DE69514883T2

DE69514883T2 - Spezies-spezifischer Nachweis von Mycobacterium Kansasii

Info

Publication number: DE69514883T2
Application number: DE69514883T
Authority: DE
Inventors: Patricia Anne Spears
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2000-10-05
Anticipated expiration: 2015-08-10
Also published as: EP0707075A3; CA2155387C; US5500341A; CA2155387A1; AU2848195A; JPH08103299A; DE69514883D1; EP0707075B1; EP0707075A2; AU690294B2; JP2686428B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Amplifikations-Primer und Methoden zum Amplifizieren von Nukleinsäure-Target-Sequenzen. Im speziellen, bezieht sich die Erfindung auf die Spezien spezifische Amplifikation von Mycobacterium kansasii Target-Sequenzen.

Hintergrund der Erfindung

Die Mycobakterien sind eine Gattung von Bakterien, die säurefeste, unbewegliche, grampositive Stäbchen sind. Die Gattung enthält einige Spezien wie Mycobakterium africanum, M. avium, M. bovis-BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum, M. paratuberculosis und M, tubercolosis, ist aber nicht auf diese eingeschränkt. Bestimmte dieser Organismen sind die kausalen Wirkstoffe, die Krankheiten verursachen. Zum ersten Mal seit 1953 nehmen die Fälle der mycobakteriellen Infektion in den Vereinigten Staaten zu. Im speziellen betroffen ist Tuberkulose, dessen ätiologischer Wirkstoff M. tuberculosis ist. Weiters haben auch Infektionen, die von anderen Mycobakterien als tuberculosis (MOTT) zugenommen. Viele dieser neuen Fälle stehen mit der AIDS-Epidemie in Zusammenhang, die eine immun gefährdete Bevölkerung bedingt, die vor allem anfällig für Infektionen durch Mycobakterien ist. Mycobakterium avium, Mycobakterium kansasii und andere nicht-tuberculose Mycobakterien wurden als opportunistische Phatogene in HIV infizierten und anderen in ihrem Immunsystem geschwächten Patienten gefunden. Es besteht ein steigender Bedarf an schnellen Diagnosen dieser Infektionen, da sie sich schnell ausbreiten können und innerhalb einer kurzen Zeitspanne fatal sein können.
Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Diagnose von mycobakteriellen Infektionen abhängig von säurefesten Färbungen und der Kultivierung der Organismen, gefolgt von biochemischen Bestimmun gen. Diese Prozeduren sind zeitraubend, und eine typische Diagnose unter Verwendung konventioneller Kultivierungs-Methoden kann bis zu sechs Wochen dauern. Automatisierte Kultivierungssysteme wie das BACTEC System (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) können die für die Diagnose benötigte Zeit bis zu einer oder zwei Wochen verringern. Trotzdem ist es nach wie vor notwendig, die für das Diagnostizieren einer mycobakteriellen Infektion benötigte Zeit auf weniger als eine Woche zu verringern, vorzugsweise auf ungefähr einen Tag. Auf oligonukleotide Proben basierende Untersuchungen wie Southern Hybridisationen oder Punktflecken (engl. dot blots) sind geeignet, um ein schnelles Resultat (z. B., innerhalb eines Tages oder weniger) zu liefern. Gattungs- und Spezien spezifische Primer können ebenfalls in Direktuntersuchungen auf klinische Proben durch Nukleinsäure Amplifikation verwendet werden. Trotzdem, beide dieser schnellen Detektions- und Identifikationsmethoden verlangen oligonukleotidische Proben oder Primer, die spezifisch für die Gattung Mycobakteria (tuberculosis und nicht-tuberculosis) oder spezifische für eine spezielle mycobakterielle Spezies sind, wenn eine spezifische Identifikation des Organismus gewünscht wird.
Konventionelle laboratorische Identifikationen des Mycobakterium kansasii verläßt sich auf biochemisches Testen und die Determination der Wachstumseigenschaften. Diese inkludieren Katalaseproduktion, Ureaseaktivität, TWEEN- Hydrolyse, Nitratreduktion und die Fähigkeit des Bakteriums Pigmente zu produzieren, wenn sie dem Licht ausgesetzt werden (Photochromogenität). Da einige andere mycobakterielle Spezien ein ähnliches biochemisches Profil aufweisen, stellt die Photochromogenität üblicherweise eine entscheidende Eigenschaft für die Identifikation des Mycobakteriums kansasii dar. Jedoch verlangt die Determination der Photochromogenität eine reine Kultur des Organismus und dieser Phänotyp kann variabel, subjektiv und schwer verläßlich zu determinieren sein. Aus diesen Gründen gab es Versuche, das Mycobakterium kansasii durch Spezien spezifische Hybridisation oder Nukleinsäure Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotid- Proben zu identifizieren. Z. H. Huang, et al. (1991. J. Clin. Microbiol. 29, 2125-2129) berichteten von einer DNA- Proben, die von einer genomischen Bank mit einem Grad von Spezienspezifität für das Mycobakte rium kansasii erhalten wurde. Dieser Klon (pMK 1-9) zeigt gewisse Kreuzhybridisationen mit anderen Spezien, inklusive M. gastri, und detektierte keine genetisch unterschiedliche Untergruppe von M. kansasii. Die Nukleotidsequenz von pMK 1-9 wurde weder berichtet, noch wurde das Gen, von welchem es abgeleitet wurde, identifiziert. B. C. Ross, et al. (1992. J. Clin. Microbiol. 30, 2930-2933) berichteten ebenfalls von Identifikationen von genetisch unterschiedlichen Unterspezien des M. kansasii unter Verwendung der pMK 1-9 - Sonde, einer 65kDa Antigen Genprobe und einem kommerziellen DNA- Test, wobei die Proben spezifisch zu rRNA (ACCU-PROBE, Gen-Probe, San Diego, CA) hybridisiert wurden. Amplifikations-Primer die zum 16S rRNA Gen hybridisiert wurden, wurden verwendet um die 16S rma Gensequenz der untersuchten M. kansasii Varianten zu sequentieren und zu studieren. M. Yang, et al. (1993. J. Clin. Microbiol. 31, 2769-2772) berichteten von der Isolation einer Sequenz von einer klinisch isolierten Probe, die wenn sie als Hybridisationsprobe verwendet wird, Spezienspezifität für M. kansasii aufweist. Diese Probe (p6123) wurde zu allen getesteten M. kansasii Kulturstämmen, inklusive der Untergruppe die pMK 1-9 negativ ist, hybridisiert.
T. Rogall, et al. (1990. J. Gen. Microbiol. 136, 1915-1920) verwendete die 16S rRNA Sequenz in einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) basierend auf die Sequenzierungsstrategie zur Identifikation von mycobakteriellen Spezien. Allerdings konnten diese Primer nicht verwendet werden um die M. gastri von den M. kansasii zu differentieren, da die 16S rRNA Sequenz von diesen beiden Spezien identisch ist, ungeachtet ihrer unterschiedlichen phänotypischen Charakteristika. Ähnliche Studien wurden von B. Böddinghaus, et al. (1990. J. Clin. Microbiol. 28, 1751-1759) veröffentlicht, der von Oligonukleotiden berichtete, die von 16S rRNA Sequenzen abgeleitet wurden, die spezifisch für die M. tuberculosis Gruppe, z. B., M. avium-M. paratuberculosis, und M. intracellulare sind.
