DE69528893T2

DE69528893T2 - Tapetumspezifitätverleihende regulationisches element

Info

Publication number: DE69528893T2
Application number: DE69528893T
Authority: DE
Inventors: Gary A Huffman
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2015-04-21
Also published as: ATE228167T1; NZ284885A; CA2188280A1; MX9604989A; AU694922B2; CA2188280C; EP0757721B1; AU2355995A; ES2188658T3; PT757721E; BR9507398A; EP0757721A1; US5470359A; DE69528893D1; ZA953197B; WO1995029247A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue regulatorische Elemente, die der Genexpression Tapetum-Spezifität verleihen. Insbesondere ist die Erfindung auf ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element des Mais-SGB6-Gens gerichtet und auf die Verwendung eines solchen regulatorischen Elementes zur Herstellung transgener, männlich-steriler Pflanzen. Darüber hinaus ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in der Nachkommenschaft von männlich-sterilen Pflanzen gerichtet.

2. Hintergrund

Die Kontrolle der Pollenfertilität ist wesentlich bei der Herstellung von hybridem Getreide. Bei hybrider Maisherstellung wird die Kontrolle der Pollenfertilität typischerweise durch physikalisches Entfernen der männlichen Infloreszenz oder des männlichen Blütenstandes vor der Pollenfreisetzung (pollen shed) erreicht. Manuelles Entfernen des männlichen Blütenstandes (detasseling) ist sehr arbeitsintensiv. Wenngleich mechanisches Entfernen des männlichen Blütenstandes weniger arbeitsintensiv ist als manuelles Entfernen des männlichen Blütenstandes, ist mechanisches Entfernen des männlichen Blütenstandes weniger zuverlässig und erfordert nachfolgende Untersuchungen des Getreides und möglicherweise Abhilfe schaffendes manuelles Entfernen des männlichen Blütenstandes. Beide Verfahren zur Entfernen des männlichen Blütenstandes verursachen eine Ertragseinbuße.
Die Pollenfertilität kann ferner mittels Auftragen einer chemischen Zusammensetzung auf die Pflanze oder Erde zur Verhinderung der Pollenherstellung in weiblichen Pflanzen kontrolliert werden. Siehe zum Beispiel Ackmann et al., U.S. Patent Nr. 4,801,326. Gemäß diesem Verfahren werden hybride Samen durch Fremdbefruchtung der behandelten weiblichen Pflanzen mit Pollen von nicht- behandelten Pflanzen hergestellt. Allerdings ist der chemische Ansatz arbeitsintensiv und bietet potenzielle Probleme mit der Toxizität der in die Umwelt eingebrachten Chemikalien.
Ein weiterer Ansatz zur Kontrolle der Fertilität basiert auf der Verwendung eines/mehrerer zytoplasmatischen/r Gene(s) für männliche Sterilität. Siehe zum Beispiel Patterson, U.S. Patent Nr. 3,861,079. Das Problem mit diesem Ansatz ist allerdings, dass die Expression gewisser zytoplasmatischer männlicher Sterilitätsgene von erhöhter Anfälligkeit gegenüber fungösen Pathogenen begleitet ist. Zum Beispiel führte der extensive Einsatz von einem Zytotyp, cmsT, zu einem epiphytischen Ausbruch von Südlicher-Mais-Blattbraunfäule (Southern Corn Leaf Blight) in den frühen 1970ern. Wenngleich zusätzliche cms-Zytotypen erhältlich wurden, ist ihr Einsatz aufgrund von Bedenken wegen Anfälligkeit gegenüber Südlicher-Mais-Blattbraunfäule-Pathogen oder anderen bisher unbekannten Pathogenen nicht weit verbreitet worden.
Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur Kontrolle der Pollenherstellung, ohne Vertrauen auf natürlich vorkommende männliche Sterilitätsgene oder auf traditionelle manuelle, mechanische und chemische Verfahren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung männlich-steriler Maispflanzen bereitzustellen, bei dem ein Expressionsvektor, der die Funktion von Antheren-Tapetumzellen stört, eingesetzt wird.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein DNA-regulatorisches Element bereitzustellen, das Tapetum-spezifische Genexpression verleiht.
Diese und andere Aufgaben werden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Bereitstellen eines isolierten DNA-Moleküls gelöst, wobei das DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) SEQ ID NR.: 1; (b) einer Nukleotidsequenz, die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NR: 1 hat; und (c) Fragmenten von (a) oder (b), wobei das DNA-Molekül ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Expressionsvektor umfassend ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element bereitgestellt. Ein solcher Expressionsvektor kann einen Promotor enthalten, der unter der Kontrolle des Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes steht. Ein Beispiel eines Promotortyps ist ein DNA-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) SEQ ID NR.: 2; (b) einer Nukleotidsequenz, die wesentliche Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NR.: 2 hat; und (c) Fragmenten von (a) oder (b), wobei das DNA-Molekül ein Promotor eines Antheren-spezifischen Gens ist, welches während der meiotischen bis Tetradenstadien der Entwicklung exprimiert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Expressionsvektor bereitgestellt, der ein fremdes Gen umfasst, wobei die Expression des fremden Gens unter der Kontrolle eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elements steht und wobei das Produkt des fremden Gens die Funktion der Tapetumzellen stört.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine Verwendung eines solchen Expressionsvektors zur Herstellung einer männlichensterilen Pflanze bereitgestellt, umfassend den Schritt des Einführens eines Expressionsvektors in embryogene Pflanzenzellen, wobei das fremde Gen des Expressionsvektors ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Strukturgen, einem Antisense-Gen, einem Ribozym-Gen und einem externen Leitsequenzgen (external guide sequence gene).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine Verwendung eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes zur Herstellung einer männlich-fertilen Hybridpflanzen bereitgestellt, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer ersten männlich-sterilen Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element, einen Promotor und ein erstes fremdes Gen umfasst, wobei das Tapetum-spezifische regulatorische Element in Verbindung mit dem Promotor die Expression des ersten fremden Gens kontrolliert und wobei das Produkt des ersten fremden Gens die Funktion der Tapetumzellen stört;
(b) Herstellen einer zweiten Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der das Tapetum-spezifische regulatorische Element, einen Promotor und ein zweites fremdes Gen umfasst, wobei das Tapetum- spezifische regulatorische Element in Verbindung mit dem Promotor die Expression des zweiten fremden Gens kontrolliert; und
(c) Fremdbefruchten der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Herstellung einer Hybridpflanze,
wobei die Tapetumzellen der Hybridpflanze das zweite fremde Gen exprimieren und wobei das Produkt des zweiten fremden Gens die Störung der Tapetumfunktion durch das Produkt des ersten fremden Gens verhindert, um dadurch eine männlich-fertile Hybridpflanze herzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt Strategien, die zur Subklonierung und Sequenzierung der Stromaufwärtsregion (upstream region) des SGB6-Mais-Antheren-Tapetum-Klons eingesetzt wurden. SGB6-DNA-Fragmente wurden entweder in pBluescript® KS+ oder pBluescript® SK+ (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA) subkloniert.
Fig. 2 zeigt Studien zur Induktion von transienter Luziferaseaktivität in Antherengewebe mittels einer SGB6-5'-Deletionsserien.
Fig. 3 zeigt Studien zur Induktion von transienter Luziferaseaktivität in Antherengewebe mittels einer SGB6-5'-Deletionsserien.
Fig. 4 zeigt Studien zur Induktion von transienter Luziferaseaktivität in Antherengewebe mittels einer SGB6-3'-Deletionsserie, wobei die stromaufwärts SGB6- Fragmente mit dem SGB6-Kernpromotor fusioniert wurden.
Fig. 5 zeigt Studien zur Induktion von transienter Luziferaseaktivität in Antherengewebe mittels stromaufwärts SGB6-DNA-Fragmenten, die interne Deletionen enthalten.
Fig. 6 zeigt Studien zur Induktion von Luziferase(LU)-Aktivität eines Kontrollplasmids oder eines Testplasmids enthaltend 94-Basenpaar-Tapetum-spezifisches regulatorisches Element ("SGB6-Antherenspezifitätsbox" (SGB6 anther specificity box)) oder Teile davon. Das Kontrollplasmid enthält einen CaMV-35S- Promotor, eine Tabakmosaikvirus (TMV) nicht translatierte Leaderregion Ω', das erste Intron des Mais-Alkohol-Dehydrogenase-1-(ADH1)-Gens und das Luziferasegen. Alle Plasmide enthielten eine 3'-Transkript-Prozessierungsregion (transcript processing region) aus dem Kartoffelproteinaseinhibitor-II-(PinII)-Gen, das stromabwärts von dem Luziferasegen fusioniert war.
Fig. 7 zeigt Studien zur Induktion von Luziferaseaktivität in Antheren, Keimblattscheiden, Wurzeln und einer Mais-embryonischen-Suspension (maize embryonic suspension) mittels eines Kontrollplasmide oder mittels Testplasmiden.
Fig. 8 zeigt Studien zur Induktion von Luziferaseaktivität in Antheren mittels des 94-Basenpaar-Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes (SGB6- Antherenspezifitätsbox), durch einen Promotor eines Antheren-spezifischen Gens, welches während der meiotischen bis Tetradenstadien der Entwicklung exprimiert wird (G9-Promotor), oder durch eine Kombination von SGB6- Antherenspezifitätsbox und G9-Promotor.
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz des 289-Basenpaar-G9-Promotors [SEQ ID NR.: 2].

