DE69706241T2

DE69706241T2 - Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Leukämie enthaltend 9-cis-Retinoinsäure-alpha-Tocopherolester

Info

Publication number: DE69706241T2
Application number: DE69706241T
Authority: DE
Inventors: Yoshio Honma; Kohei Inomata; Yasuhiro Kanatani; Takao Kishiye; Makoto Makishima
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2001-12-06
Anticipated expiration: 2017-06-28
Also published as: US5929057A; EP0815858A1; CA2209205A1; DE69706241D1; US5827878A; EP0815858B1; DK0815858T3

Description

Diese Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Leukämie, die 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester enthält, und ein Verfahren für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Leukämie. Die Zusammensetzung zur Behandlung von Leukämie enthält auch entweder 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; (nachfolgend als "VD&sub3;" bezeichnet) oder 9-cis-Retinoesäure (nachfolgend als "9-cis-RA" bezeichnet).
Krebserkrankungen haben, unter verschiedenen Erkrankungen, kürzlich die erste Position bei den Todesursachen eingenommen und es wurde eine bereits frühere Entwicklung und Einführung einer neuen Therapie gegen Krebserkrankungen gewünscht. Insbesondere gab es Versuche einer Therapie gegen Leukämie, einem Blutkrebs, bei der Mittel mit einer inhibitorischen Wirkung auf die Proliferation von Leukämiezellen und eine induzierende Wirkung auf die Differentiation der Zellen verwendet wurden. Es ist bekannt, daß die Induktion der Differentiation von Leukämiezellen in ausgereifte; leukozytenähnliche Zellen die Proliferation von Leukämiezellen inhibieren kann, was zu einem Verlust von Eigenschaften von Leukämiezellen führt.
Es wird berichtet, daß die Behandlung mit einer natürlichen Art eines Retinoids, all-trans Retinoesäure (nachfolgend bezeichnet als "ATRA"), bei den Patienten, die an akuter promyelozytischer Leukämie mit PMURARa-Transposition (New Eng. J. Med., Vol. 329, 177, 1993) leiden, in 90% oder mehr zur vollständigen Remission führt.
Kürzlich wurde ein Retinoesäurerezeptor (nachfolgend als "RAR" bezeichnet) als ein Rezeptor für ATRA (Nature, Vol. 330, 440, 1987 und ibid., Vol. 330, 624, 1987) gefunden und es wird angenommen, daß ATRA verschiedene Transkriptionskontrollen über RAR leistet. Es traten jedoch häufig Rückschläge bei der Therapie unter Verwendung von ATRA ein, und, im Fall von Rückschlägen nach der Behandlung mit ATRA, war die Reremissionsrate durch ATRA auf 36% abgesenkt. Darüber hinaus kann ATRA schwere Nebenwirkungen zeigen und, wenn es in hoher Dosis verabreicht wird, sind verschiedene Störungen in der Haut, dem zentralen Nervensystem, der Leber, usw. induziert worden. Ferner begleitet die Verabreichung von ATRA an schwangere Frauen ein Risiko einer teratogenen Wirkung. Demgemäß kann sich den Patienten das Problem der Überwindung derartiger, durch eine hohe Dosis hervorgerufener Störungen stellen. Es ist auch bekannt, daß eine kontinuierliche Verabreichung von ATRA eine Bindung von Proteinen induziert, wie dem intrazellulären ATRA-bindenden Protein (CRABP), wodurch folglich eine Serum-ATRA-Konzentration verringert werden kann, so daß sie in nachteiligen Ergebnissen im Hinblick auf den Zweck der Leukämietherapie resultiert (Blood, Vol. 82, 1949, 1993).
Kürzlich wurde ein neuer Retinoidrezeptor, Retinoid-X-Rezeptor (nachfolgend als "RXR" bezeichnet) gefunden und sein Ligand ist als 9-cis-RA identifiziert worden, welches ein geometrisches Isomer von ATRA an dessen 9-Position ist (Cell, Vol. 68, 397, 1992). 9-cis-RA ist als starker Ligand nicht nur für RXR bekannt, sondern auch für RAR, mit einer Differentiation induzierenden Aktivität in HL-60-Zellen von myelozytischen Leukämiezellen ("IGAKU NO AYUMI", Vol. 175, 925, 1995 und Blood, Vol. 81, 1009, 1993).
Das 9-cis-RA ist jedoch auch als chemisch instabil und leicht zu ATRA zu isomerisieren bekannt, wovon ähnliche Nebeneffekte wie solche von ATRA erwartet werden können. Somit war eine möglicherweise verringerte Dosis von 9-cis-RA wünschenswert.
Andererseits besitzt das als Mittel zur Verbesserung des Knochenmetabolismus bekannte VD&sub3; eine Zelldifferentiation induzierende Aktivität, wie ATRA und induziert die Differentiation solcher Zellen, die von einem Kolonkarzinom, Brustkarzinom und Leukämie stammen (Endocrine Rev., Vol. 13, 765, 1992). Die Verwendung von VD&sub3; als Antikrebsmittel wird auch erwartet. VD&sub3; ist jedoch nur in geringer Dosis anwendbar. Zum Beispiel kann eine Serum-VD&sub3;- Konzentration jenseits von 10&supmin;&sup9; Mol zu Nebenwirkungen führen, wie Hyperkalzämie und anderen.
Daher ist eine klinische Verwendung einer solchen Dosis zur Bewirkung einer hohen VD&sub3;-Konzentration im Serum beschränkt worden (Cancer Treat. Rep., Vol. 69, 1399, 1985).
Zur Kombination von ATRA mit VD&sub3; offenbart das japanische Patent Kokai 7- 2674 unter dem Punkt des Standes der Technik, daß eine kombinierte Verwendung von beiden Verbindungen nur additive Wirkungen auf die Inhibition des Wachstums und der Differentiationsinduktion von HL-60-Leukämiezellen erzeugen könnte. Die Veröffentlichung offenbart ein Therapeutikum für Leukämie, das ATRA und ein VD&sub3;-Aanalogon umfaßt, um eine synergistische Wirkung zu erzielen. Aus Tabelle 1 der Veröffentlichung ist jedoch offensichtlich, daß eine Serumkonzentration des VD&sub3;-Analogons 10&supmin;&sup8; Mol oder mehr sein sollte, um 50% oder mehr Wachstumsinhibierungsrate der Leukämiezellen zu erreichen. Die Verwendung von VD&sub3; bei einer so hohen Konzentration würde mögliche Nebeneffekte erzeugen, so wie schwere Hyperkalzämie, wie oben beschrieben.
Unser japanisches Patent Kokai 4-244076 offenbart ein verestertes Produkt von · 9-cis-RA und ein Tocopherolderivat und ist für die Behandlung von Hautgeschwüren, peptischen Geschwüren und Tumore verwendbar. Es wird jedoch nicht offenbart, daß der Ester als Therapeutikum für Leukämie verwendbar ist.
