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Die Erfindung bezieht sich auf die
Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett. Insbesondere bezieht sich
die Erfindung auf die Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett
durch die Verwendung eines Amylaseinhibitors, der aus dem Weizen
stammt. Die Anreichung von Viszeralfett kann durch die vorliegende
Erfindung gehemmt werden, wodurch eine Viszeralfett-Fettleibigkeit
verhindert wird, die eine der Krankheitsursachen beim Erwachsenen
darstellt.
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Zahlreiche Ernährungsgewohnheiten führen beim
Menschen zu einem Anstieg von Erwachsenenkrankheiten, wie die Arteriosklerose
und der Diabetes. Dies beruht auf einer Fettleibigkeit, die bei
einer unzureichenden körperlichen
Bewegung durch eine überschüssige Aufnahme
von Fetten und Kohlenhydraten hervorgerufen wird und zwar ungeachtet
der Tatsache, dass der Körper
aufgrund des Alterns einen reduzierten Energieverbrauch des Grundstoffwechsels
zeigt. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass eine Viszeralfett-Fettleibigkeit mit
einer Anreicherung von Fett in dem Viscus ein höheres Risiko für das Entstehen
einer Erwachsenenkrankheit beinhaltet im Vergleich mit einer subkutanen
Fettleibigkeit, die durch eine Anreicherung von Fett in dem subkutanen
Gewebe, gekennzeichnet ist. In dieser Situation ist es wichtig,
eine Viszeralfett-Fettleibigkeit als Prophylaxe für Krankheiten
beim Erwachsenen zu verhindern. Es ist somit erforderlich, eine
Substanz oder ein Mittel zu entwickeln, dass in geeigneter Weise
die Anreicherung von Viszeralfett hemmen kann. Dies wurde jedoch
bisher noch nicht erzielt.
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Ein Amylaseinhibitor mit Weizenherkunft,
der die Aktivität
der menschlichen pankreatischen α-Amylase
hemmt und die Verdauung von aufgenommener Stärke einschränkt, ist bekannt, wobei ein
Anstieg der Blutzuckerkonzentration gehemmt und eine Insulinsekretion
reduziert wird, so dass der Amylaseinhibitor für Menschen mit einer hohen
Blutzuckerkonzentration oder für
einen Diabetes-Kandidaten wirksam ist. Die EP-A-O 618 229 beschreibt
die Verwendung von Amylaseinhibitoren aus dem Weizen für die Hemmung
des Anstiegs der Blutzuckerkonzentration, für die Kontrolle von Insulinkonzentrationen
sowie für
die Unterdrückung
des Appetits. Es ist auch bekannt, dass der Amylaseinhibitor aus
dem Weizen bei der Gewichtskontrolle wirksam ist.
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Unter diesen Umständen wurden intensive Studien
hinsichtlich der Funktion und er chemischen Struktur von Amylaseinhibitoren
mit Weizenherkunft durchgeführt
und es wurde ein industriell effizientes Verfahren für die Herstellung
von Amylaseinhibitoren mit einer hohen Amylase-Hemmaktivität aus dem
Extrakt von Weizenmehl oder ähnlichem
gefunden. Dieses Verfahren ist in den japanischen Patenten Kokai
5–301898, 7–48268 und
7–48400
offenbart. Es wurde dann ein neues Protein gefunden, welches aus
zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist, die jeweils als SEQ ID
Nr. 1 identifiziert wurden, wobei das neue Protein, welches eine sehr
hohe Aktivität
besitzt, in dem japanischen Patent Kokai 7–41499 offenbart ist.
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Die 1 ist
ein Chromatogramm, das die Peaks der Fraktionen zeigt, die in dem
Vergleichsbeispiel 1 erzielt wurden.
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Es wurden weitere Studien auf Basis
der oben erläuterten
Studien durchgeführt
und es wurde gefunden, dass die Amylaseinhibitoren aus dem Weizen
wirksam sind für
die Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett, was zu der vorliegenden
Erfindung führt.
Dieses Ergebnis basiert auf der vollständig unerwarteten Funktion
mit einer unterschiedlichen Natur im Vergleich zu den Funktionen
der Amylaseinhibitoren aus dem Weizen, die bisher bekannt waren,
das heißt,
die Funktionen auf der Basis der Hemmung der Verdauung von Stärke, des
Anstiegs der Blutzuckerkonzentration und der Insulinsekretion sowie
der Funktion der Gewichtskontrolle.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich somit auf die Verwendung eines Amylaseinhibitors, der aus dem
Weizen stammt, für
die Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Anreicherung
von Viszeralfetten.
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Die Amylaseinhibitoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind keine spezifisch limitierten Inhibitoren, soweit sie aus dem
Weizen abstammen und eine hohe Amylase-Hemmaktivität zeigen.
