DE69700464T2

DE69700464T2 - Verfahren zur hemmung der leaderless-proteinausscheidung mittels herzglykosiden, deren aglykone, oder derivate

Info

Publication number: DE69700464T2
Application number: DE69700464T
Authority: DE
Inventors: Robert Florkiewicz
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 2000-04-06
Anticipated expiration: 2017-02-13
Also published as: WO1997028808A1; AU706644B2; EP0941733A2; ATE183922T1; US6107283A; US6071885A; US6281197B1; EP0941733A3; EP0828497B1; EP0828497A1; JPH11500454A; US5891855A; DE69700464D1; ES2140215T3; CA2242245A1; AU2123197A

Description

Eine Unterstützung für diese Erfindung erfolgte teilweise durch Gabe von Geldmitteln durch die Regierung durch NIH DK18811. Die Regierung kann an der Erfindung bestimmte Rechte haben.

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Inhibitoren von Leader-freiem Proteinexport und genauer gesagt die Verwendung von Herzglykosiden und Aglyconderivaten, um den Export von Leader-freien Proteinen in extrazelluläre Räume zu inhibieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Viele Proteine üben eine Wirkung auf Zellwachstum, Differenzierung und Entzündung durch Signaltransduktion aus, vermittelt durch Binden an einen Zelloberflächenrezeptor. Andere Proteine jedoch, wie Faktoren, die die Blutgerinselbildung initiieren oder dafür notwendig sind, wirken im Blut enzymatisch. Während diese Vorgänge im allgemeinen Teil normaler Prozesse sind, kann es, unter bestimmten Umständen, wünschenswert sein, die Wirkung bestimmter Proteine und die Wirkungen der nachfolgenden Signalübermittlung zu inhibieren. Zum Beispiel ist das durch einen Wachstumsfaktor, wie bFGF, der auf Melanom-Zellen wirkt, geförderte Tumorwachstum schädlich und führt oft zum Tode.
Ansätze, um bestimmte Proteine zu inhibieren, konzentrierten sich in erster Linie darauf, Protein-Substrat- oder Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen zu stören. Typischerweise umfaßt dies die Verwendung eines Antikörpers oder anderen Moleküls, das das Protein kompetitiv bindet, durch Verabreichung von Kompetitoren für die Rezeptorbindung, oder durch Proteaseverdau des Proteins. Ein alternativer Ansatz, der jedoch im allgemeinen nicht verfolgt wird, besteht darin, den Titer des Proteins durch Inhibieren seiner Expression auf der Ebene der Transkription oder Translation zu verringern. Verfahren zum Reduzieren von Proteintitern durch Inhibierender Transkription oder Translation des Proteins waren schwierig zu erreichen infolge der inhärenten Probleme, die spezifische Expression von einem oder einigen wenigen Proteinen zu inhibieren. Die Entdeckung, daß bestimmte Proteine, wie Wachstumsfaktoren, Entzündungsmediatoren und Mediatoren für Blutgerinnung durch einen nichtklassischen Sekretionsweg exportiert werden, erlaubt die Entwicklung spezifischer Inhibitoren für diese Proteine. Diese Proteine werden identifiziert durch das Fehlen einer hydrophoben Leader-Sequenz, die die Sekretion durch den klassischen Golgi/ER-Weg vermittelt. Man glaubt, daß diese Proteine aus einer Zelle durch Exocytose exportiert werden.
Diese Erfindung sieht Inhibitoren für den Export dieser Leader-freien Proteine, was die Kontrolle unerwünschter Proliferation und Entzündung erlaubt, ebenso wie andere damit im Zusammenhang stehende Vorteile vor.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht allgemein Verfahren zum Inhibieren des Exports von einem Leader-freien Protein aus einer Zelle vor, die das Protein exprimiert. In einem Aspekt der Erfindung wird der Export inhibiert durch Kontaktieren einer Zelle, die das Protein exprimiert, mit einem Herzglykosid. In bestimmten Ausführungsformen ist das Herzglykosid ausgewählt aus der Gruppe, die Digoxin, Strophanthin K, Digitoxin, Lanatosid A und Ouabain umfaßt. Bevorzugterweise ist das Herzglykosid Ouabain oder Digoxin.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren vorgesehen zum Inhibieren des Exports eines Leader-freien Proteins aus einer Zelle, die das Protein exprimiert, durch Kontaktieren der Zelle mit einem Aglykonderivat eines Herzglykosids. In bestimmten Ausführungsformen ist das Aglykonderivat ausgewählt aus der Gruppe, die Digoxigenin, Digitoxigenin und Uzarigenin umfaßt. Bevorzugterweise ist das Aglykonderivat Digoxigenin.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren vorgesehen zum Inhibieren des Exports von FGF-2 aus einer Zelle, die FGF-2 exprimiert, die Kontaktieren der Zelle mit einem Herzglykosid oder einem Aglykonderivat eines Herzglykosids umfassen. In einem noch weiteren Aspekt werden Verfahren vorgesehen zum Behandeln eines FGF vermittelten pathophysiologischen Zustandes in einem Patienten, die Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Herzglykosids oder Aglykonderivates eines Herzglykosids umfaßt und dadurch Verringern der Menge an FGF-2, die exportiert wird. In bestimmten Ausführungsformen ist der pa thophysiologische Zustand Melanom, Eierstockkarzinom, Teratokarzinom oder Neuroblastom.
In noch weiteren Aspekten werden Verfahren zum Inhibieren der Proliferation einer Zelle, die einen FGF-Rezeptor trägt, vorgesehen, die Kontaktieren der Zelle mit einem Herzglykosid oder einem Aglykonderivat eines Herzglykosids umfassen. In noch weiteren Aspekten werden Verfahren vorgesehen zum Behandeln von Komplikationen von Diabetes, die Kontaktieren einer Zelle mit einer inhibierenden Menge eines Herzglykosids oder Aglykonderivates umfassen.
Es werden auch Verfahren vorgesehen zum Inhibieren des Exports von Leader-freien Proteinen, die Behandeln von Zellen mit einer Verbindung umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Formel 1, Formel 2, Formel 3, Formel 4 oder Formel 5 umfaßt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden offensichtlich werden nach Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen. Verschiedene Literaturstellen werden unten angegeben, die detaillierter bestimmte Verfahrensweisen oder Zusammensetzungen (z. B. Plasmide etc.) beschreiben. Alle diese Literaturstellen sind in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Zeichnung der allgemeinen Struktur des Aglykonnukleus von verschiedenen Herzglykosiden.
Fig. 2 ist ein SDS-PAGE-Gel von Puls-markierten, immunpräzipitiertem zellulärem (Spuren, die mit C markiert sind) und extrazellulärem FGF-2 (Spuren, die mit M markiert sind) nach Behandlung ohne Ouabain (Tafel A) und mit Ouabain (Tafel B).
Fig. 3 ist ein SDS-PAGE-Gel von Puls-markierten, immunpräzipitiertem zellulärem (Spuren, die mit C markiert sind) und extrazellulärem (Spuren, die mit M markiert sind) menschlichem Corion-Gonadatrophin α nach Behandlung ohne Ouabain (Tafel A) und mit Ouabain (Tafel B).
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Quantifizierung des FGF-2-Exports nach Behandlung mit Ouabain zeigt.
Fig. 5 ist ein Photo von immunpräzipitiertem FGF-2 und HCG-α von zellulären (C) und Medien (M)-Fraktionen nach metabolischer Markierung. COS-1-Zellen wurden mit p18dx oder hCG-α transfiziert und metabolisch in Medium alleine (A), Brefedin A (B) oder 2- Deoxy-D-Glukose plus NaN&sub3; (C) markiert. FGF-2 und HCG-α wurden immunpräzipitiert aus Zellen (C) oder Medium (M), einer Elektrophorese unterzogen und autoradiographiert.
Fig. 6 ist ein Western Blot, der FGF-2 intrazellulär oder auf der Zelloberfläche in CF18- und COS-Zellen vom Wildtyp zeigt. Intrazelluläre Proteine werden gereinigt durch Heparin- Sepharose. FGF-2 wird durch einen Pfeil markiert, Molekulargewichtsstandards sind auf der rechten Seite angegeben.
Fig. 7A und 7B sind Western Blot und ein Diagramm, das die Ergebnisse des Blots quantifiziert. Für den Blot werden CF18-Zellen mit Carbonatpuffer gewaschen und in Gegenwart oder Abwesenheit von Ouabain inkubiert. A, ein typischer Western Blot von Zelloberflächenprotein, FGF2 ist markiert durch einen Pfeil, Molekulargewichtsstandards sind auf der rechten Seite. CTL, Kontrolle; 48, kultiviert für 48 Stunden; +OUA, kultiviert für 48 Stunden in Anwesenheit von Ouabain. B, das Mittel + Standardabweichung des auf intrazellulären FGF2 eingestellten Signals. *, p< 0,002 gegenüber Kontrolle; +, p< 0,002 gegenüber 48 Stunden (n = 6).
Fig. 8 ist eine Graphik, die den freigesetzten FGF2 (als Prozent der Kontrolle) von normalen Chondrocyten zeigt, die in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Ouabain- Konzentrationen inkubiert wurden. Die Balken zeigen die Standardabweichung an.
Fig. 9A und 9B sind Autoradiogramme einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1- Antikörper nach Transfektion von COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 codiert. C, Zellextrakt; M, Zell-konditioniertes Medium.
Fig. 10 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1-Antikörper nach Transfektion von COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 exprimiert. C, Zellextrakt; M, Zell-konditioniertes Medium.
Fig. 11 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1-Antikörper nach Transfektion mit COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 exprimiert. Die COS-Zellen werden mit 5 mM Ouabain behandelt. C, Zellextrakt; M, Zell-konditioniertes Medium.
Fig. 12 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1-Antikörper nach Transfektion mit COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 exprimiert. C, Zellextrakt; M, Zellkonditioniertes Medium.
Fig. 13 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1-Antikörper nach Transfektion mit COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 exprimiert. Zellen werden behandelt mit 5 mM Ouabain. C, Zellextrakt; M, Zell-konditioniertes Medium.
Fig. 14 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation mit anti-IL-1-Antikörper nach Transfektion mit COS-Zellen mit einem Plasmid, das IL-1 exprimiert. COS-Zellen werden entweder behandelt mit 5 mM Ouabain oder erhalten keine Behandlung. C, Zellextrakt; M, Zell-konditioniertes Medium.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Als ein Hilfsmittel, um die Erfindung zu verstehen, werden Definitionen bestimmter hierin verwendeter Begrifflichkeiten vorgesehen.
"Herzglycosid" bezeichnet eine Gruppe von Verbindungen, die strukturell verwandt sind. Strukturell sind diese Verbindungen abgeleitet von dem Cyclopentanoperhydro-Phenanthren- Nukleus, der für Steroid-Verbindung charakteristisch ist, weisen einen fünf-gliedrigen ungesättigten Lacton-Ring oder einen sechs-gliedrigen doppelt ungesättigten Lacton-Ring an C17 von Ring D, eine Hydroxylgruppe an C3 in Ring A zum Binden mittels einer Ether-Bindung an einen oder mehreren Zuckerresten und eine Hydroxygruppe an C14 auf (Fig. 1). Die Aglykon-Derivate von Herzglycosiden weisen eine ähnliche Struktur auf, es fehlt ihnen jedoch die für die Herzglycoside charakteristischen Kohlenhydrate. Die Aglykon-Derivate sind auch in der vorliegenden Erfindung nützlich. Typische Beispiele dieser Gruppe finden sich in einer Anzahl von botanischen Quellen, ebenso wie in Säugetieren. (Siehe; A Survey of Cardiac Glycosides and Genins, University of South Carolina Press, 1961.) Die Herzglycoside umfassen Ouabain-ähnliche/Digoxin-ähnliche Verbindungen, die aus Säugetieren isoliert worden sind (Siehe US-Patent Nr. 4,780,314).
"Leader-freies-Protein" bezeichnet ein Protein oder Polypeptid, das in einer extrazellulären Umgebung ankommt, dem aber eine kanonische Leader-Sequenz fehlt. Eine Leader-Sequenz vermittelt die Translokation in das ER und wird durch Signalerkennungsproteine (SRP) erkannt. Proteine in der extrazellulären Umgebung umfassen sekretierte Proteine, die in extrazellulären Räumen gefunden werden, ebenso wie Proteine, die Membran-gebunden sind, aber kein integrales Membranprotein. Die prototypische Leader-Sequenz weist eine aminoterminale positiv geladene Region, eine zentrale hydrophobe Region und eine polare carboxyterminale Region auf (siehe von Heijne, J. Membrane Biol. 115: 195-201, 1990). Leader-freie Proteine umfassen FGF-1, FGF-2, Interleukin 1α, Interleukin 1β, Vas deferens-Protein, Plättchen-abgeleiteter Endothelzellen-Wachstumsfaktor, ciliarer neurotropher Faktor, Thymosin, Parathymosin, 14,5 kDa Lektin (L14), Transglutaminase, Thioredoxin-ähnliches Protein, Hüftnervenwachstums-fördernde Aktivität, Faktor XIIIa und int-2. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfassen Leader-freie Proteine natürlicherweise vorkommende Proteine ebenso wie Proteine, die so konstruiert sind, daß ihnen eine Leader-Sequenz fehlt, die aber exportiert werden. Die Begriffe "Signal-Sequenz", "Leader-Peptid" und "Leader-Sequenz" werden hierin in austauschbarer Weise verwendet.
"Export" eine Proteins bezeichnet einen metabolisch aktiven Prozeß des Transportierens eines translatierten zellulären Produkts zu den extrazellulären Räumen oder an die Zellmembran durch einen Mechanismus, der verschieden ist von einem solchen mittels einer Leader- Sequenz.