Unter diesen Umständen war die Entwicklung eines neuen und wirksamen Therapeutikums für Leukämie mit weniger Nebenwirkungen an lebenden Körpern wünschenswert, aber ein befriedigend wirksames Medikament äst bis zur heutigen Zeit noch nicht gefunden worden. Im Hinblick hierauf bestand ein Bedürfnis für eine neue Zusammensetzung zur Verwendung als Therapeutikum für Leukämie mit einem stärkeren therapeutischen Effekt und einer höheren Sicherheit im Vergleich mit den Therapeutika für Leukämie aus dem Stand der Technik.
Wir haben gewissenhafte Untersuchungen durchgeführt, um die oben genannten Probleme zu lösen und schließlich gefunden, daß 9-cis- Retinoesäure-α-tocopheroiester, welches ein α-Tocopherolester von 9-cis-RA ist, in kombinierter Verwendung mit VD&sub3; oder 9-cis-RA sehr wirksam bei der Behandlung von Leukämie bei so niedrigen Dosen von VD&sub3; oder 9-cis-RA ist, die keine Nebeneffekte am lebenden Körper erzeugen. Diese Erfindung wurde aufgrund dieser Befunde getätigt.
Fig. 1 ist ein Diagramm, das einen Zusammenhang zwischen VD&sub3;-Konzentrationen und NBT-verringernden Aktivitätswerten zeigt, die in den Fällen erhalten wurde, in denen VD&sub3; alleine verwendet wurde (- -), in denen 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester zusammen mit VD&sub3; verwendet wurde (- -) und in denen Tretinoin Tocoferil zusammen mit VD&sub3; verwendet wurde ( -), wobei alle auf NB4-Zellen angewendet wurden.
Fig. 2 ist ein Balkendiagramm, das die inhibitorischen Wirkungen auf die Proliferation von NB4-Zellen ausgedrückt in Prozent (%) der erhaltenen Proliferation in den Fällen zeigt, in denen 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol), 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) und Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) jeweils alleine verwendet wurden, und in denen 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) oder Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) verwendet wurde, wobei alle auf NB4-Zellen angewendet wurden.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das einen Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensitäten eines Differentiationsmarkers (CD11b) und der Anzahl erhaltener Zellen in den Fällen zeigt, in denen 9-cis-RA alleine verwendet wurde (3 · 10&supmin;&sup9; Mol oder 3 · 10&supmin;&sup8; Mol)und in denen. 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit 9-cis-Rentinoesäure-α-tocopherofester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) oder Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) verwendet wurde, wobei alle auf NB4-Zellen angewendet wurden.
Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das eine inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von NB4-Zellen zeigt, ausgedrückt in Prozent (%) der in den Fällen erhaltenen Proliferation, in denen VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol), 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) jeweils alleine verwendet wurden und in denen VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) oder Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) verwendet wurde, wobei alle auf NB4-Zellen angewendet wurden.
Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das Werte von NBT-reduzierender Aktivität zeigt, die in den Fällen erhalten wurde, in denen VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol), 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und Tretinoin Tocoferü (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) jeweils alleine verwendet wurden und in denen VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) oder Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) verwendet wurde, wobei alle auf NB4-Zellen angewendet wurden.
Diese Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Leukämie, umfassend:
(a) als koaktiven Inhaltsstoff ein 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester, wiedergegeben durch die Formel (I)
(b) als koaktiven Inhaltsstoff eine Verbindung ausgewählt aus 1-α,25- Dihydroxyvitamin D&sub3; und 9-cis-Retinoesäure; und
(c) einen pharmazeutischen Träger oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel dafür.
Die Erfindung betrifft auch 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester der obigen Formel (f) zusammen mit 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; (VD&sub3;) und/oder mit 9-cis- Retinoesäure (9-cis-RA) zur therapeutischen Verwendung.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester der obigen Formel (I) optional zusammen mit VD&sub3; oder 9-cis- RA bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Leukämie.
Die japanische Patentveröffentlichung 60-56156 offenbart, daß 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester durch Lichtisomerisation von all-trans-α- Tocopherolvitamin A-Säure erhalten werden kann. Kommerziell kann es durch Veresterung von 9-cis-RA mit α-Tocopherol hergestellt werden. Die Veresterung von 9-cis-RA mit α-Tocopherol kann gemäß einem beliebigen, allgemein bekannten Veresterungsverfahren durchgeführt werden, zum Beispiel durch das in unserem japanischen Patent kokai 5- 202020 offenbarte Verfahren.
Der Ausdruck "α-Tocopherol", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf dlα-Tocopherol, d-α-Tocopherol und 1-α-Tocopherol.
Auch der Ausdruck "ein durch die Formel (I) wiedergegebener 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf alle möglichen optischen Isomere, Razemate und razemischen Mischungen davon. Diese möglichen, optisch aktiven Substanzen, können zum Beispiel gemäß Chiralsynthese unter Verwendung von optisch aktiven Ausgangsmaterialien hergestellt werden.
Obwohl 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester selbst biologische Aktivitäten zur Inhibierung der Proliferation von Leukämiezellen ausüben und die Differentiation der Zellen induzieren kann, kann eine synergistische Wirkung durch Verwendung zusammen mit VD&sub3; oder 9-cis-RA erreicht werden. Die Dosis an VD&sub3; oder 9-cis-RA kann zur Vermeidung von Nebeneffekten, die von VD&sub3; oder 9-cis-RA hervorgerufen werden, herabgesetzt werden.
Die Leukämie, auf welche das vorliegende Therapeutikum klinisch angewendet werden soll, schließt hämatologische Tumore ein, das heißt Leukämie, insbesondere akute promyelozytische Leukämie und Lymphome.
