DE69635493T2

DE69635493T2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren

Info

Publication number: DE69635493T2
Application number: DE69635493T
Authority: DE
Inventors: Hiroko Kawasaki-shi KISHINO; Masako Kawasaki-shi Izui; Yukiko Kawasaki-shi ONO; Hisao Kawasaki-shi ITO; Osamu Kawasaki-shi KURAHASHI
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-27
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2016-08-28
Also published as: US6319696B1; SK282611B6; WO1997008333A1; PL325155A1; HUP9901198A2; EP0877090A4; EP0877090A1; HU224895B1; DE69635493D1; EP0877090B1; SK23598A3; CN1077139C; CN1200150A; HUP9901198A3; JPH09121872A; JP4032441B2; DK0877090T3; PL183472B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur effektiven Produktion von Aminosäuren, für die eine steigende Nachfrage besteht, wie solche, die als Nahrungsmitteladditive (L-Threonin) und Ausgangsmaterialien für Arzneimittel, wie Infusionslösungen (L-Threonin und L-Isoleucin), eingesetzt werden.
Stand der Technik
Es gibt eine große Anzahl an Verfahren zur Produktion von Aminosäuren auf der Grundlage der Verwendung von Mikroorganismen.
Beispielsweise sind Verfahren zur Produktion von L-Phenylalanin bekannt, einschließlich solche, die auf der Verwendung von Rekombinanten von Escherichia coli (E. coli) basieren, wie in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-4276, der offen gelegten Japanischen Patentanmeldung (PCT) Nr. 4-501813, der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5-244956 und der Internationalen Veröffentlichung WO87/00202 offenbart.
Verfahren zur Produktion von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin sind ebenfalls bekannt, einschließlich solche, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes der Gattung Corynebakterium basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 61-128897 offenbart, und solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten eines Corynebakteriumstammes basieren, wie in den offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 60-34197, 60-24192, 61-260892 und 61-124375 offenbart.
Es wurde über Verfahren zur Produktion von L-Tryptophan berichtet, einschließlich über solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten von Escherichia coli basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 57-71397 und in dem US-Patent Nr. 4,371,614 offenbart, solche, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes von Bacillus subtilis basieren, wie in den Japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 53-39517 und 62-34399 offenbart, solche die auf der Verwendung einer Rekombinanten von Bacillus subtilis basieren, wie in den offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 61-104790 und 1-67179 offenbart, solche, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes der Gattung Brevibacterium basieren, wie in der Japanischen offen gelegten Patentveröffentlichung Nr. 57-174096 offenbart, und solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten der Gattung Brevibacterium basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 62-51980 offenbart.
Es wurde über Verfahren zur Produktion von L-Threonin berichtet, einschließlich über solche, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes der Gattung Escherichia basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5-304969 offenbart, solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten von Escherichia coli basieren, wie in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 1-29559, den offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 2-109985 und 56-15696 und der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung (PCT) Nr. 3-501682 offenbart. Außerdem wurden solche Verfahren berichtet, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes eines Bakteriums der Gattung Corynebakterium basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 62-239996 offenbart, und solche, die auf der Verwendung eines rekombinanten Bakteriums der Gattung Corynebakterium basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 61-195695 offenbart.
Es wurden Verfahren zur Produktion von L-Isoleucin berichtet, einschließlich solche, die auf der Verwendung von Escherichia coli basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5-130882 offenbart, und solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten von Escherichia coli basieren, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-458 offenbart. Außerdem wurden Verfahren berichtet, die auf der Verwendung eines Mutantenstammes eines Bakteriums der Gattung Corynebakterium basieren, wie in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 3-62395 offenbart, und solche, die auf der Verwendung einer Rekombinanten der Gattung Corynebakterium basieren, wie in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5-47196 offenbart.
Die Mikroorganismen, die für die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Produktion von Aminosäuren eingesetzt worden sind, wurden prinzipiell auf der Grundlage der Verstärkung von Enzymen für katalytische Reaktionen in allgemeinen Synthesewegen für verschiedene Aminosäuren und in speziellen Synthesewegen für die individuellen Aminosäuren oder auf der Grundlage der Vermeidung der Kontrolle, die durch die Endprodukte oder dergleichen bewirkt wird (Rückkopplungshemmung und Suppression) gezüchtet. Genauer gesagt umfasst diese Züchtung beispielsweise die Übertragung von Auxotrophie auf den Mikroorganismus, die Übertragung einer Arzneimittelresistenz und die Amplifikation von Enzymgenen, welche an dem Biosynthesesystem beteiligt sind, und die Einführung einer Mutation auf der Grundlage der rekombinanten DNA-Technologie zur Entkopplung von Kontrollmechanismen.
Das Enzym, das für die erste Reaktion in dem allgemeinen Syntheseweg für aromatische Aminosäuren verantwortlich ist, ist 3-Deoxy-D-arabino-hepturonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase (DS). DS aus Escherichia coli umfasst drei Typen von Isoenzymen, die durch die Gene aroF, aroG beziehungsweise aroH codiert werden, und die einer Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin, L-Phenylalanin beziehungsweise L-Tryptophan unterliegen. Was diese Enzyme betrifft, ist ein Verfahren zur Verbesserung der Produktion von aromatischen Aminosäuren bekannt, welches auf der Einführung einer Kombination eines Gens, das für ein unempfindliches Enzym (ein Enzym, das im Wesentlichen nicht der Rückkopplungshemmung unterliegt), welches von aroF oder aroG abgeleitet ist, unterliegt, was zu einer hohen Enzymaktivität führt, und eines Tryptophan Operons, welches ein Gen enthält, das für eine unempfindliche Anthranilatsynthase (AS) des Systems der L-Tryptophanbiosynthese codiert, in Escherichia coli basiert.