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

1. Definitionen

In der folgenden Beschreibung werden eine Anzahl von Begriffen vielfach verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Ein Strukturen ist eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wird, die daraufhin in eine für ein spezifisches Polypeptid charakteristische Aminosäuresequenz translatiert wird.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens regelt. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Gens lokalisiert, proximal der Transkriptionsstartstelle eines Strukturgens. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann steigt die Transkriptionsrate als Antwort auf ein Induzierungsmittel. Im Gegensatz dazu ist die Transkriptionsrate nicht durch ein Induzierungsmittel reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Ein Kernpromotor enthält essenzielle Nukleotidsequenzen für die Promotorfunktion, einschließlich der TATA-Box und Transkriptionsstart. Nach dieser Definition kann ein Kernpromotor eine detektierbare Aktivität in Abwesenheit von spezifischen Sequenzen, die die Aktivität verstärken können oder die gewebsspezifische Aktivität ermitteln, haben oder nicht haben. Zum Beispiel besteht der SGB6-Kernpromotor aus ungefähr 37 Nukleotiden 5'-wärts von der Transkriptionsstartstelle des SGB6-Gens, während der Blumenkohlmosaikvirus-(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)-35S-Kernpromotor aus ungefähr 33 Nukleotiden 5'-wärts von der Transkriptionsstartstelle des 35S-Genoms besteht.
Ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element ist eine DNA-Sequenz, die in Antherentapetumgewebe zu einem höheren Spiegel der Transkription eines assoziierten Gens führt als in einigen oder allen anderen Gewebe einer Pflanze. Zum Beispiel wird das hier beschriebene SGB6-Gen in Tapetumzellen exprimiert. Das Tapetum-spezifische regulatorische Element des SGB6-Gens kann die Expression eines fremden Gens in Antherengewebe, aber nicht in Wurzelgewebe oder Keimblattschalengewebe, steuern, Daher wird das 94-Basenpaar-Tapetum- spezifische regulatorische Element des SGB6-Gens als "SGB6- Antherenspezifitätsbox" bezeichnet
Ein Operator ist ein DNA-Molekül, das 5'-wärts von dem Strukturgen lokalisiert ist und das eine Nukleotidsequenz enthält, die von einem Repressorprotein erkannt und gebunden wird. Die Bindung eines Repressorproteins an seinen verwandten Operator führt zur Inhibition der Transkription des Strukturgens. Zum Beispiel kodiert das LexA-Gen ein Repressorprotein, das den LexA-Operator bindet.
Ein isoliertes DNA-Molekül ist ein DNA-Fragment, das nicht in das Genom eines Organismus integriert ist. Zum Beispiel ist das Tapetum-spezifische regulatorische Element ein DNA-Fragment, das aus der genomischen DNA einer Inzucht- Maispflanze abgetrennt wurde. Ein weiteres Beispiel eines isolierten DNA- Moleküls ist ein chemisch synthetisiertes DNA-Molekül, das nicht in die DNA eines Organismus integriert wurde.
Ein Enhancer ist ein DNA-regulatorisches Element, das die Effizienz der Transkription erhöhen kann, unabhängig von Abstand oder Orientierung des Enhancers relativ zur der Transkriptionsstartstelle.
Komplementäre DNA (cDNA) ist ein Einzelstrang-DNA-Molekül, das aus einer mRNA-Matrize mittels des Enzyms Reverse-Transkriptase gebildet wird. Typischerweise wird ein zu Teilen der mRNA komplementärer Primer eingesetzt, um die reverse Transkription einzuleiten. Der Fachmann verwendet den Begriff "cDNA" überdies, um sich auf doppelsträngige DNA-Moleküle zu beziehen, die aus einem solchen Einzelstrang-DNA-Molekül und seinem komplementären DNA-Strang bestehen.
Der Begriff Expression bezieht sich auf die Biosynthese eines Genproduktes. Beispielsweise umfasst Expression im Falle eines Strukturgens die Transkription des Strukturgens in mRNA und die Translation von mRNA in ein oder mehrere Polypeptid(e).
Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Cosmid, oder ein Bakteriophage, das/der die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle hat. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise sowohl eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an denen fremde DNA-Sequenzen in bestimmbarer Weise eingefügt werden können, ohne Verlust einer essenziellen biologischen Funktion des Vektors, als auch ein Markergen, das geeignet ist für den Einsatz zur Identifikation und Selektion von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen. Markergene schließen typischerweise Gene ein, die Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz verschaffen.
Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, welches in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise wird die Genexpression unter die Kontrolle von bestimmten regulatorischen Elementen gestellt, einschließlich konstitutiver oder induzierbarer Promotoren, gewebsspezifischer regulatorischer Elemente und Enhancer. Ein solches Gen wird als mit den regulatorischen Elementen "funktionsfähig verknüpft" bezeichnet.
Ein fremdes Gen bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung auf eine DNA- Sequenz, die mit mindestens einem heterologen regulatorischen Element funktionsfähig verknüpft ist. Zum Beispiel ist mit einem fremden Gen jedes andere als das SGB6-Strukturgen gemeint, sofern die Expression jenes Gens durch ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element des SGB6-Gens kontrolliert wird.
Ein rekombinanter Wirt kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor enthält. Der Begriff schließt solche prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ein, die genetisch verändert wurden, damit das klonierte Gen/die klonierten Gene in dem Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten ist/sind.
Eine transgene Pflanze ist ein Pflanze, die eine oder mehrere Pflanzenzellen hat, die einen Expressionsvektor enthalten.
In Eukaryoten katalysiert RNA-Polymerase II die Transkription eines Strukturgens damit mRNA hergestellt wird. Ein DNA-Molekül kann so entworfen werden, dass es eine RNA-Polymerase-II-Matrize enthält, in der das RNA-Transkript eine zu der spezifischen mRNA komplementäre Sequenz aufweist. Das RNA- Transkript wird eine Antisense-RNA genannt und eine DNA-Sequenz, die die Antisense-RNA kodiert, wird ein Antisense-Gen genannt. Antisense-RNA- Moleküle sind in der Lage, mRNA-Moleküle zu binden, was zu einer Hemmung der mRNA-Translation führt.
Ein Ribozym ist ein RNA-Molekül, das ein katalytisches Zentrum enthält. Der Begriff schließt RNA-Enzyme, selbstspleißende RNAs und selbstspaltende RNAs ein. Eine DNA-Sequenz, die ein Ribozym kodiert, wird Ribozymgen genannt.
Eine externe Leitseguenz ist ein RNA-Molekül, dass das endogene Ribozym, RNAse P, zu einer bestimmten Spezies einer intrazellulären RNA leitet, was zur Spaltung der mRNA durch RNAse P führt. Eine DNA-Sequenz, die eine externe Leitsequenz kodiert, wird als externes Leitseauenzgen bezeichnet.
Zwei Nukleinsäuremoleküle werden erachtet eine wesentliche Sequenzähnlichkeit zu haben, wenn ihre Nukleotidsequenzen eine Ähnlichkeit von mindestens 50 % aufweisen. Sequenzähnlichkeitsbestimmungen können zum Beispiel durch Einsatz des FASTA-Programms (Genetics Computer Group; Madison, WI) durchgeführt werden. Alternativ können Sequenzähnlichkeitsbestimmungen unter Verwendung von BLASTP (Basic Local Alignment Search Tool) des Experimental GEINFO(R) BLAST Network Service durchgeführt werden. Siehe Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Siehe auch Pasternak et al., "Sequence Similarity Searches, Multiple Sequence Alignments and Molecular Tree Building," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (Hrsgb.), Seiten 251-267 (CRC Press, 1993).

2. Isolation eines regulatorischen Elementes aus einem Tapetum- spezifischen Gen

Der Einsatz von Gentechnik, um eine Veränderung in der phänotypischen Expression einer Pflanze in einer gewebsspezifischen Weise zu bewirken, ist in der Technik bekannt. Ein Ansatz zur Kontrolle der Pollenherstellung besteht darin, die Genexpression in dem Tapetum zu manipulieren. Das Tapetum ist eine Zellschicht, die mikrosporogene Zellen in der Anthere umgibt und Nährstoffe, wie reduzierende Zucker, Aminosäuren und Lipide für die Entwicklung der Mikrosporen bereitstellt. Reznickova, C. R. Acad. Bulg. Sci. 31: 1067 (1978); Nave et al., J. Plant Physiol. 125: 451 (1986); Sawhney et al. J. Plant Physiol. 125: 467 (1986). Tapetumzellen produzieren ferner β(1,3)-Glucanase ("Callase"), das die Mikrosporenfreisetzung fördert. Mepham et al., Protoplasma 70: 1 (1970). Es gibt daher eine empfindliche Beziehung zwischen dem Tapetum und den mikrosporogenen Zellen, und jede Störung der Tapetumfunktion führt wahrscheinlich zu fehlfunktionierenden Pollenkörnern. Tatsächlich sind Läsionen der Tapetum- Biogenese dafür bekannt, dass sie zu männlichen Sterilitätsmutanten führen. Kaul, "Male Sterility in Higher Plants," in MONOGRAPHS ON THERORETICAL AND APPLIED GENETICS, Bd. 10, Frankel et al. (Hrsgb.), Seiten 15-95 (Springer Verlag, 1988). Ein Defekt der Mikrosporen, sich zu reifen Pollenkörner zu entwickeln, kann daher durch Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls induziert werden, das ein zur Störung der Tapetumfunktion fähiges Gen enthält, das unter der Kontrolle von Tapetum-spezifischen regulatorischen Sequenzen steht.
Antheren-spezifische Promotoren und Gene sind in der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel McCormick et al., "Anther-Specific Gens: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants," in PLANT REPRODUCTION: FROM FLORAL INDUCTION TO POLLINATION, Lord et al., (Hrsgb.), Seiten 128-135 (1989); Scott et al., International Application Publication No. WO 92/11379 (1992); von der Meer et al., The Plant Cell 4: 253 (1992). Allerdings gibt es keine allgemein akzeptierten Prinzipien oder strukturelle Kriterien zur Erkennung von DNA-Sequenzen, die der Genexpression in Mais Antheren- Spezifität, insbesondere Tapetum-Spezifität verleihen. Es ist folglich nicht möglich, ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element direkt aus einer genomischen Mais-Bibliothek mittels Screenen nach einer Consensus-Sequenz, die Tapetum-spezifische Genexpression verleiht, zu isolieren.
Das neue Tapetum-spezifische regulatorische Element der vorliegenden Erfindung wurde stromaufwärts von DNA-Sequenzen entdeckt, die das wie weiter unten beschriebene Mais-SGB6-Gen kodieren. Das regulatorische Element wurde erhalten mittels Isolieren von cDNA-Molekülen, die Tapetum-spezifische Gene kodieren, danach gefolgt vom Einsetzen der cDNA als Sonden zum Identifizieren entsprechender Gene in einer geeigneten genomischen Bibliothek.