Leader-freie-Proteine

Wie oben festgehalten sind Leader-freie Proteine Proteine, die in der extrazellulären Umgebung ankommen, denen aber eine Signal-Sequenz fehlt, die so funktioniert, das die Translokation eines Proteins in das ER durch SRP-Erkennung vermittelt wird. Typischerweise werden diese Proteine zuerst identifiziert, da ihrem primären Translationsprodukt eine kanonische hydrophobe Leader- oder Signalsequenz fehlt, die gewöhnlicherweise am N-Terminus des primären Translationsproduktes angeordnet ist und die beim Transportprozeß durch den Golgi/ER verwendet wird. Eine Leader-Sequenz weist drei distinkte Domänen auf: eine amino terminale positiv geladene Region mit einer Länge von etwa 1-5 Resten; eine zentrale, hydrophobe Region mit einer Länge von etwa 7-15 Resten; und eine polare carboxyterminale Domäne mit einer Länge von etwa 3-7 Resten (von Heijne, aaO). Die hydrophobe Zentralregion ist entscheidend.
Mehrere Leader-freie Proteine sind identifiziert worden auf der Grundlage ihrer Anordnung in der extrazellulären Umgebung, Transport durch einen Mechanismus, der verschieden ist von dem durch den/das Golgi/ER und Fehlen einer Leader-Sequenz. Derartige Proteine schließen ein IL-1α (SEQ ID NOS: 4,5; Precursor, reife Formen), IL-1β (SEQ ID NOS: 6,7; Precursor; reife Formen), FGF-1, FGF-2 (SEQ ID NO : 1,2; cDNA, 18 kD-Form), PD-ECGF (Plättchen abgeleiteter Endothelzellen-Wachstumsfaktor), CNTF (ciliärer nutrotropher Faktor), Hüftnervenwachstums-fördernde Aktivität, Vas deferens-Protein, Transglutaminase, L-14-Lektin, Faktor XIIIa, Thioredoxin-ähnliches Protein (ADF), Thymosin, Parathymosin und int-2.
Andere Leader-freie Proteine, die exportiert werden, können identifiziert werden durch einen zweistufigen Test: (1) Identifizierung des Proteins in extrazellulären Räumen, einschließlich an der Membran und (2) Brefeldin-resistenter Export. Eine vorläufige Bewertung, um mögliche Leader-freien Proteine zu identifizieren, kann durchgeführt werden durch Begutachtung der Aminosäuresequenz des primären Translationsproduktes. Ein Vergleich der aminoterminalen Sequenz mit anderen bekannten Leader-Sequenzen oder Identifizierung der prototypischen Mustersequenz, wie hierin beschrieben (von Heijne, aaO.), liefert ein Mittel, um potentielle Leader-freie Proteine zu klassifizieren. Wie oben diskutiert sind Leader-Sequenzen etwa 15-25 Aminosäuren lang und enthalten zumindestens eine zentrale Region aus 7-15 hydrophoben Resten, wie Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Phenylalanin, Methionin, Threonin, Serin, Prolin, Cystein, Alanin, Tyrosin und Tryptophan. Eine jegliche primäre Translationssequenz eines Proteins, dem eine derartige Sequenz fehlt, ist ein Kandidat für ein exportiertes Leader-freies Protein.
Wie oben festgehalten beruht die Identifizierung eines Proteins als ein Leader-freies Protein auf dem zweistufigen Test, der Entdeckung des Proteins in der extrazellulären Umgebung und der Brefeldin-Resistenz.
Der erste Test wird durchgeführt, um das Protein extrazellulär nachzuweisen. Für diesen Test sind Testzellen erforderlich, die ein Leader-freies Protein exprimieren. Entweder können die Testzellen natürlicherweise das Protein produzieren oder produzieren es bevorzugterweise von einem transfizierten Expressionsvektor. Für FGF-2-Expression sind COS-Zellen für die Transfektion bevorzugt. Für Expression von IL-1 sind p388D1-Zellen bevorzugt. Nach Expression wird das Protein durch irgendeines einer Reihe von gut bekannten Verfahren und Verfahrensweisen nachgewiesen. Derartige Verfahren umfassen Färben mit Antikörpern in Verbindung mit Flußcytometrie, Konfokal-Mikroskopie, Bildanalyse, Immunpräzipitation von Zellmedium, Western Blot von Zellmedium, ELISA oder Bioassay. Ein bevorzugter Test während des anfänglichen Screenens ist ELISA. Irgendein Kandidat wird bestätigt durch einen dieser anderen Tests, bevorzugt durch Immunpräzipitation von Zellmedium nach metabolischer Markierung. Kurz gesagt werden Zellen, die mögliche Leader-freie Proteine exprimieren, Puls-markiert für 15 Minuten mit ³&sup5;S-Methionin und/oder ³&sup5;S-Cystein in Methionin- und/oder Cystein-freiem Medium und verfolgt in mit überschüssigem Methionin und/oder Cystein versetztem Medium. Mediumfraktionen werden gesammelt und durch Zentrifugation in einer Mikrofuge geklärt. Lyse-Puffer, der 1% NP-40, 0,5% Deoxycholat (DOC), 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10 nM PMSF, 10 ng/ml Aprotinin, 10 ng/ml Leupeptin und 10 ng/ml Pepstatin enthält, wird zu dem geklärten Medium hinzugegeben, um Proteasen zu inhibieren. Antikörper gegen das mögliche Leader-freie Protein wird hinzugesetzt und nach Inkubation in der Kälte wird ein präzipitierender zweiter Antikörper oder Immunglobulin-bindendes Protein, wie Protein A-Sepharose® oder GammaßindTM-Sepharose® für die weitere Inkubation hinzugegeben. Parallel wird, als eine Kontrolle, ein Vektor, der ein cytosolisches Protein codiert, co-transfiziert und ein Antikörper gegen ein bekanntes cytosolisches Protein wird bei Immunpräzipitationen verwendet. Immunkomplexe werden pelletiert und mit eiskaltem Lyse-Puffer gewaschen. Komplexe werden weiter mit eiskaltem IP-Puffer gewaschen (0,15 M NaCl, 10 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 1% DOC, 1% NP-40, 0,1% SDS). Immunkomplexe werden direkt in SDS-Gel-Probenpuffer eluiert und in SDS-PAGE elektrophoretisiert. Der Prozentsatz von Acrylamid wird abhängen vom Molekulargewicht des Leader-freien Proteins. Das Gel wird für Fluorographie verarbeitet, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Proteine, die verglichen mit der cytosolischen Proteinkontrolle in höheren Mengen in Medium exprimiert werden, werden auf Brefeldin-resistenten Export getestet.
Brefeldin-Resistenz wird gemessen an Zellen, die ein Leader-freies Protein exprimieren, wie oben beschrieben. Kurz gesagt werden Zellen, wie COS-1-Zellen, mit einem Expressionsvektor transfiziert; der die Expression des Leader-freien Proteins, wie FGF-2, steuert. Etwa 2 Tage später werden die transfizierten Zellen metabolisch Puls-markiert für 15 Minuten mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein in Methionin- und Cystein-freien Medien. Die Markierung wird entfernt und die Zellen weitere inkubiert in Medium, das 15 ug/ml Brefeldin A enthält. Zur Quantifizierung des FGF-2-Exports werden 25 ug/ml Heparin zu dem Nachweis-Medium zugegeben. Das Fehlen einer statistisch signifikanten Verringerung des FGF-2-Exportes zeigt an, daß der Protein-Export Brefeldin A-resistent ist.

