Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft eine Zentrifugenvorrichtung zum
Abtrennen glnef Komponente, wie Fibrinmonomer von Plasma, wobei
das Verfahren die Behandlung von Plasma mit einem oder mehreren
Reagenzien beinhaltet, wobei die Reagenzien an eine geeignete
Reaktionskammer geliefert werden, die das Plasma enthält und wo
daher solche Reagenzien aus einem gewünschten Produkt durch
eine neuartige Zentrifugalfiltrationsvorrichtung und ein
neuartiges Zentrifugalfiltrationsverfahren entfernt werden.
Technischer Hintergrund
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EP-PS Nr. 592,242 beschreibt Verfahren und
Zusammensetzungen für ein vollständig neuartiges Fibrindichtungsmittel, die
beinhalten, eine gewünschte Stelle mit einer Zusammensetzung in
Kontakt zu bringen, die Fibrinmonomer aufweist, und dieses
Fibrinmonomer gleichzeitig mit dem Kontaktschritt in ein
Fibrinpolymer umzuwandeln. Der Ausdruck "Fibrin" ist als Fibrin I, Fibrin
II, und/oder des-ββ-Fibrin definiert.
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Ferner ist aus der US-Patentanmeldung Nr. 155,984 ein
Verfahren zum Abtrennen einer Komponente bekannt, wie
Fibrinmonomer aus Blut. Dieses Verfahren zum Abtrennen der Komponenten
aus einer Flüssigkeit, die mehrere Komponenten variierender
spezifischer Gewichte enthält, beinhaltet die Schritte, daß das
Blut in einer ersten Kammer einer Vorrichtung gesammelt wird,
wobei die Kammer durch eine im wesentlichen achsensymmetrische
Außen- und Innenwand definiert wird. Das Blut wird durch eine
Rotation der Vorrichtung um die Symmetrieachse der Kammer einer
Zentrifugierung unterzogen, um eine konzentrische Grenzfläche
zwischen den Komponenten des Blutes herzustellen. Mindestens
eine der Komponenten des Blutes, wie Plasma, wird anschließend
vorzugsweise durch eine Verminderung des Volumens der ersten
Kammer während einer fortgesetzten Zentrifugierung der
Vorrichtung in eine zweite Kammer in der Vorrichtung überführt. Die im
wesentlichen achsensymmetrische Innenwand ist in der ersten
Kammer vorgesehen, um sicherzustellen, daß das gesamte Blut
einer Zentrifugalrotation unterzogen wird, die notwendig für
die Abtrennung ist. Diese Innenwand weist einen Radius auf,
welcher der gewünschten Rotationsgeschwindigkeit angepaßt ist.
In der zweiten Kammer wird vom Plasma eine Fraktion mit
nicht-vernetztem Fibrinpolymer mittels eines geeigneten Enzyms
abgetrennt und anschließend in Fibrinmonomer wiederaufgelöst
und durch einen Filter in eine Spritze überführt, indem das
Volumen der zweiten Kammer reduziert wird.
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Es stellte sich jedoch heraus, daß die Abtrennung einer
Komponente, wie Fibrin I aus Blut nur durch Filtration in einer
Vorrichtung des obigen Typs kein zufriedenstellendes Ergebnis
liefert. Dies ist hauptsächlich auf die Tatsache
zurückzuführen, daß es schwierig ist, eine zufriedenstellende Abtrennung
der Fibrin-I-enthaltenden Fraktion in der zweiten Kammer
sicherzustellen, und folglich geht eine verhältnismäßig große
Menge des Gehaltes im Blut von Fibrin I während der folgenden
Überführung einer Fluidfraktion von der zweiten Kammer zur
ersten Kammer während des nachfolgenden Schrittes des
Verfahrens verloren.
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Auch erzeugte im früheren Fibrinmonomer-Verfahren die oben
beschriebene Behandlung des Fibrinogens innerhalb des Plasmas
mit einem geeigneten Enzym das nicht-vernetzte Fibrinpolymer in
der Form einer dicken Gelmasse am Boden der zweiten Kammer, um
die gewünschte Fibrinmonomer-Lösung bereitzustellen, war eine
beträchtliche Menge des wiederauflösenden Puffers kombiniert
mit beträchtlichen Rühren erforderlich. Dies führte zu mehreren
Nachteilen. Erstens benötigen bevorzugte
Fibrinmonomer-Verfahren, z. B. zur Verwendung als ein Fibrindichtungsmittel, wie in
EP 592,242, konzentrierte Fibrinmonomer-Lösungen, und die
erforderliche große Menge des wiederauflösenden Puffers oder
Lösungsmittels, um die Gelmasse aufzulösen, lieferte verdünnte
Lösungen, die nicht ebenso gut arbeiteten. Ferner kann das
beträchtliche Rühren, das notwendig ist, um die Gelmasse in
1 einer Fibrinmonomer-Lösung aufzulösen, eine Beschädigung der
Vorrichtung und des Fibrins selbst verursachen.
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WO 91/17778 offenbart eine Vorrichtung zur Herstellung
eines Konzentrats von Gerinnungsfaktoren, wie Fibrinogen aus
einer Blutprobe. Die Vorrichtung weist eine erste Kammer zur
Abtrennung einer Plasmafraktion und eine zweite Kammer zum
Sammeln des Plasmas und zur Ausfällung eines Konzentrats auf. Die
erste Kammer wird durch einen Kolben definiert, der sowohl in
Verbindung mit der Blutprobensammlung und der Überführung der
Fraktion in die zweite Kammer als auch beim Zurückführen der
Plasma-Fraktion in die erste Kammer nach der Ausfällung des
Konzentrats verschiebbar ist.
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WO 93/09753 offenbart einen Behälter zum Aufnehmen und
Trennen von Blut-Plasma in seine Bestandteile. Der Behälter
weist zwei Sektionen auf, die durch einen Kanal miteinander
verbunden sind, der an jedem Ende Ventilsitze aufweist.
Ventilelemente erzeugen dichte Verschlüsse der Kammern, wobei die
ventilelemente aneinander stoßende Vorsprünge aufweisen, die eine
Trennung zwischen den Ventilelementen im gekoppelten Zustand der
Sektionen sicherstellen, jedoch in einer Position während einer
Trennungsbewegung der Behältersektionen kleiner als der Abstand
zwischen zugehörigen Ventilsitzen sind.
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Eine mitanhängige Anmeldung mit dem Titel "Method and
Device for Separating a Component Such as Fibrin I From Blood
Disease", die gleichzeitig hiermit eingereicht wurde, offenbart
eine Erfindung, die ein Verfahren einschließt, das für die
Abtrennung von nicht-vernetztem Fibrinpolymer aus einer
Plasmafraktion in einer zylindrischen Kammer sorgt, die während der
Zentrifugierung ausgeführt wird, wodurch das nicht-vernetzte
Fibrinpolymer an der Außenwand der Kammer niedergeschlagen
wird, wonach die verbleibende Fluidfraktion, die in der Kammer
gesammelt wird, aus der Kammer entfernt wird, und daß bewirkt
wird, daß die Fraktion mit nicht-vernetztem Fibrinpolymer, die
in der Kammer im wesentlichen niedergeschlagen an der Wand
bleibt, durch die Zugabe eines Lösungsmittels und durch
zentrifugales Rühren aufgelöst wird.
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Da die Behandlung des Plasmas mit dem Enzym während der
fortgesetzten Zentrifugierung ausgeführt wird, sorgt die
Zentrifugalkraft auf das sich ergebende nicht-vernetzte
Fibrinpolymer dafür, daß es als ein dünner Gelfilm ausgefällt wird, der
im wesentlichen an den Umfangswänden der Kammer haftet. Die
verbleibende Plasmaflüssigkeit schlägt sich am Boden der Kammer
nieder, wenn die Zentrifugierung gestoppt wird, und kann durch
irgendwelche geeigneten Mittel entfernt werden. Die gewünschte
Fibrinmonomer-Lösung wird danach bereitgestellt, indem eine
geeignete wiederauflösende Pufferlösung in die Kammer
eingebracht wird und der Puffer in der gelbeschichteten Kammer
zentrifugalem Rühren unterzogen wird. Dieses Verfahren stellt
Vorteile gegenüber dem früheren Verfahren bereit. Erstens ist die
die Wiederauflösung des nicht-vernetzten Gels durch die
Pufferlösung äußerst effizient, teilweise infolge des großen
Oberflächenbereiches desselben Volumens Fibringels verglichen mit der
Fibringelmasse, die im früheren Verfahren bereitgestellt wird.
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Demzufolge kann das Gel mit kleinen Mengen wiederauflösenden
Puffers aufgelöst werden, was zu einer wünschenswerten
konzentrierten Fibrinmonomer-Lösung führt. Ferner ist die Wirkung des
zentrifugalen Rührens auf die Pufferlösung in der
gelbeschichteten Kammer ein vergleichsweise schonendes Verfahren, das
keine Beschädigung der Anlage oder des Fibrinmonomer-Produkts
verursacht.