Phosphoenolbrenztraubensäure (im Folgenden, falls erforderlich, "PEP" genannt) und D-Erythrose-4-phosphat (E4P) werden als Substrate in der Synthesereaktion für DAHP eingesetzt. PEP dient auch als Vorläufer für die Biosynthese von L-Asparaginsäure, L-Threonin, L-Isoleucin und dergleichen. Die vorstehend beschriebenen Substrate werden von einer Kohlenstoffquelle, wie Glucose, über die Glycolyse und den Pentosephosphatweg bereitgestellt. Es ist bislang jedoch bei der Züchtung von Aminosäure-produzierenden Stämmen kein Fall bekannt, bei dem die Fähigkeit zur Bereitstellung solcher Substrate erhöht wird, um die Produktivität von Aminosäuren zu verbessern.
Phosphoenolpyruvatsynthase (im Folgenden, falls erforderlich, als "PPS" abgekürzt) ist ein Enzym, das in Mikroorganismen weit verbreitet gefunden wird. Dieses Enzym spielt eine wichtige Rolle, um PEP aus Brenztraubensäure in die Glyconeogenese zu speisen. Escherichia coli, das ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, ist eingesetzt worden, um die Klonierung eines Gens (pps), das für PPS codiert, die Bestimmung der Nucleotidsequenz des Gens und die funktionelle Analyse des Enzyms durchzuführen. Daneben wurde berichtet, dass DAHP in einer Menge, die fast der theoretischen Ausbeute entspricht, durch gleichzeitige Amplifizierung des pps-Gens und des Transketolasegens in einem Dehydrochinatsynthase-defizienten Stamm produziert wird (Patnaik, R. et al., Appl. Environ. Mircobiol., Vol. 60, Nr. 11, 3903-3908 (1994)). Es ist jedoch kein Fall bekannt, bei dem die Amplifizierung des pps-Gens die Produktivität von aromatischen Aminosäuren oder anderen Aminosäuren verstärkt.
US 4,968,609 offenbart ein Verfahren zur Produktion einer aromatischen Aminosäure, welches das Kultivieren eines coryneformen Bakteriums umfasst, welches ein rekombinantes DNA-Molekül trägt, das für 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase codiert.
Patnaik et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov. 1994, S. 3903-3908, offenbaren im Zusammenhang mit der Produktion von aromatischen Aminosäuren in E. coli und anderen Mikroorganismen, dass die Überexpression von PEP-Synthase zu einer Erhöhung von DAHP und somit zu einer Erhöhung von aromatischen Metaboliten führt.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktion von bestimmten nicht-aromatischen Aminosäuren auf kostengünstige Weise und in hoher Ausbeute bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Produktivität der L-Aminosäuren L-Threonin und L-Isoleucin durch Verstärken der Aktivität von Phosphoenolpyruvatsynthase in Zellen eines Mikroorganismus, der L-Aminosäuren produzieren kann, verbessert werden kann. Somit wurde die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung liegt in einem Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren, welches die Stufen umfasst, bei denen in einem Medium ein Mikroorganismus mit der Fähig keit zur Produktion von L-Aminosäuren kultiviert wird, die L-Aminosäure in dem Medium produziert und angehäuft wird und die L-Aminosäure gewonnen wird, wobei die L-Aminosäure L-Threonin oder L-Isoleucin ist und die Aktivität von Phosphoenolpyruvatsynthase in Mikroorganismuszellen im Vergleich mit einem Wildstamm erhöht ist.
Die L-Aminosäure, die durch das vorstehend beschriebene Produktionsverfahren hergestellt wird, ist L-Threonin oder L-Isoleucin.
Der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren ist beispielsweise ein Bakterium der Gattung Escherichia oder ein coryneformes Bakterium. Die hier erwähnten coryneformen Bakterien umfassen Bakterien, die bislang zur Gattung Brevibakterium gezählt wurden, die jedoch jetzt unter die Gattung Corynebakterium vereint werden (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Außerdem umfassen die hier genannten coryneformen Bakterien Bakterien der Gattung Brevibakterium, die der Gattung Corynebakterium extrem nah verwandt sind.
Die Mittel zum Verstärken der Fähigkeit eines Mikroorganismus zur Produktion von Phosphoenolpyruvat sind die Verstärkung der Aktivität von PPS in Mikroorganismuszellen. Die Mittel zur Verstärkung der Aktivität von PPS in Mikroorganismuszellen umfassen beispielsweise ein Verfahren zur Erhöhung der Expressionsmenge eines pps-Gens in den Mikroorganismuszellen, sowie ein Verfahren zur Einführung eines Gens, das für PPS mit einer hohen spezifischen Aktivität codiert, in die Zellen.
Im Speziellen umfassen Mittel zur Erhöhung der Menge der Expression des pps-Gens in die Mikroorganismuszellen beispielsweise ein Verfahren zur Erhöhung der Kopienzahl des pps-Gens in den Mikroorganismuszellen sowie ein Verfahren zur Verstärkung der Transkriptionsaktivität eines Promotors für das pps-Gen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben.
Der Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung bevorzugt eingesetzt wird, ist nicht besonders eingeschränkt und umfasst beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Escherichia, Brevibakterium, Corynebakterium, Bacillus, Serratia und Pseudomonas, mit der Maßgabe, dass ein DNA-Fragment, das einen Replikationsursprung eines Plasmides enthält, für den Mikroorganismus erhalten wird, das pps-Gen in dem Mikroorganismus funktioniert, die Kopienzahl des pps-Gens in dem Mikroorganismus erhöht werden kann und der Mikroorganismus die Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren hat (beispielsweise im Fall von L-Phenylalanin wird die Fähigkeit zur Produktion von L-Phenylalanin durch Übertragen von beispielsweise der Resistenz gegen ein L-Phenylalaninanaloges erworben). Unter diesen sind bevorzugte Bakterien solche der Gattung Escherichia und die coryneformen Bakterien.
