DE69715481T2

DE69715481T2 - Kininogen zur Stimulierung der Knochenbildung und Verhinderung der Knochenresorption

Info

Publication number: DE69715481T2
Application number: DE69715481T
Authority: DE
Inventors: Seiichiro Aoe; Masaaki Goto; Yukihiro Takada; Junichi Yamamura
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1996-02-08
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2017-01-31
Also published as: DE69715481D1; EP0787499A1; JP3073439B2; JPH09216834A; AU1255597A; NZ314121A; EP0787499B1; US5885964A; AU723386B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Stimulierung der Knochenbildung und der Verhinderung der Knochenresorption, umfassend Kininogen und/oder Abbauprodukte von Kininogen als einen wirksamen Bestandteil.
Darüberhinaus betrifft die Erfindung ein Getränk, Nahrung, Medizin und Futter, das mit Kininogen und/oder einem Abbauprodukt des Kininogens kombiniert wird.

Hintergrund der Erfindung

Einhergehend mit der Verlängerung der menschlichen Lebenserwartung hat sich das Auftreten von Stoffwechselerkrankungen, wie zum Beispiel Osteoporose, Knochenbrüchen, Knochenschmerzen, etc. in letzter Zeit erhöht. Im Knochengewebe tritt stets Knochenbildung und Knochenresorption auf. Während das Gleichgewicht von Knochenbildung und Knochenresorption in der Jugend gehalten wird, übersteigt im Alter die Knochenresorption aus verschiedenen Gründen die Knochenbildung (Entkopplung). Und wenn die Knochenresorption über einen längeren Zeitraum anhält, wird das Knochengewebe brüchig, was stoffwechselartige Knochenerkrankungen, wie zum Beispiel Osteoporose, Knochenbrüche, Knochenschmerzen, etc. verursacht. Falls daher eine Entkopplung verhindert werden kann, ist eine Vorbeugung stoffwechselartiger Knochenerkrankungen, wie zum Beispiel Osteoporose, Knochenbruch, Knochenschmerz, etc. zu erwarten.
Als herkömmliche Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung stoffwechselbedingter Knochenerkrankungen, die auf der Verhinderung der Entkopplung beruhen, können (1) mit Calcium angereicherte Diäten, (2) leichte Übungen, (3) Sonnenbaden, (4) medizinische Therapie als Beispiele dienen. So werden für Diäten, die mit Calcium angereichert sind, Calciumsalze, wie zum Beispiel Calciumcarbonat, Calciumphosphat, etc., und natürlich vorkommende calciumhaltige Zubereitungen, wie zum Beispiel Rinderknochenpulver, Eierschalen, Fischgrätenpulver, etc. eingesetzt. Sie sind jedoch nicht notwendigerweise für die orale Aufnahme geeignet. Als leichte Übungen können Jogging oder Walking empfohlen werden. Jedoch sind sie mühselig für eine Person, die schwach wird, und ziemlich schwierig für eine unbewegliche alte Person. Man glaubt, daß Sonnenbaden zur Unterstützung der aktiven Form von Vitamin D&sub3; gut, jedoch nicht hinreichend ist. Als medizinische Therapie kann 1α- Hydroxyvitamin D&sub3; und/oder Calcitonin eingesetzt werden, und sie sind als zur Behandlung der Osteoporose wirksam bekannt. Jedoch sind sie selbst Arzneien und können nicht als Nahrungsmittelrohstoffe eingesetzt werden.
Andererseits haben die vorliegenden Erfinder gefunden, daß die Fraktion, die aus Weizenprotein erhalten wird, zur Stärkung des Knochens wirksam ist (veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 183371 (1992)). Darüberhinaus haben die vorliegenden Erfinder gefunden, daß die Fraktion, die aus der vorstehenden knochenstärkenden Fraktion durch Behandlung mit Ethanol, Erhitzen, Behandlung mit Salzen oder Behandlung mit einer Ultrafiltrationsmembran erhalten wurde, wirksam war für die Stimulation der Osteoblasten-Proliferation (veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 176715 (1993)) und zur Stärkung der Knochen (veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 320066 (1993)). Zusätzlich fanden die vorliegenden Erfinder, daß eine basische Proteinfraktion, die in sehr geringen Mengen in Milch vorhanden ist, stimulierende Wirkungen auf die Osteoblasten-Proliferation, Stärkung der Knochen und Verhinderung der Knochenresorption hat (Japanische Patentanmeldung Nr. 207509 (1995)).
Wundheilende Mittel, die Kininogen oder dessen Fragmente als wirksamen Bestandteil enthalten, sind offenbart in den Japanischen Patent Abstracts vol. 095, Nr. 006, 31. Juli 1995 und JP 07082172 A (Hoechst + Japan Ltd.) 28. März 1995.
Die Japanischen Patent Abstracts vol. 18, Nr. 086 (C-1165), 14. Februar 1994 und JP 05292921 A (Taiko Kagaku Co. Ltd.), 9. November 1991 offenbaren ein Fisch-Pastenprodukt, das ein zugesetztes Kininogen umfaßt.
Eine Stimulation der Knochenresorption in kultivierten Mäuseschädeldecken durch Met-Lys-Bradykinin, das aus Kininogen durch Spaltung mittels saurer Proteasen von neutrophilen Leukozyten freigesetzt werden kann, ist offenbart in den Chemical Abstracts vol. 108, Nr. 17, 25. April 1988, Columbus Ohio US, Abstract Nr. 144150, Ljunggreen, O. et al., page 152, col. 2; XP 002032033 und J. Periodontal Res. 1988, 23(1), 75-77.
Die vorliegenden Erfinder versuchten darüber hinaus, wirksame Bestandteile des basischen Proteins abzutrennen, zu reinigen und zu identifizieren, welche eine stimulierende Wirkung auf die Osteoblasten-Proliferation, Stärkung der Knochen und Verhinderung der Knochenresorption haben, und haben gegebenenfalls gefunden, daß es sich um das Fragment 1, 2 des Kininogens handelte, das bereits bekannt war. Die Erfinder fanden ebenfalls, daß Kininogen und Abbauprodukte des Kininogens eine die Knochenbildung stimulierende und die Knochenresorption verhindernde Wirkung besitzen, und vervollständigten die vorliegende Erfindung. Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Mittel bereitzustellen, das die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, und Kininogen und/oder Abbauprodukte des Kininogens als wirksame Bestandteile umfaßt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Getränk, Nahrung, Medizin und Futter bereitzustellen, das die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, in Kombination mit Kininogen und/oder Abbauprodukten des Kininogens.

