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CN1244872A - 胰高血糖素样肽－2的类似物 - Google Patents

胰高血糖素样肽－2的类似物 Download PDF

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CN1244872A CN97195331A CN97195331A CN1244872A CN 1244872 A CN1244872 A CN 1244872A CN 97195331 A CN97195331 A CN 97195331A CN 97195331 A CN97195331 A CN 97195331A CN 1244872 A CN1244872 A CN 1244872A
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Abstract

一种胰高血糖素基因表达的产物胰高血糖素样肽－2的类似物已经鉴别为肠组织生长因子。公开了它们在治疗小肠紊乱的药学用途和治疗用途方面的制剂。

Description

胰高血糖素样肽-2的类似物
相互引用的相关申请
这项申请是于1996年4月12日申请的申请序号08/631,273的部分继续申请。
发明领域
这项发明涉及具有促进肠组织生长特性的胰高血糖素相关肽及其在治疗由于这些组织生长受损或丧失而导致的各种肠道病理状况的治疗用途。
发明背景
胰高血糖素基因的表达产生由含160个残基的原胰高血糖素产物经加工而来的多种组织决定肽产物。这些肽在原胰高血糖素前体中的组织是通过大鼠、仓鼠和牛胰脏的前原胰高血糖素cDNA的分子克隆而阐明的。这些分析表明，前原胰高血糖素不仅包含胰高血糖素和大鼠的序列，还包含另外两个胰高血糖素样肽(GLP-1和GLP-2)，有两个间隔区或称间插肽(IP-I和IP-II)将这两个胰高血糖素样肽和胰高血糖素之间以及这两个胰高血糖素样肽之间分隔开来。这些肽的两端有成对的碱性氨基酸，这是激素原切割位点的特征，这暗示它们可能在原胰高血糖素的翻译后处理中被释放出来(Drucker，pancreas，V1990，5(4)：484)。
例如，对从胰岛原胰高血糖素释放出的肽的分析表明释放出的胰肽主要是29个残基的胰高血糖素，而胰高血糖素样肽、oxyntomodulin、IP-II以及胰高血糖素样肽更常见于大肠和小肠。肠中胰高血糖素样肽的发现促使研究进入了分析这些新发现的肠肽的精细结构和纯粹功能的阶段。大多数研究集中于GLP-1上，因为有一些证据表明GLP-1可能是一种新发现的重要的调节肽。事实上GLP-1已经被确定为最有效的促进胰岛素释放的肽类刺激因子之一，胰岛素的释放为以葡萄糖依赖型方式通过与胰岛β细胞上的受体相互作用介导的作用。GLP-1及其衍生物正被发展用于对糖尿病的治疗。
胰高血糖素样肽和oxyntomodulin(即所谓的“肠胰高血糖素”)的生理作用也正在研究中，特别是关于它们在酸分泌调节及肠细胞生长中的作用。Oxyntomodulin能够以一种剂量决定型的方式抑制五肽促胃酸激素所促进的胃酸分泌。也有人研究过胰高血糖素样肽对肠的适应性改变和肠粘膜生长的调节作用，1994年8月31日Matsuno等人在EP 612,531上报道了胰高血糖类似肽的肠营养效应及在治疗中的用途。
尽管包括人、大鼠、牛、猪、豚鼠和仓鼠在内的各种生物的胰高血糖素样肽GLP-2同源物已经被分离和测序，但与GLP-1和其它胰高血糖素相关肽相比，人们对GLP-2的生理作用所知少得可怜。几个不同的研究小组使用由人工合成的GLP-2制备的GLP-2抗血清进行研究，已经确认GLP-2主要存在于肠提取物，而不是存在于胰提取物中(参见Mojsov等，J.Biol.Chem.，1986，261(25)：11880；Orskov等，Endocrinology，1986，119(4)：1467和在Diabetologia，1987，30：874和FEBS Letters，1989，247(2)：193；George等，FEBS Letters，1985，192(2)：275)。关于GLP-2的生理作用，Hoosein等人(FEBS Letters，1984，178(1)：83)报道：GLP-2既不能与胰高血糖素竞争结合大鼠的肝组织和脑组织，也不能刺激肝脏质膜中产生腺苷酸环化酶，却能在30-50pM的浓度下不可思议地刺激大鼠的下丘脑和垂体组织中的腺苷酸环化酶。很明显，阐明GLP-2的生理作用是迫切需要的。
发明摘要
现在们已经发现促进小肠组织生长的GLP-2类似物。因此本发明总的目的就是提供这样的GLP-2相似物以其治疗用途及用于相关目的。
在本发明的一个方面，所述GLP-2类似物显示肠营养活性，并符合结构式1：
R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2，其中
X1   是His或Tyr；
X2   是Ala或一个Ala取代氨基酸，该取代氨基酸赋予所述类似物对DPP-IV酶的抗性；
X3   是Pro、HPro、Asp或Glu；
X4   是Gly或Ala；
P1   是Glu-X10-Asn-Thr-Ile或Tyr-Ser-Lys-Tyr；
X10  是Met或一个氧化稳定的Met取代氨基酸；
X19  是Ala或Thr；
X20  是Arg、Lys、His或Ala；
P2   是Ile-Asn、Ile-Ala或Val-Gln；
P3   是一个共价键或是Ile、Ile-Thr或Ile-Thr-Asn；
R1   是H或一个N端封闭基团；
R2   是OH或一个C端封闭基团；
Y1   是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；
Y2   是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；并且
m和n独立地为0或1；并且其中至少X1、X2、X3、X4、P1、X10、X19、X20、P2和P3中的一个不同于野生型哺乳动物GLP-2的残基。
特别优选的依照结构式1的类似物是那些通过用一个替代氨基酸取代X2位Ala而赋予对人DPP-IV酶切的抗性的类似物。本发明的其它类似物是那些以氧化稳定的氨基酸残基取代X10位上氧化敏感的Met的类似物。这样，与X10位上是野生型Met残基的GLP-2肽相比，所述类似物肽具有更高的稳定性。另一个本发明的最佳实施方案是在X20位掺入一个选自His或Lys的碱性氨基酸。当化学合成所述GLP-2类似物时，这种置换是有利。通常出现在这个位置上的Arg强烈地结合用于肽合成方法中的溶剂。对Arg的取代允许更容易地将合成生产的GLP-2类似物配制成药学上可接受的组合物。
更具体地说，按照本发明的一个方面，提供了选自哺乳动物物种的GLP-2的类似物和其N端和/或C端修饰形式，所述类似物具有肠营养活性，并且与所述的哺乳动物GLP-2相比，至少在一个哺乳动物GLP-2的保守位置上掺入一个氨基酸置换。在一优选方面，所述GLP-2类似物掺入选自以下的置换：
1)于2位或3位掺入一个取代氨基酸，该取代氨基酸赋予所述
  类似物对二肽基肽酶-IV(以下称为DPP-IV)的抗性；和
2)于10位掺入一个氧化稳定的Met取代氨基酸；和
3)于X20位掺入非Arg的取代氨基酸。
再一方面，本发明提供了哺乳动物GLP-2、特别是人类GLP-2的肠营养性类似物，其中或者其N端和/或C端用一个封闭基团或另外氨基酸修饰，或者用一个修饰的或替代取代氨基酸所取代。在又一方面，本发明提供了哺乳动物、最好是人类GLP-2的类似物，其中在X1、X5、X7、X16-18、X25、X30或X33等位置上掺入了一个取代氨基酸，该取代氨基酸不同于在天然存在的野生型哺乳动物GLP-2中发现的氨基酸。可选地，在另一方面，本发明提供了从C端缺失3-8个残基的肠营养性类似物。
另一方面，本发明提供了一种药用组合物，该药用组合物包含具有治疗有效量、最好是肠营养量的本发明的GLP-2类似物和药学上可接受的载体。
再一方面，本发明提供了一种促进有需要患者的小肠组织生长的方法，包括将肠营养量的本发明GLP-2类似物传递给该患者。
除促进肠组织生长外，本发明的另一方面提供了一种治疗胃肠疾病的方法，该方法通过将治疗有效量的GLP-2类似物和药学上可接受的载体一起给与患有胃肠疾病的患者，来减轻胃肠疾病的病理效应和症状。
在本发明的又一方面，提供了一种用于鉴别肠营养性GLP-2类似物的方法，该方法包括以下步骤：
1)获取一种符合上文所示结构式1的GLP-2类似物；
2)用一种能引出使用大鼠GLP-2时的肠营养效应的制度，用所述类似物治疗哺乳动物；并且
3)与模拟治疗的哺乳动物相比，确定所述类似物对小肠重量的作用，藉此所述的肠营养性GLP-2类似物鉴定为引出所述重量增加的类似物。发明详述
本发明涉及GLP-2类似物的治疗用途及相关用途，特别是用于促进小肠组织生长的方面。本发明的GLP-2类似物所引出的对生长的效应表现为与模拟治疗的对照相比，小肠重量增加。具体地讲，如果在本文例举的鼠模型中进行评估时，与仅接受载体处理的对照动物相比，GLP-2类似物介导了小肠重量至少增加了10％，那么所述类似物就被认为具有“肠营养”活性。特别适用于治疗用途的是那些介导了小肠重量增加至少20％的GLP-2类似物；推荐用于治疗用途的是那些介导小肠重量增加50％或更多的GLP-2类似物。肠营养活性在空肠中最显著，包括远端空肠和近端空肠，特别是近端空肠，在回肠中也观察到。