Inhibitoren

Wie oben beschrieben, sind Herzglykoside und Aglykone Inhibitoren für den Export von Leader-freien Proteinen. Herzglykoside und ihre Aglykonderivate sind abgeleitet von dem Cyclopentanoperhydro-Phenanthren-Nucleus, der für Steroidverbindungen typisch ist (Fig. 1). An C 17 von Ring D befindet sich ein fünf-gliedriger ungesättigter Lactonring oder ein sechs-gliedriger, doppelt ungesättigter Lactonring. An C3 von Ring A befindet sich eine Hydroxylgruppe, um einen oder mehrere Zuckerreste durch eine Etherbindung anzubinden, und an C14 existiert eine Hydroxygruppe. Zusätzlich können andere C-Atome, wie C16, Seitengruppen aufweisen. Die Zuckergruppe an C3 umfaßt Monosaccharide, einschließlich Glukose, Rhamnose, Cymarose, Di-, Tri- und Polysaccharide, einschließlich Cymarose-β-D- Glukose, L-Rhamnose-D-Glukose, Tridigitoxose, Digitoxose&sub3;-D-Glukose und dergleichen, ebenso wie Saccharidderivate. Aglykonderivate weisen eine ähnliche Struktur auf wie Herzglykoside, es fehlt ihnen aber der/die Kohlenhydratrest(e). Es können jedoch andere Seitengruppen an der C3-Position in Aglykonderivaten substituiert sein. Zusammen werden Herzglykoside und Aglykonderivate als Cardenolide klassifiziert.
Herzglykoside, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Lanatosid A, Desacetyllanatosid A, Actyl-Digitoxin, Digitoxin, Lanatosid C, Desacetyllanatosid C, Digoxin, Strophanthosid, K-Strophanthin, Ouabain, Seillaren A, Proscillaridin A, Uzarin, Digitoxose, Gitoxin, Strophantidin-3β-Digitoxosid, Strophantidin-α- L-Rhamnopyranosid, Strophanthidol, Oleandrin, Acovenosid A, Strophanthidin- Digilanobiosid, Strophanthidin-D-Cymarosid, Digitoxigenin-L-Rhamnosid-Digitoxigenin- Theretosid und dergleichen. Aglykone umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Strophanthidin, Digitoxigenin, Uzarigenin, Digoxigenin, Digoxigenin-3,12-Diacetat, Gitoxigenin, Gitoxigenin-3-Acetat, Gitoxigenin-3,16-Diacetat, 16-Acetyl-Gitoxigenin, Acetyl- Strophanthidin, Ouabagenin; 3-Epidigoxigenin und dergleichen. Bevorzugterweise ist das Herzglykosid Ouabain, Digoxin oder Digitoxin. Am bevorzugtesten ist das Herzglykosid Ouabain und das Aglykonderivat Strophanthidin.
Herzglykoside und Aglykone können gereinigt werden aus Organismen, wie Pflanzen, oder aus menschlichem Serum oder Urin (siehe zum Beispiel Hinweise im Merck Index, Zehnte Ausgabe; PCT-Anmeldung WO 91/17176; US-Patent No. 4,780,314; Kelly et al., Kidney Int'l 30: 723-729, 1986). Die Verbindungen können auch kommerziell erworben werden (z. B. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Calbiochem, San Diego, CA).

Tests zum Nachweisen der Inhibierung des Exports von Leader-freien Proteinen

Herzglykosid- oder Aglykonderivat-Inhibitoren des Exports von Leader-freien Proteinen werden identifiziert durch einen der hierin beschriebenen Tests. Kurz gesagt wird eine Zelle, die ein Leader-freies Protein exprimiert, mit dem Herzglykosid oder Aglykonderivat behandelt und die Menge von Leader-freiem Protein, das als ein extrazelluläres Protein nachgewiesen wird, wird verglichen mit der Menge, die ohne Behandlung nachgewiesen wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung muß ein Inhibitor drei Kriterien erfüllen: (1) er blockiert den Export eines Leader-freien Proteins, (2) er blockiert nicht den Export eines Proteins mit einer Leader-Sequenz, und (3) er fördert nicht die Expression eines cytosolischen Proteins in der extrazellulären Umgebung.
In einem jeden der hierin beschriebenen Tests können die Testzellen die Leader-freien Proteine entweder natürlich oder nach Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls exprimieren, das das Protein codiert. In ähnlicher Weise kann die Expression des sekretierten Proteins und cytosolischen Proteins natürlich sein oder nach Transfektion eines Vektors erfolgen, der das Protein codiert. Die rekombinante Expression des Leader-freien Proteins wird bevorzugt. Irgendeines der oben beschriebenen Leader-freien Proteine, chimäre Leader-freie Proteine (d. h. Fusion von Leader-freiem Protein mit einem weiteren Protein oder Proteinfragment) oder Protein-Sequenzen, die so konstruiert sind, daß ihnen eine Leader-Sequenz fehlt, können verwendet werden. Sekretierte Proteine, die durch eine Leader-Sequenz exportiert werden, sind gut bekannt und umfassen menschliches Choriongonadatropin (HCGα) (SEQ ID NO: 3), Wachstumshormon, Hepatocyten-Wachtsumsfaktor, Transferrin, Nervenwachstumsfaktor, Vaskularendothel-Wachstumsfaktor, Ovalbumin und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor. In ähnlicher Weise sind cytosolische Proteine gut bekannt und umfassen Neomycin, β- Galactosidase, Actin und andere Cytoskelettproteine, Enzyme, wie Proteinkinase A oder C. Die nützlichsten cytosolischen oder sekretierten Proteine sind jene, die leicht in einem herkömmlichen Test, wie einem ELISA, gemessen werden. Die drei Proteine können natürlich oder durch Transfektion in den Testzellen exprimiert werden, oder getrennt in Wirtszellen. Die Proteine können vorübergehend oder von stabil transformierten Zellen exprimiert werden.
Lediglich um ein Beispiel anzugeben, wird ein Konstrukt beschrieben, das die 18 kD-Isoform von FGF-2 enthält. Plasmid 18dx codiert die 18 kD Isoform von FGF-2, die von der menschlichen Wildtyp-FGF-2-cDNA abgeleitet wurde, wie kürzlich beschrieben (Florkiewicz und Sommer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3978, 1989). Die FGF-2-Sequenz wurde 11 bp 5' des ATG-Codons für die 18 kD-Isoform verkürzt. Somit kann nur die 18 kD-Form exprimiert werden. Ein Fragment, das die cDNA enthält, wurde in pJC 119 inseriert, einem Expressionsvektor auf der Basis von SV-40. Es wird offensichtlich sein, daß andere Expressionsvektoren austauschbarerweise verwendet werden können und daß die Auswahl des Vektors teilweise von der zu transfizierenden Wirtszelle abhängen wird. Die FGF-2-cDNA wurde exprimiert in COS-Zellen unter Verwendung eines Expressionsvektors auf der Basis von SV-40. Der Vektor, pJC119 (Sprague et al., J. Virol. 45: 773, 1983), ist ein Vektor auf der Basis von SV-40, der den späten Promotor von SV-40 verwendet, um die Expression des inserierten Gens zu kontrollieren. COS-Zellen wurden ausgewählt, da sie normalerweise sehr niedrige Titer an FGF-2 exprimieren und, als solche, die geeignete zelluläre Maschinerie für den Export dieses Leader-freien Proteins besitzen.
Andere, oben beschriebene Leader-freien Proteine können in Konstrukten anstelle von FGF-2 verwendet werden. DNA-Moleküle, die diese Proteine codieren, können mittels herkömmlicher Verfahren, wie Genbankscreening, PCR-Amplifikation und Klonieren, oder von der ATCC/NIH-Hinterlegungsstelle von menschlichen und Maus-DNA-Sonden erhalten werden. Nukleotid-Sequenzen dieser Proteine sind allgemein erhältlich von Genbank und EMBL- Datenbanken oder Publikationen.
Es wird anerkannt werden, daß andere Zelltypen, Vektoren, Promotoren und andere Elemente, die für die Expression verwendet werden, leicht ersetzt werden können unter Anwendung gut bekannter Prinzipien. Zumindest muß ein Vektor-Konstrukt, das das Leader-freie Protein enthält, eine Promotor-Sequenz aufweisen, die in der Zielzelle aktiv ist. Optional und bevorzug terweise enthält das Konstrukt einen Enhancer, einen Transkriptionsterminator und einen selektierbaren Marker. Derartige Vektoren werden so ausgewählt, daß sie für die Spezies oder für den Gewebetyp der transfizierten Zelle geeignet sind. Die Zellen können von Säugetier-, Vogel- oder andere eukaryontische Zellen, einschließlich Hefe, stammen.
Säugetierzellen, die geeignet sind, um die vorliegende Erfindung auszuführen, umfassen, unter anderem, COS (ATCC No. CRL 1650), BHK (ATCC No. CRL 6281), CHO (ATCC No. CCL 61), HeLa (ATCC No. CCL2), 293 (ATCC No. 1573), NS-1 (ATCC No. T1B18) und Hep G2 (ATCC No. HB 8065).
Es kann eine große Vielzahl von Promotoren verwendet werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Die Auswahl des Promotors wird, zumindest teilweise, von der Empfängerzellinie für die Transfektion abhängen. Beispielsweise können Promotoren, wie der oben beschriebene SV-40-Promotor, MoMuL V LTR, RSV LTR, adenoviraler Promotor, Metallothionenin-Gen-Promotor, unmittelbarer früher Cytomegalovirus-Promotor oder später Cytomegalovirus-Promotor verwendet werden. Es kann auch ein gewebespezifischer Promotor verwendet werden, solange er in der Zielzelle aktiviert ist. Zum Beispiel kann der Immunglobulin-Promotor verwendet werden, um Gene in B-Lymphozyten zu exprimieren. Bevorzugte Promotoren exprimieren das Leader-freie Protein auf hohem Niveau.
Tests, um Leader-freie Proteine, sekretierte Proteine und cytosolische Proteine nachzuweisen, umfassen Immunpräzipitation von Proteinen, die in einem Pulse-Chase-Verfahren markiert sind, ELISA, Avidin-Präzipitation von Zelloberflächenproteinen, die biotinyliert sind, Western Blot, biologische Tests und phagokinetische Systeme. In all diesen Tests werden Testzellen, die ein Leader-freies Protein exprimieren und exportieren, mit und ohne dem Kandidaten-Inhibitor inkubiert.
Immunpräzipitation ist ein bevorzugter Test, um die Inhibierung zu bestimmen. Kurz gesagt werden für die Immunpräzipitation Zellen, die ein Leader-freies Protein von einem eingeführten Vektorkonstrukt exprimieren, mit ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;S-Cystein für eine kurze Zeitspanne, typischerweise 15 Minuten, in Methionin- und Cystein-freiem Zellkulturmedium markiert. Nach Puls-Markierungen werden die Zellen mit einem Überschuß an unmarkiertem Methionin und Cystein plus Heparin supplementiertem Medium gewaschen, wenn das Leader-freie Protein Heparin-bindend ist. Die Zellen werden dann in demselben Nachweismedi um für verschiedene Zeitspannen inkubiert. Kandidaten-Inhibitoren werden zu Kulturen zu verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Der Kulturüberstand wird gesammelt und geklärt. Die Überstände werden mit anti-FGF-2-Immunserum oder einem monoklonalen antikörper inkubiert, gefolgt von einem Entwicklungsreagens wie Staphylococcus aureus Cowan- Stamm I, Protein A-Sepharose® oder Gamma-bindTM-G-Sepharose®. Immunkomplexe werden durch Zentrifugation pelletiert, in einem Puffer gewaschen, der 1% NP-40 und 0,5% Deoxycholat, EGTA, PMSF, Aprotinin, Leupeptin und Pepstatin enthält. Die Präzipitate werden dann gewaschen in einem Puffer, der Natriumphosphat, pH 7,2, Deoxycholat, NP-40 und SDS enthält. Die Immunkomplexe werden in einen SDS-Gel-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE getrennt. Das Gel wird für die Fluorographie verarbeitet, getrocknet und gegenüber Röntgenfilm exponiert.
Alternativ wird ein ELISA verwendet, um die Menge an FGF-2 oder anderen Leader-freien Proteinen in Zellkulturüberständen nachzuweisen oder zu quantifizieren. Kurz gesagt werden, wenn FGF-2 das Leader-freie Testprotein ist, Platten mit 96 Näpfen mit einem anti-FGF-2- Antikörper beschichtet, gewaschen und Kulturüberstand zu den Näpfen zugegeben. Nach Inkubation und Waschen wird ein zweiter Antikörper gegen FGF-2 hinzugegeben. Nach weiterer Inkubation wird ein Entwicklungsreagens hinzugefügt und die Menge an FGF-2 bestimmt unter Verwendung eines ELISA-Platten-Lesegerätes. Das Entwicklungsreagens ist typischerweise ein anti-Isotyp-Antikörper, der mit einem Enzym gekoppelt ist, wie Meerrettich- Peroxidase, das mit einem Substrat reagiert, was zu einer kolorimetrischen Reaktion führt. Es wird anerkannt werden, daß anstelle daß ein zweiter Antikörper verwendet wird, der an ein Enzym gekoppelt ist, der anti-FGF-2-Antikörper direkt an die Meerrettich-Peroxidase oder ein anderes äquivalentes Nachweisreagens gekoppelt sein kann. Sofern erforderlich, können die Zellüberstände konzentriert werden, um die Nachweisgrenze zu erhöhen.
Alternativ kann konzentrierter Überstand elektrophoretisiert werden auf einem SDS-PAGE- Gel und auf einen festen Träger überführt werden, wie Nylon oder Nitrozellulose. Das Leader-freie Protein wird dann durch einen Immunoblot nachgewiesen (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Leader-freie Protein, der eine Isotopen- oder nicht-Isotopen-Reportergruppe enthält. Diese Reportergruppen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Enzyme, Cofaktoren, Farbstoffe, Radioisotope, lumineszierende Moleküle, fluoreszierende Moleküle und Biotin. Bevorzugterweise ist die Reportergruppe ¹²&sup5;I oder Meerrettich-Peroxidase, die durch Inkubation mit 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthioazolinsulfonsäure nachgewiesen werden kann.
Wie hierin diskutiert, kann ein exportiertes Leader-freies Protein mit der Zellmembran assoziiert sein. Zum Beispiel exportieren COS-Zellen, die stabil transformiert sind mit einem Vektor, der FGF-2 exprimiert, FGF-2, setzen aber das Protein nicht in das Kulturmedium frei. Zelloberflächen-assoziierte Leader-freie Proteine können getestet werden durch irgendein Verfahren, das konstruiert oder angepaßt ist, um Zelloberflächenproteine nachzuweisen, wie Fluoreszenz-markierte Antikörper-Markierungsverfahren und Biotinylierung von Oberflächenproteinen nach Avidin- oder Streptavidin-Präzipitation. Kurz gesagt werden für die Biotinylierung Zellen im Dunkeln für eine kurze Zeit mit einem Biotin inkubiert, das in der Lage ist, ein Addukt zu bilden (z. B. NHS-ss-Biotin; Pierce Chemicals), gewaschen und lysiert. Das Lysat wird dann mit Streptavidin über Nacht inkubiert. Die Streptavidin-Komplexe werden durch Zentrifugation aufgearbeitet und auf einem Acrylamidgel elektrophoretisiert. Die intrazellulären Proteine können im Überstand aufgearbeitet und wie hierin beschrieben verarbeitet werden. Anstelle von Biotin kann eine andere reaktive Verbindung verwendet werden, die einen korrespondierenden Antikörper oder Bindungsmolekül aufweist.
Ein alternativer Test, ein Bioassay, kann durchgeführt werden zum Quantifizieren der Menge des in ein Zellmedium exportierten Leader-freien Proteins. Zum Beispiel kann die Bioaktivität des 18kD FGF-2 gemessen werden durch einen Proliferationstest, wie den Einbau von mit Tritium versehenem Thymidin. Kurz gesagt werden Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der FGF-2 enthält, für etwa 30 Stunden inkubiert, während dessen ein Kandidaten-Inhibitor hinzugegeben ist. Nach dem Inkubieren werden Zellen in ein Medium mit geringem Serumgehalt für eine weitere 16-stündige Inkubation gegeben. Das Medium wird entfernt und durch Zentrifugation geklärt. Ein Lysepuffer, der Protease-Inhibitoren enthält, wird hinzugegeben. FGF-2 wird angereichert durch Binden an Heparin-Sepharose® CL-6B und mit 3,0 M NaCl eluiert, nachdem nicht-FGF-2-Proteine mit 1,0 M NaCl eluiert sind. Die Bioaktivität von FGF-2 wird dann gemessen durch Hinzufügen verschiedener Mengen des Eluats zu kultivierten ruhenden 3T3-Zellen. Mit Tritium versehenes Thymidin wird zu dem Medium hinzugegeben und TCA-präzipitierbare Zähler etwa 24 Stunden später gemessen. Gereinigter rekombinanter menschlicher FGF-2 kann als ein Standard verwendet werden.
Für Leader-freie Proteine, die Zellmotilität verursachen, wie FGF-2, kann ein phagokinetischer Systemtest verwendet werden, um die Menge an exportiertem Leader-freiem Protein zu bestimmen (Mignatti et al., J. Cellular Physiol. 151: 81-93, 1992). In diesem Test erlaubt man den Zellen zu wandern und Mikroskop-Deckglas, das mit kolloidalem Gold beschichtet ist. Bei Dunkelfeldbeleuchtung erscheinen die Goldpartikel als stark lichtbrechende Partikel vor einem schwarzem Hintergrund. Wenn eine Zelle auf das Substrat wandert, schiebt es die Goldpartikel zur Seite und produziert eine dunkle Spur. Ein Bildanalysegerät kann verwendet werden, um die Länge der Spuren zu messen. Unter Bedingungen korreliert die Zellmotilität direkt mit der Menge des durch die Zellen produzierten FGF-2. Die Wahl des Bioassays wird, zumindestens teilweise, von dem getesteten Leader-freien Protein abhängen.
In einem jeden dieser Tests inhibiert ein Herzglycosid oder Aglykonderivat den Export, wenn in dem durchgeführten Test mit dem Inhibitor eine statistisch signifikante Verringerung der Menge an extrazellulär nachgewiesenem Protein verglichen mit dem Test, der ohne Inhibitor durchgeführt wird, auftritt. Bevorzugterweise verringert der Inhibitor den Export des Leaderfreien Proteins um wenigstens 50%, sogar bevorzugter um 80% oder mehr, und ebenso bevorzugterweise in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Zusätzlich sollte es keine statistisch signifikante Wirkung geben betreffend des Auftretens von entweder dem sekretierten Protein oder dem cytosolischen Protein. Bevorzugterweise gibt es eine Erhöhung oder Verringerung des Auftretens dieser zwei Proteine um weniger als 10%.