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Die mitanhängige Erfindung schließt auch ein Verfahren ein,
welches beinhaltet, Blut vorzugsweise in der Gegenwart einer
gerinnungshemmenden Substanz einer ersten Ringkammer in einer
Vorrichtung zuzuführen, wobei die Ringkammer durch eine
zylindrische Außenwand und eine zylindrische Innenwand, wobei sich
beide Wände koaxial um eine gemeinsame Achse erstrecken, als
auch durch eine obere Wand und eine untere Wand definiert ist,
wobei die obere Wand oder die untere Wand durch einen
Kolbenkörper gebildet wird, der in der ersten Kammer verschiebbar
ist, wobei das Verfahren ferner eine Zentrifugierung der
Vorrichtung um die gemeinsame Achse beinhaltet, um im wesentlichen
Blut in eine Zellfraktion und eine Plasmafraktion zu trennen,
dem folgt, daß die sich ergebende Plasmafraktion, während sie
durch den Kolbenkörper beeinflußt wird, in eine zweite Kammer
überführt wird, die durch eine äußere zylindrische Wand
definiert wird, die sich koaxial mit der gemeinsamen Achse
erstreckt, wodurch bewirkt wird, daß eine Fraktion mit
nichtvernetztem Fibrinpolymer in der zweiten Kammer abgetrennt wird,
während ein geeignetes Enzym hinzugegeben wird. Dieses
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die fibrinogenenthaltende
Plasmafraktion während der Zentrifugierung dem Enzym ausgesetzt
wird, so daß das sich ergebende nicht-vernetzte Fibrinpolymer
auf der zylindrischen Außenwand der zweiten Kammer
niedergeschlagen wird, wonach die Fluidfraktion, die am Boden der zweiten
Kammer gesammelt wird, während sie durch den Kolbenkörper
beeinflußt wird, in die erste Kammer überführt wird, und daß
bewirkt wird, daß die Fraktion mit nicht-vernetztem
Fibrinpolymer, die in der zweiten Kammer bleibt, die im wesentlichen
auf der zylindrischen Wand niedergeschlagen wird, durch Zugabe
eines Lösungsmittels und durch zentrifugales Rühren aufgelöst
wird. Danach kann das Enzym entfernt werden, falls gewünscht,
und die so erzeugte Fibrinmonomer-Lösung wird zu irgendeinem
gewünschten Aufnahmebehälter überführt.
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Folglich wird leicht ein keimfreier Zustand zur Sammlung
der Lösung aufrechterhalten. Nachdem das Fibrinmonomer
wiederaufgelöst worden ist, kann es zum weiteren Gebrauch zu einem
Aufnahmebehälter überführt werden, wie einer Spritze, wie im
Stand der Technik beschrieben. Vör der Überführung kann das
Enzym durch irgendein geeignetes Mittel entfernt werden.
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Die obige mitanhängige Anmeldung offenbart ferner eine
Vorrichtung zum Abtrennen von Komponenten aus einer Flüssigkeit
durch Zentrifugierung um eine zentrale Rotationsachse, die eine
erste Ringkammer aufweist, die durch eine äußere zylindrische
Wand und eine innere zylindrische Wand, wobei beide Wände
konzentrisch um die Rotationsachse angeordnet sind, als auch durch
eine obere Wand und eine untere Wand definiert wird, wobei die
untere Wand durch einen Kolbenkörper gebildet wird, der
innerhalb der ersten Kammer verschiebbar ist, wobei die Vorrichtung
ferner eine zweite Kammer aufweist, die mit der ersten Kammer
durch eine erste Leitung in Verbindung steht und durch eine
äußere zylindrische Wand, die konzentrisch um die
Rotationsachse angeordnet ist, und durch den Kolbenkörper und eine
untere Wand definiert wird, wobei die zweite Kammer angepaßt
ist, während der Zentrifugierung unter der ersten Kammer
angeordnet zu werden, und wobei die Vorrichtung auch eine Blutzufuhreinrichtung
zum Zuführen von Blut zur ersten Kammer und
eine Zusammensetzungs-Zufuhreinrichtung zum Zuführen einer
Zusammensetzung, welche die Abtrennung unterstützt, als auch
eine Aufnahmeeinrichtung für die Verbindung von mindestens
einem Flüssigkeits-Aufnahmebehälter aufweist, wobei die
Aufnahmeeinrichtung mit der zweiten Kammer durch eine zweite
Leitung in Verbindung steht. In einer bevorzugten Ausführungsform
weist die Kolbenstange die Innenwand der ersten Kammer auf.
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Diese erfinderische Vorrichtung zum Ausführen der
Verfahrens gemäß der mitanhängigen Erfindung ist dadurch
gekennzeichnet, daß die erste Leitung mindestens einen Kanal aufweist, der
sich zwischen einer Öffnung an der oberen Wand der erste Kammer
und einer Öffnung an der untere Wand der zweiten Kammer
erstreckt.
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Als Ergebnis wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die
verhältnismäßig einfach ist und die unabhängig von der Position
des Kolbens eine leichte und schnelle Überführung der
fraglichen Fraktionen von einer Kammer zur anderen Kammer, und
insbesondere der Fluidfraktion von der zweiten Kammer zur ersten
Kammer nach der Abtrennung der Fibrin-I-enthaltenden Fraktion
sicherstellt. Das Letztgenannte ist insbesondere auf die
Tatsache zurückzuführen, daß das Fluid automatisch am Boden der
zweiten Kammer konzentriert wird, wenn die Zentrifugierung
gestoppt wird, wodurch es leicht zur ersten Kammer überführt
werden kann, indem der Kolben bewegt wird.
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Gemäß der mitanhängigen Erfindung wird besonders bevorzugt,
daß der mindestens eine Kanal sich durch das Innere der äußeren
zylindrischen Wand in sowohl die erste als auch die zweite
Kammer erstreckt, mit dem Ergebnis, daß die Vorrichtung besonders
einfach und leicht herzustellen ist.
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Ferner kann die Öffnung des Kanals an der unteren Wand der
zweiten Kammer zentral in der Kammer in Verbindung mit einer
Aussparung angeordnet sein, die durch die untere Wand gebildet
wird. Als Ergebnis wird die fragliche Fluidfraktion leicht und
schnell direkt zur Einlaßöffnung des Kanals geleitet.
Alternativ kann jeder Kanal durch ein Rohr gebildet werden, das sich
geradlinig durch den Kolbenkörper erstreckt und an den Enden in
der oberen Wand der ersten Kammer bzw. der unteren Wand der
zweiten Kammer befestigt ist, wo es mit Kanalabschnitten in
Verbindung steht, die in der jeweiligen Kammer enden.
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Zusätzlich kann die erste und die zweite Kammer in einer
besonders einfachen Weise eine gemeinsame äußere zylindrische
Wand aufweisen, die durch einen äußeren und einen inneren
Zylinder geformt ist, die abdichtend ineinander passen und
dazwischen einen sich axial erstreckenden Kanal bilden, und die
Zylinder können an einem Ende durch eine Endwand abgeschlossen
werden, die eine Öffnung aufweist, die den Durchgang einer
Kolbenstange zuläßt, die mit dem Kolbenkörper verbunden ist, wobei
der Kolbenkörper die untere Wand der ersten Kammer bildet und
die erste Kammer von der zweiten Kammer trennt, und wobei der
Kanal sich zwischen den Endwänden der Zylinder zu einer der
Kolbenstange unmittelbar benachbarten Öffnung erstreckt.
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Bei der Verwendung einer solchen Vorrichtung und eines
solchen Verfahrens, wurden geeignete Reagenzien zur Vereinfachung
der Abtrennung und Behandlung der gewünschten Komponenten im
Blutplasma in die zweite Kammer vorgeladen. Zum Beispiel
beschreibt EP 592,242, daß das Biotin-Avidin-Einfangsystem
praktisch verwendet werden kann, um das Batroxobin aus der
gewünschten Lösung zu entfernen. Es ist erforderlich, daß das
Biotin-Batroxobin in der zweiten Kammer vorhanden ist, um mit
dem Fibrinogen im Plasma zu reagieren und es in ein
Fibrinmonomer umzuwandeln (das sich sofort in ein Fibrinpolymer umwandelt).
Um danach das biotinylisierte Batroxobin unter
Verwendung des Biotin-Avidin-Systems einzufangen, muß Avidin, das zum
Beispiel an Agarose gebunden ist, ebenfalls in der zweiten
Kammer vorhanden sein. In einer geschlossenen, automatisierten
Zentrifugenvorrichtung müssen diese Mittel vor der
Blutverarbeitung in die Vorrichtung geladen werden. Das Vorladen des
biotinylisierten Batroxobins und der Avidin-Agarose in dieselbe
Kammer hat Schwierigkeiten bereitet, da die hohe Affinität des
Avidins auf das Biotin, auf die man zum Enzymeinfang angewiesen
ist, verhindert, daß ausreichende Mengen des Enzym zuerst mit
dem Fibrinogen reagieren, wie es erforderlich ist.
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Eine zweite mitanhängige Anmeldung, die gleichzeitig
hiermit eingereicht wurde, mit dem Titel "Centrifuge with Annular
Filter" beschreibt eine Vorrichtung, die es möglich macht, eine
oder mehrere Reagenzien einfach innerhalb der Reaktionskammer
anzuordnen und solche Reagenzien in einer gewünschten
Reihenfolge freizusetzen. Vorzugsweise, wenn sie in einer Vorrichtung
der beschriebenen Art in der obenerwähnten mitanhängigen
Anmeldung verwendet werden, können Reagenzien, wie ein Enzym und
eine Enzym-Einfang-Zusammensetzung wie gewünscht freigesetzt
werden. In Erfüllung der vorhergehenden Aufgabe wird
erfindungsgemäß eine Vorrichtung bereitgestellt, die dadurch
gekennzeichnet ist, daß eine Kapsel in der zweiten Kammer angeordnet
wird und mehrere Kompartimente zur Aufnahme jeweiliger
Zusammensetzungen aufweist, welche die Abtrennung unterstützen, und
daß die Kapsel Verschlußeinrichtungen aufweist, welche die
Kompartimente abschließen und, während sie durch den Kolben
beeinflußt werden, angepaßt sind, sich der Reihe nach für die
Freisetzung der Inhalte der Kompartimente zu öffnen.