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Die Amylaseinhibitoren mit Weizenherkunft
können
ein bekanntes Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht, die
jeweils identifiziert wurden als SEQ ID Nr. 1 (im folgenden bezeichnet
als „0,26
AIa") (siehe das japanische Patent Kokai 7–41499), umfassen sowie ein
neues Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht, die jeweils
identifiziert wurden als SEQ ID Nr. 2 (im folgenden bezeichnet als „0,26 Alb"),
ein bekanntes Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht, die
jeweils identifiziert wurden als SEQ ID Nr. 3 (im folgenden bezeichnet
als „0,19
AI") [siehe Biochim. Biophys. Acta, Bd. 828, Seiten 213–221 (1985),
japanisches Patent Kokai 5–301898,
japanisches Patent Kokai 7–48268],
ein bekanntes Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht, die
jeweils identifiziert wurden als SEQ ID Nr. 4 (im folgenden bezeichnet
als „0,53
AI") [siehe Biochim. Biophys. Acta, Bd. 743, Seiten 52-57 (1983)], und ein
bekanntes Protein, das identifiziert wurde als SEQ ID Nr. 5 (im
folgenden bezeichnet als „0,28
AI") [siehe Phytochemistry, Bd. 20, Nr. 8, Seiten 1781–1784 (1981)].
All diese Proteine haben eine Amylase-Hemmaktivität, wobei
die Proteine 0,26 AIa, 0,26 AIb und 0,19 AI eine höhere Amylase-Hemmaktivität besitzen,
wie dies in der folgenden Tabelle 1 dargestellt ist. Es ist somit
bevorzugt, dass die Mittel für
die Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett als aktive Komponente
wenigstens einen der Amylaseinhibitoren 0,26 AIa, 0,26 Alb und 0,19
AI umfassen, die eine höhere
Amylase-Hemmaktivität
aufweisen.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht
sich auf ein neues Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht,
die jeweils identifiziert wurden als SEQ ID Nr. 2, für die Verwendung
als ein Medikament und insbesondere zur Verwendung als Inhibitor
für die
Anreicherung von Viszeralfetten.
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Tabelle
1
| Proteintyp
mit Weizenherkunft | Amylase-Hemmakivität(U/mg) |
| 0,26
AIa (SEQ ID NR.1) | 26.100 |
| 0,26
AIb (SEQ ID NR.2) | 20.500 |
| 0,19
AI (SEQ ID NR.3) | 20.300 |
| 0,53
AI (SEQ ID NR.4) | 3.940 |
| 0,28
AI (SEQ ID NR.5) | 840 |
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Die hier für die Amylase-Hemmaktivität angegebenen
Zahlenwerte wurden durch das folgende Verfahren bestimmt, wobei
diese Werte jeweils einen Hemmaktivitätswert gegen die menschliche,
pankreatische α-Amylase
darstellen.
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Bestimmung der Hemmaktivität gegen
menschliche, pankreatische α-Amylase:
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Eine wässrige Lösung einer Probe und einer
menschlichen, pankreatischen α-Amylase
wurde zu 20 mM Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)-Puffer (pH 6,9) zugesetzt,
der 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2 und 0,02% Eiweißalbumin
enthielt. Die Mischung stand bei 37°C für 30 Minuten und wurde dann
mit 0,5 ml einer 1,5% löslichen
Stärkelösung (pH
6,9) gemischt. Die erzielte Lösung
reagierte bei 37°C
für 10
Minuten. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 2,5 ml einer Lösung (0,08
M HCl und 0,4 M Essigsäure)
beendet. Zu 0,2 ml der Reaktionslösung wurde 2,5 ml einer Iodlösung (0,05%
KI und 0,005% Iod) zugesetzt und die Mischung wurde hinsichtlich
der Extinktion bei 660 nm gemessen. Die Amylase wurde in einer Menge
verwendet, die ausreichte, um eine Reduktion der Extinktion um 80%
zu erzielen, wenn keine Probenlösung
vorhanden war, wobei die Menge des Amylaseinhibitors, die ausreichte,
um 50% der Amylaseaktivität
zu diesem Zeitpunkt zu hemmen, als eine (1) Amylase-Hemmeinheit
(U) dargestellt ist.
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Die Mittel zur Hemmung der Anreicherung
von Viszeralfett können
einen oder mehrere Amylaseinhibitoren mit Weizenherkunft umfassen.
Beispielsweise können
die Mittel als aktiven Wirkstoff einen Amylaseinhibitor umfassen
und zwar nur eines der Proteine von 0,26 AIa, 0,26 AIb und 0,19
AI, zwei von diesen Proteinen oder alle drei Proteine. Alternativ
können
die Mittel, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einen
höheren
Anteil von wenigstens einem Protein aus 0,26 AIa, 0,26 AIb und 0,19
AI und einen niedrigeren Anteil eines Proteins von 0,58 AI, 0,28
AI, etc. umfassen, die eine geringere Amylase-Hemmaktivität zeigen.