Im Speziellen umfassen solche, die bevorzugt für L-Threonin eingesetzt werden, beispielsweise Escherichia coli VKPM B-3996 (RIA 1867) (vergleiche US-Patent Nr. 5,175,107) und Corynebakterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (vergleiche US-Patent Nr. 5,188,949); und solche, die bevorzugt für L-Isoleucin eingesetzt werden, umfassen beispielsweise Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781) (vergleiche Europäische Patentveröffentlichung Nr. 519,113) und Brevibakterium flavum AJ12149 (FERM BP-759) (vergleiche US-Patent Nr. 4,656,135).
Das Mittel zum Verstärken der vorstehend beschriebenen Fähigkeit eines Mikroorganismus zur Produktion von PEP ist die Erhöhung der PPS-Aktivität in den Mikroorganismuszellen.
Mittel zum Verstärken der PPS-Aktivität umfassen die Erhöhung der Expressionsmenge des pps-Gens in den Mikroorganismuszellen. Eines der Mittel zum Verstärken der PPS-Aktivität ist die Modifizierung des pps-Gens unter Bildung von PPS mit erhöhter Aktivität.
Die Mittel zum Erhöhen der Expressionsmenge des pps-Gens in Mikroorganismuszellen umfassen die Erhöhung der Kopienzahl des pps-Gens in den Mikroorganismuszellen. Um die Kopienzahl des pps-Gens zu erhöhen, ist es erforderlich, ein DNA-Fragment zu erhalten, welches dasselbe Gen trägt. Das pps-Gen wurde in Escherichia coli als ein Bakterium der Gattung Escherichia kloniert und dessen Nucleotidsequenz wurde bestimmt (Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)). Dementsprechend wird die Präparation des DNA-Fragments, welches dieses Gen enthält, durch Einsatz eines in dem vorstehend beschriebenen Dokument offenbarten Verfahrens erreicht. Ein gewünschtes DNA-Fragment kann durch Einsatz eines Hybridisierungsverfahrens auf Grundlage der Verwendung einer synthetischen DNA-Sonde, hergestellt unter Bezugnahme auf die vorstehend beschriebene Nucleotidsequenz, oder durch Einsatz eines PCR (Polymerase Kettenreaktion)-Verfahrens auf der Grundlage der Verwendung von synthetischen DNA-Primern, die unter Bezugnahme auf dieselbe Nucleotidsequenz hergestellt werden, erhalten werden. Die Kopienzahl des pps-Gens kann durch Ligieren des DNA-Fragments, welches das pps-Gen enthält, mit einer Vektor-DNA, die in einem Zielmikroorganismus autonom replizierbar ist, und Einführen eines erhaltenen rekombinanten DNA-Fragments in diesem Mikroorganismus erhöht werden.
Die DNA-Primer, die eingesetzt werden, um das pps-Gen aus einem Bakterium der Gattung Escherichia unter Einsatz des PCR-Verfahrens zu klonieren, können beispielsweise auf der Grundlage einer für Escherichia coli bekannten Sequenz in geeigneter Weise präpariert werden (Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)).
Im speziellen sind die zwei Primer
5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 1), und
5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3' (SEQ ID NO: 2)
geeignet, was es ermöglicht, eine Region von etwa 3,3 kb zu amplifizieren, welche das pps-Gen enthält. Diese Primer ermöglichen es, das pps-Gen in einer Form zu amplifizieren, in der SalI-Spaltenden an beiden Termini vorliegen. Wenn die Restriktionsenzymschnittenden in die Termini des PCR-Produkts eingeführt werden, wird das amplifizierte DNA-Fragment auf bequeme Weise unter Verwendung des entsprechenden Restriktionsenzyms kloniert, und das DNA-Fragment wird in geeigneter Weise auf eine andere Vektor-DNA übertragen. Die Primer-DNA's können beispielsweise unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergeräts Modell 380B, hergestellt von Applied Biosystems, gemäß dem Phosphoamiditverfahren (vgl. Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) synthetisiert werden. Die PCR-Reaktion kann beispielsweise unter Verwendung des DNA Thermal Cycler PJ2000 Type, hergestellt von Takara Shuzo, und unter Einsatz der Taq-DNA-Polymerase gemäß dem vom Hersteller genannten Verfahren durchgeführt werden.
Das DNA-Fragment, welches das pps-Gen enthält, kann auch aus Mikroorganismen erhalten werden, die nicht zur Gattung Escherichia gehören. Das Verfahren zur Bereitstellung des DNA-Fragments umfasst ein Hybridisierungsverfahren auf der Grundlage der Verwendung einer synthetischen DNA-Sonde, hergestellt unter Bezugnahme auf die in dem vorstehend genannten Dokument offenbarten Nucleotidsequenz (Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)) oder ein PCR-Verfahren auf der Grundlage der Verwendung synthetischer DNA-Primer, hergestellt unter Bezugnahme auf die genannte Nucleotidsequenz. Die für das Hybridisierungsverfahren eingesetzte DNA-Sonde kann auch in geeigneter Weise auf der Grundlage der bekannten Sequenz auf dieselbe Weise wie die DNA-Primer, die für das PCR-Verfahren eingesetzt werden, hergestellt werden. Es wird angenommen, dass die Nucleotidsequenz des Gens in Abhängigkeit von dem jeweiligen Mikroorganismus unterschiedlich ist. Deshalb ist es wünschenswert, synthetische DNA herzustellen, die mit einem Bereich hybridisiert, der für PPS in jedem Mikroorganismus konserviert ist.
Wenn das pps-Gen, das mit dem PCR-Verfahren amplifiziert worden ist, in ein Bakterium der Gattung Escherichia eingeführt wird, wird es mit Vektor-DNA, die in Zellen eines Bakteriums der Gattung Escherichia autonom replizierbar ist, ligiert, und die erhaltene rekombinante DNA wird in Zellen von Bakterien der Gattung Escherichia eingeführt.