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Eine solche Kapsel macht es möglich, in einer einfachen und
leichten Weise die für die Abtrennung des Fibrin I notwendigen
Substanzen zuzuführen, wobei die Kapsel vorzugsweise im voraus
mit diesen Substanzen versehen wird. Zusätzlich lassen die
vorgesehenen Kompartimente eine einheitliche vorbestimmte
Dosierung der fraglichen Menge zu. Das Batroxobin wird vorzugsweise
in einem Kompartiment in einer chemischen Beziehung mit Biotin
angeordnet, was dafür sorgt, daß das Enzym-Batroxobin nach dem
Gebrauch mittels Avidin leicht eingefangen werden kann, was
daher im zweiten Kompartiment in einer chemischen Beziehung mit
Agarose in Form verhältnismäßig großer Teilchen angeordnet
wird. Die hohe Affinität des Biotins auf das Avidin sorgt dafür,
daß komplexierte biotinylisierte Batroxobin/Avidin-Agarose-
Teilchen anschließend ohne weiteres durch Filtration aus der
Fibrin-I-Lösung entfernt werden. Die Anordnung der beiden
Substanzen in ihrem jeweiligen Kompartiment macht es auch möglich,
die Substanzen zu den gewünschten Zeiten durch Beeinflussung
der Kolben zu dosieren. Die obigen Substanzen oder
Zusammensetzungen, Biotin-Batroxobin, bzw. Avidin-Agarose können in jeder
geeigneten Form verwendet werden, z. B. in lyophilisierter
Pulverform.
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Gemäß der mitanhängigen Reagenz-Liefersystem-Erfindung,
wird besonders bevorzugt, daß die Kapsel ein Mittelnabe
aufweist, die koaxial im Inneren der zweiten Kammer angebracht ist
und drei gegenseitig beabstandete radiale Scheiben trägt, die
Aufteilungen in den Kompartimenten bilden und eine im
wesentlichen identische äußere Umfangskontur aufweisen, und daß die
Verschlußeinrichtungen durch einen büchsenförmigen Körper
gebildet werden, der verschiebbar, jedoch abdichtend die
radialen Scheiben umgibt.
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Zum Aktivieren des büchsenförmigen verschiebbaren Körpers
kann der Kolben erfindungsgemäß vorteilhafterweise eine nach
unten weisende Einfassung aufweisen, die mit dem büchsenförmigen
Körper an der Kapsel zusammenwirken, um den büchsenförmigen
Körper schrittweise zu verschieben, wodurch sich der Körper der
Reihe nach zur Freisetzung der Inhalte der Kompartimente
innerhalb der Kapsel öffnet.
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Gemäß der mitanhängigen Reagenz-Liefersystem-Erfindung
kann die Kapsel in Verbindung mit einem axialen Durchgang zu
einer benachbarten dritten Kammer angeordnet sein, wobei die
Außenseite des büchsenförmigen Körpers der Kapsel mindestens
nach einer anfänglichen Verschiebung des Körpers abdichtend an
die Seitenwand des axialen Durchgangs stößt, wodurch die
unterste Aufteilung der Kapsel einen freien Durchgang der
Flüssigkeit von der zweiten Kammer zur dritten Kammer nach einer
Endverschiebung des büchsenförmigen Körpers zuläßt, die durch den
Kolben bewirkt wird, der außerhalb seines Eingriffs mit dem
Umfang der untersten Aufteilung befindet. Auf diese Weise
bildet die Kapsel in einer vorteilhaften Weise ferner einen Teil
der Vorrichtung und hilft der Vorrichtung bei ihrem weiteren
Betrieb während der Abtrennung des Fibrins I.
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Um ferner einen integrierten Teil der Vorrichtung zu
bilden, kann die Nabe der Kapsel erfindungsgemäß einen axialen,
durchgehenden Durchgang aufweisen und an einem nach oben
gerichteten Vorsprung befestigt sein, der zentral im Boden der
unteren, dritten Kammer angeordnet ist, wobei der durchgehende
Durchgang am Boden flüssigkeitsmäßig mit dem äußeren
Ringkompartiment der dritten Kammer durch ein Kanalsystem in
Verbindung steht, und das obere Ende der Nabe kann angepaßt sein, mit
einem axialen Durchgang im Kolbenkörper abdichtend verbunden zu
sein, um mit einem daran befestigbaren
Flüssigkeits-Aufnahmebehälter verbunden zu sein.
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Um das eine oder die mehreren Reagenzien aus der
gewünschten Produktlösung zu entfernen, wird die sich ergebende Fibrin-
I-enthaltende Fluidfraktion durch einen Filter in eine Spritze
überführt, während sie durch den Kolben beeinflußt wird. Als
Ergebnis wird die Lösung von Fibrin I durch den Filter gedrückt,
während das Enzym und andere Substanzen, die zur Beschleunigung
der Abtrennung zugemischt werden, durch den Filter
zurückgehalten werden. Die sich ergebende Ausbeute von Fibrin I ist jedoch
nicht völlig zufriedenstellend, wenn sie mit der Menge von
Fibrin I verglichen wird, die in einer Blutproben vorhanden
ist.
Zusammenfassung der Erfindung
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Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren
bereitzustellen, das es möglich macht, eine höhere Ausbeute von
Fibrin I mittels einer Vorrichtung des Typs zu erzielen, die
behandelt wird.
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In Erfüllung der vorhergehenden Aufgabe wird
erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß der Teil der Flüssigkeitsfraktion, der in der zweiten
Kammer bleibt, vor der Überführung in den
flüssigkeitsaufnehmenden Behälter in eine dritte Kammer überführt wird, die
koaxial mit den anderen Kammern angeordnet ist, und daß bewirkt
wird, daß die nun in der dritten Kammer vorhandene Flüssigkeit
während der Zentrifugierung durch einen Ringfilter geht, um in
ein Ringaußenkompartiment einzutreten, das angepaßt ist, mit
dem flüssigkeitsaufnehmenden Glied verbunden zu werden. Als
Ergebnis kann die Fibrin-I-Lösung durch einen Filter unter dem
Einfluß der Zentrifugalkraft geschickt werden, was bedeutend
effektiver ist, als eine Filtration mittels des Kolbens.
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Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zum
Ausführen des obigen Verfahrens. Die erfinderische Vorrichtung weist
eine erste Ringkammer auf, die durch eine äußere zylindrische
Wand und eine innere zylindrische Wand, wobei beide Wände
konzentrisch
um die Rotationsachse angeordnet sind, und durch eine
obere Wand und eine untere Wand definiert wird, wobei die obere
Wand oder die untere Wand durch einen innerhalb der ersten
Kammer verschiebbaren Kolbenkörper gebildet wird, wobei die
Vorrichtung ferner eine zweite Kammer aufweist, die mit der ersten
Kammer durch eine erste Leitung in Verbindung steht und durch
eine äußere zylindrische Wand, die konzentrisch um die
Rotationsachse angeordnet ist, die untere Wand der ersten Kammer und
eine weitere untere Wand definiert wird, wobei die zweite
Kammer angepaßt ist, während der Zentrifugierung unter der ersten
Kammer angeordnet zu werden, und wobei die Vorrichtung auch
eine Blutzufuhreinrichtung zum Zuführen von Blut in die erste
Kammer und eine Zusammensetzungs-Zufuhreinrichtung zum
Zuführen von Zusammensetzungen, welche die Abtrennung unterstützen,
als auch eine Aufnahmeeinrichtung für die Verbindung von
mindestens einem Flüssigkeits-Aufnahmebehälter aufweist, wobei
die Aufnahmeeinrichtung mit der zweiten Kammer durch eine
zweite Leitung in Verbindung steht.
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Diese Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch
gekennzeichnet, daß die zweite Leitung mit der zweiten Kammer durch eine
dritte Kammer in Verbindung steht, die relativ dazu koaxial
angeordnet ist und einen Durchgang zur zweiten Kammer aufweist,
der von außen geöffnet werden kann, daß die dritte Kammer ein
inneres Kompartiment und ein äußeres Ringkompartiment aufweist,
wobei die Kompartimente durch einen sich radial erstreckenden
Umfangsdurchgang miteinander verbunden sind, in dem ein
Ringfilter angeordnet ist, um den Durchgang einer Flüssigkeit zu
verhindern, die unerwünschte Bestandteile enthält, die zum
Unterstützen der Abtrennung verwendet werden.
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Erfindungsgemäß kann der Durchgang zwischen der zweiten und
der dritten Kammer relativ zu den beiden Kammern koaxial angeordnet
sein und wird mittels einer Kapsel verschlossen, die in
der obenerwähnten mitanhängigen Patentanmeldung mit dem
"Centrifuge Reagent Delivery System" offenbart wird. Diese
Kapsel weist eine Mittelnabe auf, die koaxial in der zweiten Kammer
angebracht ist und die mehrere von voneinander beabstandeten
radialen Scheiben trägt, die Aufteilungen in mehreren
Kompartimenten in der Kapsel bilden, wobei die Scheiben eine
identische äußere Umfangskontur aufweisen, daß die Kompartimente nach
außen mittels eines dichtenden, verschiebbar angebrachten,
hülsenförmigen Körpers verschlossen sind, dessen Außenseite
angepaßt ist, abdichtend an die Seitenwand des axialen
Durchgangs anzustoßen, wobei die unterste aufteilungsbildende
Scheibe der Kapsel einen freien Durchgang von Flüssigkeit von
der zweiten Kammer in die dritte Kammer durch eine axiale
Verschiebung des hülsenförmigen Körpers aus seinem Eingriff mit
dem Umfang der untersten Aufteilung zuläßt, während er durch
den Kolben beeinflußt wird. Als Ergebnis wird ein leichter und
einfacher Zugang zum fraglichen Filter mittels einer Kapsel
erhalten, die schon zum Zuführen der Substanzen verwendet wird,
die notwendig zur Unterstützung der Abtrennung von Fibrin I
innerhalb der zweiten Kammer sind.
