DE69619982T2

DE69619982T2 - Stabilisierte standards und kalibratoren

Info

Publication number: DE69619982T2
Application number: DE69619982T
Authority: DE
Inventors: Frank Grenier; F. Holzman; H. Smith; C. Tsurutani
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: US5736401A; JP3863564B2; EP0832433A1; EP0832433B1; CA2219931C; US5635406A; ATE214803T1; CA2219931A1; ES2176459T3; DE69619982D1; WO1996041184A1; JP2001515581A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Gebiet:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine wässerige in vitro Zusammensetzung, welche einen Arzneistoff umfaßt, vorzugsweise Tacrolimus, mit einer verbesserten Stabilität. Die Erfindung verwendet ein bindendes Protein, um den Arzneistoff in einer wässerigen Matrix zu stabilisieren.

Hintergrund:

Viele Arzneistoffe, welche zu therapeutischen Zwecken verabreicht werden, erfordern eine genaue und präzise Analyse der Messung des Arzneistoffes in einer Körperflüssigkeit. Üblicherweise verwenden solche analytische Verfahren eine Zusammensetzung des Arzneistoffes in einer oder mehreren Kalibrator- oder Kontrolllösungen. Diese Lösungen werden beispielsweise verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, gegen welche die Patientenprobe (mit einer unbekannten Konzentration des Arzneistoffes von Interesse) genau extrapoliert werden kann. Zusätzlich basieren die Qualitätskontrollschemata der meisten Assaysysteme auf der Verwendung stabiler Arzneistoffstandards, um die Verlässlichkeit des Assays zu beurteilen.
Wie es oft der Fall ist, wird der Arzneistoffstandard als ein Bestandteil eines Assaykits bereitgestellt und somit ist es wünschenswert, daß die Bestandteile des Kits stabil sind gegenüber den Erschütterungen des Transports, der Verarbeitung und der Lagerung. Zum Zwecke der einfachen Anwendung für den Techniker werden die Assaystandards bevorzugt als im wesentlichen wässerige Zusammensetzungen bereitgestellt. Jedoch sind viele dieser Arzneistoffe in wässeriger Umgebung nicht stabil und haben somit die Tendenz, in wässerigen Matrices schnell zu degradieren. Beispielhaft für solche Arzneistoffe, welche in wässerigen Umgebungen nicht stabil sind, sind die immunosuppressiven Arzneistoffe Tacrolimus (ebenfalls als FK506 bekannt) und Rapamycin. Die Entwicklung von kommerziellen diagnostischen Assays wurde durch solche instabile Verbindungen behindert. Die Überwindung dieser Probleme stellt eine Herausforderung in der Entwicklung von diagnostischen Assays dar.
Sowohl Tracrolimus als auch Rapamycin wurden als immunosuppressive Substanzen verwendet, um Gewebeabstoßung nach einer Transplantationstherapie zu vermeiden. Somit ist es ein wichtiger Aspekt der klinischen Versorgung, daß die Konzentration dieser Arzneistoffe im Blut überwacht wird, ähnlich der Überwachung während einer Cyclosporintherapie.
EP 0 293 892 beschreibt eine ELISA Methode zur Messung von FK506 (Tacrolimus), zusammengesetzt aus 1) einer ELISA Platte beschichtet mit anti-FK506 Antikörpern, 2) einem FK506- Meerrettichperoxidasekonjugat, welches mit freiem FK506 kompetitiert und als ein Signal erzeugendes Reagenz wirkt, und 3) einem geeigneten Substrat für die Meerrettichperoxidase. Das Protkoll erfordert, daß die Kontrollösung von FK506, welche in dem Assay verwendet wird, direkt vor der Anwendung aus einem Aliquot von FK506, welches in Ethanol bi 2-8ºC gelagert ist, erstellt wird.
Das U.S. Patent 5,338,684 von Grenier, et al beschreibt eine stabilisierte Zusammensetzung von FK506, worin der Arzneistoff gelagert wird im Vorhandensein von Voll- oder lysiertem Blut. Das Patent beschreibt, daß eine solche Zusammensetzung mindestens einen Tag lang bei 37ºC stabil ist, verglichen mit dem in Abwesenheit von Vollblut oder lysiertem Blut gelagerten Arzneistoff. Die Zusammensetzung soll nützlich sein als Standard oder Kalibrator bei Assays für FK506. Jedoch leidet eine solche Zusammensetzung an dem Nachteil der Verwendung von Blut oder Blutbestandteilen in der Zusammensetzung und den daraus folgenden möglichen biologischen Gefahren, welche durch die Verarbeitung solcher Produkte erzeugt werden.
Bindende Proteine für Arzneistoffe in der Klasse der Immunosuppresiva sind beschrieben. Beispielhaft für solche bindende Proteine für die Arzneistoffe Tacrolimus oder Rapamycin sind die U.S. Patente 5,196,352, 5,109,112, die internationale Publikationsnrn. WO 93/07269 und WO 92/18527 und die europäischen Patentanmeldungen 0 584 217 und 0 482 189.
Die internationale Publikationsnr. WO 92/01052 und die europäische Patentanmeldung 0 481 673 beschreiben DNA Sequenzen, welche für FK506 bindende Proteine kodieren.
Die internationale Publikationsnr. WO 93/25533 beschreibt ein rekombinantes FKBP Fusionsprotein und seine Anwendung in einem Assay für die Reinigung von Tacrolimus.
Die internationale Publikationsnr. WO 94/04700 beschreibt einen monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch ist für eine antigene Determinante sowohl auf FK506 als auch auf FKBP und einen Assay zur Verwendung eines solchen Antikörpers.
Die internationale Publikationsnr. WO 95/00174 beschreibt, daß Antikörper während der Lagerung stabilisiert werden können durch eine Lösung eines protektiven Liganden mit einer geringen Affinität für einen Antikörper.
Demgemäß besteht ein Bedürfnis für stabile, wässerige in vitro Zusammensetzungen von Arzneistoffen, die unter wässerigen Bedingungen instabil sind, zur Verwendung beispielsweise als wässerige Standards für diagnostische Assays für solche Arzneistoffe.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung liefert eine stabilisierte wässerige Matrix, welche einen Arzneistoff umfaßt, welcher normalerweise instabil ist unter wässerigen Bedingungen, und eine wirksame Menge eines bindenden Proteins.
In einer bevorzugten Matrix der Erfindung ist der Arzneistoff Rapamycin oder Tacrolimus und das bindende Protein ist FKBP. Am stärksten bevorzugt ist das bindende Protein FKBP- 12.
Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung der stabilisierten Matrix der Erfindung als ein Standard in einem diagnostischen Assay für den Arzneistoff.

