kulturen mit lediglich Vehikel änderte die Amyloidcytotoxizität nicht. Die Schutzwirkung von CI-1004 wurde ferner durch die Tatsache, dass die Amyloidansammlung durchgängig durch die Zellen verringert war, was impliziert, dass das Thiazolidinon entweder einen zellulären Rezeptor für Amyloid verringerte oder das Entfernen eines Amyloidrezeptors bewirkte, belegt.
Die im Vorhergehenden genannten biologischen Daten belegen, dass das Thiazolidinon zur Behandlung und Prophylaxe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen verwendbar ist.
Daher ist die Verbindung zur Behandlung und Prophylaxe von Multiple Sklerose und Alzheimer-Krankheit besonders gut geeignet.
Wie im Vorhergehenden angegeben, ist das Thiazolidinon wegen der langen Wirkungsdauer und den im Wesentlichen feh lenden ungünstigen Nebenwirkungen ferner zur Behandlung von älteren Patienten gut geeignet. Die toxikologischen Eigenschaften des Thiazolidinons wurden in oralen und intravenösen (iv) Untersuchungen einer Einzeldosis bei Mäusen und Ratten und oralen Untersuchungen einer Mehrfachdosis bei Ratten und Hunden bewertet. Das Thiazolidinon wurde bei Hunden und Affen hinsichtlich der oralen Toxizität mit zunehmender Dosis getestet, um die empfindlichste Nichtnagetierart zu bestimmen. Nachdem bei der ersten Untersuchung von 13 Wochen an Hunden perivaskuläre mononukleäre Infiltrate im Hirn beobachtet wurde, wurden Mehrfachdosisuntersuchungen bei Affen durchgeführt, um zu bestimmen, ob ähnliche Effekte bei anderen Nichtnagetierarten auftraten. Die erste Untersuchung von 13 Wochen an Hunden wurde wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der perivaskulären Effekte zu bewerten. Untersuchungen zur Ermittlung des Dosierungsbereichs wurden an trächtigen Ratten und Kaninchen durchgeführt und das genotoxische Potential wurde in vitro und in vivo getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen belegen, dass das toxikologische Profil des Thiazolidinons ähnlich dem von NSAID ist, und die untersuchte Art reagierte auf eine qualitativ und quantitativ ähnliche Weise. Eine charakteristische Leberenzyminduktion des NSAID-Typs, die nicht mit einer offenkundigen Organtoxizität verbunden war, wurde bei Ratten und Hunden beobachtet. Zu nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln verwandte Magen-Darm-Effekte bei Ratten und Hunden und schwächere Niereneffekte bei Ratten wurden bei genau festgelegten Untersuchungen von 13 Wochen beobachtet. Keine typischen zu NSAID-verwandte Veränderungen wurden bei 13 Wochen behandelten Affen beobachtet. Oberflächliche ileozäkale Erosionen, die mikroskopisch festgestellt wurden, wurden bei der Untersuchung von 13 Wochen an Affen beobachtet, jedoch wurden diese Läsionen nicht dem Arzneimittel zugeordnet, da das Auftreten und die Schwere in keiner Beziehung zur Dosis oder dem systemischen Einwirken standen. Auf der Grundlage des Einwirkens mit einer Dosis ohne Wirkung in genau festgelegten Untersuchungen scheint die Ratte, gefolgt von Hund und Affe die am stärksten empfindliche Art zu sein, ungeachtet geringerer Unterschiede des Einwirkens zwischen den Arten. Keine Wirkungen wurden bei männlichen Ratten beobachtet, die 10 mg/kg erhielten, wobei die hiermit verbundenen Cmax- und AUC(0–24)-Werte 0,97 μg/ml bzw. 16,5 μg/ml betragen. Niereneffekte wurden bei weiblichen Ratten mit 10 mg/kg beobachtet, jedoch waren die Cmax- und AUC-Werte die etwa zweifachen der männlichen Ratten mit der gleichen Dosis. Diese Daten belegen, dass Thiazolidinon zur Behandlung einer breiten Vielzahl von Patienten und insbesondere älteren Patienten, die an neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, leiden, gut geeignet ist.
Das Thiazolidinon kann mit üblichen Streckmitteln zur bequemen parenteralen, transdermalen und oralen Verabreichung formuliert werden. Ein bevorzugtes Verfahren der Behandlung verwendet eine orale Verabreichung. Das folgende Beispiel 6 erläutert die Herstellung einer typischen Kapselformulierung, die zur Verabreichung an Patienten zur Behandlung oder Prophylaxe der neurodegenerativen Erkrankungen Alzheimer-Krankheit und Multiple Sklerose gut geeignet ist.
BEISPIEL 6
Die Bestandteile werden bis zur Gleichförmigkeit gemischt, getrocknet und in Gelatinekapseln zur oralen Verabreichung 1 bis 4 mal pro Tag zur effektiven Prophylaxe und Behandlung der neurodegenerativen Erkrankungen Alzheimer-Krankheit und Multiple Sklerose gefüllt.

Claims

Verwendung von 5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]methylen)-2-imino-4-thiazolidinon oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz desselben zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe von Alzheimer-Krankheit oder Multiple Sklerose.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das verwendete Salz (Z)-5-[[3,5-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxyphenyl]-methylen]-2-imino-4-thiazolidinon-methansulfonat ist.