DE69625897T2 - Verfahren zum Durchsuchen von Substanzen - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die Verfügbarkeit einer rasch wachsenden Menge genomischer Informationen eröffnet neue Verwendungsmöglichkeiten. Diese sind am wichtigsten auf Gebieten, die stark von biologischem Wissen profitieren, z. B. den Medizinwissenschaften. Genomforschung wird zu einem besseren Verständnis der molekularen Basis vieler Krankheiten führen und liefert somit die Basis für spezifischere und effektivere Wirkstoffe. Insbesondere Wirkstofffindungsprogramme werden von der Verfügbarkeit des rasch wachsenden Arsenals von Genen, deren Struktur identifiziert worden ist, profitieren. Diese Gene und ihre Produkte sind wichtige Kandidaten für neue Wirkstoffziele. Genomstrukturanalyse (DNA-Sequenzierung) schreitet mit rascher Geschwindigkeit fort und die ersten kompletten Genomanalysen wurden bereits veröffentlicht. Unter diesen ist die Vollendung der DNA-Analyse der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) von besonderer Bedeutung, da die Hefe den ersten eukaryontischen Organismus darstellt, dessen Genom vollständig sequenziert wurde (Pressemitteilung des Deutschen Forschungsministeriums, 24. April 1996). Die Konservierung der grundlegenden Strukturen und Funktionen zwischen den eukaryontischen Organismen hat die Hefe bereits zu einem wichtigen eukaryontischen Modellorganismus gemacht, von dem Extrapolationen zu höheren eukaryontischen Zellen (z. B. Säugerzellen) möglich sind.
• Genomforschung wird die Rolle der Hefe als eukaryontischem Modellorganismus wahrscheinlich stärken.
• Ein limitierender Faktor in der Nutzung der genomischen Information ist die Zuordnung von Funktionen zu bekannten Genstrukturen. Ohne dieses Wissen ist ein großer Teil der verfügbaren DNA-Sequenzinformation nur von begrenztem Wert, d. h. es ist nur möglich allgemeine Schlussfolgerungen bezüglich der allgemeinen Klassifizierung zu ziehen, die auf groben strukturellen und/oder funktionellen Kriterien beruhen. Weithin benutzte strukturelle Kriterien sind DNA-Homologien und Ähnlichkeiten von DNA- und Proteinmotiven zu Genen und Genprodukten, die bereits bekannt sind. Schwieriger ist es, neuen Genen Funktionen zuzuweisen. Dies beruht üblicherweise auf phänotypischen Veränderungen, die auf genetischen Mutationen basieren. Eine allgemeine Strategie für das Letztgenannte ist die Untersuchung von Gen-"Knockouts" (Deletionen oder Unterbrechungen von proteinkodierenden Regionen, die oft als "open reading frames" (offene Leseraster), ORFs bezeichnet werden). Genunterbrechungstechniken sind verfügbar für eine Reihe von Organismen, wobei die Geschwindigkeit, mit der spezifische Unterbrechungen erhalten werden, stark zwischen den verschiedenen Organismen variiert. In diesem Zusammenhang sind die Techniken, die für Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden, weit fortgeschritten (Baudin et al., Nucleic Acids Res. 21 (1992), 3329).
• Selbst für Organismen wie Saccharomyces cerevisiae ist die Zuordnung von Funktionen zu neuen und ansonsten unidentifizierbaren Genen eine größere Aufgabe, die mehrere Jahre bis zur Vollendung benötigen wird. In der Zwischenzeit werden sich DNA-Sequenzdaten anhäufen, ohne die Möglichkeit, diese geeignet zu nutzen. Daher besteht ein Bedarf, Systeme zu entwickeln, um neu identifizierte ORFs zu nutzen, ohne ein a priori Wissen über ihre verwandten Funktionen zu haben. Wenn es möglich wäre, einen Ansatz zu finden, der es ermöglicht, ORFs zu nutzen, ohne ein detailliertes Wissen ihrer Funktion zu besitzen, würde dies ihre Nützlichkeit enorm beschleunigen. Ferner, wenn es möglich wäre, den Effekt chemischer Substanzen auf ihre Funktionen herauszufinden, könnte ein solcher Ansatz unmittelbar benutzt werden, um neue Wirkstoffe, die mit ihrer Funktion interferieren, zu finden, um neue Wirkstoffzielstrukturen zu identifizieren und um die biologischen Wirkungen von Chemikalien auf eine Vielzahl zellulärer Ziele zu verfolgen.
• Hefe besitzt wichtige Vorteile gegenüber anderen eukaryontischen Modellorganismen. Es ist einfach mit ihr experimentell zu arbeiten (schnelles Wachstum, leichte Handhabbarkeit) und das Wissen über ihre Biologie ist weit fortgeschritten (exzellentes genetisches System, weitreichendes biochemisches und physiologisches Wissen, fortgeschrittene Zellbiologie). Sie wurde schon lange als biotechnologisches Hilfsmittel benutzt. Seit Tausenden von Jahren sind Wein und Brot klassische Produkte der metabolischen Eigenschaften von ganzen Hefezellen, während Ethanol und andere definierte Metaboliten traditionelle biotechnologische Produkte sind, seit die Hefe bewusst als Produktionssystem benutzt wird. Seit dem Beginn der achtziger Jahre wird die Hefe intensiv als Wirt für rekombinante Genprodukte benutzt. Für den pharmazeutischen Gebrauch wurden verschiedene rekombinante Proteine entwickelt (z. B. Impfstoffe, Insulin, Hirudin etc.), die bereits auf dem Markt sind oder sich in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung befinden.