Zusammenfassung der Erfindung

Dementsprechend besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Mittel zur Stimulierung der Knochenbildung und der Verhinderung der Knochenresorption bereitzustellen, das Kininogen und/oder Abbauprodukte des Kininogens als einen wirksamen Bestandteil umfaßt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Getränk, Nahrung, Medizin und Futter bereitzustellen, das mit Kininogen und/oder Abbauprodukten des Kininogens kombiniert ist.

Genaue Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen

Kininogen, das als wirksamer Bestandteil in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist als ein Vorläufer des Kinins bekannt, das ein biologisch aktives Peptid ist, welches die Wirkung der Gefäßerweiterung, der Herabsetzung des Blutdrucks, der Kontraktion der glatten Uterusmuskulatur usw. besitzt. Es wurde berichtet, daß Rinderkininogen aus Plasma (Komiya, M., Kato, H. und Suzuki, T., J. Biochem. (Tokyo), vol. 76, p. 811, 1974), und aus Milch (Wilson, W. E., Lazarus, L. H. und Tommer, K. B., J. Biol. Chem., vol. 264, p. 17777, 1989) abgetrennt und gereinigt wurde. Dessen Nukleinsäure-Seguenz wurde berichtet (Kitamura, N., Takagaki, Y., Furuto, S., Tanaka, T., Nawa, H. und Nakanishi, S., Nature, vol. 305, p. 545, 1983).
Dieses Kininogen kann gewonnen werden, beispielsweise durch die folgenden Schritte:
(1) Auftragen von Rinderplasma auf ein Anionenaustausch-Harz, um die Kininogen enthaltende Fraktion zu adsorbieren;
(2) dessen Elution mit einem Natriumchlorid-Gradienten;
(3) Auftragen des Eluenten auf ein Kationenaustausch-Harz, um die Kininogen enthaltende Fraktion zu adsorbieren;
(4) deren Elution mit einem Natriumchlorid-Gradienten; und
(5) deren Reinigung durch eine Gel-Filtrations- Chromatographie.
Das Fragment 1, 2 des Kininogens, welches als ein wirksamer Bestandteil in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, bestehen aus Abbauprodukten, die sich durch Verdauung des Rinderkininogens mit hohem Molekulargewicht mit Kallikrein, einer Protease, ergeben. Das Rinderkininogen mit hohem Molekulargewicht ist ein Glycoprotein, das eine einzelne Kette eines Polypeptids mit einem Molekulargewicht von etwa 80 kilo- Dalton (bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese) umfaßt, und eine Primärstruktur besitzt, die eine schwere Kette, Bradykinin, Fragment 1, 2 und eine leichte Kette von dessen aminoterminalem Ende umfaßt. Dessen schwere Kette und leichte Kette sind über eine intramolekulare Disulfid-Bindung vernetzt. Es wird mit Kallikrein verdaut, um Bradykinin und anschließend das Fragment 1, 2 freizusetzen. Bradykinin ist ein biologisch aktives Peptid, das die Wirkungen der Gefäßerweiterung, Herabsetzung des Blutdrucks, Kontraktion der glatten Uterusmuskulatur, etc. besitzt, und aus 9 Aminosäuren zusammengesetzt ist. Das Fragment 1, 2 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 14 kilo-Dalton, das aus 110 Aminosäuren zusammengesetzt ist, welche viele Histidin- und Lysin-Reste umfassen, um eine basische Region zu bilden. Die Funktion des Fragments 1, 2 war bis jetzt nicht klar.
Darüberhinaus gibt es im Rinderplasma ein Kininogen mit niedrigem Molekulargewicht, welches Bradykinin enthält, jedoch kein Fragment 1, 2.