Verabreichung

Wie oben beschrieben ist ein Inhibitor des Exports eines Leader-freien Proteins nützlich bei der Behandlung von Tumoren, Inhibieren der Proliferation von Zellen, einschließlich glatter Muskelzellen, die Restenose verursachen, und Behandeln von Komplikationen von Diabetes, neben anderen Verwendungen. Behandlung bedeutet, daß Symptome verringert sein können oder das Fortschreiten der Erkrankung oder der Zustände angehalten oder verzögert wird. Zu behandelnde Zellen werden in Kontakt gebracht mit einem Herzglykosid oder Glykonderivat eines Herzglykosids mit einer therapeutisch wirksamen Dosis. Das Kontaktieren kann bewirkt werden durch Inkubieren von Zellen ex vivo oder in vivo, wie durch topische Behandlung, Abgabe durch spezifische Träger oder durch vaskuläre Versorgung.
Die Konjugate können hierin formuliert werden zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, die geeignet sind für topische, lokale, intravenöse und systemische Verabreichung. Zeitfreisetzungsformulierungen sind auch wünschenswert. Wirksame Konzentrationen von einem oder mehreren der Konjugate werden mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger oder Vehikel gemischt. Die Konzentrationen oder Mengen der Konjugate, die wirksam sind, erfordern die Abgabe einer Menge, nach Verabreichung, die die Symptome verbessert oder die Krankheit behandelt. Typischerweise werden die Zusammensetzungen für Einzeldosisverabreichung formuliert. Therapeutisch wirksame Konzentrationen und Mengen können empirisch bestimmt werden, indem die Konjugate in bekannten in vitro und in vivo Systemen getestet werden, wie jene, die hierin beschrieben sind. Dosierungen für Menschen oder andere Tiere können dann davon extrapoliert werden.
Kandidatentumoren für die hierin beschriebene Behandlung umfassen jene mit Rezeptoren für FGF. Derartige Tumoren umfassen Melanome, Teratokarzinome, Eierstockkarzinome, Blasentumore und Neuroblastome.
Andere Erkrankungen, Störungen und Syndrome sind für die Behandlung geeignet. Diabetische Komplikationen, wie diabetische Retinopathie, Restenose, polycystische Nierenerkrankung und Atherosklerose sind auch Kandidaten für derartige Behandlungen. Zellen im Auge, in der Niere und den peripheren Nerven, die bei Diabetes betroffen sind, können mit den hierin beschriebenen Konjugaten behandelt werden.
Pharmazeutische Träger oder Vehikel, die für Verabreichung der hierin vorgesehenen Konjugate geeignet sind, umfassen jegliche derartige Träger, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, die für die spezielle Art der Verabreichung geeignet sind. Zusätzlich kann der Inhibitor als der einzige pharmazeutisch aktive Bestandteil in der Zusammensetzung formuliert sein, oder kann mit weiteren aktiven Bestandteilen kombiniert sein.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden für die Verabreichung über eine Vielzahl verschiedener Routen. Lokale Verabreichung der Herzglykoside oder Aglykon-Derivate wird bevorzugt. Der Inhibitor kann mit geeigneten Bindemitteln, wie Salzen, Puffern, Stabilisatoren und dergleichen gemischt werden. Wenn topisch verabreicht, wie auf die. Haut und die Mukosamembranen, kann der Inhibitor in der Form von Gelen, Cremen und Lotionen vorliegen. Derartige Lösungen, insbesondere jene, die für die ophthal mische Anwendung verwendet werden sollen, können als 0,01%-10% isotonische Lösungen, pH etwa 5-7, mit geeigneten Salzen formuliert werden (siehe, z. B., US-Patent Nr. 5,116,868).
Lösungen oder Suspensionen, die für parenterale, intradermale, subkutane oder topische Anwendung verwendet werden, können irgendeine der folgenden Verbindungen umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser für Injektion, Salinelösung, fettes Öl, Polyethylenglycol, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antimikrobielle Agenzien, wie Benyzlalkohol und Methylparabene; Antioxidanzien, wie Ascorbinsäure und Natriumbisulfit; Chelatbildner wie Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA); Puffer, wie Acetate, Citrate und Phosphate; und Mittel für das Einstellen der Toxizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Parenterale Präparate können in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisviolen aus Glas, Kunststoff oder anderen geeigneten Materialien eingeschlossen sein.
Wenn intravenös verabreicht umfassen geeignete Träger physiologische Saline oder Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und Lösungen, die Eindickungs- und Löslichkeits-vermittelnde Agenzien enthalten, wie Glucose, Polyethylenglycol und Polypropylenglycol und Mischungen davon. Liposomensuspensionen können auch geeignet sein als pharmazeutisch akzeptable Träger. Diese können hergestellt werden gemäß den den Fachleuten bekannten Verfahren.
Der Inhibitor kann hergestellt werden mit Trägern, die ihn vor schnelle Entfernung aus dem Körper schützen, wie Zeitfreisetzungsformulierungen oder Beschichtungen. Derartige Träger umfassen kontrollierte Freisetzungsformulierungen, wie Implantate und mikroenkapsulierte Freisetzungssysteme und biologisch abbaubare, biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat; Polyanhydride, Polyglycolsäure, Polyorthoester, Polymilchsäure und andere, sind aber darauf nicht beschränkt. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung während einer Operation unter Verwendung eines Schwammes, wie eines kommerziell erhältlichen Operationsschwammes (siehe, z. B., US-Patente 3,956,044 und 4,045,238) verabreicht werden.
Die Inhibitoren können verabreicht werden durch irgendeine geeignete Route, z. B. oral, parenteral, intravenös, interdermal, subkutan oder topisch in flüssiger, halbflüssiger oder fester Form und werden formuliert in einer Art und Weise, die für einen jeden Verabreichungsweg geeignet ist. Bevorzugte Verabreichungswege hängen von der behandelten Indikation ab. Dermatologische und ophthalmologische Indikationen werden typischerweise lokal behandelt werden; wohingegen Tumoren und Restenose typischerweise durch systemische, interdermale oder intramuskuläre Verabreichungsweisen behandelt werden.
Der Inhibitor ist enthalten in dem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer Menge, die ausreichend ist, um eine therapeutisch nützliche Wirkung in Abwesenheit unerwünschter Nebenwirkungen zu entfalten. Es wird verstanden, daß die Anzahl und der Umfang von Nebenwirkungen von dem Zustand abhängt, für den die Konjugate verabreicht werden. Zum Beispiel werden bestimmte toxische und unerwünschte Nebenwirkungen toleriert, wenn lebensbedrohliche Krankheiten, wie Tumoren, behandelt werden, die nicht toleriert werden würden bei der Behandlung von Störungen mit geringfügigeren Konsequenzen. Die Konzentration von Konjugat in der Zusammensetzung wird abhängen von seiner Absorption, seiner Inaktivierung und seinen Exkretionsraten, dem Dosierungszeitplan und der verabreichten Menge ebenso wie anderen, den Fachleuten bekannten Faktoren.
Der Inhibitor kann einmal verabreicht werden oder in eine Anzahl kleinerer Dosen aufgeteilt sein, die in bestimmten Zeitintervallen verabreicht werden. Es wird verstanden, daß die genaue Dosierung und Dauer der Behandlung eine Funktion der zu behandelnden Erkrankung ist und empirisch bestimmt werden kann unter Verwendung bekannter Testprotokolle oder durch Extrapolation von in vivo oder in vitro Testdaten. Es soll festgehalten werden, daß die Konzentration und Dosierungswerte auch mit der Schwere des zu mildernden Zustandes schwanken können. Es wird weiter verstanden, daß für einen jeden Patienten spezifische Dosierungsschemata über die Zeit angepaßt werden sollen entsprechend den individuellen Bedürfnissen und der professionellen Einschätzung der Person, die die Verabreichung der Zusammensetzung vornimmt oder überwacht und daß die hierin angegebenen Konzentrationsbereiche lediglich beispielhaft sind und den Umfang oder die Verwendung der beanspruchten Zusammensetzungen nicht beschränken sollen.
Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung gegeben und nicht zu Zwecken der Beschränkung.