Für die Behandlung von Leukämie reicht eine therapeutisch wirksame Serumkonzentration des 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters in einem erwachsenen Patienten von 60 kg Gewicht gewöhnlich von 1 · 10&supmin;&sup9; Mol bis 5 · 10&supmin;&sup5; Mol, damit der vorliegende Ester seine Wirkung ausreichend ausüben kann. Eine besondere Dosis für Erwachsene kann somit zur Erfüllung der oben angegebenen Serumkonzentrationen in dem Bereich von 10 mg bis 1200 mg liegen, stärker bevorzugt von 60 mg bis 600 mg, ausgedrückt als 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester.
Das vorliegende Therapeutikum, das als aktiven Bestandteil eine Kombination des vorliegenden 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters mit VD&sub3; umfaßt, sollte in einer solchen Dosis verabreicht werden, die einen synergistischen Effekt beider Bestandteile ausreichend ausübt, wobei das VD&sub3; in einer ausreichend niedrigen Dosis verabreicht werden sollte, damit es keine Nebenwirkungen hervorruft, das heißt in einer solchen Dosis, daß seine Serumkonzentration in einem Patienten 10&supmin;&sup9; Mol oder weniger ist. Eine Serumkonzentration des 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolesters in einem erwachsenen Patienten von 60 kg Gewicht reicht gewöhnlich von 1 · 10&supmin;&sup9; Mol bis 5 · 10&supmin;&sup5; Mol, damit der synergistische Effekt ausreichend ausgeübt wird. Eine spezielle Tagesdosis für Erwachsene, um die oben angegebenen Anforderungen für beide der Serumkonzentrationen zu erfüllen, kann bevorzugt in dem Bereich von 10 mg bis 1200 mg, stärker bevorzugt von 60 mg bis 600 mg des 9-cis-Retinoesäure- α-tocopherolesters und in dem Bereich von 0,005 ug bis 5 ug, stärker bevorzugt von 0,01 ug bis 0,50 ug an VD&sub3; liegen. Es ist wesentlich, beide der Inhaltsstoffe gleichzeitig zu verabreichen.
Das vorliegende Therapeutikum, das als aktiven Bestandteil eine Kombination des vorliegenden 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters mit 9-cis-RA cmfaßt, sollte in einer solchen Dosis verabreicht werden, daß es einen Synergieeffekt beider Bestandteile ausreichend ausüben kann, wobei das 9-cis-RA in einer ausreichend geringen Dosis verabreicht werden sollte, um keine seiner Nebenwirkungen hervorzurufen, das heißt bei einer solchen Dosis, daß seine Serumkonzentration 10&supmin;&sup7; Mol oder weniger ist. Eine Serumkonzentration des 9- cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters in einem erwachsenen Patienten von 60 kg Gewicht reicht gewöhnlich von 1 · 10&supmin;&sup5; Mol bis 5 · 10&supmin;&sup5; Mol, um die Synergiewirkung ausreichend auszuüben. Dementsprechend kann eine spezielle Tagesdosis für Erwachsene zur Erfüllung der oben genannten Erfordernisse für beide Serumkonzentrationen bevorzugt in dem Bereich von 10 mg bis 1200 mg, stärker bevorzugt von 60 mg bis 600 mg des 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolesters und in dem Bereich von 1,0 mg bis 80 mg, stärker bevorzugt von 5,0 mg bis 20 mg des 9-cis-RA liegen. Es ist wesentlich, beide Bestandteile gleichzeitig zu verabreichen.
Das erfindungsgemäße Therapeutikum kann typischerweise über die orale, intravenöse, subkutane, intramuskuläre oder rektale Route verabreicht werden, wobei die intravenöse oder orale Administration bevorzugt ist.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Leukämie kann gemäß einem beliebigen herkömmlichen Präparationsverfahren hergestellt werden. Eine pharmazeutische Zubereitung für die orale Verabreichung kann verschiedene Dosierungsformen einschließen, zum Beispiel Tabletten, Granulate, Pulver, harte Kapseln, weiche Kapseln, flüssige Zubereitungen für die orale Verabreichung, etc. Eine pharmazeutische Zubereitung für parenterale Verabreichung kann verschiedene Dosierungsformen einschließen, zum Beispiel, Injektionen, Zäpfchen, etc.
Die Dosierungsformen können durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren unter Verwendung gewöhnlich für pharmazeutische Zubereitungen verwendeter Additive, falls gewünscht, hergestellt werden, wobei Additive verwendet werden können wie Arzneimittelträger, Stabilisatoren, antiseptische Mittel, Lösungsvermittler, Benetzungsmittel, Emulgierungsmittel, Gleitmittel, Süßstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Antioxidanzien und dergleichen. Besondere Beispiele dieser Additive können Stärke, Sucrose, Fructose, Lactose, Glucose, Manitol, Sorbitol, präzipitiertes Calciumcarbonat, kristalline Cellulose, Carboxymethylcellulose, Dextrin, Gelatine, Akaziengummie, Magnesiumstearat, Talk, Hydroxypropylmethylcellulose und dergleichen einschließen.
Für Injektionen oder flüssige Zubereitungen können die aktiven Bestandteile in der Form einer Lösung oder einer Suspension derselben in einem herkömmlichen Verdünnungsmittel verwendet werden. Typische Beispiele des Verdünnungsmittels können physiologische Salzlösung, Ringerlösung, wässrige Glucoselösung, Alkohole, Fettsäureester, Glycole, Glycerol, Fettsäuregayceride, aus tierischen und pflanzlichen Quellen stammendes Fett, Paraffine und dergleichen sein.
Injektionen können gemäß beliebigem herkömmlichem Verfahren unter Verwendung von Additiven, falls erforderlich, hergestellt werden, wie pH- Einstellungsmittel, Puffer, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler und dergleichen.
Diese Erfindung wird genauer durch das folgende Herstellungsbeispiel, die Beispiele und die Formulierungsbeispiele erläutert. Diese Beispiele sind jedoch nicht zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht.
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Medikamente und Reagenzien waren wie nachfolgend angegeben erhältlich:
Dimethylsulfoxid (nachfolgende als "DMSO" bezeichnet) und VD&sub3; waren von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich. ATRA war von der Sigma Chemical Co. erhältlich. 9-cis-RA war von den Biomol Research Laboratories oder BASF (über Nisshin Badische) erhältlich. Nitro blau Tetrazolin (nachfolgend als "NBT" bezeichnet) und Phorbol-12-myristat-13-acetat (nachfolgend als "TPA" bezeichnet) waren von Sigma Chemical Co. erhältlich.