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Diese Kapsel wird vorzugsweise durch den Kolbenkörper
aktiviert, der eine nach unten gerichtete Einfassung aufweist, die
sich koaxial mit dem hülsenförmigen Körper der Kapsel
erstreckt und angepaßt ist, mit dem Körper in Eingriff zu
treten, wenn der Kolbenkörper nach unten gedrückt wird, um dadurch
der Reihe nach zu geeigneten Momenten die jeweiligen
Kompartimente in der Kapsel zu öffnen und schließlich den Durchgang von
Flüssigkeit von der zweiten Kammer in die dritte Kammer zu
öffnen.
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Um das Überführen der Fibrin I-Lösung in einen Flüssigkeits-Aufnahmebehälter,
wie einer Spritze zu erleichtern, kann
die Nabe der Kapsel erfindungsgemäß einen axialen,
durchgehenden Durchgang aufweisen und an einem nach oben gerichteten
Vorsprung befestigt sein, der zentral im Boden der unteren dritten
Kammer angeordnet ist, wobei der durchgehende Durchgang
flüssigkeitsmäßig in mit dem äußeren Ringkompartiment der dritten
Kammer durch eine Kanalsystem Verbindung steht, und das obere
Ende der Nabe kann angepaßt sein, um abdichtend mit einem
Durchgang im Kolbenkörper verbunden zu sein, um mit einem darin
befestigbaren Flüssigkeits-Aufnahmebehälter verbunden zu sein.
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Schließlich kann die Nabe der Kapsel erfindungsgemäß an dem
Vorsprung im Boden der dritten Kammer mittels einer Hülse
befestigt sein, die an jedem Ende die Nabe bzw. den Vorsprung
umgibt, und die Hülse kann einen nach außen vorstehenden
Umfangswandabschnitt aufweisen, wodurch der Ringfilter
zwischen dem Außenumfang der Wandfläche und der unteren Wand der
zweiten Kammer befestigt ist, wodurch der nach außen
vorstehende Wandabschnitt der Hülse in einem Abstand vom Boden der
dritten Kammer angeordnet ist und dadurch die Verbindung
zwischen dem äußeren Ringkompartiment und einem sich axial
erstreckenden Kanal bildet, der in Verbindung mit dem
durchgehenden Durchgang der Nabe steht und sich zwischen der
Außenseite des Vorsprungs und der benachbarten Innenseite der Hülse
erstreckt. Die sich ergebende Vorrichtung ist besonders
einfach.
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Die Verfahren der vorliegenden Erfindung befassen sich mit
verbesserten Prozessen zum Abtrennen und Isolieren einer
einzelnen Blutkomponente oder einer Lösung, die eine solche
Komponente enthält. Jedoch ist das vorliegende Verfahren für jede
Prozedur geeignet, die auf eine zylindrischen Zentrifuge
adaptierbar ist, wobei eine erste Lösung während einer Zentrifugierung
mit einem oder mehreren Katalysatoren oder Reagenzien
behandelt wird.
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Andere Blutverfahren, die aus einem solchen Verfahren
Nutzen ziehen können, umfassen die Isolation irgendeiner
Blutkomponente, wie
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plättchenreiches Plasma,
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Plättchenkonzentrat,
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cryoausgefälltes Fibrinogen,
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andere Proteine im Plasma, wie Thrombin, Fibronectin und
dergleichen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise
stammt das Blut von einem einzigen Spender und am meisten wird
es bevorzugt, daß das Blut von derselben Person stammt, der die
Blutkomponente verabreicht werden wird.
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Während die vorliegenden Verfahren im folgenden
hinsichtlich der Herstellung einer Fibrinmonomerlösung beschrieben
werden, sollte der Rahmen der Erfindung, wie durch Fachleute
erkannt werden wird, nicht so begrenzt sein.
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Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck
"zentrifugales Rühren" die Bewegung der Vorrichtung, in welche die
Wiederauflösungspufferlösung eingebracht wird, um das
Zwischenprodukt, wie nicht-vernetztes Fibrinpolymergel, von den
äußeren Kammerwände wiederaufzulösen. Eine solche Bewegung oder
zentrifugales Rühren kann eine Zentrifugierung aufweisen, um
sicherzustellen, daß der gesamte freiliegende
Oberflächenbereich des Gels der Wiederauflösungslösung ausgesetzt ist, und
weist vorzugsweise eine solche Zentrifugierung auf, der sich
Stop-und-Start-Rotationen in dieselbe Richtung und/oder Stop-
und-Start-Rotationen in entgegengesetzte Richtungen
anschließen. Typisches zentrifugales Rühren weist 5-30 Sekunden
Drehungen, vorzugsweise 5-10 Sekunden Drehungen, bei 2000-5000 U/min
in wiederholten Vorwärts-/Rückwärtszyklen für jede gewünschte
Dauer auf, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In den
vorliegenden Verfahren werden 5-10 Sekunden Drehungen bei etwa 3000
U/min in wiederholten Vorwärts-/Rückwärtszyklen für 1-2 Minuten
bevorzugt. Wie vorher erwähnt, kann dies durch eine etwas
längere Drehung, z. B. 20 Sekunden oder mehr eingeleitet werden, um
das Lösungsmittel anfänglich zu verteilen.
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Der Ausdruck "Fibrin", wie er hierin verwendet wird,
bezeichnet Fibrin I, Fibrin II oder des-ββ-Fibrin. Die
vorliegende Vorrichtung, die das hierin offenbarte zentrifugale
Ringfiltersystem enthält, stellt ein effizientes und genaues
Verfahren zum Rückgewinnen von einer oder mehren Reagenzien aus
einer gewünschten Produktlösung bereit. Dies ist besonders
entscheidend in geschlossenen, unabhängigen, automatisierten
Zentrifugen zur Verwendung in Bluttrennungstechniken, wobei zwei
oder mehrere Reagenzien benötigt werden, um in eine
Reaktionskammer in einer aufeinanderfolgenden Weise eingebracht und
daher entfernt werden sollen. In den hierin beschriebenen
bevorzugten Verfahren und Vorrichtungen zum Bereitstellen einer
fibrinmonomerenthaltenden Lösung, z. B. zur Verwendung in einem
neuartigen Fibrindichtungsmittel, stellt die
aufeinanderfolgende Einleitung von biotinylisierten Batroxobin, gefolgt von
Avidin-Agarose in die plasmaenthaltende Kammer ein
hochentwickeltes Verfahren zur Herstellung einer solchen Lösung bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Es werden nun bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Vorrichtung und der Verfahren unter Bezugnahme auf die
Zeichnung beschrieben. Es zeigen:
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Fig. 1 eine axiale Schnittansicht durch eine bevorzugte
Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, und
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Fig. 2 eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung.
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Die vorliegende Vorrichtung ist eine einzelne, geschlossene
automatiserbare Vorrichtung, die fähig ist, Vollblut in
gewünschte Blutkomponenten, vorzugsweise autologene bzw. endogene Komponenten
umzuwandeln, die zum Beispiel als Fibrindichtungsmittel
nützlich sind.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung
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Vorzugsweise wird das vorliegende
Zentrifugen-Ringfiltersystem mit einer Vorrichtung eingesetzt, wie sie in den oben
bezeichneten mitanhängigen Anmeldungen abgedeckt wird, und es
wird daher unten unter Widerhall auf eine solche Vorrichtung
beschrieben. Jedoch sollte es zu verstehen sein, daß es in jeder
Reaktionskammer-Vorrichtung eingesetzt werden könnte, die eine
Entfernung von einer oder mehrern Reagenzien benötigt.
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Die Vorrichtung der Fig. 1 ist erfindungsgemäß aus Teilen
aufgebaut, die im wesentlichen eine Rotationssymmetrie
aufweisen und darauf hinauslaufen, daß die Vorrichtung in einer als
solche bekannten Zentrifugierungsvorrichtung in einer
einfachen Weise angeordnet werden kann, um um eine Mittelachse 1
zentrifugiert zu werden. In dieser Fig. 1 weist eine bevorzugte
Ausführungsform der Vorrichtung einen äußeren Behälter 2 und
einen inneren Behälter 3 auf, die so gestaltet sind, daß sie
vollständig ineinander passen und überall eng aneinander
anstoßen, abgesehen von dem Abschnitt, wo ein sich axial
erstreckender dazwischenliegender Kanal 4 vorgesehen ist. Der Kanal 4
wird durch eine Rille bereitgestellt, die im inneren Behälter
3 ausgebildet ist. Die beiden Behälter 2 und 3 weisen ihre
jeweilige oberen Abschnitte 5 bzw. 6 auf, die eine zentrale
Öffnung 7 definieren, die den Durchgang einer Kolbenstange 8
erlaubt. Um die Öffnung 7 weisen die beiden Behälter sich axial
erstreckende Teile 9 bzw. 10 auf, die sich nahe der hohlen Kolbenstange
8 in eine Richtung weg vom Inneren der Behälter
erstrecken. Der äußere Behälter 2 stößt an die hohle
Kolbenstange längs eines kurzen, sich radial erstreckenden Flansches
11 an, der mit einer Aussparung 12 versehen ist, die einen
Dichtungsring 13 aufnimmt.
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Wie in Fig. 1 dargestellt, setzt sich der Kanal 4 zwischen
dem inneren und dem äußeren Behälter über die ganze Strecke von
den äußeren zylindrischen Wänden des inneren und des äußeren
Behälters längs der oberen Abschnitte 5, 6 und den axialen
Teilen 9 und 10 zu der Öffnung unmittelbar unter dem Dichtungsring
13 in der Öffnung 7 fort. Der axiale Teil 10 des inneren
Behälters 3, der an die Öffnung 7 anstößt, ist so bemessen, daß ein
enger, aber freier Durchgang zum Inneren der Behälter 2 und 3
um die hohle Kolbenstange 8 vorhanden ist.