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Für
die Herstellung eines Amylaseinhibitors mit Weizenherkunft und mit
einer höheren
Produktivität
im industriellen Maßstab
ist es im Allgemeinen zweckmäßig, eine
Mischung (grob gereinigtes Produkt) von mehreren Proteinen (Amylaseinhibitoren)
herzustellen, welche die Proteine 0,26 AIa, 0,26 AIb, 0,19 AI und
in einigen Fällen
die Proteine 0,58 AI, 0,28 AI, etc. umfassen. Diese Vorgehensweise
ist geeigneter als die Reinigung der entsprechenden Proteine (Amylaseinhibitoren)
0,26 AIa, 0,26 AIb oder 0,19 AI, bis sie in einer hohen Reinheit
vorliegen. Selbst solch eine Mischung (grob gereinigtes Produkt)
kann eine ausreichende Hemmaktivität auf die Anreicherung von
Viszeralfett zeigen, falls sie eine hohe Amylase-Hemmaktivität besitzt.
Die Mittel für die
Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett können somit beide Fälle umfassen,
wo ein hochgereinigtes Protein 0,26 AIa, 0,26 AIb oder 0,19 AI als
ein Amylase-Hemmstoff für
einen aktiven Wirkstoff verwendet wird, und wo andererseits ein
grob gereinigtes Produkt in Form einer Mischung davon als ein Amylase-Hemmstoff verwendet
wird. Wenn ein Amylase-Hemmstoff verwendet wird, der die Mischung
(grob gereinigtes Produkt) von mehreren Proteinen mit einer Amylase-Hemmaktivität, wie oben
erwähnt,
umfasst, können
die Mittel zu niedrigeren Kosten hergestellt werden.
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Als Amylaseinhibitor-Mischungen (grob
gereinigte Produkte), die wirksam in den Mitteln für die Hemmung
der Anreicherung von Viszeralfett verwendet werden können und
welche die Proteine 0,26 AIa, 0,26 AIb, 0,19 AI und/oder andere
Proteine mit einer Amylase-Hemmaktivität umfassen,
können
die folgenden Mischungen beispielhaft genannt werden.
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Beispiele von Amylaseinhibitoren
(in Form einer Mischung), die verwendet werden können, um Medikamente für die Hemmung
der Anreicherung von Viszeralfett herzustellen:
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- 1. Amylaseinhibitoren, die durch ein Verfahren
hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a1) Extraktion von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit
Wasser, einer verdünnten
Säure,
einer verdünnten
Lauge oder einem wässrigen
Alkohol, um eine Lösung
zu erzielen, die einen Amylaseinhibitor enthält;
- (b1) Zugabe eines Polysaccharides zu dieser Lösung, um
einen unlöslichen
Komplex des Amylaseinhibitors mit dem Polysaccharid zu bilden, und
Trennung des unlöslichen
Komplexes von der Lösung;
- (c1) Trennung des Polysaccharides von dem Komplex, der in dem
vorherigen Schritt abgetrennt wurde, um eine Lösung zu erzielen, die den Amylaseinhibitor
enthält;
und
- (d1) Behandlung der gesammelten Lösung mit einem Kationenaustauscher,
um den Amylaseinhibitor aus den Fraktionen zu gewinnen, die nicht
an dem Kationenaustauscher adsorbiert wurden. Dieses Verfahren ist
in dem japanischen Patent Kokai 5–301898 offenbart.
- 2. Amylaseinhibitoren, die durch ein Verfahren hergestellt werden,
welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a2) Zugabe eines Polysaccharides zu einer einen Amylaseinhibitor
enthaltenden Lösung,
die aus Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer verdünnten Säure, einer
verdünnten
Lauge oder einem wässrigen
Alkohol extrahiert wurde, oder zu einem einen Amylaseinhibitor enthaltenden
Abwasser, das von Waschvorgängen
während
der Gewinnung von Stärke
und/oder Gluten aus Weizenmehl abstammt, um so einen unlöslichen
Komplex des Amylaseinhibitors mit dem Polysaccharid zu bilden, und
Trennung des unlöslichen
Komplexes von der Lösung;
- (b2) Trennung des Polysaccharides von dem unlöslichen
Komplex, um eine einen Amylaseinhibitor enthaltende Lösung zu
erzielen;
- (c2) Fällen
von 40–70%
des Proteins in der Amylaseinhibitor enthaltenden Lösung, um
das so gefällte
Protein zu sammeln, und Lösen
des gesammelten Proteins in Wasser, um eine einen Amylaseinhibitor
enthaltende Lösung
zu erzielen;
- (d2) Zugabe eines Calciumions und eines Phosphations zu der
in dem obigen Schritt erzielten Lösung, um einen unlöslichen
Komplex zu erzielen, der den Amylaseinhibitor enthält, und
Abtrennung des unlöslichen Komplexes;
- (e2) Lösen
des Amylaseinhibitors in Wasser von dem unlöslichen Komplex, der in dem
obigen Schritt abgetrennt wurde, um eine einen Amylaseinhibitor
enthaltende Lösung
zu bilden; und
- ferner den Schritt umfassend, wo unreine Proteine und andere
Verunreinigungen bei jedem Stadium bis zu der Vollendung des obigen
Schrittes (c2) entfernt werden. Dieses Verfahren ist dem japanischen
Patent Kokai 7–48268
offenbart.
