DE69533923T2

DE69533923T2 - Cytokinin-designiertes lerk-5

Info

Publication number: DE69533923T2
Application number: DE69533923T
Authority: DE
Inventors: P. Douglas CERRETTI; Pranhitha Reddy
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: US6596852B2; FI965297L; CA2194299A1; DK0770088T3; ATE286907T1; WO1996001839A1; US6492140B2; AU684988B2; US20020103358A1; EP0770088A1; PT770088E; NO965627L; JPH10502810A; NZ290253A; DE69533923D1; US6303769B1; US6479459B1; US20010009768A1; NO965627D0; EP0770088A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteine, die als Rezeptor-Tyrosinkinasen bekannt sind, weisen eine intrinsische Kinaseaktivität auf, die bei Ligandenbindung aktiviert wird. Diese Klasse von Proteinen ist durch konservierte strukturelle Motive innerhalb der katalytischen Domänen (Hanks et al., Science 242: 42, 1988) gekennzeichnet und kann basierend auf strukturellen Merkmalen der N-terminalen Regionen bis zur katalytischen Domäne in Familien unterteilt werden.
Boyd et al. (J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992) reinigten ein Zelloberflächenglycoprotein, das Tyrosinkinase-Aktivität aufwies. Die N-terminale Aminosäuresequenz identifizierte dieses Protein als ein Mitglied der Eph/Elk-Familie, so dass das Protein als Hek (humane Eph/Elk-ähnliche Kinase) bezeichnet wurde. Ein mit Hek immunoreaktiver monoklonaler Antikörper wurde verwendet, um die Hek-Expression an einer Reihe von humanen Zelltypen zu untersuchen (Boyd et al., supra). Hek-Antigen wurde auf der humanen pre-B-Zellen-Leukämiezelllinie LK63 (die Zelllinie, die als Immunogen verwendet wurde, gegen das der Antikörper gezüchtet wurde) und der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie JM gefunden. Die Raji-B-Lymphomazelllinie zeigte eine schwache Hek-Antigenexpression, während die restlichen getesteten Zelllinien (sowohl normale als auch Tumorzelllinien, unter denen sich hämopoetische Zelllinien befanden, die pre-B- und T-Zelllinien einschlossen) konsistent negativ waren. Von den normalen und Tumorgewebebiopsieproben, die ebenfalls auf Hek-Antigen-Expression getestet wurden, war keines von den normalen Geweben positiv und nur ein sehr geringer Anteil der hämopoetischen Tumore positiv.
Die Expression von Hek-Transkripten in den oben beschriebenen LK63- und JM-Zelllinien, sowie der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie HSB-2, wurde durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen (Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1611, 1992). Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für einen isolierten Hek-cDNA-Klon werden in Wicks et al., supra präsentiert.
Das als Elk bezeichnete Zellenoberflächenprotein ist ein weiteres Mitglied der Tyrosinkinaserezeptorfamilie von Proteinen. Ein partieller Klon von Elk wurde in einer Rattenhirn-cDNA-Expressionsbibliothek entdeckt, die auf Proteine untersucht wurde, die Tyrosinkinaseaktivität exprimieren (Letwin et al., Oncogene 3: 621, 1988). Danach wurde eine zusammengesetzte Sequenz, die sich über die gesamte Elkcodierungsregion erstreckt, von partiellen Klonen abgeleitet, die von einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek und einer Ratten-Kleinhirnbibliothek unter Verwendung des partiellen Klons als Sonde isoliert wurden (Lhotak et al., Mol. Cell: Biol. 11: 2496, 1991).
Die Hek- und Elk-Proteine sind eng mit einer Reihe von anderen Rezeptortyrosinkinasen verwandt, einschließlich der Hek-homologen Verbindungen Mek4 und Cek4 (Sajjadi et al. New Biol. 3: 769, 1991); Eek (Chan et al. Oncogene 6: 1057, 1991); Erk (Chan et al. supra), Eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10: 6316, 1990); Cek5 (Pasquale, E. B. Cell Regulation 2: 523, 1991); und Eph (Hirai et al. Science 238: 1717, 1987). Die Proteine dieser Unterfamilie sind nicht nur in ihren cytoplasmatischen Domänen, sondern auch in ihren extrazellulären Domänen verwandt, die 41 bis 68% identisch sind. Interessanterweise sind die Gewebeverteilungen dieser verschiedenen Rezeptoren unterschiedlich. So wurde zum Beispiel berichtet, dass die Expression von Elk-mRNA auf Hoden und Hirn beschränkt ist (Lhotak et al., supra), während Eck nicht nur in denselben zwei Geweben, sondern auch in der Lunge, im Darm, den Nieren, der Milz, dem Eierstock und der Haut gefunden wird.
Die Liganden, die für die Rezeptortyrosinkinasen identifiziert wurden, sind eine andere Gruppe von Proteinen, welche das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Zellen beeinflussen, die die Rezeptoren exprimieren. Liganden für Hek und Elk wurden isoliert, so wie weiter unten im Detail erläutert.
Die Identifikation etwaiger zusätzlicher Liganden für Hek und Elk, die existieren mögen, würden sich bei der Untersuchung der Natur von zellularen Prozessen, die mittels Signalisierung durch diese Rezeptoren reguliert werden, als nützlich erweisen. Wenn die Verstärkung oder Hemmung eines bestimmten biologischen Signals, das durch diese Rezeptoren vermittelt wird, gewünscht ist, ist es vorteilhaft, jedes der Proteine, die eine Rolle bei der Transduktion solcher Signale spielen, zu identifizieren. Ferner sind Proteine, die an bestimmte Rezeptoren binden, ohne Signaltransduktion zu starten, bekannt, einschließlich des Interleukin-1-Rezeptor-Antagonistenproteins (Eisenberg et al., Nature 343: 341, 1990; Hannum et al., Nature 343: 336, 1990; und Carter et al., Nature 344: 633, 1990). Die Identifikation von zusätzlichen Proteinen, die Hek oder Elk binden, ist wünschenswert, um festzustellen, ob solche Proteine als Antagonisten fungieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Cytokin bereit, das als LERK-5 bezeichnet wird und an Elk und Hek bindet, die Mitglieder der Eph/Elk-Familie von Rezeptortyrosinkinasen sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte DNA, die das LERK-5-Protein codiert, und Expressionsvektoren, welche die isolierte DNA aufweisen, bereit. Ein Verfahren zur Herstellung von LERK-5 umfasst das Züchten von Wirtszellen, welche die Expressionsvektoren enthalten, unter Bedingungen, die für die Expression von LERK-5-Protein geeignet sind, und die Wiedergewinnung des LERK-5. Es werden auch Antikörper geoffenbart, die gegen das LERK-5-Protein gerichtet sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt eine vergleichende Anordnung von humanen LERK-5 und Maus-LERK-5-Aminosäuresequenzen dar. Der Transmembranbereich ist durch ein Kästchen und die erste Aminosäure des reifen Proteins für jedes Protein durch einen Kreis angezeigt. Die Aminosäureidentitäten sind durch vertikale Linien angezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine cDNA, die ein neuartiges Protein mit der Bezeichnung LERK-5 codiert, welches an Zellenoberflächenrezeptoren bindet, die als Elk und Hek bekannt sind, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert. Ferner werden Expressionsvektoren bereitgestellt, die LERK-5-DNA aufweisen. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten LERK-5-Polypeptiden schließen das Züchten von Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren unter Bedingungen transformiert wurden, die für die Expression von LERK-5 geeignet sind, und das Wiedergewinnen des exprimierten LERK-5 ein. Gereinigtes LERK-5-Protein ist ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst, einschließlich löslicher Formen des Proteins, welche die extrazelluläre Domäne enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch LERK-5 oder Fragmente davon bereit, die als Immunogene agieren können, um damit reaktive Antikörper zu erzeugen. In einer Ausführungsform sind die Antikörper für LERK-5 spezifische monoklonale Antikörper.
Humane LERK-5 cDNA wurde erfolgreich isoliert, so wie in Beispiel 1 beschrieben. Die DNA-Sequenz der codierenden Region eines humanen LERK-5 cDNA-Klons und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargelegt. Das codierte Protein enthält ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –25 bis –1 von SEQ ID NO: 2), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1 bis 199), einen Transmembranbereich (Aminosäuren 200 bis 225) und eine cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 226 bis 308). Das Binden von LERK-5 an die zwei Zelloberflächenrezeptoren, die als Elk und Hek bekannt sind, wird in Beispiel 4 gezeigt.
Ein Zelllysat, das einen rekombinanten Phage-λgt10-Vektor enthält, der LERK-5 cDNA enthält, wurde bei der American Type Culture Collection am 16. Juni 1994 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC75815. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags. Der rekombinante λgt10-Vektor wurde dann in Beispiel 1 isoliert und als Klon λ6 identifiziert.
Das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte neue Cytokin ist ein Ligand für Elk, einen Rattenzellenoberflächenrezeptor, der ein Mitglied der Eph/Elk-Familie von Rezeptortyrosinkinasen ist. Die Expression von Elk-mRNA wurde im Hirn und in den Hoden von Ratten (Lhotok et al., supra) festgestellt, wobei die Möglichkeit in Betracht gezogen wurde, dass Elk onkogenischer Aktivierung fähig sein könnte (Letwin et al., supra). Das Cytokin ist außerdem ein Ligand für Hek, das ein weiteres Mitglied der Eph/Elk-Familie von Rezeptortyrosinkinasen ist (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992; Wicks et al., PNAS USA 89: 1611, 1992). Unter den Zelltypen, auf denen Hek exprimiert wird, befinden sich bestimmte humane Leukämiezelllinien.
Der Begriff „LERK-5", so wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Gattung von Polypeptiden, die imstande sind, Elk und Hek zu binden, und wesentliche Homologie mit den hierin offenbarten LERK-5-Aminosäuresequenzen aufweisen. Humanes LERK-5 liegt innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, genauso wie LERK-5-Proteine, die von anderen Säugerspezies abgeleitet werden, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – Mäuse Ratten, Rinder, Schweine oder verschiedene Primatenarten. So wie hierin verwendet, schließt der Begriff „LERK-5" membrangebundene Proteine (die eine extrazelluläre Domäne, einen Transmembranbereich und eine cytoplasmatische Region enthalten) sowie gestutzte Proteine ein, welche die Elk-bindende oder Hek-bindende Eigenschaft beibehalten. Zu diesen gestutzten Proteinen zählt zum Beispiel lösliches LERK-5, das nur die extrazelluläre (rezeptorbindende) Domäne aufweist.
Es wurden andere Proteine identifiziert, die Elk und Hek binden. Das LERK-5 der vorliegenden Erfindung ist ein neuartiges Protein, das sich von diesen anderen Elk-bindenden und Hek-bindenden Proteinen unterscheidet.
Ein Elk-Ligand ist in der PCT-Anmeldung WO 94/11384 beschrieben. Die Nukleotidsequenz von klonierter cDNA (bezeichnet Klon tele7), welche diesen Elk-Liganden codiert, sowie die Aminosäuresequenz, die dadurch codiert wird, sind in WO 94/11384 dargestellt. Das Protein ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das 346 Aminosäuren enthält, einschließlich eines N-terminalen Signalpeptids, einer extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne und einer cytoplasmatischen Domäne.