BEISPIEL 1

KONSTRUKTION VON EINEM PLASMID, DAS FGF-2 EXPRIMIERT

Der die 18 kD Isoform von FGF-2 enthaltende Expressionsvektor wird wie folgt konstruiert. Die Sequenz der 18 kD Isoform von menschlichem FGF-2 wird durch Plasmid 18dx geliefert (Florkiewicz und Sommer, Proc. Notl. Acad. Sci. USA 86 : 3978-3981, 1989). Der Vektor exprimiert nur die 18 kD-Isoform, da die Sequenzen oberhalb der ApaI-Stelle, angeordnet 11 bp 5' des ATG-Codons, das die Translation der 18 kD FGF-2-Isoform initiiert, deletiert wurden. Kurz gesagt wird Plasmid p18dx mit ApaI linearisiert und ein Oligonukleotid-Adapter, der eine XhoI-Stelle enthält, wird an das Plasmid ligiert. Das XhoI-Restriktionsfragment, das FGF-2 enthält, wird gereinigt und in die XhoI-Stelle von pJC119 subkloniert (Sprague et al., aaO), um ein Plasmid für vorübergehende Transfektionen zu erzeugen.
Ein für stabile Transformation von Zellen geeignetes Plasmid wird ebenfalls konstruiert. Die codierende Region von FGF2 wird als ein Xho I/Not I-Fragment aus Plasmid p18dx ausgeschnitten und in die Xho I/Not I-Stellen am 3'-Ende des unmittelbaren frühen CMV- Promotors/Enhancers in pCMVß inseriert (Clontech, Palo Alto, CA) nach Entfernen des SV40 Ori und β-Gal-Gens. Dieses Plasmid wird als pCMV18 bezeichnet. Das Neo-Gen unter Kontrolle des TK-Promotors wird ausgeschnitten aus pMCI Neo Poly A-Plasmid (Stratagene, San Diego, CA) als ein Xho I/Sal I-Fragment und in die Sal I-Stelle von pCMV18 in der entgegengesetzten Orientierung zum FGF2-Gen eingefügt. Dieses Plasmid wird als pCMV18 Neo bezeichnet.
Ein Expressionsvektor, der hCG-alpha codiert, zur Verfügung gestellt von Dr. Carolyn Machamer (Dept. of Cell Biology, Johns Hopkins Medical School) ist identisch mit dem in Guan et al. (J. Biol. Chem. 263: 5306-5313, 1988) beschriebenen Vektor.

BEISPIEL 2

ZELLKULTUR, TRANSFEKTION UND METABOLISCHES MARKIEREN

Von der American Type Culture Collection erhaltene COS-1-Zellen (ATCC CRL 1650) werden in DMEM kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin supplementiert ist, kultiviert. COS-1-Zellen werden werden mit 10 ug CsCl-gereinigter Plasmid-DNA in 1 ml Transfekti onspuffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl&sub2;, 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,9 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 25 mM Tris, pH 7,4) transfiziert. Das Plasmid 18dx wird co-transfiziert mit pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA), das den selektierbaren Marker Neomycinphosphotransferase enthält. Wenn 2 ug p18dx mit 10 ug pMAMneo transfiziert werden, weisen mehr als 70% der transfizierten Zellen sowohl FGF-2 als auch neo auf, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestimmt.
Nach 40 bis 48 Stunden nach der DNA-Transfektion werden COS-1-Zellen metabolisch Pulsmarkiert für 15 Minuten mit 100 uCi ³&sup5;S-Methionin- und ³&sup5;S-Cystein (Trans ³&sup5;S-Label, ICN Biomedicals, Irvine, CA) in 1 ml Methionin- und Cystein-freiem DMEM. Nach dem Markieren werden Zellmonolayer einmal mit DMEM gewaschen, das mit einem Überschuß (10 mM) unmarkiertem Methionin und Cystein plus 25 ug/ml Heparin supplementiert ist. Die Zellen werden dann in 2 ml dieses Mediums für die gleiche Zeitspanne kultiviert. Für die angegebenen Kulturen wird das Nachweismedium mit Ouabain mit den angegebenen Konzentrationen supplementiert.
COS-Zellen werden stabil mit pCMV18 Neo transfiziert. Bei dieser Verfahrensweise wird gereinigte Plasmid-DNA in COS-Zellen durch ein Standard-Calciumphosphat-Verfahren transfiziert, wie oben beschrieben. Am Tag vor der Transfektion werden 3 · 10&sup5; COS-Zellen in einer 60 mm-Schale plattiert. Plasmid-DNA (10 ug) wird als Calciumphosphatpräzipitat hinzugefügt und die Zellen werden für 8 Stunden inkubiert, dann gewaschen und über Nacht kultiviert. Die Zellen werden dann mit einer Dichte von 5 · 10&sup4; Zellen pro 100 mm Schale ausplattiert und in Gegenwart von 700 ug Geneticin (G418; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) für 12 Tage kultiviert. Einzelne Kolonien werden geerntet unter Verwendung von Klonierungszylindern und in ein Format mit 48 Näpfen überführt.

BEISPIEL 3

IMMUNPRÄZIPITATION UND WESTERN BLOT-ANALYSE

Fraktionen von Zellen und konditioniertem Medium werden hergestellt für die Immunpräzipitation, wie im wesentlichen kürzlich beschrieben (Florkiewicz et al.; Growth Factors 4: 265- 275, 1991; Florkiewicz et al.; Ann. N.Y. Acad. Sci. 638: 109-126) mit der Ausnahme, daß 400 ul Lysepuffer (1%. NP-40, 0,5%. Deoxycholat, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,01 mM Phenylmethylsufonylfluorid, 10 ng/ml Aprotinin, 10 ng/ml Leupeptin, 10 ng/ml Peptstatin) zu der Medienfraktion nach Klärung durch Zentrifugation mit einer Mikrofuge für 15 Minuten hinzugegeben wurde. Zell- oder Mediumfraktionen werden inkubiert mit Meerschweinchen-anti-FGF-2-Immunserum (1 : 200) bei 21ºC für 40 Min. GammaBindTM G- Sepharose® (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) wurde für weitere 30- minütige Inkubation hinzugegeben. Immunkomplexe wurden durch Mikrofugen- Zentrifugation pelletiert, dreimal mit Lysepuffer und viermal mit eiskaltem Immunpräzipitations-Waschpuffer (0,15M NaCl, 0,01 M Na-Phosphat pH 7,2, 1% Deoxycholat, 1% NP-40, 0,1% Natriumdodecylsulfat) gewaschen. Immunkomplexe wurden in SDS-Gel-Probenpuffer 125 mM Tres, pH 6,8, 4% SDS, 10% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau, 2 mM EGTA eluiert und durch 12% SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde für Fluorographie bearbeitet, getrocknet und gegenüber Röntgenfilm bei -70ºC exponiert. Wenn Neomycinphosphotransferase immunpräzipitiert wurde, wurde ein anti-NPT-Antikörper (5Prime-3Prime, Boulder, CO) verwendet.
Für die Western blot-Analyse wurden Proteine von dem 12% SDS-PAGE-Gel auf eine Nitrozellulosemembran (Porengröße 0,45 um in kaltem Puffer, der 25 mM 3- [Dimethyl(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropan-sulfonsäure, pH 9,5, 20% Methanol enthielt, für 90 Minuten bei 0,4 amp transferiert. Die Membranen wurden in 10 mM Tris, pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM NaN&sub3;, 0,35% Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat und 5 % fettfreier Trockenmilch (Carnation Co., Los Angeles, CA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Membranen wurden mit einem monoklonalen anti-FGF-2-Antikörper (Transduction Laboratories, Lexington, KY) mit 0,3 ug/ml in Blockierungspuffer bei 4ºC für 16 Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurden die Membranen bei Raumtemperatur durch 10-maligen Pufferwechsel gewaschen, der 150 mM NaCl, 500 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 5 mM NaN&sub3; und 0,05% Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat enthielt. Die Membranen wurden dann in Blockierungspuffer, der 1 ug/ml Kaninchen-anti-Maus-IgG enthielt (H+L, afffinipure, Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA), für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden danach in 1 l des oben beschriebenen Puffers gewaschen und für 1 Stunde in 100 ml Blockierungspuffer inkubiert, der 15 uCi ¹²&sup5;I- Protein A (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA) enthielt und mit 1 l Puffer gewaschen. Das Radiosignal wurde durch Autoradiographie visualisiert.