KURZE BESCHREIBUNG DER DARSTELLUNGEN

Fig. 1 zeigt die schützende Wirkung von FKBP 12 für eine Lösung von Tacrolimus.
Fig. 2a bis 2f zeigen die schützende Wirkung eines anti- Tacrolimus Antikörpers in einer Lösung von Tacrolimus.
Fig. 3 zeigt die Stabilisierung von Kalibratorlösungen in einer Zusammensetzung der Erfindung.
Fig. 4 bis 4c zeigen die Stabilisierung von Rapamycin in Zusammensetzungen der Erfindung.
Fig. 5 zeigt die Stabilisierung von Rapamycinkalibrierungslösungen in einer Zusammensetzung der Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Ausdrücke haben die folgenden Bedeutungen, wenn sie in dieser vorliegenden Offenlegung verwendet werden: Der Ausdruck "Arzneistoff" bei Verwendung in Verbindung mit der stabilisierten Matrix gemäß der Erfindung soll einen Arzneistoff oder ein physiologisch wirksames Mittel bezeichnen, welches nicht stabil in einer wässerigen Umgebung wäre für einen Zeitraum und unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Anwendung als Standard oder Kontrollösung in einem diagnostischen Assay für den Arzneistoff.
"Wirksame Menge" bezeichnet die Menge von bindendem Protein, welche wirksam ist, um den Arzneistoff in einer wässerigen Umgebung unter Bedingungen und für einen Zeitraum zu stabilisieren, welche die Zusammensetzung geeignet machen zur Verwendung als ein Standard in einem diagnostischen Assay.
Wie oben beschrieben umfaßt die Stabilität der Matrix der Erfindung einen Arzneistoff und eine Menge eines bindenden Proteins, welches wirksam ist, um den Arzneistoff in einer wässerigen Umgebung unter Bedingungen und für einen Zeitraum zu stabilisieren, welche die Zusammensetzung geeignet machen zur Verwendung als ein Standard in einem diagnostischen Assay für den Arzneistoff.
Jeder Arzneistoff oder jedes physiologisch aktive Mittel ist geeignet zur Verwendung in der Erfindung, vorausgesetzt daß der Arzneistoff instabil ist in einer wässerigem Umgebung und ein geeignetes bindendes Protein für den Arzneistoff verfügbar ist.
Unter jenen Arzneistoffen, von denen bekannt ist, daß sie instabil sind in wässerigen Systemen sind die Immunosuppressivaverbindungen Rapamycin und Tacrolimus. Sowohl Rapamycin wie Tacrolimus sind im Fachgebiet als instabil bekannt und zusätzlich wurden bindende Proteine für diese Verbindungen charakterisiert. Rapamycin und Tacrolimus werden bevorzugt in den Zusammensetzungen der Erfindung. Zusätzlich gibt es weitere Arzneistoffe, von denen im Fachgebiet wohl bekannt ist, das sie einen Abbau unterliegen, wenn sie wässerigen Lösungen ausgesetzt sind, beispielsweise Cyclosporin.
Jedes der bindenden Proteine für Tacrolimus und Rapamycin, welche im Fachgebiet bekannt sind, ist geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung und die bindenden Proteine können isoliert und/oder charakterisiert - werden gemäß dem Verfahren, die oben beschrieben sind. Weiterhin sind die Techniken zur Erzeugung von Antikörper gegen Tacrolimus und/oder Rapamycin wohl bekannt (siehe beispielsweise europäische Patentanmeldung 0 293 892 und die internationale Patentanmeldungen WO 94/24304 und WO 94/25022) und hinsichtlich dieser Verfahren muß keine besondere Anmerkung gemacht werden.
