RU2288264C2 - Бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-треонина и способ получения l-треонина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в котором указанная бактерия, обладающая способностью к продукции L-треонина, модифицирована таким образом, что экспрессия гена, выбранного из группы, включающей в себя glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno, и pykA, кодирующего ферменты гликолиза, усилена. Заявленное изобретение позволяет получать L-треонин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 12 табл.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения L-аминокислот методом ферментации, и более конкретно, к генам, полученным из бактерии Escherichia coli. Использование указанных генов способствует увеличению продукции L-аминокислот, например, продукции L-треонина.

Краткое описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой или побочными продуктами реакции (смотри, например, патенты США 4,346,170, 5,661,012 и 6,040,160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Эти штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5,175,107; 5,661,012; 5,705,371; 5,939,307; европейский патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ WO 0114525 А1, европейская патентная заявка 301572 А2, патент США 5,376,538), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5,175,107 и 5,661,012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5,939,307 и 6,297,031).

Штамм ВКПМ В-3996 (патенты США 5,175,107 и 5,705,371) на сегодняшний день является лучшим из известных штаммов-продуцентов треонина. Для создания штамма ВКПМ В-3996, несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были введены в родительский штамм Е. coli К-12 (ВКПМ В-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген UvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что является очень эффективньм при продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.

Ранее авторы настоящего изобретения получили, исходя из Е. coli К 12, мутант, содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rhtA23), придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Фенотипически мутация выражается в повышении продукции L-треонина (патент СССР № 974817), гомосерина, и глутамата (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991, Европейская патентная заявка 1013765А) соответствующим штаммом-продуцентом Е. coli, таким как штамм ВКПМ-3996. Более того, авторы настоящего изобретения показали, что ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е. coli, рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, и что ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и отрХ. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину).

Кроме того, авторами настоящего изобретения было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении-1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract № 457; европейская патентная заявка 1013765).

В условиях, когда главный путь биосинтеза треонина изучен и в значительной степени оптимизирован, дальнейшее улучшение штамма-продуцента треонина может быть постигнуто путем повышения эффективности путей центрального метаболизма, таких как гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа), обеспечивающего клетку энергией и различными предшественниками метаболитов.

В работе гликолизного пути участвуют следующие ферменты: глюкокиназа (ЕС 2.7.1.2), кодируемая геном glk, фосфоглюкозоизомераза (ЕС 5.3.1.9), кодируемая геном pgi, фосфофруктокиназа-1 (фруктозо-6-Р-1-киназа) (ЕС 2.7.1.11), кодируемая геном pfkA, фруктозо-1,6-бифосфатальдолаза (ЕС 4.1.2.13), кодируемая геном fbaA, триозофосфатизомераза (ЕС 5.3.1.1), кодируемая геном tpiA, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.12), кодируемая геном gapA, фосфоглицераткиназа (ЕС 2.7.2.3), кодируемая геном pgk, фосфоглицеромутаза (ЕС 2.7.5.3), кодируемая геном gpmA, енолаза (ЕС 4.2.1.11), кодируемая геном eno и изоэнзимы пируваткиназы (ЕС 2.7.1.40), кодируемые генами pykA и pykF (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Опубликован процесс производства L-лизина или других пищевых добавок, содержащих L-лизин, с помощью ферментации коринеформных бактерий, с повышенной экспрессией аллели хромосомного гена glk в условиях, способствующих формированию продукта указанного гена glk-глюкокиназы (заявка РСТ WO 03054198 A1). Также был опубликован способ получения шикимовой кислоты и ее производных с помощью ферментации бактерий Е. coli, трансформированных рекомбинантной ДНК, содержащей гены, кодирующие белок, способствующий усвоению глюкозы (glucose facilitator protein) и глюкокиназу из Zymononas mobilis, и благодаря этому обладающих способностью синтезировать шикимовую кислоту из источника углерода питательной среды (заявка РСТ WO 0229078 A2). Кроме того, описаны процессы получения внутриклеточных промежуточных метаболитов с помощью микроорганизмов - таких как эритрозо-4-фосфат, и альтернативные процессы получения соединений, например, ароматических аминокислот, таких как L-фенилаланин с помощью микроорганизмов. При этом активность трансальдолазы у указанных микроорганизмов-продуцентов была повышена (патент США 6,316,232). Этот патент '232 в качестве наилучшего способа осуществления изобретения описывает дополнительное увеличение активностей транскетолазы или транспортного белка, осуществляющего РЕР-независимый импорт сахара в клетку и/или глюкокиназы. Заявленные в патенте микроорганизмы принадлежат к родам Escherichia, Seurratia, Bacillus, Corynebacterium или Breibacterium.