Auch kann dieses Fragment 1, 2 des Kininogens beispielsweise dadurch gewonnen werden, daß Kininogen, das aus Rinderplasma hergestellt wurde, durch Verdauung mit Kallikrein abgebaut wird, und eine Gel-Filtrations-Chromatographie durchgeführt wird, bei der der Komplex aus schwerer und leichter Kette, das Fragment 1, 2 und Bradykinin nacheinander eluiert werden (Han, Y. N., Kato, H., Iwanaga, S., Oh-ishi, S. und Katori, M., J. Biochem. (Tokyo), vol. 83, p. 213, 1978).
Das Abbauprodukt von Kininogen, das als ein wirksamer Bestandteil in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist eine Peptidmischung mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 70.000 dalton, das durch Gel-Filtrations-Chromatographie des Kininogens gewonnen wird, welches zuvor mit einer Protease, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Kallikrein, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, V8 Protease und Thermolysin besteht, verdaut wurde.
Das Mittel der vorliegenden Erfindung, welches die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, umfaßt Kininogen, Fragment 1, 2 des Kininogens und das vorstehend definierte Abbauprodukt des Kininogens als einen wirksamen Bestandteil. Darüberhinaus kann Kininogen, Fragment 1, 2 des Kininogens oder ein anderes Abbauprodukt des Kininogens mit einem Getränk oder einer Nahrung kombiniert werden, wie zum Beispiel Milch, Milchgetränk, Kaffeegetränk, Saft, Gelee, Cracker, Brot, Nudel, Wurst, etc., und mit einer Medizin in Form einer Tablette oder eines Pulvers. Deren Wirkung der Stimulation der Knochenbildung kann darüber hinaus durch dessen Verwendung zusammen mit einer gut absorbierbaren Calciumzubereitung gesteigert werden, wie zum Beispiel Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumlaktat, Eischalen, von der Milch abgeleitetes Calcium, etc..
Das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Stimulierung der Knochenbildung und der Verhinderung der Knochenresorption kann in einer Menge von 100 ng bis 10 mg pro Tag, verteilt auf mehrere Male, für einen Erwachsenen, eingenommen werden. Durch Einnahme des Mittels der vorliegenden Erfindung zur Stimulation der Knochenbildung und der Verhinderung der Knochenresorption können stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, wie zum Beispiel Osteoporose, verhindert oder verbessert werden. Eine akute Toxizität des Kininogens, des Fragmentes 1, 2 des Kininogens sowie anderer Abbauprodukte des Kininogens wurde in Ratten nicht erkannt.
Das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Stimulierung der Knochenbildung und der Verhinderung der Knochenresorption, das Kininogen und/oder Abbauprodukte des Kininogens umfaßt, ist nützlich zur Vorbeugung oder Verbesserung stoffwechselbedingter Knochenkrankheiten, wie zum Beispiel Osteoporose etc..
Zusätzlich kann ein Getränk, Nahrung, Medizin und/oder Futter, das mit diesen wirksamen Bestandteilen kombiniert wird, die Knochenbildung stimulieren und/oder die Knochenresorption verhindern, was zu einer Vorbeugung oder Verbesserung stoffwechselbedingter Knochenkrankheiten, zum Beispiel Osteoporose, etc., führt.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, jedoch sollen diese Beispiele den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.