除表现出上文所定义的肠营养活性外，本发明的GLP-2类似物还在GLP-2肽“背景”中于一个或多个位点掺入一个氨基酸取代，所述GLP-2肽“背景”或是一种哺乳动物GLP-2本身，或是一种哺乳动物GLP-2的一个变异体，在该变异体中所述N端和/或C端已通过添加一个到两个碱性残基而改变，或已修饰以掺入肽化学中常用的保护肽末端不受体内不良生化攻击和降解的封闭基团。于是，所述的肽在任何哺乳动物GLP-2的内容中掺入了一个氨基酸取代，所述哺乳动物GLP-2包括但不限于人GLP-2、牛GLP-2、大鼠GLP-2、degu GLP-2、牛GLP-2、猪GLP-2、豚鼠GLP-2和仓鼠GLP-2，它们的序列已经为许多作者所报道，包括Buhl等，J.Biol.Chem.，1988，263(18)：8621。
在本发明的一个方面，所述肠营养性GLP-2类似物符合如下的结构式1的序列：
R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2，其中
X1   是His或Tyr；
X2   是Ala或一个Ala取代氨基酸，该取代氨基酸赋予所述类似物对DPP-IV酶的抗性；
X3   是Pro、HPro、Asp或Glu；
X4   是Gly或Ala；
P1   是Glu-X10-Asn-Thr-Ile或Tyr-Ser-Lys-Tyr；
X10  是Met或一个氧化稳定的Met取代氨基酸；
X19  是Ala或Thr；
X20  是Arg、Lys、His或Ala；
P2   是Ile-Asn、Ile-Ala或Val-Gln；
P3   是一个共价键或是Ile、Ile-Thr或Ile-Thr-Asn；
R1   是H或一个N端封闭基团；
R2  是OH或一个C端封闭基团；
Y1  是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；
Y2  是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；并且
m和n独立地为0或1；并且其中至少X1、X2、X3、X4、P1、X10、X19、X20、P2和P3中的一个不同于野生型哺乳动物GLP-2的残基。
通过将从不同物种的哺乳动物物种分离的GLP-2序列进行序列对比(alignin)并将该序列与所述人序列进行比较，确定在特定位置上出现的野生型哺乳动物GLP-2残基。为方便说明，下面再给出人GLP-2的序列(SEQ ID NO：2)：
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-
 1               5                   10
Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
               15                     20
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
         25                  30
为此应用，已经出现在野生型哺乳动物GLP-2特定位置上的氨基酸残基如下：
X13位可以是Ile或Val；X16位可以是Asn或Ser；X19位可以是丙氨酸或苏氨酸；X20位可以是Arg或Lys；X27位可以是Ile或Leu；X28位可以是Gln或His。
本发明的GLP-2类似物可以在哺乳动物GLP-2的N端或C端修饰形式的“背景”中掺入所需的氨基酸取代。这样的类似物如结构式1所示，其中R1构成一个N端封闭基团，和/或当m是1时，Y1是诸如Arg或Lys的一个或两个碱性氨基酸；和/或R2是C端封闭基团；和/或当n是1时，Y2独立地为诸如Arg或Lys的一个或两个碱性氨基酸。
在本发明最佳实施方案中，所述GLP-2类似物是全长GLP-2，即GLP-2(1-33)的类似物，因此P3是序列Ile-Thr-Asn。另一方面，所述GLP-2类似物可以将C端截短，产生其中P3是Ile-Thr的GLP-2(1-32)形式、或其中P3是Ile的GLP-2(1-31)形式、或其中P3是一个共价键的GLP-2(1-30)形式。
R1和R2所代表的“封闭基团”是在肽化学技术领域中常规用于赋予生化稳定性和对抗外切肽酶消化的化学基团。合适的N端保护基团包括如乙酰基之类的C1-5烷酰基。也适于作为N端保护基团的是如脱氨-Tyr1之类的缺少氨基官能的氨基酸类似物。合适的C端保护基团包括在C端羧基碳原子上形成酮或酰胺的基团、或在该羧基氧原子上形成酯的基团。形成酮和酯的基团包括烷基，特别是分枝或不分枝的C1-5烷基，如甲基、乙基和丙基；而形成酰胺的基团包括氨基官能，如伯胺或烷氨基官能，例如甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、甲基乙氨基等等的单C1-5烷氨基和二C1-5烷氨基。氨基酸类似物同样适用于保护本发明化合物的C末端，如鲱精胺之类的脱羧氨基酸类似物。
本发明的实施方案具体包括其中m是0、R1是如乙酰基之类的N端封闭基团的这类类似物；以及其中m是0、R2是如酰胺和胺(-例如-NH2)之类的C端封闭基团的类似物。
在本发明优选方面，所述GLP-2类似物是或者人GLP-2或大鼠GLP-2的类似物。人GLP-2这里指hGLP-2(1-33)，可与其互换。大鼠GLP-2具有人GLP-2的序列，但在19位掺入的是Thr残基而不是Ala残基。因此大鼠GLP-2这里指或者rGLP-2(1-33)或是人GLP-2的Thr19类似物，即表示为[Thr19]hGLP-2(1-33)。
在本发明最佳实施方案中，就结构式1的类似物和更具体的人或大鼠GLP-2的类似物来说，GLP-2类似物都掺入选自以下的一个氨基酸取代：
1)于2位或3位掺入一个取代氨基酸，该取代氨基酸赋予所述GLP-2类似物对DPP-IV酶切的抗性；
2)于10位掺入一个氧化稳定的Met取代氨基酸；和
3)于X20位掺入非Arg的取代氨基酸。
在再一方面，本发明提供了哺乳动物GLP-2、特别是人类GLP-2的肠营养性类似物，其中或者其N端和/或其C端被一个封闭基团或额外的氨基酸所修饰，或者被一个修饰的或替代氨基酸的取代所修饰。在又一方面，提供哺乳动物、最好是人类GLP-2的肠营养性类似物，其中X1、X5、X7、X16-X18、X25、X30或X33位掺入的取代氨基酸不是在天然存在的哺乳动物GLP-2中发现的。在另一方面，本发明还可选地提供从其C端缺失3-8个残基的肠营养性类似物。
DPP-IV抗性类的GLP-2类似物具有特别优良的特性。正如本文所证明的，已经发现哺乳动物GLP-2物质对DPP-IV酶切敏感，也已经发现对DPP-IV的这种敏感性来自在所有哺乳动物形式的GLP-2中发现的识别序列Ala2-Asp3。因此本发明提供了一类GLP-2类似物，其中在X2或/和X3上掺入了一个使得GLP-2类似物对于DPP-IV介导的切割具有相对抗性的取代氨基酸，正如用能够检测GLP-2消化产物存在的任何一种方便的活体内或体外评估技术所证实的。研究表明，具有DPP-IV抗性的GLP-2类似物是这样的GLP-2类似物，在同等条件下，它们加工或降解的速率明显低于人GLP-2加工或降解的速率。
在获得的实际结果的基础上，下面在实施例3中描述了一种适于评估DPP-IV敏感性和抗性的分析。
本文优选X2类的GLP-2类似物。在这些Ala2被取代的GLP-2类似物可以于X2位掺入结构上种类繁多的Ala-取代氨基酸，以获得对DPP-IV消化的相对抗性。相似的一些Ala-取代氨基酸也允许所述肠营养活性的类似物保留。为鉴别那些还保留肠营养活性的DPP-IV抗性X2类似物，在下面实施例4中所述的肠营养活性分析中筛选表现出DPP-IV抗性的X2类似物。
在本发明的实施方案中，所述Ala2取代氨基酸包括不会成为DPP-IV底物的氨基酸立体异构体，如D-Ala、D-Hpr、βAla、叔丁基-Gly、L-青霉胺、α-氨基丁酸、氨基异丁酸、正缬氨酸、L-苯基-Gly、D-Pro和一些天然存在的氨基酸，如Glu、Lys、Ile、Ser、Asp，Phe、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Tyr、Gly和Val。本发明具体的实施方案提供了如下Ala2取代GLP-2类似物：[D-Ala2]rGLP-2(1-33)、[Gly2]rGLP-2(1-33)、[Val2]rGLP-2(1-33)、[Gly2]hGLP-2(1-33)、[tBuGly2]hGLP-2(1-33)、[Asp2]hGLP-2(1-33)、[Glu2]hGLP-2(1-33)、[Phe2]hGLP-2(1-33)、[His2]hGLP-2(1-33)、[Ile2]hGLP-2(1-33)、[Lys2]hGLP-2(1-33)、[Met2]hGLP-2(1-33)、[Asn2]hGLP-2(1-33)、[Pro2]hGLP-2(1-33)、[Gln2]hGLP-2(1-33)、[Ser2]hGLP-2(1-33)、[Thr2]hGLP-2(1-33)、[Val2]hGLP-2(1-33)、[Tyr2]hGLP-2(1-33)、[D-Ala2]hGLP-2(1-33)、[Pen2]hGLP-2(1-33)、[bAla2]hGLP-2(1-33)、[aAbu2]hGLP-2(1-33)、[Nval2]hGLP-2(1-33)、[PhGly2]hGLP-2(1-33)和[Aib2]hGLP-2(1-33)。