Herstellungsbeispiel

9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester

Zu einer Lösung von 50 mg (0,1664 mMol) 9-cis-Retinoesäure (9-cis-RA) in Diisopropylether (5 ml) wurden 26 ul (0,1831 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt Dann wurde eine Lösung von 79 mg (0,1831 mMol) dl-α-Tocopherol in Diisopropylether (5 ml) tropfenweise zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 28% (w/v) wässrige Ammoniaklösung (10 ml) gegeben und die resultierende Mischung wurde mit Diisopropylether (20 ml · 3) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden nacheinander mit Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Diisopropyletherschicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Chromatografie an einer Süicagelsäule gereinigt und die Fraktionen aus Hexan, enthaltend 2% (v/v) Diisopropylether, ergaben 36 mg (30%) der Titelverbindung als gelb ölige Substanz.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz) d 0,82 bis 0,90 (m, 12H), 1,00 bis 2,20 (m, 29H), 1,05 (s, 3H), 1,55 (s, 6H), 1,66 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 2,03 (s, 6H), 2,09 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,59 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 6,08 (s, 1H), 6,09 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 6,29 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 6,33 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 7,15 (dd, J = 11,7 Hz, 15,0 Hz, 1H).

Allgemeine Anmerkung:

Kultivierte Zellen und Kulturbedingungen:
Die für die folgende Bestimmung und Beispiele verwendeten kultivierten Zellen, die NB4-Zellen, das heißt, die kultivierten Zellen von menschlicher myelomonozytischer Leukämie, die Prof. H. Phillip Koeffier des Cedars-Sinai Medical Center/UCLA School of Medicine, Los Angeles, U. S.,A. (Blood, Vol. 77, 1080, 1991) erhalten wurden und hier nach Suspendieren und Inkubieren in RPMI 1640 Medium (hergestellt von Gibco BRL), enthaltend 10% fötales bovines Serum (nachfolgend als "FBS" bezeichnet), und 80 ug/ml Gentamycin, bei 37ºC in feuchter Luft, enthaltend 5% CO&sub2;, verwendet wurde.
Proliferation kultivierter Zellen und Bestimmung der Differentiation der kultivierten Zellen:
Die oben kultivierten Zellen wurden in einer Kulturschale unter denselben Bedingungen kultiviert, wie oben beschrieben, wobei die Zugabe von 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester alleine oder in Kombination mit VD&sub3;, ATRA oder 9-cis-RA erfolgte.
Die Anzahl der kultivierten Zellen wurde mittels eines Coulter Counters Typ ZM (hergestellt von Coulter Electronics Co., Ltd., U. K.) gemessen.
Die Werte der NBT-verringernden Aktivität wurden als Standard für die Differentiationsinduktion der kultivierten Zellen der myelomonozytischen Leukämie gemäß dem folgenden Verfahren gemessen:
1) Herstellung einer NBT-Testlösung: Zu 100 ml RPMI 1640 Medium, enthaltend 10% FBS, wurde eine Lösung von 100 mg NBT in 1 ml DMSO und dann 100 ul einer DSMO-Lösung von TPA bei 100 ug/ml zugegeben und die resultierende Mischung wurde zur Herstellung einer NBT-Testlösung gut gerührt.
2) Die kultivierten Zellen wurden in ein 10 ml-Reagenzglas gegeben und die Anzahl der kultivierten Zellen wurde gemessen. Nachfolgend wurde das Reagenzglas zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entsorgt und nachfolgend wurde 1 ml Aliquot der NBT-Testlösung zu jedem Reagenzglas gegeben. Die resultierende Mischung wurde bei 37ºC für 30 Minuten geschüttelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,3 ml 5 N Salzsäure unterbrochen und man ließ die Mischung dann bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden stehen. Die so erhaltene kultivierte Zellsuspension wurde zum Entfernen der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, 0,7 ml DMSO wurden zugegeben und dann wurde die Absorption bei 560 nm mittels eines Spektrophotometers (Typ U-2000, hergestellt von Hitachi, Ltd.) gemessen. Die gemessenen Daten wurden in die Absorption pro 10&sup7; kultivierter Zellen konvertiert, welche als Wert einer NBT-verringernden Aktivität bezeichnet wurde. Ein erhöhter Wert der NBT-verringemden Aktivität bedeutet eine verstärkte Differentiationsinduktion von Leukämiezellen.