A. Isolation von cDNA-Molekülen kodierend für Tapetum-spezifische Gene

Der erste Schritt bei der Konstruktion einer cDNA-Bibliothek enthaltend Tapetum-spezifische Gene ist es, Gesamt-RNA von Antherengewebe zu isolieren. Vorzugsweise sind die Quelle des Antherengewebes zwei bis sechs Zoll lange männliche Blütenstände, die Tapetumgewebe in verschiedenen Stadien der Entwicklung enthalten, einschließlich Stadien, in denen das Tapetum eine entscheidende Rolle bei der Mikrosporenfreisetzung spielt. Am meisten bevorzugt als Quelle von Antherengewebe sind zwei bis sechs Zoll lange männliche Blütenstände von der Mais-Inzucht-B73-Linie.
Gesamt-RNA kann aus den männlichen Blütenständen gemäß dem Fachmann allgemein bekannten Techniken aufbereitet werden. Im Allgemeinen müssen RNA-Isolierungstechniken ein Verfahren bereitstellen zum Aufbrechen von Pflanzenzellen, ein Mittel zur Inhibition von RNAse-gesteuertem Abbau von RNA und ein Verfahren zur Abtrennung der RNA von DNA-, Protein- und Polysaccharid-Kontaminanten. Zum Beispiel kann Gesamt-RNA aus männlichen Blütenständen mittels Einfrieren von Pflanzengewebe in flüssigem Stickstoff, Zermahlen des gefrorenen Gewebes mit einem Mörser und Stößel zum Lysieren der Zellen, Extrahieren des gemahlenen Gewebes mit einer Lösung von Phenol/Chloroform zum Entfernen von Proteinen und Abtrennen der RNA von den bleibenden Verunreinigungen mittels selektiver Präzipitation mit Lithiumchlorid, isoliert werden. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (Hrgsb.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 4.3.1-4.3.4 (1990). Siehe weiterhin Sharrock et al., Gens and Development 3: 1745 (1989).
Alternativ kann die Gesamt-RNA aus männlichen Blütenständen mittels Extraktion gemahlenen Gewebes mit Guanidiniumisothiocyanat, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und Abtrennen der RNA von den Kontaminanten unter Einsatz differenzieller Zentrifugation, isoliert werden. Siehe zum Beispiel Strommer et al., "Isolation and characterization of Plant mRNA," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (Hrsgb.) Seiten 49-65 (CRC Press, 1993).
Poly(A) + RNA muss von einer Gesamt-RNA-Präparation isoliert werden, um eine cDNA-Bibliothek zu erstellen. Poly(A) + RNA kann aus Gesamt-RNA durch Einsatz der Oligo(dT)-Zellulosechromatographie-Standardtechnik isoliert werden. Siehe zum Beispiel Strommer et al, supra.
Doppelsträngige cDNA-Moleküle werden mittels dem Fachmann allgemein bekannter Techniken aus Poly(A) + RNA hergestellt. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, auf Seiten 5.5.2-5.6.8. Darüber hinaus können kommerziell erhältliche Kits zur Synthese doppelsträngiger cDNA-Moleküle eingesetzt werden. Solche Kits sind zum Beispiel erhältlich von GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) und Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA).
Viele Klonierungsvektoren sind für die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus männlichen Blütenständen geeignet. Zum Beispiel kann eine cDNA-Bibliothek in einem einer Bakteriophage entstammenden Vektor hergestellt werden, wie zum Beispiel einem λgt10-Vektor. Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11," in DNA Cloning: A Practical Apporach, Bd. I, Glover (Hrsgb.), Seiten 49-78 (IRL Press, 1985).
Alternativ können doppelsträngige cDNA-Moleküle in einen Plasmidvektor, wie einem pBLUESCRIPT®-Vektor (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA) oder anderen kommerziell erhältlichen Vektoren, inseriert werden. Geeignete Klonierungsvektoren können ferner aus der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten werden.
Um die klonierten cDNA-Moleküle zu amplifizieren, wird die cDNA-Bibliothek in einen prokaryotischen Wirt unter Einsatz von Standardtechniken inseriert. Zum Beispiel kann die cDNA-Bibliothek aus männlichen Blütenständen in kompetente E. coli-DH5-Zellen eingeführt werden, die von GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) erhalten werden können.
Differenzial-Screenen kann zum Isolieren von cDNA-Klonen eingesetzt werden, die Antheren-spezifische Gene aus der cDNA-Bibliothek kodieren. Zum Beispiel können einzelsträngige cDNA-Sonden in Gegenwart von radioaktiven Nukleotiden unter Verwendung von Poly(A) + RNA, die entweder aus männlichen Blütenständen oder aus Keimlingen isoliert wurde, synthetisiert werden. cDNA-Klone, die mit einer cDNA-Sonde, aber nicht mit der Keimling-cDNA-Sonde hybridisieren, werden zur weiteren Analyse isoliert. Die Technik des Differenzial-Screenens ist dem Fachmann allgemein bekannt. Siehe zum Beispiel Sargent, "Isolation of Differentially Expressed Gens," in GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Berger et al. (Hrsgb.), Seiten 423-432 (Academic Press, 1987); Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 208 (1988).
Der Grundansatz, um Tapetum-spezifische cDNA-Klone zu erhalten, kann durch Konstruieren einer subtrahierten cDNA-Bibliothek, die angereichert ist mit Antheren-spezifischen cDNA-Klonen, konstruiert werden. Hedrick et al., Nature 308: 149 (1984). Zum Beispiel kann doppelsträngige cDNA mit EcoRI-Enden aus RNA von männlichen Blütenständen zubereitet werden und mit einem 50-fachen Überschuss von kleinen, stumpfendigen cDNA-Fragmenten, präpariert aus Keimling-RNA, gemischt werden. Das Gemisch der cDNAs wird zum Schmelzen der doppelsträngigen cDNA erhitzt, einzelsträngige eDNAs lässt man hybridisieren und doppelsträngige cDNA-Moleküle werden in die EcoRI-Schnittstelle eines Klonierungsvektors inseriert. Unter diesen Bedingungen sind doppelsträngige Fragmente mit einer EcoRI-Schnittstelle an jedem der Enden jener cDNAs regenerierende cDNA Fragmente wahrscheinlich nur solche männliche Blütenstand- cDNA-Moleküle, denen komplementäre Fragmente in der Keimlings-cDNA fehlen. Ausubel et al., supra, auf Seiten 5.8.9.-5.8.15.
cDNA-Klone können unter Einsatz einer Vielzahl von Techniken analysiert werden, wie Restriktionsanalyse, Northern-Analyse und In-situ-Hybridisierung.

B. Isolation von Tapetum-spezifischen Genen aus einer genomischen Bibliothek

Die oben beschriebene Methodik kann zur Isolation von cDNA-Klonen kodierend für Proteine, die in Antherengewebe aber nicht in Keimlingsgewebe exprimiert werden, verwendet werden. Die cDNA-Klone werden als Sonden zur Isolierung der entsprechenden Gene aus der genomischen Bibliothek verwendet.
Eine pflanzengenomische DNA-Bibliothek kann mittels in der Technik allgemein bekannter Mittel hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Slightom et al., "Construction of λ Clone Banks," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (Hrsgb.), Seiten 121-146 (CRC Press, 1993). Eine bevorzugte Quelle von pflanzengenomischer DNA ist Mais-DNA. Genomische DNA kann, zum Beispiel mittels Lysieren von Pflanzengewebe mit dem Detergenz Sarkosyl, Verdau des Lysats mit Proteinase K, Aufreinigen unlöslicher Ablagerungen aus dem Lysat mittels Zentrifugation, Präzipitieren der Nukleinsäure aus dem Lysat unter Einsatz von Isopropanol und Aufreinigen resuspendierter DNA in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten, aus Maisgewebe isoliert werden. Ausubel et al., supra, auf Seiten 2.3.1-2.3.3.
Die für die Herstellung einer genomischen Bibliothek geeigneten DNA- Fragmente können durch das randomisierte Schneiden genomischer DNA oder mittels teilweisem Verdau von genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen erhalten werden. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, auf Seiten 5.3.2-5.4.4 und Slightom et al., supra.
Genomische DNA-Fragmente können im Einklang mit herkömmlichen Techniken, wie dem Einsatz von Restriktionsenzymverdau zur Bereitstellung geeigneter Enden, dem Einsatz alkalischer Phosphatasebehandlung zur Vermeidung unerwünschter Verbindung der DNA-Moleküle und Ligation mit geeigneten Ligasen, in einen Vektor, wie einen Bakteriophagen- oder Cosmidvektor, eingefügt werden. Techniken für solche Manipulationen sind von Slightom et al., supra, offenbart worden und sind in der Technik allgemein bekannt. Siehe ferner Ausubel et al., supra, auf Seiten 3.0.5-3.17.5.
Alternativ kann eine genomische Maisbibliothek kommerziell erhalten werden. Vorzugsweise ist eine solche Bibliothek eine genomische EMBL3-Bibliothek entstammend aus einem teilweisen Sau3A-Verdau von genomischer DNA, isoliert aus der Inzuchtmaislinie W22 (Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA).
Unter Einsatz von Standardtechniken wird eine genomische Klone enthaltende Bibliothek mit einem oder mehreren Antheren-spezifischen cDNA-Klonen gescreent. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, auf Seiten 6.0.3-6.6.1; Slightom et al., supra; Raleigh et al., Genetics 122: 279 (1989).