BEISPIEL 4

FGF-2-BIOASSAY

Die Bioaktivität von FGF-2 kann gemessen werden in einem Thymidineinbautest. Die mit FGF-2 wie oben beschrieben transfizierten Zellen werden für 30 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit wird das Kulturmedium für 16 Stunden durch 6 ml DMEM ersetzt, das 0,5% FBS enthält (Medium mit geringem Serum). Das Medium wird entfernt, durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 15 Minuten bei 4ºC geklärt. Ein gleiches Volumen an Lysepuffer und Heparin-Sepharose CL-6B wird hinzugefügt und die Mischung unter Schütteln für 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Sepharose wird pelletiert und dreimal mit Lysepuffer gewaschen, gefolgt von dreimaligem Waschen mit HS-Waschpuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, plus Protease-Inhibitoren, 0,5 M NaCl) und dreimal mit HS-Waschpuffer gewaschen, der 1 M NaCl enthält. Proteine, die an die Sepharose gebunden blieben, wurden in HS-Waschpuffer eluiert, der 3 M NaCl enthielt.
Die Stimulation der DNA-Synthese wurde in ruhenden Swiss 3T3-Zellen (Klon NR-6) gemessen, wie kürzlich beschrieben (Witte et al., J. Cell Physiol. 137: 86-94, 1988; Florkiewicz und Sommer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3978-3981, 1989). Kurz gesagt wurden Zellen mit geringer Dichte ausplattiert und in ihrem Wachstum blockiert durch Kultivieren in 1 ml Medium, das 0,1% FBS enthielt, für 72 Stunden. Verschiedene Mengen des 3 M NaCl HS- Eluats werden direkt zu dem Kulturmedium hinzugegeben und der Umfang von [³H]- Thymidineinbau in TCA-präzipitierbare Zähler wurde 20-24 Stunden später gemessen. Als eine Kontrolle wurde 1 pg bis 1 ng rekombinanter menschlicher FGF-2 zu den Zellen in ähnlicher Weise hinzugegeben.

BEISPIEL 5

BREFELDIN-RESISTENTER EXPORT VON FGF-2

Brefeldin A inhibiert die Sekretion von Proteinen aus dem ER und Golgi. Im Gegensatz dazu wird der Export eines Leader-freien Proteins durch Behandlung mit Brefeldin A nicht inhibiert.
COS-1-Zellen werden erhalten von der American Type Culture Collection und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, University of California, San Diego Core Facility), sup plementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Gemini Bioproducts, Inc.), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyrovat, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin. Der auf SV40 basierende Expressionsvektor, der die Wildtyp (menschliche)-cDNA enthält, die multiple FGF-2-Isoformen (24, 23, 22 und 18-kD) kodiert, ist kürzlich beschrieben worden (Florkiewicz und Sommer, aaO.) Etwa 3 · 10&sup5; COS- 1-Zellen in einer 60 mm Gewebekulturschale werden mit 10 ug CsCl-gereinigter Plasmid- DNA, die mit 1,0 ml Transfektionspuffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl&sub2;, 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,9 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 25 mM Tris pH 7,4) gemischt ist, transfiziert. Unter diesen Co- Transfektionsbedingungen unter Verwendung von 2 ug p18dx plus 10 ug pMAMneo exprimieren mehr als 70% der transfizierten Zellen beide Proteine, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestimmt. Das Verhältnis von Plasmid-DNA kann mit unerheblicher Änderung der Ergebnisse variiert werden. 40 bis 48 Stunden nach DNA-Transfektion werden die COS- 1-Zellen für 15 Minuten mit 100 uCi ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein (Trans³&sup5;S-Label, ICN Biomedicals, Inc.) metabolisch Puls-markiert in 1 ml Methionin- und Cystein-freiem DMEM. Nach Puls-Markierung werden die Zellmonolayer einmal mit DMEM gewaschen, das mit einem Überschuß (10 mM) von nicht-markiertem Methionin und Cystein supplementiert ist, und dann in 1 ml des selben Mediums (Nachweis) für die angegebenen Zeitspannen kultiviert. Kulturen, die mit Brefeldin A behandelt sind, umfassen 15 ug/ml Brefeldin A in dem Nachweismedium. Das Nachweismedium wird auch supplementiert mit 25 ug/ml Heparin. Obwohl Heparin nicht notwendig ist, um den FGF-2-Export qualitativ nachzuweisen, ist es notwendig, um den Export von FGF-2 in diesem Test quantitativ nachzuweisen.
Zell- und Medium-Fraktionen werden für die Immunpräzipitation im wesentlichen wie kürzlich beschrieben (Florkiewicz et al., 1991) hergestellt, mit der Ausnahme, daß 40 ul Lysepuffer ohne NaCl (1% NP-40, 0,5% Deoxycholat, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,01 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ng/ml Aprotinin, 10 ng/ml Leupeptin und 10 ng/ml Pepstatin) zu der durch Mikrofugenzentrifugation für 15 Minuten bei 4ºC geklärten Medium-Fraktion vor Hinzufügen des Immunserums hinzugegeben werden. Sowohl Zell- als auch Mediumfraktionen werden mit einer 1 : 200 Verdünnung von Meerschweinchen-anti- FGF-2-Immunserum (hergestellt in unserem Labor) bei 21ºC für 40 Minuten inkubiert und danach wird GammaBind G Sepharose® (Pharmacia LKB-Biotechnologie) für eine weitere 30-minütige Inkubation hinzugegeben. G-Sepharose-gebundene Immunkomplexe werden pelletiert, dreimal mit Lysepuffer und viermal mit eiskaltem Immunpräzipitationswaschpuffer (0,15 M NaCl, 0,01 M Na-Phosphat pH 7,2, 1% Deoxycholat, 1% NP-40, 0,1% Natriumdo decylsulfat) gewaschen. Immunkomplexe werden direkt in SDS-Gel-Probenpuffer eluiert und durch 12% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gel wird für die Fluorographie bearbeitet, getrocknet und Röntgenfilm bei -70ºC ausgesetzt. Für Immunpräzipitationen, die Neomycinphosphotransferase (NPT) umfassen, wurde Kaninchen-anti-NPT- Antikörper (5 Prime- 3 Prime, Inc., Boulder, CO) verwendet.
Wie in Fig. 5 gezeigt, ist der Export von 18 kD FGF-2 Brefeldin A-resistent und energieabhängig. Probe A wurde nachverfolgt/nachgewiesen mit Medium alleine, Probe B wurde nachverfolgt/nachgewiesen mit Medium, das mit 25 ug/ml Brefeldin A supplementiert war, und Probe C wurde nachverfolgt/nachgewiesen mit Medium, das mit 50 mM 2-Deoxy-D-Glukose und NaN&sub3; supplementiert war. Wie in Fig. 5 gezeigt, wird FGF-2 nach 2 Stunden in das Medium exportiert. Brefeldin A wies keine wesentliche Wirkung auf diesen Export auf. Wenn jedoch NaN&sub3; ein metabolischer Inhibitor, vorliegt, wird der Export wesentlich verringert. Im Gegensatz dazu wird hCG-α in das Medium nach 4 Stunden sekretiert und ist Brefeldinempfindlich und energieabhängig. hCG-α enthält eine hydrophobe Leader-(Signal-)Sequenz und wird konsequenterweise über das ER und den Golgi sekretiert.

BEISPIEL 6

INHIBIERUNG VON LEADER-FREIEN PROTEINEN IN VORÜBERGEHEND TRANSFIZIERTEN ZELLEN

COS-Zellen werden wie oben beschrieben mit Plasmiden co-transfiziert, die FGF2, hCG-α oder Neomycin exprimieren. Metabolisches Markieren wird durchgeführt, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß während der Nachweisperiode Inhibitor hinzugegeben wird zu 10 nM bis 1 mM in Log-Inkrementen. Am Ende des Nachweises werden Zellen und Zeilmedien geerntet und für Immunpräzipitationen verarbeitet, wie oben beschrieben.
Ouabain und Digoxin inhibierten den Export von FGF-2, aber nicht von menschlichem Choriongonadotropin α. Ouabain inhibierte 50% des Exportes bei etwa 0,1 uM und Digoin bei etwa 5 uM. Weitere Experimente mit Ouabain zeigten, daß die Inhibierung zeitabhängig ist (Fig. 2), die Sekretion von hCG-α nicht beeinflußt (Fig. 3) und den Export von FGF-2 in einer Dosis-abhängigen Art und Weise inhibiert (Fig. 4).
Wie in der Tabelle unten gezeigt, wird die Wirkung von 30 verschiedenen Herzglykosiden und Aglykonderivaten auf den Export von FGF-2 aus transfizierten COS-Zellen bestimmt. COS-Zellen werden mit einem Konstrukt transfiziert, das FGF-2 exprimiert. Nach 40 bis 48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen einmal mit 0,1 M Na-Carbonat, pH 11,4, für 1 bis 2 Minuten gewaschen und dann abgesaugt. Die Zellen werden mit Medium gewaschen, das 0,5% FBS mit 25 ug/ml Heparin enthält. Die Verbindungen werden für etwa 24 Stunden hinzugegeben. Der Überstand wird gesammelt und geklärt. Die Menge an FGF2 wird bestimmt durch einen ELISA-Test, und der Prozentsatz Inhibierung wird bestimmt durch Vergleichen des Umfangs von exportiertem FGF2 durch Zellen, die mit Verbindungen behandelt worden sind, gegenüber demjenigen von Zellen, die nicht behandelt worden sind. Im wesentlichen inhibierten alle der getesteten Verbindungen den Export bei einer Konzentration von 50 uM wesentlich.