Beispiel 1

Kombinierte Wirkung von 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester und VD&sub3; auf die Differentiationsinduktion von NB4-Zellen

Zu den als die kultivierten Zellen verwendeten NB4-Zellen (2 · 10&sup5; Zellen/ml) wurde VD&sub3; gegeben, um jeweils Konzentrationen von 3 · 10&supmin;&sup9; Mol, 3 · 10&supmin;&sup8; Mol und 3 · 10&supmin;&sup7; Mol einzustellen, und anschließend wurde weiterer 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester zugegeben, um eine Konzentration von 3 · 10&supmin;&sup6; Mol einzustellen. Zur Untersuchung der Kombinationswirkung auf die Differentiationswirkung der Zellen wurde eine Inkubation für 4 Tage durchgeführt. Zum Vergleich wurden die kultivierten Zellen, die keinen 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester enthielten, und solche, die Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) anstelle von 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Die Wirkung auf die Differentiationsinduktion der Zellen wurde durch Messen der Werte für die NBT-verringernde Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
In Fig. 1 bezeichnen die Abszisse und die Ordinate jeweils VD&sub3;- Konzentrationen und Absorptionen (das heißt Werte der NBT-verringernden Aktivität) pro 10&sup7; kultivierter Zellen. Die durch (- -), wiedergegebene Linie zeigt einen Zusammenhang: zwischen den Konzentrationen von VD&sub3; und den Werten der NBT-verringernden Aktivität, wenn VD&sub3; alleine verwendet wurde. Die durch (- -) wiedergegebene Linie zeigt einen Zusammenhang zwischen den Konzentrationen von VD&sub3; und den Werten der NBT-verringemden Aktivität, wenn 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) zusammen mit VD&sub3; verwendet wurde, und die durch (- -) wiedergegebene Linie zeigt einen Zusammenhang zwischen den Konzentrationen von VD&sub3; und den Werten der NBT-verringernden Aktivität, wenn Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) zusammen mit VD&sub3; verwendet wurde.
Fig. 1 zeigt, daß eine NBT-verringernde Fähigkeit in einem Konzentrationsbereich von bis zu 3 · 10&supmin;&sup6; Mol nicht erhöht wurde, wenn VD&sub3; alleine verwendet wurde, während Tretinointocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) bei gleichzeitiger Verwendung eine NBT-verringernde Fähigkeit von VD&sub3; potenzierte, wobei aber die Potenzierungsfähigkeit auf ungefähr das 3-fache bei 3 · 10&supmin;&sup9; Mol VD&sub3; beschränkt war. Andererseits potenzierte der 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) bei gemeinsamer Verwendung eine NBT-reduzierende Fähigkeit von VD&sub3; und seine Potenzierungsfähigkeit war auf ungefähr das 7,5-fache bei 3 · 10&supmin;&sup9; Mol VD&sub3; erhöht. Dementsprechend ist klar gezeigt, daß 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester auf bemerkenswerte Weise die Differentiation von NB4-Zellen durch VD&sub3; potenzieren kann und daß seüne Potenzierungswirkung im Vergleich mit Tretinoin Tocoferil wesentlich stärker war.

Beispiel 2

Kombinationswirkung von 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester und 9-cis-RA auf die Inhibierung der NB4-Zellenproliferation