C. Identifikation von einem Tapetum-spezifischen regulatorischen Element

Genomische Klone können unter Einsatz einer Vielzahl von Techniken, wie Restriktionsanalyse, Southern-Analyse, Primer-Extensionsanalyse und DNA- Sequenzanalyse, analysiert werden. Die Primer-Extensionsanalyse oder S1- Nuklease-Protection-Analyse können zum Beispiel eingesetzt werden, um mutmaßliche Transkriptionsstartstellen der klonierten Gene zu lokalisieren. Ausubel et al., supra, auf Seiten 4.8.1-4.8.5; Walmsley et al., "Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the S1 Nuklease Protection Assay," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, BD. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (Hrsgb.), Seiten 271-281 (Humana Press Inc. 1991). Allerdings kann die strukturelle Analyse alleine nicht zur Identifikation von einem Tapetum-spezifischen regulatorischen Element führen, das mit dem klonierten Gen assoziiert ist, weil kein Modellsystem für Mais-Tapetum- spezifische regulatorische Sequenzen entwickelt worden ist. Das regulatorische Element muss daher unter Einsatz einer funktionellen Analyse identifiziert werden.
Der allgemeine Ansatz einer solchen funktionellen Analyse beinhaltet das Subklonieren von Fragmenten des genomischen Klons in einen Expressionsvektor, der ein Reportergen enthält, das Einbringen des Expressionsvektors in verschiedene Maisgewebe und das Nachweisen des Gewebes zur Detektion der transienten Expression des Reportergens. Das Vorhandensein eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elements in dem genomischen Subklon wird durch die Beobachtung der Reportergenexpression in Antherengewebe und die Abwesenheit der Reportergenexpression in Nicht-Antherengewebe bestätigt.
Verfahren zur Herstellung von Fragmenten eines genomischen Klons sind allgemein bekannt. Vorzugsweise wird enzymatischer Verdau eingesetzt, um ineinandergeschachtelte Deletionen genomischer DNA-Fragmente zu bilden. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, auf Seiten 7.2.1-7.2.20; An et al., "Techniques for Isolating and Characterizing Transcription Promoters, Enhancers, and Terminators," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (Hrsgb.), Seiten 155-166 (CRC Press, 1993).
Beispielsweise kann die Möglichkeit, dass sich das regulatorische Element "stromaufwärts", oder 5'-wärts von der Transkriptionsstartstelle befindet, mittels Subklonieren eines DNA-Fragmentes, das die Stromaufwärtsregion enthält, Verdau des DNA-Fragmentes entweder in der 5'- nach 3'-Richtung oder in der 3'- nach 5'-Richtung unter Herstellung ineinandergeschachtelter Deletionen und Subklonieren der kleinen Fragmente in Expressionsvektoren zur transienten Expression, überprüft werden. Dieser allgemeine Ansatz ist in Beispiel 1, unten, veranschaulicht.
Die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors wird von dem Verfahren zum Einbringen des Expressionsvektors in die Wirtszellen abhängen. Typischerweise enthält ein Expressionsvektor: (1) prokaryotische DNA-Elemente kodierend für einen bakteriellen Replikationsursprung und einen antibiotischen Resistenzmarker zum Bereitstellen des Wachstums und der Selektion des Expressionsvektors in dem bakteriellen Wirt; (2) eukaryotische DNA-Elemente, die die Initiation der Transkription kontrollieren, wie einen Promotor; (3) DNA-Elemente, die das Processing der Transkripte steuern, wie eine Transkriptionsterminations- /Polyadenylierungssequenz; und (4) ein Reportergen, das mit den die Transkriptionsinitiation steuernden DNA-Elementen funktionsfähig verknüpft ist. Zweckmäßige Reportergene schließen β-Glucuronidase, β-Galactosidase, Chloramphenicolazetyltransferase, Luziferase und so weiter ein. Vorzugsweise ist das Reportergen entweder das β-Glucuronidase(GUS)-Gen oder das Luziferasegen. Allgemeine Beschreibungen der Pflanzenexpressionsvektoren und Reportergene können in Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (Hrsgb.), Seiten 89-119 (CRC Press, 1993), gefunden werden. Darüber hinaus sind GUS- Expressionsvektoren und GUS-Genkassetten erhältlich von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), während Luziferaseexpressionsvektoren und Luziferasegenkassetten von Promega Corporation (Madison, WI) erhältlich sind:
Expressionsvektoren enthaltend genomische Testfragmente können in Protoplasten oder in intakte Gewebe oder isolierte Zellen eingebracht werden. Vorzugsweise werden die Expressionsvektoren in intakte Gewebe eingebracht. Allgemeine Verfahren der Kultivierung von Pflanzengewebe sind zum Beispiel von Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGTY, Glick et al., (Hrsgb.), Seiten 67-88 (CRC Press, 1993), und von Phillips et al., "Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation," in CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3. Auflage, Sprague et al., (Hrsgb.), Seiten 345-387 (American Society of Agronomy, Inc. et al. 1988) bereitgestellt. Verfahren zur Kultivierung von Pflanzengeweben sind in den Beispielen 1 und 2 veranschaulicht.
Verfahren zum Einbringen von Expressionsvektoren in Pflanzengewebe schließen die direkte Infektion oder Co-Kultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobacterium tumefaciens ein. Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). Beschreibungen von Agrobacterium-Vektorsystemen und Verfahren zum Agrobacterium-vermittelten Gentransfer sind von Gruber et al., supra, und Miki et al., supra, bereitgestellt.
Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in Maisgewebe unter Einsatz eines direkten Gentransferverfahrens wie Mikroprojektil-vermittelter Abgabe (delivery), DNA-Injektion, Elektroporation und so weiter eingebracht. Siehe zum Beispiel Gruber et al., supra; Miki et al., supra; Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992). Noch bevorzugter werden die Expressionsvektoren in Maisgewebe unter Einsatz von Mikroprojektil-vermittelter Abgabe mit einer biolistischen Vorrichtung eingebracht. Dieses Abgabeverfahren (method of delivery) ist in den Beispielen 1-3, unten, veranschaulicht.
Die oben beschriebenen Verfahren wurden zum Identifizieren von DNA- Sequenzen, die die Genexpression in Tapetum-spezifischer Weise regulieren, eingesetzt. Insbesondere wurde ein Tapetum-spezifisches regulätorisches Element gefunden, das innerhalb eines 94-Basenpaar-DNA-Fragmentes liegt, das durch die Nukleotide 583 bis 490 stromaufwärts von der SGB6-Transkriptionsstartstelle definiert ist. Die Nukleotidsequenz des 94-Basenpaar-Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes lautet:
Die vorliegende Erfindung schließt daher ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NR.: 1 und die Funktion eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes hat, ein.
Varianten des 94-Basenpaar-Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes können mittels Deletieren, Addieren und/oder Substituieren von Nukleotiden für die in SEQ ID NR.: 1 beschriebenen Nukleotide hergestellt werden. Solche Varianten können zum Beispiel durch Oligonukleotid-spezifische (oligonucleotidedirected) Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion und so weiter, erhalten werden. Ausubel et al., supra, auf Seiten 8.0.3-8.5.9. Allgemein siehe ferner McPherson (Hrsgb.), DIRECTED MUTAGENSIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991). Die vorliegende Erfindung schließt daher DNA-Moleküle umfassend Nukleotidsequenzen, die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NR.: 1 und eine Funktion als ein Tapetum-spezifischer Promotor haben, ein.
Darüber hinaus können zusätzliche Deletionsanalysen zur weiteren Lokalisierung eines oder mehrerer Tapetum-spezifischer regulatorischer Elemente innerhalb des 94-Basenpaar-Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung schließt daher ferner Fragmente des DNA- Moleküls, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NR.: 1 hat, ein, solange die DNA-Fragmente als ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element funktionieren.