• Mit der Etablierung der Genomforschung eröffnet sich ein weiteres Anwendungsfeld für Saccharomyces cerevisiae, nämlich Hefezellen als Modell für den medizinischen Gebrauch. Es ist seit langem allgemein akzeptiert, dass Hefe ein idealer Modellorganismus für eukaryontische Zellbiologie ist. Die Hefe besitzt alle grundlegenden zellulären Strukturen und biochemischen Wege von höheren Eukaryonten und teilt mit ihnen die prinzipiellen Kommunikations- und Signalsysteme. In vielerlei Hinsicht diente die Hefezellbiologie als Pionier für das Verständnis wichtiger eukaryontischer Zellfunktionen wie der Biogenese von Organellen, zellulären Transportsystemen, Signalwegen, Zellzyklus, Transkriptionskontrolle usw. Trotz dieser engen strukturellen und funktionellen Verwandschaft zwischen der mikrobiellen Hefezelle und der höheren eukaryontischen Säugerzelle war die Nützlichkeit des Hefemodells für die Medizinforschung limitiert, hauptsächlich da über die meisten humanen Krankheiten wenig auf dem molekularen und/oder zellulären Level bekannt war. Spätestens seit dem Beginn der Genomforschung ändert sich das dramatisch. Die Ursache vieler monogenischen Krankheiten wurde auf dem molekularen Level charakterisiert und viele Krankheiten zellulären Ursprungs werden gegenwärtig intensiv untersucht. Wieder dienen Hefezellen als Referenz. Seit 1996 ist die gesamte genomische Nukleotidsequenz von S. cerevisiae, die erste komplette genomische Struktur eines eukaryontischen Organismus, bekannt. Dies stellt einen Meilenstein in der eukaryontischen Zellbiologie dar und ist gleichzeitig ein Ausgangspunkt für ein hoch kompetitives internationales Rennen in einer neuen Ära biologischer Studien: die systematische Zuordnung von Funktionen zu strukturell definierten Genen. Da die Strukturen und Funktionen zwischen eukaryontischen Organismen konserviert sind, wird dies unmittelbare Auswirkungen auf unser Verständnis der eukaryontischen Zellbiologie in ihrer Gesamtheit haben (Tugendreich et al., Hum. Mol. Genet. 3 (1994), 1509). Zur Verfügung stehende Daten bestätigen die Vermutung, dass sich die Ähnlichkeit in zellulären Strukturen auch auf dem molekularen Level der DNA und Proteine widerspiegelt, wodurch die Möglichkeit besteht, komplexe Wege und Interaktionssysteme in einer modularen Weise zu manipulieren und sie zwischen verschiedenen zellulären Systemen auszutauschen. Wieder ist die Hefe ein leicht zugänglicher Organismus, der als Modell für weitere Untersuchungen dienen wird.
• Zusammengefasst stellen Hefezellen ideale Systeme zum Studium pathologischer Funktionen und Wege und/oder zur Modellierung solcher Wege dar (Kirsch, Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993), 543). Der Nutzen dieser Modelle wird vorwiegend bei medizinischen Krankheiten liegen, deren Ursprung in der Funktionsstörung zellulärer Prozesse (Krebs, virale Krankheiten, Immunmodulation, etc.) liegt. Die Entwicklung von Wirkstoffen auf der Basis dieser molekularen Zielstrukturen wird zu einer unterschiedlichen Qualität der Medikation führen, bei der die symptomatische Behandlung durch die Behandlung der Ursache ersetzt wird.
• Zusätzlich macht die enge Verwandtschaft von S. cerevisiae mit pathogenen Pilzen (z. B. Candida albicans) das Erstellen von Modellen mit dem Ziel, neue Antipilz-Wirkstoffe zu finden, extrem lohnend. Dies ist besonders offensichtlich im Hinblick auf die deutliche weltweite Zunahme an Pilzinfektionen und das damit einhergehende Auftreten von Resistenzen gegenüber konventionellen therapeutischen Wirkstoffen.
• Natürlich wird die Entdeckung von Wirkstoffen, die mit molekularen Wegen, wie sie in Hefe vorkommen oder in Hefe entworfen wurden, interferieren, nicht notwendigerweise den Erfolg auf dem Level des menschlichen Patienten garantieren. Andere Kriterien müssen erfüllt werden, um eine biologisch aktive Komponente in einen medizinischen Wirkstoff umzuwandeln. Dazu zählen das toxikologische Profil, das pharmakologische Verhalten, gezielte Arzneimittelverabreichung, etc. Viele dieser Parameter müssen in sekundären Testsystemen wie höheren eukaryontischen Zelllinien und Tiermodellen evaluiert werden. Aber aufgrund der Einfachheit des Screening-Ansatzes stellen Hefemodelle exzellente Primärscreens dar.