所述X2 GLP-2类似物可以在其它位置掺入氨基酸取代。在本发明的实施方案中，这样的GLP-2类似物包括那些在X1、X3、X4、X10、X19、X20和X24中的一个或多个位点携带氨基酸取代的类似物，因此包括那些类似物，它们根据结构式1，至少掺入一个如下取代：X1是Tyr；X3是Glu；X4是Ala；P1是Glu-X10-Asn-Thr-Ile，其中X10是非Met的氨基酸，或P1是Tyr-Ser-Lys-Tyr；X10是一个氧化稳定的Met取代氨基酸；X19是Thr；X20是Lys或Ala；P2是Val-Gln而P3是一个共价键、Ile、Ile-Thr、Ile-Thr-Asn。
在本发明的实施方案中，所述X2 GLP-2类似物包括那些还掺入了下列取代之一的类似物：X1是Ala；X3是Ala；X4是Ala；X10是一个氧化稳定的Met取代氨基酸如Val、Ile、Asn、Glx、Tyr、Phe，最好是Leu、Nle、Ala、Ser和Gly；P2是Ile-Ala。本发明具体的实施方案提供了如下GLP-2类似物：[D-Ala2Thr19]hGLP-2(1-33)、[Gly2Thr19]hGLP-2(1-33)、[Vala2Thr19]hGLP-2(1-33)、[Gly2Ala24]hGLP-2(1-33)、[Gly2Ala10]hGLP-2(1-33)、[Ala1Gly2]hGLP-2(1-33)、[Gly2Ala3]hGLP-2(1-33)和[Gly2Ala4]hGLP-2(1-33)。
在一个相关实施方案中，所述X2类似物包括那些包含如下取代的类似物：GLP-2[Gly2Ala8]hGLP-2、[Gly2Ala11]hGLP-2、[Gly2Ala21]hGLP-2、[Gly2Ala9]hGLP-2、[Gly2Ala16]hGLP-2、[Gly2Ala17]hGLP-2、[Gly2Ala28]hGLP-2、[Gly2Ala5]hGLP-2、[Gly2Ala31]hGLP-2、[Gly2Ala27]hGLP-2、[Gly2Ala12]hGLP-2、[Gly2Ala13]hGLP-2、[Gly2Ala7]hGLP-2、[Gly2Ala6]hGLP-2、[Ser2，Gln3]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Ala25]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Ala26]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Ala14]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Ala23]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Ala30]hGLP-2(1-33)、[Tyr1，Gly2]hGLP-2(1-33)、[Gly2，Arg34]hGLP-2(1-33)和[Gly2，Tyr34]hGLP-2(1-33)。
另一方面，当X2是Ala、hPr或Pro时，通过以一个Asp取代氨基酸X3取代Asp3可以赋予DPP-IV抗性，其中X3为Pro或hPr。
本发明还提供了另一类GLP-2类似物，这类GLP-2类似物的X10代表一个氧化稳定的Met取代氨基酸。已经发现，当10位上的Met被氧化时，哺乳动物GLP-2的肠营养活性降低；也发现以对氧化不敏感的取代氨基酸取代Met10取代时，保留肠营养活性。因此这样的Met10取代的GLP-2类似物在合成、加工和储藏时更稳定。在本发明的实施方案中，这种X10 GLP-2类似物是人GLP-2的类似物。在本发明一个具体的实施方案中，这样的类似物包括：[Ser10]hGLP-2(1-33)、[Nle10]hGLP-2(1-33)、[Ala10]hGLP-2(1-33)、[Leu10]rGLP-2(1-33)、[Met10]大鼠GLP-2(1-33)和[Nle10]大鼠GLP-2(1-33)。
所述X10类似物在除X10外的一个或几个位点上也可以掺入氨基酸取代。例如，正如上文所提到的，这样的类似物包括那些在X2位掺入取代的类似物和那些P1是Tyr-Ser-Lys-Tyr的类似物、以及那些结构式1所示的任何一个X取代或P取代不同于野生型残基或序列的类似物。在具体的实施方案中，所述GLP-2类似物包括[Gly2Ala10]hGLP-2(1-33)和[Tyr9Ser10Lys11Tyr12desIle13]hGLP-2(1-33)。
本发明的其它实施方案中，所述GLP-2类似物在引入的哺乳动物GLP-2肽背景上掺入单个氨基酸取代。这样的类似物包括例如下述那些哺乳动物GLP-2类似物、特别是人类GLP-2类似物的类似物：其中X1是Tyr；X3是Glu；X4是Ala；P1是Tyr-Ser-Lys-Tyr-(desIle)；P2是Ile-Ala或Val-Gln；P3是一个共价键或是Ile或Ile-Thr。
本发明其它的GLP-2类似物通过加入氨基酸、用封闭基团或是取代的氨基酸改变其N端或C端。本发明还提供了哺乳动物GLP-2、最好是人类GLP-2的肠营养性类似物，其中在其X1、X5、X7、X16-18、X25、X30或X33位点上掺入了一个取代氨基酸，该取代氨基酸不同于在天然存在的哺乳动物GLP-2中发现的氨基酸。本发明可选地提供了从C端缺失3-8个残基的肠营养性类似物。这种肠营养性类似物的具体实例包括：Ac-大鼠GLP-2(1-33)、大鼠GLP-2(1-30)、大鼠GLP-2(1-25)、大鼠GLP-2(1-33)酰胺、[Arg2，Arg1]大鼠GLP-2(2-33)、[Pro1]hGLP-2(2-33)、[Gln20]hGLP-2(1-33)、[Asp1]hGLP-2(1-33)、[Tyr34]hGLP-2(1-34)、[desNH2Tyr1]hGLP-2(1-33)、[Thr5]hGLP-2(1-33)、[Ser16，Arg17，Arg18]hGLP-2(1-33)、[Agm34]hGLP-2(1-33)、[Arg30]hGLP-2(1-33)、[Ala5，Ala7]hGLP-2(1-33)、[Glu33]hGLP-2(1-33)、[Phe25]hGLP-2(1-33)和[Tyr25]hGLP-2(1-33)。
根据本文提供的指南，本发明的GLP-2类似物可以用肽化学的标准技术来合成并可以对其肠营养活性作出评估。就合成来说，所选定的GLP-2类似物可以采用各种生产肽产品的熟知技术制备。那些仅掺入了L-氨基酸的GLP-2类似物可以采用重组DNA技术以工业量的规模进行生产。为达到这个目的，将编码所需的GLP-2类似物的DNA序列加入表达载体中并转导入一种微生物，如酵母或其它细胞宿主内，然后将该宿主置于适于表达GLP-2的条件下培养。一些基因表达系统已经被改造以用于此目的，通常以所选宿主正常使用的表达调控元件来驱动所需基因的表达。因为GLP-2的活性并不需要翻译后糖基化，所以其生产可以很方便地在细菌宿主，如大肠杆菌中实现。为进行生产，编码选定GLP-2肽的基因可以有效地置于大肠杆菌的lac、trp或PL基因的表达调控下。作为表达编码GLP-2本身的DNA的另一选择方法，可以改造宿主，使之作为融合蛋白表达GLP-2肽，在该融合蛋白中所述GLP-2与一个载体蛋白可释放地连接在一起，这个载体蛋白有利于表达产物的分离与稳定性。
在一种广泛用于生产选定GLP-2类似物的方法和一种生产掺入非遗传编码氨基酸及N端和C端衍生形式的GLP-2类似物必需使用的方法中，采用了成熟的自动肽合成技术，对这类技术的一般描述例如可参阅J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptides Synthesis，第二版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois；M.Bodanszky和A.Bodanszk，The Practice of Peptide Synthesis，1984，Springer-Verlag，纽约；Applied Biosystems 430A Users Manual，1987，ABI Inc.，Foster City，California。在这些技术中，通过采用例如Orskov等(1989，见上述)所述的Fmoc或tBoc方案，顺序加入适当保护的氨基酸，从其连接在树脂上的C端残基开始合成GLP-2类似物。
也可以用固相肽合成方法中的常用方法掺入N端和/或C端封闭基团。例如，为掺入C端封闭基团，使用已化学修饰过的支持树脂作为固相支持体进行所需肽的合成，所述树脂的修饰使得GLP-2肽从树脂上切割下来后带有所需的C端封闭基团。例如，为提供C端具有伯氨基封闭基团的肽，合成采用了对甲基二苯甲胺(MBHA)树脂，以使得当肽合成完成时，使用氢氟酸处理释放出所需的C端酰胺化的肽。相似地，使用N-甲氨乙基衍生的DVB树脂在C端加入一个N-甲胺封闭基团，所述树脂在用HF处理时释放出C端N-甲酰胺化的肽。使用常规方法也可以实现以酯化作用保护所述C端。这需要使用允许从树脂释放侧链受保护的肽的树脂/封闭基团组合物，以便此后与所需醇反应生成酯官能。FMOC保护基团与用甲氧基烷氧基苯甲醇或同等接头衍生的DVB树脂结合，可以用于这个方面，使用含TFA的二氯甲烷有效地从该支持体上进行切割。然后通过加入所需醇，可以进行例如用DCC适当活化的羧基官能的酯化，然后将酯化的GLP-2肽去保护并分离出来。
加入N端封闭基团可以在合成的GLP-2肽仍连接在所述树脂上时进行，如用合适的酸酐或腈处理。例如，要在N端加入一个乙酰基封闭基团，可以用含20％乙酸酐的乙腈处理仍连接在树脂上的肽。然后从所述树脂上将N端封闭的GLP-2的类似物切割下来，去保护并随后分离出来。