Beispiel 1

Entsprechend einem bekannten Verfahren (Shimada, T., Sugo, T., Kato, H. und Iwanaga, S., J. Biochem. (Tokyo), vol. 92, p 679, 1982) wurde Kininogen aus Rinderplasma hergestellt. Das heißt, 10 l Rinderplasma werden auf eine DEAE-Sephadex A-50 Säule (200 · 100 mm) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0), die 50 mM Natriumchlorid enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution des adsorbierten Proteins mit einem Natriumchlorid-Gradienten bis zu 600 mM. Kininogen wurde bei etwa 300 mM Natriumchlorid eluiert. Anschließend wurde dieses mittels Dialyse entsalzt und auf eine cm-Sephadex C-50 Säule (80 · 200 mm) aufgetragen, die mit 50 mM Acetat-Pufferlösung (pH 6,3), die 0,2 M Natriumchlorid enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution des adsorbierten Proteins mit einem Natriumchlorid-Gradienten bis zu 0,8 M. Kininogen wurde bei 0,6 M Natriumchlorid eluiert. Dieses wurde durch Dialyse entsalzt und auf eine Sephadex G-150 Säule (40 · 1000 mm) aufgetragen, die mit Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0), die 1,0 M Natriumchlorid und 3 mM EDTA enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution, um Kininogen zu erhalten, das durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert wurde, um 15,2 mg Kininogen von hohem Molekulargewicht zu ergeben.

Beispiel 2

Entsprechend einem bekannten Verfahren (Han, Y. N., Kato, H., Iwanaga, S. und Suzuki, T., J. Biochem. (Tokyo), vol. 79, p. 1201, 1976) wurde das Abbauprodukt des Kininogens durch Proteasebehandlung des Kininogens mit hohem Molekulargewicht, das in Beispiel 1 erhalten wurde, hergestellt. Das heißt, 5 mg hochmolekulares Kininogen werden in 2,5 ml 0,2 M Ammonium- Bicarbonat (pH 8,0) aufgelöst, und 5 ug Kallikrein, das aus Rinderplasma stammt, wurden hierzu zugegeben; die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC gehalten, gefolgt von Erhitzen auf 80ºC für 10 Minuten, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Dialyse entsalzt und lyophilisiert, um 4 mg Abbauprodukt des Kininogens zu ergeben.