Wenn das erhaltene DNA-Fragment, welches das pps-Gen enthält, in einen Mikroorganismus eingeführt wird, der nicht zur Gattung Escherichia gehört, wird das DNA-Fragment mit Vektor-DNA, die in Zellen des Mikroorganismus, in den das DNA-Fragment eingeführt werden soll, autonom replizierbar ist, ligiert, und die erhaltene rekombinante DNA wird in die Zellen eingeführt.
Plasmidvektor-DNA wird vorzugsweise als die Vektor-DNA verwendet, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden soll. Wenn der Mikroorganismus, in den das Gen eingeführt wird, Escherichia coli ist, umfassen geeignete Vektor-DNA's beispielsweise pTWV228, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399 und RSF1010. Daneben können Vektoren, die aus Phagen-DNA zusammengesetzt sind, eingesetzt werden. Um eine effiziente Expression von PPS zu erzielen, ist es auch bevorzugt, einen Promotor einzusetzen, der in dem Mikroorganismus funktioniert, wie lac, trp und P₁. Um die Kopienzahl des pps-Gens zu erhöhen, ist es auch bevorzugt, DNA, welche das pps-Gen enthält, mittels eines Transposons (Berg, D. E. und Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), eines Mu-Phagen (offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-109985) oder durch homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) in das Chromosom einzuverleiben.
Wenn der Mikroorganismus, in dem das Gen eingeführt werden soll, ein coryneformes Bakterium ist, umfassen solche Vektor-DNA's, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden sollen, beispielsweise Plasmidvektoren, die in den coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind, wie pAM330 (vgl. Japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-11280) und pHM1519 (vgl. offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-77895).
Escherichia coli kann mit dem rekombinanten Vektor, der durch Einführen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in den Vektor wie vorstehend beschrieben erhalten wird, beispielsweise unter Einsatz eines Verfahrens zur Transformation von Escherichia coli, wie ein Verfahren zur Erhöhung der Permeabilität für DNA durch Behandeln der Zellen mit Calciumchlorid, transformiert werden (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)).
Das Verfahren zum Transformieren von Bakterien der Gattung Bacillus umfasst ein Verfahren, bei dem die Einverleibung während einer spezifischen Wachstumsperiode durchgeführt wird, in der die Zellen DNA einverleiben können (Bericht über Bacillus subtilis, eingereicht von Duncan, C. H. et al.). Außerdem kann DNA in Bakterienzellen durch Bilden von Protoplasten oder Spheroplasten als DNA-Empfänger, welche Plasmid-DNA leicht einverleiben, eingeführt werden. Diese Verfahren sind für Bacillus subtilis, Actinomyces und Hefen bekannt (Chang, S. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb et al., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
Das Elektroporationsverfahren, bei dem Poren durch die Zellwände mittels eines elektrischen Hochspannungspulses gebildet werden, sodass DNA einverleibt wird (Hanahan, D. et al., Plasmid Transformation of Escherichia coli and other bacteria, Meth. Enzymol., 204, 63 (1991)), ist auch für einen breiten Bereich an Mikroorganismen wirksam. Daneben wird ein Transformationsverfahren auf der Grundlage des Elektroporationsverfahrens für coryneforme Bakterien in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-207791 offenbart.
Um einen Vektor, in den das pps-Gen tatsächlich eingeführt worden ist, aus Kandidatenvektoren auszuwählen, welche die Fähigkeit zur Einführung des pps-Gens haben, kann beispielsweise ein Komplementationstest unter Verwendung eines PPS-defizienten Stammes durchgeführt werden. Der PPS-defiziente Stamm kann auf einem minimalen Medium, das Brenztraubensäure als alleinige Kohlenstoffquelle enthält, nicht wachsen. Deshalb kann eine Transformante, die auf diesem Medium wachsen kann, ausgewählt werden. Der PPS-defiziente Stamm von Escherichia coli umfasst AT2572-1 (vgl. J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)). Der Stamm AT2572-1 ist von dem E. coli Genetic Stock Center erhältlich (Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs., 06511-7444 New Haven, Connecticut, U.S.A., P.O. Box 6666, Strain No: CGSC5242).
Um einen Stamm, in dem die PPS-Aktivität tatsächlich erhöht ist, aus Kandidatenstämmen auszuwählen, welche die PPS-Aktivität erhöhen können, ist beispielsweise ein Verfahren zugänglich, bei dem die Erhöhung der PPS-Enzymaktivität durch ein bekanntes Verfahren bestätigt wird (Cooper, R. A. und H. L. Kornberg, Meth. Enzymol., 13, 309 (1969)).
Der Mikroorganismus, der vorzugsweise für die vorliegende Erfindung eingesetzt wird, umfasst solche, die durch Erhöhen der Fähigkeit eines Mikroorganismus, der ursprünglich die L-Aminosäure produzieren kann, zur Produktion von PEP erhalten werden, und solche, die durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäure nach dem Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von PEP erhalten werden. Außerdem ist selbst im Fall eines Mikroorganismus, der ursprünglich die Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure hat, die Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure in einigen Fällen noch weiter erhöht durch Verstärken eines Enzymgens, das an dem Biosyntheseweg der entsprechenden Aminosäure beteiligt ist, oder durch Einführen eines Operons oder eines Gens, welches für einen unempfindlichen Typ (unempfindlich gegen Hemmung) des Enzyms eines Enzyms, das ansonsten einer Rückkopplungshemmung unterliegen würde, codiert.