- 3. Amylaseinhibitoren, die durch ein Verfahren hergestellt werden,
welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a3) Behandlung einer einen Amylaseinhibitor enthaltenden Lösung, die
aus Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer verdünnten Säure, einer
verdünnten
Lauge oder einem wässrigen
Alkohol extrahiert wurde, oder Behandlung eines einen Amylaseinhibitor
enthaltenden Abwassers, welches während der Waschvorgänge bei
der Gewinnung von Stärke
und/oder Gluten aus Weizenmehl gewonnen wird, um lösliche unreine
Proteine und andere darin enthaltende Verunreinigungen in ihre unlösliche,
feste Formen zu modifizieren, und anschließende Abtrennung und Entfernung
der festen Formen;
- (b3) Bildung eines unlöslichen
Calciumphosphatgels in der Lösung,
die in dem obigen Schritt (a3) erzielt wurde, wobei der Amylaseinhibitor
in dieser Lösung
auf diesem Calciumphosphatgel adsorbiert wird, und anschließende Abtrennung
und Gewinnung des Calciumphosphatgels, welches den Amylaseinhibitor,
der daran adsorbiert ist, enthält;
- (c3) Lösen
des Amylaseinhibitors in Wasser aus dem unlöslichen Calciumphosphatgel,
das in dem obigen Schritt (b3) erzielt wurde, um eine Lösung zu
erzielen, die den Amylaseinhibitor enthält; und
- (d3) Gewinnung des Amylaseinhibitors aus der Lösung, die
in dem obigen Schritt (c3) erzielt wurde. Dieses Verfahren ist in
dem japanischen Patent Kokai 7–48400
offenbart.
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Das oben erwähnte Protein 0,26 AIb, welches
bei den Mitteln für
die Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett verwendet werden kann,
ist ein neuer Amylaseinhibitor. Dieses 0,26 AIb kann beispielsweise
hergestellt werden, indem die Amylaseinhibitoren 1–3, wie
oben erwähnt
(Amylaseinhibitoren, die eine Mischung von mehreren Proteinen mit
einer Amylase-Hemmaktivität
umfassen; das heißt
ein grob gereinigtes Produkt), einer Hochdruck-Flüssigchromatographie
unterworfen werden, bei der mit Hochdruck eine lineare Gradientenelution
mit einem Zeit/Konzentrations-Gradienten durchgeführt wird,
wobei zum Beispiel eine 0,1% wässrige
Lösung
von Trifluoressigsäure
als Lösung
A und 80% Acetonitril und eine 0,1% wässrige Lösung von Trifluoressigsäure als
Lösung
B verwendet werden, um die entsprechenden Amylaseinhibitoren (Proteine) über die Differenzen
der Retentionszeiten zu fraktionieren und um dann die Fraktion zu
gewinnen, welche dem Protein 0,26 AIb entspricht.
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Insbesondere können die folgenden Schritte
(1)–(4),
die später
bei dem Vergleichsbeispiel 1 beschrieben werden, durchgeführt werden,
wobei das Trockenpulver(1 g), welches im Schritt (4) erzielt wird,
in 100 ml einer 0,1% wässrigen
Lösung
von Trifluoressigsäure
gelöst
und mit der Hochdruck-Flüssigchromatographie unter
den in der folgenden Tabelle 2 gezeigten Betriebsbedingungen chromatographiert
wird, wobei das 0,26 AIb abgetrennt und gewonnen werden kann.
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Tabelle
2
Arbeitsbedingungen für
die Hochdruck-Flüssigchromatographie
| Säule: | Füllmaterial:CAPCELL
PAK C18 SG 120A (Partikelgröße 3 μm) (hergestellt
von Shiseido Company, Limited) Größe: 4,6 mm ϕ × 150 mm
Temperatur: 50°C |
| Fließgeschwindigkeit: | 0,5
ml/Min. |
| Nachweis: | Extinktion
bei 280 nm |
| Mobile
Phase: | lineare
Hochdruckgradientenelution mit einem unten dargestellten Zeit/Konzentrations-Gradienten, wobei
eine Lösung
A von einer 0,1 % wässrigen Lösung von
Trifluoressigsäure,
und eine Lösung B,
bestehend aus einer 80 % wässrigen
Lösung von
Acetonitril und einer 0,1% wässrigen
Lösung von
Trifluoressigsäure,
verwendet wird. |
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Die Mittel für die Hemmung der Anreicherung
von Viszeralfett können
vorzugsweise einen Amylaseinhibitor aus dem Weizen in einer Rate
von 2.000 – 30.000
Einheiten (U) eines Amylase-Hemmaktivitätswertes pro 1 mg des Mittels
enthalten, um eine Hemmwirkung auf die Anreicherung von Viszeralfett
auszuüben.
Wenn dieser Amylaseinhibitor aus einer Mischung von mehreren Amylaseinhibitoren
mit einer Amylase-Hemmaktivität
zusammengesetzt ist, werden die obigen Einheiten als Summe von allen
Amylaseinhibitoren ausgedrückt.