3. Verwendung eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes zur Kontrolle der Pollenherstellung

A. Herstellung von männlich-sterilen Pflanzen

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel zur Kontrolle der Pollenherstellung unter Einsatz eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes bereitzustellen. Von Wichtigkeit ist, dass das SGB6-Tapetum-spezifische regulatorische Element die Expression eines heterologen Gens in Tapetumzellen von Antheren von dem Tetradenstadium bis zu dem mittleren Einkernstadium (miduninukleate stage) der Entwicklung induzieren kann. Die praktische Bedeutung solcher Zeitsteuerung (timing) ist, dass die Expression eines sterilitätsinduzierenden Gens während dieser Entwicklungsphase die Antherenreifung früh genug stört, um eine visuelle Überprüfung der Funktion des sterilitätsinduzierenden Systems in dem Feld zu erlauben. Wirkungen des sterilitätsinduzierenden Gens würden daher in dem Produktionsfeld zu in einem ausreichend frühen Stadium der Entwicklung offenkundig werden, um entweder manuelles oder mechanisches Entfernen des männlichen Blütenstandes von irgendwelchen "fertilen Ausreißern" (fertile escapees) zu gestatten, die aus dem teilweisen oder vollständigen Zusammenbruch des sterilitätsinduzierenden Systems resultieren.
Ein allgemeiner Ansatz zum Induzieren männlicher Sterilität ist es, einen Expressionsvektor zu konstruieren, in dem das Tapetum-spezifische regulatorische Element funktionsfähig mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein zur Störung der Tapetumzellfunktion fähiges Protein kodiert. Zur Störung der Tapetumfunktion fähige Proteine schließen Proteine, die die Synthese von für die zelluläre Funktion essenziellen Makromolekülen hemmen, Enzyme, die für die zelluläre Funktion essenzielle Makromoleküle abbauen, Proteine, die die Biosynthese oder den Metabolismus von Pflanzenhormonen verändern, und Proteine, die eine spezifische Funktion von Tapetumzellen hemmen, ein.
Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, in dem das Tapetum-spezifische regulatorische Element funktionsfähig mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die einen Inhibitor der Proteinsynthese kodiert. Diphtherietoxin, zum Beispiel, ist ein allgemein bekannter Inhibitor der Proteinsynthese in Eukaryoten. Diphtherietoxin kodierende DNA-Moleküle können von der American Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC Nr. 39359 oder ATCC Nr. 67011 erhalten werden.
Alternativ kann die Störung der Tapetumfunktion durch Einsatz von DNA- Sequenzen erreicht werden, die zum Abbau eines biologisch wichtigen Makromoleküls befähigte Enzyme kodieren. Zum Beispiel haben Mariani et al., Nature 347: 737 (1990) gezeigt, dass die Expression in dem Tapetum von entweder Aspergillus oryzae-RNase-T1 oder einer RNase aus Bacillus amyloliquefaciens, als "Barnase" bezeichnet, die Zerstörung von Tapetumzellen induziert, was zu männlicher Unfruchtbarkeit führt. Quaas et al., Eur. J. Biochem. 173: 617 (1988), beschreiben die chemische Synthese der RNase-T1, während die Nukleotidsequenz des Barnasegens in Hartley, J. Molec. Biol. 202: 913 (1988) offenbart ist.
RNase-T1- und Barnasegene können zum Beispiel durch Synthese der Gene mit gegenseitig initiationsreagierenden (mutually priming), langen Oligonukleotiden erhalten werden. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, auf Seiten 8.2.8 bis 8.2.13. Siehe auch Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987). Darüber hinaus stellen aktuelle Methoden unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion die Fähigkeit zur Synthese von Genen von bis zu 1,8 Kilobasen Länge bereit. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993).
In einem alternativem Ansatz wird die Pollenherstellung durch Verändern des Metabolismus der Pflanzenhormone, wie Auxine, gehemmt. Zum Beispiel kodiert das rolB-Gen des Agrobacterium rhizoGens für ein Enzym, das auf den Auxinmetabolismus durch Katalyse der Freisetzung von freien Indolen aus Indoxyl-β- glucosiden störend einwirkt. Estruch et al., EMBO J. 11: 3125 (1991). Spena et al., Theor. Appl. Genet. 84: 520 (1992), haben gezeigt, dass die Antheren-spezifische Expression des rolB-Gens in Tabak zu Pflanzen mit verschrumpelten Antheren führt, bei denen die Pollenherstellung stark vermindert war. Das rolB-Gen ist daher ein Beispiel für ein Gen, das für die Kontrolle der Pollenherstellung zweckmäßig ist. Slightom et al., J. Biol. Chem. 261: 108 (1985), offenbaren die Nukleotidsequenz des rolB-Gens.
Die Kontrolle der Pollenherstellung kann ferner durch Hemmen einer spezifischen Funktion der Tapetumzellen erzielt werden. Zum Beispiel stellen Tapetumzellen β(1,3)-Glucanase oder Callase, die die Mikrosporenfreisetzung fördert, her. Mepham et at, Protoplasma 70: 1 (1970). Ein vorzeitiges oder spätes Erscheinen von Callase während der Entwicklung des Tapetums ist mit gewissen Typen männlicher Sterilität assoziiert. Warmke et al., J. Hered. 63: 103 (1972). Das Callasegen kann daher für die Störung der Tapetumzellenfunktion eingesetzt werden. Scott et al., PCT International Application Publication Nr. WO 93/02197 (1993) offenbaren die Nukleotidsequenz von einer Tapetum-spezifischen Callase.
Um ein die Taptumfunktion störendes Protein zu exprimieren, wird ein Expressionsvektor konstruiert, in dem eine das Protein kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die die Gentranskription in einer Tapetum-spezifischen Weise regulieren. Die allgemeinen Voraussetzungen an einen Expressionsvektor sind weiter oben im Zusammenhang mit einem transienten Expressionssystem beschrieben. Allerdings ist es hier das Ziel, den Expressionsvektor in das pflanzenembryonische Gewebe auf solchem Wege einzubringen, dass ein fremdes Protein zu einem späteren Stadium der Entwicklung in dem Tapetum der adulten Pflanze exprimiert wird. Mitotische Stabilität kann unter Einsatz von pflanzenviralen Vektoren, die epichromosomale Replikation bereitstellen, erreicht werden.
Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren zum Erlangen mitotischer Stabilität wird durch die Integration von Expressionsvektorsequenzen in das Wirtschromosom bereitgestellt. Solche mitotische Stabilität kann durch Mikroprojektilabgabe eines Expressionsvektors an embryonisches Gewebe, wie unten in Beispiel 3 veranschaulicht, bereitgestellt werden.
Die Transkription des fremden Gens kann durch einen Promotor eines Tapetum- spezifischen Gens oder durch einen viralen Promotor, wie ein Blumenkohlmosaikvirus (Cauliflower Mosaic Virus) (CaMV), eines Braunwurzgewächsmosaikvirus-(Figwort Mosaic Virus)-Promotors und so weiter kontrolliert werden. Gruber et al., supra. Vorzugsweise ist der Promotor ein Promotor eines Tapetum- spezifischen Gens oder der CaMV-35S-Kernpromotor. Mehr bevorzugt ist der Promotor ein Promotor eines Tapetum-spezifischen Gens und insbesondere der SGB6-Kernpromotor, wie unten beschrieben.
Alternativ kann die Transkription des fremden Gens durch einen Promotor eines Antheren-spezifischen Gens kontrolliert werden, der während der meiotischen bis Tetradenstadien der Entwicklung exprimiert wird. Auf diese Weise kann die Fremdgenexpression während der Meiose bis zum mittleren Einkernstadium durch Einsatz eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes in Verbindung mit einem solchen Promotor, wie in Beispiel 4 veranschaulicht, erreicht werden. Vorzugsweise wird der 289-Basenpaar-G9-Promotor eingesetzt, um das Entwicklungsfenster der heterologen Expression, wie weiter unten beschrieben, auszudehnen.
Um transformierte Zellen auszuwählen, enthält der Expressionsvektor ein selektierbares Markergen, wie ein Herbizidresistenzgen. Zum Beispiel können solche Gene Resistenz gegenüber Phosphinthricin, Glyphosphat, Sulfonylharnstoffe, Atrazin oder Imidazolinon verleihen. Vorzugsweise ist das selektierbare Markergen das Phosphinthricin-Resistenzgen. Wenngleich der Expressionsvektor cDNA- Sequenzen kodierend für ein fremdes Protein unter der Kontrolle eines Tapetum- spezifischen regulatorischen Elementes als auch das selektierbare Markergen unter Kontrolle von einem konstitutivem Promotor enthalten kann, wird das selektierbare Markergen vorzugsweise zu den Wirtszellen in einem getrennten Selektionsexpressionsvektor abgegeben. Eine solche "Co-Transformation" von embryonischem Gewebe mit einem Testexpressionsvektor enthaltend ein Tapetum- spezifisches regulatorisches Element und einen Selektionsexpressionsvektor ist unten in Beispiel 3 veranschaulicht.
In einem alternativen Ansatz kann die männliche Sterilität durch Einsatz eines Expressionsvektors, in dem das Tapetum-spezifische regulatorische Element mit einer eine Antisense-RNA kodierenden Nukleotidsequenz funktionsfähig verknüpft ist, induziert werden. Das Binden von Antisense-RNA-Molekülen an ZielmRNA-Moleküle führt zu Hybridisierungsstillstand der Translation. Paterson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 4370 (1987). Ein geeignetes Antisense-RNA- Molekül würde daher eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu einer mRNA-Spezies kodierend für ein Protein ist, das für die Tapetumzellfunktion notwendig ist.
Zum Beispiel würde die Produktion von Callase-Antisense-RNA die Produktion von Callaseenzym, das für die Mikrosporenfreisetzung wesentlich ist, hemmen. Zusätzlich kann männliche Sterilität durch die Hemmung der Flavonoidbiosynthese unter Einsatz eines Expressionsvektors, der Antisense-RNA für die 3'- untranslatierte Region des Chalconsynthase-A-Gens produziert, induziert werden. Van der Meer et al., The Plant Cell 4: 253 (1992). Die Klonierung und Charakterisierung des Chalconsynthase-A-Gens ist von Koes et al., Gene 81: 245 (1989) und von Koes et al., Plant Molec. Biol. 12: 213 (1989) offenbart.
Alternativ kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, in dem das Tapetum- spezifische regulatorische Element funktionsfähig mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein Ribozym kodiert. Ribozyme können zur Expression von Endonukleaseaktivität, die auf eine gewisse Zielsequenz in einem mRNA-Molekül gerichtet ist, gestaltet werden. Zum Beispiel Steinecke et al., EMBO J. 11: 1525 (1992), erzielte bis zu 100% Hemmung von Neomycinphosphotransferase- Genexpression mittels Ribozymen in Tabakprotoplasten. Vor kurzem hemmte Perriman et al., Antisense Research and Development 3: 253 (1993), die Chloramphenicolazetyl-Transferaseaktivität in Tabakprotoplasten unter Einsatz eines Vektors, der ein modifiziertes Hammerkopfribozym (hammerhead ribozyme) exprimierte. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung schließen geeignete Ziel-RNA-Moleküle für Ribozyme mRNA-Spezies ein, wie Callase-mRNA, die Protein kodieren, die für die Tapetumfunktion wesentlich sind.
In einem weiteren alternativen Ansatz können Expressionsvektoren konstruiert werden, in denen ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element die Herstellung von RNA-Transkripten, die zur Förderung RNase-P-vermittelter Spaltung von ZielmRNA-Molekülen fähig sind, steuert. Gemäß diesem Ansatz kann eine externe Leitsequenz konstruiert werden, um das endogene Ribozym, RNase P, zu einer besonderen Spezies von intrazellulärer mRNA zu leiten, die anschließend von dem zellulären Ribozym gespalten wird. Altman et al., U.S. Patent Nr. 5,168,053. Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). Vorzugsweise umfasst die externe Leitsequenz eine Sequenz von zehn bis fünfzehn Nukleotiden, die zu einer mRNA-Spezies, die ein für die Tapetumfunktion wesentliches Protein kodiert, komplementär ist, und eine 3'-NCCA-Nukleotidsequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist, umfasst. Id. Die externen Leitsequenztranskripte binden an die Ziel mRNA-Spezies (targeted mRNA species) durch Bildung von Basenpaaren zwischen der mRNA und den komplementären externen Leitsequenzen, und fördern daher die Spaltung der mRNA durch RNase P an dem an der 5'- Seite der basengepaarten Region lokalisierten Nukleotid. Id.
Alternativ können Antisense-Gene, Ribozymgene und externe Leitsequenzgene durch eine Kombination von einem Tapetum-spezifischen regulatorischen Element und einem Promotor eines Antheren-spezifischen Gens, welches während der meiotischen bis Tetradenstadien der Entwicklung exprimiert wird, reguliert werden. Vorzugsweise ist der Promotor der 289-Basenpaar-G9-Promotor.