Die Bedingungen und der Zeitraum für welchen der instabile Arzneistoff stabil gemacht werden soll durch die Verwendung einer wirksamen Menge von bindendem Protein ist selbstverständlich abhängig von der Stabilität des Arzneistoffes in einer wässerigen Umgebung, wobei einige Arzneistoffe inherent mehr oder weniger stabil sind als andere. Zusätzlich sollten die veranschlagten Bedingungen für den Kalibrator oder die Kontrolle ebenso wie die parametertestbestimmten Assays berücksichtigt werden bei der Bestimmung des Zeitraums für welchen die Zusammensetzung stabil bleiben sollte. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind wirksam zur Stabilisation des Arzneistoffes für mindestens einen Tag länger als eine Zusammensetzung des Arzneistoffes bei Fehlen des bindenden Proteins wie hierin beschrieben. Es ist wünschenswert und bevorzugt eine Stabilität des Arzneistoffes über längere Zeiträume zu erhalten selbst bei erhöhten Temperaturen. Unter diesem Aspekt wird eine bevorzugte Zusammensetzung der Erfindung den Arzneistoff für mindestens 7 Tage bei 37ºC stabilisieren. Eine stärker bevorzugte Zusammensetzung der Erfindung wird Tacrolimus für mindestens 30 Tage bei 37ºC stabilisieren bei Lagerung bei einem pH von 6,1.
Während entdeckt wurde, das die Anwendung eines bindenden Proteins, welches spezifisch den instabilen Arzneistoff bindet eine Langzeitstabilität für das Arzneistoffmolekül in einem wässerigen Medium vermittelt, ist es nicht bekannt mit einer gewissen Sicherheit durch welchen Mechanismus das bindende Protein und der Arzneistoff interagieren, um dieses Ergebnis zu erzielen. Jedoch wurde die Langzeitstabilität solcher Zusammensetzungen vollständig demonstriert, wie hierin genauer beschrieben. Weiterhin wurde die strukturelle Integrität von Tarcolimus nach Lagerung in der Zusammensetzung der Erfindung überprüft durch eine HPLC Analyse (Daten nicht gezeigt).
Die Matrix oder Zusammensetzung der Erfindung ist geeignet zu jeder Anwendung in der es wünschenswert ist eine Langzeitstabilität des physiologisch aktiven Molekülteils, der darin enthalten ist, zu erzielen. Es ist jedoch selbstverständlich, das jede beabsichtigte Anwendung die Wirkung des bindenden Proteins auf das System berücksichtigen muß, in dem es verwendet wird. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung der Erfindung nützlich als ein Standard bei einem diagnostischen Assay für den hierin enthaltenen Arzneistoff, z. B. ein Bestandteil in einer Vielzahl von Reagenzien, welche verwendet werden um eine Kalibrationskurve zu erstellen, gegen die die Messung einer Patientenprobe quantifiziert werden kann.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung der Erfindung unter Verwendung von FKBP 12. Die Herstellung von FKBP 12 ist beschrieben in Edalji, et al., J. Prot. Chem. 11: 213 (1992). Die Basismatrix ist 50 mM Piperazin- N,N'-bis[2-ethansulfonsäure] (PIPES), welche 1% Rinderserumalbumin, 0,1% TWEEN 20 (Sigma Chemical Co.), und anti-mikrobielle Wirkstoffe (0,05% (w/v) Fluorchinolon (Abbott Laboratories); 0,05% (w/v) Natriumalkylparaben (NIPASEPT, Nipa Laboratories) und 0,1% (w/v) Natriumazid (Sigma)) (hiernach bezeichnet als P/B/T) bei einem pH von 6,1 oder 7,4 enthält. FKBP 12 wird zu P/B/T in einer Konzentration von 1 ug/ml hinzugegeben. Die Matrixen werden gespickt mit FK-506 aus einer Grundlösung (10 ug/ml gelagert in Methanol bei -20ºC) und bei 2- 8ºC, 37ºC oder 45ºC inkubiert. An den angegebenen Zeitpunkten werden Aliquote der inkubierten Proben entfernt und hinsichtlich des Vorhandenseins von FK-506 untersucht unter Verwendung eines kommerziellen Tacrolimusassay (IMx® Tacrolimusassay, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