• Gegenwärtige Screening-Ansätze verfolgen verschiedene Strategien (Beven et al., TIPTECH 13 (1995), 115). Auf dem klassischen Indikationsgebiet der Antiinfektiva ist der einfachste Ansatz, sich auf die Hemmung des Wachstums des pathogenen Organismus zu verlassen. Mit diesem Prinzip wurden die meisten Antibiotika, die gegenwärtig benutzt werden, identifiziert. In den vergangenen Jahren wurden in den meisten Indikationsgebieten ausgefeiltere Strategien verfolgt, die definierte molekulare Zielstrukturen benutzen. Als Zielstrukturen werden am häufigsten Enzyme und andere Proteine (z. B. Rezeptoren) benutzt. Die Methoden der Gentechnologie haben die Definition und Entwicklung der Zielstruktur in einem hohen Grad ermöglicht. Durch genetische Manipulation von Mikroorganismen oder höheren eukaryontischen Zelllinien können leicht bestimmte Zielstrukturen produziert werden, um die Basis für Screening-Assays zu liefern. Alternativ können Ganzzelltestsysteme durch die Überexpression von spezifischen Zielproteinen (z. B. Rezeptoren) verbessert werden. Alle diese Ansätze benötigen eine a priori Definition der ins Auge gefassten Zielstruktur. Dies ist nur nach einer intensiven Forschungsphase zur Biologie des Ziels möglich. Daher existiert ein deutliches und seit langem bestehendes Bedürfnis, neue Screening-Systeme mit neuen Zielstrukturen zu entwickeln, ohne auf detailliertere Informationen bezüglich der exakten biologischen Rolle der Zielstruktur warten zu müssen. Dieses Bedürfnis wird besonders betont durch das rasche Wachstum der DNA-Sequenz-Information. Der überwiegende Teil dieser Information ist nicht sofort anwendbar, obwohl sie eine reiche Quelle darstellt, aus der biologisches Wissen in den kommenden Jahren geschöpft werden kann. Für moderne Wirkstofffindungsansätze ist es überaus wichtig, dass die verfügbare DNA-Sequenz- Information sofort, schneller und direkter benutzt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit, die Wirkung von Substanzen auf Zielstrukturen zu ermitteln, ohne ein detailliertes Wissen der einzelnen Zielstrukturen besitzen zu müssen. In einem anderen einfachen experimentellen Ansatz bietet sie eine Methode, Ziele zu identifizieren, die von Wirkstoffen beeinflusst werden. Speziell umfasst die Erfindung eine Methode, Substanzen zu screenen, die eine oder mehrere Zielstrukturen beeinflussen, oder Zielstrukturen zu identifizieren, wobei die Zielstrukturen molekulare Zielstrukturen, die von den Wirkstoffen betroffen sind, darstellen. Die Methode umfasst die Schritte:
• - Inkubieren von Zellkulturen in einer geordneten Anordnung mit reinen Substanzen oder Substanzgemischen, wobei jede Zellkultur eine spezifische Zielstruktur überexprimiert oder alternativ unterexprimiert,
• - und Identifizieren der Substanzen, die im Vergleich zu Referenz (nichtüberexprimierenden)-Zellkulturen verringerte wachstumshemmende Wirkungen auf spezifische überexprimierende Zellkulturen zeigen, oder alternativ Identifizieren von Substanzen, die im Vergleich zu spezifischen unterexprimierenden Zellkulturen verringerte wachstumshemmende Wirkungen auf Referenzkulturen zeigen, und dadurch Identifizieren der Zielstrukturen für spezifische Substanzen.
• Dementsprechend ist die erfindungsgemäße Methode geeignet, die biologische Auswirkung von reinen Substanzen auf spezifische Zielstrukturen zu bestimmen sowie molekulare Ziele von spezifischen Substanzen mit einer bekannten biologischen Aktivität, besonders Wirkstoffen, zu identifizieren.
• In ihrer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine allgemeine Lösung des Problems dar, biologisch aktive Verbindungen zu finden, die essentielle zelluläre Funktionen der benutzten Zelle hemmen. Das der Erfindung zugrundelegende Prinzip ist die spezifische Hemmung von einer oder wenigen definierten molekularen Zielstrukturen, wodurch das Wachstum beeinflusst wird. Dies wird in der Praxis erreicht, indem reine Zellkulturen in eine geordnete Anordnung gebracht werden, von denen jede mit einem oder wenigen spezifischen Genen transformiert wurden, die überexprimiert (unterexprimiert) sind. Die Überexpression wird durch Klonieren dieser Gene in einen multi-copy Plasmidvektor erreicht. Da Zellen, die große Mengen von spezifischen Genprodukten produzieren, weniger empfindlich gegenüber spezifischen Wirkstoffen sind, wird dies in einem differentiellen Wachstumsmuster resultieren. Unterexpression wird erreicht durch Expression des Gens unter der Kontrolle eines schwächeren (weniger effektiven) Promotors in einem single-copy Plasmidvektor. Daher erlaubt die erfindungsgemäße Methode die Entwicklung eines Detektionssystems für mehrere Zielstrukturen, das allein auf dem Wissen über die verfügbaren DNA-Sequenzdaten der benutzten Zelle basiert. Da jede mögliche Zielstruktur einzeln und in einer unterscheidbaren Weise überexprimiert (unterexprimiert) wird, kann der biologische Effekt einer einzelnen Substanz oder eines Substanzgemisches auf eine spezifische Zielstruktur bestimmt und direkt und eindeutig zugeordnet werden.