Zwei Hek-Ligandenproteine (durch als A2 und C6 bezeichnete Klone codiert), die auf Ebene der Aminosäuren zu 38% identisch sind, werden in der PCT-Anmeldung WO 95/06065 beschrieben. Die DNA und die codierten Aminosäuresequenzen für klonierte cDNA, welche die zwei Hek-Ligandenproteine codiert, werden in der Anmeldung WO 95/06065 vorgestellt. Die codierten Proteine enthalten jeweils ein N-terminales Signalpeptid, eine extrazelluläre Domäne und eine C-terminale hydrophobe Region, welche Signale für Glycosyl-Phosphatidylinositol(GPI)-Verankerung enthält. Nach posttranslationaler Verarbeitung sind beide Proteine an der Zelloberfläche durch GPI-Kopplung verankert.
Ein weiteres Protein, bei dem sich herausgestellt hat, dass es Elk und Hek bindet, wird als B61 bezeichnet. Nukleotid- und codierte Aminosäuresequenzen für B61-cDNA werden in Holzman et al. präsentiert (Mol. Cell. Biol. 10: 5830, 1990). In der Folge stellte sich heraus, dass B61 Elk und Hek bindet, so wie in den in WO 95/06065 beschriebenen Bindungstests beschrieben.
Von diesen vier Proteinen (B61 und die durch die Klone tele7, A2 und C6 codierten Proteine) ist das LERK-5 der vorliegenden Erfindung mit dem Elk-Liganden, der durch tele7 codiert wird (im Folgenden als Elk-L tele7 bezeichnet) am nächsten (strukturelle) verwandt. Die Aminosäuresequenzen der LERK-5 und Elk-L tele7 Proteine voller Länge sind zu 58,5% und die DNA-Sequenzen zu 61,4% identisch. Die Sequenzen, welche das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne von Elk-L und LERK-5 enthalten, sind auf Ebene der Aminosäuren zu 51,6% und auf Ebene der DNA zu 53,6% identisch. Die cytoplasmatischen Domänen sind auf Ebene der Aminosäuren zu 74,7% und auf Ebene der DNA zu 75,5% identisch.
Ein weiteres Mitglied der Rezeptortyrosinkinase-Familie ist Hek2 (Böhme et al., Oncogene 8: 2857, 1993). LERK-5 bindet an Hek2.
Die Nukleotidsequenz einer humanen exprimierten Sequenzmarkierung (EST) für Chromosom 13 ist in der GenBank^® unter der Zugriffsnummer L13819 zu finden. Die Quelle der EST ist als cDNA identifiziert, die von der mRNA aus dem Hirn eines drei Monate alten weiblichen Menschen abgeleitet wurde. Wenn die 337 bp Sequenz, die für die EST offenbart ist, mit der Elk-L tele7 Nukleotidsequenz ausgerichtet wird, ist die Sequenzmarkierung zu 59,3% mit der entsprechenden Region der Elk-L tele7 DNA identisch. Angesichts dieses Grads an Sequenzhomologie haben die gegenwärtigen Erfinder versucht, zu bestimmen, ob die Sequenzmarkierung Teil eines Gens war, das ein biologisch aktives Protein, insbesondere ein Protein, das Elk oder Hek binden würde, codierte.
Die GenBankaufzeichnungen offenbart kein Polypeptid, das durch die EST codiert wird (z.B. wird nicht angeführt, wie der Leserahmen, sollte es einen geben, aussieht), und besagt schon gar nicht, dass ein solches Polypeptid Elk oder Hek binden würde. Selbst wenn die Sequenzmarkierungs-DNA im Leserahmen exprimiert würde, der durch das Klonen der LERK-5-DNA, über die hierin berichtet wird, aufgeklärt wird, würden der Aminosäuresequenz drei der vier Cysteinreste fehlen, die in den extrazellulären der vier oben beschriebenen Proteine, die Elk und Hek binden, konserviert werden. Im LERK-5-Protein der vorliegenden Erfindung sind diese Cysteine bei den Aminosäuren 37, 64, 76 und 128 von SEQ ID NO: 2 zu finden. Ein Translat der Sequenzmarkierung würde den Aminosäuren 79 bis 190 von SEQ ID NO: 2 entsprechen (mit einer fehlenden Übereinstimmung, die in Beispiel 1 beschrieben ist). Somit wird nicht angenommen, dass die 337 bp Sequenzmarkierung ein Polypeptid codiert, das imstande ist, Elk oder Hek zu binden.
Die humane LERK-5-cDNA, die in Beispiel 1 unten isoliert ist, kann radioaktiv markiert und als Sonde verwendet werden, um andere Säuger-LERK5-cDNA durch Kreuzspezies-Hybridisierung zu isolieren. RNAs, die von verschiedenen Zelllinien oder Geweben, die von verschiedenen Säugerspezies gewonnen werden, isoliert sind, können durch Northern-Hybridisierung gescreent werden, um eine geeignete mRNA-Quelle zur Verwendung beim Klonen eines LERK-5-Gens zu identifizieren.
DNA, die Maus-LERK-5 codiert, wurde von einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus 11,5-Tage alten Embryos hergestellt wurde. Die Maus-LERK-5-Aminosäuresequenz wird in 1 dargestellt und mit der humanen LERK-5-Aminosäuresequenz ausgerichtet. Maus-LERK-5 und humanes LERK-5 sind auf Ebene der Aminosäure zu 97% identisch.
Fragmente des LERK-5-Proteins von SEQ ID NO: 2, die imstande sind, Elk oder Hek zu binden, werden durch die vorliegende Erfindung erfasst. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt lösliche LERK-5-Polypeptide bereit. Lösliche LERK-5-Polypeptide enthalten die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne eines nativen LERK-5, es fehlt ihnen jedoch an dem Transmembranbereich, welcher die Retention des Polypeptids auf einer Zellmembran bewirken würde. Lösliche LERK-5-Polypeptide enthalten vorteilhafterweise das native (oder ein heterologes) Signalpeptid, wenn sie anfangs synthetisiert werden, um Sekretion zu fördern, aber das Signalpeptid wird bei der Sekretion von LERK-5 von der Zelle gespalten. Die löslichen LERK-5-Polypeptide, die verwendet werden können, behalten die Fähigkeit, Elk oder Hek zu binden. Lösliches LERK-5 kann auch einen Teil des Transmembranbereichs oder einen Teil der cytoplasmatischen Domäne oder anderer Sequenzen einschließen, vorausgesetzt, das lösliche LERK-5-Protein kann ausgeschieden werden.
Lösliches LERK-5 kann durch Trennen intakter Zellen, welche das gewünschte Protein von dem Kulturmedium exprimieren, z.B. durch Zentrifugation, und durch Überprüfen des Mediums (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Proteins identifiziert (und von seinen nicht-löslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Die Gegenwart von LERK-5 im Medium zeigt, dass das Protein aus den Zellen ausgeschieden wurde und somit eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist. Lösliches LERK-5 kann eine natürlich vorkommende Form dieses Proteins sein.
Die Verwendung von löslichen Formen des LERK-5 ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Proteine aus rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine aus den Zellen ausgeschieden werden. Ferner sind lösliche Proteine im Allgemeinen für eine intravenöse Verabreichung besser geeignet.
Beispiele für lösliche LERK-5 Polypeptide schließen jene ein, welche die gesamte extrazelluläre Domäne eines nativen LERK-5-Proteins enthalten. Ein solches lösliches LERK-5-Protein enthält die Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2. Wenn es anfangs innerhalb einer Wirtszelle exprimiert wird, kann das lösliche Protein zusätzlich eines der unten beschriebenen heterologen Signalpeptide aufweisen, das innerhalb der verwendeten Wirtszelle funktional ist. Alternativ dazu kann das Protein das native Signalpeptid aufweisen, so dass das LERK-5 Aminosäuren –25 bis 199 von SEQ ID NO: 2 enthält. DNA-Sequenzen, die lösliche LERK-5-Proteine codieren, werden durch die vorliegende Erfindung erfasst.
Gestutztes LERK-5, einschließlich löslicher Polypeptide, kann durch eine von einer Reihe von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine gewünschte DNA-Sequenz kann unter Anwendung bekannter Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Restriktionsendonuklease-Digestion einer klonierten DNA-Sequenz voller Länge hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarose-Gels isoliert werden. Oligonukleotide, welche das 5'- oder 3'-Ende eines DNA-Fragmentes bis zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, können synthetisiert werden. Die Oligonukleotide können eine Restriktionsendonuklease-Spaltstelle stromaufwärts von der gewünschten codierenden Sequenz enthalten und ein Startcodon (ATG) am 5'-Terminus der codierenden Sequenz anordnen. Linker, die (eine) Restriktionsendonuklease-Spaltstelle(n) enthalten, können verwendet werden, um das gewünschte DNA-Fragment in einen Expressionsvektor einzufügen. Das weithin bekannte Polymerasekettenreaktionsverfahren kann ebenfalls angewendet werden, um eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Proteinfragment codiert, zu isolieren. Oligonukleotide, welche die Termini des gewünschten Fragments definieren, werden als Primer in der PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendet. Als weitere Alternative können bekannte Mutagenesetechniken angewendet werden, um ein Stopp-Codon an einem gewünschten Punkt einzufügen, z.B. unmittelbar stromabwärts des Codons für die letzte Aminosäure der extrazellulären Domäne.
In Bezug auf die vorherige Besprechung der Signalpeptide und der unterschiedlichen Domänen des LERK-5-Proteins, wird der Fachmann erkennen, dass die oben beschriebenen Grenzen solcher Regionen des Proteins ungefähre Angaben sind. Obwohl Computerprogramme zur Verfügung stehen, welche die Spaltstelle eines Signalpeptids vorhersehen, kann zum Beispiel die Spaltung an Stellen eintreten, die nicht zu den vorhergesehenen Stellen zählen. Ferner wird anerkannt, dass aufgrund des Spaltens des Signalpeptids an mehr als einer Stelle eine Proteinzubereitung eine Mischung von Proteinmolekülen enthalten kann, welche unterschiedliche N-terminale Aminosäuren aufweisen. Außerdem können sich die exakten Grenzen eines Transmembranbereichs von den durch ein Computerprogramm vorhergesehenen Grenzen unterscheiden. Posttranslationale Verarbeitung, die gemäß des jeweiligen Expressionssystems, das angewendet wird, variieren kann, kann Proteine ergeben, die N- oder C-terminale Aminosäuren aufweisen, die sich von den oben beschriebenen unterscheiden. Solche Varianten, welche die gewünschte biologische Aktivität beibehalten, sind unter den LERK-5-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zu finden.
Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte LERK-5-Polypeptide bereit, und zwar sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinante. Varianten und Derivate von nativen LERK-5-Proteinen, welche die gewünschte biologische Aktivität beibehalten (z.B. die Fähigkeit, Elk oder Hek zu binden), fallen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. LERK-5-Varianten können durch Mutationen von Nukleotidsequenzen erhalten werden, die für native LERK-5-Polypeptide codieren. Eine LERK-5-Variante, so wie hierin angeführt, ist ein Polypeptid, das im Wesentlichen mit einem nativen LERK-5 homolog ist, das aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von jener eines nativen LERK-5 aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheidet.