一旦合成所需的GLP-2类似物，则将其从所述树脂上切割下来并完全去保护，然后纯化所述肽，以确保回收具有选定氨基酸序列的单一的寡肽。完成纯化可以采用任何一种标准的方法，包括在烷基化硅胶柱、例如C4-、C8-或C18-硅胶柱上进行反相高压液相色谱(RP-HPLC)。通常使用含少量(如0.1％)配对剂(pairing agent)如TFA或TEA及10-90％的百分比增加的有机溶剂(如乙腈)的缓冲水溶液进行梯度洗脱，来实现这种柱的分级分离。另一方面，可以根据肽的电荷特征用离子交换HPLC分离肽物质。收集柱的分离组分，并可选地合并那些含所需纯度的肽的分离组分。在发明的一个实施方案中，然后以所述建立的方式处理所述GLP-2类似物，将用如乙酸、盐酸、磷酸、顺丁烯二酸、酒石酸、琥珀酸等等药学上可接受的酸交换所述切割酸(如TFA)，以产生一种药学上可接受的所述肽的酸加成盐。
为了给患者用药，最好以药学上可接受的形式提供所述GLP-2类似物及其盐，所述药学上可接受的形式例如为例如通过0.22μm滤器过滤除菌并且大致无热原的制剂。最好是，待配制的GLP-2类似物在HPLC上作为单峰或单独的峰迁移，在分析时显示一致而可靠的氨基酸组成和序列，此外还应符合各个国家药品质量管理机构的设定的标准。
关于治疗用途，将选定的GLP-2类似物与药学上可接受的、并适于通过选定的给药途径传送肽的载体一起配制。合适的药学上可接受的载体是那些常规用于肽基药物的载体，如稀释剂、赋形剂等等。关于药品配制的一般指南可参阅“Remington’s Pharmaceutical Science”，第十七版，Mack Publishing Company，Easton，Penn.，1985。在本发明的一个实施方案中，配制用于输注给药的所述化合物，如用作正在接受全身性胃肠外营养疗法的患者的液体营养补充物；或者配制用于注射给药的所述化合物，例如皮下、肌肉或静脉注射，因此用作无菌、无热原形式的水溶液，并且可选地缓冲至生理上可耐受的pH，如微酸性或生理的pH。因此，可以在诸如蒸馏水、更好是盐水、磷酸缓冲盐水或5％的葡萄糖溶液之类的溶媒中给与所述化合物。如果需要，通过加入如乙酸的溶解度增强剂，可以增加GLP-2类似物的水溶性。
所述水性载体或溶媒补充可以一定量的明胶，用作可注射物，明胶的作用是在注射位置或其附近作为储存所述GLP-2类似物，以缓慢释放GLP-2类似物到所需的作用位置。预计有效达到储存作用的明胶浓度在10-20％的范围之内。其它的胶凝剂，如透明质酸，也可以用作储存介质。
本发明的GLP-2类似物也可以配制成缓释植入装置，从而持续地给与GLP-2类似物。这种缓释制剂的实例包括与生物相容性聚合物复合材料，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-co-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸，胶原等等。药物输送载体中可降解聚合物的结构、选择与使用已经在一些出版物中进行了综述，包括A.Domb等，Polymers for AdvancedTechnologies 3：279-292(1992)。在药物配制中选择和使用聚合物的其它指南可以在下列文章中找到：M.Chasin和R.Langer(编辑)，“作为药物传递系统的可生物降解聚合物”，“Drugs and the PharmaceuticalSciences，”第45卷，M.Dekker，纽约，1990。脂质体也能用于制作GLP-2类似物的缓释装置。关于如何使用和制备目的药物的脂质体制剂的细节可以在其它地方找到，见美国专利第4,994,948号；美国专利第5,008,050号；美国专利第4,921,706号；美国专利第4,927,637号；美国专利第4,452,747号；美国专利第4,016,100号；美国专利第4,311,712号；美国专利第4,370,349号；美国专利第4,372,949号；美国专利第4,529,561号；美国专利第5,009,956号；美国专利第4,725,442号；美国专利第4,737,323号；美国专利第4,920,016号。当需要提供局部高浓度的GLP-2类似物时，缓释制特别有意义。
所述GLP-2类似物可以以无菌分装的管瓶或安瓿的形式使用，每一瓶含单位剂量或多剂量量的肠营养量的所述肽。所述管瓶或安瓿可以含有作为现成给药制剂的所述LP-2类似物和所需载体。或者，所述管瓶或安瓿可以含有适于在如磷酸盐缓冲溶液的合适载体中复制的GLP-2类似物，如冻干形式的GLP-2类似物。
作为可注射制剂的替代物，所述GLP-2类似物可以配制用于其它途径给药。口服剂型如片剂、胶囊等等可以根据标准制药规程进行配制。依照本发明，给与所述GLP-2类似物以治疗那些能够从小肠组织生长中获益的患者。正如本文所示结果所证明的，GLP-2类似物对于该组织的作用是显著的，并对患有标志为小肠到粘膜异常的疾病或病理状况的患者有明显益处，所述疾病或病理状况包括溃疡和炎症性紊乱；先天或获得性消化吸收疾病，包括吸收障碍综合征；以及由于小肠粘膜功能丧失而导致的疾病或病理状况，特别是出现在正在接受较长时间胃肠外喂养的患者或由于手术而切除了小肠并患有短肠综合征及盲管综合征的患者身上的疾病或病理状况。给与采用GLP-2类似物的治疗性治疗，以便缓解或消除这些患者身上与肠道粘膜功能降低相联系的疾病症状和/或改善其营养状况。例如，将GLP-2类似物给与患有炎症性肠病的患者，给与的量足以减轻所述病理状况引起的肠不适和腹泻。此外，还可以将GLP-2类似物给与那些患有吸收异常紊乱的患者，以便加强营养吸收，从而改善这类患者的营养状况。
一般说来，采用GLP-2类似物的治疗适用于有可能从小肠质量增加及相应的小肠粘膜功能增强中受益的患者。可以用GLP-2类似物治疗的具体疾病包括各种形式的口炎性腹泻，包括因对小麦α-麦醇溶蛋白的毒性反应而导致的腹腔性口炎性腹泻(celiac sprue)，其特征是小肠绒毛的大量损失；由于感染而引起的热带性口炎性腹泻，其特征是小肠绒毛的部分变平；低γ球蛋白血症性口炎性腹泻，这通常见于患有普通可变性免疫缺陷或低γ球蛋白血症的患者，其特点是小肠绒毛高度的显著减小。通过对肠组织的活检检查所述绒毛的形态，通过生化评价营养吸收、患者体重的增加，或与这些病理状况相关症状的缓解，可以监测所述GLP-2类似物治疗的疗效。其它可以用GLP-2类似物治疗，或GLP-2类似物可能在预防方面有效的病理状况包括辐射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎、节段性肠炎(Crohn氏病)、由于毒性或其它化疗药物导致的小肠损伤以及患有短肠综合征的患者。
当然，最适于患者治疗的治疗给药和制度因待治疗的疾病或病理状况而异，还要依患者的体重和其它参数而变。下文所示的结果表明，相当于10天内每天两次给与的大约100μg/kg体重(或更少)的GLP-2类似物的剂量，能使小肠质量非常显著地增加。预期小得到的剂量，如在μg/kg范围内的剂量，以及更短的或更长的疗程或治疗频率也能产生疗效，即特别是小肠质量在统计学意义上显著增加。此外，预计治疗制度还将包括给与适于逆转在终止初步治疗后发生的组织退化的维持量。最适于人类使用的剂量大小及给药制度如下文结果所示，并可由时适当设计的临床试验证实。
有效剂量和治疗方案可以通过常规的方法来决定，首先以低剂量用于实验动物身上，然后增加剂量，观察效果，还要系统地改变给药制度。当临床医生为给定受治疗者决定最适剂量时，可以考虑多种因素。这些因素中最主要的因素是血浆中正常循环的GLP-2量，健康成人在休息时该量是大约151皮摩尔/ml，进食后升至225皮摩尔/ml。Orskow，C.和Helst，J.J.，1987，Scand.J.Clin.Lav.Invest.，47：165。其它因素包括患者的尺寸、年龄、一般状况、治疗的具体疾病、疾病严重程度、正在使用的其它药物、所述GLP-2类似物的体内活性等等。在考虑动物实验的结果和参考临床文献后会决定试用剂量。本领域的一般技术人员会认识到，诸如由体外GLP-2结合竞争测定得到的结合常数和Ki之类的信息以及计算得到的GLP-2类似物在体内的半衰期也用于计算剂量。
常用的GLP-2肽人用剂量可以为约10μg/kg体重/天到约10mg/kg/天，优选约50μg/kg/天到约5mg/kg/天，最优选100μg/kg/天到1mg/kg/天。由于本发明的GLP-2类似物的效力可以比GLP-2高多至10倍甚至100倍，因此这样的GLP-2类似物的常用剂量要更低，如从约100ng/kg体重/天到1mg/kg/天，优选1μg/kg/到500μg/kg/天，甚至更优选1μg/kg/天到100μg/kg/天。
本发明的肠营养性GLP-2类似物也同样可用于促进家畜和宠物的肠生长及治疗其炎症性疾病。
实施例1-GLP-2类似物的合成
在一个300ml(ml)的容器内，使用每克置换0.5毫当量(meq)的6克(g)氯甲基(Merrifield)树脂(用于C端游离酸的肽)，以3毫摩尔(mmole)的规模人工进行固相肽合成(SPPS)。以叔丁酯基(t-Boc)保护氨基酸的氨基端。用下列基团保护三官能基氨基酸的侧链：苄基(Bz，用于丝氨酸和苏氨酸)、苄氧甲基(BOM，用于组氨酸)、2-溴-苄酯基(2-BrZ，用于酪氨酸)、2-氯-苄酯基(2-ClZ，用于赖氨酸)、环己基(cHex，用于天冬氨酸或谷氨酸)和甲苯磺酰基(Tos，用于精氨酸)。在氟化钾(KF)的存在下，通过将受保护的氨基酸酯化，将第一个氨基酸偶联到氯甲基树脂上。C端酰胺化肽的合成使用置换0.5meq/g的6克4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂以3毫摩尔的规模进行。依照肽链延伸的所述程序，将第一个氨基酸偶联到MBHA树脂上。