Das vorstehend beschriebene Gen oder Operon sind beispielsweise:
solche für L-Threonin, einschließlich beispielsweise das Threoninoperon mit einem Gen, das für Aspartokinase codiert, deren Rückkopplungshemmung durch L-Threonin ausgeschaltet ist (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-29559), ein Gen, das für Homoserindehydrogenase codiert (offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-012995), und ein Gen, das für Homoserinkinase und Homoserindehydrogenase codiert (offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-195695) und solche für L-Isoleucin, einschließlich beispielsweise das vorstehend beschriebene Threoninoperon und ein Gen, das für Threonindeaminase codiert, deren Rückkopplungshemmung durch L-Threonin ausgeschaltet ist (offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-458).
Die gewünschte Aminosäure kann durch Kultivieren des Mikroorganismus, der mit der rekombinanten DNA, die das pps-Gen enthält und gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wird, transformiert ist, durch Produzieren und Akkumulieren der gewünschten Aminosäure in einer Kulturflüssigkeit und Gewinnen der gewünschten Aminosäure produziert werden.
Das für die Kultivierung eingesetzte Medium ist ein übliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls andere organische Komponenten enthält.
Solche, die als Kohlenstoffquelle einsetzbar sind, umfassen beispielsweise Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Saccharose und Stärkehydrolysat; Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol; und organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure.
Solche, die als Stickstoffquelle einsetzbar sind, umfassen beispielsweise anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat; organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat; Ammoniakgas; und wässriges Ammoniak.
Es ist wünschenswert, als organische Spurenelementquelle erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1 und Vitamin B6, falls erforderlich, sowie Hefeextrakt oder dergleichen, enthalten in geeigneter Menge, einzusetzen.
Daneben werden, falls erforderlich, geringe Mengen Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen und Manganionen zugesetzt.
Die Kultivierung kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die dem einzusetzenden Mikroorganismus angepasst sind. Im Speziellen wird die Kultivierung vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird auf 30°C bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung auf 5 bis 7 kontrolliert. Für die pH-Wertanpassung ist es möglich, beispielsweise anorganische oder organische saure oder basische Substanzen sowie Ammoniakgas einzusetzen.
Die L-Aminosäure kann aus der Fermentationsflüssigkeit durch Kombinieren bekannter Verfahren, wie übliche Ionenaustausch harzverfahren, Ausfällungsverfahren und andere Verfahren gewonnen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Verfahren zum Konstruieren eines Plasmides pHSGSK.
2 zeigt ein Verfahren zum Konstruieren eines Plasmides pdGM1.
3 zeigt ein Verfahren zum Konstruieren eines Plasmides pMWGMA2.
4 zeigt ein Verfahren zum Konstruieren eines Plasmides pMWD5.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele eingehender beschrieben.
Beispiel 1: Präparation des pps-Gens von Escherichia coli
Chromosomale DNA wurde aus dem Stamm W3110, der von Escherichia coli K-12 abstammt, gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) extrahiert. Andererseits wurden Oligonucleotidprimer, die zum Amplifizieren des pps-Gens aus der chromosomalen DNA nach dem PCR-Verfahren eingesetzt werden sollen, auf der Grundlage einer bekannten Nucleotidsequenz des pps-Gens synthetisiert (Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)).

(1) 5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 1)
(2) 5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3' (SEQ ID NO: 2)

Die vorstehend genannten Primer enthalten Sequenzen, die den Sequenzen, die auf der stromaufwärtigen oder stromabwärtigen Seite des pps-Gens lokalisiert sind, homolog oder komplementär sind und sie enthalten SalI-Erkennungssequenzen zum leichteren Klonieren des PCR-Produkts.
Die PCR-Reaktion wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA und der vorstehend beschriebenen Primer nach dem Verfahren von Erlich (PCR Technology, Stockton press (1989)) durchgeführt. Die Reaktionsbedingung beruht auf einem Reaktionszyklus, der die thermische Denaturierung bei 93°C während 1 Minute, das Annealing bei 55°C während 1,5 Minuten und die Polymerasereaktion bei 72°C während 3 Minuten umfasst, wobei der Reaktionszyklus 30-mal wiederholt wurde.
Ein DNA-Fragment von 3,3 kbp, erhalten durch die PCR-Reaktion, wurde mit einem Restriktionsenzym SalI verdaut, danach wurde das Fragment an eine SalI-Stelle des Plasmidvektors pTWV228 (Ampicillinresistenz (Ap^r), hergestellt von Takara Shuzo) unter Einsatz von DNA-Ligase ligiert. Ein PPS-defizienter Stamm AT2572-1 aus Escherichia coli (vgl. J. Bacteriol., 96, 2185 (1968), erhalten vom E. coli Genetic Stock Center (vorstehend genannte Adresse)) wurde mit dem Ligationsreaktionsgemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf einer Platte verteilt, die Ampicillin enthielt, um die gewachsenen Ampicillinresistenten Stämme zu selektieren, von denen ein Stamm, der auf einem minimalen Medium unter Einsatz von Brenztraubensäure als Kohlenstoffquelle wachsen konnte, ausgewählt wurde. Plasmid-DNA wurde aus dem Stamm extrahiert, und das erhaltene Plasmid wurde pTWV-pps genannt.
Eine Restriktionsenzymschnittkarte wurde für ein Insert-DNA-Fragment von pTWV-pps, erhalten wie vorstehend beschrieben, analysiert, und die PPS-Aktivität der erhaltenen Transformante wurde gemessen. Anhand der Ergebnisse der Analyse und der Messung wurde bestätigt, dass das DNA-Fragment das pps-Gen enthielt.