• Das Wesentliche der Erfindung liegt in der Umkehrung des bekannten Prinzips der genetischen Transformation, das zuerst für Mikroorganismen entwickelt und später für andere Organismen angewendet wurde. Die meisten Transformationssysteme benutzen eine wachstumshemmende Substanz und benutzen als "Entgiftungsmittel" das Gen, das für die Zielstruktur (Selektionsmarker) in der transformierten DNA kodiert. Durch Überexpression der Zielstruktur als Konsequenz der DNA-Aufhahme wird der Inhibitor effektiv verdünnt, die transformierte Zelle wird resistent und kann überleben. Anstelle der Anwendung eines spezifischen Wirkstoffs zusammen mit einer überexprimierten Zielstruktur (Selektionsmarker), um eine resistente Zelle zu erhalten, wird die Zielstruktur in einer spezifischen Zelllinie überexprimiert, um einen unbekannten Wirkstoff zu identifizieren. In anderen Worten, die bekannte Anwendung des Phänomens ist die Applikation einer bekannten Substanz auf eine Zellkultur und die Verwendung unterschiedlicher Wachstumsraten der Zellen in Gegenwart dieser Substanz nach Exposition gegenüber einer erhöhten Gendosis, was das Selektionsprinzip der Transformation darstellt. Anstelle dieser bekannten Anwendung basiert die neue Anwendung auf einer oder mehreren Zelllinien, wobei jede einzelne Zelllinie eine spezifische Zielstruktur überexprimiert. Dies erlaubt die Suche nach bioaktiven Verbindungen, die spezifische Zelllinien differentiell inhibieren als Ergebnis der spezifischen Überexpression der Zielstruktur. In einer Abwandlung dieses Verfahrens können bekannte oder unbekannte Substanzen im Hinblick auf ihre molekulare Zielstruktur evaluiert werden. Eine Ausdehnung dieses Ansatzes liegt in der Möglichkeit, empfindlichere Zellen herzustellen, indem die Zielstruktur unterexprimiert wird, z. B. als Ergebnis einer Modifikation ihrer transkriptionellen Kontrollsequenzen.
• Die Zelllinien, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, sind im Prinzip die Zelllinien jedes beliebigen eukaryontischen Organismus, bevorzugt eines eukaryontischen Mikroorganismus. Die am meisten bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Zelllinie eines eukaryontischen Mikroorganismus, besonders geeignet ist ein genetisch gut charakterisierter eukaryontischer Mikroorganismus wie Hefe oder andere Pilze, speziell pathogene Pilze, z. B. mehr spezifisch Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus spec. Die vorhergehende und folgende Beschreibung der Erfindung ist aus Gründen der Einfachheit und Klarheit auf S. cerevisiae beschränkt, obwohl sich der Fachmann der Tatsache bewusst ist, dass die Erfindung im Wesentlichen in gleicher Weise auch auf jeden anderen Organismus, der kultiviert werden kann, anwendbar ist.
• Da das gesamte Hefegenom sequenziert ist, ist es experimentell möglich, eine Sammlung von Hefezellen zu bilden, die aus individuellen Zelllinien besteht, von denen jede eine spezifische bekannte Zielstruktur (z. B. T1) überexprimiert (unterexprimiert). Alle Zelllinien, die andere Zielstrukturen (T2, T3, T4 etc.) exprimieren, dienen als Referenz für die Zielstruktur T1. Wenn die Zielstruktur T1 betroffen ist und T1 für ein Genprodukt kodiert, dessen Gegenwart essentiell für das Wachstum ist, wird die Zelllinie, die die Zielstruktur T1 überexprimiert (unterexprimiert) verglichen mit anderen Zelllinien eine reduzierte (erhöhte) Wachstumsresistenz aufweisen. Konsequenterweise ist die Wirkung einer bioaktiven Komponente mit einer inhibitorischen Aktivität gegenüber der spezifischen Zielstruktur angedeutet.
• Die technische Umsetzung der zuvor beschriebenen Erfindung wird am besten erreicht, wenn die individuellen Zelllinien, die spezifische Zielstrukturen überexprimieren (unterexprimieren) in einer geordneten Anordnung vorliegen. Dies ermöglicht die Automation und stellt die Grundlage für ein robustes Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken und/oder rohen biologischen Extrakten dar. Solch eine Anordnung ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
• Dementsprechend betrifft die Erfindung einen festen Träger, der eine geordnete Anordnung von einer Menge von Zelllinien, von denen jede eine spezifische Zielstruktur entweder überexprimiert oder alternativ unterexprimiert, optional zusammen mit einer oder mehreren Referenzzelllinien, enthält.