采用含50％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(CH2Cl2)，然后再以含10％三乙胺(Et3N)的CH2Cl2洗两次进行中和，进行氨基的去保护。使用在CH2Cl2/二甲基甲酰胺(DMF)中活化的N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCC/HOBt)进行肽延伸。每个延伸步骤后，使用含20％Ac2O的CH2Cl2将延伸中的肽链封端。每个延伸、封端及去保护步骤之后，都用异丙醇(iPrOH)和甲醇(MeOH)冲洗肽-树脂。这种冲洗重复两次。在如上述去保护和中和后，用含20％Ac2O的CH2Cl2乙酰化末端氨基，制备N端乙酰化肽。通常通过使用含二甲硫(DMS)和对甲酚作为清除剂的氢氟酸(HF)的低-高方法，将结合树脂的产物切割下来。
使用Vydac C18(15-20μm大孔径，2英寸×12英寸)的反相硅胶柱，使用用乙腈改性的水中0.1％TFA的梯度洗脱，用制备型高压液相色谱(HPLC)纯化粗肽。在220纳米处监测洗脱。使用Vydac C18(5μm，4.6×254毫米(mm))的反相硅胶色谱柱，并使用用乙腈改性的水中0.1％TFA的梯度进行洗脱，在215纳米处监测，用分析型HPLC分析每个收集到的分级部分的纯度。将纯度高于95％的部分合并，然后冷冻干燥。通过将冻干粉溶于水中，如果需要加入乙腈以促进溶解，由所述TFA盐制备所述肽的乙酸盐。使该溶液通过质子化的Bio-Rex-70阳离子交换柱。用5倍床体积的水冲洗树脂，然后用含50％乙酸的水将结合到树脂上的肽洗脱下来。用水稀释洗脱液并冷冻干燥。
使用Vydac C18(5μm，4.6×254mm)的反相硅胶色谱柱，使用两种分析型反相HPLC方法分析最终冻干粉的纯度。使用的两种溶剂系统是以三乙胺磷酸调至pH 2.25并用乙腈改性的水的梯度以及用乙腈改性的水中0.1％TFA的梯度。在215纳米处监测柱洗脱液。每种产品的身份通过氨基酸分析或电子质谱(electrocopy-mass spectroscopy)加以确认。
然后如以下实施例2所述配制GLP-2类似物。除特别指出外，每种GLP-2类似物在室温下都完全可溶于水。实施例2-GLP-2类似物的配制
GLP-2类似物可以或者在磷酸缓冲盐水中配制或配制为明胶储存制剂用于注射。关于PBS配制的GLP-2类似物制剂，首先将80克NaCl(BDH ACS 783)、2克KCl(BDH ACS 645)、11.5克Na2HPO4(Anachemia AC-8460)和2克KH2PO4(Malinckrodt AR7100)以无菌蒸馏水溶解至1升的总体积，配成10倍PBS贮液。将所述贮液以无菌蒸馏水稀释10倍，在必要时用足够体积的10N NaOH将pH调至7.3-7.4，得到最终的工作溶液。然后将工作溶液高压灭菌30分钟。在最终的工作PBS溶液中，浓度为137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mMNa2HPO4·7H2O和1.4mM KH2PO4。
将作为粉状肽的GLP-2类似物按需要加入PBS工作溶液，以产生所需肽浓度的制剂。例如，要产生含130mg/l GLP-2类似物的PBS溶液，将5.2mg GLP-2类似物溶于40ml PBS中，产生130μg/ml的GLP-2浓度。每日注射两次，每次0.5ml。
要产生明胶基GLP-2类似物制剂，首先将12克明胶(Sigma，G-8150 Lot#54HO7241来自猪皮的A型[9000-70-8]～300 Bloom)溶于100ml蒸馏水中，制备明胶溶液。将明胶溶液高压灭菌，于37℃保温，并加入先前按上文所述方法溶于磷酸缓冲盐水的GLP-2肽，以达到所需的特定肽浓度。例如，为产生浓度为130mg/l GLP-2的明胶基PBS溶液，用30ml 20％的明胶工作溶液稀释用5.2mg GLP-2制备的10mlPBS溶液。轻轻地用吸管吸取混合该溶液，产生含130mg/l GLP-2的PBS/15％明胶的最终溶液。实施例3-二肽基肽酶IV抗性测定
检测下列肽的二肽基肽酶(DPP-IV)抗性：对照肽rGLP-2；[D-Ala2]rGLP-2类似物；[Gly2]rGLP-2类似物。为进行测定，将2.5微升(μl)含0.125毫单位(mU)人胎盘DPP-IV(Calbiochem，La Jolla，CA，cat.#317624)的50％甘油、10mM Tris(pH7.8)、EDTA和0.02％NaN3的人胎盘DPP-IV溶液加入50μl含以0.2mg/ml制备的待测肽的PBS溶液(pH7.4)。混合物在37℃循环水浴中保温24小时。加入50μl含以4mg/ml制备的diprotin A的PBS溶液猝灭保温。每种肽都测定两次。
如下用反相(PR)HPLC分析每种样品：将90μl猝灭的保温混合物注射到Rainin Dynamax 300，C15(5微米，4.6×250毫米)柱上。样品用含0.1％三氟乙酸(TFA)的0.1％乙腈改性水的线性梯度进行洗脱，流速为1ml/分钟。在214纳米(nm)处检测样品成分。通过与对应于剩余未消化的母体肽的峰相比对应于切割产物的峰的相对积分来测量切割程度。对照肽的切割产物证明，通过比较所述组分于合成肽标准rGLP-2(3-33)的保留时间，收集来自HPLC的产物并进行质谱分析，证实应是rGLP-2(3-33)的对照肽rGLP-2(1-33)的切割产物是由于在Ala2和Asp3之间的切割而来。
保温24小时后，22％的对照肽rGLP-2被DPP-IV切割。24小时后，没有检测到[D-Ala2]rGLP-2和[Gly2]rGLP-2的切割产物。实施例4-GLP-2类似物的评估
接受者是从Charles River实验室(Ontario，加拿大)获得的CD1小鼠。除特别指出外，CD1小鼠在注射时都是6周大的同龄雌性小鼠(n＝3-4/组)。在每个实验开始前，都有至少24小时的时间允许所述动物适应实验室的环境。通过耳部穿孔来区分动物。实验期间并不限制小鼠的食谱或活动。光/黑暗周期为12小时，从晚上6点到早上6点。对照是同龄、同性别(n＝3-4)动物。每日两次(b.i.d.)，总共用0.5cc含2.5μg肽的PBS给小鼠皮下注射，并在实验条件下每日一次进行监测。注射后10-14天处死动物，小鼠在处死前禁食至少20小时。
将小鼠用CO2麻醉并通过心脏穿刺抽血。血液收集于75μl TED(Traysol；EDTA(5000 KIU/ml：1.2mg/ml；Diprotin-A)中，所述血液以14000×g离心5分钟，在分析之前将血浆贮藏于-70℃。将从幽门到盲肠的小肠从腹腔中取出，洗净称重并测量。为进行比较，从相同的解剖部位获得每一动物的切片。在由幽门开始的8±2cm、18±2cm、32±2cm处取长1.5-2.0厘米的片段，这三个位置在组织形态测量学上代表近端空肠、远端空肠和远端回肠。将每个小肠片段在组织块的系肠小膜对向部的边缘纵向打开，并置于10％福尔马林(体积比)中过夜，然后转移到70％ETOH中。
小肠重量变化百分比的计算方法是：将以类似物处理的小鼠相对于仅以载体处理的小鼠的平均肠重量变化除以仅以载体处理的小鼠的平均肠重量，再将此值乘以100。
肠营养活评估的结果示于表1：
                        表1
  #                   GLP-2类似物(除注明外，均为1-33)    小肠重量增加％
  1   rGLP-2   45
  2   [Thr1]rGLP-2   37
  3   [D-Ala2]rGLP-2   86
  4   [Gly2]rGLP-2   70
  5   [Val2]rGLP-2   65
  6   [Gly2]hGLP-2   59
  7   [Gly2Ala20]hGLP-2   46
  8   [Gly2Ala10]hGLP-2   33
  9   [Ala1Gly2]hGLP-2   23
  10   [Gly2Ala3]hGLP-2   18
  11   [Gly2Ala4]hGLP-2   36
  12   [Glu3]rGLP-2   33
  13   [Ala4]rGLP-2   30
  14   [Tyr9Ser10Lys11Tyr12(desIle13)]hGLP-2   41
  15   [Leu10]rGLP-2   26
  16   [Nleu10]rGLP-2   52
17 [Met SO2 10]rGLP-2 8
  18   [Lys20]rGLP-2   62
  19   [Val23Gln24]hGLP-2   36
  20   酰胺化C端   23
  21   [Gly2Ala24]hGLP-2   67
  22   [Gly2Ala8]hGLP-2   33
  23   [Gly2Ala11]hGLP-2   42
 24 [Gly2Ala21]hGLP-2  35
 25 [Gly2Ala9]hGLP-2  31
 26 [Gly2Ala16]hGLP-2  36
 27 [Gly2Ala17]hGLP-2  36
28 [Gly2Ala23]hGLP-2 31
 29 [Gly2Ala5]hGLP-2  38
 30 [Gly2Ala31]hGLP-2  28
 31 [Gly2Ala27]hGLP-2  22
 32 [Gly2Ala12]hGLP-2  18
 33 [Gly2Ala13]hGLP-2  18
 34 [Gly2Ala7]hGLP-2  22
 35 [Gly2Ala6]hGLP-2  18