Beispiel 2: Produktion von L-Threonin
<1> Erzeugung eines L-Threonin-produzierenden Bakteriums
Das in Beispiel 1 erhaltene pTWV-pps wurde in ein L-Threoninproduzierendes Bakterium, Escherichia coli VKPM B-3996, eingeführt (beschrieben im US-Patent Nr. 5,175,107 und seit 19. November 1987 unter der Nummer RIA 1867 bei dem All-Union Scientific Center of Antibiotics (VNIIA) (Nagatinskaya Street 3-a, 113105 Moskau, Russische Föderation)). Eine Transformante wurde auf der Grundlage der Sm^r und Ap^r selektiert, wobei B-3996/pTWV-pps erhalten wurde. Der Stamm VKPM B-3996 trägt ein Plasmid pVIC40 (Streptomycinresistenz (Sm^r)), welches das Threoninoperon mit einem Gen enthält, das für Aspartokinase codiert, worin die Rückkopplungshemmung durch L-Threonin ausgeschaltet ist.
<2> Untersuchung der L-Threonin-Produktivität
Der Stamm B-3996 und B-3996/pTWV-pps wurden bei 37°C während 24 Stunden unter Einsatz eines L-Threonin-produzierenden Mediums (enthaltend 40 g Glucose, 16 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliummonophosphat, 1 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisensulfatheptahydrat, 0,01 g Manganchloridtetrahydrat, 2 g Hefeextrakt und 40 g Calciumcarbonat in 1 l Wasser, pH = 7,0) kultiviert. L-Threonin, das in dem Medium enthalten war, wurde durch Hochleistungsflüssigchromatografie quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Beispiel 3: Produktion von L-Isoleucin
<1> Erzeugung eines L-Isoleucin-produzierenden Bakteriums
(1) Konstruktion eines Plasmides, welches das Threoninoperon und das pps-Gen enthält
Ein Plasmid pVIC40, welches das Threoninoperon mit einem Gen trägt, das für Aspartokinase codiert, dessen Rückkopplungshemmung durch L-Threonin ausgeschaltet ist (beschrieben im US-Patent Nr. 5,175,107) wurde mit BamHI verdaut, und ein erhaltenes Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments mit stumpfen Enden versehen. Andererseits wurde das SalI-Fragment von 3,3 kbp, welches das pps-Gen enthält und in Beispiel 1 erhalten wurde, auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben mit stumpfen Enden versehen und mit dem vorstehend beschriebenen pVIC40-Fragment ligiert. Die Ligationsreaktionslösung wurde eingesetzt, um den Escherichia-coli-PPS-defizienten Stamm zu transformieren, um eine Transformante mit Sm^r und pps⁺ zu selektieren. Ein rekombinantes Plasmid wurde aus der Transformante extrahiert und wurde pVIC40-pps genannt (17,9 kb).
(2) Konstruktion eines Plasmides, welches das ilvGMEDA-Operon enthält
Chromosomale DNA wurde aus dem Escherichia-coli-Stamm MI162 extrahiert. Die chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Es zeigte sich, dass ein HindIII-HindIII-DNA-Fragment, welches das ilvGM-Gen enthält, eine Länge von 4,8 kb hat. Entsprechend wurde ein HindIII-HindIII-DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 4,8 kb mit einem DNA-Fragment, das durch Verdauen des Plasmidvektors pBR322 (gekauft von Takara Shuzo) mit HindIII erhalten wurde, ligiert.
Ein erhaltenes DNA-Ligationsreaktionsgemisch wurde in Escherichia coli MI262 (CGSC5769) als Acetohydroxysäuresynthasedefizienter Stamm eingeführt. Ein transformierter Stamm, worin die Eigenschaft der Defizienz der Acetohydroxysäuresynthase komplementiert wurde, wurde ausgewählt. Es wurde ein Plasmid isoliert, das in dem Stamm enthalten war. Als Ergebnis der Analyse der Struktur des Plasmides wurde ein DNA-Fragment von 4,8 kb, welches das ilvGM-Gen und einen Teil der 5'-terminalen Seite des ilvE-Gens enthält, an der HindIII-Stelle von pBR322 eingeführt. Das Plasmid wurde pBRGM7 genannt.
Synthetische Oligonucleotide, die in SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 in der Sequenzliste beschrieben sind, wurden unter Bezugnahme auf eine Nucleotidsequenz des ilvGM-Gens synthetisiert (Gene, 97, 21 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 922 (1981); und J. Bacteriol., 149, 294 (1982)). Eine Sequenz, die einen Promotor, Attenuator und eine für das ilvGM-Gen codierende Region der Nucleotidsequenz des ilvGM-Gens enthält, ist in SEQ ID NO: 5 zusammen mit einer Aminosäuresequenz der codierenden Region angegeben. Die beiden Oligonucleotide wurden als Primer eingesetzt, um DNA nach dem PCR-Verfahren unter Einsatz von chromosomaler DNA des MI162-Stammes als Matrize zu amplifizieren. Das zu amplifizierende DNA-Fragment ist ein DNA-Fragment mit einer Sequenz vom Nucleotid Nr. 25 bis zum Nucleotid Nr. 952 der in SEQ ID NO: 5 des Sequenzprotokolls angegebenen Nucleotidsequenz. Dieses Fragment wurde "Fragment (A)" bezeichnet.
Synthetische Oligonucleotide, die in SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 in der Sequenzliste beschrieben sind, wurden unter Be zugnahme auf die Nucleotidsequenz, die in Gene, 97, 21 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 922 (1981); und J. Bacteriol., 149, 294 (1982) beschrieben sind, auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben synthetisiert. Die beiden Oligonucleotide wurden als Primer zur Amplifizierung von DNA nach dem PCR-Verfahren unter Einsatz von chromosomaler DNA von MI162 als Matrize eingesetzt. Das zu amplifizierende DNA-Fragment ist ein DNA-Fragment mit einer Sequenz vom Nucleotid 1161 bis zum Nucleotid 2421 der in SEQ ID NO: 5 der Sequenzliste angegebenen Nucleotidsequenz. Das Fragment wurde "Fragment (B)" genannt.