• Eine Zielstruktur kann jedes Molekül sein, das in einer spezifischen Zelle durch ein Transformationsereignis angereichert ist. Eine Zielstruktur im Sinne der vorliegenden Erfindung ist z. B. ein molekular definiertes DNA-Segment, ein Gen, oder ein Genprodukt, das mit Effektor-Molekülen interagiert und dadurch biologische Effekte hervorruft. Im Allgemeinen ist die Zielstruktur das direkte Genprodukt (Protein, RNA), obwohl die Zielstruktur im Prinzip auch ein eng verwandter funktioneller und/oder struktureller Interaktionspartner sein kann. Am häufigsten ist die Zielstruktur ein Protein. Insbesondere ist die Zielstruktur eukaryontischen Ursprungs. Sie kann von homologer oder heterologer Natur sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zielstruktur eine molekulare Zielstruktur, die für das Wachstum der Zelle essentiell ist.
• Um die Überexpression von individuellen Zielstrukturen zu erreichen, wird jedes individuelle Gen in einen Vektor mit mittlerer Kopienzahl kloniert (für S. cerevisiae ist dies bevorzugt ein 2u-Vektor) und wird dann mit einer etablierten Methode in einen geeigneten Wirt transformiert. Unterexpression wird erreicht, indem ein individuelles Gen unter die Kontrolle eines schwächeren Promotors gebracht wird und dieses in einen Einkopien-Plasmid-Vektor kloniert wird, oder durch Schwächung des jeweiligen Promotors durch Mutagenese (Deletion oder Veränderung eines Teiles der Promotorsequenz). Technisch wird dies z. B. erreicht, indem der Promotor, der naturgemäß zum in Frage kommenden Gen gehört, durch einen schwächeren Promotor oder ein Promotor-Fragment durch konventionelle Genersetzungs- oder -unterbrechungstechniken ersetzt wird. In einer Abwandlung dieses Ansatzes können spezifische Gene auch unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gebracht werden, wodurch spezielle Bedingungen der Genüberexpression bzw. -unterexpression erreicht werden.
• Die Kulturen der individuellen Transformanten werden in einer geordneten und vorbestimmten Art und Weise auf einen festen Träger aufgebracht. Bevorzugte feste Träger sind kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten, die eine definierte Anzahl von Näpfen besitzen, z. B. 96 Näpfe. Die Kulturen werden bevorzugt in die Näpfe dieser Mikrotiterplatten gebracht, um eine vollständige Sammlung der Stämme zu erreichen. Der feste Träger ist idealerweise so konstruiert, dass die Erzeugung von Replicas, z. B. durch drucken oder durch pipettieren, möglich ist. Der feste Träger wird auch Kontrollstämme enthalten, die untransformiert sind oder mit demselben Vektor, aber ohne ein zusätzlich inseriertes Gen transformiert sind.
• Die Anordnung der Stämme, die die Klone enthalten, die die individuellen Gene überexprimieren (unterexprimieren) zusammen mit mindestens einem Referenzstamm werden mit Lösungen behandelt, insbesondere wässrigen Lösungen von reinen Substanzen oder Substanzgemischen, wobei die Substanzen hochmolekulare oder bevorzugt niedermolekulare Verbindungen aus natürlichen Quellen oder synthetische oder semi-synthetische Produkte sind.
• Wirkstoffe sind auch umfasst und können dazu dienen, die durch sie beeinflussten molekularen Targets zu identifizieren. Nach einer Wachstumsperiode, die die Differenzierung von wachstumsinhibitorischen Effekten der Verbindungen erlaubt, werden die Wachstumsraten verglichen. Gegebenenfalls müssen geeignete Verdünnungen und Inkubationszeiten gewählt werden, um die Sensitivitätsskala zu erreichen. Die individuellen Klone, die, verglichen mit den Referenzstämmen, weniger (mehr) empfindlich gegenüber den Verbindungen sind, werden identifiziert als die Wirte, die das betroffene Ziel exprimieren.
• Für spezifische molekulare Targets mit bekannten Inhibitoren können interne Standards in die Assays aufgenommen werden. Das Screening-System kann dann zur Suche nach zusätzlichen Inhibitoren benutzt werden. Aber es sind nur sehr wenige Inhibitoren von definierten Zielstrukturen bekannt und das Wissen über solche Inhibitoren ist keine Voraussetzung für die Durchführbarkeit der Erfindung. Solche Verbindungen können zugesetzt werden, um die Anwendbarkeit weiter unter Beweis zu stellen und um zusätzliche Messpunkte für eine interne Kontrolle in das System aufzunehmen. Eine bevorzugte Anwendung der Erfindung ist ihre Verwendung ohne Standards und mit molekularen Zielstrukturen, für die noch keine bekannten Inhibitoren existieren. Die am meisten bevorzugte Anwendung ist die Verwendung im Multi-Zielstruktur-Screening und/oder als Zielstruktur-Identifikationssystem. In diesem Zusammenhang kann gleichzeitig eine Vielzahl von Substanzen oder Substanzgemischen im Hinblick auf ihre Effekte auf eine bekannte Reihe von molekularen Zielstrukturen beurteilt werden. In einem verwandten Verfahren ermöglicht dies die Identifizierung von bisher unbekannten molekularen Zielstrukturen. Dies ist von Interesse für die Identifizierung und Entwicklung von neuen Zielstrukturen für die Wirkstoffentwicklung und für die Evaluierung der Wirkungsweise von bekannten und unbekannten Substanzen, z. B. giftige Verbindungen, umweltschädlichen Substanzen, etc.