Eine Variante einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz ist vorzugsweise mindestens zu 80% mit einer nativen LERK-5-Sequenz identisch, am bevorzugtesten zu mindestens 90%. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist ein LERK-5-Protein eine extrazelluläre Domäne, einen Transmembranbereich und eine cytoplasmatische Domäne auf, wobei die Aminosäuresequenz des LERK-5-Proteins zu mindestens 90% mit der Sequenz identisch ist, die als Aminosäuren 1 bis 308 von SEQ ID NO: 2 präsentiert wird. In einer anderen Ausführungsform enthält ein lösliches LERK-5-Polypeptid, das imstande ist, Elk und Hek zu binden, eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% mit der Sequenz identisch ist, die als Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 präsentiert wird.
Die prozentuelle Identität kann zum Beispiel dadurch bestimmt werden, dass Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, beschrieben von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) und erhältlich bei der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), verglichen werden. Das GAP-Programm verwendet das Anordnungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), so wie von Smith und Waterman überarbeitet (Adv. Appl. Math 2: 482, 1981). Die bevorzugten Default-Parameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358, 1979, beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche Strafe von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Endlücken.
Änderungen der nativen Sequenz können durch eine beliebige von einer Reihe von bekannten Techniken erzielt werden. Mutationen können an bestimmten Stellen durch das Synthetisieren von Oligonukleotiden eingefügt werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation codiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analogon, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, Aminosäure-Substitution oder Aminosäure-Deletion aufweist.
Alternativ dazu können oligonukleotid-gerichtete, stellenspezifische Mutageneseverfahren angewendet werden, um ein geändertes Gen bereitzustellen, das bestimmte Codone aufweist, die gemäß der geforderten Substitution, Deletion oder Insertion geändert wurden. Beispielhafte Verfahren zur Durchführung der oben genannten Änderungen werden von Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); und in den US-Patentschriften Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbart.
Varianten können konservativ substituierte Sequenzen enthalten, das heißt, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest ersetzt wird, der ähnliche biochemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines aliphatischen Rests durch einen anderen ein, wie beispielsweise Ile, Val, Leu oder Ala durch einen anderen, oder Substitutionen eines polaren Rests durch einen anderen, wie zum Beispiel zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn. Andere konservative Substitutionen dieser Art, zum Beispiel Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften sind weithin bekannt.
LERK-5 kann auch modifiziert werden, um LERK-5-Derivate durch Bilden kovalenter oder aggregierender Konjugate mit anderen chemischen Anteilen wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und dergleichen zu erzeugen. Kovalente Derivate von LERK-5 können durch Verknüpfen der chemischen Anteile zu funktionellen Gruppen auf LERK-5-Aminosäure-Seitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines LERK-5-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt werden. Andere Derivate von LERK-5, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen, schließen kovalente oder aggregierende Konjugate von LERK-5 oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie zum Beispiel durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz (z.B. den α-Faktor-Leader von Saccharomyces) am N-Terminus eines LERK-5-Polypeptids enthalten. Das Signal- oder Leader-Peptid richtet den Transfer des Konjugats co-translational oder post-translational von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand aus.
LERK-5-Polypeptidfusionen können Peptide aufweisen, welche hinzugefügt werden, um die Reinigung und Identifikation von LERK-5 zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen zum Beispiel poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in der US- Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 beschrieben sind. Ein solches Peptid ist das FLAG^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 3), das hoch antigen ist und ein Epitop bereitstellt, das durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden ist, wodurch ein rascher Test und leichte Reinigung von exprimiertem rekombinantem Protein möglich ist. Diese Sequenz wird auch insbesondere durch mukosale Enterokinase bei Rindern bei dem Rest gespalten, der unmittelbar auf das Asp-Lys-Paar folgt.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner LERK-5-Polypeptide mit oder ohne dazugehörige Glycosylierung mit nativem Muster ein. LERK-5, das in Hefe oder Säuger-Expressionssystemen (z.B. COS-7-Zellen) exprimiert ist, kann einem nativen LERK-5 Polypeptid in Bezug auf das Molekulargewicht und das Glycosylierungsmuster ähnlich sein oder sich von diesem deutlich unterscheiden, je nachdem, welches Expressionssystem gewählt wurde. Die Expression von LERK-5-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit.
N-Glycosylierungsstellen in der LERK-5 extrazellulären Domäne können modifiziert werden, um Glycosylierung auszuschließen. Solche Stellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch eine Aminosäure-Dreiergruppe Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist, und Y für Ser oder Thr steht. Das humane LERK-5-Protein enthält zwei solcher Dreiergruppen bei den Aminosäuren 11–13 und 114–116 von SEQ ID NO: 2. Geeignete Modifikationen an der Nukleotidsequenz, welche diese Dreiergruppe codiert, führt zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche ein Anheften von Kohlenhydratresten an der Asn-Seitenkette verhindern. Eine Änderung eines einzelnen Nukleotids, die so gewählt wird, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist zum Beispiel ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu deaktivieren. Bekannte Verfahren für das Deaktivieren von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen jene Verfahren ein, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und in EP 276,846 beschrieben werden.
In einem anderen Beispiel können Sequenzen, die Cys-Reste codieren, die für die biologische Aktivität nicht wesentlich sind, geändert werden, um zu bewirken, dass die Cys-Reste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wodurch die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei Renaturierung verhindert wird. Andere Varianten werden durch Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. EP 212,914 offenbart die Verwendung von stellenspezifischer Mutagenese, um KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen in einem Protein zu deaktivieren. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden durch Entfernen, Hinzufügen oder Ersetzen von Resten deaktiviert, um Arg-Arg, Arg-Lys und Lys-Arg-Paare zu ändern und so das Auftreten dieser benachbarten basischen Reste zu beseitigen. Lys-Lys-Paare sind weitaus weniger anfällig für KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Deaktivieren von KEX2-Stellen dar. Humanes LERK-5 enthält vier KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen bei den Aminosäuren 228–229, 229–230, 232–233 und 251–252 von SEQ ID NO:2.
Natürlich vorkommende LERK-5-Varianten werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung erfasst. Beispiele solcher Varianten sind Proteine, die aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder proteolytischem Spalten des LERK-5-Proteins resultieren, wobei die Elk-bindende oder Hek-bindende Eigenschaft beibehalten wird. Alternatives Spleißen von mRNA kann ein gestutztes, aber biologisch aktives LERK-5-Protein ergeben, wie zum Beispiel eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins. Variationen, die auf Proteolyse zurückzuführen sind, schließen zum Beispiel Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in verschiedenen Arten von Wirtszellen ein, und zwar aufgrund proteolytischen Entfernens von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren aus dem LERK-5-Protein (im Allgemeinen von 1–5 terminale Aminosäuren).
Varianten, welche die erforderliche Fähigkeit zum Binden von Elk oder Hek aufweisen, können durch einen beliebigen, geeigneten Test ermittelt werden. Die biologische Aktivität einer LERK-5-Variante kann zum Beispiel durch Analyse der Fähigkeit der Variante bestimmt werden, mit LERK-5 in Bezug auf das Binden an Elk oder Hek zu konkurrieren (d.h. in Konkurrenzbindungstests).
Konkurrenzbindungstests können unter Anwendung von standardmäßigen Techniken ausgeführt werden. Zum Beispiel kann radioaktiv markiertes LERK-5 verwendet werden, um mit einer LERK-5-Variante zu konkurrieren, um das Binden an zelloberflächengebundenem Elk oder Hek zu prüfen. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiografische Plattenbindungstests erhalten werden, oder es können Scatchard-Plots verwendet werden, um quantitative Ergebnisse zu erzielen. Anstatt intakter Zellen könnte man lösliches Elk oder Hek, das an eine feste Phase gebunden ist (z.B. ein lösliches Elk/Fc oder Hek/Fc-Fusionsprotein, das an eine feste Phase gebunden ist, die Protein A oder Protein G enthält), substituieren. Eine weitere Art von kompetitiven Bindungstests verwendet radioaktiv markiertes lösliches Elk oder Hek und intakte Zellen, die LERK-5 exprimieren.
Das LERK-5 der vorliegenden Erfindung kann auch in einem Bindungstest verwendet werden, um Zellen zu erfassen, die Elk oder Hek exprimieren. Zum Beispiel kann LERK-5 oder dessen extrazelluläre Domäne auf einen detektierbaren Anteil wie ein Radionuklid, ein Enzym, das eine colorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin, konjugiert werden. Zellen, die auf Elk- oder Hek-Expression geprüft werden sollen, werden mit dem markierten LERK-5 in Berührung gebracht. Nach der Inkubation wird ungebundenes markiertes LERK-5 von den Zellen getrennt und die Bindung unter Verwendung des detektierbaren Anteils gemessen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von LERK-5, um Elk- oder Hek-Proteine zu binden. Zum Beispiel kann LERK-5 als ein Reagens in Proteinreinigungsverfahren verwendet werden. LERK-5 oder LERK-5/Fc-Fusionsproteine werden mit Hilfe herkömmlicher Techniken an ein festes Trägermaterial geheftet und dazu verwendet, Elk oder Hek durch Affinitätschromatographie zu reinigen.
Die hierin offenbarten LERK-5-Proteine können auch verwendet werden, um die biologische Aktivität von Elk- oder Hek-Proteinen im Hinblick auf ihre Bindungsaffinität für LERK-5 zu messen. Zum Beispiel kann LERK-5 dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der Modifikation eines Elk- oder Hek-Proteins beibehalten wird (z.B. chemische Modifikation, Stutzen, Mutation usw.). Die biologische Aktivität eines Elk- oder Hek-Proteins kann somit ermittelt werden bevor dieses zum Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
LERK-5-Proteine finden als Reagens Anwendung, das von den Verantwortlichen für „Qualitätssicherungsstudien" eingesetzt werden kann, z.B. um die Haltbarkeit und Stabilität des Elk-Proteins unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zur Veranschaulichung sei angemerkt, dass LERK-5 in einer Bindungsaffinitätsstudie eingesetzt werden kann, um die biologische Aktivität eines Elk-Proteins zu messen, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder in verschiedenen Zelltypen hergestellt wurde. Die Bindungsaffinität des modifizierten Elk-Proteins für LERK-5 wird mit jener eines unmodifizierten Elk-Proteins verglichen, um etwaige negative Auswirkungen der Modifikationen auf die biologische Aktivität von Elk festzustellen. Ebenso kann die biologische Aktivität eines Hek-Proteins mit Hilfe von LERK-5 ermittelt werden.
LERK-5 Polypeptide finden auch als Träger Anwendung, um Wirkstoffe, die daran angeheftet sind, an Zellen zu liefern, die den Elk- oder Hek-Zelloberflächenrezeptor tragen. Die Expression von Hek-Antigen wurde bei bestimmten leukämischen Zelllinien beobachtet, einschließlich der humanen T-Zell-Leukämiezelllinie, die als JM bezeichnet ist, und der humanen pre-B-Zell-Leukämiezelllinie, die als LK63 bezeichnet ist (Boyd et et al., J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992, und Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1611, 1992). LERK-5 Proteine können somit verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe im Rahmen von in vitro oder in vivo Verfahren zu diesen Zellen zu liefern (oder zu anderen Zelltypen, bei denen festgestellt wurde, dass sie Hek auf der Zelloberfläche exprimieren).