Beispiel 3

Das Abbauprodukt (2,0 mg) des Kininogens, das in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde auf eine Sephadex G-75 Säule (40 · 1000 mm) aufgetragen, die mit 0,2 M Ammonium-Bicarbonat (pH 8,0) equilibriert wurde, und unter Verwendung eines Fraktionssammlers fraktioniert. Das Protein wurde durch die Absorption bei 280 nm gemessen. Da bekannt war, daß ein Protein von höherem Molekulargewicht entsprechend einem Standard schneller eluiert werden würde (Han, Y. N., et. al., J. Biochem. (Tokyo), vol. 79, p. 1201, 1976), wurde das zweite Signal von 3 Signalen gesammelt, mittels Dialyse entsalzt und lyophilisiert, um 0,2 mg Fragment 1, 2 des Kininogens zu ergeben.

Beispiel 4

Entsprechend einem bekannten Verfahren (Wilson, W. E., Lazarus, L. H. und Tommer, K. B., J. Biol. Chem., vol. 264, p. 17777, 1989) wurde Kininogen aus Milch hergestellt. Das heißt, 100 l Milch wurden zentrifugiert (5000 · g, 20 Minuten), um Magermilch herzustellen, zu der Salzsäure hinzugefügt wurde, um den pH auf 4,6 einzustellen. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt (5000 · g, 20 Minuten). Anschließend wurde dieser Überstand auf pH 6,4 eingestellt und auf eine DEAE- Sephadex A-50 Säule (200 · 100 mm) aufgetragen, die mit 10 mM Phosphat Pufferlösung (pH 6,4), die 10% Methanol enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution des adsorbierten Proteins mit einem Natriumchlorid-Gradienten bis zu 1000 mM. Kininogen wurde bei etwa 400 mM Natriumchlorid eluiert. Anschließend wurde dieses mittels Dialyse entsalzt und auf eine cm-Sephadex C-50 Säule (80 · 200 mm) aufgetragen, die mit 10 mM Ammoniumacetat-Lösung (pH 4,0), die 10% Acetonitril enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution des adsorbierten Proteins mit einem Guanidin-Hydrochlorid-Gradienten bis zu 0,4 M. Kininogen wurde bei etwa 0,2 M Guanidin-Hydrochlorid eluiert. Anschließend wurde dieses mittels Dialyse entsalzt und auf eine Sephadex G-150 Säule (40 · 1000 mm) aufgetragen, die mit Tris- HCl Puffer (pH 8,0) Lösung, die 1,0 M Natriumchlorid und 3 mM EDTA enthielt, equilibriert wurde, gefolgt von einer Elution des Kininogens, das mittels Dialyse entsalzt und lyophilisiert wurde, um 1,2 mg Kininogen aus Milch zu ergeben.

Beispiel 5

Entsprechend einem bekannten Verfahren (Han, Y. N., Kato, H., Iwanaga, S. und Suzuki, T., J. Biochem. (Tokyo), vol. 79, p 1201, 1976) wurde das Abbauprodukt des Kininogens durch Proteasebehandlung von Milch-abgeleitetem Kininogen hergestellt, das in Beispiel 4 gewonnen wurde. Das heißt, 0,5 mg Kininogen aus Milch wurden in 2,5 ml 0,2 M Ammonium-Bicarbonat (pH 8,0) aufgelöst, und 0,5 ug Kallikrein, das aus Schweineplasma stammt, wurden hierzu zugegeben; die Mischung wurde bei 37ºC 1 Stunde lange gehalten, gefolgt von einem Erhitzen auf 80ºC für 10 Minuten, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Dialyse entsalzt und lyophilisiert, um 0,4 mg Abbauprodukt des Kininogens zu ergeben.