• Für die Verwendung in einem Multi Verbindungen-Screening-Ansatz können Gruppen von Genen gebildet werden, die zu biologischen Klassen gehören. Zum Beispiel können Gene, die für strukturelle Elemente der Zellwand kodieren, oder die an der Kontrolle der Zellwandsynthese beteiligt sind, überexprimiert werden (Klis, Yeast 10 (1994), 851). Diese Gene sind von speziellem Interesse für die Identifizierung von Antipilz-Wirkstoffen. Andere Klassen von Genen können strukturelle Komponenten der Zellarchitektur, Gene, die die Morphogenese von Organellen, den Proteintransport und die Proteinsekretion, den Zellzyklus, die Signaltransduktion etc. kontrollieren, betreffen. Einer Schätzung zufolge, die auf einer großen Zahl von Genunterbrechungen beruht, enthält das Hefegenom ungefähr 1000 Gene, die sogar unter Bedingungen mit hohem Nährstoffgehalt für das Wachstum essentiell sind ("essentielle Gene"). Vielen dieser Gene ist noch keine biologische Funktion zugeordnet worden, aber Verbindungen, die die Produkte dieser Gene hemmen, sind von besonderem Interesse. Deshalb ist es sehr wichtig, alle essentiellen Gene in einer Anordnung zu überexprimieren (oder unterexprimieren).
• In der beiliegenden Abb. 1 ist ein Screening-Plan auf der Basis von Mikrotiterplatten gezeigt.
• Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung, wobei sie nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.
Beispiele 1. Entwicklung eines Screening-Systems für Inhibitoren der Acetyl-CoA-Carboxylase von S. cerevisiae 1.1 Herstellung eines S. cerevisiae-Stammes, der die Acetyl-CoA-Carboxylase überexprimiert
• Das Hefe ACC1 (FAS3)-Gen liegt auf einem 7,9 kb großen SacI-Restriktionsfragment (Al- Feel et al., Proc. Acad. Sci., USA 89 (1992), 4534; Vahlensieck, Doctoral Thesis, University of Basel, 1993). Dieses Fragment wird im Wesentlichen durch die von Vahlensieck beschriebene Strategie aus dem Wildtyp-Hefestamm S288C isoliert. Die experimentellen Protokolle für die Manipulation der DNA und der Plasmide und die Kultur von Escherichia coli-Zellen sind beschrieben (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Experimentelle Protokolle, die die Manipulation von Hefe-DNA und Plasmiden behandeln, sowie die Wachstumsmedien und Kulturbedingungen sind in Sherman et al. publiziert (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983). Die gesamte chromosomale DNA aus S288C wird isoliert, mit der Restriktionsendonucleasen SacI geschnitten und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. DNA mit einer Größe von etwa 8 kb wird aus dem Gel isoliert und in den SacI geschnittenen Hefe 2u-Vektor pRS425 ligiert (Christianson et al., Gene 119 (1992), 119). Der E.coli-Stamm HB101 wird mit Aliquots des Ligationsgemisches transformiert, indem das ampR-Gen als Selektionsrriarker benutzt wird. Man erhält verschiedene E.coli-Kolonien mit individuellen Klonen, die spezifische Vektor- Insert-Kombinationen enthalten. Die E.coli-Kolonien werden von den Transformationsplatten gewaschen und Plasmid-DNA wird isoliert. Dadurch wird ein Gemisch von pRS425- Plasmiden mit verschiedenen Inserts von Hefe-DNA erhalten. Um aus diesem Gemisch das spezifische Hybridplasmid zu erhalten, das das ACC&sub1;-Gen enthält, wird das Gemisch in den Hefestamm GRF18 transformiert, wobei das LEU2-Gen des Vektors als Selektionsmarker benutzt wird. Die transformierten Hefezellen werden aufgrund ihrer Resistenz gegen das Polyketidfungizid Soraphen A gescreent (Vahlensieck et al., Curr. Genet. 25 (1994), 95), indem individuelle Transformanten in einer Flüssigkultur von YPD-Medium mit 1 ug/ml Soraphen A kultiviert werden. Die Übernachtkultur bei 30ºC zeigt klare Unterschiede in den Zelldichten: Die meisten Hefekulturen zeigen kein Wachstum, aber ein paar Kulturen zeigen gutes Wachstum und sind daher ein Hinweis für eine erhöhte Gendosis des ACC&sub1;-Gens. Um diese Annahme zu bestätigen, wird Gesamt-DNA der Soraphen A-resistenten Hefezellen isoliert und der E.coli-Stamm HB 101 wie vorher beschrieben transformiert. Die Gesamtplasmid-DNA aus individuellen E.coli-Transformanten wird isoliert, mit SacI, das ein 7,9 kb-Insert erzeugt, sowie mit EcoRI und KpnI verdaut, um diagnostische DNA- Fragmentgrößen zu erreichen. Das Produkt dieses Verfahrens ist ein Hybrid pRS425-Plasmid, das ein 7,9 kb-DNA-Insert mit dem ACC&sub1;-Gen enthält. Transformation dieses Plasmids in den Hefestamm GRF18 ergibt die Hefe GRF18/ACC1, die das ACC&sub1;-Gen überexprimiert, was durch ihre Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Soraphen A zum Ausdruck kommt.