Ein Beispiel einer solchen Verwendung besteht darin, eine Hek⁺ leukämische Zelllinie einem therapeutischen Wirkstoff/LERK-5-Konjugat auszusetzen, um festzustellen, ob der Wirkstoff gegenüber den Leukämiezellen Cytotoxizität aufweist. Eine Reihe von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen, die an LERK-5 angeheftet sind, können in einen Test aufgenommen werden, um den cytotoxischen Effekt der Wirkstoffe auf die Leukämiezellen zu detektieren und zu vergleichen. LERK-5/Diagnosewirkstoff-Konjugate können verwendet werden, um die Gegenwart von Hek⁺-Zellen in vitro oder in vivo zu erfassen.
Diagnostische und therapeutische Wirkstoffe, die an ein LERK-5-Polypeptid angeheftet werden können, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Medikamente, Toxine, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine colorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren, und dergleichen ein, wobei der jeweilige Wirkstoff gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt wird. Beispiele für Medikamente sind solche, die in der Behandlung von verschiedenen Krebsformen verwendet werden, z.B. Stickstoffloste wie L-Phenylalaninstickstofflost oder Cyclophosphamid, interkalierende Wirkstoffe wie cis-Diaminodichloroplatinum, Antimetabolite wie 5-Fluoruracil, Vinca-Alkaloide wie Vincristine und Antibiotika wie Bleomycin, Doxorubicin, Daunorubicin und Derivate davon. Zu den Toxinen zählen Ricin, Abrin, Diptheria-Toxin, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, ribosomale deaktivierende Proteine, Mycotoxine wie Trichothecene und Derivate und Fragmente (z.B. einzelne Ketten) davon. Zu den Radionukliden, die für eine diagnostische Verwendung geeignet sind, zählen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Radionuklide, die für eine therapeutische Verwendung geeignet sind, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶6Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu ein.
Solche Wirkstoffe können an LERK-5 mit Hilfe eines beliebigen, herkömmlichen Verfahrens angeheftet werden. Da es sich bei LERK-5 um ein Protein handelt, enthält es funktionelle Gruppen auf Aminosäure-Seitenketten, die mit funktionellen Gruppen auf einem gewünschten Wirkstoff zum Reagieren gebracht werden können, um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ dazu können das Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzuheften. Die Derivatisierung kann das Anheften von einem der bifunktionellen Kopplungsreagenzien einschließen, die für das Heften verschiedener Moleküle an die Proteine zur Verfügung stehen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Es sind eine Reihe von Techniken für die radioaktive Markierung von Proteinen bekannt. Radionuklidmetalle können zum Beispiel durch einen geeigneten bifunktionellen chelatisierenden Wirkstoff an LERK-5 geheftet werden.
Somit werden Konjugate, die LERK-5 und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff (vorzugsweise kovalent verbunden) enthalten, zubereitet. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht oder auf andere Weise verwendet, die für die jeweilige Anwendung geeignet ist.
Eine weitere Verwendung des LERK-5 der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung als ein Forschungswerkzeug für die Untersuchung der Rolle, die LERK-5 in Verbindung mit Elk oder Hek beim Wachstum oder der Differenzierung von Zellen spielen kann, welche den Elk- oder Hek-Rezeptor tragen. Die LERK-5-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch bei in vitro Tests zum Erfassen von Elk oder LERK-5 oder Interaktionen davon verwendet werden. Ebenso findet LERK-5 in Tests für Hek oder die Interaktion von LERK-5 mit Hek Anwendung.
Wie oben besprochen, wurden bei der Analyse von verschiedenen Rattengeweben in Bezug auf Elk-mRNA Transkripte nur im Gehirn und in Hoden entdeckt (Lhotak et al., supra). Es wird angenommen, dass das Binden von LERK-5 an Elk auf neuralem Gewebe eine neuroprotektive oder neurotrophe Wirkung ausübt.
LERK-5 findet Anwendung als ein Gewebekulturreagens. Ein LERK-5-Protein kann zu Neuronen hinzugefügt werden, die in vitro gezüchtet werden, um die Überlebensfähigkeit zu stärken oder die Lebensdauer der gezüchteten Neurone zu verlängern, wodurch Forschungsstudien von neuralem Gewebe erleichtert werden. Geeignete Konzentrationen von LERK-5 für die Zugabe zu einem Kulturmedium können durch routinemäßiges Testen bestimmt werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von Störungen des neuralen Gewebes, einschließlich des In-Kontakt-Bringens des neuralen Gewebes mit LERK-5. Zu solchen Erkrankungen gehören Verletzungen oder neurologische Erkrankungen, die chronischer oder akuter Natur sein können. Ein LERK-5-Protein kann einem Säuger verabreicht werden, um eine solche Verletzung oder Erkrankung zu behandeln. LERK-5 wird bei der Behandlung von neurodegenerativen Leiden eingesetzt, die zumindest teilweise durch den Mechanismus des neuralen Todes, der als Excitotoxizität bekannt ist, gekennzeichnet sind oder vermittelt werden. Außerdem kann LERK-5 einem Säuger verabreicht werden, um eine trophe Wirkung auf neurales Gewebe auszuüben. Bei einem Patienten, der aufgrund einer Verletzung oder Erkrankung unter einem Verlust oder einer Schädigung von Neuronen leidet, kann LERK-5 die Lebensfähigkeit der Neuronen, die überlebt haben, stärken.
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche eine wirksame Menge eines gereinigten LERK-5-Polypeptids und eines geeigneten Verdünnungsmittels, Arzneimittelträgers oder Trägers enthalten. Solche Träger sind für Patienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch. Normalerweise beinhaltet die Zubereitung solcher Zusammensetzungen das Kombinieren eines Säuger-LERK-5-Polypeptids oder Derivats davon mit Puffern, Antioxidationsmitteln wie Ascorbinsäure, Peptiden mit geringem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlehydraten, einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextrans, chelatisierenden Wirkstoffen wie EDTA, Glutathion oder anderen Stabilisatoren und Arzneimittelträgern. Eine neutrale, gepufferte Salzlösung ist ein geeignetes Verdünnungsmittel.
Zum Zwecke therapeutischer Anwendung werden die Zusammensetzungen in einer Weise und Dosierung verabreicht, die für die Indikation und den Patienten geeignet sind. Für Fachleute wird klar sein, dass eine therapeutisch wirksame Dosierung in Abhängigkeit von Faktoren wie Natur und Schwere des zu behandelnden Leidens und des Alters, der Größe und des Zustands des Patienten variieren kann. Die Verabreichung kann auf einem beliebigen, geeigneten Weg erfolgen, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – kontinuierlicher Infusion, Lokalinfusion während eines chirurgischen Eingriffs, intraventrikularer Infusion (welche die Verwendung eines intraventrikularen Katheters einschließen kann), nachhaltige Freigabe von Implantaten (Gels, Membrane und dergleichen) oder Injektion (z.B. Injektion an der Stelle einer Verletzung oder Injektion in das ZNS).
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein LERK-5-Protein in einer der oben beschriebenen Formen enthalten, einschließlich Varianten, Derivative und biologisch aktiver Fragmente davon. In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Zusammensetzung ein lösliches humanes LERK-5-Protein auf. Ein solches Protein kann die extrazelluläre Domäne des humanen LERK-5 enthalten, das an ein Fc-Polypeptid fusioniert wird, wie unten beschrieben.
Oligomere Formen von LERK-5
Durch die vorliegende Erfindung werden LERK-5-Polypeptide in der Form von Oligomeren, wie Dimeren oder Trimeren, erfasst. Solche Oligomere können natürlich vorkommen oder durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt werden. Oligomere können LERK-5-Polypeptide (vorzugsweise die extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon) enthalten, die durch Disulfidbindungen gekoppelt oder als ein Fusionsprotein mit oder ohne Spacer-Peptidlinker exprimiert sind. Oligomere können beispielsweise durch Disulfidverbindungen zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen LERK-5-Polypeptiden gebildet werden.
LERK-5-Oligomere können mit Hilfe von Polypeptiden hergestellt werden, die aus Immunoglobulinen gewonnen werden. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die heterologe Polypeptide enthalten, die an verschiedene Abschnitte von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, wurde zum Beispiel von Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991) und Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990) beschrieben. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein LERK-5-Dimer durch Fusionieren von LERK-5 an die Fc-Region eines Antikörpers (IgG1) erzeugt. Das Fc-Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen LERK-5 (das nur die extrazelluläre Domäne enthält) fusioniert. Eine Genfusion, welche das LERK-5/Fc-Fusionsprotein codiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Das LERK-5/Fc-Fusionsprotein wird in Wirtszellen exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert werden, und es wird ihm ermöglicht, sich ganz ähnlich wie Antikörpermoleküle anzuordnen, woraufhin sich Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen Fc-Polypeptiden bilden, was ein zweiwertiges LERK-5 ergibt. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein LERK-5-Oligomer mit bis zu vier LERK-5 extrazellulären Regionen zu bilden.
Der Begriff „Fc-Polypeptid" schließt, so wie hierin verwendet, native und muteine Formen von Polypeptiden ein, die aus der Fc-Region eines Antikörpers gewonnen wurden. Gestutzte Formen dieser Polypeptide, welche die Gelenkregion enthalten, die eine Dimerisierung fördert, sind ebenfalls enthalten. Ein geeignetes Fc-Polypeptid, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben wird, ist ein Einkettenpolypeptid, das sich von der N-terminalen Gelenkregion bis zum nativen C-Terminus erstreckt. Ein Mutein dieses Fc- Polypeptids wird in Beispiel 3 unten beschrieben. Das Mutein weist eine reduzierte Affinität für Fc-Rezeptoren auf.
Alternativ dazu kann man LERK-5-Polypeptide (vorzugsweise zwei lösliche LERK-5-Polypeptide) über einen Peptidlinker verbinden. Peptidlinker, die sich für das Verbinden von Polypeptiden eignen, sind bekannt und können durch herkömmliche Techniken verwendet werden. Fusionsproteine, welche LERK-5-Polypeptide enthalten, die durch Peptidlinker verbunden sind, können zum Beispiel durch eine rekombinante DNA-Technologie erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Oligomere von LERK-5 extrazellulären Domänen oder Fragmenten davon bereit, die durch Disulfid-Interaktionen verbunden sind oder als Fusionspolymere mit oder ohne Spacer-Aminosäurekopplungsgruppen exprimiert werden. Zum Beispiel kann ein Dimer der LERK-5 extrazellulären Domäne durch eine IgG Fc-Region-Kopplungsgruppe verbunden werden.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von LERK-5 und Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert werden, bereit. Es kann ein beliebiges geeignetes Expressionssystem verwendet werden. Die Vektoren schließen eine LERK-5-DNA-Sequenz ein, die wirkungsmäßig mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Nukleotidsequenzen, wie jene, die aus einem Säugergen, mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen gewonnen werden, verbunden ist. Beispiele für regulatorische Sequenzen schließen transkriptionale Promotoren, Operatoren oder Verstärker, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle und geeignete Sequenzen ein, welche den Start und das Ende von Transkription und Translation steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn die regulatorische Sequenz funktionell mit der LERK-5-DNA in Beziehung steht. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz mit einer LERK-5-DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der LERK-5-DNA-Sequenz steuert. Die Fähigkeit, in den gewünschten Wirtszellen zu replizieren, die für gewöhnlich durch einen Replikationsursprung und ein Auswahl-Gen, durch welches Transformanten identifiziert werden, übertragen wird, kann zusätzlich in den Expressionsvektor aufgenommen werden.