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Die Mittel für die Hemmung einer Anreicherung
von Viszeralfett können
allein aus dem oben erwähnten
Amylaseinhibitor oder aus einer Kombination mit anderen Komponenten
zusammengesetzt sein, die vom Weizen abstammen, wie Proteine, Peptide
oder andere Materialien, zum Beispiel Stärke, Ballaststoffe, Vitamine,
Mineralstoffe.
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Die Mittel für die Hemmung einer Anreicherung
von Viszeralfett können
so, wie sie sind, aufgenommen werden oder können in der Form einer Flüssigzubereitung
angewandt werden, wie Lösungen,
oder als eine Festzubereitung, wie Körnchen oder Tabletten, welche
unter Verwendung von bekannten Trägerstoffen oder Adjuvantien
für pharmazeutische
Zubereitungen formuliert sind. Alternativ können die Mittel Nahrungsstoffen zugesetzt
werden, insbesondere Kohlenhydrat-Nahrungsmitteln, die reich an
Stärke
sind, wie Brote, Plätzchen,
Nudeln etc. oder Tee, Suppe, getrocknetes Fischmehl, Streichmittel,
wie Butter oder Marmelade. Falls die Mittel Nahrungsmitteln zugesetzt
werden, ist darauf zu achten, dass die Amylase-Hemmaktivität nicht
verloren geht, da die Amylaseinhibitoren mit Weizenursprung oft
ihre Amylase-Hemmaktivität
verlieren oder verringern, wenn sie auf eine erhöhte Temperatur erhitzt werden,
normalerweise über
100°C. Es
ist ferner bevorzugt, die Menge der Mittel auf 100 mg – 10 g pro
Mahlzeit zu begrenzen.
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Die Erfindung wird im folgenden durch
Beispiele weiter erläutert.
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Vergleichsbeispiel 1
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Zubereitung eines Amylaseinhibitors
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Zu 800 kg Weizenmehl werden 400 Liter
Wasser zugesetzt und die Mischung wird geknetet, um einen Teig zu
bilden. Der Teig wird mit 6000 Liter Wasser gewaschen, um 400 kg
Gluten und 500 kg Weizenstärke zu
gewinnen. In diesem Stadium werden 5780 Liter Abwasser aus den Waschungen
erzielt. Der pH der Wasch-Abwässer
(wässriger
Extrakt) wird auf 3 mit Salzsäure
eingestellt und die Abwässer
stehen dann für 30
Minuten. Dann wird der pH auf 6,5 mit wässrigem Ammoniak eingestellt,
wodurch unlösliche
Materialien gefällt
werden. Die Niederschläge
werden entfernt, wodurch 4850 Liter eines Überstandes erzielt wird.
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Zu 1000 Liter des Überstandes,
der so gewonnen wurde, wurden 300 ppm an Natriumalginat zugesetzt.
Die Mischung wurde auf pH 4,0 eingestellt und 40 Liter des so gebildeten
Gels wurden gewonnen. Zu dem so erzielten Gel wurde Calciumchlorid
(Dihydrat) zugesetzt, um eine Calciumkonzentration von 400 ppm einzustellen.
Anschließend
wurde stark gerührt
und für
1 Stunde stehen gelassen. Das Gel wurde dann mit einer De Laval-Zentrifuge zentrifugiert,
wodurch 10 Liter des Niederschlages gewonnen wurden. Zu dem Niederschlag
wurden 30 Liter Wasser zugegeben, um den Niederschlag zu waschen,
der dann wieder mit einer De Laval-Zentrifuge zentrifugiert wurde,
wobei 6,5 kg Niederschlag erzielt wurden. Zu diesem Niederschlag wurden
25 Liter Wasser zugesetzt und anschließend Calciumchlorid (Dihydrat),
um so eine Calciumkonzentration von 3000 ppm einzustellen. Die Mischung
wurde gründlich
gerührt
und 25 Liter des Überstandes
wurden mit einer De Laval-Zentrifuge
gewonnen. Andererseits wurden 5 Liter des Niederschlages, der durch
eine Zentrifuge abgetrennt wurde, wieder mit 12 Liter einer wässrigen
Lösung
von Calciumchlorid (3000 ppm) gewaschen und die Spülwasser
wurden mit einer De Laval-Zentrifuge gewonnen. Die Spülwasser
wurden mit 25 Liter des Überstandes,
der zuvor erzielt wurde, kombiniert, wodurch 39 Liter des Eluates
erzielt wurden.
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Zu 39 Liter des erzielten Eluates
wurden 29,1 g Dinatriumhydrogenphosphat zugegeben, um einen pH von
7,2 einzustellen. Die erzielte Lösung
warde auf 80°C
erhitzt und das hitzeinstabile Material wurde mit einer De Laval-Zentrifuge
entfernt und der Überstand
wurde mittels einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert („NTU–3250 CIR",
hergestellt von Nitto Denko K. K.), wodurch überschüssiges Calciumsalz entfernt
und eine konzentrierte Lösung
erzielt wurde.