• Als Kontrolle wird GRF 18 mit dem Plasmid pRS425 ohne Insert (Leervektor) transformiert. Dieser Stamm wird GRF18/T5 genannt.
1.2 Erstellen eines Screening-Plans auf der Basis von Mikrotiterplatten (MTP)
• Die Hefestämme GRF18/ACC1 und GRF18/T5 werden in YNB-Minimalmedium, das mit 20 ug/ml L-Histidin (YNB+his) supplementiert wurde, bis zu einer Dichte von 4 · 10&sup7; Zellen/ml kultiviert. Die Zellsuspensionen werden mit frischem YNB+his-Medium 20-fach verdünnt. 96-Napf-MTPs (erhältlich von Greiner, Deutschland) werden mit 10 ul von seriell verdünnten Substanzen oder Substanzgemischen pro Napfversetzt, wie in Abb. 1 gezeigt. Als Kontrolle erhält eine Reihe nur Lösungsmittel (Leerwert) und in einer weiteren Reihe wird Soraphen A (in einer Konzentration von 10 ug/ml) seriell verdünnt (Standard). Der Inkubationstest wird gestartet durch die Zugabe von 100 ul-Aliquots der 20-fach verdünnten Zellsuspension in die MTP-Näpfe. Die MTP wird bei 30ºC für 1-2 Tage inkubiert. In bestimmten Abständen (6 bis 10 Stunden) werden die MTPs visuell kontrolliert. Das Wachstum der Zellen wird verglichen zwischen GRF18/T und GRF 18/ACC1, Leerwerten und Soraphen A-Standards.
• Alternativ kann das Zellwachstum auch spektrophotometrisch bestimmt werden. Wenn eine Substanz oder ein Substanzgemisch wachstumshemmende Aktivität gegenüber GRF18/T5, aber keine oder eine geringere gegenüber GRF 18/ACC 1 zeigt, enthält diese wahrscheinlich einen Hemmstoff für die Acetyl-CoA-Carboxylase. Die Leerwerte und Standards stellen interne Kontrollen für Zellwachstum und Acetyl-CoA-Carboxylase-Hemmung dar.
2. Entwicklung eines Screening-Systems für Inhibitoren der Argininpermease von Saccharomyces cerevisiae
• Die Klonierung und Überexpression der Argininpermease aus Hefe ist beschrieben durch Broach et al. (Gene 8 (1979), 121). Wie darin beschrieben, wird der Hefe-2u-Vektor YEp13 zu diesem Zweck benutzt. In Analogie zu Beispiel 1 wird ein MTP-Assay entwickelt, der die folgenden Paare von Hefestämmen benutzt: GRF18/TC ( = GRF18 transformiert mit YEp13) und GRF18/CAN1 (= GRF18 transformiert mit dem Plasmid TLC-1, das das Gen für die Argininpermease von Hefe enthält, vgl. Broach et al.). Die Testanordnung ist identisch zu der in Beispiel 1 beschriebenen, außer dass Canavanin, ein bekannter Inhibitor der Argininpermease als Standard benutzt wird (Whelan et al., Genetics 91 (1979), 35).
3. Entwicklung eines Mehrzielstruktur-Screening- und -Zielstruktur- Identifikationssystems
• Unter Verwendung der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Methoden wird jedes Hefegen, für das eine essentielle Funktion für das Wachstum bekannt ist, in den Hefevektor pRS425 subkloniert. Essentielle Genfunktionen werden bestimmt unter Verwendung von Genunterbrechungstechniken, wie durch Baudin et al. (siehe oben) beschrieben. Unter Verwendung von dort beschriebenen PCR-Techniken werden spezifische offene Leseraster (ORFs) unterbrochen und der resultierende Phänotyp unter in vivo-Bedingungen unter Verwendung klassischer genetischer Techniken (Tetraden-Analyse, vgl. Sherman et al.) bestimmt. Gene, die für essentielle Funktionen kodieren, werden in den 2u-Vektor pRS425 subkloniert unter Verwendung der bei Sambrook et al. beschriebenen Klonierungstechniken (siehe oben). Hybride pRS425-Vektoren, die Inserts enthalten, die für die essentiellen Gene kodieren, werden in den Hefestamm GRF18 transformiert. Daraus resultiert eine Sammlung von transformierten GRF18-Stämmen. Diese Stämme werden in YNB+his-Medium kultiviert, wie in Beispiel 1 beschrieben, weiter behandelt wie beschrieben und in Reihen auf Mikrotiterplatten angeordnet, wie für individuelle Transformanten in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
4. Entwicklung eines Screening-Systems für Inhibitoren der Acetyl-CoA-Carboxylase auf der Basis der ACC&sub1;-Unterexpression
• Das ACC1-Gen, wie beschrieben durch Al-Feel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 4534) wird verwendet zur Erzeugung eines rnutanten GRF18-Stamm verwendet, der das ACC1-Gen unter der Kontrolle des CYC1-Promotors aus S. cerevisiae exprimiert. Dies wird erreicht, indem das ACC&sub1;-Gen (7,9 kb SacI-Restriktionsfragment) derart manipuliert wird, dass das SmaI-BamHI-Fragment, das den CYC1-Promotor des Plasmids pLG6760-Z (Guarente, Methods in Enzymology, Vol. 101 (1983), Seite 181) umfasst, in die Hindill- Schnittstelle des ACC1-Gens (12 Basenpaare stromabwärts des Initiator ATG des ACC1- Gens) durch geeignete Klonierungs- und Subklonierungstechniken (Sambrook et al., siehe oben) inseriert wird. Die exakte Fusion des CYC1-Promotors an die ACC1-Protein kodierende Sequenz wird erreicht durch eine PCR-vermittelte Deletion (Mullis, Ferre and Gibbs; PCR, The Polymerase Chain Reaction (1994), Birkhäuser Bosten). Das linearisierte SacI-Fragment, das das ACC1-Gen unter der Kontrolle des CYC1-Promotors enthält, wird durch Cotransformation mit dem Plasmid Yep 13 in den S. cerevisiae-Stamm GRF 18 transformiert. Ein 50-facher molarer Überschuss des linearisierten Fragments gegenüber dem Yep13-Vektor wird verwendet. Die Transformanten werden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber Soraphen A gescreent. Um die CYC1-Expressionslevels zu variieren, werden Glukose- oder Laktose-Wachstumsbedingungen benutzt (Guarente et al., Cell 36 (1984), 503). Um den Genaustausch zu bestätigen wird eine Southern Blot-Analyse durchgeführt unter Einsatz des CYC 1-Gens und/oder dem ACC 1-Gen als Sonde.