Außerdem können Sequenzen, welche geeignete Signalpeptide codieren, die zum LERK-5-Gen nicht nativ sind, in Expressionsvektoren aufgenommen werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) im Rahmen an die LERK-5-Sequenz fusioniert werden, so dass das LERK-5 anfänglich als ein Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid enthält. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktionell ist, verstärkt die extrazelluläre Ausscheidung des LERK-5-Polypeptids. Das Signalpeptid wird bei Ausscheiden von LERK-5 aus der Zelle aus dem LERK-5-Polypeptid gespalten.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von LERK-5-Polypeptiden schließen Prokaryote, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen ein. Geeignete Klon- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit zellularen bakteriellen, fungalen, Hefe- und Säugerwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um LERK-5-Polypeptide unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet werden.
Zu den Prokaryoten zählen grammnegative und grammpositive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen von Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie E. Coli kann ein LERK-5-Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann aus dem exprimierten rekombinanten LERK-5-Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen eines oder mehrere phenotypische selektierbare Markierungsgene auf. Ein phenotypisches selektierbares Markierungsgen ist zum Beispiel ein Gen, das ein Protein codiert, das antibiotische Resistenz überträgt oder das ein autotrophes Erfordernis bereitstellt. Beispiele nützlicher Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen schließen jene ein, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden gewonnen werden, wie der Klonvektor pBR322 (ATCC 37017). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit einfache Mittel für die Identifikation von transformierten Zellen bereit. Ein geeigneter Promotor und eine LERK-5-DNA-Sequenz werden in den pBR322-Vektor eingefügt. Andere im Handel erhältliche Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
Promotorensequenzen, die häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendet werden, schließen β-Lactamase (Penicillinase), Lactosepromotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978: und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982) ein. Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellenexpressionssystem verwendet einen Phagen-λP_L-Promotor und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die bei der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des λP_L-Promotors aufnehmen, schließen Plasmid pHUB2 (resident im E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (resident in E. coli RR1(ATCC 53082)) ein.
LERK-5 kann alternativ dazu in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise aus der Gattung der Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft einen Ursprung einer Replikationssequenz von einem 2 μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für eine Polyadenylisierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein selektierbares Markierungsgen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden ferner in Hitzeman, EPA-73,657 beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beer et al. (Nature, 300: 724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können konstruiert werden, indem DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann verwendet werden, um die Sekretion des LERK-5-Polypeptids auszurichten. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984; US-Patentschrift 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leadersequenzen, die zur Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann in der Nähe ihres 3'-Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies erleichtert die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen.
Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll wählt für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casamaninosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert sind, welche eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um die Expression in einem „reichen" Medium zu induzieren. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist ein Medium, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Die De-Repression des ADH2-Promotors tritt ein, wenn Glucose aus dem Medium erschöpft ist.
Es könnten auch Säuger- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme verwendet werden, um rekombinante LERK-5-Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Erzeugung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) untersucht. Etablierte Zelllinien mit Säugerursprung können auch verwendet werden. Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, 293-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinesische Hamstereierstockzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10)-Zelllinien sowie die CV-1/EBNA-1-Zelllinie ein, die aus der afrikanischen Grünaffennierenzellinie CVI (ATCC CCL 70) gewonnen wird, so wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist.
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säugerwirtszellen-Expressionsvektoren könne aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden aus dem Polyomavirus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalovirus gewonnen. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40-Viralgenom gewonnen werden, zum Beispiel der SV40-Ursprung, der frühe und späte Promotor, Verstärker, Spleiß- und Polyadenylisierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Sequenz eines strukturellen Gens in einer Säugerwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle erstreckt, die sich in der SV40 viralen Replikationsursprungsstelle befindet, ist eingeschlossen.
Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerwirtszellen können so konstruiert werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Hochexpression von Säuger-cDNAs in C127 Mäuse-Mamma-Epithelzellen kann im Wesentlichen so wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, wurde als ATCC39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugerexpressionsvektoren werden in EP-A-0367566 beschrieben. Andere geeignete Vektoren können aus Retroviren gewonnen werden.
Anstelle der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195, die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312: 768 (1984), das Interleukin-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607, und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 .
LERK-5-Protein
Die vorliegende Erfindung stellt gereinigtes LERK-5-Protein bereit, das durch rekombinante Expressionssysteme wie oben beschrieben hergestellt oder aus natürlich vorkommenden Zellen gereinigt werden kann. Vorteilhafterweise wird das LERK-5 so gereinigt, dass keine Proteinbande, die anderen Proteinen entsprechen, bei der Analyse mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) feststellbar sind. Fachleute werden schätzen, dass Mehrfachbande, die dem LERK-5-Protein entsprechen, durch SDS-PAGE visualisiert werden können, und zwar aufgrund von differentieller Glycosylierung, differentieller posttranslationaler Verarbeitung und dergleichen, wie oben besprochen. Das LERK-5-Protein gilt als gereinigt, so lange keine Bande, die anderen Proteinen (nicht LERK-5) entsprechen, visualisiert werden. Das LERK-5 wird am bevorzugtesten auf beträchtliche Homogenität gereinigt, wie durch ein Einzelproteinband bei der Analyse durch SDS-PAGE angezeigt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung des LERK-5-Proteins weist das Züchten einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz enthält, welche LERK-5 unter Bedingungen codiert, unter denen LERK-5 exprimiert wird. Das LERK-5-Protein wird dann in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten wiedergewonnen. Dem Fachmann wird klar sein, dass Verfahren zur Reinigung des rekombinanten LERK-5 in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Typ der verwendeten Wirtszellen und in Abhängigkeit davon, ob das LERK-5 in das Kulturmedium ausgeschieden wird oder nicht, variieren werden.
Wenn zum Beispiel Expressionssysteme verwendet werden, welche das rekombinante Protein ausscheiden, kann das Kulturmedium zuerst mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrierungseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrierungsmedium aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit überhängenden Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere, bei der Proteinreinigung häufig verwendete Arten sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt durchgeführt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrixen ein, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeistchromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z.B. Silicagel mit überhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um LERK-5 weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Reinigungsschritte können in unterschiedlichen Kombinationen durchgeführt werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche die ligandenbindende Domäne von Elk oder Hek enthält, um exprimierte LERK-5-Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. LERK-5-Polypeptide können aus einer Affinitätssäule in einem hohen Salz-Eluierungspuffer gewonnen und danach zur Verwendung in einen niedrigeren Salzpuffer dialysiert werden. Alternativ dazu kann eine Immunoaffinitätssäule einen Antikörper aufweisen, der LERK-5 bindet. Lösliche LERK-5/Fc-Fusionsproteine können unter Verwendung einer Chromatographiematrix gereinigt werden, an die Protein A oder Protein G geheftet ist.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird für gewöhnlich durch anfängliches Zerreißen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpellets, im Fall eines unlöslichen Polypeptids, oder aus der überstehenden Flüssigkeit, im Fall eines löslichen Polypeptids, isoliert, gefolgt von einer oder mehreren Schritten der Konzentration, des Aussalzens, Ionenaustauschs, der Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie. Schließlich kann die RP-HPLC für endgültige Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch ein beliebiges, geeignetes Verfahren zerrissen werden, einschließlich eines Frier-Tau-Zyklus, einer Beschallung, mechanischen Zerreißens oder der Verwendung von Zelllysiermitteln.
In transformierten Hefewirtszellen wird LERK-5 vorzugsweise als ein ausgeschiedenes Polypeptid exprimiert, um die Reinigung zu vereinfachen. Das ausgeschiedene rekombinante Polypeptid kann durch Verfahren gereinigt werden, die den Verfahren, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart werden, gegenüber analog sind. Urdal et al. beschreiben ein Verfahren, das zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule einschließt.
Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt ferner LERK-5-Nukleotidsequenzen bereit. Solche Nukleotidsequenzen schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – die hierin offenbarte LERK-5-DNA, sowohl in der Einzelstrang- als auch der Doppelstrangform, und das RNA-Komplement davon ein. Die LERK-5-DNA der vorliegenden Erfindung schließt zum Beispiel cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR amplifizierte DNA und Kombinationen davon ein. Die genomische DNA kann durch herkömmliche Techniken isoliert werden, indem die in Beispiel 1 isolierte cDNA, oder ein geeignetes Fragment davon, als Sonde verwendet wird.
Beispiele für LERK-5-DNAs der vorliegenden Erfindung schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – eine DNA ein, welche eine Nukleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Nukleotiden 1 bis 1002 von SEQ ID NO: 1 (welche das LERK-5 voller Länge von SEQ ID NO: 2 codieren), Nukleotide 76 bis 1002 von SEQ ID NO: 1 (welche ein reifes LERK-5 voller Länge codieren); Nukleotide 1 bis 672 von SEQ ID NO: 1 (welche das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne codieren); und Nukleotide 76 bis 672 von SEQ ID NO: 1 (welche die extrazelluläre Domäne codieren) besteht. Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure codieren. Somit kann eine DNA-Sequenz von den oben beschriebenen abweichen und dennoch ein Polypeptid codieren, das dieselbe Aminosäuresequenz aufweist. Solche abweichenden DNA-Sequenzen können aus stummen Mutationen resultieren, zu denen es z.B. während der PCR-Verstärkung kommen kann. Alternativ dazu können solche stummen Mutationen das Produkt bewusster Mutagenese einer nativen Sequenz sein. DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes zu einer LERK-5-codierenden DNA-Sequenz, die hierin offenbart ist, degeneriert sind, sind durch die vorliegende Erfindung erfasst.
Nützliche Fragmente der LERK-5-Nukleinsäuren schließen Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide ein, welche eine Einzelstrang-Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die imstande ist, an Ziel-LERK-5-mRNA (Sinn) oder LERK-5-DNA (Gegensinn)-Sequenzen zu binden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen ein Fragment der codierenden Region von LERK-5-cDNA auf. Ein solches Fragment enthält im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide, vorzugsweise von ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz zu gewinnen, welche ein bestimmtes Protein codiert, ist zum Beispiel in Stein und Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) und in van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988) beschrieben.
Das Binden von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Doppelsträngen, welche die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch eines von mehreren Mitteln blockieren, einschließlich verstärkter Degradierung der Doppelstränge, verfrühter Termination der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können daher verwendet werden, um die Expression von LERK-5-Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide auf, welche modifizierte Zuckerphosphodiester-Hauptketten (oder andere Zuckerverbindungen wie die in WO 91/06629 beschriebenen) aufweisen, und wobei die Zuckerverbindungen endogenen Nukleasen gegenüber resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d.h. imstande, enzymatischer Degradierung zu widerstehen), behalten aber die Sequenzspezifizität, um an Ziel- Nukleotidsequenzen binden zu können. Andere Beispiele von Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene Oligonukleotide ein, die kovalent mit organischen Anteilen wie jenen, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und anderen Anteilen verbunden sind, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-lysin) erhöhen. Außerdem können interkalierende Wirkstoffe wie Ellipticin und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angeheftet werden, um die Bindungsspezifizitäten des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids für die Ziel-Nukleotidsequenz zu ändern.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch ein beliebiges Gentransferverfahren eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren wie dem Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise durch Einfügen des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt, wobei danach die Zelle mit dem Retrovirusvektor, der die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht wird. Geeignete retrovirale Vektoren schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – jene ein, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, N2 (einem aus M-MuLV gewonnenem Retrovirus) oder den Doppelkopievektoren gewonnen werden, die mit DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656).
Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, auch durch Bilden eines Konjugats mit einem ligandbindenden Molekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandbindende Moleküle schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden ein, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise führt die Konjugation des ligandbindenden Moleküls zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Fähigkeit des ligandbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ dazu kann ein Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung bestimmter Ausführungsformen vorgesehen und stellen keine Einschränkung des Erfindungsumfangs dar.
BEISPIEL 1
Isolation von humaner LERK-5-cDNA
cDNA, die humanes LERK5 codiert, wurde wie folgt isoliert. Das Verfahren begann mit der Herstellung einer Sonde, die zur Identifikation von geeigneten cDNA-Bibliotheken, die im Klonversuch zum Einsatz kommen, und zum Screenen dieser Bibliotheken verwendet werden sollte.
Erststrang-cDNA wurde auf RNA, die von einer Reihe von Zelltypen isoliert wurde, synthetisiert. Danach wurden Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit Hilfe herkömmlicher Techniken durchgeführt, wobei die cDNAS als Matrizen dienten. Die 5'- und 3'-Primer, die in der PCR verwendet wurden, waren Oligonukleotide, welche die Termini eines 337 bp-DNA-Fragments definieren, das als ch13 seq tag (GenBank^® Zugriffsnummer L13819) bezeichnet ist. Dieses DNA-Fragment wurde angesichts seines Homologiegrads mit einem Abschnitt einer Elk-Liganden-DNA gewählt, wie oben detaillierter besprochen.
Eine DNA-Bande der erwarteten Größe (337 bp) wurde durch die PCR in einer Reaktion verstärkt, in der die cDNA-Matrize aus RNA gewonnen wurde, die von einer humanen T-Zell-Leukämiezelllinie isoliert wurde, die als CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1) bezeichnet ist. Dieses 337 bp Einzelstrang-DNA-Fragment wurde isoliert und mit ³²P durch Standardtechniken zur Verwendung als Sonde markiert.
Northern-Blots, die mRNA aus einer Reihe von Geweben enthielten, wurden mit dem ³²P-markieren DNA-Fragment geprüft. Hybridisierende mRNA (ungefähr 5 kb) wurde in Geweben entdeckt, welche humane(s) fötale(s) Hirn und Lunge einschlossen. Zusätzlich wurden DNA-Bande der erwarteten Größe (337 bp) erfolgreich durch die PCR verstärkt, wobei entweder humane Lungen-cDNA-Bibliotheken eines Erwachsenen oder humane Lungen-cDNA-Bibliotheken eines Fötus als Matrize verwendet wurden. Somit wurden cDNA-Bibliotheken, die aus humanem fötalem Hirn und aus humanen Lungenfibroblasten gewonnen wurden, für das Screening mit der ³²P-markierten Sonde ausgewählt, um einen Klon voller Länge zu isolieren.
Die humane cDNA-Bibliothek eines fötalen Hirns in dem Phagen-λ-Vektor λgt10 wurde bei Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, gekauft. Die cDNA wird in die EcoRI-Stelle des Vektors eingefügt. Die zweite cDNA-Bibliothek wurde aus der SV40-transformierten humanen Erwachsenen-Lungenfibroblast-Zelllinie WI-26 VA4 gewonnen. Diese Bibliothek im Phagen-λVektor λgt10 wurde so wie in Beispiel 2 der US-Patentschrift 5,264,416 beschrieben konstruiert, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Das Screening mit der 337 bp-Sonde erfolgte mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, wobei hybridisierende Klone in beiden Bibliotheken identifiziert wurden. Es wurde die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts von einem individuellen Klon, der aus der humanen Fötushirn-Bibliothek isoliert wurde und als Klon λ6 designiert ist, bestimmt. Die DNA-Sequenz der codierenden Region der Klon-λ6-cDNA und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellt. Ein Klon, der aus der WI26 VA4-Bibliothek isoliert wurde, enthielt DNA, die am 5'-Ende gestutzt war, aber nur 5 bp vor dem Startcodon der Sequenz von SEQ ID NO: 1.
Das codierte Protein, als LERK-5 bezeichnet, weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –25 bis 1 von SEQ ID NO: 2), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1 bis 199), einen Transmembranbereich (Aminosäuren 200 bis 225) und eine cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 226 bis 308) auf. LERK-5 bindet an die zwei Zelloberflächenrezeptoren, die als Elk und Hek bekannt sind, so wie in Beispiel 4 gezeigt ist. Die Nukleotide 310 bis 646 von SEQ ID NO: 1 entsprechen der oben beschriebenen 337 bp Sequenzmarkierung (GenBank^® Zugriffsnummer L13819), mit einer fehlenden Übereinstimmung. Das Nukleotid 568 der LERK-5 DNA von SEQ ID NO: 1 ist ein A, während in der Sequenzmarkierung ein G an dieser Position erscheint. Mögliche Erklärungen sind unter anderem Allelen-Variation oder Klonierungsartefakte. Wenn das A bei Position 568 von SEQ ID NO: 1 zu einem G verändert würde, dann wäre die Aminosäure bei Position 165 Asp anstatt Asn.
Ein Zelllysat, das Klon-λ6-DNA (die LERK-5-cDNA in λgt10) enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, am 16. Juni 1994 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC 75815. Die Hinterlegung erfolgte zu den Bedingungen des Budapester Vertrags.
BEISPIEL 2
Herstellung von löslichem Elk/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches Elk/Fc-Fusionsprotein codiert. Dieses Fusionsprotein wurde in dem Bindungstest von Beispiel 4 verwendet, um zu bestimmen, ob LERK-5 imstande ist, Elk zu binden.
Eine DNA und eine codierte Aminosäuresequenz für Ratten-Elk-cDNA wird in Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11, 2496, 1991) vorgestellt, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Ratten-Elk-Protein weist eine 538 Aminosäure extrazelluläre Domäne, eine 25 Aminosäure Transmembrandomäne und eine 419 Aminosäure cytoplasmatische Domäne auf.
Ein Ratten-Elk-cDNA-Fragment wurde an das 5'-Ende von cDNA fusioniert, welche den Fc-Abschnitt eines humanen IgG1-Antikörpers codiert. Die Ratten-Elk-cDNA wurde bei T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto) beschafft. Eine Asp718 Restriktions-Endonuklease-Schnittstelle wurde stromaufwärts von der Elk codierenden Region eingeführt. Ein Asp 718-BglII-Fragment von Ratten-Elk-cDNA (welche die gesamte extrazelluläre Domäne, den Transmembranbereich und einen kleinen Abschnitt der cytoplasmatischen Domäne enthielt) wurde isoliert.
DNA, welche eine Einzelpolypeptidkette codiert, welche die Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers aufweist, wurde in die SpeI-Stelle des pBLUESCRIPT SK^®-Vektors kloniert, der bei Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien, kommerziell erhältlich ist. Dieser Plasmidvektor ist in E. coli replizierbar und enthält ein Polylinker-Segment, das 21 einzigartige Restriktionsstellen einschließt. Die Nukleotidsequenz der klonierten DNA wird gemeinsam mit der Aminosäuresequenz des dadurch codierten Fc-Polypeptids in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben, die hiermit zur Bezugnahme aufgenommen wird. Eine einzigartige BglII-Stelle wurde eingeführt und umfasst die Codons für Aminosäuren drei und vier des Fc-Polypeptids. Das codierte Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Gelenksregion zum nativen C-Terminus, d.h. ist eine Antikörper-Fc-Region mit im Wesentlichen voller Länge.
Das oben beschriebene ASp718-BglII-Elk-cDNA-Fragment wurde in den pBLUESCRIPT SK^®-Vektor kloniert, der die Fc-cDNA enthielt, so dass die Elk-cDNA stromaufwärts von der Fc-cDNA positioniert ist. Einzelstrang-DNA, die aus der resultierenden Genfusion gewonnen wurde, wurde durch das in Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985) und Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987) beschriebene Verfahren mutagenisiert, um die gesamte extrazelluläre Domäne von Elk vollkommen an die Fc-Sequenz zu fusionieren. Die mutagenisierte DNA wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die richtigen Nukleotide entfernt wurden (d.h. dass der Transmembranbereich und die partielle DNA der cytoplasmatischen Domäne gelöscht wurden) und dass die Elk- und die Fc-Sequenz sich im selben Leserahmen befanden.
Das Elk/Fc-Fusionsprotein wird vorzugsweise in Säuger-Wirtszellen synthetisiert, wie CV1-EBNA oder COS-7-Zellen. Die Elk/Fc-Genfusion wurde ausgeschnitten und in einen Säuger-Expressionsvektor mit der Bezeichnung HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142: 4314, 1989) eingefügt. Säuger-Wirtszellen wurden mit dem resultierenden rekombinanten Expressionsvektor transfiziert und gezüchtet, um eine transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Elk-Signalpeptid ausgeschieden wurde. Das Elk/Fc-Fusionsprotein wurde durch Affinitätschromatographie mit Hilfe einer Protein-A-Sepharosesäule gereinigt.
BEISPIEL 3
Zubereitung von löslichem Hek/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches Hek/Fc-Fusionsprotein codiert. Dieses Fusionsprotein wurde in den Bindungstests von Beispiel 4 verwendet, um zu bestimmen, ob LERK-5 imstande ist, Hek zu binden.
Eine DNA und codierte Aminosäuresequenz für humane Hek-cDNA wird in Wicks et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1611, 1992) gezeigt, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Dieses Hek-Protein enthält (von N- bis C-Terminus) eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne.
Zwei DNA-Fragmente, von denen eines ein N-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von Hek und das andere ein C-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von Hek codiert, wurden durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) isoliert, die unter Standardbedingungen unter Verwendung von Oligonukleotidprimern basierend auf der Hek-Nukleotidsequenz durchgeführt wurden, die von Wicks et al., supra, publiziert wurde. Die Matrize für die PCR war cDNA, die aus mRNA hergestellt wurde, die aus einer humanen T-Zellleukämie-Zellinie mit der Bezeichnung CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) isoliert wurde. Die PCR-Produkte, welche das 5'-Ende der Hek-DNA enthielten, wurden mit SpeI und HindIII aufgeschlossen, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das sich von dem 5'-Ende der reifen humanen Hek-Sequenz (d.h. ohne DNA, welche die Signalsequenz codiert) zu einer HindIII- Stelle erstreckt, die im Hek-Gen zu finden ist. Die PCR-Produkte, welche das 3'-Ende der extrazellulären Domäne der Hek-DNA enthielten, wurden mit HindIII und ClaI aufgeschlossen, um ein Fragment zu isolieren, das sich von der internen HindIII-Stelle zu einer ClaI-Stelle unmittelbar stromabwärts des 3'-Endes der Sequenz erstreckte, welche die Hek extrazelluläre Domäne codierte. Die ClaI-Stelle wird unmittelbar stromabwärts von der extrazellulären Domäne in eine Mehrfach-Klonierungsstelle (mcs) eingeführt.