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Der äußere Behälter 2 weist einen zylindrischen Teil mit
einem einheitlichen Durchmesser auf, vergleiche Fig. 1. Nach
unten, wenn relativ zur Zeichnung betrachtet, setzt sich dieser
Teil in einen zylindrischen Teil 14 mit einem geringfügig
größeren Durchmesser durch ein kurzes Übergangsteil 15 fort, das
eine kegelstumpfförmige Innenfläche 16 bildet. Der innere
Behälter 3 endet an der Stelle, wo das Übergangsteil 15 des
äußeren Behälters 2 sich in den zylindrischen Teil 14 mit einem
größeren Durchmesser fortsetzt. Das untere Ende des inneren
Behälters 3 weist eine Außenfläche 17 mit einer
kegelstumpfförmigen Form auf, die zu der Form der kegelstumpfförmigen
Oberfläche 16 auf der Innenseite des äußeren Behälters 2 paßt. Eine
äußere und eine innere Ringscheibe 19 bzw. 20 sind unmittelbar
unter dem unteren Ende des inneren Behälters 3 vorgesehen, der
in einer radialen Oberfläche 18 endet. Diese Scheiben stoßen
eng aneinander an, abgesehen von der Tatsache, daß sie
dazwischen einen Kanal 21 definieren, der sich in einer axialen Ebene
von einer zentralen Öffnung 22 und nach vorn zur Innenseite des
äußeren Behälters 2 erstreckt, wo der Kanal 21 mit dem Kanal 4 ·
zwischen dem äußeren Behälter 2 und dem inneren Behälter 3 durch
ein sich axial erstreckendes Teil 23 in Verbindung steht. Der
Kanal 21 und der axiale Kanalteil 23 sind geeignet mittels einer
Rille in der Seite der inneren Scheibe 20 vorgesehen, die zur
äußeren Scheibe 19 weist. Die beiden Scheiben 19 und 20 sind
mit einem solchen schiefen Verlauf geformt, daß sie im
wesentlichen innere und äußere kegelstumpfförmige Oberflächen
aufweisen, vergleiche Fig. 1, und sich dadurch nach unten zur
zentralen Öffnung 22 hin neigen. Fig. 1 zeigt auch, daß die innere
Scheibe 20 eine radiale Oberfläche 24 aufweist, die an die
benachbarte radiale Oberfläche 18 am inneren Behälter 3
anstößt. Die radiale Oberfläche 24 der inneren Scheibe 20 ist
mit einer Aussparung 25 zum Aufnehmen eines Dichtungsrings 26
versehen.
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Die beiden Scheiben 19 und 20 werden in ihrer Position in
Anstoß gegen die radiale Oberfläche 18 des inneren Behälter 3
mittels einer Abdeckung 27 gehalten, die den äußeren Behälter
in die Abwärtsrichtung verschließt. Diese Abdeckung 27 weist
ein hülsenförimiges Umfangsteil 28 auf, das angepaßt ist, eng
an die Innenseite des äußeren Behälters 2 zu stoßen, an dem es
in einer geeigneten Weise befestigt ist, wie durch eine
Einschnappwirkung durch einen Eingriff zwischen einer Umfangsrippe
29 auf der Außenseite der Hülse 28 und einer entsprechenden
Umfangsrille 30 auf der Innenseite des äußeren Behälters 2.
Eine dichtende Verbindung wird mittels eines Dichtungsringes 31
in einer Umfangsaussparung 32 am äußeren Rand der äußeren
Scheibe 19 sichergestellt. Die Abdeckung 27 weist ferner eine
verhältnismäßig dünne Wand 32 auf, die angepaßt ist, den
unteren Boden der Vorrichtung in der in Fig. 1 gezeigten Position
zu bilden. Diese Wand 32 erstreckt sich im wesentlichen längs
eines Verlaufs parallel zur äußeren und der inneren Scheibe 19
und 20 in einer solchen Weise, daß sich die Wand 32 von der
Innenseite der Hülse 28 in einen Abschnitt benachbart zu den
Scheiben 19 und 20 und nach unten zu einem Abschnitt erstreckt,
der im wesentlichen auf einer Ebene mit dem unteren Kranz 33
des äußeren Behälters 2 befindet. Um diese verhältnismäßig
dünne Wand 32 zu verstärken, ist in regenmäßigen Abständen eine
verstärkende radiale Rippe 34 vorgehen, wobei nur eine der
Rippen in Fig. 1 erscheint. Diese Rippe 34 ist teilweise mit einem
Abschnitt, der außerhalb der Wand 32 angeordnet ist, und
teilweise mit einem Abschnitt ausgebildet, der innerhalb der Wand
32 angeordnet ist, vergleiche Fig. 1. Der letztgenannte
Abschnitt ist mit der Bezugsziffer 35 bezeichnet und so
geformt, daß er an die Unterseite der äußeren Scheibe 19
anstößt, mit dem Ergebnis, daß er dabei hilft, die Scheiben 19
und 20 in einer zuverlässigen Position zu halten.
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Eine Aufteilungseinrichtung 36 ist zwischen die äußere
Scheibe 19 und die Abdeckung 27 eingezwängt. Diese
Aufteilungseinrichtung 36 weist eine zentrale Rohrlänge 37 auf. Diese
Rohrlänge ist auf einem Stift 38 angebracht, der axial nach
innen versteht und integral mit der Wand 32 der Abdeckung 27
ausgebildet ist. Diese Rohrlänge 37 ist integral mit einer
Umfangswandscheibe 39 ausgebildet, die sich nach außen von der
Rohrlänge 37 in einer solchen Weise erstreckt, daß sie sich
anfänglich leicht nach unten zur Wand 32 der Abdeckung 27 hin
neigt, wonach sie sich längs eines kurzen axialen Verlaufs so
erstreckt, daß sich sie in einem Verlauf fortsetzt, der sich im
wesentlichen parallel zur Wand 32 der Abdeckung erstreckt. Die
Wandscheibe 39 endet in einem sich radial erstreckenden Rand
40, der auf einer Schulter 41 auf den Rippenabschnitten 35 auf
der Abdeckung 27 ruht. Eine Ringfiltereinheit 42 ist zwischen
dem äußeren Rand 40 der Wandscheibe 39 und der Unterseite der
äußeren Scheibe 19 eingezwängt. Diese Ringfiltereinheit 42
stößt an eine im wesentlichen radial geformte Oberfläche 43 auf
der benachbarten Außenseite der äußeren Scheibe 19 an. Eine
Vorrichtung und ein Verfahren, die einen solchen Ringfilter
einsetzen, sind der Gegenstand einer mitanhängigen Anmeldung,
die gleichzeitig hiermit eingereicht wurde, mit dem Titel
"Centrifuge with Annular Filter".
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Um eine Stabilität in der Aufteilungseinrichtung 36
sicherzustellen, sind ferner verstärkende radiale Rippen, die mit der
Bezugsziffer 44 bezeichnet sind, zwischen der Rohrlänge 37
angeordnet und der Wandscheibe 39 angeordnet.
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Das Reagenzliefersystem der vorliegenden Erfindung weist
eine Kapsel auf, die durch die allgemeine Bezugsziffer 45
bezeichnet wird, und ist an dem Ende befestigt, das der
Abdeckung 27 der Rohrlänge 37 der Aufteilungseinrichtung 36
gegenüberliegt. Eine solche Kapsel ist geeignet zur selektiven
Freigabe von Mitteln bzw. Agensien in die zweite Kammer 75. Diese Kapsel weist
eine längliche Rohrlänge 46 auf, die integral mit einem
radialen Ring 47 ausgebildet ist und zwei zusätzliche radiale Ringe
48 und 49 trägt. Diese radialen Ringe 48 und 49 sind durch einen
Preßsitz an ihrer jeweiligen Seite des festen Ringes 47
befestigt. Die losen Ringe 48 und 49 sind in ihrem jeweiligen
Abstand vom festen Ring 47 mittels Umfangsschultern 50 bzw. 51
an der Rohrlänge 46 angeordnet. Die drei Scheiben 47, 48 und 49
weisen alle denselben Außendurchmesser auf und tragen längs
ihren jeweiligen Rändern eine verschiebbar angebrachte
Umfangshülse 52.
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Wie in der Zeichnung dargestellt, stößt die untere Scheibe
49 an das obere Ende der Rohrlänge 37 der Aufteilungseinrichtung
36, wodurch die Position der Kapsel 45 in die axiale
Richtung festgelegt wird. Diese Position wird ferner in einer
solchen Weise festgelegt, daß wenn sie in die axiale Richtung
verschoben wird, die verschiebbare Hülse 52 der Kapsel durch ihr
unteres Ende mit der innersten Kante 53 auf der äußeren Scheibe
19 in die zentrale Öffnung 22 in einen dichtenden Eingriff
eintritt, vergleiche die Zeichnung. In dieser Position der Hülse
52 ist noch eine Verbindung zwischen dem Raum in der inneren
Scheibe 20, welche die Hülse 52 umgibt, und der Einlaßöffnung
des Kanals 21 zwischen der äußeren Scheibe 19 und der inneren
Scheibe 20 vorhanden. Die axiale Länge der verschiebbaren
Hülse 52 ist so angepaßt, daß der Eingriff mit der äußeren
Scheibe 20 auftritt, bevor das obere Ende, vergleiche die
Zeichnung, def Hülse 52 sich vom festen Ring 47 während der
axialen Abwärtsverschiebung der Hülse 52 löst. Der
Innendurchmesser der Hülse 52 ist auch an den Außendurchmesser des sich
axial erstreckenden Teils der Wandscheibe 39 der
Aufteilungseinrichtung 36 in einer solchen Weist angepaßt, daß eine
fortgesetzte Abwärtsverschiebung der Hülse 52 zur Abdeckung 27 hin
bewirkt, daß die Hülse 52 fest mit der Aufteilungseinrichtung
36 in Eingriff kommt, sobald sie sich von der äußeren Scheibe
19 gelöst hat. Die Länge des axialen Teils der
Aufteilungseinrichtung 36 entspricht auch der axialen Länge der Hülse 52 in
einer solchen Weise, daß die Hülse 52 in der untersten Position
im wesentlichen vollständig durch die Aufteilungseinrichtung 36
aufgenommen wird.