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14 Liter der erzielten, konzentrierten
Lösung
wurden mit Ammoniak auf einen pH von 7,5 eingestellt. Nach Entfernung
der Verunreinigungen durch eine Filterpresse wurde die Lösung mit
3 kg eines Kationenaustauscherharzes behandelt („Diaion HPK–55", hergestellt
von Mitsubishi Kasei K. K.) und dann mit Zitronensäure auf
einen pH von 4 eingestellt. Die pH-eingestellte Lösung wurde
bei 80°C
hitzebehandelt und dann unter Verwendung eines Gefriertrockners
gefriergetrocknet, wodurch 250 g Trockenpulver erzielt wurden.
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Die Trockenpulver wurden hinsichtlich
ihrer Amylase-Hemmaktivität
gemäß dem zuvor
erwähnten
Verfahren analysiert, wobei sich eine Aktivität von etwa 8000 U/mg zeigte.
Die Trockenpulver wurden als Amylaseinhibitor verwendet (ein Mittel
für die
Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett).
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Die Trockenpulver wurden mit einer
Hochdruck-Flüssigchromatographie
unter den in der Tabelle 2 gezeigten Betriebsbedingungen fraktioniert,
um die Art der Proteine, die in den Fraktionen vorlagen, zu untersuchen.
Das in der 1 gezeigte
Diagram wurde so erzielt. Es wurde gefunden, dass die Trockenpulver
die oben erwähnten
Proteine 0,26 AIa, 0,26 AIb, 0,19 AI, 0,53 AI, 0,28 AI, etc. enthielten.
In der 1 war die Fraktion
bei dem Peak Nr. 10 das 0,19 AI Protein, die Fraktion bei Peak Nr.
12 war das 0,26 AIb Protein, die Fraktion bei dem Peak Nr. 13 war
das 0,26 AIa Protein, die Fraktion bei Peak Nr. 14 war das 0,53
AI Protein und die Fraktion bei dem Peak Nr. 17 war das 0,28 AI
Protein.
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Beispiel 1
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16 männliche Ratten des Wistar-Stammes
wurden in einem Alter von 6 Wochen in zwei Gruppen aufgeteilt, die
jeweils aus 8 Tieren bestanden und das durchschnittliche Körpergewicht
wurde bestimmt.
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Die Ratten der ersten Gruppe (Testgruppe)
wurden ad libitum über
2 Wochen mit einer Nahrung gefüttert,
die durch Zugabe des Trockenpulverproduktes (ein Mittel zur Hemmung
der Anreicherung von Viszeralfett), welches in dem Vergleichsbeispiel
1 erzielt wurde, zu der synthetischen Grundnahrung erzielt wurde, die
in der folgenden Tabelle 3 gezeigt ist, wobei eine Rate von 2,4%
auf Basis des Nahrungsgewichtes verwendet wurde.
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Andererseits wurden die Ratten der
zweiten Gruppe (Kontrollgruppe) ad libitum über 2 Wochen mit einer Nahrung
gefüttert,
die hergestellt wurde durch Zugabe eines inaktivierten Mittels zu
der Grundnahrung, wie sie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt ist,
wobei eine Rate von 2,4% auf Basis des Nahrungsgewichtes verwendet
wurde. Das inaktivierte Mittel wurde zuvor hergestellt, indem 400
g der Trockenpulver (ein Mittel zur Hemmung der Anreicherung von
Viszeralfett), die in dem Vergleichsbeispiel 1 erzielt wurden, in
2000 ml heißem
Wasser (60°C)
gelöst
wurden, der pH der Lösung
auf 9,2 eingestellt und für
10 Minuten auf 90°C
erhitzt wurde, um die Amylase-Hemmaktivität vollständig zu inaktivieren, wobei
anschließend
eine Gefriemocknung und Pulverisierung zur Erzielung der Pulver
durchgeführt
wurde.
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Tabelle
3: Formulierung einer synthetischen Grundnahrung (Gewichtsteile)
| α-Weizenstärke | 55 |
| Casein | 20 |
| Lard | 13 |
| Weizenöl | 2,0 |
| Cellulose | 5,0 |
| Mineralmischung | 3,5 |
| Vitaminmischung | 1,0 |
| DL-Methionin | 0,3 |
| Cholinbitartrat | 0,2 |
| Gesamt | 100 |
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Nach 2 Wochen wurden die Ratten der
beiden Gruppen getötet
und die Leber, das epididymale Fettgewebe und das mesenteriale Fettgewebe
wurden jeweils gewonnen. Die Gewichte davon wurden bestimmt und
ein Durchschnittsgewicht pro Tier wurde berechnet, wobei die Ergebnisse
gemäß der folgenden
Tabelle 4 erzielt wurden.