DNA, welche ein Mutein der Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers codiert, wurde isoliert. Diese Fc-Mutein-DNA und das dadurch codierte Polypeptid werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/097,827 und dem Titel „Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40", eingereicht am 23. Juli 1993, beschrieben, wobei diese Anmeldung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Mutein-DNA wurde aus einer nativen Fc-Polypeptid-codierenden DNA durch stellengerichtete Mutagenese gewonnen, welche im Wesentlichen so durchgeführt wurde wie von Deng und Nickoloff Anal. Biochem. 200: 81 (1992), beschrieben. Die Aminosäuresequenz des Fc-Muteinpolypeptids ist mit jener von dem nativen Fc-Polypeptid identisch, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben wird, außer, dass die Aminosäure 10 von Leu in Ala, die Aminosäure 20 von Leu in Glu und die Aminosäure 22 von Gly in Ala geändert wurde. Dieses Mutein-Fc weist reduzierte Affinität für Immunoglobulinrezeptoren auf.
Ein rekombinanter Vektor, der die Fc-Mutein-DNA enthielt, wurde mit ClaI und NotI gespalten, welche den Vektor in einer Polylinkerregion unmittelbar stromaufwärts bzw. stromabwärts von dem Fc-Mutein-DNA-Insert spalten. Das gewünschte Fc-Mutein-codierende Fragment wurde isoliert.
Das Mutein-Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Gelenksregion zum nativen C-Terminus, d, h. ist eine Antikörper-Fc-Region mit im Wesentlichen voller Länge. Fragmente von Fc-Regionen, z.B. jene, die an dem C-terminalen Ende gestutzt sind, können ebenfalls verwendet werden. Die Fragmente enthalten vorzugsweise mehrere Cysteinreste (mindestens die Cysteinreste in der Hingeregion), um die Bildung von Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Polypeptidabschnitten von zwei getrennten Hek/Fc-Fusionsproteinen zu ermöglichen, wodurch Dimere gebildet werden.
Ein Säuger-Expressionsvektor mit der Bezeichnung SMAG4 wurde mit SpeI und NotI gespalten. Der SMAG4-Vektor enthält eine Maus-Interleukin-7 signalpeptidcodierende Sequenz (beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195), die in den Säuger-Hochexpressionsvektor pDC201 (beschrieben in Sims et al., Science 241: 585, 1988 und in der PCT-Anmeldung WO 89/03884) eingefügt ist, welche auch imstande ist, in E. coli zu replizieren. SpeI spaltet den Vektor unmittelbar stromabwärts der IL-7 signalpeptidcodierenden Sequenz. NotI spaltet ungefähr 155 bp stromabwärts von der SpeI-Stelle in einer Mehrfach-Klonierungsstelle des Vektors. Das große SpeI/NotI-Fragment, das die Vektorsequenzen und die IL-7 signalpeptidcodierende DNA enthält, wurde isoliert.
Eine Vierweg-Ligation wurde durchgeführt, um die zwei Hek-codierenden DNA-Fragmente und das oben beschriebene Fc-Mutein codierende DNA-Fragment in den SpeI/NotI gespaltenen SMAG4-Expressionsvektor einzufügen. E. coli-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transfiziert, und der gewünschte rekombinante Vektor wurde daraus isoliert. Der isolierte Vektor codiert ein Fusionsprotein, das (vom N- zum C-Terminus) das Maus-IL-7 Signalpeptid, die extrazelluläre Domäne von Hek, vier Aminosäuren, die durch die eingeführte mcs codiert werden, und das Fc-Mutein enthält.
Der Expressionsvektor wurde danach mit Plasmid pSV3.NEO in CV1/EBNA-Zellen co-transfiziert. Die CV1/EBNA-Zelllinie (ATCC CRL 10478) wurde aus einer Affennieren-Zelllinie gewonnen, wie in McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben. Der Vektor pSV3.NEO exprimiert das SV40 T-Antigen, das nicht durch die Wirtszellen hergestellt wird. Der pSV3.NEO-Vektor ist ähnlich dem pSV3 (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981), aber enthält zusätzlich ein Neomycinresistenzgen. Die transformierten Zellen wurden gezüchtet, um eine transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Maus-IL-7-Signalpeptid ausgeschieden wird. Das Fusionsprotein wurde auf einer Protein-A Sepharosesäuie gereinigt, eluiert und verwendet, um Zellen auf ihre Fähigkeit, das Hek/Fc-Protein zu binden, zu prüfen, so wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.
BEISPIEL 4: Bindungsstudie
Die Fähigkeit von LERK-5, an die Rezeptoren, die als Elk und Hek bekannt sind, zu binden, wurde im Rahmen des folgenden Tests untersucht. Das Verfahren begann mit der Herstellung von Zellen, welche LERK-5 auf der Zelloberfläche exprimieren.
LERK-5-DNA wurde durch PCR verstärkt, wobei die Klon-λ6-DNA, die in Beispiel 1 beschrieben wird, als Matrize verwendet wurde. Die in der PCR verwendeten Primer definierten die Termini der codierenden Region der LERK-5-DNA und fügten auch eine XhoI Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine Not I Stelle am 3'-Ende der vergrößerten DNA hinzu. Der 5'-Primer fügte zusätzlich eine Konsens-Kozak-Sequenz stromaufwärts vom Startcodon hinzu.
Die Reaktionsprodukte wurden mit XhoI und NotI aufgeschlossen und in einen Expressionsvektor eingefügt, der mit SalI (das mit XhoI kompatibel ist) und NotI gespalten wurde. Der Expressionsvektor war pDC410, wobei es sich dabei um einen Säuger-Expressionsvektor handelt, der auch in E. coli repliziert. pDC410 ist ähnlich dem pDC406 (McMahan et al., EMBO J: 10: 2821, 1991). Die pDC410 Mehrfach-Klonierungsstelle (mcs) unterscheidet sich von jener von pDC406 insofern, als sie zusätzliche Restriktionsstellen und drei Stoppcodons (eines in jedem Leserahmen) enthält. Ein T7-Polymerasepromotor stromabwärts der mcs erleichtert das Sequenzieren von DNA, die in die mcs eingefügt ist. Außerdem ist der EBV-Replikationsursprung durch DNA ersetzt, welche das SV40 große T-Antigen (aus einem SV40-Promotor getrieben) in pDC410 codiert.
CV1-EBNA-1-Zellen in 10 cm² Schalen wurden mit dem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert, der LERK-5-DNA enthielt. Die CV-1/EBNA-1-Zelllinie (ATCC CRL 10478) exprimiert konstitutiv EBV nukleares Antigen-1, das aus dem CMV unmittelbaren-frühen Verstärker/Promotor getrieben ist. CV1-EBNA-1 wurde aus der Afrikanischen Grünaffennieren-Zelllinie CV-1 (ATCC CCL 70) gewonnen, wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist.
Die transfizierten Zellen wurden 24 Stunden lang gezüchtet und die Zellen in jeder Schale danach in eine 24-Vertiefungen-Platte aufgeteilt. Nach weiteren 48 Stunden des Züchtens wurde ein Bindungstest durch folgendes Verfahren durchgeführt. Die transfizierten Zellen (ungefähr 4 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden mit BM-NFDM gewaschen, das ein Bindungsmedium ist (RPMI 1640, das 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 enthält), zu dem 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch hinzugefügt wurde. Die Zellen wurden danach eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit verschiedenen Konzentrationen des Elk/Fc-Fusionsproteins, das in Beispiel 2 hergestellt wurde, oder dem in Beispiel 3 hergestellten Hek/Fc-Fusionsprotein inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration eines ¹²⁵I-Maus-Anti-Human-IgG in Bindemedium inkubiert, mit leichtem Rühren bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von einer Stunde. Nach extensivem Waschen wurden die Zellen über Trypsinierung freigegeben.
Das Maus-Anti-Human-IgG, das oben verwendet wurde, ist gegen die Fc-Region des humanen IgG gerichtet und wurde bei Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA beschafft. Der Antikörper wurde mit Hilfe des standardmäßigen Chloramin-T- Verfahrens radiojodiert. Der Antikörper bindet an den Fc-Abschnitt eines beliebigen Elk/Fc- oder Hek/Fc-Fusionsproteins, das an die Zellen gebunden hat. In allen Tests wurde nicht-spezifische Bindung des ¹²⁵I-Antikörpers in Abwesenheit von Elk/Fc (oder Hek/Fc) sowie in der Gegenwart von Elk/Fc (oder Hek/Fc) und eines 200-fachen molaren Überschusses nicht markierten Maus-Anti-Human-IgG-Antikörpers geprüft.
Der zellgebundene ¹²⁵I-Antikörper wurde auf einem Packard-Autogamma-Zähler quantifiziert. Die Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) wurden mit Hilfe eines Delta-Graph-Programms erzeugt.
In dem Test bezüglich des Bindens von Elk/Fc wiesen die Zellen, die rekombinantes LERK-5 exprimieren, eine einzelne Affinitätsbindungsklasse auf, mit ungefähr 103.317 Bindungsstellen pro Zelle. Die Affinitätskonstante (K_a) war 1,05 × 10⁹ M^–1. Als die Ergebnisse von vier Bindungstests gemittelt wurden, betrug die K_a von Elk/Fc-Bindung 1,2 ± 0,3 × 10⁹ M^–1.
Es wurde festgestellt, dass die Zellen, die rekombinantes LERK-5 exprimierten, auch Hek/Fc binden. Die K_a der Hek/Fc-Bindung lag bei 4,3 ± 3,3 × 10⁹ M^–1 (Mittelwert aus vier Experimenten).
BEISPIEL 5: Northern-Blot-Analysen
Um die Expression von LERK-5 in verschiedenen Geweben zu untersuchen, wurden Northern Blots, die mRNA von einer Reihe von menschlichen Geweben (sowohl von Föten als auch Erwachsenen) enthielten, mit einer LERK-5-Ribosonde untersucht. Die Ribosonde wurde wie folgt aus dem 337 bp-DNA-Fragment gewonnen, das in Beispiel 1 isoliert wurde.
Oligonukleotide, welche die Termini des 337-bp-DNA-Fragments definieren, wurden als Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Der 3'-Primer enthielt zusätzlich den T3-RNA-Polymerasepromotor. Die PCR wurde unter Anwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt, wobei die 337-bp-DNA als Matrize verwendet wurde. Die resultierende amplifizierte DNA enthielt somit den T3-RNA-Polymerasepromotor am 3'-Ende. Eine Ribosonde wurde mit Hilfe von Standardtechniken unter Verwendung der T3-RNA-Polymerase hergestellt, wobei die amplifizierte DNA als Matrize diente.
Die Blots wurden mit der Ribosonde bei 63°C hybridisiert, danach gewaschen, zuerst eine Stunde lang bei 68°C mit 1 × SSC/0,1% SDS, danach mit 0,1 × SSC/0,1%SDS 30 Minuten lang bei 68°C. Der Blot wurde 11 Tage lang zwischen zwei Verstärkungsfolien einem Röntgenfilm bei –70° ausgesetzt.