Aus den Ergebnissen (in Fig. 1 gezeigt) wird ersichtlich das der Zusatz von FKBP bei 1 ug/ml zu der Matrix bei jedem pH FK-506 stabilisiert, und jeder ersichtliche Verlust von Analyten verhindert wird.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines wässerigen Zusammensetzung der Erfindung unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Tacrolimus. Die Antikörper werden abgeleitet von Hybridomen hergestellt aus Splenocyten von Mäusen immunisiert mit einem Tacrolimus-Proteinimmunogen gemäß publizierter Techniken. Drei Antikörper (bezeichnet als AbA, AbB und AbC) werden zu P/B/T (pH 6,1 und 7,4) in einer Konzentration von 5 ug/ml hinzugegeben, und die entstehenden Lösungen werden spickt mit Tacrolimus zu einer Konzentration von 20 ug/ml durch Verdünnung der Grundlösung, die Beispiel 1 beschrieben ist. Als Kontrolle wird ein monoklonaler Antikörper (AbD) welcher nicht mit Tacrolimus interagiert in P/B/T mit 5 ug/ml gespickt. Als zusätzlicher Vergleich wird ebenfalls P/B/T hergestellt mit 1 ug/ml. FKBP und mit 20 ng/ml Tacrolimus gespickt. Die Lösungen, welche Arzneistoffe enthalten, werden inkubiert bei 2-8, 37 und 45 Grad Celius und einem Assay unterworfen gemäß dem kommerziellen Assay um die Konzentration von Tacrolimus zu bestimmen, welche zurückbleibt nach der Inkubation bei den angegebenen Zeitpunkten und Temperaturen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 2a bis 2f gezeigt. Sowohl bei pH 6,1 und 7,4 wird bei 2-8ºC eine sehr geringer Abbau ersichtlich. Bei den erhöhten Temperaturen von 37 und 45ºC ist die Verminderung der untersuchten Tacrolimuskonzentration dramatisch bei den unverstärkten und Kontroll (ABD) Matrixen. Der Zusatz von FKBP, AbA oder AbC hat einen merklichen stabilisierenden Effekt auf den Arzneistoff während der Inkubation bei der angegebenen Temperatur. Es wird ebenfalls festgestellt das nicht alle Antikörper gleichwertig sind in dieser schützenden Wirksamkeit, insofern, das AbA und AbC wirksamer sind als AbB bei der Stabilisierung von Tacrolimus. Somit ist die beschleunigte Stabilitätsstudie, die hierin beschrieben ist, ebenfalls nützlich bei der Beurteilung der stabilisierenden Wirkung, oder der schützenden Kapazität von Antikörpern.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung der Erfindung, welche Tacrolimus monoklonale Antikörper verwendet und FKBP als Zusätze um die funktionelle Lebenszeit von Tacrolimuskalibratoren zu verlängern. Kalibratoren mit Konzentration von Tacrolimus von 0, 10, 20 und 30 ng/ml wurden hergestellt durch Verdünnung einer Tacrolimusgrundlösung (Beispiel 1) in P/B/T, pH 6,1. Diese Kalibratoren werden verstärkt mit entweder 1 ug/ml FKBP oder 5 ug/ml anti-Tacrolimus Antikörper. Die Kalibratoren werden durch ein 0,2 um Filter gefiltert. Eine ähnliche Serie von Kalibratoren (0, 10, 20 und 30 ng/ml Tacrolimus) ohne FKBP oder anti- Tacrolimus werden hergestellt in dem Tacrolimusassay Vollblutverdünner (Abbott). Alle Kalibratoren werden gelagert bei 2-8ºC oder 37ºC bis zur Anwendung. Eine Serie von Tacrolimusproben werden hergestellt in dem kommerziell verfügbaren Tacrolimusverdünnerpuffer (Abbott) bei 12 (Probe A), 18 (Probe B) und 24 (Probe C) ng/ml und bis zur Verwendung von -20ºC gelagert. An dem angegebenen Tag wird eine Probe von A, B und C aufgetaut und die Konzentration bestimmt in dem kommerziellen Assay unter Verwendung der verstärkten Kalibratoren für jede der vier Verdünnungen. Für jeden Kalibratorsatz bei jeder Temperatur wird eine Standardkurve erzeugt und die Konzentration von - Tacrolimus in der Probe berechnet unter Verwendung von Punkt zu Punkt Datenreduktion. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Eine wesentliche Eigenschaft, welche die funktionelle Lebenszeit eines Kalibratorsatzes bestimmt, ist das die Konzentration der zu bestimmenden Probe, unter Verwendung des Kalibratorsatzes sich nicht ändern sollte. Wie in Fig. 3 gezeigt wird sich die augenscheinliche Konzentration des Arzneistoffes in untersuchten Proben unter Verwendung dieses Kalibratorsatzes erhöhen, wenn das Tacrolimus in einem Kalibratorsatz bei verlängerter Lagerung bei 37ºC abgebaut wird. Wie gesehen werden kann liefern sowohl die FKBP wie die anti- Tacrolimus Antikörper verstärkten Kalibratorzusammensetzungen der Erfindung eine längere funktionelle Lebenszeit bei dieser beschleunigten Stabilitätsstudie.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung der Erfindung eines bindenden Proteins als Zusatz um die funktionelle Lebenszeit von Rapamycin zu verlängern. P/B/T wird verstärkt mit FKBP mit 3 ug/ml, anti- Rapamycin monoklonalen Antikörper bei 5 ug/ml (AbA) oder einem Kontrollantikörper bei 5 ug/ml (AbB). Die Vollblutkalibratormatrix aus dem kommerziellen Assaykit wird verwendet als Vergleich. Die Matrices werden gespickt mit Rapamycin zu 40 ng/ml aus einer Grundlösung 10 ug/ml in Methanol und bei -20ºC gelagert) und gelagert bei 2-8ºC, bei 37ºC und Raumtemperatur. Kalibratoren für die Assays für jeden Tag werden frisch hergestellt durch Verdünnung aus der Methanollösung in P/B/T und auf Eis gelagert. Das Assayprotokoll ist ähnlich zu jenem verwendet zu dem kommerziellen Assay, außer das die Assaymikropartikel hergestellt werden aus einem anti-Rapamycin monoklonalen Antikörper und das Assaykonjugat ein Rapamycin-CMO- alkaline Phosphatasekonjugat ist. Die Extraktionsreagenzie ist 1% ZnSO&sub4; in 40% wässerigem Methanol. Vor dem Assay werden Probe und Kalibratoren verdünnt mit einem gleichen Volumen von Vollblutkalibratorverdünner oder P/B/T um eine endgültige Konzentration von 50% Vollblutkalibratorverdünner zu ergeben und dann 1 : 1 mit Extraktionsreagenzie extrahiert. Das Extrakt wird zentrifugiert und der Überstand wird in die Instrumentenprobenkammer eingegeben und einem Assay unterworfen wie zuvor beschrieben. Die Konzentration der Proben wird abgelesen aus einer Standardkurve, die erzeugt wurde unter Verwendung einer Punkt zu Punkt Datenreduktion. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4a-4c gezeigt. Die rasche Verschlechterung von Rapamycin in P/B/T und P/B/T & Kontroll Ab bei Raumtemperatur in 37ºC ist offensichtlich. Der schützende Effekt von entweder FKBP-12 oder dem anti-Rapamycin Antikörper ist ebenfalls ersichtlich und ist ähnlich zu jenem von der Tacrolimusvollblutverdünnerzusammensetzung. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Wirksamkeit der bindenden Proteine bei der Stabilisierung von Rapamycin bei 2-8ºC an den Tagen 26 und 36 dieser Studie.