由上表可以很容易地看出，哺乳动物GLP-2分子的类似物具有增强的肠营养活性。另外，明显可见根据取代模式显示不同水平的肠营养活性。例如，与天然存在的分子相比，[Gly2]rGLP-2具有大大增强的肠营养活性；与rGLP-2相比，[Gly2]hGLP-2显示了实质增强的肠营养活性，而[Leu10]rGLP-2增加的肠营养活性低于50％。
进行以下实验以证实：与用野生型GLP-2处理的动物相比，用DPP-IV抗性的GLP-2类似物处理的实验动物表现的肠重量增加，部分源于所述分子的DPP-IV抗性性质。这个实验利用了一个DPP-IV缺陷型大鼠品系Fisher 334 DPP-IV-大鼠的可用性。比较注射rGLP-2对Fisher DPP-IV缺陷型大鼠和普通Sprague-Dawley大鼠的小肠重量的作用。
在下面的实验中，Sprague-Dawley大鼠每日两次注射含rGLP-2的凝胶制剂。Fisher大鼠每日两次皮下注射含GLP-2肽(rGLP-2及其类似物)的PBS溶液。
与只给与载体的对照动物相比，每日两次注射2.5μg或是每日两次注射25μg rGLP-2的普通Sprague-Dawley大鼠在小肠重量上未见任何变化。然而，与仅用载体处理的动物相比，每日两次用20μg rGLP-2处理时，Fisher 334 DPP-IV-大鼠(DPP-IV缺陷型动物)表现出小肠重量增加了大约40-50％；此外，与仅用载体处理的动物相比，用20μg[Gly2]rGlp-2处理的DPP-IV缺陷型动物的小肠重量增加了50-60％。另外，与仅给与载体的动物相比，每日两次用20μg[Gly2]rGlp-2处理的Fisher 334野生型大鼠表现出小肠重量增加了75-85％。
上述结果非常清楚地表明，GLP-2在普通大鼠的体内由于被DPP-IV样酶切割掉了N端两个刺激而失活。此外，这些结果表明，经修饰而对DPP-IV切割有抗性的GLP-2类似物所导致普通大鼠的肠重量的实质增加可能是由于GLP-2在体内半衰期延长的结果。
由于在所有已知天然存在的GLP-2中，DPP-IV切割位点都是保守的，因此哺乳动物DPP-IV的切割可能是一种重要、也可能是主要的致使GLP-2在体内失活的机制。重要的是，DPP-IV抗性的GLP-2类似物与其天然形式相比，具有增强的肠营养活性。实施例5
按照以上实施例4所述的方法重复评估各种类似物的小肠诱导活性的实验。在这些实验中，计算每种类似物相对于天然大鼠GLP-2(1-33)(以100％活性表示)在小鼠中的小肠诱导活性。按照以上实施例3所述的方法检测类似物对DPP-IV切割的抗性。实验结果见表2。
                               表2鉴定                             序列描述             相对于rGLP-2    DPP-IV切
                                                    的活性％     割的百分比
                             ALE-0109大鼠GLP-2(1-33)                  天然大鼠序列            100％          58％大鼠GLP-2(4-33)                  N-3；除去3个N端残基     6％Ac-大鼠GLP-2(1-33)               N-乙基                  44％           0％琵琶鱼GLP-1                      天然琵琶鱼GLP-1         7％[Arg-1]大鼠GLP-2(1-33)           Arg加入N端              11％           0％大鼠GLP-2(1-30)                  C-3；除去3个C端残基     23％大鼠GLP-2(1-25)                  C-8；除去8个C端残基     8％大鼠GLP-2(1-33)酰胺              C端酰胺                 56％[Arg-2，Arg-1]大鼠GLP-2(2-33)    Arg-Arg加入N端          43％           0％[DAla2]大鼠GLP-2(1-33)        Ala2→D-Ala2                 210％       0％[Gly2]大鼠GLP-2(1-33)         Ala2→Gly2                   196％       0％[Tyr1]大鼠GLP-2(1-33)         His1→Tyr1                    81％     100％[Ala4]大鼠GLP-2(1-33)         Gly4→Ala4                    59％      72％[Glu3]大鼠GLP-2(1-33)         Asp3→Glu3                    65％      50％[Leu10]大鼠GLP-2(1-33)        Met10→Leu10                  51％[Nle10]大鼠GLP-2(1-33)        Met10→Nle10                 100％[Lys20]大鼠GLP-2(1-33)        Arg20→Lys20                 120％[Ser2，Gln3]hGLP-2(1-33)      Ala2→Ser2，Asp3→Glu3        11％       0％[Val23，Gln24]hGLP-2(1-33)    Ile23→Val23，Asn24→Gln24    82％[Val2]GLP-2(1-33)             Ala2→Val2，TPA              145％       0％Degu GLP-2                    天然drgu序列                  70％[Tyr9，Ser10，Lys11，Tyr12，  Glu9→Tyr9，Met10→Ser10，    94％des-Ile13]hGLP-2(1-33)        Asn11→Lys11，Thr12→Tyr12，
                          并且缺失Ile13[Gly2，Ala8]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Asp8→Ala8       120％[Gly2，Ala11]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Asn11→Ala11     150％[Gly2，Ala21]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Asp21→Ala21     125％[Gly2，Ala24]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Asn24→Ala24     139％       0％[Gly2，Ala25]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Trp25→Ala25      18％[Gly2，Ala26]hGLP-2[1-33)     Ala2→Gly2，Leu26→Ala26      28％[Gly2，Ala27]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Ile27→Ala27      82％[Gly2，Ala9]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Glu9→Ala9       112％[Gly2，Ala10]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Mer10→Ala10      82％[Gly2，Ala12]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Thr12→Ala12      67％[Gly2，Ala13]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Ile13→Ala13      67％[Gly2，Ala14]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Leu14→Ala14      30％[Gly2，Ala16]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Asn16→Ala16     130％[Gly2，Ala17]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Leu17→Ala17     130％[Gly2，Ala20]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Arg20→Ala20     105％[Gly2，Ala23]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Ile23→Ala23      