Die vorliegende Erfindung schlägt Nukleinsäure Sequenzen als verwendbar als Amplifikations-Primer zur Spezien spezifischen Detektion und Identifikation von dem Mycobakterium kansasii vor. Spezienspezifität bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Primer eine Target-Sequenz in M kansasii Nukleinsäuren mit ge ringer oder nicht erkennbarer Amplifikation von Target-Sequenzen anderen Spezien von Mycobakterien oder von nahe verwandten Mikroorganismen wie M. gastri, Rhodococcus rhodochrous und Nocardia asteroides vergrößert. Die Amplifikations-Primer nach der Erfindung stammen von der p6123 Sequenz ab, die früher von Yang, et al. (1993) berichtet wurde, allerdings hatten diese Autoren früher nur die Gesamtlänge p6123-Sequenz verwendet, um Spezienspezifität bei Pr4obenhybridisation (z. H. Southern blots) zu demonstrieren. Es war vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, ob kurze Amplifikations-Primer geplant werden konnten, die Spezienspezifität beibehalten würden und auch als Primer für SDA funktionieren würden.
Die Primer können, nachdem sie zum Kultivieren einer Probe verwendet wurden, als ein Mittel für bestätigende Identität der Kulturen verwendet werden. Alternativ konnten sie früher zum Kultivieren für die Detektion und Identifikation von mycobakterieller DNA unter Verwendung von Nukleinsäure Amplifikationstechniken, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. In jedem Fall stellen die neuen Primer und Diagnosemethoden ein Mittel zur Verfügung zum schnellen Diskriminieren zwischen M. kansasii und anderen Spezien der Mycobakterien, was den Praktikern erlaubt schnell diese Mikroorganismen zu identifizieren ohne auf die zeitraubenden phänotypischen und biochemischen Prozeduren zurückgreifen zu müssen, auf die man sich herkömmlicherweise stützt. Solche schnellen Identifikationen von dem spezifischen ätiologischen Wirkstoff, der in eine mycobakterielle Infektion eingebunden ist, liefert Informationen, die verwendet werden können, um innerhalb einer kurzen Zeitspanne eine geeignete Therapie zu determinieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert Oligonukleotid-Amplifikations-Primer die M, kasasii-Spezifität in Nukleinsäüre Amplifikations-Reaktionen aufweisen. Ebenfalls werden Methoden zum Detektieren und Identifizieren von M. kansasii Nukleinsäuren unter Verwendung der Amplifikations-Primer nach der Erfindung geliefert. Einhundert Prozent der klinischen und environmen talen getesteten isolierten M. kansasii waren positiv in Amplifikationsversuchen unter Verwendung der neuen Amplifikations-Primer.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das Target-Generations-Schema für Strand Displacement Amplification (SDA-linke Seite) und die Reaktionsschritte für die exponentielle Amplifikation von einer Target-Sequenz mit der SDA (rechte Seite).
Fig. 2 ist eine Darstellung der Nukleotid-Sequenzen, die mit p6123 in fünf Strängen von M. kansasii korrespondieren, die die Stellen der Hybridisation der Amplifikations-Primer zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Oligonukleotide entsprechend der Erfindung sind besonders geeignet als Amplifikations-Primer zum Detektieren von M. kansasii Target-Nukleinsäure-Sequenzen in einer Probe, von der erwartet wird, daß sie Mycobakterien enthält. Die Proben können isolierte Nukleinsäuren, isolierte Mikroorganismen enthalten, oder es können klinische Proben sein. Typische klinische Proben liegen in der Form einer biologischen Flüssigkeit oder eines biologischen Gewebes, z. B. Sputum, Bronchialspülungen, Magenspülungen, Blut, Milch, Lymphe, Haut und weiches Gewebe, vor. Vor der Hybridisation mit den Primern nach der Erfindung wurden Proben, von denen erwartet wurde, daß sie intakte Mikroorganismen eher als freie Nukleinsäuren enthalten, generell mit gängigen im Fachgebiet bekannten Methoden behandelt um Nukleinsäuren aus allen Mikroorganismen, die anwesend sein könnten, freizusetzen. Zusätzlich werden Sputumproben typischerweise verflüssigt bevor die Nukleinsäuren zur Analyse freigegeben werden. Passende Verflüssigungsmethoden sind im Fachgebiet bekannt. Da Mycobakterien sowohl menschliche als auch nicht-menschliche tierische Spezien infizieren, ist die vorliegende Erfindung sowohl auf humane als auch auf veteri näre Diagnoseprozeduren anwendbar und die Proben können von beiden Quellen erhalten werden. Da Menschen für die Infektion mit einer Fülle von Mycobakterien, einschließlich M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum und M. fortuitum anfällig sind, können die Sofort- Primer und Diagnosemethoden zur schnellen Identifikation von Fällen verwendet werden, in denen M. kansasii der ätiologische Agens ist, wodurch sie bei der Auswahl einer passenden Therapie helfen.
Die Oligonukleotid-Primer nach der Erfindung werden bevorzugt zum Detektieren und/oder Identifizieren von Mycobakterium kansasii durch Amplifikation von mycobakteriellen Nukleinsäure Target-Sequenzen verwendet. Jedoch kann der Teil des Primers, der die Target-Sequenz hybridisiert, auch als Hybridisationsprobe zur direkten Detektion von Target-M. kansasii-Nukleinsäure in verschiedenen Nukleinsäure-Hybridisations-Verfahren verwendet werden. Hybridisationsmethoden beinhalten Southern Blots zur Detektion von DNA, Northern Blots zur Detektion von RNA und Dot Blots zur Detektion entweder von DNA oder von RNA. Sie sind generell gut bekannt im Fachgebiet und sind in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 beschrieben. In der bevorzugten Darstellung wird die Anwesenheit von M. kansasii in einer Probe durch Spezien spezifische Amplifikation der Target-Nuklein-Sequenz detektiert und/oder identifiziert. In dieser Darstellung werden die Amplifikations-Primer dieser Erfindung in konventionellen Nukleinsäure-Amplifikations-Protokollen verwendet. Jedes Amplifikations-Protokoll das sich auf zyklische spezifische Hybridisation von Primern der Target-Nukleinsäure bezieht, kann verwendet werden, z. B., Polymerase Chain Reaction (PCR, U. S. Patent Nr. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188), Strand Displacement Amplification (SDA) (G. Walker, et al. 1992. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 392-396; G. Walker, et al. 1992. Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696; U. S. Patent Nr. 5,270,184), Nucleic Acid Based Sequence Amplification (NASBA: U. S. Patent No. 5,130,238 to Cangene), Transcription Based Amplification (D. Kwoh, et al. 1989. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 1173- 1177), Self-Sustained Sequence Replication (J. Guatelli, et al. 1990. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) oder das Qß Replicase System (P. Lizardi, et al. 1988. BioTechnology 6, 1197-1202). Die bevorzugten Amplifikationsmethoden zur Verwendung mit den Primern nach der Erfindung sind Methoden die zyklische, spezifische Hybridisation der Primer von Target-Sequenz, Streckung der Primer unter Verwendung der Target-Sequenz als eine Schablone und Verlagerung der aufgedehnten Primer von der Target-Sequenz, z. B. PCR und SDA, verwenden.