• Mutante Stämme mit einem korrekten Genaustausch werden ausgewählt und in Screening- Assays mit dem unmutierten S. cerevisiae GRF18-Stamm als Kontrolle benutzt. Substanzen, die eine stärkere Wachstumshemmung gegenüber dem Mutantenstamm verglichen mit dem unmutierten GRF 18-Stamm ausüben, sind exzellente Kandidaten für Acetyl-CoA- Carboxylase-Inhibitoren.

Claims (10)

1. Ein Verfahren zum Durchsuchen von Substanzen, die eine oder eine Vielzahl von Zielstrukturen hemmen, oder zur Identifizierung von Wirkstoff-Zielstrukturen, wobei die Wirkstoff-Zielstrukturen molekulare Zielstrukturen kennzeichnen, die durch Wirkstoffe gehemmt werden, das Verfahren umfassend die Schritte

- Inkubieren von Zellkulturen in einer geordneten Anordnung mit reinen Substanzen oder Substanzgemischen, wobei jede Zellkultur eine spezifische Zielstruktur überexprimiert oder alternativ unterexprimiert,

- und Identifizieren der Substanzen, die im Vergleich zu Referenz (nicht- überexprimierenden)-Zellkulturen verringerte wachstumshemmende Wirkungen auf spezifische überexprimierende Zellkulturen zeigen, oder alternativ Identifizieren von Substanzen, die im Vergleich zu spezifischen unterexprimierenden Zellkulturen verringerte wachstumshemmende Wirkungen auf Referenzkulturen zeigen, und dadurch Identifizieren der Zielstrukturen für spezifische Substanzen,

wobei Überexpression und Unterexpression eine Veränderung der Genexpressionsstärke durch Erhöhen oder Erniedrigen der Genkopienzahl oder durch Erhöhen oder Erniedrigen der Promotorstärke im Vergleich zu der Referenzzellkultur bedeutet.

2. Verfahren zum Durchsuchen von Substanzen, die die eine oder eine Vielzahl von Zielstrukturen hemmen, gemäß Anspruch 1, umfassend

- Inkubieren von Zellkulturen in einer geordneten Anordnung mit reinen Substanzen oder Substanzgemischen, wobei jede Zellkultur eine spezifische Zielstruktur überexprimiert

- und Identifizieren von Substanzen, die im Vergleich zu Referenzzellkulturen verringerte wachstumshemmende Wirkungen auf spezifische überexprimierende Zellkulturen zeigen.

3. Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoff-Zielstrukturen gemäß Anspruch 1, umfassend

- Inkubieren von Zellkulturen mit einem Wirkstoff in einer geordneten Anordnung, wobei jede Zellkultur eine spezifische Zielstruktur überexprimiert,

- und Identifizieren der Zielstrukturen für den Wirkstoff.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zellkultur eines eukaryotischen Mikroorganismus verwendet wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der eukaryotische Mikroorganismus Hefe ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Zielstruktur eukaryotischen Ursprungs ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Substanz eine Verbindung aus natürlichen Quellen oder eine synthetische oder halbsynthetische Verbindung ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Substanz ein Wirkstoff ist.

9. Ein fester Träger, der in einer geordneten Anordnung eine Vielzahl von Zelllinien, die jeweils eine spezifische individuelle Zielstruktur überexprimieren (unterexprimieren), optional zusammen mit einer oder mehreren Referenzzelllinien, enthält, wobei Überexpression und Unterexpression eine Veränderung der Genexpressionsstärke durch Erhöhen oder Erniedrigen der Genkopienzahl oder durch Erhöhen oder Erniedrigen der Promotorstärke im Vergleich zu den Referenzzelllinien bedeutet.

10. Ein fester Träger gemäß Anspruch 9, wobei der Träger eine Mikrotiterschale mit einer definierten Anzahl von Vertiefungen ist.