B. Wiederherstellen der männlichen Fertilität in dem F1-Hybrid

Die oben beschriebenen Verfahren können zur Herstellung transgener männlichsteriler Maispflanzen für die Herstellung von Fl-Hybriden in großem Maßstab gerichtet auf die Kreuzung zwischen Inzuchtlinien eingesetzt werden. Wenn alle Eizellen der transgenen männlich-sterilen Pflanzen kein fremdes Gen enthalten, das die Tapetumfunktion stört, dann wird ein Anteil der F1-Hybriden einen männlich-fertilen Phänotyp haben. Andererseits werden F1-Hybriden einen männlich-sterilen Phänotyp haben, wenn das fremde Gen in allen Eizellen der transgenen männlich-sterilen Pflanzen vorhanden ist, weil die durch das fremde Gen induzierte Sterilität dominant sein würde. Es ist daher wünschenswert, ein männliches Fertilitätswiederherstellungssystem einzusetzen, um die Herstellung von männlich-fertilen F1-Hybriden bereitzustellen. Solch ein Fertilitätswiederherstellungssystem hat einen besonderen Wert, wenn das geerntete Produkt Same ist.
Ein Ansatz zur männlichen Fertilitätswiederherstellung würde das Kreuzen transgener männlich-steriler Pflanzen mit transgenen männlich-fertilen Pflanzen, die ein Fertilitätswiederherstellungsgen unter der Kontrolle eines Tapetum- spezifischen regulatorischen Elementes enthalten, sein. Zum Beispiel kreuzten Mariani et al., Nature 37: 384-387 (1992), männlich-fertile Pflanzen, die einen Barnase-Inhibitor exprimierten, als "Barstar" bezeichnet, mit männlich-sterilen Pflanzen, die Barnase exprimierten. Hartley, J. Mol. Biol. 202: 913 (1988), offenbart die Nukleotidsequenz von Barstar.
Alternativ kann die männliche Fertilitätswiederherstellung erreicht werden durch Expression von Diphtherietoxinribozymen in männlich-fertilen Pflanzen, um die Wirkungen von Diphtherietoxinen in männlich-sterilen Pflanzen zu neutralisieren. Männliche Fertilität kann daher in den F1-Hybriden durch Herstellen einer männlich-fertilen transgenen Pflanze wiederhergestellt werden, die eine besondere Spezies von RNA-Molekül oder Polypeptid synthetisiert, um die den Wirkungen des besonderen jeweiligen fremden Gens, das in männlich-sterilen Pflanzen exprimiert wird, entgegenzuwirken.
In einem alternativen Verfahren zur Wiederherstellung männlicher Fertilität enthalten transgene männlich-sterile Pflanzen einen Expressionsvektor, der die folgenden Elemente umfasst: ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element, ein prokaryotisches regulatorisches Element und ein fremdes Gen, das zur Störung der Tapetumfunktion befähigt ist. Transgene männlich-fertile Pflanzen, die ein prokaryotisches Peptid unter der Kontrolle eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes exprimieren, werden hergestellt. In den F1-Hybriden bindet das prokaryotische Peptid an die prokaryotische regulatorische Sequenz und unterdrückt die Expression des fremden Gens, das zur Störung der Tapetumfunktion befähigt ist. Ein Vorzug dieses Ansatzes zur Fertilitätswiederherstellung ist, dass eine Form der transgenen männlich-fertilen Pflanze unabhängig von der Identität des fremden Gens, das zur Störung der Tapetumfunktion in der transgenen männlich-sterilen Pflanze eingesetzt wurde, zur Bereitstellung der F1-Fertilität eingesetzt werden kann.
Zum Beispiel kann das LexA-Gen/LexA-Operatorsystem zur Regulation der Genexpression gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Siehe U.S. Patent Nr. 4,833,080 (das '080 Patent) und Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1805 (1993). Noch spezifischer würde der Expressionsvektor der männlich-sterilen Pflanze, die LexA-Operatorsequenz enthalten, während der Expressionsvektor der männlich-fertilen Pflanze die kodierenden Sequenzen des LexA-Repressors enthalten würden. In dem F1-Hybrid würde der LexA-Repressor an die LexA- Operatorsequenz binden und die Transkription des fremden Gens, das ein zur Störung der Tapetumfunktion befähigtes Produkt kodiert, hemmen.
LexA-Operator-DNA-Moleküle können zum Beispiel durch Synthese von DNA- Fragmenten, die die allgemein bekannte LexA-Operatorsequenz enthalten, erhalten werden. Siehe zum Beispiel das '080-Patent, supra, und Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 236: 125 (1992). Das LexA-Gen kann durch Synthese eines DNA- Moleküls kodierend den LexA-Repressor erhalten werden. Gensynthesetechniken sind weiter oben besprochen und LexA-Gensequenzen sind zum Beispiel von Garriga et al., supra, beschrieben. Alternativ können die den LexA-Repressor kodierenden DNA-Moleküle aus dem Plasmid pRB500, American Type Culture Collection Zugangsnummer 67758, erhalten werden. Der Fachmann kann andere Fertilitätswiederherstellungsstrategien unter Einsatz von prokaryotischen regulatorischen Systemen, wie dem lac-Repressor/lac-Operon-System oder dem trp- Repressor/trp-Operon-System leicht entwerfen.
Die vorliegende auf diese Weise allgemein beschriebene Erfindung wird durch Bezug zu den folgenden Beispielen leichter verstanden werden, die auf dem Weg der Veranschaulichung bereitgestellt werden und ist nicht zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung intendiert sind.

Beispiel 1

Identifikation von einem Tapetum-spezifischen regulatorischen Element mittels Deletionsanalyse

Dr. Stephen Goff (U.S. Department of Agriculture; Albany, CA) stellte einen genomischen Klon, der ein als SGB6 bezeichnetes Gen enthält, bereit. Der SGB6- genomische Klon war aus einer genomischen Mais-W22-Bibliothek in EMBL3 (Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA) unter Einsatz radioaktiv markierter SGB6-cDNA als eine Sonde isoliert worden. Da das SGB6-Gen in der Tapetumschicht der Maisanthere exprimiert wird, wurden die Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element stromaufwärts von dem SGB6-Gen liegt.
Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz der SGB6-Stromaufwärtsregion wurde ein 1339-Basenpaar ApaLI/SmaI-DNA-Fragment enthaltend die Stromaufwärtsregion in den Vektor, pBluescript® KS+ (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA), inseriert. Siehe Subklon "DP1425" in Fig. 1. Ineinander geschachtelte Deletionen (nested deletions) des ApaLI/SmaI-Fragmentes wurden unter Einsatz allgemein bekannter Techniken und eines von Strategene Cloning Systems, Inc., erhaltenen Testkits herstellt. Kurz gefasst wurde Plasmid-DNA entweder mit Bam- HI oder EcoRI zur Herstellung eines 5'-einzelsträngigen DNA-Segmentes als Ausgangspunkt für den Exonuklease-III-Verdau verdaut. Auch Plasmid-DNA wurde entweder mit SacI oder KpnI verdaut, um eines 3' einzelsträngiges DNA- Segment zu herstellen, um Vektor-DNA vor Exonuklease-III-Verdau zu schützen. Im Anschluss an den Verdau mit Exonuklease III wurde die DNA mit Mungbohnennuklease (mung bean nuklease) zur Herstellung stumpfer Enden verdaut. Subklone enthaltend ineinandergeschachtelte Deletionen wurden mittels der Dideoxyketten-Abbruchmethode von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 74: 5463 (1977) unter Einsatz eines ABI Sequencer (Applied Biosystems, Inc.; Foster City, CA) sequenziert.
Die Funktion des mutmaßlichen Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes des SGB6-Gens wurde durch Deletionsanalyse charakterisiert. Deletionsplasmide wurden gemäß allgemein bekannter Techniken unter Einsatz von Exonuklease-III- und Mungbohnennuklease-Verdau konstruiert. Siehe zum Beispiel Ausubel et ab, supra. Fig. 2 zeigt durch diesen Ansatz erhaltenen Deletionsplasmide.
Deletionsplasmide wurden ferner durch Klonierung von Fragmenten der mutmaßlichen regulatorischen Region, die durch Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) synthetisiert worden waren, erhalten. Fig. 3 zeigt eine 5'-Deletionsserie mit Endpunkten von 50-Basenpaar-Erhöhungen von den Nukleotiden -633 bis - 33. Fig. 4 zeigt eine 3'-Deletionsserie mit Endpunkten von 50-Basenpaar- Erhöhungen von den Nukleotiden -589 bis -139.
Die Funktion der Deletionsplasmide wurde mit einem transienten Expressionstest unter Einsatz von Luziferase (LU) als Reportergen überprüft. Für diese Studien wurden Maisantheren aus männlichen Blütenständen von Z. mays W22 r-g Stadler in verschiedenen Stadien der Entwicklung isoliert. Eine Anthere einer jeden Einzelblüte wurde in Farmers Lösung (Farmers Solution) (3 : 1; V/V; Ethanol/Eisessig) zur Bestimung der Stadien fixiert. Berlyn et al. BOTANICAL MICROTECHNIQUE AND ZYTOCHEMISTRY, Seite 32 (The Iowa State University Press 1976). Zwei Antheren von jeder Einzelblüte wurden auf Männlichem-Blütenstand-Reifungsmedium (tassel maturation medium) ausplattiert, wie von Pareddy et al., Crop Sci. J. 29: 1564 (1989) beschrieben, das mit 0,5% Gel- Rite-Agar (Scott Laboratories, Inc.) verfestigt wurde.
Plasmid-DNA wurde in Antherengewebe mittels Bombardement des Gewebes mit DNA-umhüllten 1,8 u-Wolframteilchen eingebracht. Kurz gefasst wurden 10 ug DNA in einem Volumen von 10 ul auf ungefähr 750 ug (50 ul) Salpetersäuregewaschener Wolframteilchen durch Zugabe von 50 ul 2,5 M Kalziumchlorid und 20 ul 0,1 M Spermidin präzipitiert. Das Gemisch wurde ultrabeschallt (sonicated) und die Teilchen wurden mittels Zentrifugation pelletiert, in Äthanol gewaschen und in 60 ul Äthanol mittels Ultrabeschallung resuspendiert. Zehn Mikroliter Aliquots wurden auf Makro-Carrier-Scheiben zur Bombardierung mit der PDS-1000 Heliumteilchenpistole (helium particle gun) (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA), unter Einsatz von 1000 PSI Bruchscheiben (rupture disks) trocknen gelassen. Im Anschluss an das Teilchenbombardement wurde Antherengewebe bei 27 ºC in Dunkelheit für 16 bis 24 Stunden inkubiert.
Proteinextrakte von Antherengewebe wurden auf das Vorhandensein von Luziferaseaktivität unter Einsatz von Standardtechniken getestet. Siehe zum Beispiel De Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987). Kurz gefasst wurde lösliches Protein wurde aus Antherengewebe durch Mahlen des Gewebes auf Eis in 100 ul Mahlpuffer (50 mM KPO&sub4;, 10 mM EDTA und 2 mM Dithiothreitol; pH 7,8) extrahiert. Unlösliche Ablagerungen wurde durch Zentrifugieren des Gemisches für 5 Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer gekühlten Microfuge entfernt. Typischerweise wurde ein 20 ul Aliquot Pflanzenextrakt mit 200 ul Testpuffer (assay buffer) (25 mM Tricin, 15 mM MgCl&sub2;, 5 mM ATP und 500 ug/ml Rinderserumalbumin) und 100 ul 500 uM Luciferin (Kaliumsalz) inkubiert. Lichtausstoß wurde in einem Monolight 2010 Analytical Luminometer gemessen.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass ein DNA-Fragment enthaltend die SGB6-Stromaufwärtsregion transiente Luziferaseexpression in Antheren des Tetradenstadiums und bis zum mittleren Einkernstadium der Antherenentwicklung induzieren kann. Im Gegensatz dazu wurde wenig oder keine Luziferaseaktivität in prämeiotischen Antheren nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass ein DNA-Fragment enthaltend die Nukleotide -735 bis -489 stromwärts der SGB6-Transkriptionsstartstelle in Kombination mit dem SGB6- Kernpromotor (d. h. die ersten 37 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle) einen hohen Spiegel von Luziferaseexpression in dem Antherengewebe induzieren kann. Siehe Fig. 4. Schließlich deuten die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse an, dass innerhalb der Nukleotide -583 bis -483 ein regulatorisches Element lokalisiert ist.