Ein großes Fragment, das durch Verdauen des Fragments (A) mit SmaI erhalten wurde, wurde mit einem DNA-Fragment ligiert, das durch Verdauen des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) mit SmaI erhalten wurde, wobei ein Plasmid pUCA hergestellt wurde. Ein großes Fragment, das durch Verdauen des Fragments (B) mit KpnI erhalten wurde, wurde mit einem großen Fragment, das durch Verdauen von pHSG399 (Takara Shuzo) mit HincI und KpnI erhalten wurde, ligiert, wobei das Plasmid pHSGB hergestellt wurde.
Das Plasmid pUCA wurde mit KpnI verdaut, und das verdaute Ende wurde unter Verwendung eines großen Fragments (Klenow-Fragment) der DNA-Polymerase I mit stumpfen Enden versehen, und danach wurde mit PstI verdaut, um schließlich ein DNA-Fragment, welches das Fragment (A) enthält, zu isolieren. Das Plasmid pHSGB wurde mit HindIII verdaut, und das verdaute Ende wurde unter Einsatz des großen Fragments (Klenow-Fragment) der DNA-Polymerase I mit stumpfen Enden versehen, und danach wurde mit PstI verdaut, um schließlich ein DNA-Fragment zu isolieren, welches das Fragment (B) enthält. Die beiden DNA-Fragmente wurden miteinander ligiert, wobei ein Plasmid pHSGSK erhalten wurde.
Das SmaI-KpnI-Fragment, das auf dem Plasmid pHSGSK enthalten war und von den Fragmenten (A) und (B) stammte, wurde als "Fragment (C)" bezeichnet. Das Fragment (C) entspricht einem Fragment, das durch Verdauen des HindIII-HindIII-Fragments von 4,8 kb, welches das ilvGM-Gen enthält, mit SmaI und KpnI erhalten wird, wobei der Promotor, die SD-Sequenz und die stromaufwärtige Region des ilvG-Gens, jedoch nicht eine Sequenz von etwa 0,2 kb im Bereich von der Leadersequenz bis zur Attenuatorregion enthalten sind. Das Verfahren zum Konstruieren von pHSGSK, wie vorstehend beschrieben, ist in 1 zusammengefasst.
Das Fragment (C) wurde durch Verdauen des Plasmides pHSGSK mit SmaI und KpnI erhalten. Ein großes DNA-Fragment wurde durch Verdauen des Plasmides pBRGM7 mit SmaI und KpnI erhalten. Die beiden Fragmente wurden miteinander ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde pdGM1 genannt. Ein HindIII-HindIII-Fragment von 4,6 kb, welches das ilvGM-Gen enthält, das auf pdGM1 enthalten ist, weist nicht die für die Attenuation erforderliche Region auf. Das ilvGM-Gen, welche die für die Attenuation erforderliche Region nicht aufweist, wird als "ΔattGM" in diesem Beispiel und in den Zeichnungen bezeichnet. Das vorstehend beschriebene Verfahren zum Konstruieren von pdGM1 ist in 2 zusammengefasst.
Das Plasmid pDRIA4, das in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-458 beschrieben ist, ist in Bakterien der Gattung Escherichia autonom replizierbar. Das Plasmid pDRIA4 wird durch Kombinieren eines Shuttle-Vektors pDR1120, der in Bakterien der Gattung Brevibakterien autonom replizierbar ist, mit einem BamHI-BamHI-Fragment, welches das für Threonindeaminase aus E.-coli-K-12 codierendes ilvA-Gen und einem Teil der 3'-terminalen Seite des ilvD-Gens enthält. Das BamHI-BamHI-Fragment wird in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-458 als 2,3 kb-Fragment beschrieben. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das BamHI-BamHI-Fragment 2,75 kb groß ist. Das Plasmid pDRIA4 existiert außerhalb der chromosomalen DNA von Brevibakterium flavum AJ12358 (FERM P-9764) oder Brevibakterium flavum AJ12359 (FERM P-9765). Das Plasmid pDRIA4 kann aus diesen Stämmen nach üblichen Verfahren hergestellt werden.
Das HindIII-BamHi-Fragment, welches das für Threonindeaminase codierende ilvA-Gen enthält, wobei die Inhibition durch L-Isoleucin im Wesentlichen ausgeschaltet ist, wurde aus dem BamHI-BamHI-DNA-Fragment von 2,75 kb auf dem Plasmid pDRIA4 hergestellt. Das HindIII-BamHi-Fragment wurde mit einem DNA-Fragment ligiert, das durch Verdauen eines Vektors pMW119 (hergestellt von Nippon Gene) mit HindIII und BamHI erhalten wurde. Das so hergestellte Plasmid wurde pMWA1 genannt.
Ein DNA-Fragment, erhalten durch Verdauen des Plasmides pMWA1 mit HindIII, wurde mit einem DNA-Fragment, welches das ilvGM-Gen, erhalten durch Verdauen des Plasmides pdGM1 mit HindIII, enthält, ligiert. Ein Plasmid, worin das ilvGM-Gen dieselbe Transkriptionsrichtung wie die Transkriptionsrichtung des ilvA-Gens hat, wurde durch Analysieren der Position der Restriktionsenzymerkennungsstelle, die auf dem Plasmid vorhanden ist, selektiert. Das erhaltene Plasmid wurde pMWGMA2 genannt. Das Plasmid pMWGMA2 hat das ilvGM-Gen, von dem der Attenuator entfernt worden ist, einen Teil der 5'-terminalen Seite des ilvE-Gens und einen Teil der 3'-terminalen Seite des ilvD-Gens. Das vorstehend beschriebene Verfahren zum Konstruieren von pMWGMA2 ist in 3 zusammengefasst.