Beispiel 5

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung unter Verwendung des bindenden Proteins FKBP-12 um Rapamycinkalibratoren in einem Assay zu stabilisieren. P/B/T bei pH 7,4 (Matrix A) oder P/B/T, pH 7,4 verstärkt mit 1 u/ml FKBP-12 (Matrix B) wird hergestellt um ein Kalibratorenset herzustellen bestehend aus 0, 10 und 20 ng/ml Rapamycin. Eine Rapamycinkontrolle bei 4 ng/ml wird hergestellt in dem Vollblutkalibratorverdünner und bei -20ºC gelagert. Die Kalibratorensätze werden bei 2-8ºC, Raumtemperatur, oder 37ºC gelagert. An den angegebenen Tagen wird eine Kontrollviole aufgetaut und untersucht wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Konzentrationen der Kontrollen werden auf Standardkurven bestimmt, welche aus jedem Kalibratorset erzielt werden durch Punkt zu Punkt Datenreduktion.
Die Ergebnisse zeigen in Fig. 5 die Verschlechterung der Rapamycinkalibratoren bei 2-8ºC innerhalb von 12 Tagen, bei Raumtemperatur innerhalb von 2 Tagen und bei 37ºC innerhalb 1 Tages. Der Zusatz des FKBP-12 zu der Kalibratormatrix verzögert die Kalibratorverschlechterung bei allen 3 Temperaturen, wodurch die Nützlichkeit des bindenden Proteins in der wässerigen Rapamycinkalibratormatrix gezeigt wird.

Claims

1. Ein Verfahren zur Stabilisierung einer wässerigen Zusammensetzung, die Tacrolimus oder Rapamycin enthält, das den Schritt Hinzufügen eines bindenden Proteins für Tacrolimus bzw. Rapamycin zu der wässerigen Zusammensetzung umfaßt.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Tacrolimus enthält und wobei das bindende Protein gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus FKBP's und Anti-Tacrolimus-Antikörpern.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Rapamycin enthält und wobei das bindende Protein gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus FKBP's und Anti- Rapamycin-Antikörpern.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung 7,4 beträgt.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das bindende Protein FKBP 12 ist.

6. Ein Verfahren zur Erstellung einer Kalibrationskurve zur Verwendung als ein Standard in einem Immunoassay für Tacrolimus in einer Patientenprobe, das den Schritt der Durchführung eines Immunoassays an wässerigen Kalibrationszusammensetzungen von Tacrolimus umfaßt, das durch die Zugabe eines bindenden Proteins für Tacrolimus, vorzugsweise Anti-Tacrolimus-Antikörpern oder FKBP, stabilisiert ist.

7. Ein Verfahren zur Erstellung einer Kalibrationskurve zur Verwendung als ein Standard in einem Immunoassay für Rapamycin in einer Patientenprobe, das den Schritt der Durchführung eines Immunoassays an wässerigen Kalibrationszusammensetzungen von Rapamycin umfaßt, das durch die Zugabe eines bindenden Proteins für Rapamycin, vorzugsweise Anti-Rapamycin-Antikörpern oder FKBP, stabilisiert ist.