Ein Amplifikations-Primer ist ein Primer zur Amplifikation einer Target-Sequenz durch Primerstreckung oder Abbindung anliegender Primer, die zu der Target-Sequenz hybridisiert sind. Für die Amplifikation durch SDA werden bevorzugt die Oligonukleotid-Primer so ausgewählt, so daß der GC Gehalt niedrig ist, vorzugsweise niedriger als 70% der gesamten Nukleotid-Zusammensetzung der Probe. Auf ähnliche Weise haben die Target- Sequenzen für SDA bevorzugterweise einen niedrigen GC-Gehalt um die Sekundärstruktur zu minimieren. Das 3 Ende eines SDA Amplifikations-Primers (die Target bindende Sequenz) hybridisiert an dem 3' Ende der Target-Seguenz. Die Target bindende Sequenz verleiht Targetspezifität an dem Amplifikations-Primer. Der SDA- Amplifikations-Primer enthält weiters eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuklease nahe ihrem 5' Ende. Die Erkennungsstelle ist für eine Restriktions-Endonuklease, die einen Strang eines DNA-Duplex einkerbt, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert ist, wie von Walker, et al. (1992. PNAS 89, 392.396) beschrieben wurde. Für den Großteil der SDA-Reaktin ist der Akplifikationsprimer verantwortlich für die exponentielle Amplifikation der Target-Sequenz. Der SDA-Amplifikations-Primer kann auch als "S"-Primer bezeichnet werden, z. B. 51 und 52 wenn ein Paar von Amplifikations-Primern zur Amplifikation einer doppelsträngigen Sequenz verwendet wird. Für andere Amplifikations-Verfahren, die nicht die Anbringung von spezialisierten Sequenzen an die Enden des Targets erfordern, besteht der Amplifikations-Primer generell aus nur einer Target bindenden Sequenz. Zum Beispiel M. kansasii- spezifische Amplifikationen durch PCR entsprechend der Erfindung setzen Amplifikations-Primer ein, die aus Target bindenden Sequenzen der SDA-Primer bestehen. Diese sind an die Target-Sequenz hybridisiert, ausgedehnt durch Polymerase und die Streckungsprodukte werden durch Heizen entfernt wie es für PCR üblich ist.
Ein Bumper oder externer Primer ist ein Primer der in der SDA verwendet wird, der sich an eine Target-Sequenz stromaufwärts eines Amplifikations-Primers so anbindet, daß die Streckung des Bumperprimers den stromabwärts des Amplifikations-Primers und dessen Streckungsprodukte verlagert. Bumper-Primer können als "B"-Primer bezeichnet werden, z. B. B&sub1; und B&sub2; wenn ein Paar von Bumper-Primern verwendet wird, um die Streckungsprodukte eines Paares von Amplifikations-Primern zu ersetzen. Die Streckung von Bumper-Primern ist eine Methode um die Streckungsprodukte von Amplifikations-Primern zu ersetzen, doch ist Erhitzen ebenfalls geeignet.
Die Bezeichnungen Target oder Target-Sequenz beziehen sich auf Nukleinsäure-Sequenzen, die durch Amplifikations-Primer amplifiziert wurden. Diese inkludieren die zu amplifizierenden originalen Nukleinsäure-Sequenzen, den komplementären Sekundärstrang der originalen zu amplifizierenden Sequenz, und jeden Strang einer Kopie der originalen Sequenz, der durch die Amplifikations-Reaktion erzeugt wurde. Diese Kopien dienen als amplifizierbare Target-Sequenz auf Grund von der Tatsache, daß sie auch Kopien der originalen Target-Sequenzen enthalten, zu denen die Amplifikations-Primer hybridisiert werden.
Kopien der Target-Sequenzen die während der Amplifikations- Reaktion generiert werden, werden als Amplifikations-Produkte, Amplimers oder Amplicons bezeichnet.
Die Bezeichnung Streckungsprodukt bezieht sich auf die einfachsträngige Kopie einer Target-Sequenz die durch Hybridisation eines Amplifikations-Primers und der Streckung eines Amplifikations-Primers durch Polymerase unter Verwendung einer Target-Sequenz als Schablone.
Die bevorzugte Methode zur Amplifikation der M. kansasii- Target-Sequenz ist Strand Displacement Amplification (SDA). Die SDA Targetgenerations- und Amplifikations-Reaktionsschemata sind in Fig. 1 dargestellt. Die Target-DNA wird in Gegenwart eines Überschusses von vier Primern (B&sub1;, B&sub2;, S&sub1; und S&sub2;) durch Hitze denaturiert. S&sub1; uns S&sub2; sind Amplifikations-Primer die an ihren 3'Enden targetbindende Sequenzen und eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease (z. B. HinoII- 5' GTTGAC) 5' zu der targetbindenden Sequenz enthalten. Die Restriktions- Endonuklease- Erkennungsstellen sind durch die erhöhten Kästchen gekennzeichnet. Für die Bequemlichkeit wird in der folgenden Beschreibung die HincII- und die exo-Klenow- Polymerase als Beispiel verwendet, allerdings kann jede der Restriktions- Endonukleasen und der 3'-5'Exonuklease Angel- Polymerasen, die für die Verwendung in den USA bekannt sind, substituiert werden.
S&sub1; und S&sub2; hybridisieren an entgegengesetzten Strängen der Doppelsträngigen Target-Sequenz und flankieren die Region die amplifiziert werden soll. B&sub1; und B&sub2; sind externe Bumper-Primer die nur aus targetbindenden Sequenzen bestehen und an den Positionen 5' an S&sub1; und S&sub2; hybridisieren. Nach dem Anbinden der Primer an das Target bei ungefähr 40ºC wird HincII zu einer Exonuklease- Mangelform des Klenow-Fragments der E. coli- DNA- Polymerase I (exo&supmin; Klenow) hinzugefügt. An diesem Punkt tritt die verbleibende Targetgeneration auf der linken Seite der Fig. 1 fortfahrend als eine einzelne Kaskade auf. Exo&supmin; Klenow, das in großem molarem Überschuss über die Nummer der Target- Sequenzen vorliegt, streckt gleichzeitig alle vier Primer unter Verwendung von dGTP, dCTP, dUTP (oder TTP) und dATPαS (Deoxyadenosin 5'-[α-thio]triphosphat). S&sub1; und S&sub2; werden gestreckt und ihre Streckungsprodukte und durch Streckung von B&sub1; und B&sub2; verlagert. Die verlagerten Streckungsprodukte von S&sub1; und S&sub2; (S&sub1;- ext und S&sub2;- ext) dienen als Targets zur Bindung an die entgegengesetzen Amplifikations-Primer. Weitere Runden der Streckung und der Verlagerung produzieren zwei Target- Fragmente mit einem Hemiphosphorothioat- HincII- Stelle an jedem Ende und zwei längere Target- Fragmente mit einer Hemiphosphorothioat- HincII- Stelle an nur einem Ende (untere linke Seite von Fig. 1). Aufnahme von dATPαS an Stelle von dATP in einer der beiden Stränge durch die Polymerase bedingt, daß die Restriktion Endonulease eher einen Strang einschnürt, als beide Stränge zu einem Doppelstrang zu verkleben. "Einschnüren" bezieht sich auf das Ankleben eines Stranges einer doppelsträngigen DNA als Gegensatz zur doppelsträngigen Anklebung. HincII kerbt die unmodifizierten Primer- Stränge der Hemiphosphorothioat- Erkennungsstelle und verläßt intakt die modifizierten komplementären Stränge. Exo&supmin; Klenow streckt dann vom 3'Ende der Kerbe und verlagert den stromabwärtigen neu synthetisierten