Beispiel 2

Charakterisierung des 94 Basenpaar Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes

Nach Identifikation einer ungefähr 100-Basenpaar-Stromaufwärtsregion, die in Genexpression von hohem-Spiegel in Antherengewebe involviert ist, wurden DNA-Fragmente enthaltend interne Deletionen unter Einsatz der 5'- und 3'- Deletionsplasmide, wie oben beschrieben, herstellt. Fig. 5 zeigt, dass die interne Deletionen enthaltenden DNA-Fragmente entweder die gesamte 100-Basenpaar- Region entbehrten oder Teile der 100-Basenpaar-Region entbehrten. Ein Vergleich der Ergebnisse erhalten mit den Plasmiden DP4989 und DP4999 deuteten an, dass in der sich ungefähr von dem Nukleotid -588 bis Nukleotid -489 erstreckenden Region ein regulatorisches Element liegt.
Die SGB6 regulatorische Region wurde weiter charakterisiert durch Synthetisieren eines 94-Basenpaar-DNA-Fragmentes enthaltend die Nukleotide -583 bis - 490, Fusionieren des 94-Basenpaar-Fragmentes stromaufwärts von dem SGB6- Kernpromotor und Insertion des resultierenden DNA-Fragmentes in einen Luziferasevektor. Siehe Fig. 6. Zusätzliche Vektoren wurden mit vielfach-Kopien (multiple copies) der 94-Basenpaar-Region konstruiert, wobei die 94-Basenpaar- Region relativ zu dem Promotor in umgekehrter Orientierung positioniert wurde und wobei Teile der 94-Basenpaar-Region sich über 32 oder 45 Basenpaare der Mitte der 94-Basenpaar-Region erstreckten. Ein Kontrollplasmid enthielt den CaMV-35S-Promotor, Tabakmosaikvirus nicht translatierte Vorsequenzregion (leader region) Ω', und das erste Intron des Mais-ADH1-Gens, mit dem Luziferasegen fusioniert war. Alle Konstrukte enthielten eine 3'-Transkript-Processing- Region des Proteinase-Inhibitor II (PinII)-Gens der Kartoffel.
Wie in Fig. 6 gezeigt, können Konstrukte, die das 94 Basenpaar-Fragment gebunden an den SGB6-Kernpromotor enthalten, Genexpression induzieren. Die Genexpression wurde durch Verdoppelung oder Vervierfachung der Zahl der Kopien des 94-Basenpaar-Fragmentes stromaufwärts von dem Kern-56B6-Promotor gesteigert. Darüber hinaus induzierte auch die Insertion des 94-Basenpaar- Fragmentes in umgekehrter Orientierung die Genexpression. Daher deuten die Ergebnisse an, dass das 94-Basenpaar-Fragment die Genexpression in einer positions- und orientierungsunabhängigen Weise induziert, was Charakteristika von Enhancern sind.
Es wurden Experimente durchgeführt zur Bestimmung, ob ein das 94-Basenpaarregulatorische Element enthaltendes Plasmid transiente Luziferaseaktivität in Keimblattscheiden, Wurzeln oder embryonischem Gewebe induzieren kann. Keimblattscheiden und Wurzeln wurden erhalten, indem die Oberflächen von B73-Keimlingen mit 20% Bleiche sterilisiert wurden, die Keimlinge mit sterilen destilliertem Wasser zweifach gespült wurden und die Keimling das Wasser für ein bis drei Stunden absorbieren gelassen wurden. Die Keimlinge keimten in der Dunkelheit bei 20ºC für 48 Stunden. Der gekeimte Embryo und das Scutellum wurden aus den Samen herausgeschnitten und auf Murashige- und Skoog- Medium enthaltend 0,5 mg/l Zeatin und 0,3% GelRite-Agar ausplattiert. Gewebe wurden mit DNA-umhüllten Wolframteilchen wie oben beschrieben bombardiert und Embryos wurden für 18-20 Stunden bei 28ºC in der Dunkelheit inkubiert. Keimblattscheiden und Wurzeln wurden aus den gekeimten Keimlingen unmittelbar vor der Homogenisierung des Gewebes für den Luziferasetest (luciferase assay) herausgeschnitten, der wie oben beschrieben durchgeführt wurde.
Embryogene Suspensionen wurden bei 28ºC in Dunkelheit mittels Subkultivieren des Gewebes zweimal wöchentlich in Medium enthaltend MS-Salze und 2,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure beibehalten, Murashige et al., Physiol. Plant 15: 473 (1962). Vor dem Teilchenbombardement wurden die Kulturen homogenisiert und in Murashige- und Skoog-Medium enthaltend 0,5 mg/l Zeatin, 0,3% GelRite-Agar und 0,25 M Mannitol resuspendiert. Kulturen wurden in Dunkelheit bei 28ºC entweder für 5 Stunden oder über Nacht mit Schütteln vor dem Teilchenbombardement inkubiert. Nach dem Bombardement wurden die Kulturen in Medium enthaltend AT-Basenmedium, Prolin (700 mg/l), 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (0,75 mg/l) und 0,3% Gel-Rite-Agar überführt. AT Basenmedium ist aus den folgenden Komponenten (Gramm/100 Liter Wasser) zusammengesetzt: Kaliumnitrat (160), wasserfreies Magnesiumsulfat (12,2), Ammoniumsulfat (170), FeSO&sub4;·XH&sub2;O (2,039), Dinatrium EDTA (2,78), Kaliumjodid (0,075), Borsäure (0,3), MnSO&sub4;·H&sub2;O (1,0), ZnSO&sub4;·H&sub2;O (0,125), Na&sub2;·MoO&sub4;·2H&sub2;O (0,025), wasserfreies Kupfervitriol (0,0016), wasserfreies Kobaltchlorid (0,0014), wasserfreies Kalziumchlorid (22,65), monobasisches Kaliumphosphat (30,0), Pyridoxin HCl (0,05), Thiamin HCl (0,1). Nikotinsäure (Niacin; 0,05) und Glycin (0,2). Die Kulturen wurden für 18-24 Stunden bei 28ºC in Dunkelheit inkubiert.
Ein Kontrollplasmid enthaltend einen CaMV-35S Promotor stromaufwärts von dem Luziferasegen induzierte starke Luziferaseaktivität in Antherengewebe, Keimblattscheiden, Wurzeln und embryogenen Suspensionen. Siehe Fig. 7. Im Gegensatz dazu induzierten Testplasmide enthaltend das 94-Basenpaar fusioniert mit entweder den SGB6-Kernpromotor oder den CaMV 35-Kernpromotor starke Luziferaseaktivität in Antheren, aber geringe oder keine Luziferaseaktivität in Keimblattscheiden, Wurzeln oder embryogenen Suspensionen. Folglich kann das 94-Basenpaar-regulatorische Element die Funktion des SGB6-Promotors oder eines heterologen Promotors in einer Antheren-spezifischer Weise regulieren.

Beispiel 3

In vivo-Expression eines Reportergens kontrolliert durch ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element

Die Funktion der SGB6 regulatorischen Region wurde durch Herstellung einer transgenen Maispflanze enthaltend einen GUS-Expressionsvektor unter der Kontrolle von Tapetum-spezifischen regulatorischen Sequenzen untersucht. Die Vektoren enthielten ferner eine 3'-nos-transkriptionale Processing-Region stromabwärts von dem GUS-Reportergen. Transgene Pflanzen wurden mittels Teilchenbombardement von entweder einer GS2 Mais embryogenen Suspensionskultur (Pioneer Hi-Bred International, Inc.; Des Moines, IA) oder Callusgewebes erhalten von Hi-II, einer geschützten Maissorte (Pioneer Hi-Bred International, Inc.) erhalten. Die GS2-Kultur wurde in einem Medium enthaltend MS-Salze und 2 mg/ml 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure beibehalten. Das Callus-Gewebe wurde auf Festmedium enthaltend N6-Salze [Chu et al., Sci. Sin. 18: 659 (1975)], 1 mg/ml 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 25 mM Prolin und 0,2% GelRite-Agar beibehalten.
Vor dem Teilchenbombardement wurde embryoGens Gewebe für vier Stunden in dem oben beschriebenen Medium mit 0,25 M Mannitol suspendiert und dann auf sterile 3MM Filterpapierscheiben, befeuchtet mit 0,5 ml des Mediums, übertragen. Typischerweise wurden die Gewebe bei 650 PSI mit Säure-gewaschenen 1,8 u Wolframteilchen, präzipitiert mit 0,1 bis 10 ug DNA, wie oben beschrieben bombardiert. In diesen Experimenten wurden die Wolframteilchen mit einem 1 : 1- Gemisch von Testplasmid und Selektionsplasmid umhüllt. Das Testplasmid enthielt ein SGB6-GUS-Konstrukt, während das Selektionsplasmid das Phosphinthricin-N-azetyltransferasegen fusioniert mit einem CaMV-35S-Promotor enthielt. Die Selektion würde unter Einsatz des oben beschriebenen Mediums, verfestigt mit 0,2% GelRite-Agar und enthaltend 3 mg/ml Bialaphos (Phosphinthricin) durchgeführt.
Die GUS-Aktivität wurde unter Einsatz von einer Standardtechnik gemessen. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987).
Das in GS2 eingebrachte Testplasmid, pPHP2125, enthielt die SGB6 5'-Region von Nukleotid -1047 bis Nukleotid +100, das mit dem GUS-Reportergen fusioniert war. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass die SGB6- regulatorische Region GUS-Genexpression in der Tapetum-Schicht der Anthere einer transgenen Pflanze induzieren kann. Im Gegensatz dazu induzierte die SGB6-regulatorische Region keine GUS-Genexpression in Blättern oder Wurzeln transgener Pflanzen. Die GUS-Genexpression wurde nicht in Antheren von Kontrollpflanzen, die allein mit dem Phosphinthricin-Resistenzgenexpressionsvektor transformiert wurden, beobachtet.
Das in Hi-II-Gewebe eingebrachte Testplasmid, pPHP5390, enthielt die SGB6-5'- Region von Nukleotid -735 bis Nukleotid -489, die SGB6-Kempromotorregion von Nukleotid -37 bis Nukleotid + 100 und das GUS-Reportergen. Die Ergebnisse deuten an, dass die SGB6-regulatorische Region GUS-Genexpression in Hi-II- Antheren von transgenen Pflanzen induzieren kann. Die GUS-Genexpression wurde nicht in Antheren von Kontrollpflanzen, die allein mit dem Phosphinthricin-Resistenzgenselektionsvektor transformiert wurden, beobachtet.