24％[Gly2，Ala28]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Gln28→Ala28     130％[Gly2，Ala30]hGLP(1-33)       Ala2→Gly2，Lys30→Ala30      24％[Gly2，Ala31]hGLP-2(1-33)     Ala2→Gly2，Ile31→Ala31     100％[Gly2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Gly2                   300％       0％[Ala1，Gly2]hGLP-2(1-33)      His1→Ala1，Ala2→Gly2        53％       0％[Gly2，Ala3]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Asp3→Ala3        44％       0％[Gly2，Ala4]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Gly4→Ala4       100％       0％[Gly2，Ala5]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Ser5→Ala5       136％       0％[Gly2，Ala6]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Phe6→Ala6        67％[Gly2，Ala7]hGLP-2(1-33)      Ala2→Gly2，Ser7→Ala7        82％[Pro1]hGLP-2(1-33)            His1→Pro1                    12％       0％[Met(O)10]大鼠GLP-2(1-33)     Met10亚砜                     18％[Gln20]hGLP-2(1-33)           Arg20→Gln20                  80％[Asp1]hGLP-2(1-33)            His1→Asp1                    60％       0％[tBuGly2]hGLP-2               Ala2→t-bury1-Gly2           123％       0％[Tyr34]hGLP-2(1-34)           加入C端Tyr                   135％[Asp2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Asp2                    83％       0％[Glu2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Glu2                    93％       0％[Phe2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Phe2                    50％       0％[His2]hGLP-2(1-33)            Ala2→His2                     0％       0％[Ile2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Ile2                    90％       0％[Lys2]hGLP-2(1-33)            Ala→Lys2                     90％       0％[Met2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Met2                   170％       0％[Asn2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Asn2                    67％       0％[Pro2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Pro2                    50％      16％[Gln2]hGLP-2(1-33)            Ala2→Gln2                   100％       0％[Ser2]hGLP-2(1-33)                Ala2→Ser2                 167％            0％[Thr2]hGLP-2(1-33)                Ala2→Thr2                 117％            0％[Val2]hGLP-2(1-33)                Ala2→Val2                 180％           13％[Tyr2]hGLP-2(1-33)                Ala2→Tyr2                  57％            0％[D-Ala2]hGLP-2(1-33)              Ala2→D-Ala2               130％            0％hGLP-2(1-33)                      天然人类序列               100％           60％[desNH2Tyr1]hGLP-2(1-33)          His1→脱氨-Tyr1            125％           15％[Thr5]hGLP-2(1-33)                Ser5→Thr5                  73％[Ser16，Arg17，Arg18]             Asn16→Ser16，Leu17→Arg17，59％hGLP-2(1-33)                      Ala18→Arg18[Asn33]hGLP-2(1-33)               Asp33→Asn33                91％[Pen2]hGLP-2(1-33)                Ala2→L-青霉胺2             58％           20％[bAla2]hGLP-2(1-33)               Ala2→β-Ala2              118％            0％[aAbu2]hGLP-2(1-33)               Ala2→α-氨基丁酸2          84％           49％[Val2]hGLP-2(1-33)                Ala2→Nval2(正缬氨酸)      111％            0％[PhGly2]hGLP-2(1-33)              Ala2→L-苯基-Gly2           37％            0％[Agm34]hGLP-2(1-34)               加入C端鲱精胺               97％
                                    (Agm为脱羧Arg)iArg30]hGLP-2(1-33)               Lys30→Arg30               103％           59％[Pro3]hGLP-2(1-33)                Asp3→Pro3                 140％            0％[Ala5，Ala7]hGLP-2(1-33)          Ser5→Ala5，Ser7→Ala7     108％           77％[Tyr1，Gly2]hGLP-2(1-33)          His1→Tyr1，Ala2→Gly2     241％            0％[Glu33]hGLP-2(1-33)               Asp33→Glu33               121％           55％[Phe25]hGLP-2(1-33)               Trp25→Phe25               114％           54％[Tyr25]hGLP-2(1-33)               Trp25→Tyr25                64％           48％[Gly2，Tyr34]hGLP-2(1-33)         Ala2→Gly2+C端Tyr          297％            0％[Aib2]hGLP-2(1-33)                Ala2→氨基异丁酸2          202％            0％[Gly2，Arg34]hGLP-2(1-34)         Ala2→Gly2+C端Arg         -250％            0％
                      等同物
上述说明书足以让本领域技术人员实践本发明。事实上，对于那些分子生物学、蛋白质化学、医学或相关领域的技术人员来说显而易见的对进行本发明的上述方法的各种修改都将包括在下面权利要求书的范围之内。