Name der Verbindung %Inhibition (50 uM)

20(22)-Dihydro-digitoxigenin 0
17α-Hydroxy-digitoxigenin-3-acetat 0
14-Deoxy-14-amino-15-hydroxy-digitoxigenin 0
Digitoxigenin-3-azidoacetat 46
Digitoxigenin-3-bromoacetat 52
Digitoxin-3',3",3''',4""-tetranitrat 8
14-Deoxy-digitoxigenin-Lactam 17
17α-Digitoxigenin 0
21-Oxo-3,16-diacetylgitoxigenin-Lactam 0
Digoxigenin-3,12-dibromoacetat 45
14(13,12αH)Abeo-13(18)-dihydro-digitoxigenin-3β-o-bis-digitoxosid 33
16α-Hydroxy-digitoxigenin 0
16α-Hydroxy-digitoxigenin-3,16-dinitrat 82
Proscillardin A 85
Proscillardin A-Lactam 77
(21R)-Methyl-digitoxigenin-Glucosid 76
(21S)-Methyl-digitoxigenin-Glucosid 60
(23R)-23-Methyl-actodigin 70
(23S)-23-Methyl-actodigin 60
Actodigin 55
3α-Methyl-digitoxigenin-3β-D-Glucosid 69
4-Amino-4'-deoxy-α-L-Oleandross 61
17B-(Pyrid-3'-yL)-14B-androst-4-en-3B,14-diol 64
17B-(N-Methyl-2-maleimido) 0
(21S)-21-Floro-gitoxigenin 0
(21R)-21-Floro-gitoxigenin 87
14B, 15B-Epoxy-17B-(pyrid-2"-on-3"-yl)-andros-4-en-3-on 37
3-Deoxy-3-amino-digitoxigenin-isopropylsulfonat 87
3-O-Acetyl-15B-azido-14a-hydroxy-digitoxigenin 16
3-O-Acetyl-15B-amino-14α-hydroxy-digitoxigenin 0

BEISPIEL 7

INHIBIERUNG VON LEADER-FREIEN PROTEINEN IN STABIL TRANSFORMIERTEN ZELLEN

COS-Zellen werden stabil transformiert, wie oben beschrieben, mit pCMV18 Neo, einem Plasmid, das FGF-2 exprimiert, und exportiertes Protein wird getestet. Da das meiste, wenn nicht alles, des exportierten FGF-2 mit der Zellmembran assoziiert ist, wird FGF2 nach Biotinylierung durch Präzipitation mit Streptavidin isoliert. Bei diesem Verfahren werden, einen Tag nach dem Ausplatieren, COS-Zellen einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen, mit 2 ml Carbonatpuffer bei pH 11,4 für 90 sec inkubiert, um Zelloberflächenprotein zu entfernen, sukzessiv mit PBS und DMEM gewaschen, das 0,5% FBS enthält, und für 48 Stunden in DMEM, 0,5% FBS in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 uM Ouabain inkubiert. Für Biotinylierung werden Schalen mit Zellen auf Eis gegeben und zweimal mit PBS gewaschen, das 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM CaCl&sub2; (PBS Ca/Mg) enthält. NHS-ss-Biotin (Pierce Chemicals) (1,5 mg/ml in 150 mM NaCl, 10 mM Triethanolamin pH 9,0 und 2 mM CaCl&sub2;) werden zu den Zellen für 30 Minuten bei 4ºC im Dunkeln hinzugegeben. Die Zellen werden dann einmal in PBS Ca/Mg gewaschen, das 100 mM Glycin enthält, und in demselben Puffer für 20 Minuten inkubiert. Die Zellen werden dann lysiert, geklärt und mit Streptavidin für 16 Stunden inkubiert. Der Streptavidin-Komplex wird von intrazellulären Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Für einige Anwendungen wird der Überstand, der intrazelluläre Proteine enthält, weiter angereichert durch Heparin-Sepharose-Chromatographie. Die Streptavidin-Komplexe werden dreimal in Lysepuffer gewaschen, und das Streptavidin-gebundene biotinylierte Protein wird direkt in SDS-Gel-Probenpuffer eluiert. Die Proteine in dem Gel werden auf Nitrozellulose transferiert. FGF-2-Protein wird nachgewiesen in einem Western Blot-Test, wie oben beschrieben.
Insgesamt werden 39 Klone erfolgreich zu Zellinien expandiert. Nahezu alle dieser Klone überexprimierten FGF-2 verglichen mit nicht-transfizierten COS-Zellen. Es wurden jedoch nur sehr geringe Mengen an FGF-2 in konditioniertem Medium gefunden. Wenn Klone vorübergehend mit p18dx transfiziert sind, wird FGF-2 im Konditionierungsmedium in einer Konzentration von 55 ± 4 ng/ml nachgewiesen. Ein derartiger Export ist empfindlich gegenüber Ouabain. Wenn stabile Transformanden biotinyliert sind und wie oben beschrieben verarbeitet werden, wird FGF-2 auf der Zelloberfläche nachgewiesen (Fig. 6). Wie in Fig. 6 gezeigt, befinden sich 30% des FGF-2 auf der Oberfläche von CF18-Zellen, der ein typischer Klon ist. Darüber hinaus ist dieser Export Ouabain-empfindlich. FGF-2 auf der Oberfläche von CF18-Zellen wird entfernt durch eine Carbonatwaschung. 48 Stunden später werden Zellen biotinyliert und wie beschrieben verarbeitet. Wie in Fig. 7A und 7B gezeigt, erhöht sich das Verhältnis von Zelloberflächen-/intrazellulärem FGF-2 um 40% gegenüber der Kontrolle (p< 0,002). Darüber hinaus verhindert die Anwesenheit von 10 uM Ouabain vollständig den Export von FGF2 an die Zelloberfläche verglichen mit keinem Ouabain (p< 0,002).

BEISPIEL 8

INHIBIERUNG VON FGF-2-EXPORT IN CHONDROCYTEN

Normale Chondrocyten werden in Kultur bis zur Sub-Konfluenz angezogen. Dosen von Ouabain von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;¹&sup0; M werden zu den Kulturen wie oben beschrieben hinzugegeben. Wie in Fig. 8 gezeigt, wird der FGF-2-Export bei einer Konzentration von 10&supmin;¹&sup0; M um 50% inhibiert (verglichen mit der Kontrolle, bei der kein Ouabain hinzugefügt ist).

BEISPIEL 9

OUABAIN-EMPFINDLICHKEIT DES EXPORTS VON IL-1

Ein Vektor, der ein IL-1α-Gen enthält, wird in COS-Zellen transfiziert. Die. Zellen werden metabolisch markiert und Protein mit einem anti-IL-1α-Antikörpet präzipitiert. Wie aus den Fig. 9A, 9B, 10, 12 und 14 ersichtlich, wird IL-1α in die Medienfraktion (M) exportiert.
Dieser Export wird inhibiert durch Inkubation mit 5 mM Ouabain (Fig. 11, 13 und 14). Im Gegensatz zu dem Export von FGF-2 ist die Rate des IL-1-Exportes geringer mit einer T1/2 von mehr als 24 Stunden. Wie bei FGF-2 ist der Export jedoch empfindlich gegenüber Ouabain. Zusätzlich kann IL-1α immunpräzipitiert werden aus co-transfizierten COS-Zellen (transfiziert mit IL- 1α und der α1-Untereinheit von Na/K ATPase) unter Verwendung von anti-α1-Untereinheiten-Antikörper.
Aus dem vorstehenden wird anerkannt werden, daß obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindungen hierin zu Zwecken der Veranschaulichungen beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Entsprechend ist die Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche beschränkt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Florkiewizc, Robert Z.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Inhibitoren von Leader-freiem Proteinexport
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 13
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: SEED and BERRY
(B) STRASSE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C) ORT: Seattle
(D) STAAT: Washington
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 98104-7092
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG: 12. Februar 1997
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: Nottenburg Ph.D., Carol
(B) REGISTRIERNUMMER: 39,317
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 760100.416PC
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (206) 622-4900
(B) TELEFAX: (206) 682-6031
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3877 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GCCAGATTAG CGGACGCGTG CCCGCGGTTG CAACGGGATC CCGGGCGCTG CAGCTTGGGA 60
GGCGGCTCTC CCCAGGCGGC GTCCGCGGAG ACAACCATCC GTGAACCCCA GGTCCCGGCG 120
CGCCGGCTCG CCGCGCACCA GGGGCCGGCG GACAGAAGAG CGGCCGAGCG GCTCGAGGCT 180
GGGGGACCCG GCGCGGCCGC GCGCTGCCGG GCGGGAGGCT GGGGGGCCGG GGCGGGGCCG 240
TGCCCCGGAG CGGGTCGGAG GCCGGGGCCG GGGCCGGGGG ACGGCGGCTC CCCGCGCGGC 300
TCCAGCGGCT CGGGGATCCC GGCCGGGCCC CGCAGGACCA TGGCAGCCGG GAGCATCACC 360
ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG 420
GACCCGAACC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGGGCATCCA CCCCGACGGC 480
CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA 540
GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGAA 600
GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG 660
GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG 720
AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT 780
TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGATTT TAATGGCCAC ATCTAATCTC ATTTCACATG 840
AAAGAAGAAG TATATTTTAG AAATTTGTTA ATGAGAGTAA AAGAAAATAA ATGTGTAAAG 900
CTCAGTTTGG ATAATTGGTC AAACAATTTT TTATCCAGTA GTAAAATATG TAACCATTGT 960
CCCAGTAAAG AAAAATAACA AAAGTTGTAA AATGTATATT CTCCCTTTTA TATTGCATCT 1020
GCTGTTACCC AGTGAAGCTT ACCTAGAGCA ATGATCTTTT TCACGCATTT GCTTTATTCG 1080
AAAAGAGGCT TTTAAAATGT GCATGTTTAG AAACRAAATT TCTTCATGGA AATCATCATA 1140
TACATTAGAA AATCACAGTC AGATGTTTAA TCAATCCAAA ATGTCCACTA TTTCTTATGT 1200
CATTCGTTAG TCTACATGTT TCTAAACATA TAAATGTGAA TTTAATCAAT TCCTTTCATA 1260
GTTTTATAAT TCTCTGGCAG TTCCTTATGA TAGAGTTTAT AAAACAGTCC TGTGTAAACT 1320
GCTGGAAGTT CTTCCACAGT CAGGTCAATT TTGTCAAACC CTTCTCTGTA CCCATACAGC 1380
AGCAGCCTAG CAACTCTGCT GGTGATGGGA GTTGTATTTT CAGTCTTCGC CAGGTCATTG 1440
AGATCCATCC ACTCACATCT TAAGCATTCT TCCTGGCAAA AATTTATGGT GAATGAATAT 1500
GGCTTTAGGC GGCAGATGAT ATACATATCT GACTTCCCAA AAGCTCCAGG ATTTGTGTGC 1560
TGTTGCCGAA TACTCAGGAC GGACCTGAAT TCTGATTTTA TACCAGTCTC TTCAAAACCT 1620
TCTCGAACCG CTGTGTCTCC TACGTAAAAA AAGAGATGTA CAAATCAATA ATAATTACAC 1680
TTTTAGAAAC TGTATCATCA AAGATTTTCA GTTAAAGTAG CATTATGTAA AGGCTCAAAA 1740
CATTACCCTA ACAAAGTAAA GTTTTCAATA CAAATTCTTT GCCTTGTGGA TATCAAGAAA 1800
TCCCAAAATA TTTTCTTACC ACTGTAAATT CAAGAAGCTT TTGAPnTGCT GAATATTTCT 1860
TTGGCTGCTA CTTGGAGGCT TATCTACCTG TACATTTTTG GGGTCAGCTC TTTTTAACTT 1920
CTTGCTGCTG TTTTTCCCAA AAGGTAAAAA TATAGATTCA AAAGTTAAAA CATTTTGCAT 1980
GGCTGCAGTT CCTTTGTTTC TTGAGATAAG ATTCCAAAGA ACTTAGATTT ATTTCTTCAA 2040
CACCGAAATG CTGGAGGTGT TTGATCAGTT TTCAAGAAAC TTGGAATATA AATAATTTTA 2100
TAATTCAACA AAGGTTTTCA CATTTTATAA GGTTGATTTT TCAATTAAAT GCAAATTTAT 2160
GTGGCAGGAT TTTTATTGCC ATTAAGATAT TTTTGTGGCT GCTTTTTCTA CACATCCAGA 2220
TGGTCCCTCT AACTGGGCTT TCTCTAATTT TGTGATGTTC TGTCATTGTC TCCCAAAGTA 2280
TTTAGGAGAA GCCCTTTAAA AAGCTGCCTT CCTCTACCAC TTTGCTGAAA GCTTCACAAT 2340
TGTCACAGAC AAAGATTTTT GTTCCAATAC TCGTTTTGCC TCTATTTTAC TTGTTTGTCA 2400
AATAGTAAAT GATATTTGCC CTTGCAGTAA TTCTACTGGT GAAAAACATG CAAAGAAGAG 2460
GAAGTCACAG NAACATGTCT CAATTCCCAT GTGCTGTGAC TGTAGACTGT CTTACCATAG 2520
ACTGTCTTAC CCATCCCCTG GATATGCTCT TGTTTTTTCC CTCTAATAGC TATGGAAAGA 2580
TGCATAGAAA GRGTATAATG TTTTAAAACA TAAGGCATTC GTCTGCCATT TTTCAATTAC 2640
ATGCTGACTT CCCTTACAAT TGAGATTTGC CCATAGGTTA AACATGGTTA GAAACAACTG 2700
AAAGCATAAA AGAAAAATCT AGGCCGGGTG CAGTGGCTCA TGCCCATATT CCCTGCACTT 2760
TGGGAGGCCA AAGCAGGAGG ATCGCTTGRG CCCAGGAGTT CAAGACCAAC CTGGTGAAAC 2820
CCCGTCTCTA CAAAAAAACA CAAAAAATAG CCAGGCATGG TGGCGTGTAC ATGTGGTCTC 2880
AGATACTTGG GAGGCTGAGG TGGGAGGGTT GATCACTTGA GGCTGAGAGG TCAAGGTTAC 2940
AGTGAGCCAT AATCGTGCCA CTGCAGTCCA GCCTAGGCAA CAGAGTGAGA CTTTGTCTCA 3000
AAAAAAGAGA AATTTTCCTT AATAAGAAAA GTAATTTTTA CTCTGATGTG CAATACATTT 3060
GTTATTAAAT TTATTATTTA AGATGGTAGC ACTAGTCTTA AATTGTATAA AATATCCCCT 3120
AACATGTTTA AATGTCCATT TTTATTCATT ATGCTTTGAA AAATAATTAT GGGGAAATAC 3180
ATGTTTGTTA TTAAATTTAT TATTAAACAT AGTAGCACTA GTCTTAAATT TGATATAACA 3240
TCTCCTAACT TGTTTAAATG TCCATTTTTA TTCTTTATGT TTGAAAATAA ATTATGGGGR 3300
TCCTATTTAG CTCTTAGTAC CACTAATCAA AAGTTCGGCA TGTAGCTCAT GATCTATGCT 3360
GTTTCTATGT CGTGGAAGCA CCGGATGGGG GTAGTGAGCA AATCTGCCCT GCTCAGCAGT 3420
CACCATAGCA GCTGACTGAA AATCAGCACT GCCTGAGTAG TTTTGATCAG TTTAACTTGA 3480
ATCACTARCT GACTGAAAAT TGAATGGGCA AATAAGTGCT TTTGTCTCCA GAGTATGCGG 3540
GAGACCCTTC CACCTCAAGA TGGATATTTC TTCCCCAAGG ATTTCAAGAT GAATTGAAAT 3600
TTTTAATCAA GATAGTGTGC TTTATTCTGT TGTATTTTTT ATTATTTTAA TATACTGTAA 3660
GCCAAACTGA AATAACATTT GCTGTTTTAT AGGTTTGAAG ACATAGGAAA AACTAAGAGG 3720
TTTTATTTTT GTTTTTGCTG ATGAAGAGAT ATGTTTAAAT ACTGTTGTAT TGTTTTGTTT 3780
AGTTACAGGA CAATAATGAA ATGGAGTTTA TATTTGTTAT TTCTATTTTG TTATATTTAA 3840
TAATAGAATT AGATTGAAAT AAAATATAAT GGGAAAT 3877
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 477 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..474
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 158 Basenpaare
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 351 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..348
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 116 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 816 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..813
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 271 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 480 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..477
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 159 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 810 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..807
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 269 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 462 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 1..459
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 153 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGTE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