Strang. Neue S1 und S2 Primer binden an die verlagerten Stränge an und werden gestreckt. Dies ist gefolgt von additiven Einkerbungs- und Strangverlagerungsschritten bis die vier Duplex an der unteren linken Seite der Fig. 1 zu dem "steady state" Amplifikations- Zyklus konvergieren, der in der rechten Seite der Fig. 1 dargestellt ist. Während jedes SDA- Zykluses hybridisiert das 3' Ende von S&sub1; an das 3' Ende des verlagerten Targetstranges T&sub2;, wobei ein Duplex mit 5' Überhängen ausgebildet wird. Desgleichen bindet S&sub2; an den verlagerten T&sub1;. Exo&supmin; Klenow streckt die ausgebuchteten 3' Enden des Duplex wobei dieser Hemiphosphorothioat- Erkennungsstellen produziert, die von HincII eingekerbt werden. Diese Einkerbungs- und Streckungs/Verlagerungs- Schritte kreisen kontinuierlich (kurze gebogene Pfeile auf der rechten Seite von Fig. 1), da die Streckung an einer Einkerbung eine kerbbare HincII- Erkennungsstelle regeneriert. Der Strang der vom S&sub1;-T&sub2; Duplex verlagert wurde, ist identisch zu T&sub1;. Gleicherweise ist der verlagerte Strang vom S&sub2;-T&sub1;- Duplex identisch zu T&sub2;. Folglich ist die Target- Amplifikation exponentiell, da jedes verlagerte T&sub2; einen neuen S&sub1;- Primer bindet und jedes verlagerte T&sub1; einen neuen S&sub2; bindet (lange gebogene Pfeile auf der rechten Seite der Fig. 1). Rechts- und linksdrehende Stränge werden durch dünne und dicke Linien unterschieden. Intakte und eingekerbte HincII- Erkennungsstellen werden durch und dargestellt. Die partiellen HincII -Erkennungsstellen (5'- GAC und sein Komplement 5'- GTC) sind an den 5'- und 3'- Enden der verlagerten Stränge vorhanden und sind jeweils durch und dargestellt.
Über die Parameter für das Aussehen der Amplifikations-Primer für SDA ist nur wenig bekannt. Im Allgemeinen sind Target-Sequenzen mit relativ niedrigem GC- Gehalt und wenig Sequenz - Variabilität wünschenswert. Jedoch müssen zwei solche Regionen (eine für die Hybridisation von jedem Amplifikations-Primer) nahe genug beieinander sein um durch SDA amplifiziert werden zu können. SDA in seiner derzeitigen Form verlangt kürzere Targets als PCR, üblicherweise weniger als 100 Nukleotide. Jedoch, auch wenn diese Kriterien erfüllt sind, ist der Nutzen von Amplifikations- und Bumper -Primern, die in SDA designed sind, nicht vorhersehbar. Ein Amplifikations-Primer, der als exaktes Ebenbild der Target-Sequenz designed wurde, kann aus ungeklärten Gründen darin versagen, diese zu amplifizieren, wogegen die von der selben Region der Target-Sequenz abgeleiteten, aber Fehlstellen enthaltenden alle Varianten von Strängen effizient amplifizieren können. Das kann zum Teil aufgrund von undefinierte Effekte der anderen Sequenzen, die Amplifikations-Primer (z. B. die Restriktions -Endonuklease- Erkennungsstelle und flankierende Sequenzen die für die Endonuklease Platz lassen um anzubinden) beinhalten, der Fall sein. Weiters haben die Bumper -Primer oft einen signifikanten Einfluß auf die Amplifikation, obwohl sie nicht auf die Target- Sequenz gerichtet sind und nicht direkt am Amplifikationsprozess teilnehmen. Es wurde weiters gefunden, daß die Kombination von Amplifikations-Primern und Bumper -Primern kritisch sein kann. Der Grund dafür liegt darin, daß eine Bumper - Primer/ Amplifikations-Primer- Kombination auch effiziente Amplifikationen zuläßt, aber wenn der selbe Bumper- Primer in Kombination mit einem anderen aber nahe verwandtem Amplifikations-Primer verwendet wird, kann die Amplifikation verhindert werden. Deshalb ist die Identifikation von Sequenzen mit kleiner oder keiner Variabilität unter Mycobakterien -Spezien ein erster Schritt aber es ist nicht ausreichend um sicherzustellen, daß passende Amplifikations-Primer für die Verwendung in SDA designed werden können. Gegenwärtig baut das Verfahren zur Gestaltung von SDA sehr erheblich auf der Identifizierung zweier scheinbar aussichtsreicher Bereiche der Target- Sequenz (niedriger GC Geehakt, geringe Sequenz- Variabilität, Nähe zueinander), gestalten einer Serie von verwandten oder überlappenden Primern, und Testen verschiedener Kombinationen von Primern in SDA auf, um zu bestimmen, welche, wenn überhaupt, eine Amplifikation unterstützt.
Da Nukleinsäuren keine vollständige Komplemetarität in Bezug auf das Hybridisieren verlangen, ist es zu verstehen, daß die Proben - und Primer-Sequenzen, die hier beschrieben wurden, in erheblichem Ausmaß modifiziert werden können, ohne daß dadurch ihre Verwendbarkeit als M. kansasii -spezifische Proben und Primer verloren geht. Wie im Fachgebiet bekannt, kann die Schärfe der Hybridisation von komplementären und teilweise komplementären Nukleinsäure- Sequenzen durch die Einstellung der Hybridisationebedingungen erhöht oder gesenkt werden (z. B. Einstellung der Hybridisationstemperatur oder Salzgehalt des Puffers). Solche kleinen Modifikationen der beschriebenen Sequenzen und jede nötige Einstellung der Hybridisationsbedingungen um die M. kansasii -Spezifität zu bewahren, erfordern nur Routineexperimente und liegen innerhalb des Könnens des Fachmannes auf diesem Gebietes.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Primer erzeugten Amplifikationsprodukte können durch eine charakteristische Größe nachgewiesen werden, zum Beispiel an Polyacrylamid oder Agarose- Gels die mit Ethidium- Bromid gefärbt sind. Alternativ dazu kann M. kansasii -Nukleinsäure in einer Probe oder in einer spezifisch amplifizierten M. kansasii -Target-Sequenz durch Hybridisation an die erfindungsgemäßen Amplifikations- Primer oder ihre targetbindenden Sequenzen detektiert werden. Für die Detektion durch Hybridisation sind die Oligonukleotide auf typische Weise mit einem detektierbaren Label versehen. Das detektierbare Label ist ein Teil, die entweder direkt oder indirekt als eine Indikation für die Hybridisation der Probe an die Target- Nukleinsäure erfaßt werden kann. Für die direkte Detektion des Labels werden die Proben mit Radioisotopen versehen und durch Autoradiographie erfaßt oder mit einem fluoreszierenden Teil versehen und durch Fluoreszenz detektiert, wie das im Fachgebiet bekannt ist. Alternativ dazu können Proben indirekt detektiert werden, indem sie mit einem Label versehen werden, das zusätzliche Reagenzien erfordert um es nachweisen zu machen. Indirekt detektierbare Labels beinhalten zum Beispiel chemilumineszente Agenzien, Enzyme die sichtbare Reaktionen produzieren und Liganden (z. B. Haptene, Antikörper oder Antigene) die detektiert werden können, indem sie an gekennzeichnete spezifische Bindungspartner (z. B. Antikörper oder Antigene/Haptene) binden. Besonders geeignete Labels beinhalten Biotin (detektierbar durch die Bindung an mit einem Label gekennzeichnetes Avidin oder Streptavidin) und Enzyme wie Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase (detektierbar durch Addition von Enzym- Substraten um gefärbte Reaktionsprodukte zu produzieren). Methoden um solche Labels zu Oligonukleotiden hinzuzufügen oder solche Labels in Oligonukleotide einzuschließen sind im Fachgebiet bekannt und alle diese Methoden sind für den Gebrauch in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Zur Detektion von amplifizierten Target-Sequenzen können die in der Amplifikationsreaktion verwendeten Primer gekennzeichnet und als Detektor-Proben verwendet werden, da die Primer in das Amplifikationsprodukt eingebracht werden. Alternativ dazu kann wenigstens eine gekennzeichnete Probe im Unterschied zu den Amplifikations-Primern als Probe zur Detektion von amplifizierten Target-Sequenzen durch Hybridisation verwendet werden. Diese Probe sollte ausgewählt werden, um an eine Sequenz im Target zu hybridisieren, die zwischen den Amplifikations-Primern liegt, z. B. eine interne Probe. Alternativ dazu kann entweder der Primer oder die interne Probe gekennzeichnet werden und durch Polymerase für die Detektion der Amplifikationsprodukte gestreckt werden, wie dies bei Walker, et al., Nucl. Acids Res., supra beschrieben ist.
Zur besseren Handhabung können Amplifikations-Primer zur spezien -spezifischen Detektion und Identifikation von M. kansasii in Form eines Kits abgepackt werden, der weiters andere Komponenten und Reagenzien zur Durchführung der Detektionsverfahren beinhalten. Zum Beispiel enthält so ein Kit wenigstens ein Paar Amplifikations-Primer entsprechend der vorliegenden Erfindung. Für die Detektion durch Hybridisation können auch eine Hybridisationslösung wie 6X SSC (0.9M Natriumchlorid, 0.09M Natriumzitrat, pH 7.0), 0.1M EDTA pH 8.0, 5X Denhardt's Lösung (0.1% w/v FICOLL TYPE 400, 0.1% w/v Polyvinylpyrrolidon, 0.1% w/v Rinderserum- Albumin) und 100 ug/ml scherfrakturierters denaturiertes Lachs- Sperma DNA oder. andere Reagenzien, die als verwendbar für die Hybridisation der Probe bekannt sind, enthalten sein. Siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Alternativ dazu können für die Verwendung mit einem der bekannten Nukleinsäure Amplifikations- Verfahren geeignete Reagenzien mit M. kansasii -spezifischen Amplifikations- Primern enthalten sein. Die Komponenten des Kits sind in einem gemeinsamen Behälter zusammengepackt und enthalten typische Anleitungen zur Durchführung einer spezifischen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren. Zusätzlich beinhaltet der Kit fakultative Komponenten wie z. B. eine zweite mit einem passenden Label versehene Probe für den Gebrauch als Detektions- Probe und Reagenzien oder Mittel zur Durchführung der Detektion des Labels.
Weil die Heterogenität der Target-Sequenzen unter den Isolierten einer Spezies die Gestaltung von Spezien- spezifischen Amplifikations- Primern verhindern kann und die Spezien- spezifische Amplifikation des Targets ausschließen kann war es zuerst notwendig die Streckung der Heterogenität der p6123 Sequenz unter den Strängen der M. kansasii festzustellen. p6123 hatte vorher Spezien- Spezifität nur als Hybridisationsprobe aufgewiesen. Die Untersuchung der Hybridisation, wie Southern blots, ermöglicht einen hohen Pegel an nicht- passenden Sequenzen (viel mehr als 70%) was nicht tolerierbar für Amplifikations-Primers ist. Durch Ausrichtung der p6123 Sequenz mit einer analogen aber verschiedenen Sequenz, die sich von einem unterschiedlichen Strang von M. kansasii (p6232) ableitet, wurden PCR Primer entwickelt, um ein Subfragment der analogen Sequenz in drei zusätzlichen Isolationen von M: kansasii (TMC1201, LCDC724 und 13638) zu amplifizieren. SEQ ID NO: 1 (MY-1) ist ein Antisens- Primer korrespondierend zu den Nukleotiden 503-484 von der p6123 Sequenz. Zwei Sense- Primer wurden korrespondierend zu den Nukleotiden 50-69 synthetisiert. Der erste SEQ ID NO: 2 (MY2a) hat ein Adenein an der Position 58 wogegen der zweite SEQ ID NO: 3 (MY-2 g) ein Guanin an der Position 58 hat. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 wurden alle auf einem Applied Biosystems 380B Synthesizer wie vom Hersteller empfohlen synthetisiert. Die Oligonukleotide wurden durch die Verwendung von Ammoniumhydroxid bei 50ºC für 16 Stunden entmantelt, dann, wie vom Hersteller (Aplied Biosystems) empfohlen, OPC gereinigt.
PCR-Amplifikationen werden in 100 ul Reaktionen bestehend aus 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl&sub2;, 0.001% (w/v) Gelatine, 200 uM dATP, 200 uM dCTP, 200 uM dGTP, 200 uM TTP, 1.0 uM von jedem Primer (Sense und Antisense) und 106 bis 104 Moleküle der Target-DNA. Die Reaktionen wurden überdeckt mit Mineralöl und auf 95ºC für 5 Minuten erhitzt. AMPLITAQ-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) wurde zu jeder Reaktion (2.5 Einheiten/100 ul) zugegeben und das Wärmezyklus wurde gestartet. Das Protokoll des Wärmezyklusses, für insgesamt 30 Zyklen war wie folgt: 94ºC für 1 Minute 30 Sekunden, 55ºC für 2 Minuten, 72ºC für 3 Minuten. Auf diesen folgte eine Inkubation bei 72ºC für 7 Minuten. Die Proben wurden bei 4ºC gelagert.
Ein 454 Basenpaar-Produkt wurde von M:kansasii TMC 1201, LCDC 724 und 13638 unter Benutzung von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 amplifiziert. Ein 454 Basenpaar-Produkt wurde ebenso von LCDC 724 und 13638, aber nicht von TMC 1201, unter Benutzung von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden in pUC18 Plasmide digeriert mit SmaI (Pharmacia LKB) subkloniert und zwei unabhängige Klone von jedem Strang wurden unter Benutzung eines Applied Biosystems 373A Sequencer und Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems), wie vom Hersteller empfohlen sequenziert. Ein substanzieller Betrag von Sequenzvariation wurde unter den Strängen gefunden. Die von M:kansasii 13638 (SEQ ID NO: 15) amplifizirte Sequenz war identisch mit der Sequenz von p6232 aber verschieden von p6123. Die Sequenz von TMC1201 (SEQ ID NO: 13) und LCDC724 (SEQ ID NO: 14) differierte von beiden p6123 und p6232. Bei Ausrichtung der Sequenzen von verschiedenen M:kansasii-Isolierten (p6123, p6232,. TMC1201, LCDC724 und 13638-Fig. 2) in einer Reihe, wurden mehrere Amplifikations- und Bumper- Primer entwickelt, die potentiell alle fünf Isolierten amplifizieren konnten. Diese wurden basierend auf dem GC-Gehalt der Target-Sequenz, der Nähe der Bindungsstelle der zwei Amplifikations- Primer und der Sequenzvariabilität ausgesucht.