Zu den als die kultivierten Zellen verwendeten NB4-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen/ml) wurde 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) gegeben und dann wurde 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester weiter zugegeben, um so eine Konzentration von 3 · 10&supmin;&sup6; Mol einzustellen. Zur Untersuchung der lnhibierungswirkung auf die Zellproliferation wurde eine Inkubation für 4 Tage durchgeführt. Zum Vergleich wurden kultivierte Zellen, die beides nicht enthielten, 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester und 9-cis-RA (Kontrolle), die keinen 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester enthielten, und die Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) anstelle des 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Nach 4 Tagen wurde die Anzahl von Zellen gezählt und als relative Prozentangabe, berechnet von der als Kontrolle als 100 definierten Zellzahl, ausgerechnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Die in Fig. 2 unterhalb der Abszisse angeordneten Angaben "ohne" und "9CRA" stehen jeweils für die Gruppe, der kein 9-cis-RA gegeben wurde, und die Gruppe, die 9-cis-RA enthielt. Die Balken geben in der Reihenfolge von links nach rechts die Kontrolle (der keine aktiven Agenzien gegeben wurden), die Gruppe, der Tretinoin Tocoferil alleine (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde, die Gruppe, der 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester alleine (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde, die Gruppe, der 9-cis-RA alleine (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) gegeben wurde, die Gruppe, der gleichzeitig 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) und Tretinoin Tocoferü (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde, und die Gruppe, der gleichzeitig 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) und 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde, wieder.
Fig. 2 zeigt, daß die Proliferation von NB4-Zellen nicht mit 9-cis-RA alleine (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) inhibiert werden konnte, während Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) die Proliferation von NB4-Zellen bei gemeinsamer Verwendung mit 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) inhibieren konnte, wobei aber dessen Inhibierungsrate (das heißt ein relativer Prozentsatz der Anzahl überlebender Zellen zu der der Kontrolle) ungefähr 86% war. Im Gegensatz dazu war bei der gemeinsamen Verwendung mit 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) die Proliferation von NB4-Zellen inhibiert und die Inhibierungsrate betrug ungefähr 72%, was bedeutet, daß die Proliferation von NB4-Zellen bemerkenswert inhibiert war. Dementsprechend ist klar demonstriert, daß die Differentiation von NB4-Zellen wirksam durch eine kombinierte Verwendung von 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester mit 9-cis-RA inhibiert werden kann und die lnhibierungswirkung im Vergleich mit der von Tretinoin Tocoferil wesentlich potenter war.

Beispiel 3

Kombinationswirkung von 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester und 9-cis-RA auf die Differentiationsinduktion von NB4-Zellen

Zu den als die kultivierten Zellen verwendeten NB4-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen/ml) wurde 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) und dann 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester bis zu einer Konzentration von 3 · 10&supmin;&sup6; Mol gegeben. Eine Inkubation wurde für 4 Tage durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Phosphatpuffer gewaschen und dann bei 4ºC für eine Stunde mit einem monoklonalen Mausantikörper CD11b (bezogen von der Nichirei Corporation) [verdünnt mit IFA-Puffer (10 mMol Hepes, pH 7,4, 150 mMol NaCl, 4% FBS, 0,1% Natriumacid] bei 4ºC für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit IFA-Puffer gewaschen und dann mit einem FITC-markierten Kaninchen-Antimausantikörper (verdünnt mit IFA-Puffer) bei 4ºC für 1 Stunden umgesetzt. Die Zellen wurden zweimal mit IFA-Puffer gewaschen und floureszenzpositive Zellen wurden mittels Flußzytometrie (Epics XL, hergestellt von Coulter Electronics Co., Ltd.) analysiert. Zum Vergleich wurden die kultivierten Zellen, die 9-cis-Retinoesäureα-tocopherolester und 9-cis-RA beide nicht enthielten, die 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) enthielten, die 9-cis-Retinoesäure alleine (3 · 10&supmin;&sup8; Mol) enthielten, und die Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) enthielten anstelle des 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolesters auf ähnliche Weise inkubiert und mit den Antikörpern umgesetzt. Das Erscheinen eines Differentiationsmarkers für CD11b zeigt die Differentiation der Zellen in ein Granulozytensystem an. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
In Fig. 3 geben die Angaben "ohne" und "9CRA" die Gruppe wieder, der kein 9- cis-RA gegeben wurde, und die Gruppe, der 9-cis-RA gegeben wurde, während jeweils die Symbole "9CRA + TT" und "9CRA + 9CTT" die Gruppe wiedergeben, der 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) und Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde, und die Gruppe, der 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) und 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) gegeben wurde.
Fig. 3 zeigt, daß eine Differentiation wesentlich stärker induziert werden konnte, wenn Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) weiter zugegeben wurde, wie im Vergleich dazu, wenn 9-cis-RA (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) alleine verwendet wurde. Weiterhin kann eine Differentiation noch stärker bemerkenswert induziert werden, wenn 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) weiterhin zugegeben wurde, wie aus dem Vergleich hervorgeht, wenn Tretinoin Tocoferil (3 · 10&supmin;&sup6; Mol) weiter zugegeben wurde, und die differentiationsinduzierende Fähigkeit war äquivalent zu der, wenn 9-cis-Retinoesäure (3 · 10&supmin;&sup8; Mol) alleine verwendet wurde. Dementsprechend ist klar gezeigt, daß eine gleichartige Wirkung durch eine Kombination von 9-cis-Retinoesäure mit 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester erzielt werden kann, sogar wenn die Menge der zu verwendenden 9-cis-Retinoesäure auf 1/10 verringert sein kann.