Beispiel 6

Das Abbauprodukt des Kininogens (0,2 mg), das in Beispiel 5 gewonnen wurde, wurde auf eine Sephadex G-75 Säule (40 · 1000 mm) aufgetragen, die mit 0,2 M Ammonium-Bicarbonat (pH 8,0) equilibriert wurde, und unter Verwendung eines Fraktionssammlers fraktioniert. Das Protein wurde durch die Absorbanz bei 280 nm gemessen. Da bekannt war, daß ein Protein mit höherem Molekulargewicht entsprechend einer Referenz (Han, Y. N., et. al., J. Biochem. (Tokyo), vol. 79, p. 1201, 1976) eluiert werden würde, wurde das zweite Signal von 3 Signalen gesammelt, mittels Dialyse entsalzt und lyophilisiert, um 0,02 mg Fragment 1, 2 des Kininogens zu ergeben.

Testbeispiel 1

Die in den Beispielen 1 bis 6 gewonnenen Substanzen wurden in Bezug auf ihre Wirkung der Stimulierung der Osteoblasten- Proliferation untersucht. Das heißt, 2 · 104 Zellen/ml der Osteoblasten-Zell-Linie MC3T3-E1 aus Mäusen in a-modifiziertem Minimal-Essential-Medium (a-MEM), das 10% fötales Rinderserum (Flow Laboratories) enthielt, wurden in jeden Napfeiner 96- Napfplatte geimpft und bei 37ºC 24 Stunden lang in Gegenwart von 5% CO&sub2; kultiviert, die als Zellen für die Testkultur eingesetzt wurden. Anschließend wurde das Medium zu α-MEM gewechselt, welches kein fötales Rinderserum enthielt, in das die in Beispiel 1 bis 6 gewonnenen Fraktionen zugegeben wurden, um eine Endkonzentration von 10 ug/ml zu erreichen, und bei 37 ºC 18 Stunden lang kultiviert. 2 Stunden, nachdem 0,02 MBq 3H- Thymidin hierzu zugegeben wurden, wurden die Zellen anschließend auf einem Glasfilter mittels eines Zellenernters gesammelt, die in die Zellen eingelagerte Radioaktivität wurde mit einem Flüssig-Scintillationszähler gemessen zur Bestimmung der proliferativen Wirkung der Osteoblasten. Als Kontrollen wurde eine Kultur ohne irgendeine Zugabe, sowie eine weitere mit Zugabe von EGF (epidermal growth factor) eingesetzt. Die proliferative Wirkung wurde in jedem Fall dadurch berechnet (%), daß 100% als dasjenige definiert wurden, das sich in dem Fall der Kultur ohne irgendeine Zugabe ergab, und die Ergebnisse wurden in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Proliferative Wirkung der Osteoblasten

Beispiel 1 250 ± 23 (%)
Beispiel 2 234 ± 15
Beispiel 3 350 ± 34
Beispiel 4 280 ± 28
Beispiel 5 260 ± 36
Beispiel 6 369 ± 44
EGF 253 ± 33
Verglichen mit der proliferativen Wirkung der Gruppe, der nichts zugesetzt wurde, lag das Ergebnis einer jeden Gruppe, der eine in den Beispielen 1 bis 6 gewonnene Substanz zugesetzt wurde, höher, und war gleich mit derjenigen Gruppe, der EGF zugesetzt wurde. Und solch ähnliche Ergebnisse wurden im Fall der Testkultur erzielt, wobei eine andere Osteoblasten-Zel1-Linie UTMIR eingesetzt wurde.