Strand Displacement Amplifikations (SDA)-Reaktionen wurden generell ausgeführt wie vorher beschrieben (Walker et al., Nucl. Acids Res., supra), mit Substitution von dUTP für TTP um eine Inaktivierung (Dekontamination) von unter Benutzung von Uracil-DNA-Glykosidase (UDG) generierten Amplicons zu erlauben. Die Reaktionen wurden in einem 50 ul Volumen bestehend aus 6mM MgCl&sub2;, .2mM von jedem dGTP, dCTP und α-thio-dATP (2'- deoxyadenosin 5'-O-(1-thiotriphosphat), .5 mM dUTP, 100 ug/ml acetyliertes Rinderserum- Albumin, 1 ng/ul menschliche placentale DNA, 42.5 mM KiPO&sub4; pH 7.6, 0.5 uM Primer S&sub1; und S&sub2;, 0.05 uM Primer B&sub1; und B&sub2;, 3 Einheiten/ul HincII, 0.1 Einheiten/ul. exo&supmin; Klenow DNA-Polymerase (United States Biochemical) und verschiedene Beträge von Target-DNA. Die Reaktionen enthielten außerdem 15% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO). Vor der Zugabe von HincII, exo&supmin; Klenow und MgCl&sub2;, wurden die Reaktionen auf 95ºC für 2 Minuten erhitzt um die Target-DNA zu denaturieren, gefolgt von 2 Minuten bei 41ºC um die Primer zu binden. Nach der Zugabe von den Enzymen und MgCl&sub2;, wurden die Reaktionen bei 41ºC für 2 Stunden zur Amplifikation inkubiert. Die Amplifikation wurde durch erhitzen für 2 Minuten bei 95ºC beendet. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Hybridisierung und Extension eines ³²P- markierten Primers (SEQ ID NO: 12) nachgewiesen gefolgt von einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese wie vorher beschrieben (Walker et al., Nucl. Acids Res., supra).
SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 (MYs1 und MYs1.1) wurden als S&sub1; Amplifikations-Primer für SDA entwickelt. SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 (MYs2 und MYs2.1) wurden als S&sub2; Amplifikations-Primer für SDA entwickelt. Sie enthalten Target- Bindungsregionen, die Target- Sequenz und eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease HincII hybridisieren. SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 (MYb1 und MYb1.1) sind B&sub1; externe Primer. SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 (MYb2 und MYb2.1) sind B&sub2; externe Primer. B&sub1; und B&sub2; Primer bestehen aus Target- Bindungs- Sequenzen und hybridisieren das Target stromaufwärts von S&sub1; und S&sub2; (Fig. 2). Die Streckung der B&sub1; und B&sub2; Primer dient dazu die Streckungsprodukte der S&sub1; und S&sub2; Primer in den ersten Zyklus der SDA Targetgeneration zu verlagern. SEQ ID NO: 12 (MYd1) ist die Detectorprobe, die für den spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten durch Primerextensionsanalyse verwendet wird. Die Oligonukleotide SEQ ID NOS: 4-12, wurden synthetisiert und durch Synthetic Genetics (San Diego, CA) gelgereinigt.
Die zusätzliche Sequenzinformation erhalten durch die Stränge TMC1201, LCDC724 und 13638, zeigte ein 3' Fehlmuster des Primers SEQ ID NO: 4 (MYs1) mit LCDC724. Es gab auch mehrere Fehlmuster mit LCDC724 und TMC1201 innerhalb von SEQ ID NO: 8 (MYb1), aber keine Fehlmuster mit p6123, p6232 oder 13638. Deshalb, wurden der SEQ ID NO: 9 (MYb1.1) B&sub1; Primer als ein perfektes Muster mit LCDC724 und TMC1201 ausgeführt und synthetisiert. Die Targetregionen von SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 waren unter allen sequenzierten Strängen identisch. Trotzdem wurden Fehlmuster in der Target- Bindungsregion der Detektorprobe SEQ ID NO: 12 gefunden. Da die Detektorprobe ein 16mer ist, das durch eine Polymerase unter niedrigbündigen Verhält nissen gestreckt wird, ist nicht zu erwarten, daß diese Fehlmuster den Nachweis der Amplifikations- Produkte beeinträchtigen.
Das erste Set von SDA Primern (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10) wurde allein auf der Basis der Ausrichtung von p6123 und p6232 entwickelt, da zu dem Zeitpunkt keine Sequenzinformation für die zusätzlichen Stränge verfügbar war. Dieses Primerset brachte den Nachweis für die 3 zusätzlichen Isolierten von den getesteten M.kanasii (LCDC724, 13638 und TMC1201) und zeigten keine Kreuzungsreaktivität mit M.gastri, M.tuberculosis oder M.avium. Trotzdem variierte der Grad der Amplifikation (der Amplifikations- Faktoren) unter den verschiedenen Isolierten. Die Amplifikation wurde in LCDC724 sehr reduziert, möglicherweise auf Grund eines 3' Fehlmusters im SEQ ID NO: 4 Primer (siehe unten).
Bei einem Versuch die Amplifikations-Primer für SDA zu identifizieren, der konsistentere Amplifikationsfaktoren ergab, wurden neue S&sub1; und S&sub2; SDA Primer auf der Basis von Sequenzanordnungen aller fünf M.kansasii Strängen entwickelt. Diese waren SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 (MYs1.1 und MYs2.1). Ebenso wurde ein neuer B&sub2; Primer, SEQ ID NO: 11 (MYb2.1), entwickelt und synthetisiert. SEQ ID NO: 11 war identisch mit SEQ ID NO: 10 (MYb2) mit der Ausnahme, daß das 5' Nukleotid ein A anstelle eines G war um ein perfektes Muster der p6123 Sequenz zu machen, die sich von p6232, TMC1201, LCDC724 und 13638 unterscheidet. Verschiedene Primer-Kombinationen wurden dann getestet um festzustellen ob welche konsistente Amplifikations- Faktoren in TMC1201, LCDC724 und 13638 ergeben. Die vier getesteten Kombinationen von Amplifikations- Primern waren die folgenden:
A) SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6
B) SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 7
C) SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6
D) SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
Set A und Set C produzierten in allen drei Isolierten leicht nachweisbare Pegel der amplifizierter Target- Sequenz. Set D amplifizierte TMC1201 und 13638 aber leistete wenig mit LCDC724. Set B produzierte keine nachweisbaren Amplifikations- Produkte in LCDC724 aber amplifizierte gut in TMC1201 und 13638. Diese Resultate waren ähnlich bei der Verwendung irgendeiner Kombination von Bumper- Primern, so lange SEQ ID NO: 11 nicht enthalten war, wie unten diskutiert wird. Die Kombination von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 ergab die besten Resultate mit den am meisten konsistenten Amplifikationsfaktoren.
Diese Resultate illustrieren die nicht vorhersagbaren Interaktionen zwischen SDA Primern - SEQ ID NO: 4 enthält ein Fehlmuster am 3' Ende mit LCDC724. Es wird generell angenommen, daß das 3' Ende des Primers hybridisiert werden muß damit die Polymerase ihn effizient strecken kann. Dieser ist konsistent mit dem Mangel an Amplifikation wenn SEQ ID NO: 4 mit SEQ ID NO: 7 gepaart ist. Trotzdem erlaubt die Paarung des SEQ ID NO: 4 Amplifikations-Primers mit SEQ ID NO: 6 unerwartet eine effiziente Amplifikation in allen drei Isolierten ungeachtet des 3' Fehlmusters. Beide SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 6 sind perfekte Muster für die Target-Sequenz und es würde erwartet werden, daß sie wenig Auswirkungen auf die Amplifikation haben, wenn sie mit dem selben entgegengesetzten Amplifikations-Primer gepaart sind. Die Auswahl von Bumper- Primern hatte ebenso nicht vorhersagbare und unerwartete Auswirkungen auf die Amplifikation. SEQ ID NO: 10 enthält ein Fehlmuster am 5' Ende. SEQ ID NO: 11 wurde entwickelt um das Fehlmuster zu korrigieren und um ein perfektes Paßmuster des Bumper- Primers zu schaffen. Trotzdem, mehr als die Amplifikation zu erhöhen, unterdrückte sie SEQ ID NO: 11 unerwartet fast auf nicht nachweisbare Niveaus. Im Kontrast dazu funktionierte der Bumper- Primer, der ein 5' Fehlmuster enthielt, normal und erlaubte normale Pegel der Amplifikation.