Beispiel 4

Inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von NB4-Zellen durch 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester alleine und in kombinierter Anwendung des Esters mit VD&sub3;

Zu den als die kultivierten Zellen verwendeten NB4-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen/ml) wurde 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) zugegeben. Eine Inkubierung wurde für 4 Tage durchgeführt. Zum Vergleich wurden die Zellen, die keine aktiven Verbindungen enthielten, und solche, die Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) anstelle des 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolesters enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Zur Untersuchung der durch eine kombinierte Verwendung mit VD&sub3; erzielten Wirkung wurden die 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) enthaltenden, und zum Vergleich solche, die Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
In Fig. 4 geben die Angaben "ohne", "9CTT" und "TT", die jeweils unter der Abszisse dargestellt sind, die Gruppe wieder, der kein 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester oder Tretinoin Tocoferil gegeben wurde, die Gruppe, der 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde, und die Gruppe, der Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde. Die Balken geben in der Reihenfolge von links nach rechts die Kontrolle (der kein aktives Agenz gegeben wurde), die Gruppe, der VD&sub3; alleine gegeben wurde (3 · 10&supmin;&sup9; Mol), die Gruppe, der 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester alleine gegeben wurde (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol), die Gruppe, der VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde, die Gruppe, der Tretinoin Tocoferil alleine (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde, und die Gruppe, der VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) zusammen mit Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde, wieder.
Fig. 4 zeigt, daß 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester sogar bei alleiniger Verwendung die Proliferation von NB4-Zellen stark inhibieren konnte und daß seine Inhibierungswirkung wesentlich stärker als bei der alleinigen Verwendung von Tretinoin Tocoferil war. Fig. 4 zeigt ferner, daß 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) eine Inhibierungswirkung auf die Proliferation von VD&sub3; bemerkenswert potenzieren kann und diese Inhibierungswirkung effektiver als bei der gemeinsamen Verwendung von Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) war.

Beispiel 5

Zelldifferentiation induzierende Wirkung durch 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester

Zu den als kultivierten Zellen verwendeten NB4-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen/ml) wurde 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben und eine Inkubation wurde für 4 Tage durchgeführt, um die Wirkung auf die Differentiationsinduktion der Zellen zu untersuchen. Zum Vergleich wurden die kultivierten Zellen, die keinen 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester enthielten und solche, die Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Andererseits wurden zur Untersuchung der Wirkung durch kombinierte Verwendung mit VD&sub3; die 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) enthaltenden Zellen untersucht und zum Vergleich, solche, die Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) anstelle des 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolesters und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) enthielten, auf gleiche Weise inkubiert. Die Wirkung auf die Proliferationsinduktion der Zellen wurde durch Messung der Werte für die NBT-verringernde Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.
In Fig. 5 zeigt die Ordinate Absorptionen (Werte der NBT-verringernden Aktivität) pro 107 kultivierter Zellen, während die unterhalb der Abszisse erfolgten Angaben "ohne", "9CTT" und "TT" jeweils die Gruppe wiedergeben, der kein 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester oder Tretinoin Tocoferil gegeben wurde, die Gruppe, der 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde und die Gruppe, der Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) gegeben wurde. Die Balken geben in der Reihenfolge von links nach rechts die Kontrolle (der keine aktiven Agenzien gegeben wurde) wieder, die Gruppe, der VD&sub3; alleine gegeben wurde (3 · 10&supmin;&sup9; Mol), die Gruppe, der 9-cis-Retinoesäureα-tocopherolester alleine gegeben wurde (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol), die Gruppe, der 9-cis- Retinoesäure-α-tocopheroiester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) zusammen mit VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) gegeben wurde, die Gruppe der Tretinoin Tocoferil alleine gegeben wurde (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol), und die Gruppe, der Tretinointocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) zusammen mit VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) gegeben wurde.
Fig. 5 zeigt, daß 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup6; Mol) sogar bei alleiniger Verwendung eine NBT-reduzierende Fähigkeit bemerkenswert erhöhen konnte und diese Wirkung wesentlich stärker als die bei alleiniger Verwendung von Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) war. Fig. 5 zeigt ferner, daß 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) eine inhibierende Wirkung auf die Proliferation durch VD&sub3; bemerkenswert erhöhen kann und diese inhibierende Wirkung wesentlich wirksamer als bei der gemeinsamen Verwendung von Tretinoin Tocoferil (1,5 · 10&supmin;&sup5; Mol) und VD&sub3; (3 · 10&supmin;&sup9; Mol) war. Dementsprechend ist klar gezeigt worden, daß 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester die Differentiation von NB4-Zellen sehr stark induzieren und die Differentiation von NB4-Zellen durch VD&sub3; potenzieren kann.
Zusammengefaßt können die drei Arten der vorliegenden pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Leukämie die Proliferation von Leukämiezellen wesentlich wirksamer inhibieren und die · Differentiationsinduktion der Zellen bemerkenswert fördern. Darüber hinaus sind sie immer noch bei der Behandlung von Leukämie wirksam, sogar bei einer VD&sub3;-Serumkonzentration von 10&supmin;&sup9; Mol oder weniger, wobei diese Dosis keine Nebenwirkungen hervorruft. Außerdem kann eine Dosis von 9-cis-RA auf ein solches Niveau reduziert werden, daß keine Nebenwirkungen entwickelt werden, was sehr nützlich bei der Behandlung von Leukämie ist.

Formulierungsbeispiel 1

Weiche Kapseln für orale Verabreichung:

50 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester wurde mit 130 g Kokosnußöl zur Bildung einer homogenen Lösung gemischt. Getrennt wurde eine Gelatinelösung für eine Kapselbeschichtung aus 93 g Gelatine, 19 g Glycerol, 10 g D-Sorbitol (70 w/v%), 0,4 g Ethyl-p-hydroxybenzoat, 0,2 g Propyl-phydroxybenzoat und 0,4 g Titanoxid hergestellt. Die weichen Kapseln wurden aus den oben hergestellten zwei Lösungen nach einem manuellen Plattenpreßverfahren hergestellt, wobei jede Kapsel 180 mg 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester enthielt.