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Wie in der Zeichnung dargestellt, weist die hohle
Kolbenstange 8 einen Umfangskolben 55 innerhalb des äußeren Behälters
2 und des inneren Behälters 3 auf, wobei der Kolben 55
abdichtend an die Innenseite des inneren Behälters 3 durch einen
Dichtungsring 56 angreift.
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Eine Luer-Kupplung 57 ist innerhalb der hohlen Kolbenstange
zur Aufnahme einer herkömmlichen Spritze 58 mit einem als
Kolben wirkenden Stopfen 59 ausgebildet, um auf den Inhalt der
Spritze 58 zu wirken. Die Kupplung 57 ist im wesentlichen als
eine Rohrlänge ausgebildet, die durch einen kegelstumpfförmigen
Abschnitt 60 mit einer zentralen Öffnung 61 im Kolben 55 in
Verbindung steht. Die Rohrlänge 57 ist mit einem radial nach innen
vorstehenden Steg 62 versehen, um das Fluid, das die Spritze 58
verläßt, von einem axialen Weg weg und dadurch um die Rohrlänge
46 darunter innerhalb der Kapsel 45 herum zu leiten. Die
letztgenannte Rohrlänge 46 weist eine solche Länge und solche
Abmessungen auf, daß sie abdichtend in die Rohrlänge 57 innerhalb
der hohlen Kolbenstange 8 eingreifen kann, wenn der Kolben 55
sich in seiner untersten Position nahe der Abdeckung 27
befindet. Um die obige dichtende Verbindung zu unterstützen, ist die
Innenseite der Rohrlänge 57 mit einem allmählich abnehmenden
Durchmesser am dem Kolben 55 benachbarten Ende ausgebildet.
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Eine axial vorstehende Einfassung 63 ist integral mit dem
Kolben 55 um die zentrale Öffnung 61 des Kolbens ausgebildet.
Diese Einfassung 63 ist mit einem solchen Durchmesser und einer
solchen Länge ausgebildet, daß sie durch eine geeignete
Verschiebung des Kolbens 55 die obige Verschiebung der
verschiebbaren Hülse 52 der Kapsel 45 in die Positionen aktivieren kann,
in der sie mit dem inneren Kranz 53 der zentralen Öffnung 22
durch die beiden Scheiben 19 und 20 in Eingriff kommt, dem sich
ein Eingriff der Aufteilungseinrichtung 36 anschließt.
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Eine elastische Ringlippendichtungseinrichtung 64 ist, wie
angezeigt, um den hohlen Kolben an der oberen Innenseite der
Behälter 2 und 3 befestigt, vergleiche Fig. 1. Diese
Lippendichtungseinrichtung 64 ist angepaßt, einen unerwünschten
Durchgang von Fluid aus dem Inneren der Behälter 2 und 3 in den
Kanal 4 zu verhindern, jedoch läßt sie den Durchgang von Fluid
zu, wenn eine Kraft durch den Kolben 55 ausgeübt wird.
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Wie am oberen Teil der Fig. 1 angezeigt, ist eine Verbindung
zu einem Schlauch 65 durch eine Öffnung 66 im äußeren und
inneren Behälter 2 bzw. 3 vorgesehen. Diese Verbindung ist bekannt
und wird daher nicht detaillierter gezeigt, aber sie läßt eine
Unterbrechung der Verbindung zum Schlauch zu, falls gewünscht.
Zusätzlich ist eine Luftaustrittsöffnung mit einem geeigneten
Filter in einer herkömmlichen Weise vorgesehen und wird daher
weder gezeigt noch detaillierter beschrieben.
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Ein Durchgang 69 ist von dem Bereich zwischen der Auf
teilungseinrichtung 36 und der Abdeckung 27 und die ganze Strecke
nach oben durch das Innere der Rohrlänge 37 der
Aufteilungseinrichtung 36 und durch das Innere der Rohrlänge 46 der Kapsel 45
vorgesehen. Dieser Durchgang 69 läßt eine Überführung von Fluid
zur Spritze 58 von diesem Bereich zu, wenn die letztgenannte
Rohrlänge 46 mit der Rohrlänge 57 im Inneren der Kolbenstange
8 gekoppelt ist. Der Durchgang 66 wird im untersten Abschnitt
des Stiftes 38 in der Abdeckung 27 durch den Stift 38
bereitgestellt, der mit einer ebenen, axialen Oberfläche ausgebildet
ist, wobei der Stift einen im wesentlichen kreisförmigen
Querschnitt aufweist. Als Ergebnis wird ein Raum zwischen dem Stift
und dem benachbarten Abschnitt der Innenseite der Rohrlänge 37
bereitgestellt. Ein Bereich 67 ist unmittelbar über dem Stift
38 vorgesehen, wo die Aufteilungseinrichtung 36 einen
geringfügig reduzierten Innendurchmesser präsentiert. Auf diese Weise
ist es möglich, einen kleinen Filter 68 unmittelbar über dem
Bereich anzuordnen, vergleiche Fig. 1, wodurch das Fluid durch
den Filter gehen muß, bevor es in die Rohrlänge 46 der Kapsel
45 eintritt.
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Die beschriebene Vorrichtung weist eine erste Ringkammer 70
auf, die nach innen durch den hohlen Kolben 8, der eine
zylindrische Innenwand 71 bildet, und nach außen durch eine
zylindrische Außenwand 27 definiert wird, die durch den äußeren
Behälter 2 und den inneren Behälter 3 gebildet wird. Wenn sie
sich in der üblichen Gebrauchsposition befindet, vergleiche
Fig. 1, wird die Ringkammer 70 nach oben durch eine obere Wand
73 definiert, die durch den Boden 5 bzw. 6 des äußeren Behälters
2 und des inneren Behälters 3 gebildet wird. Nach unten wird
die Ringkammer 70 durch eine untere Wand 74 definiert, die durch
den Kolben 55 gebildet wird. Eine zweite Kammer 75 ist unter
dem Kolben 55 definiert, wobei die zweite Kammer nach außen
durch dieselbe zylindrische Außenwand 72 wie die erste Kammer
70 definiert wird. Nach unten ist die zweite Kammer 75 durch
eine zweite untere Wand 76 definiert, die durch die äußere
Scheibe 19 und die innere Scheibe 20 definiert wird. Die Kapsel
45 ist zentral im Inneren der zweiten Kammer 75 angeordnet. Eine
dritte Kammer 77 ist unter der zweiten unteren Wand 76
vorgesehen, und diese dritte Kammer 77 wird durch die
Aufteilungseinrichtung 36 und die Ringfiltereinheit 42 definiert.
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Zusätzlich steht diese dritte Kammer 77 mit der zweiten Kammer
75 durch den Durchgang in Verbindung, der durch die zentrale
Öffnung 22 in der äußeren Scheibe 19 und der inneren Scheibe 20
gebildet wird. Schließlich ist eine vierte Kammer 78 unter der
Aufteilungseinrichtung 36 vorgesehen, wobei die vierte Kammer
78 nach außen durch die Wand 32 der Abdeckung 27 und ferner
durch Abschnitte der Hülse 28 der Abdeckung 27 und die
Unterseite der äußeren Scheibe 19 definiert wird.
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Wie oben beschrieben, ist die beschriebene Vorrichtung
hauptsächlich zur Abtrennung einer Komponente, wie
Fibrinmonomer aus Blut geeignet, und zu diesem Zweck wird die zweite
Kammer 75, und vorzugsweise die obere Kammer 80 der Kapsel 46 im
voraus mit einem geeigneten Enzym gefüllt, wie Batroxobin. Wie
aus EP-PS Nr. 592,242 zu entnehmen ist, kann jedes
thrombinähnliche Enzym eingesetzt werden. Solche Enzyme weisen Thrombin
selbst oder irgendein anderes Material mit einer ähnlichen
Aktivität auf, wie Ancrod, Acutin, Venyym, Asperase, Botropase,
Crotabase, Flavorxobin, Gabonase und das bevorzugte Batroxobin
auf. Batroxobin kann chemisch an Biotin gebunden werden, das
eine synthetische Substanz ist, was es gestattet, daß das
Batroxobin in einer üblichen bekannten Weise mittels Avidin in
einer Avidin-Agarose-Zusammensetzung eingefangen wird.
Folglich ist Avidin-Agarose in der untersten Kammer 81 der Kapsel
zu finden. Sowohl die Biotin-Batroxobin-Zusammensetzung aus
auch die Avidin-Agarose-Zusammensetzung sind verhältnismäßig
leicht in die jeweiligen Kammern 80 und 81 in der Kapsel 45 zu
füllen, bevor die Kapsel in der Vorrichtung angeordnet wird.
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Schließlich wird eine Spritze 58 angeordnet, wobei die
Spritze einen pH-4-Puffer enthält, der aus einem Acetat
hergestellt wird, das mit Essigsäure verdünnt wird und zur Aufnahme
von Fibrin 1 geeignet ist.
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Ein anderer aus dem Stand der Technik bekannter Puffer kann
ebenfalls verwendet werden. Das Wiederauflösungs-Puffermittel
kann irgendeine Säurepufferlösung seine, vorzugsweise jene, die
einen pH-Wert zwischen 1 und 5 aufweisen. Geeignete Beispiele
umfassen Essigsäuref Succinsäure, Glucuronsäure, Cysteinsäure,
Crotonsäure, Itakonsäure, Glutonsäure, Ameisensäure,
Aspargirisäure, Adipinsäure und Salze irgendeiner von diesen.