Опубликован способ получения L-аминокислот, в частности L-лизина, включающий в себя культивирование модифицированных бактериальных клеток, в частности Corynebacterium glutamicum, содержащих повышенный пул НАДФН по сравнению с неизмененными бактериальными клетками, в котором указанная модифицированная бактериальная клетка отличается усиленным потоком углерода через окислительную ветвь пентозофосфатного цикла (заявка РСТ WO 0107626 A2). Эта патентная заявка в качестве наилучшего способа осуществления изобретения описывает модифицированную бактериальную клетку с ослабленным потоком углерода через гликолитический путь из-за сниженной каталитической активности 6-фосфоглюкозоизомеразы, возникшей в результате мутации в resepgi. Также опубликован сходный способ получения L-лизина с использованием коринеформных бактерий, с нулевой внутриклеточной активностью фосфоглюкозоизомеразы (pgi) (патент США 6,586,214).

Опубликован способ получения L-лизина, включающий в себя культивирование коринеформной бактерии - продуцентов L-лизина, в которой повышена внутриклеточная активность 6-фосфофруктокиназы, кодируемой геном pfkA (Европейская патентная заявка ЕР 1195431 А1). Но в то же время был опубликован процесс получения L-аминокислот, в частности L-лизина, путем ферментации, включающий в себя культивирование коринеформных бактерий для получения целевой L-аминокислоты, у которой как минимум один ген, кодирующий 6-фосфофруктокиназу (pfkA ген) и/или ген, кодирующий 1-фосфофруктокиназу (fruK ген), ослаблен(ы) (заявка РСТ WO 02074944 A1). В этой публикации в качестве наилучшего практического осуществления процесса получения L-лизина с использованием коринеформной бактерии, помимо ослабления гена/ов pfK- и/или fruK, также одновременно усилены, в частности, усилена экспрессия одного или более генов из группы, включающей в себя ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, устойчивую к ингибированию по типу обратной связи, ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу, ген gap, кодирующий глицеральдегидфосфатдегидрогеназу, ген рус, кодирующий пируваткарбоксилазу, ген mqo, кодирующий малат-хинон-оксидоредуктазу, ген zwal, кодирующий глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, ген lysE, кодирующий экспортер лизина, ген zwal, кодирующий белок zwal, ген tpi, кодирующий триозофосфатизомеразу, и ген pgk, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу.

Описан процесс получения L-аминокислот, таких как L-лизин и L-треонин, методом ферментации коринеформных бактерий, в которых амплифицирован, как минимум, ген zwf (заявка РСТ WO 0170995 A1). В этой публикации в качестве наилучшего способа осуществления изобретения описывается процесс получения L-аминокислот с использованием коринеформных бактерий, в которых, помимо амплификации гена zwf, дополнительно амплифицированы или обладают повышенной экспрессией один или несколько генов одновременно из группы, состоящей из: ген dapA, кодирующий дигидропиколинатсинтазу, ген lysC, кодирующий аспартаткиназу, устойчивую к ингибированию по типу обратной связи, ген gap, кодирующий глицеролальдегид-3-фосфатдегидрогеназу, ген pyc, кодирующий пируваткарбоксилазу, ген tkt, кодирующий транскетолазу, ген gnd, кодирующий глюконат-6-фосфатдегидрогеназу, ген lysE, кодирующий экспортер лизина, ген zwal, ген eno, кодирующий енолазу.

Описаны коринеформные бактерии-продуценты L-аминокислот, включая L-треонин, содержащих от одной копии на хромосоме в природном локусе и до трех дополнительных копий генов или открытых рамок считывания (ORF), выбранных из группы, которая помимо других генов, включает в себя гены eno, gap, pgk и tpi (заявки РСТ WO 03014330 A2, WO 03040373 A2).

Описан процесс получения L-глутаминовой кислоты методом ферментации коринеформных бактерий, в которой экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей D-аланинрацемазу (alr), ослаблена, в частности, отсутствует (заявка РСТ WO 0208437 A2). В этой публикации в качестве наилучшего воплощения описывается процесс получения L-глутаминовой кислоты с использованием коринеформной бактерии, в которой, помимо ослабленной экспрессии нуклеотидой последовательности, кодирующей D-аланинрацемазу (alr), дополнительно усилены или обладают повышенной экспрессией один или несколько генов из группы, которая помимо других генов, включает в себя гены gap и eno.

Описан способ получения химически чистых соединений или метаболитов, таких как L-треонин, с использованием микроорганизмов, в частности, коринеформных бактерий или Escherichia coli, в которых способность к фосфорилированию как минимум одного белка была перманентно повышена, благодаря мутации как минимум в одной аминокислоте указанного белка, в результате чего был увеличен выход как минимум одного чистого соединения, синтезируемого микроорганизмом, в сравнении с природным (заявка РСТ WO 03023016 A2). Одним из примеров подобных мутантных белков является енолаза (enoS330E).

Среди генов, кодирующих ферменты гликолиза, для повышения продукции L-треонина бактериями семейства Enterobacteriaceae, в частности Escherichia coli, были модифицированы четыре гена. Это гены fbaA, gpmA (pgm),pykF и pfkB.

Так был описан процесс получения L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, продуцирующих целевую L-аминокислоту, и в которых повышена экспрессия гена fba или нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок Fba (PCT application WO 03004664 A2). В то же время, тем же самым заявителем была подана патентная заявка РСТ WO 03004662 A2 на процесс ферментативного производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой L-аминокислоты, в которых экспрессия одного или более генов из группы, включающей в себя среди прочих ген fba, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Fba, ослаблена, в частности, отсутствует. Данная заявка не содержит практических примеров.

Также был заявлен процесс производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой аминокислоты, в которых повышена экспрессия renapgm или нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Pgm (заявка РСТ WO 03004598 A2). В то же время, тем же самым заявителем была подана патентная заявка РСТ WO 03004662 A2 на процесс ферментативного производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой L-аминокислоты, в которых экспрессия одного или более генов из группы, включающей в себя среди прочих ген pgm, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Pgm, ослаблена, в частности, отсутствует. Данная заявка не содержит практических примеров.

Также был заявлен процесс производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой аминокислоты, в которых повышена экспрессия гена pykF или нуклеотидной последовательности, кодирующей белок PykF (заявка РСТ WO 03008609 A2). В то же время, тем же самым заявителем была подана патентная заявка РСТ WO 03008600 A2 на процесс ферментативного производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой L-аминокислоты, в которых экспрессия одного или более генов из группы, включающей в себя среди прочих ген pykF, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок PykF, ослаблена, в частности, отсутствует. Данная заявка не содержит практических примеров.

И, наконец, процесс производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой аминокислоты, в которых повышена экспрессия гена pfkB или нуклеотидной последовательности, кодирующей белок PfkB (заявка РСТ WO 03008610 A2). В то же время, тем же самым заявителем была подана патентная заявка РСТ WO 03008600 A2 на процесс ферментативного производства L-аминокислот, в частности L-треонина, путем ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae - продуцентов целевой L-аминокислоты, в которых экспрессия одного или более генов из группы, включающей в себя среди прочих ген pfkB, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок PfkB, ослаблена, в частности, отсутствует. Данная заявка не содержит практических примеров.

На сегодняшний день нет сведений об использовании бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, с повышенной экспрессией генов, кодирующих ферменты гликолиза, таких как glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno и pykA, для продукции L-треонина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов продуцентов L-треонина и предоставление способа получения L-треонина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что гены, такие как glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno и pykA, кодирующие ферменты гликолиза, клонированные в низкокопийный вектор, могут увеличивать продукцию треонина. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, продуцента L-треонина, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность одного или более ферментов гликолиза увеличена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, продуцента L-треонина, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия одного или более генов, выбранных из группы генов glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno и pykA, кодирующих ферменты гликолиза, или нуклеотидные последовательности, кодирующие такие же ферменты, усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия одного или нескольких указанных генов усилена за счет увеличения числа копий этого гена/этих генов или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена/ов таким образом, что экспрессия указанного/ых гена/ов усиливается.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный/ые ген/ы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой указанные гены получены из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из;

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу; и

- гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA усилена.

А также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-треонина, включающего выращивание описанной выше бактерии в питательной и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Бактерия, согласно настоящему изобретению - это бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, продуцент L-треонина, модифицированная с целью повышения активности одного или более ферментов гликолиза. Более конкретно, бактерией, согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина, модифицированная с целью усиления экспрессии одного или более генов, выбранных из группы glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno и pykA, кодирующих ферменты гликолиза, или нуклеотидных последовательностей, которые кодируют указанные ферменты.

Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент треонина» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-треонина в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-треонина может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-треонина» также означает бактерию, которая способна к продукции L-треонина и вызывает накопление L-треонина в ферментационной среде в количествах больших, чем природный или родительский штамм Е. coli, такой, как штамм Е. coli К-12.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, но не единственного в указанном роду, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1) могут быть включены в их число согласно настоящему изобретению.

Термин «модифицирована таким образом, что экспрессия гена/ов усилена» означает то, что количество экспрессируемых копий гена/ов выше, чем у не модифицированного штамма, например, природного штамма. Примерами такой модификации могут являться увеличение количества экспрессируемого/ых гена/ов в пересчете на одну клетку, повышение уровня экспрессии гена и так далее. Количество копий экспрессирующегося гена может быть измерено, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК, с последующей гибридизацией по Саузерну, при этом в качестве зонда используется зонд, синтезированный на основе нуклеотидной последовательности исследуемого гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и подобные им. Уровень экспрессии генов определяется с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественный RT-PCR и подобным им. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате повышения уровня экспрессии указанного/ых гена/ов наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-треонина.

Ферменты гликолиза, согласно настоящему изобретению, представлены глюкокиназой (ЕС 2.7.1.2), кодируемой геном glk, фосфоглюкозоизомеразой (ЕС 5.3.1.9), кодируемой геном pgi, фосфофруктокиназой-1 (фруктозо-6-Р 1-киназой) (ЕС 2.7.1.11), кодируемой геном pfkA, триозофосфатизомеразой (ЕС 5.3.1.1), кодируемой геном tpiA, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой (GAPDH) (ЕС 1.2.1.12), кодируемой геном gapA, фосфоглицераткиназой (ЕС 2.7.2.3), кодируемой геном pgk, енолазой (ЕС 4.2.1.11), кодируемой геном eno и изоферментами пируваткиназы (ЕС 2.7.1.40), кодируемых геном pykA.

Согласно настоящему изобретению, термин "глюкокиназа" означает фермент, способный к катализу реакции АТФ-зависимого фосфорилирования глюкозы с образованием глюкозо-6-фосфата. Термин "фосфоглюкозоизомераза" означает фермент, способный к катализу реакции превращения глюкозо-6-фосфата в фруктозо-6-фосфат. Термин "фосфофруктокиназа-1 (фруктозо-6-Р 1-киназа)" означает фермент, способный к катализу реакции АТР-зависимого фосфорилирования глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозо-1,6-дифосфата. Термин "триозофосфатизомераза " означает фермент, способный к катализу реакции взаимопревращения диоксиацетонфосфата в глицеральдегид-3-фосфата и наоборот. Термин "глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа" означает фермент, способный к катализу реакции НАД⁺-зависимого превращения глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат. Термин "фосфоглицераткиназа" означает фермент, способный к катализу реакции дефосфорилирования 1,3-дифосфоглицерата с образованием 3-фосфоглицерата и АТФ. Термин "енолаза" означает фермент, способный к катализу реакции дегидратации 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата. Термин "пируваткиназа" означает фермент, способный к катализу реакции образования пирувата из фосфоенолпирувата с высвобождением АТФ.

Любой из упомянутых генов, полученных из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и генов, полученных из других бактерий, таких как коринеформные бактерии, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus или подобные им, могут быть использованы в качестве генов, кодирующих указанные ферменты гликолиза. Среди этих генов, гены, полученные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, предпочтительны.

В качестве гена, кодирующего глюкокиназу из Escherichia coli, известен ген glk (номера нуклеотидов с 2506481 по 2507446 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16130320; SEQ ID NO:1). Ген glk расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между открытыми рамками считывания (ORF) b2387 и b2389. В качестве гена, кодирующего фосфоглюкозоизомеразу Escherichia coli, известен ген pgi (номера нуклеотидов с 4231337 по 4232986 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi: 16131851; SEQ ID NO: 3). Ген pgi расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между генами lysC-ayjbE. В качестве гена, кодирующего фосфофруктокиназу-1 из Escherichia coli, известен ген pfkA (номера нуклеотидов с 4105132 по 4106094 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi:16131754; SEQ ID NO: 5). FespfkA расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между рамкой считывания yiiP ORF и геном sbp. В качестве гена, кодирующего триозофосфатизомеразу из Escherichia coli, известен ген tpiA (номера нуклеотидов с 4108320 по 4109087 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi:16131757; SEQ ID NO: 7). Ген tpiA расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между геном cdh и рамкой считывания ORF. В качестве гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из Escherichia coli, известен ген gapA (номера нуклеотидов с 1860795 по 1861790 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi: 16129733;

SEQ ID NO: 9). Ген gapA расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между рамками считывания уеаА ORF и уеаО ORF. В качестве гена, кодирующего фосфоглицераткиназу из Escherichia coli, известен ген pgk (номера нуклеотидов с 3069479 по 3070642 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi: 16130827; SEQ ID NO: 11). Ympgk расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между генами fbaA и epd. В качестве гена, кодирующего енолазу из Escherichia coli, известен ген eno (номера нуклеотидов с 2904665 по 2905963 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi: 1613 0686;

SEQ ID NO: 13). Ген eno расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между рамкой считывания b2778 ORF и геном pyrG. В качестве гена, кодирующего пируваткиназу II из Escherichia coli, известен ген pykA (номера нуклеотидов с 1935673 по 1937115 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank, gi: 16129807; SEQ ID NO: 15). Ген pykA расположен в хромосоме штамма Е. coli K12 между рамкой считывания yebK ORF и геном msbB. Следовательно, ген asd может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al.. Trends Genet, 5,185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основании последовательности нуклеотидов указанного гена.

Примером гена glk из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (А) или (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); или

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью глюкокиназы.

Примером гена pgi из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (С) или (D):

(C) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO:4); или

(D) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO:4), и который обладает активностью фосфоглюкозоизомеразы.

Примером гена pfkA из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (Е) или (F):

(Е) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID NO:6); или

(F) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID NO:6), и который обладает активностью фосфофруктокиназы-1 (фруктозо-6-Р 1-киназы).

Примером гена tpiA из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (G) или (Н):

(G) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO:8); или

(Н) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO:8), и который обладает активностью триозофосфатизомеразы.

Примером гена gapA из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (I) или (J):

(I) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO:10); или

(J) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO:10), и который обладает активностью глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Примером гена pgk из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (К) или (L):

(К) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO:12); или

(L) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO:12), и который обладает активностью фосфоглицераткиназы.

Примером гена eno из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (М) или (N):

(М) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 14 (SEQ ID NO:14); или

(N) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 14 (SEQ ID NO:14), и который обладает активностью енолазы.

Примером гена pykA из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (О) или (Р):

(О) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 16 (SEQ ID NO:16); или

(Р) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 16 (SEQ ID NO:16), и который обладает активностью пируваткиназы.

Количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15, и, более предпочтительно, от 2 до 5 для белка (А). Это происходит из-за того, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия в таких аминокислотах не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка и его активности. Поэтому, белком (В) может быть белок, имеющий гомологию не меньше, чем 30-50%, предпочтительно 50-70%, более предпочтительно 70-90% и наиболее предпочтительно - более 90% по отношению ко всем аминокислотным остаткам, составляющим глюкокиназу и обладающий активностью глюкокиназы. Тот же подход применим и для белков (С), (Е), (G), (I), (К), (М) и (О).

ДНК, кодирующая практически такие же белки, как описанные выше ферменты гликолиза, может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей указанный фермент, например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенных местах содержат делеции, замены, вставки или добавки. ДНК, модифицированная как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ-излучения или реагентом, таким как Н-метил-Н'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как глюкокиназа, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей клетке, и изучения активности любого экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как глюкокиназа, также может быть получена путем выделения ДНК из геномной ДНК, кодирующей глюкокиназу, содержащую мутации, или из клетки, содержащей ее, и которая гибридизуется с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность 1 (SEQ ID NO: 1), в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью глюкокиназы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Трудно четко описать такие условия в каких-либо численных выражениях. Однако, например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие меньшей гомологией, не гибридизуются друг с другом.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска FASTA описан W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63- 98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).

С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, IxSSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1xSSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, от рекомендаций изготовителя. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1 (SEQ ID NO:1). Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2 х SSC и 0.1% SDS.

Делеции, замены, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, в виду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих глюкокиназу.

ДНК, кодирующая практически такие же белки, как другие ферменты гликолиза, могут быть получены способом, описанным выше для глюкокиназы.

«Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок», означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами.

Трансформация указанной ДНК приводит к увеличению экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, может быть использован метод обработки клеток - реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

К методам увеличения экспрессии гена относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Используемый здесь термин «низкокопийный вектор» используется для векторов, количество которых не превышает 5 копий на клетку. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, может быть использован метод обработки клеток - реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53,159 (1970)).

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосомы бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации, Ми интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Ми интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до трех копий интегрируемого гена.

Также увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, pr или pl промоторы фага лямбда. Сила промотора определяется частотой акта начала синтеза РНК. Методы оценки силы промотора и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J., 5, 2987-2994 (1986)).

Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт-кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Ранее авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении-1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract № 457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим веществам, транспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок одного или более генов, кодирующих ферменты гликолиза, в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO/18935 или патентной заявке Японии № 1-215280.

Увеличение числа копий одного или более генов, кодирующих ферменты гликолиза, может быть достигнуто путем введения множественного числа копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК, в качестве мишеней. В качестве последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК в нескольких копиях, могут использоваться повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Также, как это описано в патентной заявке Японии № 1-109985, возможно ввести целевой ген в транспозон, для последующей трансформации с введением множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и дотирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-треонина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-треонина.

Примерами родительских штаммов, имеющих отношение к настоящему изобретению, при этом не ограничивающих весь возможный список родительских штаммов, могут являться штаммы - продуценты треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5,175,107 и 5,705,371), штамм Е. coli NRRL-21593 (патент США 5,939,307), штамм Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5,474,918), штаммы Е. coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5,376,538), штамм Е, coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е. coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген UvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA *ВС, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105, Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия одного или нескольких следующих генов в дополнение к одному или более генов, кодирующих ферменты гликолиза:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

Другое предпочтительное практическое воплощение настоящего изобретения заключается в том, чтобы указанная бактерия была модифицирована путем усиления экспрессии гена rhtA, кодирующего, как предполагается, трансмембранный белок. Наиболее предпочтительным воплощением настоящего изобретения является бактерия с усиленной экспрессией гена/ов, кодирующего/их ферменты гликолиза, мутантного гена thrA, генов thrB, thrC и rhtA.

Способ получения L-треонина согласно настоящему изобретению включает стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде, и выделения L-треонина из культуральной жидкости. Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-треонина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Некоторые питательные добавки могут быть, при необходимости, добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим изолейцин (ауксотрофия по изолейцину), соответствующее количество изолейцина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-треонин может быть выделен и очищен методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

На чертеже изображена структура синтетического мутантного промотора Р_A3m.

Примеры.

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие Примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения. Для оценки эффекта амплификации генов, кодирующих ферменты гликолиза, на продукцию L-треонина, в качестве родительского штамма был использован штамм Е. coli ВКПМ В-3996 (патент США 5,175,107). Плазмида pMW119 и ее производные совместимы с плазмидой pVIC40 (репликон pRSF1010), следовательно обе плазмиды - pVIC40 и плазмида, производная от pMW119, содержащая ген, кодирующий фермент гликолиза могут одновременно экспрессироваться в одной бактериальной клетке. В приведенных таблицах представлены результаты ферментации как среднее из минимум трех независимых экспериментов.

Пример 1: Клонирование гена glk из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена glk на продукцию L-треонина.

Ген glk был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры PI (SEQ ID NO: 17) и Р2 (SEQ ID NO: 18). Праймер PI содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р2 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (968 п.н.), включающий в себя ген glk, обработали рестриктазами BamHI и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Р_lac на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-PR-glk, содержащая ген glk под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена glk за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-Pp-glk ввели в устойчивый к стрептомицину штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996(pMW-PR-glk).

Оба штамма Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-glk) выращивались в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащих стрептомицин (100 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл). Для получения посевной культуры, каждый из штаммов выращивался в ферментационных пробирках 20х200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой на роторной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов. Затем в ферментационную среду внесли 0.1 мл (5%) посевной культуры. Ферментацию проводили в пробирках 20х200 мм с 2 мл минимальной ферментационной среды. Клетки выращивались в течение 24 часов при температуре 32°С на роторной качалке при 250 об/мин.

После окончания ферментации количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Пластинки Sorbfil (Акционерное Общество Сорбополимер, Краснодар, Россия) экспонировались в жидкой фазе следующего состава: изопропанол: ацетон: вода: 25% аммиак = 25:25: 7: 6 (соотношения объема). В качестве визуализирующего реагента использовался раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 1.

Использовали следующий состав среды для ферментации (г/л):

Глюкоза	40.0
(NH4)2SO4	10.0
КН2PO4	1.0
MgSO4×7H2O	0.4
FeSO4×7H2O	0.02
MnSO4×5Н2О	0.02
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
СаСО3	20.0
L-изолейцин	0.05

Сахарозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН соответствовало 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.

Таблица 1.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
В-3996	9.7±0.1	14.3±0.1
B-3996(pMW-PR-glk)	9.6±0.1	14.8±0.1

Как видно из Таблицы 1, усиление экспрессии гена glk повышает продукцию L-25 треонина штаммом В-3996.

Пример 2: Клонирование гена pfkA из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена pjkA на продукцию L-треонина.

Ген pfkA был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали 30 хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры Р3 (SEQ ID NO: 19) и Р4 (SEQ ID NO: 20). Праймер Р3 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р4 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (987 п.н.), содержащий ген pfkA напрямую клонировали в вектор pCR 2.1 (Invitrogen) путем лигирования смеси вектора и фрагмента в течение ночи при + 4°С. Затем фрагмент ДНК BamHI - Sad, содержащий ген pfkA, переклонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Р_lac на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-PR- pfkA, содержащая ген pfkA под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена pfkA за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-PR-pfkA ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR- pfkA).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-pfkA) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996	9.7±0.1	14.3±0.1
B-3996(pMW-PR-pfkA	9.3±0.1	14.4±0.1

Поскольку эффект влияния усиления экспрессии гена pfkA на увеличение продукции L-треонина оказался в пробирочной ферментации несущественен, была проведена ферментация по исчерпанию глюкозы (batch fermentation) в лабораторных ферментерах емкостью 1.0 литр.

Для этой цели штаммы Е. coli ВКПМ-3996 и ВКПМ-3996(рМ-PR-pfkA) выращивали в течение 18-24 часов 37°С при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащих стрептомицин (100 мкг/мл). Затем одну микробиологическую петлю с культурой клеток внесли в 50 мл L-бульона следующего состава: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л. Клетки (50 мл, OD540 - 2 о.е.), выращенные при 37°С в течение 5 часов на щейкере (240 об/мин), использовали в качестве посевного материала - для засева 450 мл ферментационной среды. Ферментация (batch fermentation) проводилась в лабораторных ферментерах емкостью в 1.0 литр с аэрированием (1/1 wm) и скоростью мешалки 1200 об/мин при 37°С. рН статирование производилось автоматически - поддерживалось значение рН 6.6 с использованим 8% водного раствора аммиака. Результаты представлены в Таблице 3.

Использовали следующий состав среды для ферментации (г/л):

Глюкоза	100.0
NH4Cl	1.75
KH2РО4	1.0
MgSO4×7H2O	0.8
FeSO4×7H2O	0.01
MnSO4×5H2O	0.01
Mameno (TN)	0.15
Бетаин	1.0
L-изолейцин	0.2

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. Значение рН соответствовало 6.6.

Таблица 3

Штамм	OD560 (конечная)	Треонин, г/л
В-3996 B-3996(pMW-PR-pfkA)	39.9±2.1 34.4±1.5	33.80±3.1 39.57±1.0

Как видно из Таблицы 3, усиление экспрессии гена pfkA повышает продукцию L-треонина штаммом В-3996.

Пример 3: Клонирование гена fbaA из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии TQH.Q.fbaA на продукцию L-треонина.

TesfbaA был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры Р5 (SEQ ID NO: 21) и Р6 (SEQ ID NO: 22). Праймер Р5 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р6 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (1155 п.н.), включающий в себя ген fbaA, обработали рестриктазами BamHI и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Р_lac на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-PR-fbaA, содержащая ген fbaA под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена fbaA за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-PR-fbaA ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR- fbaA).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR- fbaA) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996	9.7±0.1	14.3±0.1
B-3996(pMW-PR-fbaA)	9.3±0.2	15.1±0.5

Как видно из Таблицы 4, усиление экспрессии гена fbaA повышает продукцию L-треонина штаммом B-3996.

Пример 4: Клонирование гена tpiA из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена tpiA на продукцию L-треонина.

Ген tpiA был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры Р7 (SEQ ID NO: 23) и Р8 (SEQ ID NO: 24). Праймер Р7 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р8 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (774 п.н.), включающий в себя ген tpiA, обработали рестриктазами BamHI и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора fda на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида rmw-pr- tpiA, содержащая ген tpiA под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена tpiA за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-PR-tpiA ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина E. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR-tpiA).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-tpiA) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 5.

Таблица 5.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996	9.7±0.1	14.3±0.1
B-3996(pMW-PR-tpiA)	9.6±0.5	14.6±0.1

Поскольку эффект влияния усиления экспрессии гена tpiA на увеличение продукции L-треонина в пробирочной ферментации оказался несущественным, была проведена ферментация по исчерпанию глюкозы (batch fermentation) в лабораторных ферментерах емкостью 1.0 литр, как описано выше (смотри Пример 2).

Результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 6.

Штамм	OD560 (конечная)	Треонин, г/л
B-3996 B-3996(pMW-PR-tpiA)	39.9±2.1 34.9±2.6	33.80±3.1 37.16±1.4

Как видно из Таблицы 6, усиление экспрессии гена tpiA повышает продукцию L-треонина штаммом B-3996.

Пример 5: Клонирование гена gapA из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена gapA на продукцию L-треонина.

Для изучения влияния эффекта усиления экспрессии гена gapA на продукцию L-треонина, ген gapA был клонирован в плазмиду pMWl 19 под контроль мутантного синтетического промотора (А3m), полученного из промотора A3 фага Е. coli Т3 (Yamada, M. et al. Promoter sequence analysis in Bacillus and Escherichia coli: construction of strong promoter in Е. coli. Gene, 99(1), 109-114 (1991)). Мутации, введенные в нуклеотидную последовательность промотора A3 - конститутивного полимераза-холофермент Ест⁷⁰- зависимого промотора, привели к снижению его промоторной силы. Нуклеотидная последовательность олигонуклеотидов, составляющих мутантный синтетический промотор А3m, приведены под номерами SEQ ID NO: 25 и 26. Структура промотора А3m изображена на чертеже.

Ген gapA был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры gapA-5' (SEQ ID NO: 27) и gapA-ter (SEQ ID NO: 28). Праймер gapA-5' содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер gapA-ter содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Xbal. Полученный фрагмент ДНК (1200 п.н.), включающий в себя ген gapA с 5' нетранслируемой областью до сайта начала транскрипции Р1 и без собственной промоторной последовательности, обработали рестриктазами BamHI и Xbal, лигировали с синтетическим промотором А3m, чей фрагмент ДНК имел липкие концы EcoRI и BamHI, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, обработанный рестриктазами EcoRI и Xbal. Таким образом была получена плазмида pMWl 19-PA3m-gapA. Структура полученного гена gapA была подтверждена секвенированием.

Клетки штамма Е. coli HB101 трансформировали плазмидой pMWl 19 - PA3m-gapA (Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Активности GAPDH в середине логарифмической кривой роста штаммов HB101 и HB101 (pMW-РА3m-gapA) определялись согласно методике, описанной у Peng. L., и Shimizu. К. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 61,163-178 (2003)). Результаты представлены в Таблице 7.

Таблица 7.

Штамм	Активность (нмоль/мг · мин)
HB101 НВ 101 (pMW-PA3m-gapA)	39 86

Как видно из Таблицы 7, уровень активности GAPDH в клетках HB101, содержащих плазмиду, в 2 раза выше.

Затем плазмиду pMW-PA3m-gapA ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PA3m-gapA).

Оба штамма Е. coli B-3996 и B-3996 (pMWl 19 - pA3-gapA) выращивались в течение ночи при температуре 37°С на чашках с L-агаром, или, в случае штамма В-3996 (pMWl 19 - pA3-gapA), на чашках с L-агаром, содержащих ампициллин (100 мкг/мл). По одной микробиологической петле (OD595 ~ 2 - 3 о.е.) ночной культуры каждого из штаммов внесли в ферментационные пробирки с 2 мл минимальной ферментационной среды следующего состава: дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 16.0 г/л, К₂HPO₄ - 0.7 г/л, MgSO₄ x 7H₂O - 1.0 г/л, MnSO₄ x 5H₂O - 0.01 г/л, FeSO₄ x 7H₂O - 0.01 г/л, тиамин HCl (Bi) - 0.2 мг/л, глюкоза - 4 %, СаСО₃ (мел) -30.0 г/л, L-изолейцин - 50 мг/л, ампициллин - 100 мкг/мл (только для штамма 3996 (pMWl 19 - pA3-gapA)). Клетки выращивались в течение 48 часов при температуре 32°С на роторной качалке при 250 об/мин.

После окончания ферментации, количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии. Использовалась жидкая фаза следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода =4:1:1 (соотношения объема). Аминокислоты окрашивались спиртовым раствором нингидрина (1%), содержащего CdCl₂ (0,5%). После 1 часа инкубации при 37°С, образцы измерялись при ODsog. Результаты представлены в Таблице 8.

Таблица 8.

Штамм	OD555	Треонин, г/л
В-3996	13.2±0.1	13.6±0.2
B-3996(pMW-PA3m-gapA)	13.3±0.1	15.6±0.3

Как видно из Таблицы 8, усиление экспрессии гена gapA повышает продукцию L-треонина штаммом В-3996.

Пример 6: Клонирование гена eno из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена eno на продукцию L-треонина.

Ген eno был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры Р9 (SEQ ID NO: 29) и Р10 (SEQ ID NO: 30). Праймер Р9 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI., Праймер Р10 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (1298 п.н.), включающий в себя ген eno, обработали рестриктазами BamYQ и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Pfd на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-PR-eno, содержащая ген eno под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена eno за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-Pp-eno ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR-eno).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-eno) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 9.

Таблица 9.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996	9.7±0.1	14.3±0.1
B-3996(pMW-PR-eno)	9.3±0.2	14.9±0.4

Как видно из Таблицы 9, усиление экспрессии гена fbaA повышает продукцию L-треонина штаммом B-3996.

Пример 7: Клонирование гена pgi из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена pgi на продукцию L-треонина.

Ген pgi был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма МО 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры P11 (SEQ ID NO: 31) и Р12 (SEQ ID NO: 32). Праймер P11 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р12 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (1657 п.н.), включающий в себя ген pgi, обработали рестриктазами BamHI и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWI 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Р_lac на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-Pp-pgi, содержащая ген pgi под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена pgi за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-PR-pgi ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR-pgi).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-pgi) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 10.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996 B-3996(pMW-PR-pgi)	8.7±0.4 8.4±0.2	18.4±0.7 19.7±0.4

Как видно из Таблицы 10, усиление экспрессии гена pgi повышает продукцию L-треонина штаммом B-3996.

Пример 8: Клонирование гена pgk из Е. coli и эффект влияния повышения экспрессии гена pgk на продукцию L-треонина.

Ген pgk был получен с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК из штамма MG 1655 (ВКПМ В-6195) Е. coli, а в качестве праймеров - праймеры Р13 (SEQ ID NO: 33) и Р14 (SEQ ID NO: 34). Праймер Р13 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BamHI. Праймер Р14 содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы Sad. Полученный фрагмент ДНК (1163 п.н.), включающий в себя ген pgk, обработали рестриктазами BamHI и Sad, после чего клонировали в плазмидный вектор pMWl 19, предварительно модифицированный путем замены промотора Р_lac на промотор pr фага лямбды, также обработанный указанными рестриктазами. Таким образом была получена плазмида rmw-pr-pgk, содержащая ген pgk под контролем промотора pr. Благодаря использованию этой плазмиды можно достичь высокого уровня экспрессии гена pgk за счет отсутствия ее регуляции.

Плазмиду pMW-Pp-pgk ввели в стрептомицин - устойчивый штамм-продуцент треонина Е. coli B-3996 (патент США 5,175,107). Таким образом был получен штамм B-3996 (pMW-PR-pgk).

Методика определения количества накопленного в питательной среде L-треонина штаммами Е. coli B-3996 и B-3996 (pMW-PR-pgk) описана выше (смотри Пример 1). Результаты представлены в Таблице 11.

Таблица 11.

Штамм	OD560	Треонин, г/л
B-3996 B-3996(pMW-PR-pgk)	10.3±0.5 10.2±0.5	19.2±0.2 20.3±0.4

Как видно из Таблицы 11, усиление экспрессии гена pgk повышает продукцию L-треонина штаммом B-3996.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Claims (7)

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент L-треонина, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в ней усилена экспрессия гена, выбранного из группы, состоящей из генов glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno и pykA, кодирующих ферменты гликолиза.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия гена усилена за счет увеличения числа копий гена, или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии указанного гена таким образом, что экспрессия этого гена усиливается.

3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген.

4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанные гены получены из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

5. Бактерия по п.4, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия мутантного гена thrA, гена thrB, гена thrC и гена rhtA усилена.

7. Способ получения L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии - продуцента L-треонина в питательной среде и выделения L-треонина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерию по п.1.

Images