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Dann wurden die cytoplasmatischen
Fraktionen aus dem epididymalen Fettgewebe, welches wie oben gesammelt
wurde, hergestellt und die in der Fraktion enthaltenen lipogenen
Enzyme (Fettsäure-Synthetase, Malatdehydrogenase
und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase)
wurden auf ihre enzymatische Aktivität getestet und ein Durchschnittswert
für die
Messungen der 8 Ratten wurde berechnet, wobei die in der folgenden Tabelle
4 gezeigten Ergebnisse erzielt wurden.
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Test für die Aktivität der Fettsäure-Synthetase
in der cytoplasmatischen Fraktion des epididymalen Fettgewebes:
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Die Zubereitung einer Enzymlösung und
der Test für
die enzymatische Aktivität
wurden gemäß dem Verfahren
von Muto & Gibson
(Biochem Biophys. Res. Commu., Bd. 38, Seiten 9–15 (1970)) durchgeführt und die
enzymatische Aktivität
der Fettsäure-Synthetase
(FAS), Malatdehydrogenase (ME) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
(G6PDH) in dem Fettgewebe wurde jeweils getestet.
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(i) Zubereitung der Enzymlösung:
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Zu 0,5 g des epididymalen Fettgewebes
der Ratte wurden 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) zugesetzt, der
0,25 M Saccharose, 0,07 M Kaliumhydrogencarbonat und 1mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatrium
(EDTA-Na2) und 1 mM Dithiothreitol (DTT)
enthielt. Das Gewebe wurde unter Eiskühlung mit einem Teflon-Homogenisator
homogenisiert. Die homogenisierte Lösung wurde bei 8000 × g und
bei 4°C
für 20
Minuten zentrifugiert, um die mitochondriale Fraktion zu entfernen.
Der so gewonnene Überstand
wurde weiter bei 105000 × g
und bei 4°C
für 60
Minuten in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert und
der Überstand
wurde als Enzymlösung
verwendet.
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Der Test auf die FAS-Aktivität wurde
an dem gleichen Tag durchgeführt,
an dem die Enzymlösung
hergestellt wurde. Ein Teil der Fraktion des Überstandes (die Enzymlösung), die
wie oben erzielt wurde, wurde bei –70° C eingefroren und die ME- und
die G6PDH-Aktivitäten wurden
innerhalb von 2 Tagen nach dem Einfrieren gemäß den folgenden Verfahren getestet.
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(ii) Test auf FAS:
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In einer Küvette wurden 20 μl von 12
mM NADPH (Endkonzentration: 300 μM),
20 μl von
7 mM Acetyl-CoA (Endkonzentration: 176 μM), 700 μl einer Cocktaillösung (0,114
M L-Histidinhydrochlorid-Puffer; pH 6; 7,5 mM DTT und 4,57 mM EDTA-Na2 enthaltend) (Endkonzentration: Histidin
100 mM, DTT 5 mM, EDTA 4 mM) und 40 μl der Enzymlösung als enzymatische Reaktionslösung eingebracht
und die erzielte Mischung wurde dann gut gerührt. Sofort anschließend wurde
die Mischung in einem autographischen Spektrophotometer vorinkubiert
(„UV265–FS", hergestellt
von Shimadzu Corporation), welches auf 37°C für 2 Minuten eingestellt war.
20 μl von
3,2 mM Malonyl-CoA (Endkonzentration von 78 μM) wurde der Reaktion zugesetzt
und die abfallende Rate der Extinktion bei 340 nm während der
Reaktion wurde gemessen. Der Aktivitätswert von FAS wurde aus der
Menge des während
der Reaktion verbrauchten NADPH berechnet, wobei der molare Extinktionscoeffizient
von NADPH auf 6230 definiert wurde.
-
(iii) Test der ME-Aktivität:
-
In einer Küvette wurden 80 μl destilliertes
Wasser, 40 μl
von 0,1 M Magnesiumchlorid (Endkonzentration: 4 mM), 20 μl von 12
mM ß-NADP
(Endkonzentration: 0,24 mM), 800 μl
einer Cocktaillösung
(0,125 M Tris-Hydrochlorid-Puffer; pH 7,4; 0,125 mM DTT enthaltend)
(Endkonzentration: 0,1 M Tris und 0,1 mM DTT) und 40 μl der Enzymlösung, die
optional auf das 2–5fache
mit dieser Cocktaillösung
verdünnt
war, als die enzymatische Reaktionslösung eingebracht und die so
erzielte Mischung wurde gut gerührt.
Direkt anschließend wurde
die Mischung in einem autographischen Spektrophotometer vorinkubiert
(„UV265–FS", hergestellt
von Shimadzu Corporation), das auf 37° C für 2 Minuten eingestellt war.
20 μl von
0,15 M L-Natriummalat (Endkonzentration: 3 μM) wurden für die Reaktion hinzugegeben
und eine gestiegene Rate der Extinktion bei 340 nm wurde während der
Reaktion gemessen. Der Aktivitätswert
von ME wurde anhand der während
der Reaktion verbrauchten Menge von NADPH bestimmt.