Succinsäure, Asparginsäure, Adipinsäure und Salze von Essigsäure,
z. B. Natriumacetat werden bevorzugt. Auch kann die
Solubilisation auch bei einem neutralen pH mittels eines chaotropen
Mittels ausgeführt werden. Geeignete Mittel umfassen Harnstoff,
Natriumbromid, Guanidinhydrochlorid, KCNS, Kaliumiodid und
Kaliumbromid. Konzentrationen und Volumina solcher Säurepuffer
oder eines solchen chaotropen Mittels sind so gestaltet, wie in
EP-PS Nr. 592,242 beschrieben.
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Während oder unmittelbar nach der Zufuhr von Blut wird die
Kolbenstange 8 so weit in das Innere der Vorrichtung geschoben,
daß die verschiebbare Hülse 52 der Kapsel 45 nach unten in
einen dichtenden Eingriff in den durchgehenden Durchgang durch
die untere Wand 76 und in die zweite Kammer 77 bewegt wird. Als
Ergebnis wird gleichzeitig ein Zugang zu der Biotin-Batroxobin-
Zusammensetzung in der obersten Kammer 80 der Kapsel geöffnet.
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Wenn die Vorrichtung gebrauchsfertig ist, wird in einer
üblichen Weise durch eine nicht gezeigte Nadel und den Schlauch
65 eine Blutprobe in die erste Kammer zugeführt, wobei der
Blutprobe vorzugsweise auch in einer üblichen Weise eine
gerinnungshemmende Substanz zugemischt wird. Während des Zuführens
des Blutes durch den Schlauch 65 und die Öffnung 66 in das
Innere der ersten Kammer 70, wird in einer üblichen Weise Luft
aus der Kammer entfernt. Nach dem Zuführen des Blut wird der
Schlauch 65 entfernt, und die Öffnung 66 wird abdichtend
verschlossen. Anschließend wird die Vorrichtung mit dem Blut in
einer Zentrifuge angeordnet, die unter anderem dabei hilft, die
verschiedenen Teile abdichtend zusammenzudrücken. Die
Zentrifuge veranlaßt die Vorrichtung, sich um die Rotationsachse 1 zu
drehen. Als Ergebnis der Zentrifugierung wird das Blut in der
ersten Kammer 70 in eine Plasmafraktion getrennt, die sich
radial im verbleibenden Teil des Blutes absetzt, wobei der
verbleibende Teil die roten und die weißen Blutzellen enthält. Wie
in EP-PS Nr. 592,242 beschrieben, können die Plättchen in jeder
Fraktion vorhanden sein, wie gewünscht, indem die
Geschwindigkeit und Zeit der Zentrifugierung variiert wird.
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Wenn die Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem verbleibenden
Teil des Blutes sich stabilisiert hat, d. h. wenn die
Abtrennung beendet ist, wird durch die Kolbenstange 8 eine
Verminderung des Volumens der ersten Kammer 70 eingeleitet und
anschließend wird der Kolben 55 herausgezogen. Als Ergebnis
geht zuerst eine mögliche innere Schicht aus Luft durch die
Kanäle 4 und 21 in die zweite Kammer 75, und eine weitere
Bewegung des Kolbens 55 bringt es mit sich, daß auch das Plasma in
die zweite Kammer 75 geht. Die Bewegung des Kolbens 55 wird
gestoppt, wenn die gesamte Schicht des Plasmas in die zweite
Kammer 75 gedrängt worden ist, d. h. wenn die Grenzfläche
zwischen der Plasmafraktion und dem verbleibenden Anteil des
Blutes die Innenwand 71 der ersten Kammer 70 erreicht hat.
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In der zweiten Kammer 75 kommt die Plasmafraktion in
Kontakt mit dem Enzym Batroxobin mit dem Ergebnis, daß
Fibrinmonomer, das sofort zu einem nicht-vernetzten Fibrinpolymer
polymerisiert, aus der Plasmafraktion freigesetzt wird. Dieser
Prozeß wird durchgeführt, während die Vorrichtung kontinuierlich
zentrifugiert wird, mit dem Ergebnis, daß Fibrinpolymer
effizient aus dem verbleibenden Teil der Plasmafraktion abgetrennt
wird, wobei das Fibrinpolymer durch die Reaktion der Biotin-
Batroxobin-Zusammensetzung und Absetzen einer viskosen Schicht
längs der zylindrischen Außenwand 72 gebildet wird. Wenn diese
Abtrennung vollendet worden ist, wird die Zentrifugierung
gestoppt, wodurch der verbleibende relative Fluidanteil der
Plasmafraktion leicht durch den Kolben 55, der zuerst
hochgezogen wird, um Luft von der ersten Kammer 70 in die zweite
Kammer 75 zu überführen, gefolgt davon, daß der Kolben 55
heruntergedrückt wird, in die erste Kammer 70 zurückgedrückt werden
kann. Diese Überführung kann verhältnismäßig leicht und schnell
durchgeführt werden, bevor die viskose Schicht mit
Fibrinpolymer die Öffnung des Kanals 21 erreicht. Es können optional weitere
Maßnahmen ergriffen werden, um zu verhindern, daß die
viskose Schicht den Einlaß des Kanals 21 zu schnell erreicht, wie
z. B. durch Vorsehen eines Ringes von nach oben vorstehenden
Zähnen 82, die durch gepunktete Linien am Boden 76 gezeigt
werden. Diese Zentrifugierungs- /Entwässerungsprozedur kann zwei
oder mehrere Male ausgeführt werden, wie es erforderlich sein
kann, um so viel des Plasmafluids aus dem Fibrinpolymer
herauszubekommen, wie möglich.
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Sobald der verbleibende Teil der Plasmafraktion aus der
zweiten Kammer 75 herausgetrieben worden ist, wird die
verschiebbare Hülse 52 der Kapsel 45 weiter in einer solchen Weise
nach unten verschoben, daß ein Zugang zur untersten Kammer 81
zugelassen wird. Zur selben Zeit oder in Verbindung mit der
letztgenannten Verschiebung der Hülse wird der Stopfen 49 der
Spritze 58 mittels einer Spindel vollständig nach unten
gedrückt, die von außen in einer solchen Weise wirkt, daß der
pH-4-Puffer in die zweite Kammer 75 überführt wird, was
geschehen kann, während ein zentrifugales Rühren eingeleitet wird.
Die Zugabe des pH-4-Puffers sorgt dafür, daß das Fibrinpolymer
darin aufgelöst wird, und das Vorhandensein der Avidin-Agarose-
Zusammensetzung in der unteren Kammer 81 in der Kapsel 45 sorgt
dafür, daß die Biotin-Batroxobin-Zusanimensetzung in einer
üblichen Weise durch das Avidin gebunden wird. Eine fortgesetzte
Verschiebung des Kolben 55 bewirkt, daß die verschiebbare
Hülse 52 auf der Kapsel 45 mit der Aufteilungseinrichtung 36
in Eingriff kommt und sich von der unteren Wand 76 löst, mit
dem Ergebnis, daß ein freier Zugang zur dritten Kammer 77
bereitgestellt wird. Als Ergebnis können die Inhalte der
zweiten Kammer 75 frei nach unten in die dritte Kammer 77 fließen.
Vorzugsweise wird die Wiederauflösung während dem zentrifugalen
Rühren ausgeführt, das eine Zentrifugierung und eine Reihe von
Stop-und-Start- Vorwärts-/Rückwärts-Rührbewegungen beinhaltet.
Eine fortgesetzte Zentrifugierung sorgt dafür, daß die
Fibrinmonomerlösung in der dritten Kammer durch die
Ringfiltereinheit 42 abgetrennt werden kann, welche die verhältnismäßig
großen Teile der Agarose und des daran über das Biotin-Avidin-
Einfangsystem gebundenen Batroxobins zurückhält. Wenn die
Fibrinmonomerlösung als Ergebnis der obigen Zentrifugierung in
die unterste vierte Kammer 78 gegangen ist, wird die
Zentrifugierung gestoppt, und die Fibrin-I-Lösung wird durch ein
erneutes Zurückziehen des Stopfens 59 leicht in die Spritze 58
überführt, wobei das oberste Ende der Rohrlänge 46 der Kapsel
45 mit der Rohrlänge 57 in Eingriff kommt, welche die Verbindung
mit der Spritze 58 bildet.
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Da während einer fortgesetzten Zentrifugierung in der
zweiten Kammer 75 Fibrinpolymer von der Plasmafraktion abgetrennt
wird und da die Fibrinmonomerlösung in der dritten Kammer 77
durch Zentrifugierung abgetrennt wird, ist es möglich, eine
verhältnismäßig hohe Ausbeute von Fibrin I aus der fraglichen
Blutprobe zu gewinnen.
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Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf eine bevorzugte
Ausführungsform beschrieben worden. Es können jedoch viele
Modifikationen durchgeführt werden, ohne dadurch vom Rahmen der
Erfindung abzuweichen.