Claims (21)

1.GLP-2类似物，其特征在于肠营养活性并符合式1：
R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26-Ile27-Gln-28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2，其中
X1    是His或Tyr；
X2    是Ala或一个Ala取代氨基酸，该取代氨基酸赋予所述类似物对DPP-IV酶的抗性；
X3    是Pro、HPro、Asp或Glu；
X4    是Gly或Ala；
P1    是Glu-X10-Asn-Thr-Ile或Tyr-Ser-Lys-Tyr；
X10   是Met或一个氧化稳定的Met取代氨基酸；
X19   是Ala或Thr；
X20   是Arg、Lys、His或Ala；
P2    是Ile-Asn、Ile-Ala或Val-Gln；
P3    是一个共价键或是Ile、Ile-Thr或Ile-Thr-Asn；
R1    是H或一个N端封闭基团；
R2    是OH或一个C端封闭基团；
Y1    是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；
Y2    是选自Arg、Lys和His的一个或两个碱性氨基酸；并且
m和n独立地为0或1；并且其中至少X1、X2、X3、X4、P1、X10、X19、X20、P2和P3中的一个不同于野生型哺乳动物GLP-2的残基。
2.依照权利要求1的GLP-2类似物，其中所述的类似物至少掺入选自下列的氨基酸取代之一：
1)于X2位掺入一个氨基酸，该氨基酸赋予所述的肠营养性GLP-2类似物对人类DPP-IV酶切的抗性；
2)于X10位掺入一个氧化稳定的Met取代氨基酸；和
3)于X20位掺入一个选自His或Lys的碱性氨基酸。
3.依照权利要求2的GLP-2类似物，其中X2被一个赋予所述类似物对DPP-IV酶消化的抗性的氨基酸取代。
4.依照权利要求3的GLP-2类似物，其中X2选自D-hPr、D-Pro、D-Ala、Gly、Val、Glu、Lys、Arg、Leu和Ile。
5.依照权利要求3的GLP-2类似物，所述类似物在下列位置至少掺入一个氨基酸取代：X1、X3、X4、X10、X19、X20和P2。
6.依照权利要求2的GLP-2类似物，其中X10被选自Val、Ile、Asn、Glx、Tyr、Phe、Leu、Nle、Ala、Ser和Gly的一个氨基酸所取代。
7.依照权利要求1的GLP-2类似物，选自[Tyr1]rGLP-2、[Ala4]rGLP-2、[Val23Gln24]hGLP-2和[Asn33]hGLP-2(1-33)。
8.人类GLP-2肽的类似物，其中所述的类似物包含选自下列的至少一个氨基酸取代：
a)于X2位和/或X3位掺入一个取代氨基酸，该取代氨基酸赋予GLP-2类似物对DPP-IV酶切的抗性；
b)于X10位掺入一个氧化稳定的取代氨基酸；和
c)于X20位掺入非Arg的取代氨基酸。
9.依照权利要求8的GLP-2类似物，它在X2掺入一个氨基酸取代，其中于X2位取代的氨基酸是选自D-hPr、D-Pro、D-Ala、Gly、Val、Glu、Lys、Arg、Leu和Ile。
10.权利要求9所述的GLP-2类似物，其中所述类似物选自：
[Gly2]hGLP-2；
[D-Ala2Thr19]hGLP-2；
[Gly2Thr19]hGLP-2；
[Ala1Gly2]hGLP-2；
[Gly2Ala3]hGLP-2；
[Gly2Ala4]hGLP-2；
[Gly2Ala5]hGLP-2；
[Gly2Ala6]hGLP-2；
[Gly2Ala7]hGLP-2；
[Gly2Ala8]hGLP-2；
[Gly2Ala9]hGLP-2；
[Gly2Ala10]GLP-2；
[Gly2Ala11]hGLP-2；
[Gly2Ala12]hGLP-2；
[Gly2Ala13]hGLP-2；
[Gly2Ala10]hGLP-2；
[Gly2Ala17]hGLP-2；
[Val2Thr19]hGLP-2；
[Gly2Ala20]hGLP-2；
[Gly2Ala21]hGLP-2；
[Gly2Ala24]hGLP-2；
[Gly2Ala27]hGLP-2；
[Gly2Ala28]hGLP-2；和
[Gly2Ala31]hGLP-2.
11.依照权利要求8的GLP-2类似物，它在X10掺入一个氨基酸取代，其中于X10取代的氨基酸选自Val、Ile、Asn、Glx、Tyr、Phe、Leu、Nle、Ala、Ser和Gly。
12.依照权利要求11的GLP-2类似物，其中所述类似物选自[Ser10]hGLP-2(1-33)、[Nle10]hGLP-2(1-33)、[Ala10]hGLP-2(1-33)、[Leu10]rGLP-2(1-33)、[Nle10]大鼠GLP-2(1-33)、[Gly2Ala10]hGLP-2(1-33)、[Met(O)10]大鼠GLP-2(1-33)和[Tyr9Ser10Lys11Tyr12(desIle13)]hGLP-2(1-33)。
13.依照权利要求8的GLP-2类似物，其中所述类似物选自[Pro3]hGLP-2、[HPr3]hGLP-2、[Glu3Thr3]hGLP-2和[Thr19Lys20]hGLP-2。
14.依照权利要求8的GLP-2类似物，其中所述类似物选自：[Ser7，Gln3]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Ala25]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Ala26]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Ala14]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Ala23]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Ala30]hGLP-2(1-33)；[Tyr1，Gly2]hGLP-2(1-33)；[Gly2，Arg34]hGLP-2(1-34)；[Gly2，Tyr34]hGLP-2(1-34)；[tBuGly2]hGLP-2；[Asp2]hGLP-2(1-33)；[Glu2]hGLP-2(1-33)；[Phe2]hGLP-2(1-33)；[His2]hGLP-2(1-33)；[Ile2]hGLP-2(1-33)；[Lys2]hGLP-2(1-33)；[Mer2]hGLP-2(1-33)；[Asn2]hGLP-2(1-33)；[Pro2]hGLP-2(1-33)；[Gln2]hGLP-2(1-33)；[Ser2]hGLP-2(1-33)；[Thr2]hGLP-2(1-33)；[Val2]hGLP-2(1-33)；[Tyr2]hGLP-2(1-33)；[D-Ala2]hGLP-2(1-33)；[Pen2]hGLP-2(1-33)；[bAla2]hGLP-2(1-33)；[aAbu2]hGLP-2(1-33)；[Nval2]hGLP-2(1-33)；[PhGly2]hGLP-2(1-33)；和[Aib2]hGLP-2(1-33).
15.肠营养性GLP-2类似物，选自：
大鼠GLP-2(4-33)
Ac-大鼠GLP-2(1-33)
大鼠GLP-2(1-30)
大鼠GLP-2(1-25)
大鼠GLP-2(1-33)酰胺
[Arg-2，Arg-1]大鼠GLP-2(2-33)
[Pro1]hGLP-2(1-33)；
[Gln20]hGLP-2(1-33)；
[Asp1]hGLP-2(1-33)；
[Tyr34]hGLP-2(1-34)；
[desNH2Tyr1]hGLP-2(1-33)；
[Thr5]hGLP-2(1-33)；
[Ser16，Arg17，Arg18]hGLP-2(1-33)；
[Agm34]hGLP-2(1-34)；
[Arg30]hGLP-2(1-33)；
[Ala5，Ala7]hGLP-2(1-33)；
[Glu33]hGLP-2(1-33)；
[Phe25]hGLP-2(1-33)；和
[Tyr25]hGLP-2(1-33).
16.肽[Gly2]hGLP-2。
17.药用组合物，包含治疗有效量的依照权利要求1-16中任一项的GLP-2类似物和一种药学上可接受的的载体。
18.依照权利要求1-16中任一项的GLP-2类似物的用途，即用于生产促进有需要的患者或动物的小肠组织生长的药物。
19.依照权利要求1-16中任一项的GLP-2类似物的用途，即用于生产治疗患者或动物的胃肠疾病的药物。
20.权利要求19的用途，其中所述胃肠疾病选自溃疡、消化紊乱、吸收障碍综合征、短肠综合征、盲管综合征、炎症性肠病、腹腔性口炎性腹泻(celiac sprue)、热带性口炎性腹泻、低γ球蛋白血症性口炎性腹泻、肠炎、节段性肠炎(Crohn氏病)、由于毒性或其它化疗药物导致的小肠损伤和短肠综合征。
21.鉴别肠营养性GLP-2类似物的方法，包括下列步骤成：
a)获取依照权利要求1的GLP-2类似物；
b)用能引出使用大鼠GLP-2时的肠营养效应的制度处理哺乳动物；以及
c)确定相对于模拟处理的对照哺乳动物的所述类似物对小肠重量作用的效应，藉此所述的肠营养性GLP-2类似物鉴定为引起所述重量增加的类似物。
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