Beispiel 4

Der Einsatz von einem G9-Promotor zum Ausdehnen des Entwicklungsfensters von Tapetum-spezifischer Genexpression

Um das Entwicklungsfenster von Tapetum-spezifischer Genexpression auszudehnen, wurden Promotorsequenzen von einem Antheren-spezifischen Gen, bezeichnet als "G9", erhalten, das während der meiotischen bis Tetradenstadien der Entwicklung exprimiert wird. G9-Promotorsequenzen wurden unter Einsatz allgemeiner Verfahren wie oben beschrieben isoliert. Kurz gefasst wurde G9-cDNA mittels subtraktiver Hybridisierungstechniken unter Einsatz einer MaisährenScdhössling-cDNA-Bibliothek (corn ear shoot cDNA library) und einer cDNA-Bibliothek aus männlichem-Blütenstand des Mais, bei der die meisten reifen Antheren in Meiose waren, erhalten. Die G9-cDNA wurde als Sonde zur Isolierung des G9-genomischen Klons eingesetzt. Die Orientierung der genomischen Sequenzen, die mit dem G9-cDNA-Klon übereinstimmten, wurde bestimmt und die Stromaufwärtsregion des G9-Gens wurde sequenziert.
Studien mit an ein Luziferasereportergen fusionierten G9- Stromaufwärtssequenzen zeigten an, dass der G9-Promotor Genexpression in Antheren während der Meiose und bis zum Tetradenstadium der Entwicklung induziert. Siehe Fig. 8. Deletionsanalysen identifizierten ein 289 Basenpaar- Fragment, das sich von dem Translationsstart bis 192 Nukleotide stromaufwärts von der mutmaßlichen TATA-Box erstreckt und das den G9-Promotor enthält.
Die Nukleotidsequenz des 289 Basenpaar-G9-Promotors ist in Fig. 9 dargestellt [SEQ ID NR.: 2].
Ein Expressionsvektor, der die folgenden Elemente in Reihenfolge umfasst wurde konstruiert: das 94-Basenpaar-Tapetum-spezifische regulatorische Element ("SGB6 Antherenspezifitätsbox"), der 289-Basenpaar-G9-Promotor und das Luziferasegen. Der Expressionsvektor wurde in Antherengewebe eingebracht und transiente Luziferasegenexpression wurde wie oben beschrieben untersucht.
Wie in Fig. 8 gezeigt, dehnte die Kombination des Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes und des G9-Promotors das Entwicklungsfenster für Luziferasegenexpression aus. Das chimäre regulatorische Konstrukt stellte Tapetum- spezifische Genexpression während der Meiose bis zum mittleren Einkernstadium der Entwicklung bereit.
Wenngleich sich das Vorangehende auf besonders bevorzugte Ausführungsformen bezieht, wird es verstanden sein, dass die vorliegende Erfindung nicht so beschränkt ist. Es wird dem Fachmann einfallen, dass an den offenbarten Ausführungsformen vielfache Änderungen vorgenommen werden können und dass diese Änderungen beabsichtigt sind, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu liegen, der von den folgenden Ansprüchen definiert wird.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt wurden, weisen auf den Grad der Kenntnisse des Fachmanns hin, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Publikationen und Patentanmeldungen werden hierdurch in der gleichen Weise per Referenz inkorporiert, als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch oder individuell angezeigt worden wäre, per Referenz in ihrer Gesamtheit inkorporiert zu werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: TAPETUM SPEZIFITÄT VERLEIHENDES REGULATORISCHES ELEMENT
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Foley & Lardner
(B) STRASSE: 3000 K Street, N. W., Suite 500
(C) STADT: Washington, D.C.
(D) LAND: U.S.A.
(E) PLZ: 20007-5109
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT/US95/
(B) ANMELDETAG: 20.APR.1995
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: BENT, Stephen A.
(B) REGISTRIERNUMMER: 29,768
(C) REFERENCE/PROZESSLISTENNUMMER: 33229/304/PIHI
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(D) TELEFON: (202) 672-5300
(E) TELEFAX: (202) 672-5399
(F) TELEX: 904136
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 94 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 292 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

Claims

1. Isoliertes DNA-Molekül, wobei das DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) SEQ ID NR.: 1 und (b) Fragmente von (a) umfasst, wobei das DNA-Molekül ein Tapetum- spezifisches regulatorisches Element ist.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das DNA-Molekül aus der Nukleotidsequenz der SEQ ID NR.: 1 besteht.

3. Expressionsvektor umfassend ein Tapetum-spezifisches regulatorisches Element nach Anspruch 1.

4. Expressionsvektor nach Anspruch 3, ferner umfassend einen Promotor, wobei die Funktion des Promotors unter der Kontrolle des Tapetum- spezifischen regulatorischen Elements steht.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem SGB6-Kernpromotor, welcher aus ungefähr 37 Nukleotiden 5'-wärts von der Transkriptionsstartstelle des SGB6-Genes besteht, und dem CaMV-35S-Kernpromotor.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Promotor der in Anspruch 5 definierte SGB6-Kernpromotor ist.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Promotor ein isoliertes DNA-Molekül ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) SEQ ID NR.: 2;

(b) einer Nukleotidsequenz, die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NR.: 2 hat; und

(c) Fragmenten von (a) oder (b), ist,

wobei das genannte DNA-Molekül ein Promotor eines Antheren- spezifischen Genes ist, das während der meiotischen bis Tetraden-Stadien der Entwicklung exprimiert wird.

8. Expressionsvektor nach Anspruch 4, weiterhin umfassend ein fremdes Gen, wobei das fremde Gen mit dem Promotor funktionsfähig verknüpft ist.

9. Expressionsvektor nach Anspruch 8, wobei das Produkt des fremden Genes die Funktion der Tapetumzellen stört.

10. Verwendung des Expressionsvektors nach Anspruch 9 zur Herstellung einer männlich-sterilen Pflanze, umfassend die Schritte der Einführung des Expressionsvektors in embryogene Pflanzenzellen, wobei das fremde Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Strukturgen, einem Antisense-Gen, einem Ribozym-Gen und einem Externen Leitsequenz- Gen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Strukturgen ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diphtherietoxin, Aspergillus oryzae RNase-T1, Barnase und Callase kodiert.

12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Produkt des Antisense-Genes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Callase-Antisense-RNA und Chalconsynthase-A-RNA.

13. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Ribozym-Gen Callasenukleotidsequenzen umfasst.

14. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das externe Leitssequenz-Gen Callasenukleotidsequenzen umfasst.

15. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die embryogenen Pflanzenzellen embryogene Maiszellen sind.

16. Transgene Pflanze umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 9.

17. Verfahren zur Herstellung einer männlich-sterilen Pflanze, umfassend die Schritte:

(a) Konstruieren eines Expressionsvektors umfassend ein Tapetum- spezifisches regulatorisches Element, einen Promotor und ein fremdes Gen, wobei das Tapetum-spezifische regulatorische Element eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) SEQ ID NR.: 1 und (ii) Fragmente von (i) umfasst,

wobei das Tapetum-spezifische regulatorische Element in Verbindung mit dem Promotor die Expression des fremden Genes kontrolliert und wobei das Produkt des fremden Genes die Funktion der Tapetumzellen stört und dadurch eine männlich-sterile Pflanze hergestellt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, weiterhin umfassend den Schritt:

(b) Einführen des Expressionsvektors in embryogene Pflanzenzellen.

19. Verwendung eines Tapetum-spezifischen regulatorischen Elementes zur Herstellung einer männlich-fertilen Hybridpflanze, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer ersten männlich-sterilen Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der das Tapetum-spezifische regulatorische Element nach Anspruch 1, einen Promotor und ein erstes fremdes Gen umfasst, wobei das genannte Tapetum-spezifische regulatorische Element in Verbindung mit dem Promotor die Expression des ersten fremden Genes kontrolliert und wobei das Produkt des ersten fremden Genes die Funktion der Tapetumzellen stört;

(b) Herstellen einer zweiten Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der das Tapetum-spezifische regulatorische Element, einen Promotor und ein zweites fremdes Gen umfasst, wobei das Tapetum- spezifische regulatorische Element in Verbindung mit dem Promotor die Expression des zweiten fremden Genes kontrolliert; und

(c) Fremdbefruchten der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Herstellung einer Hybridpflanze,

wobei die Tapetumzellen der Hybridpflanze das zweite fremde Gen exprimieren und wobei das Produkt des zweiten fremden Genes die Störung der Tapetumfunktion durch das Produkt des ersten fremden Genes verhindert, wodurch eine männlich-fertile Hybridpflanze hergestellt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das erste fremde Gen Barnase kodiert und das zweite fremde Gen einen Barnaseinhibitor kodiert.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Produkt des ersten fremden Genes Diphtherietoxin ist und das Produkt des zweiten Genes ein Diphtherietoxin-Ribozym ist.