Testbeispiel 2

Die in den Beispielen 1 bis 6 gewonnenen Substanzen wurden in Bezug auf ihre inhibierende Wirkung der Knochenresorption untersucht. Lange Knochen wurden aus 10 bis 20 Tage alten ICR- Mäusen erhalten, und die gesamten, die Osteoblasten enthaltenden Knochenmarkszellen wurden dadurch gewonnen, daß das weiche Gewebe von den Knochen entfernt wurde, und die Knochen mechanisch in α-MEM, das 8% fötales Rinderserum enthielt, in kleine Stücke zerteilt wurde. Etwa 2 · 106 dieser Zellen in a- MEM, das 5% fötales Rinderserum enthielt, wurden auf ein Stück Zahnbein gegeben. 2 Stunden danach wurde eine Testprobe in a- MEM, das 5% fötales Rinderserum enthielt, zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 ug/ml zu ergeben, die 5 Tage lang kultiviert wurde, und die knochenresorbierende Wirkung der Osteoblasten wurde untersucht.
Die Analyse der Knochenresorption wurde durchgeführt, indem die Zellen von einem Stück Zahnbein nach Kultivierung entfernt wurden, diese mit Hematoxylin-Farbstoff gefärbt wurden, und die Anzahl der Knochenresorptions-Vertiefungen durch morphometrische Analyse mit PIAS-LA-555 gezählt wurden. Als Kontrollen wurden die Kultur ohne jegliche Zugabe sowie eine weitere mit Zugabe von EGF verwendet, und die knochenresorbierende Wirkung wurde in jedem Fall dadurch berechnet, daß der Fall der Gruppe, der nichts hinzugesetzt wurde, als 100% definiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Verglichen mit der knochenresorbierenden Wirkung derjenigen Gruppe, der nichts hinzugesetzt wurde, lag die verhindernde Wirkung einer jeden Gruppe, der eine in den Beispielen 1 bis 6 gewonnene Substanz zugesetzt wurde, höher. Es wurde gefunden, daß sie eine die Knochenresorption verhindernde Wirkung besitzen.

Tabelle 2

Knochenresorbierende Wirkung

Beispiel 1 80,6 ± 5,7
Beispiel 2 77,7 ± 9, 9
Beispiel 3 50,4 ± 5, 5
Beispiel 4 77,6 ± 9,3
Beispiel 5 66,5 ± 8,5
Beispiel 6 44,4 ± 7, 7
EGF 103,0 ± 4, 5

Beispiel 7

Ein Getränk mit Wirkungen, das die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischen der in Tabelle 3 dargestellten Rohmaterialien hergestellt, in einen Behälter verpackt und durch Erhitzen sterilisiert.

Tabelle 3

Gemischtes isomerisiertes Saccharid 15,0 Gew.-%
Fruchtsaft 10,0 Gew.-%
Zitronensäure 0,5 Gew.-%
In Beispiel 1 gewonnene Substanz 0,0005 Gew.-%
Geschmack 0,1 Gew.-%
Calcium 0,5 Gew.-%
Wasser 73,9 Gew.-%

Beispiel 8

Eine Tablette mit einer Wirkung, die die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischung der in Tabelle 4 dargestellten Materialien hergestellt, und unter Druck formuliert.

Tabelle 4

Kristallines Glucose-Hydrat 93,5 Gew.-%
In Beispiel 2 gewonnene 0,005 Gew.-%
Substanz
Calcium 5,0 Gew.-%
Zucker-Ester 1,0 Gew.-%
Geschmack 0,5 Gew.-%

Beispiel 9

Ein Cracker mit Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischen der in Tabelle 5 dargestellten Rohmaterialien hergestellt, zu einem Teig verarbeitet, formuliert und gebacken.

Tabelle 5

Weizenpulver 50,0 Gew.-%
Zucker 20,0 Gew.-%
Natriumchlorid 0,5 Gew.-%
Margarine 12,5 Gew.-%
Eier 12,1 Gew.-%
Wasser 3,7 Gew.-%
Natrium-Bicarbonat 0,1 Gew.-%
Ammonium-Bicarbonat 0,2 Gew.-%
Calciumcarbonat 0,5 Gew.-%
In Beispiel 1 gewonnene Substanz 0,005 Gew.-%

Beispiel 10

Ein Gelee mit einer Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischung der in Tabelle 6 dargestellten Rohmaterialien hergestellt, in einen Behälter verpackt und durch Erhitzen sterilisiert.