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Fig. 2 stellt Beispiele solcher Modifikationen dar, da die
Fig. 2 eine zweite Ausführungsform der Erfindung darstellt, die
mehr oder weniger der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der
Erfindung entspricht. Die Ausführungsform der Fig. 2 weist eine
erste Kammer 90 und eine zweite Kammer 91 auf, die durch einen
Kolben 92 getrennt sind, der eine hohle Kolbenstange 93
aufweist, die nach innen die erste Kammer definiert. Nach außen
werden die beiden Kammern durch einen Abschnitt eines im
wesentlichen röhrenförmigen Gliedes 94 definiert, das eine
äußere zylindrische Wand 95 für die beiden Kammern 90 und 91
bildet. Nach oben wird die erste Kammer 90 durch eine obere Wand
85 definiert, die wiederum durch eine obere Abdeckung gebildet
wird, die an dem röhrenförmigen Glied 94 mittels eines Rings 96
befestigt ist, der in das röhrenförmige Glied 94 geschraubt
ist. Die obere Wand 85 definiert eine Durchgangsöffnung für den
Durchgang der hohlen Kolbenstange 93. Nach unten wird die
zweite Kammer 91 durch eine untere Wand 96 definiert, die durch
einen Umfangsinnenflansch im röhrenförmiges Glied 94 gebildet
wird. Auf der zur zweiten Kammer 91 benachbarten Seite weist
das röhrenförmige Glied 94 eine kegelstumpfförmige Oberfläche
97 auf, die sich vom Kolben 92 weg zur Mitte der zweiten Kammer
91 hin neigt. Die untere Wand 96 definiert einen zentralen
durchgehenden Durchgang 98 zu einer dritten Kammer 99. Die
dritte Kammer 99 wird durch eine Aufteilungseinrichtung 100 und
eine Ringfiltereinheit 101 zwischen der unteren Wand 96 und der
Aufteilungseinrichtung 100 definiert und führt zu einer vierten
Ringkammer 102. Die vierte Kammer 102 ist zwischen einer
tassenförmigen Abdeckung 103 definiert, die durch Gewinde am
röhrenförmigen Glied 94 befestigt ist. Die Abdeckung 103 hält
durch dazwischenliegende Rippen 103 die Aufteilungseinrichtung
100 zentral innerhalb des röhrenförmigen Gliedes 94 in
Position, während sie die Ringfiltereinheit 101 einzwängt.
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Eine Kapsel 105 ist an einem zentralen und nach oben
vorstehen Stift 104 an der Aufteilungseinrichtung 100 befestigt.
Die Kapsel 105 weist einen röhrenförmigen Abschnitt 106 mit
scheibenförmigen Ringen 107, 108 auf, die locker daran
angebracht sind und Kammern für die Enzyme, die durch die Buchstaben
BB bzw. AA angezeigt werden, mittels einer verschiebbar
angeordneten Hülse definieren. Die scheibenförmigen Ringe sind an
den gewünschten gegenseitigen Abständen mittels Schultern an
der Rohrlänge 106 befestigt, die daran ausgebildet sind, indem
die äußere Peripherie des röhrenförmigen Gliedes 106 von unten
und nach oben einen abnehmenden Durchmesser aufweist.
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Es sind Durchgangskanäle 115 und 116 vom oberen Teil der
ersten Kammer 90 zum Boden der zweiten Kammer 91 vorgesehen.
Diese Kanäle werden mittels ihrer jeweiligen festen Rohrlänge
117 bzw. 118 bereitgestellt, die sich parallel zur
Rotationsachse der Vorrichtung erstrecken und an den Enden in
zugehörigen Öffnungen in der oberen Wand 95 und der unteren Wand 96
befestigt sind. Die Kanalverbindung zwischen diesen Rohrlängen
und den Kammern wird jeweils durch geeignete Bohrungen und
darin befestigte Stopfen bereitgestellt. Die Rohrlängen 117 und
118 erstrecken sich durch ihre jeweilige Öffnung im Kolben 92.
Es sind überall Dichtungsringe vorgesehen, um eine
Undichtigkeit zu vermeiden.
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Eine Kupplung 120 ist zentral innerhalb des Kolbens 92
befestigt zum Kuppeln an eine Spritze 121 innerhalb der hohlen
Kolbenstange 93 und an das obere Ende der Rohrlänge 106 der
Kapsel 105. Die Kupplung 120 trägt eine Einfassung 122, die in die
zweite Kammer 91 vorsteht und die verschiebbare Hülse 110 auf
der Kapsel 105 beeinflußt. Wie dargestellt, ist der
Außendurchmesser dieser Hülse 110 an den Durchmesser des durchgehenden
Durchgangs 98 abwärts zur dritten Kammer 99 in einer solchen
Weise angepaßt, daß die Hülse 110 durch die untere Wand 96 in
jeder Position und folglich auch in einer untersten Position
geführt und gehalten wird, in der die Hülse 105 nicht mit dem
untersten scheibenförmigen Ring 109 in der Kapsel in Eingriff
steht, und läßt den Durchgang von Fluid von der zweiten Kammer
91 nach unten in die dritte Kammer 99 zu. Ein Kanal 123
erstreckt sich von der vierten Kammer 102 und geht zentral durch
den Stift 104 auf der Aufteilungseinrichtung 100 nach oben und
ferner durch das röhrenförmige Glied 106 der Kapsel 105 nach
oben, wodurch es zugelassen wird, daß Fluid von dort in die
Spritze 121 eintritt.
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Die Vorrichtung der Fig. 2 wird vollständig in derselben
Weise wie die Vorrichtung der Fig. 1 verwendet, wodurch
natürlich auch Einrichtungen vorgesehen sind, um einen Schlauch zum
Zuführen von Blut daran zu kuppeln.
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Die beschriebenen Teile, die Teil der verschiedenen
Vorrichtungen bilden, werden durch Spritzguß leicht aus geeigneten
Plastikmaterialien hergestellt, und die fraglichen
Vorrichtungen sind daher auch verhältnismäßig kostengünstig und zum
Einweggebrauch geeignet.
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Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf bevorzugte
Ausführungsformen der Vorrichtung beschrieben. Das erfindungsgemäße
Verfahren kann jedoch leicht in einem Labor unter keimfreien
Bedingungen mittels eines Tiegels durchgeführt werden, der
durch einen Deckel verschlossen werden kann. Plasma und Enzym
werden in den Tiegel gefüllt und durch Mischen und
anschließender Zentrifugierung wird das nicht-vernetzte Fibrinpolymer auf
dem Boden oder der Wand des Tiegels wie oben beschrieben
abgetrennt. Nach dem Entfernen der verbleibenden Plasmafraktion
wird das nicht-vernetzte Fibrinpolymer durch Zugabe eines
Lösungsmittels und durch zentrifugales Rühren wiederaufgelöst,
wie ebenfalls oben beschrieben.
Ausführungsbeispiel
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140 ml Vollblut und 20 ml gerinnungshemmende Natriumnitrat-
Substanz (USP) wurden in die erste Kammer 70 der oben
beschriebenen Vorrichtung eingebracht. Diese Kombination wurde für 2
Minuten bei etwa 6000 U/min zentrifugiert, um eine Trennung von
Plasma und Blutzellen bereitzustellen. Während die Zentrifugierung
fortgesetzt wurde, um die Abtrennung zu beizubehalten,
wurde der Kolben hochgezogen, um die innerste Phase, d. h. das
Plasma in die zweite Kammer 75 zu überführen. Annährend 60 ml
Plasma wurden überführt. Diese wurden mit 30 Einheiten
biotinylisierten Batroxobin behandelt, das in die zweite Kammer 75
über die Kammer 80 der Kapsel 45 eingeführt wurde, wie
vorhergehend beschrieben. Das Plasma und Abroxobin wurden mit einer
niedrigeren Geschwindigkeit gemischt, z. B. etwas 2000 bis 3000
U/min und danach für 9 Minuten bei 9000 U/min zentrifugiert.
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Das nicht-vernetzte Fibrinpolymergel wurde als eine dünne
Gelschicht auf den Zylinderwänden ausgefällt und die Rotation
wurde beendet. Das verbleibende Plasmafluid (Serum) wurde dann
zurück in die erste Kammer 70 überführt. Dem schlossen sich
weitere 1 Minute lange Zentrifugierungen bei 9000 U/min an, um so
viel des Serums im Gel wie möglich zu entfernen. Anschließend
an eine solche 1 Minute lange Zentrifugierung wurde das
überschüssige Serum in die erste Kammer 70 überführt.
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Danach wurde über die Spritze 58 eine Pufferlösung mit 3,5
ml von 0,2 M Natriumacetat (pH 4,0), die 24 mM Calciumchlorid
enthielt, in die zweite Kammer 75 eingeführt. Zu dieser Zeit
wurde ein zentrifugales Rühren, das aus 5-10 Sekunden
Umdrehungen bei etwa 3000 U/min bestand, jeweils in wiederholten
Vorwärts-/Rückwärtszyklen für 2 Minuten ausgeführt, um das
Fibrinpolymergel aufzulösen und eine fibrinmonomerenthaltende Lösung
bereitzustellen. Der so hergestellen Lösung wurde
Avidin-Agarose über die untere Kammer 71 der Kapsel 45 zugegeben. Dem
schloß sich ein weiteres zentrifugales Rühren an, das aus 5-10
Sekunden Umdrehungen bei etwa 3000 U/min bestand, die jeweils
in wiederholten Vorwärts-/Rückwärtszyklen für 5 Minuten
ausgeführt wurden. Die sich ergebende Lösung enthielt Fibrinmonomer
plus einem Komplex aus Avidin-Agarose: Biotin-Batroxobin.
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Diese Lösung wurde in die dritte Kammer 77 überführt und
durch einen 20 um Ring-Porexfilter für 1 Minute bei 9000 U/min
zentrifugenfiltriert. Die sich ergebende Fibrinmonomerlösung
wurde in der Spritze 58 gesammelt, wie vorhergehend
beschrieben.
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Die so gebildete Fibrinmonomerlösung (Fibrin I in diesem
Fall) wurde durch Mitverabreichung auf eine Stelle, die ein
solches Dichtungsmittel benötigte, mit einem 0,75 M
Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer mit einem Verhältnis von Fibrin I :
Puffer von 5 : 1 zu einem Febrindichtungsmittel um- bzw. repolymerisiert.