Um die Auswirkungen der Fehlmuster der Primer zu kompensieren, wurden unkonventionelle SDA Primersets zusammengestellt. Wogegen SDA vorher mit nur zwei Amplifikations- Primern und zwei Bumper- Primern ausgeführt wurde, enthielten diese unkonventionellen Primersets zusätzliche Amplifikations- und Bumper- Primer, die erheblich effektiver verschiedene Sequenzen hybridisieren konnten. Zum Beispiel, SDA unter Benutzung von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, und SEQ ID NO: 6 (drei Amplifikations-Primer) mit SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 (drei Bumper- Primer) brachte spezienspezifische Amplifikation bei einem etwas reduzierten Niveau, aber es hatte den Vorteil, daß es die Variabilität der Amplifikationsfaktoren unter den Isolierten essentiell eliminierte. Das war unerwartet, da SEQ ID NO: 12 fast die Amplifikation eliminierte wenn es in konventionellen Primerpaaren verwendet wurde (siehe oben). Der gravierende inhibitorische Effekt von SEQ ID NO: 11 schien übertroffen zu werden wenn drei Amplifikations-Primer und drei Bumper-Primer verwendet wurden. SDA unter Verwendung von SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 (zwei Amplifikations- Primer) mit SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, und SEQ ID NO: 10 (drei Bumper- Primer) erlaubte die Amplifikation in den Strängen, die nicht amplifiziert wurden unter der Verwendung von SEQ ID NO: 8 alleine als B&sub1; Primer, und verbesserte auch die Konsistenz der Amplifikationsfaktoren unter den verschiedenen Isolierten.
Um die spezienspezifische Amplifikation unter Verwendung von Primern weiter zu demonstrieren, wurde DNA von 74 Isolierten von M.kansasii durch SDA unter Verwendung von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, und SEQ ID NO: 10 getestet. Diese enthielten 17 Isolierte von Australien (14 klinische und 3 aus der Umwelt), zwei klinische Isolierte von den Salomon- Inseln, 11 klinische Isolierte von Japan, fünf Isolierte von England (ein klinischer und vier aus der Atmung), 11 klinische Isolierte aus den Vereinigten Staaten, vier klinische Isolierte von Südafrika, 11 Isolierte von der Schweiz (neun aus dem Urin, 1 klinischer und 1 Sputum), vier Isolierte aus Belgien (3 klinische und 1 aus dem Urin). Fünf Laborstränge (LCDC711, LCDC714, LCDC715, LCDC725 und D-31) wurden zusätzlich zu TMC1201, 13638 und LCDC724 getestet. Ein spezifisches Amplifikationsprodukt wurde durch Hybridisierung und Polymerase- Extension des ³²P-markierten Primers (SEQ ID NO: 12) in allen dieser DNA-Proben nachgewiesen. Bei diesem SDA System gab es keine Kreuzreaktionen mit einer anderem getesteten Mycobakerium, z. B. gab es keine nachweisbaren Amplifikationsprodukte, die in M. gastri, M. avium, M. tberclosis, M. bovis, M. chelonae, M, flavescens, M. fortuitum, M. gordonae, M. ntracellulare, -m. marinum, M. microti, M. malmoense, M. segmatis, M. szulgai oder M. xenopi erzeugt werden. Außerdem traten bei diesem Set von Primern keine Kreuzreaktionen mit Nocardia asteroides oder Rhodococcus rhodochrous auf, die mit Mycobakterien nahe verwandt sind.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: BECTON; DICKINSON AND COMPANY
(A) NAME: BECTON; DICKINSON AND COMPANY
(B) STRASSE: 1 Becton Drive
(C) STADT: Franklin Lakes
(D) BUNDESSTAAT: NJ
(E) STAAT: US
(F) POSTLEITZAHL: 07417
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: SPEZIENSPEZIFISCHER NACHWEIS VON MYCOBACTERIUM KANSASII
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 15
(iv) LESBARE FORM FÜR DEN COMPUTER:
(A) MEDIUM TYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBS- SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25
(v) LAUFENDE ANTRAGSDATEN:
(A) ANTRAGSNUMMER:
(B) ANMELDE-DATUM:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
TGAAACGTGT TTTGCCAGCG 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2 0 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
ACCAGCGGAT CGTCACGGTG 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
ACCAGCGGGT CGTCACGGTG 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOKATION: 19...24
(D) WEITERE INFORMATION: / Funktion = "HincII Erkennungsstelle"
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc_binding
(B) LOKATION: 25...37
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "Hybridisierung der Target-Sequenz"
/Standard_Name = "Target- Bindungssequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCAGCAC CTCGGCG 37
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc feature
(H) LOKATION: 19..24
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "HincII Erkennungsstelle"
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc_binding
(B) LOKATION: 26..38
(D) WEITERE INFORMATION: / Funktion = "Hybridisierung der Target-Sequenz"
/ Standardname = "Target- Bindungssequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACAGAACA GCACCTCG 38
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc feature
(B) LOKATION: 19..24
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "HincII Erkennungsstelle"
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc_binding
(B) LOKATION: 25..37
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "Hybridisierung der Target-Sequenz"
/ Standardname = "Targetbindungssequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACCGATTC CTGGTGG 37
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc feature
(B) LOKATION: 19..24
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "HincII Erkennungsstelle"
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/KEY: misc_binding
(B) LOKATION: 25..37
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "Hybridisierung der Target-Sequenz"
/Standard Name = "Target- Bindungssequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACAGCGTT CTGCGAC 37
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
CCGGCCAACA G 11
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
ACGGTGCTGC GGC 13
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GTCGGTGTGG CA 12
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
ATCGGTGTGG CA 12
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
AACTCGACGG CCTCGG 16
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 200 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 200 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 200 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGTYP: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium kansasii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