In dem Blot, der die RNA enthielt, die aus den fötalen Geweben gewonnen wurde, wurde eine Haupt-mRNA-Bande von ungefähr 5,0 kb im Herzen, Hirn, der Lunge und der Niere, nicht jedoch in der Leber, sichtbar gemacht. In Blots, welche die RNA aus den Erwachsenengeweben enthielten, wurde eine 5 kb Bande in Lunge und Niere entdeckt, obgleich die Expressionswerte niedriger erschienen als in den fötalen Geweben. In Herz, Hirn, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Colon und peripheren Blutlymphozyten von Erwachsenen war keine hybridisierende mRNA-Bande oder nur eine sehr schwache mRNA-Bande feststellbar.
BEISPIEL 6: Monoklonale Antikörper gegen LERK-5
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen LERK-5. LERK-5 wird in Säuger-Wirtszellen, wie COS-7 oder CV-1/EBNA-1-Zellen, exprimiert, und unter Verwendung von Elk/Fc-Affinitätschromatographie gereinigt. Gereinigtes LERK-5 (oder ein Fragment davon, wie z.B. die extrazelluläre Domäne) kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper gegen LERK-5 unter Verwendung herkömmlicher Techniken, zum Beispiel jener Techniken zu erzeugen, die in der US-Patentschrift 4,411,993 beschrieben werden. Kurz gesagt, Mäuse werden mit LERK-5 als Immunogen, das in vollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert ist, immunisiert und in Mengen von 10–100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem LERK-5, das in unvollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert ist, erneut geimpft. Die Mäuse werden daraufhin periodisch nach einem wöchentlichen oder zweiwöchentlichen Immunisierungsplan nachgeimpft. Serumproben werden periodisch durch retro-orbitales Bluten oder Schwanzspitzenschneiden zur Überprüfung mittels Dot-Blot-Test oder ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) auf LERK-5 Antikörper untersucht.
Nach dem Entdecken eines geeigneten Antikörper-Titers erhalten positive Tiere eine letzte intravenöse Injektion von LERK-5 in Salzlösung. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, Milzzellen geerntet, wobei die Milzzellen an eine Maus-Myeloma-Zelllinie fusioniert werden, z.B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Die Fusionen erzeugen Hybridomazellen, die in Mehrfach-Microtiterplatten in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) selektiven Medium plattiert werden, um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomahybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomazellen werden mit Hilfe von ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes LERK-5 durch Anpassungen der in Engvall et al., Immunochem. 8: 871, 1971 und in der US-Patentschrift 4,703,004 offenbarten Techniken untersucht. Eine bevorzugte Untersuchungstechnik ist die Antikörper-Fangtechnik, die in Beckmann et al., (J. Immunol. 144: 4212, 1990) beschrieben wird. Positive Hybridomazellen können intraperitoneal in gen-identische BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Asciten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen an Anti-LERK-5 monoklonalen Antikörpern enthalten. Alternativ dazu können Hybridomazellen in vitro in Glaskolben oder Rollflaschen durch verschiedene Techniken gezüchtet werden. Monoklonale Antikörper, die in Maus-Asciten produziert werden, können durch Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von einer Gel-Ausschlusschromatographie, gereinigt werden. Alternativ dazu kann auch eine Affinitätschromatographie auf der Basis des Bindens von Antikörper gegenüber Protein A oder Protein G verwendet werden, ebenso wie eine Affinitätschromatographie auf der Basis des Bindens an LERK-5.
BEISPIEL 7: Rezeptorphosphorylierung
Im folgenden Experiment zeigte Lerk-5 die Fähigkeit, Phosphorylierung von Elk zu induzieren. Ein lösliches Lerk-5/Fc-Protein wurde durch Fusionieren von DNA, die Aminosäuren –25 bis 198 des Lerk-5 von SEQ ID NO: 2 codiert, an eine DNA, welche das oben beschriebene humane IgG1-Fc-Polypeptid codiert, im Vektor pDC303 hergestellt. Der Säuger-Expressionsvektor pDC303, auch als SF CAV bekannt, wird in der PCT-Anmeldung WO 93/19777 beschrieben. Das lösliche Lerk-5/Fc-Protein wurde durch Verfahren exprimiert und gereinigt, die zu den in Fanslow et al. (J. Immunol. 149: 655, 1992) beschriebenen Verfahren analog sind.
Ratten-Elk-cDNA wurde in den Säuger-Expressionsvektor pDC303 eingefügt und in CV1/EBNA-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden von einer 10-cm-Platte auf eine Sechs-Vertiefungen-Platte aufgeteilt. Nach zwei weiteren Tagen wurden die Zellen für Methionin und Cystein ausgehungert und danach 3 Stunden lang mit einer 1:1-Mischung von [³⁵S]-Methionin und [³⁵S]Cystein (Amersham) bei einer Gesamtkonzentration von 100 μCi ml^–1 radioaktiv markiert.
Es wurden Stimulierungen ausgeführt, indem lösliches LERK-5/Fc oder lösliches Elk-L/Fc (beschrieben in WO 94/11384) bei 1 μg ml^–1 10 Minuten lang bei 37°C beigemengt wurde. Danach wurden die Zellen schnell zwei Mal mit kaltem PBS + 1 mM Orthovanadat gewaschen und im Lysispuffer lysiert (25 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Na Fluorid, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Orthovanadat, plus Protease-Inhibitoren).
Zelllysate wurden mit einem Kaninchen-Anti-Elk-Antikörper unter Verwendung von Protein-G-Sepharose immunogefällt. Der Anti-Elk-Antikörper wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem humanen Elk-Fc-Fusionsprotein erzeugt. Nach dreimaligem Waschen mit RIPA-Puffer (50 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40 und 0,1% SDS) und 1 × PBS wurden Proben in den reduzierenden Puffer gegeben und durch SDS-PAGE analysiert. Danach wurden die Proteine zu Nitrozellulose transferiert und [³⁵S]-markierte Proteine auf einem PhophorImager (Molecular Dynamics) entdeckt. Die Membran wurde dann immunogeblottet mit Anti-Phosphotyrosin 4G10 (Upstate Biotech Inc., Lake Placid, NY) gefolgt von Biotin-Ziegen-Antimaus (Kirkegaard und Perry Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), Strapavidinperoxidase (Kirkegaard und Perry) und dann unter Verwendung von ECL-Entwicklungsreagenzien (Amersham) entwickelt. Die Western-Analyse von Elk-Immunopräzipitaten mit dem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper zeigte, dass LERK-5/Fc Elk-Phosphorylierung stimulierte, so wie dies Elk-L/Fc tat. Liganden-abhängige phosphorylierte Proteine wurden nicht in CV1/EBNA-Zellen entdeckt, die mit Medien alleine behandelt oder mit einem Kontrollplasmid transfiziert wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die ein LERK-5 Polypeptid codiert, das imstande ist, elk oder hek zu binden, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens zu 90% mit der Sequenz der Reste 1 bis 308 von SEQ ID NO: 2 identisch ist.
DNA nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine extrazelluläre Domäne, einen Transmembranbereich und eine cytoplasmatische Domäne aufweist, wobei die extrazelluläre Domäne die Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 enthält, wobei der Transmembranbereich die Aminosäuren 200 bis 225 von SEQ ID NO: 2 und die cytoplasmatische Domäne die Aminosäuren 226 bis 308 von SEQ ID NO: 2 enthält.
DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA eine Aminosäuresequenz codiert, welche aus den Aminosäuren –25 bis 308 oder 1 bis 308 von SEQ ID NO: 2 ausgewählt ist.
Isolierte DNA, welche ein lösliches LERK-5 Polypeptid codiert, das imstande ist, elk oder hek zu binden, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 enthält.
DNA nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid die extrazelluläre Domäne des LERK-5 Polypeptids von SEQ ID NO: 2, welches die Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 enthält, oder ein Fragment dieser extrazellulären Domäne aufweist, wobei das Fragment imstande ist, elk oder hek zu binden.
DNA nach Anspruch 4, wobei die DNA eine Aminosäuresequenz codiert, die aus den Aminosäuren –25 bis 199 oder 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 ausgewählt ist.
Expressionsvektor, der eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines LERK-5 Polypeptids, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen, welche die Expression von LERK-5 fördern, und die Gewinnung des LERK-5 Polypeptids aufweist.
Gereinigtes LERK-5 Polypeptid, das imstande ist, elk oder hek zu binden, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens zu 90% mit der Sequenz der Reste 1 bis 308 von SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine extrazelluläre Domäne, einen Transmembranbereich und eine cytoplasmatische Domäne enthält, wobei die extrazelluläre Domäne die Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 enthält, wobei der Transmembranbereich die Aminosäuren 200 bis 225 von SEQ ID NO: 2 und die cytoplasmatische Domäne die Aminosäuren 226 bis 308 von SEQ ID NO: 2 enthält.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 308 von SEQ ID NO: 2 enthält.
Gereinigtes, lösliches LERK-5 Polypeptid, das imstande ist, elk oder hek zu binden, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 90% mit der Sequenz der Reste 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid die extrazelluläre Domäne des LERK-5 Polypeptids von SEQ ID NO: 2 enthält, welches die Aminosäuren 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 oder ein Fragment der extrazellulären Domäne enthält, wobei das Fragment imstande ist, elk oder hek zu binden.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 199 von SEQ ID NO: 2 aufweist.
Rekombinantes LERK-5 Polypeptid, das durch die LERK-5 cDNA im rekombinanten Vektor des als ATCC 75815 hinterlegten Stammes codiert ist.
Antikörper, der für ein LERK-5 Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 16 spezifisch ist.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Oligomer, das zwei bis vier LERK-5 Polypeptide nach einem der Ansprüche 10 bis 16 enthält.
Oligomer nach Anspruch 19, wobei die LERK-5 Polypeptide lösliche LERK-5 Polypeptide sind.
Fusionsprotein, das ein lösliches LERK-5 Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und ein von einem Immunoglobulin abgeleitetes Polypeptid enthält.
Fusionsprotein nach Anspruch 21, wobei das von einem Immunoglobulin abgeleitete Polypeptid ein Fc-Polypeptid ist.
Dimer, das zwei Fusionsproteine nach Anspruch 22 enthält, wobei die Fusionsproteine durch Disulfidbindungen verbunden sind.
Zusammensetzung, die ein LERK-5 Polypeptid oder Oligomer nach einem der Ansprüche 10 bis 16, 19, 20 oder 23 und ein geeignetes pharmazeutisches Verdünnungsmittel, einen geeigneten pharmazeutischen Excipient oder einen Träger enthält.
Zusammensetzung, welche ein LERK-5 Polypeptid oder Oligomer nach einem der Ansprüche 10 bis 16, 19, 20 oder 23 und ein Verdünnungsmittel, einen Excipient oder einen Träger enthält.
LERK-5 Polypeptid, Oligomer oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, 19, 20, 23, 24 oder 25 zur Verwendung in der Humanmedizin.
Verwendung eines LERK-5 Polypeptids, Oligomers oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, 19, 20, 23, 24 oder 25 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neuralgewebeleidens.
LERK-5 Polypeptid oder Oligomer nach einem der Ansprüche 10 bis 16, 19, 20 oder 23 zur Verwendung beim Auffinden oder Binden eines Rezeptors, der LERK-5 bindet.