Claims

1. Verwendung eines Herzglykosides zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren des Exportes eines signalsequenzfreien Proteines aus einer Zelle, die das Protein exprimiert, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Herzglykosid.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Herzglykosid Digoxin, k-Strophanthin, Digitoxin, Lantasonid A, Ouabain, Digitoxose, Gitoxin, Oleandrin oder Acovenosid A ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, bei der das Herzglykosid Ouabain ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2, bei der das Herzglykosid Digoxin ist.

5. Verwendung eines Aglykonderivates eines Herzglykosides zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren des Exportes eines signalsequenzfreien Proteines aus einer Zelle, die das Protein exprimiert, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Aglykonderivat eines Herzglykosides.

6. Verwendung nach Anspruch 5. bei der das Aglykonderivat Strophanthidin, Digoxigenin, Digitoxigenin oder Uzarigenin ist.

7. Verwendung nach Anspruch 5, bei der das Aglykonderivat Digoxigenin ist.

8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das signalsequezfreie Protein FGF-1, FGF-2, IL-1α, IL-1β, PD-ECGF, CNTF, Thymosin, Parathymosin und Faktor XIIIa, Vas deferenz-Protein, das Wachstum des Hüftnerves fördernde Aktivität, Transglutaminase, L-14 Lectin, thioredoxinartiges Protein, HIV tat oder int-2 ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das signalsequenzfreie Protein FGF-2 ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das signalsequenzfreie Protein IL-1 ist.

11. Verwendung nach Anspruch 8, bei der das signalsequenzfreie Protein HIV tat ist.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der das Arzneimittel zur Behandlung eines durch FGF vermittelten pathophysiologischen Zustandes bei einem Patienten dient, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Herzglykosides oder eines Aglykonderivates eines Herzglykosides, wodurch die Menge FGF, die exportiert wird, herabgesetzt wird.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der das Arzneimittel der Inhibierung der Poliferation einer Zelle dient, die einen FGF-Rezeptor trägt, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Herzglykosid oder einem Aglykonderivat eines Herzglykosides.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der das Arzneimittel der Behandlung von Diabeteskomplikationen dient, umfassend das Inkontaktbringen einer Zelle, die FGF oder ein anderes signalsequenzfreies Protein exportiert, mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Herzglykosides oder eines Aglykonderivates eines Herzglykosides.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 12-14, bei der das Herzglykosid Digoxin, k- Strophanthin, Digitoxin, Lanatosid A, Ouabain, Digitoxose, Gitoxin, Oleandrin oder Acovenosid A ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, bei der das Herzglykosid Ouabain ist.

17. Verwendung nach Anspruch 15, bei der das Herzglykosid Digoxin ist.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 12-14, bei der das Aglykonderivat Strophanthidin, Digoxigenin, Digitoxigenin oder Uzarigenin ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, bei der das Aglykonderivat Digoxigenin ist.

20. Verwendung nach Anspruch 12, bei der der pathophysiologische Zustand ein Melanom, Ovarialcarzinom, Teratocarzinom oder ein Neurom ist.

21. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

Formel I

wobei R = (Digitoxose)&sub3;-D-Glukose + Acetyl, (Digitoxose)&sub3;-D-Glucose, (Digitoxose)&sub3; + Acetyl oder (Digitoxose)&sub3;,

Formel II

wobei R = (Digitoxose)&sub3;-D-Glucose + Acetyl, (Digitoxose)&sub3;-D-Glucose oder (Digitoxose)&sub3;;

Formel III

wobei R = Cymarose-D-Glucose-α-D-Glucose oder Cymarose-β-D-Glucose;

Formel IV

wobei R = L-Rhamnose; und

Formel V

wobei R = L-Rhamnose oder L-Rhamnose-D-Glucose ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren des Exportes signalsequenzfreier Proteine, umfassend Behandeln von Zellen mit der Verbindung.

22. Verfahren zum in vitro-Inhibieren des Exportes eines signalsequenzfreien Proteines aus einer Zelle, die das Protein exprimiert, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Herzglykosid.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Herzglykosid Digoxin, k-Strophanthin, Digitoxin, Lantanosid A, Ouabain, Digitoxose, Gitoxin, Oleandrin oder Acovenosid A ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Herzglykosid Ouabain ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Herzglykosid Digoxin ist.

26. Verfahren zum in vitro-Inhibieren des Exportes eines signalsequenzfreien Proteines aus einer Zelle, die das Protein exprimiert, umfassen das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Aglykonderivat eines Herzglykosides.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem das Aglykonderivat Strophanthidin, Digoxigenin, Digitoxigenin oder Uzarigenin ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem das Aglykonderivat Digoxigenin ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, bei dem das signalsequenzfreie Protein FGF-1, FGF-2, IL-1α, IL-1β, PD-EDGF, CNTF, Thymosin, Parathymosin und Faktor XIIIa, Vas deferens-Protein, das Wachstum des Hüftnerves fördernde Aktivität, Transglutaminase, L-14 Lectin, thioredoxinartiges Protein, HIV tat oder int-2 ist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem das signalsequenzfreie Protein FGF-2 ist.

31. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem das signalsequenzfreie Protein IL-1 ist.

32. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem das signalsequenzfreie Protein HIV tat ist.

33. Verfahren zum in vitro-Inhibieren der Proliferation einer Zelle, die einen FGF- Rezeptor trägt, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Herzglykosid oder einem Aglykonderivat eines Herzglykosides.

34. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem das Herzglykosid Digoxin, k-Strophanthin, Digitoxin, Lantanosid A, Ouabain, Digitoxose, Gitoxin, Oleandrin oder Acovenosid A ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem das Herzglykosid Ouabain ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem das Herzglykosid Digoxin ist.

37. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem das Aglykonderivat Strophanthidin, Digoxigenin, Digitoxigenin oder Uzarigenin ist.

38. Verfahren nach Anspruch 37, bei dem das Aglykonderivat Digoxigenin ist.

39. Verfahren zum in vitro-Inhibieren des Exportes eines signalsequenzfreien Proteins, umfassend Behandeln der Zellen mit einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: