DE69631793T2

DE69631793T2 - Verfahren zur herstellung einer peptidmischung

Info

Publication number: DE69631793T2
Application number: DE69631793T
Authority: DE
Inventors: E. Dereck CHATTERTON; Grete Berntsen; Kristian Albertsen; E. Bent PEDERSEN
Original assignee: Arla Foods AMBA
Current assignee: Arla Foods AMBA
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: NO317285B1; ES2214542T3; DE69631793D1; NZ311633A; CN1064216C; NO976118L; CA2226001A1; ATE260567T1; NO976118D0; KR100437984B1; JPH11509727A; CN1192656A; EP0871371B1; WO1997001966A1; US6060269A; EP0871371A1; KR19990028632A; AU704743B2; AU6299196A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes und industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung einer Peptidmischung mit erwünschten Spezifikationen, insbesondere was das Molekulargewicht, die Osmolalität, die Bakteriologie und den Gehalt an Mineralstoffen betrifft.
Solche Mischungen sind gut sowohl zur Verwendung als Mittel oder in Mitteln für die Peritonealdialyse und die parenterale Ernährung als auch für andere pharmazeutische und kosmetische Anwendungen geeignet.
Die normale Funktion der Säugernieren umfasst eine solche Aktivität wie die Aufrechterhaltung eines konstanten Säure-Base-Gleichgewichts und eines Elektrolytgleichgewichts und die Entfernung von überschüssigen Flüssigkeiten und unerwünschten Produkten des Körperstoffwechsels aus dem Blut. Bei einer Person mit Nierenkrankheit kann diese Funktion der Niere auf so niedrig wie 5% oder weniger des Normalwertes verringert sein. Wenn die Nierenfunktion beträchtlich abgenommen hat, müssen künstliche Maßnahmen angewandt werden, um die Nierenaktivität zu ersetzen, wenn das Leben zu erhalten ist. Dies wird klinisch durch Verwendung der Dialyse erreicht. Eines der üblichsten Verfahren, um dies zu erreichen, ist die Hämodialyse, in welcher das Blut des Patienten durch einen künstlichen Nierendialysator geführt wird. In diesem Dialysator wirkt eine synthetische, halbdurchlässige Membran als künstliche Niere, mit welcher das Blut des Patienten auf einer Seite kontaktiert wird, während auf der gegenüberliegenden Seite der Membran sich eine Dialyseflüssigkeit oder ein Dialysat befindet, deren bzw. dessen Zusammensetzung derart ist, dass die unerwünschten Produkte in dem Blut des Patienten in natürlicher Weise durch die Membran hindurch durch Diffusion in die Flüssigkeit wandern. Das Blut wird somit gereinigt, im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie die Niere es hat getan hätte, und das Blut wird in den Körper des Patienten zurückgeführt. Dieses Dialyseverfahren erfordert, dass der Patient körperlich für einige Stunden, häufig mehrmals pro Woche, an den Dialysator "angeschlossen" wird. Obwohl dieses Verfahren wirksam ist, ist es aus ersichtlichen Gründen mit einer Anzahl von Unannehmlichkeiten verbunden.
Einige der Nachteile, die mit der Hämodialyse verbunden sind, welche die extrakorporale Behandlung des Bluts erfordert, werden durch die Verwendung von Techniken überwunden, welche das eigene Peritoneum des Patienten als die erforderliche halbdurchlässige Membran verwenden. Das Peritoneum ist die Membranauskleidung, welche eine große Anzahl von Blutgefäßen und Kapillaren enthält, und welche daher befähigt ist, als natürliche, halbdurchlässige Membran zu wirken. Die Dialyselösung wird in die Peritonealhöhle über einen Katheder in die Bauchwand eingeführt. Eine geeignete Aufenthaltszeit für das Dialysat erlaubt den Austausch von gelösten Bestandteilen zwischen dem Dialysat und dem Blut. Die Entfernung der Flüssigkeit wird durch Vorsehen eines geeigneten osmotischen Gradienten aus dem Blut zu dem Dialysat erreicht, so dass ein Ausfluss von Wasser aus dem Blut möglich ist. Auf diese Weise erhält das Blut das geeignete Säure-Base-Gleichgewicht, das Elektrolytgleichgewicht und das Flüssigkeitsgleichgewicht, und unerwünschte Produkte werden aus dem Blut entfernt. Die Dialyselösung wird sehr einfach aus der Körperhöhle durch den Katheder nach vollständiger Dialyse abgeleitet. Obwohl es mehr als einen Typ der Peritonealdialyse gibt, ist die als kontinuierliche, ambulante Peritonealdialyse (CAPD) bekannte Technik besonders bevorzugt, da sie nicht erfordert, dass der Patient an das Gerät für die Dauer des Ersatzes von gelösten Bestandteilen und Flüssigkeit angeschlossen bleibt. Die einzige erforderliche Sitzungszeit ist während der Infusion und der Ableitung der Dialyselösung.
Was die Zusammensetzung von Mitteln zur Verwendung in der Peritonealdialyse betrifft, so gibt es ganz spezielle Erfordernisse hierfür. Diese Erfordernisse können weiter von Patient zu Patient variieren. Die Mittel dürfen natürlich nicht-toxisch sein. Zusätzlich müssen sie die genauen Spezifikationen haben, was die Molekulargröße, die Leitfähigkeit und den Gehalt an Salzen und Mineralstoffen betrifft.
Das Mittel, das gegenwärtig die verbreiteste Akzeptanz erreicht, was das Erreichen des erforderlichen osmotischen Gradienten betrifft, ist Glucose. Glucose hat den Vorteil, sowohl nicht-toxisch zu sein als auch rasch metabolisierbar zu sein, wenn es in das Blut eintritt. Das Hauptproblem bei ihrer Verwendung ist jedoch, dass sie rasch in das Blut aus dem Dialysat aufgenommen wird. Obwohl jede Substanz eventuell ihren Weg in den Blutkreislauf findet, wandert Glucose so rasch durch das Peritoneum, dass der osmotische Gradient innerhalb von 2 bis 3 Stunden Infusion zusammenbricht. Das kann sogar eine Umkehr der Richtung der Ultrafiltration verursachen, was das unerwünschte Ergebnis hervorruft, d. h. dass Wasser aus dem Dialysat gegen das Ende der Dialysebehandlung wieder absorbiert wird. Weiter kann die Menge der aufgenommenen Glucose einen großen Anteil der Energieaufnahme des Patienten ausmachen, der möglichennreise so hoch ist wie 12 bis 35%. Obwohl dies einen nicht-diabetischen Patienten nicht wesentlich nachteilig beeinflusst, kann es ein schweres metabolisches Problem für einen Patienten sein, dessen Glucosetoleranz bereits verschlechtert ist. Dieses zusätzliche Problem kann bei Hyperglykämie und Fettsucht beteiligt sein, was in einer Anzahl von CAPD-Patienten beobachtet worden ist. Diabetische Patienten leiden unter der weiteren Unannehmlichkeit und dem Risiko, dass Insulin zu dem Peritonealdialysat zugesetzt werden muss, um die Risiken von Hyperglykämie zu verringern, die aus der erhöhten Glucosebelastung herrühren.
Glucose enthaltende Dialysierflüssigkeit kann die Filtrationswirksamkeit des Peritoneums aufgrund von nicht-enzymatischer Glykosylierung der Proteine im Peritoneum verringern. In diesem Zusammenhang wird auf einen Artikel von James W. Dobbie "New Concepts in Molecular Biology and Ultrastructural Pathology of the Peritoneum: Their Significance for Peritoneal Dialysis", in American Journal of Kidney Diseases, Bd. XV, Nr. 2, Februar 1990, Seiten 97 bis 109 Bezug genommen.
Die Verwendung von Glucose ergibt auch Probleme bei der Herstellung des Dialysats. Die Sterilisation des Dialysats wird typischerweise durch Erhitzen durchgeführt, welches bei einem physiologischen pH-Wert eine Karamelisierung von Glucose hervorruft. Um dies auszugleichen, wird der pH-Wert des Dialysats gewöhnlich auf 5,0 bis 5,5 eingestellt. Dieser niedrige pH-Wert, der so weit unter dem Wert liegt, der für den Körper normal ist, kann für den Schmerz verantwortlich sein, den einige Patienten beim Einströmen spüren und könnte eine Sklerose der Peritonealmembran verursachen, die wiederum eine Abnahme der Äquilibrierung oder Entfernung von gelösten Bestandteilen verursacht (Schmidt et al., Arch. Int. Med., 141: 1265 bis 1266, 1980).
Diese Nachteile machen das Auffinden einer geeigneten Alternative zu Glucose als osmotisches Mittel hoch erwünscht. Es sind eine Anzahl von Substanzen vorgeschlagen worden, welche die Kriterien erfüllen, biologisch inert zu sein, nicht rasch die Peritonealmembran zu durchqueren, nicht-toxisch zu sein und einen passenden osmotischen Druck auszuüben. Eine Anzahl der vorgeschlagenen Materialien haben sich als ungeeignete Ersatzstoffe für Glucose erwiesen. So ist z. B. die Verwendung von Dextranen (Gessing, Acta Med. Scan., 185: 237–239, 1960) oder Polyanionen (US-Patentschrift Nr. 4,339,433) aufgrund ihres hohen Molekulargewichts vorgeschlagen worden. Hierdurch wird eine Verringerung ihrer Diffusion durch das Peritoneum in das Blut erreicht. Die Rolle des lymphatischen Systems in dem Verfahren des Transports von löslichen Bestandteilen beschränkt jedoch klar die Vorteile des hohen Molekulargewichts als solches (Allen et al., Amer. J. Physiol., 119: 776–782, 1937). Was die Polyanionen betrifft, so ist es auch unklar, wie ihre toxische Wirkung sein würde, da die meisten von ihnen nicht metabolisierbar sind. Ähnliche Probleme mit dem Metabolismus werden mit Verbindungen, wie Sorbit, Xylit und Glucosepolymeren, beobachtet. Sorbit, welches sehr langsam metabolisiert wird, ist mit Fällen von hyperosmolarem Koma und Tod (Raja et al., Ann. Int. Med., 73: 993–994, 1970) verbunden gewesen und wird nicht länger verwendet. Sowohl Xylit als auch Glucosepolymere neigen auch zur Ansammlung im Blut und können mit unangenehmen Nebenwirkungen verbunden sein (Bazyato et al., Trans Amer. Soc. Artif. Interm. Organs, 28: 280–286, 1982). Fructose, die in ihrer osmotischen Kapazität mit Glucose vergleichbar ist, weist ebenfalls zahlreiche der gleichen Nachteile auf. Aufgrund ihrer hohen Kosten hat sie keine breite Verwendung erzielt.
Versprechender ist die vorgeschlagene Verwendung von Aminosäuren zum Ersatz von Glucose. Aminosäuren werden ohne bekannte nachteilige Nebenwirkungen gut toleriert (Oren et al., Perit. Dial. Bull., 3: 66–72). Aufgrund ihres niedrigen Molekulargewichts üben sie eine höhere osmotische Wirkung auf einer Massenbasis als Glucose aus. Dies führt jedoch wahrscheinlich ebenfalls zu einer rascheren Aufnahme in das Blut, was einen schnellen Verlust des osmotischen Gradienten verursacht. Obwohl eine Aufnahme von Aminosäuren im Gegensatz zur Aufnahme von Glucose vorteilhaft dahingehend sein kann, dass sie den bei vielen CAPD-Patienten beobachteten Proteinverlust ausgleicht, besteht ein beträchtlicher Nachteil in den fast untragbaren Kosten von Aminosäurelösungen im Vergleich zu Glucose. Weiterhin führt die rasche Aufnahme von Aminosäuren zu einer beträchtlichen Stickstoffbelastung, welche die Blutharnstoff-Stickstoffwerte beträchtlich erhöht. Somit ist ersichtlich, dass selbst Aminosäuren nicht die geeigneten Ersatzstoffe ergeben.
Verbesserungen im Verfahren für die Peritonealdialyse sind durch die in DK 168 080 beschriebene Erfindung erreicht worden, die nachstehend ausführlicher beschrieben wird. Hier wird von einem osmotischen Mittel Gebrauch gemacht, welches nicht nur eine sichere und vorteilhafte Alternative zu Glucose ist, sondern welches ebenfalls wirtschaftlich in der Verwendung ist. Es ist festgestellt worden, dass eine Mischung von relativ niedermolekularen Oligopeptiden (300 bis 2000 Dalton), abgeleitet aus der enzymatischen Hydrolyse eines qualitativ hochwertigen Proteins, wie Molkeprotein, als wirksames osmotisches Mittel in einer Peritonealdialysierlösung verwendet werden kann. Im Vergleich mit einer Aminosäurelösung verhindert das etwas höhere Molekulargewicht der Peptide die rasche Aufnahme in das Blut, was sowohl eine wirksamere Aufrechterhaltung des osmotischen Gradienten als auch die Verhinderung einer unerwünschten Erhöhung von Stickstoff im Blut erlaubt. Die Peptidmischung, die am Ende, obwohl sehr langsam, in das Serum absorbiert wird, liefert weiter eine wertvolle Nahrungsergänzung, da die Peptidmischung von einem qualitativ hochwertigen Protein abgeleitet ist. Schließlich stellt die vorliegende Peptidmischung eine kostengünstige und leicht zugängliche Quelle eines osmotischen Mittels dar.
Peptide mit einem Molekulargewicht über etwa 5000 Dalton können allergische Probleme hervorrufen, was natürlich insbesondere in Produkten unannehmbar ist, die in den Körper eingeführt werden.
Eine Peptidmischung der vorliegenden Art kann weiter mit einer osmotisch ausgeglichenen, wässrigen Lösung, die zur Verwendung als Peritonealdialysat geeignet ist, kombiniert werden. Um wirksam osmotisch für den vorliegenden Zweck ausgeglichen zu sein, müssen verwendbare Dialysate Elektrolyte in einer Konzentration enthalten, die ausreichend ist, um eine Diffusion von Wasser und unerwünschten metabolischen Produkten durch das Peritoneum hervorzurufen. Es gibt keine Standard-Dialysierlösung, da die Erfordernisse von einer Person zur anderen variieren können. Eine gewöhnliche Lösung würde z. B. spezifische Mengen von Natrium, Chlorid, Lactat, Magnesium und Calcium enthalten. Der Gehalt einer typischen Dialysatlösung erscheint aus der folgenden Liste ohne Spezifikation der Menge des osmotischen Mittels. In einer Glucoselösung würde Glucose-Monohydrat typischerweise in einer Menge von etwa 1,5 bis 4,25% zugesetzt sein. Es ist klar, dass dies nur ein Beispiel einer möglichen Lösung wiedergibt und die Variationen in dem Muster sind für den Fachmann ersichtlich. Der Anteil der Peptidmi schung in dem Dialysat kann variieren, liegt aber normalerweise in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 15 Gew.-% der Dialysatlösung. In jedem Fall muss die Menge des verwendeten Peptids ausreichend sein, um zusammen mit unterstützenden Elektrolyten eine Osmolalität von etwa 300 bis 500 mOsm/I zu verleihen (die normale Serumosmolalität beträgt 280 mOsm/I). Die Verabreichung des Dialysats wird in der Weise erreicht, die gewöhnlich für die Peritonealdialyse angewandt wird. Beispielhafte Arten der Peritonealdialyse sind in "Peritoneal Dialysis", K. Nolph, Hrsg., Martinus Nighoff Publishers, 1981 beschrieben. Die besondere Behandlung, die für einen individuellen Patienten erforderlich ist, ist durch den Arzt des Patienten rasch bestimmbar.
Komponenten einer typischen Peritonealdialysierlösung sind (in mÄq/I):

Natrium 132,0

Calcium 3,5

Magnesium 0,5

Chlorid 96,0

Lactatanion 40,0
Aus der Internationalen Patentanmeldung WO 87/01286 und der entsprechenden EP-Patentbeschreibung Nr. 270 545, der US-Patentschrift Nr. 4,906,616 und der dänischen Patentbeschreibung Nr. 165 734 ist es bekannt, eine Dialysierflüssigkeit durch enzymatische Hydrolyse von Milchprodukten herzustellen. Unter diesen wird die Molkefraktion erwähnt, es wird aber erklärt, dass sie unter dem Nachteil leidet, eine ziemlich unbestimmte chemische Zusammensetzung zu haben und eine Anzahl von Restproteinen zu enthalten, die schwierig zu entfernen sind, was nach sich zieht, dass eine Neigung besteht, dass die Hydrolyse nicht reproduzierbar ist, und dass das Hydrolyseprodukt kontaminiert wird. Folglich ist die Verwendung von β-Lactoglobulin und α-Lactoalbumin und insbesondere die Caseinfraktion bevorzugt. Die enzymatische Hydrolyse wird mit einer wässrigen Lösung von Natriumcaseinat durchgeführt. Nach der Hydrolyse wird eine Filtration durch ein Bakterienfilter durchgeführt, und das Produkt wird auf die erwünschte Osmolalität und den pH durch Zugabe von Salz eingestellt.
Casein ist jedoch weniger geeignet aufgrund eines hohen Phosphorgehalts, welcher für Patienten, die unter Nierenkrankheiten leiden, ungeeignet ist.
Aus der EP-Patentbeschreibung Nr. 218 900 und den entsprechenden dänischen Patentbeschreibungen Nr. 168 692 und 168 080 und der US-Patentschrift Nr. 5,039,609, wie vorstehend genannt, sind Mischungen von Peptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 2000 Dalton bekannt, welche Mischungen zur Verwendung als osmotisch wirksames Mittel in Verbindung mit der Peritonealdialyse gut geeignet sind. Die gleichen Veröffentlichungen beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus einem qualitativ hochwertigen Protein durch enzymatische Hydrolyse, gefolgt von Dialyse und Umkehrosmose. Als Protein wird z. B. von Molkeprotein Gebrauch gemacht. Das Verfahren ist ziemlich mühsam und erfordert eine sehr spezielle Ausrüstung, und es ist nicht möglich, die Zusammensetzung zu variieren. Dies ist von besonderer Wichtigkeit für Substanzen mit niedrigem Gehalt an molekularem Stickstoff, Lactose und Mineralstoffen, insbesondere Aluminium, da es durch dieses Verfahren nicht möglich ist, diese Komponenten zu entfernen, wenn sie einmal in das Dialysat eingeführt worden sind.
Weiterhin beschreibt WO 94/14468 Dialysierlösungen, die Peptide und Glucose enthalten. Sie beschreibt kein spezielles Verfahren zur Herstellung solcher Peptide.
Die US-Patentschrift Nr. 4,427,658 beschreibt ein Hydrolysat von Molkeprotein, welches insbesondere gut für Ernährungszwecke geeignet ist. Es ist vollständig hydrolysiert und hat folglich einen hohen Gehalt an freien Aminosäuren. Es können soviel wie 15% freie Aminosäuren vorhanden sein. Dies ist nicht allgemein erwünscht und insbesondere nicht für die Dialyse, wo die empfohlene Konzentration unter 5% liegt. Das Hydrolysat wird durch Hydrolyse mit einem proteolytischen Enzym, z. B. Pankreatin, hergestellt, und die Hydrolyse wird fortgesetzt bis kein mit 12% Trichloressigsäure ausfällbarer Stickstoff mehr vorhanden ist.
Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 92/21248 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Molkeproteinhydrolysats für Ernährungszwecke unter Verwendung eines Molkeproteinprodukts mit einem Proteingehalt von wenigstens 65%, berechnet als Trockensubstanz, als Ausgangsmaterial und auf eine Kombination von Nicht-pH-Stat-Hydrolyse, gefolgt von einer Ultrafiltration/Mikrofiltration. Das Verfahren ergibt ein wohlschmeckendes und organoleptisch annehmbares Produkt in hoher Ausbeute. Das Produkt hat jedoch einen Mineralstoffgehalt, welcher für Dialyseprodukte zu hoch ist.
Es hat sich nun als möglich herausgestellt, Peptidpräparationen herzustellen, die gut für die Dialyse, die parenterale Ernährung und andere Zwecke geeignet sind, die ein passendes Molekulargewicht und einen passenden Gehalt von Stickstoff und Mineralstoffen haben, abhängig davon, was benötigt wird. Dies wird mittels eines besonders vorteilhaften Verfahrens erreicht, durch welches es möglich ist, leicht und wirtschaftlich die Zusammensetzung der Präparation zu regeln. Das Verfahren kann mittels einer leicht zugänglichen Ausrüstung durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung einer Peptidmischung, die gut zur Verwendung in der Peritonealdialyse und/oder der parenteralen Ernährung und für andere Zwecke geeignet ist, welche Mischung ein Peptidmolekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton und einen niedrigen Gehalt an Mineralstoffen, so niedrig, dass sie für die peritoneale Dialyse geeignet ist, hat, ist von der Art, durch welche ein Protein in einer wässrigen Lösung unter hydrolysierenden Bedingungen behandelt wird, und sie ist dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Schritte umfasst:

a) Hydrolysieren bis ein Osmolalitätsanstieg in dem Bereich von 120 bis 250 mOsm/kg H₂O, gemessen in einer 8%-igen Proteinlösung, erreicht ist,
b) Mikrofiltrieren, Zentrifugieren oder chromatografisches Trennen, um dadurch unerwünschte hochmolekulare Substanzen zu entfernen,
c) Ultrafiltrieren des Permeats aus Schritt (b) oder Behandeln des Permeats durch ein chromatografisches Verfahren, um dadurch die erwünschten Peptide zu isolieren,
d) Nanofiltrieren des Permeats aus Schritt (c) oder Behandeln des Permeats mit einem chromatografischen Verfahren,
e) Sammeln des Retentats aus der Nanofiltration, mögliches Kühlen des Retentats,
f) Elektrodialysieren des Retentats aus Schritt (e) nach vorhergehender Einstellung des pH auf den optimalen Wert für die Elektrodialyse,
g) optional Sterilfiltrieren des erhaltenen Produkts,
h) wonach das sterile Produkt getrocknet wird, falls erwünscht,

Durch dieses Verfahren gemäß der Erfindung ist es möglich, eine Peptidmischung mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton, vorzugsweise von 400 bis 1500 Dalton und insbesondere weniger als 1000 Dalton herzustellen, welches für einen Dialysebestandteil erwünscht ist. Durch das Verfahren gemäß der Erfindung ist es auch möglich, eine Peptidmischung mit äußerst niedrigem Gehalt an Mineralstoffen herzustellen, nämlich
einem Phosphorgehalt von maximal 0,01%,
einem Aluminiumgehalt von maximal 0,5 ppm,
einem Natriumgehalt von maximal 0,6%,
einem Chloridgehalt von maximal 0,7%,
einem Kaliumgehalt von maximal 0,02% und
einem Magnesiumgehalt von maximal 0,01%.
Molkeprotein ist ein gut geeignetes Proteinausgangsmaterial. Dies gilt insbesondere für ein Molkeproteinkonzentrat. Ein besonders bevorzugtes Molkeproteinkonzentrat ist das Produkt, das unter der Marke BIPROR vertrieben wird. Es enthält 90% Protein und hat einen sehr geringen Gehalt an Fett, Lactose und Mineralstoffen. Unter dem Ernährungsgesichtspunkt hat Molkeprotein einen hohen Wert, z. B. höhere TD (wahre Verdaubarkeit), höheren BV (biologischer Wert), höhere NPU (Nettoproteinverwertung) und höheres PER (Proteinwirksamkeitsverhältnis) als Sojaisolate und Casein, Werte der gleichen Größe wie Vollei (Eiweiß + Eigelb).
Etwa 50% der Peptide in der Peptidmischung, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt ist, besteht aus essentiellen Aminosäuren. Folglich wird diese Peptidmischung auch gut geeignet sein für u. a. die parenterale und peripher-parenterale Ernährung durch geeignetes Vermischen von Kohlehydraten, Fetten, Vitaminen usw. In die sem Zusammenhang wird auf Encyclopaedia of Food Science, Food Technology and Nutrition, Seiten 3420 bis 3422 "Parenteral Nutrition" und auf Essentials of Nutrition and Diet Therapy, 1994, Mosby, Kapitel 18, Feeding Methods: "Enteral and Parenteral Nutrition" Bezug genommen.
Es ist jedoch auch möglich, andere Proteinausgangsmaterialien, wie z. B. Casein und Sojaprotein, zu verwenden, aber, wie erwähnt, sind sie nicht so vorteilhaft wie Ausgangsmaterialien auf Molkebasis.
Im Prinzip ist eine Säure- oder Basehydrolyse verwendbar, aber eine bessere Ausbeute wird durch enzymatische Hydrolyse erhalten. Die Säure- oder Basehydrolyse ergibt weiterhin ein ungeregelteres Verfahren mit variierender Zusammensetzung, und einige Aminosäuren können sogar durch das Verfahren zerstört werden, z. B. Leu, Val und/oder Ile. Folglich wird normalerweise der enzymatischen Hydrolyse der Vorzug gegeben.
Verwendbare Enzyme umfassen z. B. Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin und Pankreatin. Insbesondere haben sich die Enzymprodukte Alcalase^® und Neutrase^® von Novo Nordisk A/S als gut geeignet erwiesen.
Abhängig von der Enzymwahl und dem Ausgangsmaterial kann eine Wärmebehandlung des in Wasser aufgelösten Ausgangsmaterials vor der Hydrolyse durchgeführt werden, was eine Öffnung des Proteins zustande bringt, was die Ausbeute erhöhen und/oder die Behandlungszeit verringern kann. Wenn eine Wärmebehandlung durchgeführt wird, wird gewöhnlich eine Behandlung bei einer Temperatur von etwa 80 bis 90°C für 1 bis 3 Minuten im Fall von Molkeprotein geeignet sein. Eine enzymatische Hydrolyse mit Alcalase^® und Neutrase^® wird bei 30 bis 65°C, vorzugsweise 52 bis 53°C, durchgeführt, aber die Hydrolysetemperatur hängt natürlich von dem verwendeten Enzym oder den verwendeten Enzymen ab.
Der Hydrolysegrad wird durch Messen des Osmolalitätsanstiegs oder durch Bestimmen des Aminostickstoffs oder durch Titration mit einer Base überwacht. Während der Hydrolyse kann der pH in Abhängigkeit von dem verwendeten Enzym konstant sein oder variieren. Der pH variiert somit normalerweise zwischen 8,5 und 6,0, wenn Alcalase^®/ Neutrase^® verwendet wird.
Der Gehalt der Hydrolysemischung an nicht-hydrolysiertem Protein, Aggregaten und Fettkomponenten wird von der Hydrolysemischung z. B. durch Mikrofiltration, Zentrifugation oder ein chromatografisches Verfahren abgetrennt, um hierdurch die Peptide von der ursprünglichen Hydrolysemischung zu trennen.
Durch Diafiltration des Retentats wird eine erhöhte Ausbeute von Peptiden in dem Permeat erhalten. Dieser Verfahrensschritt wird unter hoher Trennleistung durchgeführt, und der Hauptteil der hochmolekularen Substanzen wird aus den Peptiden (dem Permeat) entfernt. Um den Rest der hochmolekularen Komponenten aus dem Permeat zu entfernen, wird eine Ultrafiltration durchgeführt, oder es wird eine chromatografische Reinigung des Permeats durchgeführt. Diese Verfahrensschritte laufen bei beträchtlich niedrigerer Trennleistung als die vorausgehende Mikrofiltration ab und stellen die Entfernung von sämtlichem hochmolekularem Material aus der Peptidmischung sicher. Zur Entfernung von Wasser und niedermolekularem, Stickstoff enthaltendem Material und Salzen wird die Peptidmischung mittels Nanofiltration oder chromatografischen Verfahren getrennt. Die erhaltene Peptidmischung wird hierdurch aufkonzentriert, was die Trockensubstanz betrifft, und gleichzeitig ist eine Verringerung des Gehalts an Mineralstoffen und Stickstoff enthaltendem Material erhalten worden.
In dem Elektrodialyseschritt wird die beste Entfernung von Mineralstoffen bei pH 4 bis 5, insbesondere etwa 4,5, erreicht. Die Elektrodialyse wird in einfacher Weise durch Messen der Leitfähigkeit überwacht, die im Gleichschritt mit der Entfernung der Mineralstoffe verringert wird. Eine solche Entfernung von Mineralstoffen ist wichtig in Produkten für die Peritonealdialyse und für die parenterale und peripher-parenterale Ernährung.
Gewöhnlich werden der pH und die Temperatur während der einzelnen Verfahrensschritte so eingestellt, dass die optimalen Verfahrensbedingungen für Enzyme und Trennungen erreicht werden.
Ferner werden Sterilisierschritte zur Entfernung von Bakterien und Keimen eingeführt, um ein Endprodukt mit einer sehr hohen bakteriologischen Qualität zu erhalten.
Das Verfahren gemäß der Erfindung besitzt große Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Diese Vorteile liegen insbesondere in den Aufspaltungsschritten, welche eine verbesserte Möglichkeit zum Eingreifen in das Verfahren an der rechten Stelle und zu seiner Regelung und als Ergebnis die Zusammensetzung des erwünschten Produkts bieten. Ferner ist es ein wirtschaftlich vorteilhaftes Verfahren, das eine hohe Ausbeute ergibt.
Wie erwähnt, kann es in einer gewöhnlich verwendeten Ausrüstung durchgeführt werden, nämlich einer Ausrüstung, die u. a. im Molkereibereich verwendet wird, was nicht der Fall ist, soweit es das aus EP 218 900 bekannte Verfahren betrifft, welches eine speziell gebaute Vorrichtung verwendet. Dies bedeutet natürlich, dass das Verfahren gemäß der Erfindung im Vergleich mit den bekannten Techniken aus diesem Grund allein wirtschaftlicher durchzuführen ist.
In der vorstehenden dänischen Patentschrift Nr. 168 080, vgl. Seite 14, Zeile 27 ff. wird behauptet, dass eine Ultrafiltration mit einem schweren Nachteil dahingehend verbunden ist, dass eine verlässliche Trennung nicht erhalten werden kann. Gemäß dem Verfahren der Erfindung ist dieses Problem unter Verwendung einer speziellen Ultrafiltrationsmembran (UF-Membran) gelöst worden, wodurch Moleküle mit einem Molekulargewicht erheblich über 2000 Dalton nur in minimalen und unbedeutenden Mengen in der Peptidmischung, hergestellt durch das Verfahren gemäß der Erfindung, vorliegen. Solche UV-Membranen sind seit 1984 im Handel erhältlich gewesen.
Weiter wird in dem vorliegenden Verfahren, wie erwähnt, vorzugsweise von einem speziellen Ausgangsmaterial Gebrauch gemacht, nämlich einem Molkeproteinprodukt mit einem Proteingehalt so hoch wie 90% und einem sehr niedrigen Gehalt sowohl an Fett und Lactose als auch Mineralstoffen. Der Fettgehalt beträgt typischerweise etwa 0,5%, und der Lactosegehalt beträgt typischerweise 0,5%, während der Gehalt an Mineralstoffen 1,6% beträgt. Dadurch wird ein ausreichend reines Produkt einfacher erhalten, da Fett, Lactose und Mineralstoffe für die genannten Anwendungen unerwünscht sind. Weiterhin ist auch der Keimgehalt sehr niedrig.
Die Erfindung wird im Einzelnen durch das folgende Beispiel erläutert.
Beispiel
20,0 kg Molkeprotein-Isolatpulver werden in 210 Liter entmineralisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird 2 Minuten bei 85°C wärmebehandelt, auf etwa 50°C abgekühlt und in einen Hydrolysebehälter überführt. 0,2% des Enzymprodukts ALCALASE^®-2.4 L und 0,1% des Enzympräparats NEUTRASE^®-0,5 L werden zugesetzt. Beide verwendeten Enzyme werden von Novo-Nordisk A/S vertrieben. Nach 15 Stunden Hydrolyse bei etwa 50°C beträgt der Osmolalitätsanstieg 166 mOsm/kg N₂O. Das Produkt wird auf 60°C erwärmt und wird danach auf einer 0,2 μm-Membran von der Firma Societe des Ceramique Techniques, Frankreich, mikrofiltriert. Die Mikrofiltration findet bei etwa 60°C statt, und die Diafiltration erfolgt mit etwa 200 Liter entmineralisiertem Wasser. Der mittlere Fluss beträgt etwa 150 l/(m²·h). Das Permeat wird gesammelt und 3 Minuten bei 85°C wärmebehandelt und auf 50°C abgekühlt. Danach wird das Permeat bei 50°C auf einer Ultrafiltrationsmembran des Typs Desal G50 von der Firma Desalination Systems, Inc., Escondido, Kalifornien, USA, ultrafiltriert. Die Membran hat einen Ausschlusswert von 15000. Der mittlere Fluss bei der Ultrafiltration beträgt 5,8 l/(m²·h). Das Permeat wird 2 Minuten bei 70°C wärmebehandelt und auf 60°C abgekühlt, wonach es auf einer Membran des Typs PCI AFC30 von der Firma PCI Membrane Systems Ltd., England, bei etwa 60°C nanofiltriert wird. Der mittlere Fluss beträgt 240 l/(m²·h). Das Retentat der Nanofiltration wird 2 Minuten bei 70°C wärmebehandelt und auf 5°C abgekühlt, wonach es auf pH 4,5 mittels verdünnter HCl eingestellt wird. Das Produkt wird bei etwa 10°C und einer Spannung in dem Bereich von etwa 50 V elektrodialysiert, und während des Verfahrens wird die Stromstärke von 6,5 A auf 0,5 A verringert. Die Leitfähigkeit nimmt hierdurch auf 0,8 mS ab. Die Elektrodialysemembranen sind vom Typ NEOSEP-TA-AMX und -CMX von der Firma Eurodia, Frankreich. Danach wird das Retentat der Elektrodialyse gesammelt und 2 Minuten bei 70°C wärmebehandelt und auf 60°C abgekühlt, wonach es auf einem Filter des Typs 0,05 μm-Filter von der Firma Societe des Ceramique Techniques, Frankreich, bei 60°C steril filtriert wird. Der mittlere Fluss beträgt 2300 l/(m²·h). Das gesammelte, steril filtrierte Produkt wird auf einem Sprühturm des Typs Niro Minor von der Firma Niro Atomizer, Dänemark, getrocknet, und es werden 9,0 kg Peptidmischung in Pulverform erhalten.

Das erhaltene Produkt wird analysiert und ergibt die folgenden Ergebnisse:

pH	4,75
Proteingehalt	90,5 Gew.-% (N% 6,38).
Gehalt an Trockensubstanz	96,8 Gew.-%
Fettgehalt	< 0,02 Gew.-%
Lactosegehalt	< 0,1 Gew.-%
Aschegehalt	0,17 Gew.-%
Phosphorgehalt	0,007 Gew.-%
Natriumgehalt	0,012 Gew.-%
Kaliumgehalt	0,006 Gew.-%
Chloridgehalt	< 0,05 Gew.-%
Calciumgehalt	0,008 Gew.-%
Aluminiumgehalt	< 0,5 ppm nach Gewicht
Mw	620
Mn	410
Molekulargewicht < 2000 D	99,24
Molekulargewicht < 1000 D	86,46
Gesamtkeimgehalt	< 1 pro Gramm

Die Probe wurde in der mobilen Phase bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst. Es wurde eine Probe von 20 Mikroliter injiziert. Der Detektormesswert gegen das Elutionsvolumen wurde aufgezeichnet. Das Chromatogramm wurde in Zeitsegmente (und Elutionsvolumensegmente) unterteilt, wobei jedes Segment durch das Elutionsvolumen und die Fläche des Chromatogramms über das Zeitintervall charakterisiert ist.
Die Molekulargewichte nach Gewicht bzw. Zahl wurden gemäß den folgenden Gleichungen bestimmt:
worin
Mw das gewichtsmittlere Molekulargewicht ist,
Mn das zahlenmittlere Molekulargewicht ist,
A_l die Fläche des Chromatogramms für jedes Segment ist, gemessen als die akkumulierte Detektoranzeige über jedes Zeitintervall. Mw,i ist das entsprechende Molekulargewicht für jedes Segment. Der Wert wird mittels der Kalibrierungskurve unter Verwendung des mittleren Elutionsvolumens über das Zeitintervall berechnet.

Aminosäureanalyse, Gew.-%:

Tyrosin	3,70
Tryptophan	1,90
Cystin	2,62
Methionin	2,05
Asparaginsäure	10,9
Threonin	4,53
Serin	3,95
Glutaminsäure	17,1
Prolin	4,43
Glycin	1,70
Alanin	5,69
Valin	5,14
Isoleucin	5,38
Leucin	12,0
Phenylalanin	3,53
Histidin	2,33
Lysin	10,3
Arginin	1,97

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Peptidmischung, die gut zur Verwendung in der Peritonealdialyse und/oder der parenteralen Ernährung und für andere Anwendungen geeignet ist, welche Mischung ein Peptidmolekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton und einen so niedrigen Gehalt an Mineralstoffen hat, dass sie für die Peritonealdialyse geeignet ist, bei welchem Verfahren ein Protein in einer wässrigen Lösung unter hydrolysierenden Bedingungen behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst a) Hydrolysieren bis ein Osmolalitätsanstieg in dem Bereich von 120 bis 250 mOsm/kg H₂O, gemessen in einer 8%-igen Proteinlösung, erreicht ist, b) Mikrofiltern, Zentrifugieren oder chromatografisches Trennen, um dadurch unerwünschte hochmolekulare Substanzen zu entfernen, c) Ultrafiltrieren des Permeats aus dem Schritt b) oder Behandeln des Permeats durch ein chromatografisches Verfahren, um dadurch die erwünschten Peptide zu isolieren, d) Nanofiltrieren des Permeats aus dem Schritt c) oder Behandeln des Permeats mit einem chromatografischen Verfahren, e) Sammeln des Retentats aus der Nanofiltration, mögliches Kühlen des Retentats, f) Elektrodialysieren des Retentats aus dem Schritt e) nach vorhergehender Einstellung des pH auf den optimalen Wert für die Elektrodialyse, g) optional Sterilfiltrieren des erhaltenen Produkts, h) wonach das sterile Produkt getrocknet wird, falls erwünscht,
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Peptidmischung mit einem niedrigen Gehalt an Mineralstoffen mit der folgenden Zusammensetzung: einem Phosphorgehalt von maximal 0,01%, einem Aluminiumgehalt von maximal 0,5 ppm, einem Natriumgehalt von maximal 0,6%, einem Chloridgehalt von maximal 0,7%, einem Kaliumgehalt von maximal 0,02% und einem Magnesiumgehalt von maximal 0,01%, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrationsbedingungen und andere Bedingungen entsprechend dem erwünschten Gehalt an Mineralstoffen ausgewählt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Peptidmischung mit einem Molekulargewicht von 400 bis 1500 Dalton, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Hydrolyse- und Filtrationsbedingungen als auch andere Bedingungen entsprechend dem erwünschten Molekulargewicht ausgewählt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Peptidmischung mit einem Molekulargewicht bis zu 1000 Dalton, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Hydrolyse- und Filtrationsbedingungen als auch andere Bedingungen entsprechend dem erwünschten Molekulargewicht ausgewählt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsmaterial verwendete Proteinmaterial ein Molkeprodukt, insbesondere ein Molkeproteinkonzentrat, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse eine enzymatische Hydrolyse ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den einzelnen Schritte eine Wärmebehandlung und/oder eine Kühlung entsprechend dem Bedart durchgeführt wird/werden.