Claims

1. Ein Set von Primern für spezienspezifische Amplifikation von M. kansasii Targetnukleinsäuren, die einen ersten Amplifikationsprimer bestehend aus SEQ ID NO: 5 und einen zweiten Amplifikationsprimer bestehend aus SEQ ID NO: 6, oder einen ersten Amplifikationsprimer bestehend aus den Nukleotiden 26-38 von SEQ ID NO: 5 und einem zweiten Amplifikationsprimer bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6 enthalten.

2. Ein Set von Primern für spezienspezifische Amplifikation von M.kansasii Targetnukleinsäuren, die einen ersten Amplifikationsprimer bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 4 und einen zweiten Amplifikationsprimer bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6 oder einen ersten Amplifikationsprimer bestehend aus SEQ ID NO: 4 und einen zweiten Amplifikationsprimer bestehend aus SEQ ID NO: 6 enthalten.

3. Das Set von Primern aus Anspruch 2, die weiters einen dritten Amplifikationsprimer bestehend aus SEQ ID NO: 5 enthalten.

4. Verfahren zum spezienspezifischen Nachweis von einer doppelsträngigen M.kansasii Nuklensäure-Target-Sequenz, umfassend:

a) hybridisieren zu der Targetsequenz, wenn vorhanden, eines ersten Amplifikationsprimers bestehend aus den Nukleotiden 26-38 von SEQ ID NO: 5 und eines zweiten Amplifikationsprimers bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6;

b) amplifizieren der Targetsequenz durch Strecken des hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationsprimers mit Polymerase um Streckungsprodukte zu produzieren und die Streckungsprodukte zu verlagern, und;

c) nachweisen der verstärkten Targetsequenz.

5. Verfahren zum spezienspezifischen Nachweis von einer doppelsträngigen M.kansasii Nuklensäure-Target-Sequenz umfassend:

a) hybridisieren zu der Targetsequenz, wenn vorhanden, eines ersten Amplifikationsprimers, der eine erste Target- Bindungs-Sequenz bestehend aus den Nukleotiden 26-38 von SEQ ID NO: 5 enthält und eines zweiten Amplifikationsprimers, der eine zweite Target-Bindungs- Sequenz bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6 enthält, wobei die ersten und zweiten Amplifikationsprimer weiters eine Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle 5' an der ersten und zweiten Target-Bindungs-Sequenz enthalten;

b) erzeugen eines Targetfragments, das eine Targetsequenz beinhaltet, durch Streckung der hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationsprimer um erste und zweite Streckungsprodukte zu produzieren, und Verlagern der ersten und zweiten Streckungsprodukte;

c) amplifizieren der Targetsequenz durch Einkerben der Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle im Targetfragment, Streckung von der Kerbe unter Benutzung von Exonuklease mangelnder Polymerase, und Verlagern von Kopien der Targetsequenz, und;

d) nachweisen der verstärkten Targetsequenz.

6. Verfahren nach Anspruch 5 wobei der erste Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO: 5 besteht und der zweite Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO: 6 besteht.

7. Verfahren zum spezienspezifischen Nachweis von einer doppelsträngigen M.kansasii Nuklensäure-Target-Sequenz umfassend:

a) hybridisieren zu der Targetsequenz, wenn vorhanden, eines ersten Amplifikationsprimers bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 4 und eines zweiten Amplifikationsprimers bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6;

b) amplifizieren der Targetsequenz durch Strecken der hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationsprimer mit Polymerase um Streckungsprodukte zu produzieren und verlagern der Streckungsprodukte, und;

c) nachweisen der verstärkten Targetsequenz.

8. Verfahren zum spezienspezifischen Nachweis von einer doppelsträngigen M.kansasii Nuklensäure-Target-Sequenz umfassend:

a) hybridisieren zu der Targetsequenz, wenn vorhanden, eines ersten Amplifikationsprimers, der eine erste Target- Bindungs-Sequenz bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 4 enthält und eines zweiten Amplifikationsprimers, der eine zweite Target-Bindungs- Sequenz bestehend aus den Nukleotiden 25-37 von SEQ ID NO: 6 enthält, wobei die ersten und zweiten Amplifikationsprimer weiters eine Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle 5' an der ersten und zweiten Target-Bindungs-Sequenz enthalten;

b) erzeugen eines Targetfragmentes, das die Targetsequenz enthält, durch Strecken der hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationsprimer um erste und zweite Streckungsprodukte zu produzieren, und verlagern der ersten und zweiten Streckungsprodukte;

c) amplifizieren der Targetsequenz durch Einkerben der Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle in dem Targetfragment, Streckung von der Kerbe unter Verwendung von Exonuklease mangelnder Polymerase, und Verlagern von Kopien der Targetsequenz, und;

d) nachweisen der verstärkten Targetsequenz.

9. Verfahren nach Anspruch 8 wobei der erste Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO: 4 besteht und der zweite Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO: 6 besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9 weiters umfassend die Hybridisierung eines dritten Amplifikationsprimers bestehend aus SEQ ID NO: 5.