-
(iv) Test auf die G6PDH-Aktivität:
-
In einer Küvette wurden 100 μl von destilliertem
Wasser, 40 μl
von 12 mM ß-NADP
(Endkonzentration: 0,48 mM), 800 μl
einer Cocktaillösung
(0,125 M Tris-Hydrochlorid-Puffer;
pH 8,0, enthaltend 17,5 mM MgCl2) (Endkonzentration:
0,1 M Tris und 0,1 mM DTT) und 20 μl der Enzymlösung, die optional auf das
2–5fache
mit der Cocktaillösung
verdünnt
war, als die enzymatische Reaktionslösung eingebracht und dann wurde
die erzielte Mischung gut gerührt.
Sofort anschließend
wurde die Mischung in einem autographischen Spektrophotometer („UV265–FS", hergestellt
von Shimadzu Corporation) vorinkubiert, welches auf 37°C für 2 Minuten
eingestellt war. 20 μl
von 20 mM Glucose-6-phosphat (Endkonzentration: 0,8 mM) wurde zugesetzt
und reagierte und dann wurde die gestiegene Rate der Extinktion
bei 340 nm während
der Reaktion gemessen. Der Aktivitätswert von G6PDH wurde anhand
der während
der Reaktion verbrauchten Menge von NADPH bestimmt.
-
(v) Beschreibung der enzymatischen
Aktivität:
-
Die Aktivität der Fettsäure-Synthetase wurde ausgedrückt als
die Menge des NADPH, welches in 1 Minute durch das Enzym pro 1 mg
Protein in einer Enzymlösung
verbraucht oder hergestellt wurde, und ist als nmol(spezifische
Aktivität)
dargestellt.
-
-
-
Die Ergebnisse in der Tabelle 4 zeigen,
dass es keinen substanziellen Unterschied zwischen der ersten Gruppe
(Testgruppe) und der zweiten Gruppe (Kontrollgruppe) hinsichtlich
dem Körpergewicht
am Ende des Tests, der Nahrungsaufnahme und dem Gewicht der Leber
gibt. Die Ergebnisse in der Tabelle 4 zeigen ferner, dass das mesenterische
Fettgewebegewicht in der ersten Gruppe (Testgruppe), die mit einer
Nahrung gefüttert
wurde, welche den vorliegenden Amylaseinhibitor enthielt, signifikant
geringer war im Vergleich zu der zweiten Gruppe (Kontrollgruppe),
die mit einer Nahrung gefüttert
wurde, die keine Amylase-Hemmaktivität besaß. Dies zeigt, dass die vorliegenden
Amylaseinhibitoren mit Weizenursprung wirksam sind für die Hemmung der
Anreicherung von Viszeralfett.
-
Die Ergebnisse in der Tabelle 4 zeigen
ferner, dass die Aktivität
der lipogenen Enzyme in dem Fettgewebe der ersten Gruppe (Testgruppe),
die mit der Nahrung gefüttert
wurde, welche den vorliegenden Amylaseinhibitor enthielt, niedriger
war als in der zweiten Gruppe(Kontrollgruppe), die mit einer Nahrung
gefüttert
wurde, die keine Amylase-Hemmaktivität aufwies. Anhand dieser Ergebnisse
wurde bestätigt,
dass die Mittel zur Hemmung der Anreicherung von Viszeralfett gemäß der vorliegenden
Erfindung, die einen Amylaseinhibitor mit Weizenursprung enthalten,
die Aktivität
der lipogenen Enzyme in dem Viscus reduzieren können, so dass die Anreicherung
von Fett in dem Viscus gehemmt wird.
-
Demgemäss können die Mittel gemäß der vorliegenden
Erfindung, welche als Wirkstoff einen Amylaseinhibitor, der aus
dem Weizen stammz, umfassen, die Anreicherung von Viszeralfett in
dem Viscus unterdrücken
und so eine Viszeralfett-Fettleibigkeit verhindern, die eine der
Ursachen für
Erkrankungen beim Erwachsenen darstellt. Die vorliegenden Mittel
können
sicher aufgrund ihres Weizenursprungs verwendet werden und können in
geeigneter Weise ohne physikalisch nachteilige Empfindlichkeiten
durch orale Verabreichung oder durch andere Routen oder in Form
von Nahrung, bei der die Mittel hinzugesetzt sind, aufgenommen werden.
-
Sequenzprotokoll
-
- (1) Allgemeine Informationen:
- (iii) Zahl der Sequenzen: 5
- (2) Information für
SEQ ID Nr. 1:
- (i) Sequenzcharakteristik:
- (A) Länge:
124 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:
- (2) Information für
SEQ ID Nr. 2:
- (i) Sequenzcharakteristik:
- (A) Länge:
122 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2:
- (2) Information für
SEQ ID Nr. 3:
- (i) Sequenzcharakteristik:
- (A) Länge:
124 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:
- (2) Information für
SEQ ID Nr. 4:
- (i) Sequenzcharakteristik:
- (A) Länge:
124 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4:
- (2) Information für
SEQ ID Nr. 5:
- (i) Sequenzcharakteristik:
- (A) Länge:
123 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:
-