Chromosomale DNA von Escherichia coli MI162 wurde präpariert und dann mit SalI und PstI unter Bildung eines DNA-Fragmentgemisches verdaut. Auf der anderen Seite wurde der Vektor pUC19 (Takara Shuzo) mit SalI und PstI verdaut, wobei ein DNA-Fragment hergestellt wurde. Das DNA-Fragmentgemisch wurde mit dem DNA-Fragment ligiert, das durch Verdauen von pUC19 erhalten wurde, wobei ein DNA-Gemisch erhalten wurde. Dieses DNA-Gemisch wurde in den Stamm AB2070 als Transaminase B-defizienter Stamm (J. Bacteriol., 109, 703 (1972), erhalten vom E. coli Genetic Stock Center, CGSC2070) eingeführt, um einen transformierten Stamm zu selektieren, der eine Auxotrophie für verzweigte Aminosäuren aufweist. Nach Präparation eines Plasmides aus dem erhaltenen Stamm wurde das DNA-Fragment, erhalten durch Verdauen des Plasmides pUC19 mit SalI und PstI, mit dem SalI-PstI-DNA-Fragment, welches das ilvE-Gen enthält, ligiert. Das Plasmid wurde pUCE1 genannt. Das Plasmid pUCE1 umfasst einen Teil der 3'-terminalen Seite des ilvM-Gens, das ilvE-Gen und einen Teil der 5'-terminalen Seite des ilvD-Gens.
Das Plasmid pMWGMA2 wurde mit HindIII teilweise verdaut, wobei ein DNA-Fragmentgemisch erhalten wurde. Andererseits wurde pU-CE1 mit HindIII verdaut, wobei ein HindIII-HindIII-DNA-Fragment von 1,7 kb erhalten wurde, welches einen Teil des ilvE-Gens und einen Teil der 5'-terminalen Seite des ilvD-Gens enthält. Beide wurden miteinander ligiert, wobei ein DNA-Gemisch erhalten wurde, das eingesetzt wurde, um einen Dihydroxysäuredehydratase (ilvD-Genprodukt)-defizienten Stamm, d. h. den Stamm AB1280, zu transformieren. Ein transformierter Stamm, aus dem die Auxotrophie für verzweigte Aminosäuren verschwunden war, wurde aus den transformierten Stämmen ausgewählt. Nachdem aus dem erhaltenen transformierten Stamm ein Plasmid präpariert worden war, wurde ein DNA-Fragment, erhalten durch Verdauen von pMWGMA2 allein an der HindIII-Stelle, die zwischen ΔattGM und ilvA vorhanden ist, mit dem HindIII-HindIII-DNA-Fragment von 1,7 kb, das aus pUCE1 stammt und einen Teil des ilvE-Gens und einen Teil des ilvD-Gens enthält, worin das ilvGMEDA-Operon regeneriert war, ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pMWD5 genannt. Das vorstehend beschrie bene Verfahren zum Konstruieren von pMWD5 ist in 4 zusammengefasst.
Das Plasmid pMWD5 (Ap^r), das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, ist ein Plasmid, das auf der Verwendung von pMW119 als Vektor basiert, welcher das ilvGMEDA-Operon trägt, aus dem die für die Attenuation erforderliche Region entfernt ist.
(3) Erzeugung des L-Isoleucin-produzierenden Bakteriums
Das Plasmid pVIC40-pps wurde in Escherichia coli VNIIGenetika TDH-6 (TDH-6 entspricht einem Wirtsbakterium, erhalten durch Entfernen des Plasmids pVIC40 aus Escherichia coli VKPM B-3996, wie vorstehend beschrieben) eingeführt, um eine Transformante unter Einsatz von Sm^r zu selektieren. Außerdem wurde das Plasmid pMWD5 eingeführt, um eine Transformante TDH-6/pVIC40-pps,pMWD5 mit Sm^r und Ap^r zu erhalten. Andererseits wurde pVIC40 und pMWD5 in TDH-6 wie vorstehend beschrieben unter Einsatz von Sm^r und Ap^r eingeführt, wobei TDH-6/pVIC40, pMWD5 erhalten wurde.
<2> Beurteilung der L-Isoleucin-Produktivität
TDH-6/pVIC40-pps, pMWDS wurde 24 Stunden bei 37°C unter Verwendung eines L-Isoleucin-produzierenden Mediums kultiviert (enthaltend 40 g Glucose, 16 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliummonophosphat, 1 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisensulfatheptahydrat, 0,01 g Manganchloridtetrahydrat, 2 g Hefeextrakt und 40 g Calciumcarbonat in 1 1 Wasser, pH = 7,0). TDH-6/pVIC40, pMWD5 wurde als Kontrolle auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben kultiviert. Das in dem Medium enthaltene L-Isoleucin wurde durch Hochleistungsflüssigchromatografie quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Industrielle Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß ist es möglich, die Aminosäuren L-Threonin und L-Isoleucin in hoher Ausbeute zu produzieren. Die Produktion dieser L-Aminosäuren kann durch Anwenden der vorliegenden Erfindung auf Mikroorganismen mit einer hohen Produktion dieser L-Aminosäuren weiter verstärkt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, umfassend die Schritte des Kultivierens eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, die L-Aminosäure zu produzieren, in einem Medium, Produzieren und Akkumulieren der L-Aminosäure in dem Medium und Gewinnen der L-Aminosäure, wobei die L-Aminosäure L-Threonin oder L-Isoleucin ist, und die Aktivität von Phosphoenolpyruvatsynthase in Mikroorganismuszellen im Vergleich mit einem Wildstamm erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist, das zur Gattung Escherichia gehört.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Coryneform Bakterium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aktivität von Phosphoenolpyruvatsynthase in Mikroorganismuszellen durch Erhöhung der Expressionsmenge eines Phosphoenolpyruvatsynthasegens in den Mikroorganismuszellen erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Expressionsmenge des Phosphoenolpyruvatsynthasegens durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Stamm ist, der mit dem Phosphoenolpyruvatsynthasegen transformiert ist.