Tabelle 6

Fructose 20,0 Gew.-%
Gekörnter Zucker 15,0 Gew.-%
Hirse-Gelee 5,0 Gew.-%
Agar-Agar 1,0 Gew.-%
In Beispiel 4 gewonnene Substanz 0,0005 Gew.-% Geschmack 0,11 Gew.-%
Calcium 0,1 Gew.-%
Wasser 58,39 Gew.-%

Beispiel 11

Ein verarbeiteter Käse mit einer Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischung der in Tabelle 7 dargestellten Rohmaterialien hergestellt und bei 85ºC homogenisiert.

Tabelle 7

Gouda Käse 43,0 Gew.-%
Cheddar Käse 43,5 Gew.-%
Natrium Citrat 2,0 Gew.-%
In Beispiel 4 gewonnene Substanz 0,0005 Gew.-%
Calcium aus Milch 1,0 Gew.-%
Wasser 10,5 Gew.-%

Beispiel 12

Nach Sterilisieren von entfetteter Milch, die um 12 Gew.-% reduziert war, bei 90ºC für 20 Minuten, wurden darauf Lactobacillus-Acidophilus und Streptococcus-Thermophilus angeimpft, um 2 Arten von Starterkulturen zu ergeben, die in der selben Menge vermischt wurden. Ein Joghurt mit einer Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischung der in Tabelle 8 dargestellten Rohmaterialien hergestellt, und fermentiert.

Tabelle 8

Joghurtmischung 97,0 Gew.-%
Startkultur 3,0 Gew.-%
Die in Beispiel 4 gewonnene Substanz 0,0005 Gew.-%

Beispiel 13

Eine Trockenmilch für Kleinkinder mit einer Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischen der in Tabelle 9 dargestellten Rohmaterialien hergestellt.

Tabelle 9

Entrahmte Milch 75,61 Gew.-%
Molkenprotein-Konzentrat 2,36 Gew.-%
Laktose 13,86 Gew.-%
Mineralmischung 0,32 Gew.-%
Wasserlösliche Vitaminmischung 0,32 Gew.-%
Fettenthaltende fettlösliche Vitamine 7,53 Gew.-%
In Beispiel 4 gewonnene Substanz 0,001 Gew.-%

Beispiel 14

Ein Hundefutter mit einer Wirkung, welche die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert, wurde durch Mischen der in Tabelle 10 dargestellten Rohmaterialien hergestellt.

Tabelle 10

Sojabohnen Preßkuchen 12,0 Gew.-%
Magermilchpulver 14,0 Gew.-%
Sojabohnenöl 4,0 Gew.-%
Maisöl 2,0 Gew.-%
Palmöl 28,0 Gew.-%
Maisstärke 15,0 Gew.-%
Weizenpulver 9,0 Gew.-%
Weizenkleie 2,0 Gew.-%
Vitaminmischung 9,0 Gew.-%
Mineralmischung 2,0 Gew.-%
Cellulose 3,0 Gew.-%
In Beispiel 1 gewonnene Substanz 0,001 Gew.-% Die Kombination dieser wirksamen Bestandteile mit einem Getränk, Nahrung, Medizin und Futter bringt Wirkungen zur Vorbeugung und/oder Verbesserung stoffwechselbedingter Knochenerkrankungen hervor, wie zum Beispiel Osteoporose etc., in dem es die Knochenbildung stimuliert und die Knochenresorption verhindert.

Claims

1. Verwendung von Kininogen und/oder einem Abbauprodukt des Kininogens, wobei das Abbauprodukt des Kininogens eine Peptid- Mischung mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 70.000 Dalton ist, welche durch Gel-Filtrations-Chromatographie des Kininogens gewonnen wird, welches zuvor mit einer Protease verdaut wird, welche aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Kallikrein, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, V8 Protease und Thermolysin besteht, zur Herstellung eines Mittels zur Stimulierung der Knochenbildung oder Verhinderung der Knochenresorption.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Abbauprodukt des Kininogens das Fragment 1, 2 des Kininogens ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel in Form eines Getränks oder in Form von Nahrung vorliegt.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel in Form einer Medizin vorliegt.

5. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel in Form eines Futters vorliegt.