Formulierungsbeispiel 2

Injektionen:

5 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester, ein geeignetes Volumen Sojabohnenöl und 1 g Benzylalkohol wurden gemischt und dann zu einem Gesamtvolumen von 100 ccm mit Sojabohnenöl aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde unter aseptischen Bedingungen portionsweise in Ampullen injiziert, wobei jede Portion 2 ccm enthielt und die Ampullen nachfolgend versiegelt wurden.

Formulierungsbeispiel 3

Weiche Kapseln zur oralen Verabreichung:

50 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherofester und 5 ug VD&sub3; wurden mit 130 g Kokosnußöl zur Bildung einer homogenen Lösung gemischt. Getrennt wurde eine Gelatinelösung zur Kapselbeschichtung aus 93 g Gelatine,19 g Glycerol, 10 g D-Sorbitol (70 3/v%), 0,4 g Ethyl-p-hydroxybenzoat, 0,2 g Propyl-phydroxybenzoat und 0,4 g Titanoxid hergestellt. Die weichen Kapseln wurden aus den oben hergestellten beiden Lösungen gemäß einem manuellen Plattenpreßverfahren hergestellt, wobei jede Kapsel 180 mg 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester und 0,018 ug VD&sub3; enthielt.

Formulierungsbeispiel 4

Injektionen:

5 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester, 0,5 ug VD&sub3;, ein geeignetes Volumen an Sojabohnenöl und 1 g Benzylalkohol wurden gemischt und dann bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ccm mit Sojabohnenöl aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde unter aseptischen Bedingungen portionsweise in Ampullen gefüllt, wobei jede Portion 2 ccm enthielt und die Ampullen nachfolgend versiegelt wurden.

Formulierungsbeispiel 5

Weiche Kapseln zur oralen Verabreichung:

50 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester und 2,8 g 9-cis-RA wurden mit 130 g Kokosnußöl zur Bildung einer homogenen Lösung gemischt. Getrennt wurde eine Gelatinelösung zur Kapselbeschichtung aus 93 g Gelatine, 19 g Glycerol, 10 g D-Sorbitol (70 w/v%), 0,4 g Ethyl-p-hydroxybenzoat, 0,2 g Propyl-phydroxybenzoat und 0,4 g Titanoxid hergestellt. Die weichen Kapseln wurden aus den oben hergestellten zwei Lösungen nach einem manuellen Plattenpreßverfahren hergestellt, wobei jede Kapsel 180 mg 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester und 10 mg 9-cis-RA enthielt.

Formulierungsbeispiel 6

Injektionen:

5 g 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester, 280 mg 9-cis-RA, ein geeignetes Volumen Sojabohnenöl und 1 g Benzylalkohol wurden gemischt und dann bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ccm mit Sojabohnenöl aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde unter aseptischen Bedingungen portionsweise in Ampullen gefüllt, wobei jede eine Portion von 2 ccm enthielt und die Ampullen nachfolgend versiegelt wurden.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Leukämie, umfassend:

(a) als koaktiven Inhaltsstoff ein 9-cis-Retinoesäure-αtocopherolester, wiedergegeben durch die Formel (I)

(b) als koaktiven Inhaltsstoff eine Verbindung ausgewählt aus 1-α,25- Dihydroxyvitamin D&sub3; und 9-cis-Retinoesäure; und

(c) einen pharmazeutischen Träger oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel dafür.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin Bestandteil (b) 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei Bestandteil (b) 9-cis-Retinoesäure ist.

4. 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester der Formel (I), wie in Anspruch 1 wiedergegeben, zusammen mit 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; und/oder 9- cis-Retinoesäure zur therapeutischen Verwendung.

5. Produkt, enthaltend 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester der Formel (I), wie in Anspruch 1 wiedergegeben, zusammen mit 1-α,25- Dihydroxyvitamin D&sub3; und/oder mit 9-cis-Retinoesäure als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen, getrennten oder sequenziellen Verwendung bei der Behandlung von Leukämie.

6. Verwendung von 9-cis-Retinoesäure-α-tocopherolester, wiedergegeben durch die Formel (I),

bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Leukämie.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, bei der die tägliche Dosis an 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester für einen Erwachsenen von 10 mg bis 1200 mg beträgt.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7, bei der der 9-cis-Retinoeosäure-cttocopherolester zusammen mit 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; verabreicht wird.

9. Verwendung gemäß Anspruch 6, bei der die Dosis für 1-α,25- Dihydroxyvitamin D&sub3; eine Tagesdosis für einen Erwachsenen von 0,005 ug bis 5 ug ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 8, bei die tägliche Dosis an 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester für einen Erwachsenen von 10 mg bis 1200 mg ist und die tägliche Dosis an 1-α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; für einen Erwachsenen von 0,05 ug bis 5 ug.

11. Verwendung gemäß Anspruch 6, bei der der 9-cis-Retinoesäure-cxtocopherolester zusammen 9-cis-Retinoesäure verabreicht wird.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, bei der die Dosis von- 9-cis- Retinoesäure eine Tagesdosis für einen Erwachsenen von 1,0 mg bis 80 mg ist.

13. Verwendung gemäß Anspruch 11, bei der die tägliche Dosis von 9-cis- Retinoesäure-α-tocopherolester für einen Erwachsenen von 10 mg bis 1200 mg ist und die tägliche Dosis von 9-cis-Retinoesäure für einen Erwachsenen von 1,0 mg bis 80 mg.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, bei der die Leukämie eine akute promyelozytische Leukämie ist.